HU219813B - Mitogenezis és motogenezis peptid inhibitorok - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát olyan peptidek képezik, amelyek képesekkölcsönhatásba lépni az intracelluláris transz- ducerekkel, és ígyzavarják a sejtproliferációhoz és -motilitáshoz vezetőszignáltranszdukciós bioszintézisutakat. A találmány szerintipeptideket kémiai úton állíthatják elő egyedi aminosavakból és/vagykettő, vagy több aminosavat tartalmazó, előre elkészített peptidekből.A találmány szerinti peptideket hasznosan lehet alkalmaznineoplasztikus betegségek kezelésében. ŕ

Description

A találmány tárgyát a sejtbiológia területén olyan új peptidek képezik, amelyek képesek kölcsönhatásba lépni az intracelluláris szignáltranszducerekkel, és ezáltal zavarják a sejtek szaporodásához és motilitásához vezető transzdukciós bioszintézisutakat.

A polipeptid növekedési faktorok fiziológiai hatásukat úgy fejtik ki, hogy a tirozinkináz-aktivitással rendelkező sejtfelszíni receptorokhoz kötődnek [Ullrich, A. and Schlessinger, J., Cell, 61, 203-211 (1990)].

Az ezekhez a ligandumokhoz való kötődés során a növekedésifaktor-receptorok dimerizáción esnek át, amit specifikus tirozincsoportok autofoszforilezése követ.

A fehéqék intracelluláris közegében olyan, meghatározott biológiai funkcióval rendelkező molekulák találhatók, amelyek szubsztrátként szolgálhatnak a ligandummal aktivált tirozinkináz-receptorok számára.

Az utóbbi néhány évben felhalmozódott kísérleti bizonyítékok azt jelzik, hogy a receptorhoz való kötődés során ezek a szubsztrátmolekulák aktivált formájúra váltanak, és a növekedési faktorok által a sejtek szaporodását szabályozó kritikus szignálbioszintézis-út részévé válnak.

Számos citoplazmatikus molekuláról, amelyek befolyásolják a növekedési faktorokra adott sejtválaszt, kimutatták, hogy SRC2 homológiarégiójukon (SH2) keresztül kölcsönhatásba lépnek az aktivált receptorokkal [Koch, C. A. et al., Science, 252, 668-674 (1991)].

Az SH2 dómén egy konzerválódott fehérjemodul, mérete körülbelül 100 aminosav, amely a citoplazmatikus szignálfehérjék igen eltérő csoportjában található.

Az SH2 domént tartalmazó fehérjék gyakran egy másik, eltérő, 50 aminosavból álló szekvenciát tartalmaznak, az SH3 domént, amely szintén szerepet játszik a fehérje-fehérje kölcsönhatásban a szignáltranszdukció során [Clark, S. G, et al., Natúré, 356, 340-344 (1992); valamint az ebben található referenciák].

A ligandum megkötődését követő receptorautofoszforilezés egy molekuláris kapcsolót hoz létre, ezzel a citoplazmatikus szignálfehérjék SH2 doménjének hoz létre egy kapcsolót [Anderson, D., et al., Science, 250, 979-982 (1990)], amely ezután az aktiválás célpontja lesz.

Az SH2 domének közvetlenül felismerik a foszfotirozint [Matsuda, M. et al., Science, 248, 1537-1539 (1990)].

Egy SH2 doménnek a nagy affinitású kötődése azonban azt igényli, hogy a foszfotirozin be legyen ágyazva egy specifikus aminosavszekvenciába, amit eredetileg az SH2 kötési helyek vizsgálata után javasoltak [Cantley, L. C. et al., Cell, 64, 281-302 (1991)].

Például az SH2-t tartalmazó fehérjék, a foszfatidilinozit ΡΙ-3-kináz, a Ras GTP-áz aktiválófehérje (Ras GAP) és a foszfolipáz C-γ (PLC-γ), mindegyik különböző autofoszforilezési helyekhez kötődik a vérlemezke eredetű növekedési faktor β-receptorán [Kashishian, A. et al., EMBO J., 11, 1373-1382 (1992); Fantl, W. J. et al., Cell, 69, 413-423 (1992)].

A ΡΙ-3-kináz, a PLC-γ és Ras GAP számára specifikus dokkolóhelyként működő autofoszforilezési helyeket azonosítottak még az epidermális faktor receptorában (EGF-R), az 1-es telepstimuláló faktor receptorában (CSF-1R) és a fibroblaszt növekedési faktor receptorában (FGF-R) [Cantley, L. C. et al., Cell, 64, 281-302 (1991); Mohammadi, M. et al., Mól. Cell. Bioi., 11, 5068-5078 (1991); Reedijk, M. et al., EMBO J., 41, 1365-1372 (1992); Rotin, D. et al., EMBO I, 11, 559-567(1992)].

Kimutatták, hogy a PDGF-receptor foszforilezési helyeinek megfelelő, viszonylag rövid peptidszekvenciák gátolják az aktivált PDGF-receptor és a ΡΙ-3-kináz közötti kölcsönhatást [Escobedo, J. A. et al., Mól. Cell. Bioi., 11, 1125-1132].

Úgy tűnik, hogy a foszfotirozin után C-terminális irányban közvetlenül található csoportok, különösen a +1, +2 és +3 pozíciókban, biztosítják a szelektivitást a specifikus SH2 domének számára.

így a ΡΙ-3-kináz p85 alegységének felismerőmotívumát azonosították a PDGF-receptorban: a szekvencia a Tyr-Met/Val-Xxx-Met (YMXM vagy YVXM), amelyben Xxx és X jelentése bármely aminosav a hárombetűs vagy egybetűs kódban [Domchek, S. M. et al., Biochemistry, 31, 9865-9870 (1992)].

Az SH2-t tartalmazó molekulacsalád új tagjainak azonosítása, valamint a megfelelő felismerőmotívum azonosítása mostanában gyorsan folyik.

Ezek közül a molekulák közül néhányról igazolták, hogy egy ligandumra adott biológiai válasz kiváltásában közvetlen szerepet játszik. Ez az eset a Grb2 fehérje esetében is, amely az SH2 doménjén keresztül mindkét EGF-receptorral asszociálódik a ligandumstimulálás hatására.

A Grb2 és H-ras fehérjének emlőssejtekbe való mikroinjekciózása a DNS-szintézis serkentését eredményezi, és így mitogén hatása van [Lowenstein E. J. et al., Cell, 70, 431-442 (1992)].

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Grb2 kritikus szerepet játszik a ras-szignál növekedési faktor által való szabályozásában.

Míg az elmúlt néhány évben a legtöbb erőfeszítés a citoplazmatikus szignálfehérjék és a legjobban jellemzett EGF- és PDGF-receptorok közötti kölcsönhatás vizsgálatára koncentrálódott, a jelen találmány szerzői figyelmüket a hepatocita növekedési faktor receptorára irányították.

A HGF, amely Scatter-faktor (SF) néven is ismert, egy heterodimer fehérje, amelyet mezodermális eredetű sejtek szekretálnak [Stoker, M. et al., Natúré, 327, 239-242 (1987); Weidner, K. M. et al., J. Cell. Bioi.,

II, 2097-2108 (1990)].

A faktor biológiai aktivitások spektrumát indukálja az epiteliális sejtekben, beleértve a mitogenezist, a sejtmotilitás serkentését és a mátrixinvázió elősegítését [Nakamura, T. et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun., 122, 1450-1459 (1984); Stoker, M. et al., Natúré, 327, 239-242 (1987); Weidner, K. M. et al., J. Cell. Bioi.,

III, 2097-2108 (1990); Rubin, J. S. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88, 415-419(1991)].

A HGF/SF emellett egy in vitro morfogén is [Stem C. D. et al., Development, 110, 1271-1284 (1990);

HU 219 813 Β

Montesano et al., Cell, 66, 697-711 (1991)], valamint egy potens angiogén faktor mind in vitro mind in vivő körülmények között [Bussolino, M. F. et al., J. Cell. Bioi., 119, 629-641 (1992)].

Míg a HGF/SF biológiai hatásai a célsejttől függően változnak, a HGF/SF jelet egyetlen receptor, a MET protoonkogén által kódolt tirozinkináz módosítja [Comoglio, P. M., in D. Goldberg and E. M. Rosen (szerkesztő), Hepatocyte Growth Factor-Scatter Factor (HGF/SF) and the C-Met Receptor, Birkhauser Verlag Basel/Switzerland],

A HGF-receptor, amely pl90^Mel néven is ismert, egy heterodimer receptor, amely egy extracelluláris trés egy transzmembrán β-alegységből áll [Giordano, S. et al,, Natúré, 339, 155-156 (1989)], mindegyik egy közös egyláncú, 170 kD méretű prekurzor proteolitikus hasításából származik [Giordano, S. et al., Oncogene, 4, 1383-1388(1989)].

A humán Met cDNS-sel transzfektált N1H3T3 fibroblasztok funkcionális receptorokat expresszálnak, és fokozott motilitással, valamint az extracelluláris mátrixba való fokozott invázióval reagálnak a HGF/SF-re [Giordano S. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 90, 649-653 (1993)].

A HGF/SF receptor szabályozatlan tirozinkináz-aktivitását figyelték meg a transzformált sejtvonalakban, kromoszomális átrendeződéseket követően [Park et al., Cell, 45, 895-904 (1986)], géntúlexpressziót követően [Giordano S. et al., Natúré, 339, 155-186 (1989)], defektív poszttranszlációs processzálást követően [Mondino et al., Mól. Cell. Bioi., 11, 6084-6092 (1991)] és autokrin loop után.

A receptor túlexpresszióját számos epiteliális eredetű humán tumorban megfigyelték [Di Renzo et al., Oncogene, 6, 1997-2023 (1991); Di Renzo et al., Oncogene, 7, 2549-2553 (1992); Prat et al., Int. J. Cancer, 49, 323-328 (1991)].

Ez hangsúlyozza a HGF/SF receptor onkogén potenciálját.

Keveset tudunk a HGF/SF által beindított transzdukciós bioszintézisutakról.

A faktor által indukált pleiotróp biológiai válasz azt sugallja, hogy egynél több mechanizmus aktiválódhat.

A jelen találmány szerzői kimutatták, hogy a HGF/SF receptor autofoszforilezést követően in vitro asszociálódik a ΡΙ-3-kinázzal, a ras-GAP-pal, a PLC-γval és az SRC-vel rokon tirozinkinázokkal [Bardelli, A. etal., Oncogene, 7, 1973-1978 (1992)].

A ΡΙ-3-kináznak az aktivált receptorral való asszociációját in vivő is megtalálták, HGF/SF által serkentett sejtekben [Graziam, A. et al., J. Bioi. Chem., 266, 22087-22090 (1991)].

A szerzők újabban azt is kimutatták, hogy a HGF/SF aktiválja a Ras-t, oly módon, hogy fokozza a tumovert a GDP- és GTP-kötött állapotai között, egy guaninnukleotid kicserélőfaktor révén [Graziam, A. et al., J. Bioi. Chem., in press (1993)].

Azt találtuk, hogy a HGF/SF receptor az Shc és Gbr2 fehérjékkel asszociálódik. Az emlős-Shc-gén három bőven expresszálódó átfedőfehérjét kódol, méretük 66, és 52 kD (p66^Shc, p46^Shc, és p52^Shc), amelyek a Cterminális SH2 domént tartalmazzák, valamint egy Nterminális kollagénhomológia régiót [Pelicci et al., Cell, 70, 93-104 (1992)]. A p46^shc-t és a p52^Shc-t ugyanaz a transzkriptum kódolja, két különböző ATG-t használva.

A p66^Shc-t egy alternatív módon érő transzkript kódolja [Migliacco et al., in preparation). A kísérleti eredmények azt mutatják, hogy az Shc fehéijék a tirozinkináz-receptorok által keltett szignál transzdukciójában játszanak szerepet. Ezek közül az Shc fehérjék gyorsan tirozinfoszforileződnek az EGF-receptoraktiválásra adott válaszként [Pelicci et al., Cell, 70, 93-104 (1992)], valamint a PDGF-receptoraktiválásra adott válaszként (nem közölt eredmények), az Erb-B-2-re [Segatto et al., Oncogene, 2105-2112 (1993)], az Srcre és Fps-re [McGlade et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 89, 8869-8873 (1992)] adott válaszként. Az Shc fehérjék túlexpressziója a neurittúlnövést mutatja a PC 12 pheochromocytomasejtekben, és ezt a hatást blokkolja egy domináns negatív Ras-mutáns [Rozakis-Adcock et al., Natúré, 360, 689-692 (1992)]. Bizonyos növekedési faktorokkal végzett sejtstimulálásra az Shc fehérjék stabil komplexeket képeznek a Grb2/Sem5 adapterrel [Lowenstein et al., Cell, 70, 431-442 (1992); Rozakis-Adcock et al., Natúré, 360, 689-692 (1992)]. Az utóbbi adapterről ismert, hogy aktiválja a Ras-funkciókat, oly módon, hogy segítségül hívja az SoS-t, egy guaninnukleotid kicserélőfaktort [Li et al., Natúré, 363, 85-87 (1993); Gale et al., Natúré, 363, 88-92 (1993); Rozakis-Adcock et al., Natúré, 363, 45-51 (1993); Simon et al., Cell, 73, 169-177 (1993); Olivér et al., Cell, 73, 179-191 (1993)] a membránhoz.

A fentiekből nyilvánvaló, hogy egy aktivált tirozinkináz-receptor és egy citoszól transzducermolekula közötti kölcsönhatás kritikus lépés a szignál bioszintézisútban, ami a sejtek szaporodásához és motilitásához vezet.

Mivel ezek a biológiai válaszok képezik a tumornövekedés és -terjedés legjellemzőbb tulajdonságait, a szakterületen dolgozó szakemberek felismerték, hogy az ilyen kölcsönhatás megzavarására szükség van.

A jelen találmány szerzői egy foszfopeptidcsoportot szintetizáltak, amelynek tagjai képesek kölcsönhatásba lépni az intracelluláris szignáltranszducerekkel, és ezáltal zavaiják azokat a bioszintézísutakat, amelyek a sejtek szaporodásához, mozgásához és az extracelluláris mátrixba való behatolásához vezetnek.

Ezek a biológiai tulajdonságok arra használhatók, hogy gátolják a neoplasztikus sejtek növekedését és megakadályozzák a metasztázisos elteijedést.

A jelen találmány szerzői emellett az alábbi új megfigyeléseket tették: (1) az Shc fehérjék az SH2 doménen keresztül kötődnek a tirozinfoszforilezett SF/HGF receptorhoz; (2) az Shc fehérjék az SHF/HGF receptor farok γΐ349 és γΐ356 foszfotirozinjához kötődnek; (3) az Shc fehérje túlexpressziója fokozza az SF/HGF-re adott motogenikus választ; (4) az Shc fehéijék az Y³¹⁷-en foszforileződnek, az SF/HGF receptorhoz való kötődés után; (5) az Y³¹⁷-en foszforileződött Shc fehérjék specifikus

HU 219 813 Β komplexeket képeznek a Grb2 fehérjével; és (6) a Grb2 dokkolási helyének az Shc-n (Y³¹⁷VNV) ugyanaz a szekvenciája, mint a szignáltranszducer-kötési helyeknek a HGF/SF receptoron (YVNV). Tehát peptideket szintetizáltunk az Shc-n levő Grb2 dokkolási helyről és a hepatocita növekedési faktoron levő Y¹³⁴⁹VHV, valamint Y¹³⁵⁴VNV felismerési motívumot tartalmazó Shc dokkolási helyről. Ezek a peptidek képesek megzavarni azokat a bioszintézisutakat, amelyek a sejtek szaporodásához és mozgásához, valamint az extracelluláris mátrixba való behatolásához vezetnek.

Ennek megfelelően, a jelen találmány tárgya továbbá egy olyan peptid, amelynek ugyanaz a szekvenciája, mint az Shc fehérje egy részének, amely peptid képes egy citomólban levő szignáltranszducerhez kötődni. A peptid általában képes gátolni az Shc fehérje és a Grb2 fehérje közötti kötődést, valamint a Grb2 és az aktivált hepatocita növekedési faktor receptora közötti kötődést.

A találmány tárgya emellett egy olyan peptid, amelynek ugyanaz a szekvenciája, mint a humán hepatocita növekedési faktor intracelluláris régiója egy részének, amely peptid képes egy citomólban levő szignáltranszducerhez kötődni.

A peptid általában képes gátolni az Shc fehéqe vagy a foszfatidil-inozitol-3-kináz p85 alegysége és az aktivált hepatocita növekedésifaktor-receptor közötti kötődést, vagy az Shc és más citomólban levő szignáltranszducerek közötti kötődést.

A jelen találmány szerinti peptidek általában tirozintartalmú molekulák, amelyek a tirozinfoszforilezés helyét jelentik. A peptidek hossza például 4-20 aminosav, azaz például 8-12 aminosav.

A peptidek általában reprodukálják az intracelluláris szignáltranszducerek SH2 doménjeinek potenciális felismerési motívumait.

A peptidek 4-20 aminosavat tartalmazhatnak, és szekvenciájuk X_N-YVN(vagy H)V-Xc, ahol X_N és X_c jelentése bármely, 0-16 aminosavból álló szekvencia.

X_N és X_c előnyösen olyan szekvenciák, amelyek a HGF/SF receptorban és az Shc fehérjében az YVN(vagy H)V szekvenciák egyikét határolják. Egy transzducer és egy aktivált tirozinkináz-receptor közötti kölcsönhatás lehetővé teszi magának a transzducernek a besorolását és aktiválását.

A HGF/SF receptor aktiválása lehet fiziológiai (azaz ligandum megkötődése és a receptorral való dimerizáció eredményeképpen), illetve konstitutív (azaz a receptor állandóan aktiválódik, még a ligandum távollétében is). Konstitutív aktiválódás előfordulhat a receptor egy olyan formájában, amelynek nincs extracelluláris ligandumkötő doménje, például egy onkogén receptorban vagy egy kromoszomális transzlokációt követően (mint az alábbiakban ismertetett TPR-MET fúzióban). A legtöbb intracelluláris szignáltranszducer korrelál a sejtnövekedéssel és az onkogén transzformációval [Fantl, W. J. et al., Cell, 69, 413-423 (1992); Reedijk, M. et al., Mól. Cell. Bioi., 10, 5601-5608 (1990); Lowenstein, E. J. et al., Cell, 70, 431-442 (1992)].

Ennek következtében az aktivált tirozinkináz-receptorral való kötődés, vagy az Shc fehérje és más transzducerek közötti kötődés szolgáltatja az eszközt a celluláris mitogenezis és motogenezis gátlására, és így a találmány szerinti peptid egy tumor fejlődése ellen hathat.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja egy, az alábbi csoportból választott peptid:

A tirozin pozíciója a HGF/SF receptor szekvenciában	Foszfopeptidek
Hárombetűs kód	Egybetűs kód
971	H-Tyr*-Asp-Ala-Arg-Val-His-Thr-Pro-OH	Y*DARVHTP
1003	H-Tyr*-Arg-Ala-Thr-Phe-Pro-Glu-Asp-OH	Y*RATFPED
1026	H-Tyr*-Pro-Leu-Thr-Asp-Met-Ser-Pro-OH	Y*PLTDMSP
1093	H-Tyr*-His-Gly-Thr-Leu-Leu-Asp-Asn-OH	Y*HGTLLDN
1159	H-Tyr*-Met-Lys-His-Gly-Asp-Leu-Arg-OH	Y*MKHGDLR
1192	H-Tyr*-Leu-Ala-Ser-Lys-Lys-Phe-Val-OH	Y*LASKKFV
1230	H-Tyr*-Asp-Lys-Glu-Tyr-Tyr-Ser-Val-OH	Y*DKEYYSV
971	H-Tyr*-Asp-Ala-Arg-Val-His-Thr-Pro-OH	Y*DARVHTP
1234	H-Tyr*-Tyr-Ser-Val-His-Asn-Lys-Thr-OH	Y*YSVHNKT
1235	H-Tyr*-Ser-Val-His-Asn-Lys-Thr-Gly-OH	Y*SVHNKTG
1284	Η-Tyr* -Pro-Asp-V al-Asn-Thr-Phe-Asp-OH	Y*PDVNTFD
1295	H-Tyr*-Leu-Leu-Gln-Gly-Arg-Arg-Leu-OH	Y*LLQGRRL
1307	Η-Tyr* -Cy s-Pro-Asp-Pro-Leu-T yr-Glu-OH	Y*CPDPLYE
1313	H-Tyr*-Glu-Val-Met-Leu-Lys-Cys-Trp-OH	Y*EVMLKCW
1349	H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH	Y*VHVNATY
1349-1356Y	H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*- Val-Asn-Val-Lys-OH	Y*VHVNAT Y*VNVK
1356	H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH	Y*VNVKCVA
1365	H-Tyr*-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Glu-OH	Y*PSLLSSE

ahol Tyr* jelentése egy foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozincsoport.

HU 219 813 Β

Az ismert intracelluláris szignáltranszducerek közül a ΡΙ-3-kinázról igazolták, hogy mind in vitro, mind in vivő kötődik a HGF-receptorhoz, a ligandumstimulálás következtében. A HGF/SF receptoron levő felismerési motívumát még nem azonosították.

A korábbi munkákban, amelyeket a PDGF-receptorral végeztek, kimutatták, hogy a Tyr-Xxx-Xxx-Met (YXXM) négy aminosavból álló szekvencia, amelyben Xxx vagy X jelentése bármely aminosav a hárombetűs kódban, illetve az egybetűs kódban, a ΡΙ-3-kináz kanonikus konszenzusszekvenciája.

A HGF-receptorban van egy potenciális felismerési motívum, a Tyr-Glu-Val-Met (Y₁₃₁₃EVM), amely a PI3-kináz kötőhelye lehet.

Meglepő módon, az alábbiakban közölt kísérleti eredmények azt mutatják, hogy jóllehet a konszenzus Y _13l3EVM-et tartalmazó szintetikus foszfopeptid képes kötődni a ΡΙ-3-kinázhoz, a 1313-as tirozin eliminálható, anélkül, hogy a ΡΙ-3-kötődést érintenénk.

Ezzel szemben mind a találmány szerinti szintetikus foszfopeptidek, mind receptor-Tyr-Phe-mutánsok használatával a jelen találmány szerzői azonosították a PI-3kináz kötőhelyeit a 1349-es és 1356-os pozícióban levő foszfotirozinokban, amint azt azokkal a gátlási adatokkal lehet igazolni, amelyeket a H-Tyr*-Val-His-ValAsn-Ala-Thr-Tyr-OH, H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-CysVal-Ala-OH és H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-ThrTyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH foszfopeptidekkel kaptak.

Ezek a csoportok tehát a Tyr-Val-(Asn vagy His)Val [YV (N vagy H)V]-szekvenciát azonosítják egy új felismerőmotívumként a ΡΙ-3-kináz számára, és a megfelelő foszfopeptidek hasznosan alkalmazhatók inhibitorként a HGF-receptor és a ΡΙ-3-kináz kötődésében.

A jelen találmánynak egy különösen előnyös megvalósítási módja ennek következtében egy olyan foszfopeptid, amelynek szekvenciája H-Tyr*-Val-His-ValAsn-Ala-Thr-Tyr-OH, H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-CysVal-Ala-OH vagy H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-ThrTyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH, ahol Tyr* jelentése foszforilezett tirozin.

A jelen találmány egy további előnyös megvalósítási módja a H-Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr*-Val-Asn-Val-GlnOH peptid (DDPSY*VNVQ), amelyben Tyr* (Y*) jelentése foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozin.

A találmány szerinti peptideket gyógyászatilag elfogadható sók formájában állíthatjuk elő. Az elfogadható sók közé tartoznak például az alkálifémsók (például nátrium- vagy káliumsók) és ammóniumsók; valamint a savaddíciós sók, mint például a hidroklorid- és acetátsók.

A találmány szerinti peptideket standard módszerekkel állíthatjuk elő, mint amilyeneket a szakirodalomban ismertettek [Escobedo, J. A. et al., Mól. Cell. Bioi., 11, 1125-1132 (1991); Turck, C. W„ Peptide Rés., 5, 156-160 (1992)], például védett, prefoszforilezett tirozincsoport alkalmazásával.

Pontosabban, a peptideket előállíthatjuk a szakterületen jártas szakember számára ismert szilárd fázisú módszerekkel [Schroeder et al., „The Peptides”, I, Academic Press (1965); Bodánszky et al., „Peptide Synthesis”, Interscience Publishers (1966), vagy McOmie (szerkesztő) „Protective Group in Organic Chemistry”, Plenum Press (1973); Bárány et al., „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology”, 2, 1. fejezet, Academic Press (1980)].

Tehát a találmány tárgyát képezi egy eljárás egy, a találmány szerinti peptid előállítására, amely eljárás szerint kémiailag szintetizáljuk a peptidet egyedi aminosavakból és/vagy előre elkészített peptidekből, amelyek kettő vagy több aminosavat tartalmaznak.

Ha arra van szükség, hogy egy olyan peptidet állítsunk elő, amely foszforilezett tirozint tartalmaz, akkor egy előre foszforilezett, védett tirozincsoportot lehet bevinni a szilárd fázisú szintézisbe, illetve egy védett, előre elkészített pepiidben levő tirozincsoportot foszforilezhetünk, míg a peptidet egy szilárd hordozóhoz kötjük.

A szilárd fázisú szintézis esetében bármely kézikönyv vagy automata peptidszintetizátor alkalmazható, és a peptideket lépésenként lehet összeállítani egy gyantahordozón, vagy Boc- vagy Fmoc-stratégiák alkalmazásával.

Mindegyik, kiindulási anyagként használt reagens kereskedelmi forgalomban van, illetve a szakterületen ismert módszerekkel előállítható és tisztítható.

Amikor egy foszfopeptidet készítünk, akkor ahhoz, hogy elkerüljük a foszfátcsoport lehasadását a védőcsoportoknak a védett peptidekről való eltávolítása közben, akkor scavengerek megfelelő keverékét tartalmazó trifluor-metánszulfonsav -trifluor-ecetsav-oldatot használunk.

A védőcsoport-mentesített peptideket fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk egy C18-Vydac-oszlopon (Hesperia Calif.) 0,1%-os trifluor-ecetsavban, lineáris acetonitril-gradienst használva, majd liofilezéssel izoláljuk. Mindegyik foszfopeptidet polihidrált poli(trifluor-acetát) formájában kapjuk meg. Az összes termék peptidtartalma 65-90%, és kromatográfiás tisztasága több mint 95%, a HPLCcsúcs λ=225 nm-en való relatív csúcsintegrálásával. Az aminosavelemzéseket savhidrolizátumokkal végezzük (110 °C 22 óra hosszat 6 N HCl+0,1% fenol összetételű oldatban). Egy másik módszer szerint először egy nem foszforilezett tirozint tartalmazó peptidet lehet szintetizálni, majd ezt követően egy foszfátcsoportot lehet bevinni a tirozincsoportra, vagy enzimatikusan vagy kémiai módszerekkel (ilyen esetben a többi, a foszforilezőreagenssel reagálni képes funkciót megfelelő módon meg kell védeni).

Ebben a leírásban az aminosavak és védőcsoportok rövidítései az IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature ajánlásai szerintiek [Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984)]. Leginkább az alábbi rövidítéseket használjuk a szövegben: Boc, t-butil-oxi-karbonil; tBu, t-butil; Bzl, benzil; Clz, 4-klór-benzil-oxikarbonil; DPCDI, diizopropil-karbodiimid; DCM, diklór-metán; DMF, dimetil-formamid; Dnp, dinitro-fenil; Fmoc, 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil; RP-HPLC, fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia; Trt, tritil.

A találmány szerinti foszfopeptideknek az intracelluláris transzducereknek a tirozinkináz-receptorokhoz

HU 219 813 Β vagy az Shc fehérjékhez való kapcsolódásának gátlási kapacitását kompetíciós kísérletekkel lehet megbecsülni, amint az a tirozinkináz-receptor kötődésére vonatkozó kísérleti részben látható.

Az autofoszforilezési helyeknek a tirozinkináz-receptorokra gyakorolt biológiai jelentőségének további igazolását a kísérleti részben ismertetett fókuszképzódési vizsgálati módszerrel végezzük.

Pontosabban, ez a vizsgálat azt mutatja meg, hogy a természetes aktivált HGF-receptor transzformálóaktivitása miképpen gátolható hatékonyan azáltal, hogy a receptoron magán elmutáltatjuk a figyelembe vett specifikus autofoszforilezési helyeket (Tyr-Phe mutáció).

A HGF/SF receptor vagy Shc egy foszforilezési helyét reprodukáló peptid zavarhatja a transzducerek kötődését, és ezáltal gátolhatja a mitogén és motogén szignál lefelé való továbbadását.

A találmány szerinti peptidek ennélfogva jól használhatók állatok vagy emberek kezelésében, például neoplasztikus betegségek kezelésében.

A találmány szerinti peptidek vagy foszforilezettek vagy nem foszforilezettek. A peptidek aktív formája általában foszforilezett, de előnyös lehet, ha a peptidet foszforilezetlen formában adjuk be, és hagyjuk, hogy a beteg testében foszforileződjön. Ez azért előnyös, mivel a peptideket sokkal könnyebb felvenni, ha nincsenek foszforilezve.

A találmány szerinti peptideket a betegeknek bármely szokványos parenterális módon beadhatjuk, vagy önmagában, vagy megfelelően konjugálva, hogy fokozzuk az enzimatikus stabilitását és sejtpermeabilitását.

Annak megválasztása, hogy szubkután, intravénás vagy intramuszkuláris úton adjuk be a peptideket, a dózis megválasztása, a beadás gyakoriságának megválasztása számos tényezőtől függ. Ezek közé a tényezők közé tartozik a beadás célja, a kezelt beteg kora, testsúlya és általános állapota. Terápiásán hatékony mennyiséget kell beadni. A peptidet azonban tipikusan 10-1000 pg per dózis, előnyösebben 50-500 pg per dózis mennyiségben adjuk be, mindegyik beadási módnál.

A peptidet gyógyászati készítményben formulázhatjuk. A gyógyászati készítmény tartalmazhat egy gyógyászatilag elfogadható hordozó- vagy hígitószert. Bármely megfelelő hordozó- vagy hígítószer használható, a beadás módjától függően.

Az alábbi példák illusztrálják a találmányt.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékletben megadott ábrákat.

1. ábra: A p85 és a hgf/sh receptor kötődésének gátlása tirozinfoszforilezett peptidekkel.

Rekombináns HGF/SF receptort tisztítunk immunprecipitációval bakulovírussal fertőzött Sf9 sejtekből, nyúl-poliklonálisantiszérum felhasználásával és hideg ATP-vei foszforilezzük. A p85-öt expresszáló Sf9 sejtek lizátumait előinkubáljuk az egyes foszfopeptidekkel (10 pmol/l). A lizátumokat azután hagyjuk asszociálódni az immobilizált rekombináns HGF/SF receptorokkal. Az asszociálódást követően a komplexet mossuk, és a receptorhoz kötött p85-öt in vitro kinázvizsgálattal mutatjuk ki, amint azt a 4. példában ismertetjük az

Anyagok és módszerek részben. A foszfopeptideket az N-terminális tirozin száma alapján azonosítjuk.

2. ábra: A p85 HGF/SF receptorhoz való kötődésének gátlása különböző koncentrációjú tirozinfoszforilezett peptidekkel.

Azokat a foszfopeptideket, amelyek hatékonyan leszorítják a p85-öt a HGF/SF receptorról (1. ábra) használjuk növekvő koncentrációban (10 nmol/1,100 nmol/1, 1 pmol/l, balról jobbra), azzal a céllal, hogy meghatározzuk a p85-höz való relatív affinitásukat. A kísérlet körülményei ugyanazok, mint amiket az 1. ábránál ismertettünk. A p85 kölcsönhatáshoz negatív kontrollként a 1365-ös foszfopeptidet használjuk.

3. ábra: A ΡΙ-3-kináz-holoenzim HGF/SF receptorhoz való kötésének gátlása tirozinfoszforilezett peptidekkel.

Azokat a foszfopeptideket, amelyek hatékonyan leszorítják a p85-öt (1. ábra), megvizsgáljuk, hogy mennyire képesek zavarni a ΡΙ-3-kináz-holoenzimnek a HGF/SF receptorhoz való kötődését. Három napig éheztetett A549 sejtek citoszólkivonatait előinkubáljuk az egyes foszfopeptidekkel (10 pmol/l), mielőtt az immobilizált rekombináns HGF/SF receptorra inkubáljuk. A receptorhoz kötődő ΡΙ-3-kináz jelenlétét az immunkomplexben a ΡΙ-3-kináz-aktivitás vizsgálatával határozzuk meg, amint azt a 4. példában, az Anyagok és módszerek fejezetben ismertetjük. A Pl-3-kináz-reakció foszfatidilinozitol-3-foszfát (PIP) termékének pozícióját jelezzük.

4. ábra: A Tyr-Phe mutációk hatása a HGF/SF receptor és a p85 kölcsönhatására.

COS-7 sejteket transzfektálunk vad típusú HGF/SF receptort (wt), vagy olyan receptort, amelyben a tirozinkodon a jelzett pozícióban egyenként fenil-alanin-kodonná van átalakítva, kódolóplazmidokkal, vagy ezeknek a kombinációjával. A COS-7 sejtek endogén HGF/SF receptort expresszálnak. A majomfehérjét azonban a C-terminális humán specifikus peptid elleni monoklonális antitestek nem ismerik fel. Ezeket a peptideket használjuk arra, hogy szelektíven immunprecipitáljuk a humán HGF/SF receptort a transzfektált COS-7 sejtekből. Az immobilizált prefoszforilezett receptorokat a p85-öt expresszáló Sf9 sejtek lizátumaival inkubáljuk. Az A panelben mind a receptort, mind a p85-öt in vitro kinázassay-ben jelezzük, amint azt a 4. példának az Anyagok és módszerek részében ismertetjük. A B panelben a p85 jelenlétét a receptor immunkomplexben immunblottal határozzuk meg, anti-p85 monoklonális antitestek felhasználásával.

5. ábra: A Tyr-Phe-mutációk in vivő hatása a HGF/SF receptor és a ΡΙ-3-kináz-holoenzim kölcsönhatására.

A vad típusú vagy mutált receptorokat expresszáló COS-7 sejteket HGF/SF-fel serkentjük, majd lizáljuk. A receptorokat humán specifikus monoklonális ellenanyagokkal immunprecipitáljuk. Az A és B panelben a receptorhoz kötött ΡΙ-3-kináz jelenlétét ΡΙ-3-kináz-aktivitás vizsgálattal határozzuk meg, amint azt a 4. példa Anyagok és módszerek fejezetében ismertetjük. A PI3-kináz-reakció foszfatidilinozitol-3-foszfát (PIP) ter6

HU 219 813 Β mékének. pozícióját jelöljük, A C és D panel immunblottal mutatja (humán specifikus monoklonális antitestek felhasználásával), hogy a ΡΙ-3-kináz-aktivitásra vizsgált minták ekvivalens mennyiségű rekombináns receptort tartalmaznak. A TK- receptormutánst konvertáljuk, oly módon, hogy az 1204-es pozícióban levő aszparaginsavat aszparagincsoporttá alakítjuk át. Ennek eredménye a kinázinaktív HGF/SF receptor.

6. ábra: Az Y₁₃₄₉ és az Y₁₃₅₆ azonosítása in vitro foszforilezési helyekként a HGF/SF receptorban, triptikus foszfopeptid-térképezéssel.

Az A profil egy szintetikus nem foszforilezett pepiidnek (I24K) a 214 nm-en végzett HPLC-elemzését mutatja, amely megfelel triptikus peptidet tartalmazó Y₁₃₄₉ és Y₁₃₅₆ tirozinnak a HGF/SF receptorban. Az I24K 65 perc alatt eluálódik a HPLC-oszlopról. A B és C az in vitro [y-³²P]ATP-foszforilezett vad típusú receptorból (B) és a Phe₁₃₄₉_₁₃₅₆ receptormutánsból (C) származó triptikus foszfopeptidek radio-HPLC elúciós profilját mutatja.

7. ábra: A 1313,1349 és 1356 foszfotirozinok relatív affinitása a p85 N- és C- SH2 doménjeihez

Az affinitásokat biospecifikus kölcsönhatással határozzuk meg, a BIAcore-berendezés alkalmazásával [Jonsson, U., Fagerstam, L., Roos, H., Ronnberg, J., Sjolander, Stenber, E., Stahlberg, R., Urbaniczky, C., Ostlin, H. and Malmquist, Surface plasmon resonance and microfluidics fór reál time biospecific interaction analysis, Biotechniques, 11, 520-527 (1991); Jonsson, U. and M. Mamlmquist, Reál time biospecific analysis. The integration of surface plasmon resonance detection, generál biospecific interface chemistry and microfluidics intő one analytical system, 291-336, In F. Turner (szerkesztő) Advances in Biosensors, 2, JAI Press, London (1992); Karlsson, R., Michaelsson, A. and L. Mattsson, Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system, J. Immunoi. Meth., 145, 229-246 (1991)].

A relatív affinitásokat úgy határozzuk meg, hogy mérjük a foszfopeptideknek azt a képességét, hogy mennyire képesek gátolni a kölcsönhatást az SH2 domének és egy immobilizált foszfopeptid (DMSKDESVDY*VPMLDMK) között, amely magában foglalja a humán PDGF-receptorban levő Y₇₅₁-et. A C panel azokat a foszfopeptidkoncentrációkat mutatja, amelyek a kötődés félmaximális gátlásához szükségesek.

8. ábra: Fókuszképződési vizsgálat különböző TPR-MET-konstrukciókkal.

A TPR-MET¹³⁴⁹-ben, TPR-MET Phe¹³«>-ban és a TPR-Met Phe¹³⁴⁹~¹³⁵⁶-ban a HSF/SF receptor Tyr₁₃₄₉ének és/vagy a Tyr₁₃₅₆-ának megfelelő tirozincsoportokat mutagenizáltuk fenil-alaninná.

9. ábra. Az SF/HGF az Shc foszforilációját és az SF/HGF receptorral, valamint a Grb2-vel való asszociációját indukálja.

Az A549 sejteket, amelyek lehetnek kontrollsejtek vagy az Shc cDNS Y³¹⁷=>F mutánsát expresszáló sejtek (A549/Y317F), a sejtek egybefolyó rétegének kialakulásáig növesztjük, szérumra éheztetjük 24 órán át, majd lizáljuk. Ahol külön jelezzük (+), a sejteket öt percig 200 E/ml tiszta SF/HGF-fel serkentettük. Az első ellenanyaggal immunprecipitált immunkomplexeket 9%os SDS-PAGE-val választjuk szét, majd egy második antitesttel (WB) végzett immunblottal elemezzük, a jelzések szerint. A nyilak mutatják az endogén Shc izoformákat (p46, p52, p56), az SF/HGF receptor β-láncát (pl45), a transzfektált jelölt mutáns Shc izoformákat (p53 és p58), valamint a Grb2 fehérjét (p23).

10. ábra: Az Shc asszociációja és tirozinfoszforilezése az SF/HGF receptor kinázaktivitásától függ.

A vad típusú SF/HGF receptor (WT) vagy egy kinázdefektív receptor mutáns (LYS) cDNS-eit tranziens módon expresszáló COS-1 sejtek lizátumait vagy antiMet monoklonális antitesttel (A. és B.) vagy egy antiShc poliklonális szérummal (C. és D.) immunprecipitáljuk, Westem-blotot végzünk, majd vagy anti-Met vagy anti-P-Tyr antitestekkel mint próbákkal vizsgáljuk meg, amint jelezve van. A nyilak a prekurzor fehérjét (pl70) mutatják, amely a COS-1 sejtekben túlnyomó többségben található, teljesen funkcionális formája az SF/HGF receptornak [Ponzetto et al., Mól. Cell. Bioi., 13, 4600-4608 (1993)]; a p46, p52 és a p56 tiszta Shc izoformák.

11. ábra: Az Shc és Grb2 SH2 domének kötődése az SF/HGF-fel kezelt sejtekről oldatba vitt fehérjékhez.

A lizátumokat stimulálatlan (-) vagy SF/HGF-fel stimulált (+) A549 sejtek egybefolyó egy sejtrétegéből készítjük. Az asszociációs kísérleteket úgy végezzük el, hogy összsejtfehérjét glutation-Sepharose-ra immobilizált rekombináns GST-SH2.Shc-vel (A) vagy GST-SH2.Grb2-vel (B) inkubálunk. A megkötött fehérjéket eluáljuk és Westem-blottal elemezzük, a jelzett antitesteket alkalmazva.

12. ábra: Az Shc-kötési helyek térképezése az SF/HGF receptoron

SF/HGF receptorokat, akár (WT), akár az egyes sorok tetején jelzett mutált Y=>F-et expresszáló COS-1 sejteket koimmunprecipitáljuk anti-Shc ellenanyagokkal; biotoljuk, majd anti-Met antitestekkel teszszük láthatóvá. A nyíl a receptor prekurzorát (pl70) mutatja.

13. ábra: Az Shc SH2 dómén kötődik az SF/HGF receptor (Y¹³⁵⁶) dokkolási helyéhez, de nem kötődik a sajátjához (Y³¹⁷).

Az Shc-SH2-nek ugyanazt a koncentrációját injekciózzuk két, olyan bioszenzor felszínére, amelyekre két foszfopeptidet immobilizáltunk. Az Y1356P a receptorfarok VNATY¹³⁵⁶VNVK szekvenciájából származik; az Y317P a DDPSY³¹⁷VNVQ szekvenciából. Meg kell jegyeznünk, hogy mindkét peptid ugyanazt a magot tartalmazza, de eltérő upstream szekvenciák mellett. A válaszban megfigyelhető kezdeti gyors növekedés az injekciózott oldat „bulkhatásának” tulajdonítható.

14. ábra: Az Shc túlexpressziója fokozza az SF/HGF-re adott motogén választ.

Vaklukú Byden-kamrákat rakunk össze 8 pm pórusátmérőjű, zselatinnal borított polikarbonátszűrőlapokkal. A sejteket 5-[¹²⁵]jód-2’-dezoxiuridinnel jelezzük (lásd módszerek), majd a felső kamrába széleszt7

HU 219 813 Β jük. Az alsó kamrát a jelzett koncentrációjú tisztított SF/HGF-et tartalmazó, szérummentes táptalajjal töltjük meg. Hat órán át 37 °C-on végzett inkubálással a szűrőlapok felső részéhez tapadt sejteket mechanikai módszerekkel eltávolítjuk; a szűrő alsó oldalához vándorolt sejteket fixáljuk, majd egy γ-számlálóval menynyiségileg meghatározzuk (Y tengely: a kötött CPM). Az alsó panel mutatja azoknak a sejteknek a kis nagyítású (4 χ) mikrográf képét, amelyek 40 E/ml SF/HGF jelenlétében a szűrőlapok alsó oldalához vándoroltak. A sejteket vagy az SHC cDNS-t hordozó retrovírussal (SHC-plXSN) vagy az üres vírussal (MOCK) fertőzzük.

15. ábra: A Grb2 SH2 doménje kötődik az Shc Y³¹⁷ dokkolási helyéhez.

A panel: szenzorgram, amelyet úgy kaptunk, hogy különböző koncentrációjú Gst-SH2.Grb2-t injekciózunk a DDPSY*VNVQ Shc-szekvenciából származó immobilizált foszfopeptidekre. B panel: a versengő peptidek hatása a disszociáció sebességére. A Grb2injekció végén, puffért vagy 20 M nem biotinilezett foszfopeptidet injekciózunk. C panel: az A panelben bemutatott adatok elemzése. A bal oldali ábra a kötési sebesség ábrázolása a relatív válasz függvényében a hat különböző szenzorgram esetében. A jobb oldali ábra esetében az egyes vonalak iránytangensét ábrázoljuk a koncentráció függvényében: az új iránytangens adja az asszociációs sebességi állandót.

16. ábra: Az SF/HGF receptor és az SH2-t tartalmazó Shc és Grb2 adaptermolekulák közötti kölcsönhatás modellje.

A Grb2 nagy affinitással kötődik a receptorfarkon levő Y¹³⁵⁶VNV dokkolási helyhez. Az Shc adaptermolekula képes mind az Y'349 _mj_n(j _az γΐ356 foszfotirozinnal kölcsönhatásba lépni. A kötődés során az Shc a receptor révén transzfoszforileződik az Y^3l7-en, ezzel újra létrehozva a Grb2 számára egy nagy affinitású dokkolási helyet. A receptor így képes aktiválni a motogén választ az Shc bioszintézisútjában, anélkül, hogy zavarná a Grb-2 -SOS által vezérelt, Ras-közvetített mitogén választ.

1. példa

A H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH (I-es képlet) készítése

0,89 g (0,5 mmol) Fmoc-Tyr(tBu)-4-(oxi-metil) fenoxi-metil-kopoli(sztirol-1 % divinil-benzol)-gyantát (0,56 mmol/g) az alábbi ciklusnak vetjük alá, amely 5 lépésből áll:

(1) DMF (2) 20% piperidin DMF-ben (3) DMF (4) előre elkészített 2,0 mmol Fmoc-aminosav 1hidroxi-benzotriazol-észter DMS-ben (5) DMF.

A mosások és a reagensek térfogata 10-20 ml.

Mindegyik lépest annyiszor ismételjük meg, ahányszor vagy a gyanta teljes reagálásához szükséges (2-, 4es lépések), vagy ahányszor az előző reagensnek a gyantáról való teljes eltávolításához szükséges (1-es, 3-as és

5-ös lépések). Az egyes ciklusok után mintákat veszünk a gyantából, és ninhidrinteszttel megvizsgáljuk, hogy a reakció teljesen lejátszódott-e. Az Fmoc-aminosavak 1hidroxi-benzotriazol-észtereit közvetlenül felhasználás előtt készítjük el, oly módon, hogy az Fmoc-aminosavat (2,0 mmol), az 1-hidroxi-benzotriazolt (2,0 mmol) és DPCDI-t (2,0 mmol) reagáltatjuk DMF-ben.

A reakcióciklust (1-től 5-ig) minden egyes aminosavra megismételjük, hogy az I-es képletű szekvenciát megkapjuk.

Az alábbi védett aminosavakat alkalmaztuk az alábbi sorrendben: Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, FmocVal-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH és Boc-Tyr (PO₃Bz,₂)-OH. Az utolsó ciklus után a peptidilgyantát néhányszor DCM-mel mossuk, majd megszárítjuk.

A kiindulási gyantához képest 0,54 g súlynövekedést kaptunk.

A peptidilgyantából 1,0 g-ot kevertetünk 20 ml trifluor-metánszulfonsav/trifluor-ecetsav/dimetil-szulfid/etánditiol (20:50:3:3:1) keverékkel 3 óra hosszat 0 °C-on. A védőcsoportoktól megfosztott peptidet 1 liter dietil-éterrel kicsapjuk, majd szűréssel kinyeijük.

A nyerspeptidet RP-HPLC-vel tisztítjuk egy 08Vydac (Hesperia, CA) oszlopon (2,2x25 cm) 0,1% trifluor-ecetsavban, 0-65%-os lineáris acetonitrilgradiens alkalmazásával, 90 perc alatt.

A terméket tiszta formában tartalmazó frakciókat egyesítjük, az acetonitrilt csökkentett nyomáson lepároljuk, majd a megmaradt oldatot liofilezzük. Az I-es képletű vegyületből 132 mg-ot kaptunk, 95,7% kromatográfiás (HPLC) tisztasággal.

Aminosavarányok: Alá 1(1); Asp 1,07(1); His 0,96(1); Thr 0,91 (1); Tyr 1,88 (2); Val 2,03 (2).

Peptidtartalom: 73,7%.

FAB-tömegspektroszkópia: m/z 1044-4 [M-H]~.

2. példa

H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH (ΙΙ-es képlet) készítése

Kiindulva 0,5 mmol Fmoc-Ala-4-(oxi-metil)fenoximetil-kopoli(sztirol-l% divinil-benzol)-gyantából, és a védett aminosavakat az alábbi sorrendben hozzáadva: Fmoc-Val-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Val-OH, Boc-Tyr-OH, a defoszfopeptidet a gyantán ugyanúgy hozzuk létre, mint ahogy az 1. példában leírtuk.

Az utolsó ciklus után a Tyr csoport foszforilezését közvetlenül a még a gyantához kötött pepiiden végezzük el, a peptidilgyantát 30 ekvivalens lH-tetrazol és 10 ekvivalens di-terc-butil-N,N-diizopropil-foszforamidit DMF-ben készült oldatával kezeljük 25 °C-on egy óra hosszat, majd 20 ekvivalens terc-butil-hidroxi-peroxid toluolos oldatával 1 óra hosszat 25 °C-on. A hasítást, a védőcsoport eltávolítását és a nyerstermék tisztítását 1,0 g peptidilgyantával végezzük, az 1. példában leírtak alapján.

Aminosavarányok: Alá 1(1); Asp 1,02(1); Cys nd(l); Lys 0,99(1); Tyr 0,95(1); Val 2,98(3).

Peptidtartalom: 68,9%.

FAB-tömegspektroszkópia: m/z 973,4 [M-H] .

HU 219 813 Β

3. példa

A H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-AsnVal-Lys-OH (III-as képlet)

0,74 g (0, 5 mmol) Boc-Lys(Cl_z)-4-(oxi-metil)-fenil-acetamido-metil-kopoli(sztirol-1 % di vinilbenzol)gyantát (0,68 mmol/g) az alábbi, 7 kezelési lépésből álló ciklusnak vetjük alá:

(1) DCM (2) 50%-os trifluor-ecetsav DCM-ben (3) DCM (4) 5%-os diizopropil-etil-amin DMF-ben (5) DMF (6) előre elkészített 1-hidroxi-benztriazol-észter (2,0 Boc-aminosav DMF-ben) (7) DMF

Mindegyik lépést annyiszor ismételjük meg, ahányszor szükséges, akár a gyantával való teljes reakció lejátszódásához (2-es, 4-es és 6-os lépések), illetve az előző reagens teljes eltávolításához a gyantáról (1-es, 3-as, 5-ös és 7-es lépés).

Minden egyes ciklus után mintát veszünk a gyantáról, és ninhidrinteszttel ellenőrizzük a reakció teljes lejátszódását.

A Boc-aminosavak 1-hidroxi-benzotriazol-észtereit közvetlenül felhasználás előtt állítjuk elő, 2,0 mmol Boc-aminosavat, 2,0 mmol 1-hidroxi-benztriazolt és 2,0 mmol DPCDl-et reagáltatva DMF-ben.

A reakcióciklusokat (l-től 7-ig) minden egyes aminosavra megismételjük, és így kapjuk a III-as képletnek megfelelő szekvenciát.

Az alábbi védett aminosavakat adjuk a gyantához, a jelzett sorrendben: Boc-Val-OH, Boc-Asn-OH, BocVal-OH, Boc-Tyr(PO3Bzl2)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Val-OH, BocHis(Dnp)-OH, Boc-Val-OH és Boc-Tyr(PO3Bzl2)-OH.

A szintézis teljes lejátszódása után a His(Dnp) védőcsoportot eltávolítjuk 15 ml tiofenol DMS-es oldatával, míg a peptid még a gyantához kapcsolódva marad, majd a peptidilgyantát néhányszor mossuk DCM-mel, majd megszárítjuk.

1,51 g peptidilgyantát kaptunk.

A hasítást, a védőcsoportok eltávolítását és a nyerstermék tisztítását 1,0 g kiindulási peptidilgyantán végezzük, az 1 példában leírtak alapján. 196 mg III-as vegyületet kaptunk, amelynek kromatográfiás tisztasága (HPLC) 95,5%.

Aminosavarányok: Alá 1(1); Asp 1,99(2), His 1,05(1); Lys 0,97(1); Thr 0,93(1); Tyr 1,85(2); Val 4,01(4). FAB-tömegspektroszkópia: m/z 1564,62 [M-H]~.

4. példa

Anyagok és módszerek

Reagensek, sejtek, ellenanyagok

Minden reagenst, hacsak külön nem jelezzük, a Sigma Chemical Co.-tól vásárolunk. A kovalens kötéssel a Sepharose-hoz kötött protein A-t a Pharmacia LKB Biotechnology Inc.-től vásároljuk. Minden radioaktív izotópot az Amersham Corp.-től vásárolunk. Az A549 tüdőkarcinóma-sejteket és COS-7 sejteket az ATCC-től szerezzük be (CCL 185) (American Type

Culture Collection), majd 10% boíjúmagzatszérummal (Flow Laboratories, Inc.) kiegészített DMEM táptalajban növesztjük 5% CO₂-t tartalmazó, vízzel telített atmoszférában. Az ATCC-től vásárolt Spodoptera frugiperda (Sf9) sejteket (CRL 1711) egysejtréteges tenyészetekben növesztjük, SF-900 táptalajban (GIBCO BRL). Antiszérumokat és monoklonális anti-Met ellenanyagokat készíttettünk egy szintetikus peptid ellen, amely a humán MET-szekvencia tizenkilenc C-terminális aminosavának felel meg [Prat, M. et al., Mól. Cell. Bioi., 77(12), 5954-5962 (1991)]. A p85 elleni ellenanyagokat Otsu és munkatársai írták le [Otsu, M. et al., Cell, 65, 91-104 (1991)].

A szintetikus foszfopeptideket az 1-3-as példákban leírtak alapján szintetizáljuk.

A HGF/SF receptor és a p85 cDNS-ek expressziója rovarsejtekben, bakulovírus-vektorok alkalmazásával

Rekombináns HGF/SF receptort és p85 bakulovírusokat készítünk a korábban már leírt módon [Bardelli, A. et al., Oncogene, 7, 1973-1978 (1992); Otsu, M. et al., Cell, 65, 91-104 (1991)], majd Sf9 sejteket fertőzünk velük [Piwnica-Worms, H. et al., J. Virol., 64, 61-6(1990)].

GST-SH2 dómén fúziós fehérjék

A szarvasmarha-PI-3-kináz p85 alegység N- és C-SH2 doménjeit (a 314-431-es aminosavak és a 612-722-es aminosavak) polimeráz-láncreakcióval állítjuk elő, majd pGEX-2 bakteriális expressziós vektorba klónozzuk [Smith, D. B. and Johnson K. S., Gene, 67, 31-40(1988)].

Glutation-S-transzferáz (GST)-SH2 íüziós fehéijéket tisztítunk baktériumlizátumokból, glutation-affmitáskromatográfiával [Panayotou, G. et al., EMBO J., 77, 4261-4271 (1992)]. Egy Applied Biosystems 420A berendezéssel végzett aminosavanalízist használunk a rekombináns fehérjék koncentrációjának meghatározására.

A ΜΕΤ-cDNS helyspecifikus mutagenezise és expreszsziója COS- 7 sejtekben

A ΜΕΤ-cDNS klónozását korábban ismertették [Ponzetto, C. et al., Oncogene, 6, 553-559 (1991), n° X54559 EMBL Data-Bank referencia]. A ffagmens 3’végét a 2355-ös nukleotidtól a molekula végéig pSELECT™-ben szubklónozzuk. A helyspecifikus mutagenezist egy in vitro oligonukleotid helyspecifikus mutagenezis-rendszerrel végezzük (Altered Sites™ in vitro Mutagenesis System, Promega). Az oligonukleotidokat egy Applied Biosystem 391 berendezéssel szintetizáljuk. A mutáns kiónokat szekvenálással azonosítjuk (T7 szekvenálókit a Pharmaciától). A teljes méretű MET-cDNS-eket, amelyek a megfelelő Tyr-Phe mutációkat tartalmazzák, egy olyan PMT2 vektorban rekonstruáljuk, amely a fő, késői adenovírus promotert tartalmazza. Mindegyik plazmidot lipofectinnel (GIBCO BRL) transzfektáljuk COS-7 sejtekbe.

In vitro asszociációs kísérletek

A rekombináns HGF/SF receptort expresszáló Sf9 sejteket (körülbelül 4xl0^{4 * 6} sejt/pont) a fertőzés után 36 órával A pufferben lizáltatjuk (A puffer: 10 mmol/1 TRIS-HC1, pH=7,5, 10% glicerin, 1% Triton X-100,

HU 219 813 Β

150 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 EDTA), amelyet 0,2 mmol/1 fenil-metil-szulfonil-fluoriddal, 1 pg/ml leupeptinnel, 0,1 TlU/ml aprotininnel és 1 pg/ml pepsztatinnal egészítettünk ki. A lizátumokat centrifugáljuk (15 000 χ g 4 °C, 15 perc), majd a felülúszókat immunprecipitáljuk, miután 2 óra hosszat inkubáltuk Protein A-Sepharose-hoz kapcsolt anti-Met ellenanyagokkal. Az immunkomplexeket háromszor mossuk A pufferrel, egyszer mossuk B pufferrel (10 mmol/1 TRIS-HC1, pH=7,4, 100 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA), majd egyszer mossuk C pufferrel (25 mmol/1 4-(2-hidroxi-etil)-l-piperazin-etánszulfonsav- (HEPES-) puffer, pH=7,2, 100 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 MgCl₂). A mintákat előfoszforilezzük, 15 percig 25 °C-on C pufferben inkubálva 10 pmol jelzetlen ATP-vel, majd háromszor mossuk hideg A pufferrel, amelyet 1 mmol/1 nátrium-orto-vanadáttal egészítettünk ki. Az immobilizált receptor és a bakulovírus által expresszált p85 közötti asszociációt az előzőkben már leírt módon hajtjuk végre [Bardelli, A. et al., Oncogene, 7, 1973-1978 (1992)]. A ΡΙ-3-kináz-holoenzimmel végzett asszociációs kísérletekhez három napig szérumra éheztetett A549 sejteket (körülbelül 2 x1ο⁶ sejt/pont) használunk a ΡΙ-3-kináz forrásaként. Az A549 sejteket Dounce-homogenizáljuk MOPS-pufferben (20 mmol/1 3-(N-morfolino)-propánszulfonsav) (pH=7,5), 1 mmol/1 MgCl₂, 0,1 mmol/1 EDTA, 200 mmol/1 szacharóz, 1 mmol/1 nátrium-orto-vanadát), amelyet 0,2 mmol/1 fenil-metil-szulfonil-fluoriddal, 1 pg/ml leupeptinnel, 0,1 TlU/ml aprotininnel és 1 pg/ml pepsztatinnal egészítünk ki. A homogenizátumokat 20 percig 4 °C-on 100 000 xg-vei centrifugáljuk. Amikor a foszfopeptideknek azt a tulajdonságát vizsgáljuk, hogy mennyire képesek blokkolni a receptorral való asszociációt, akkor a sejtlizátumokat 1 óra hosszat 4 °C-on előinkubáljuk a foszfopeptidekkel, mielőtt az immobilizált rekombináns HGF/SF receptorral inkubáljuk. Az asszociálódást követően az immunkomplexeket háromszor mossuk A pufferrel, kétszer mossuk D pufferrel (0,5 mol/1 LiCl, 100 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,6), majd kétszer mossuk B pufferrel.

A ΡΙ-3-kináz p85 alegységének a receptorimmunprecipitátumban való jelenlétét a következő módszerekkel határozzuk meg: (i) a receptor és a hozzá kötődő fehérjék jelölése [γ-³²Ρ] ATP-vel in vitro kinázassay-ben; (ii) Westem-immunblot; (iii) ΡΙ-3-kináz-aktivitási assay.

In vivő asszociációs kísérletek

A HGF/SF receptor mutánsokat expresszáló transzfektált COS-7 sejteket 10 percig serkentjük 37 °C-on 12 ng/ml HGF/SF-fel, majd A pufferben lizáljuk, 1 mmol/1 nátrium-orto-vanadát jelenlétében. A lizátumokat 15 000xg-vei centrifugáljuk (4 °C, 15 perc), majd a felülúszókat immunprecipitáljuk, miután 2 óra hosszat inkubáltuk a humán fehérjéhez kapcsolt Protein A-Sepharose-ra specifikus anti-Met ellenanyagokkal. A komplexeket kétszer mossuk A pufferrel, kétszer mossuk D pufferrel, majd kétszer mossuk B pufferrel. A receptorhoz kötött ΡΙ-3-kináz jelenlétét a komplexben a Whitman és munkatársai által ismertetett ΡΙ-3-kinázassay-vel mutatjuk ki [Whitman, M. et al., Natúré, 315, 239-242 (1985)].

In vitro kinázassay

A receptorhoz kötött fehérjéket 20 pl C pufferben jelezzük, 15 percig, 25 °C-on 10 pCi [γ-³²Ρ] ATP jelenlétében (specifikus aktivitás 7000 Ci/mmol, Amersham). A reakciót 1 ml jéghideg, proteázinhibitort nem tartalmazó A puffer hozzáadásával állítjuk le. A mintákat háromszor mossuk hideg A pufferrel. A jelzett immunkomplexeket fonásban levő Laemmli pufferrel eluáljuk a Protein A-Sepharose-ról. A felülúszókat azután 8%os SDS-poliakrilamid-gélelektroforézisnek vetjük alá (SDS-PAGE).

Westem-immunblot

Az asszociálódás utáni immunprecipitátumokat forrásban levő Laemmli-pufferrel visszük oldatba, 8%-os SDS-PAGE-val elválasztjuk, majd nitro-cellulóz-szűrőlapokra elektrotranszferáljuk (Hi-bond, Amersham). A szűrőlapokat azután a jelzett ellenanyagokkal inkubáljuk, és a specifikus kötődést az erősített kemilumineszcencia-rendszerrel (ELCTM, Amersham) mutatjuk ki.

Triptikus foszfopeptidtérképezés

Az in vitro foszforilezett vad típusú és mutáns HGF/SF receptoroknak megfelelő ³²P-jelzett csíkokat kivágjuk a poliakrilamidgélekből, és a már közölt módon kezeljük [Ferracini, R. et al., Journal of Biological Chemistry, 266, 19558-19564 (1991)]. A triptikus peptidemésztményeket 100%-os dimetil-formamidban oldjuk, 50%-ra hígítjuk HPLC-felvivőpufferrel (0,1% trifluor-ecetsav vízben), majd nagynyomású folyadékkromatográfrával (HPLC) választjuk el fordított fázisú C₂/C₁₈ Superpack Pep-S oszlopon (Pharmacia), 0-32%-os acetonitrilgradienssel, 70 perc alatt, 0,1% trifluor-ecetsav jelenlétében, 1 ml/perc áramlási sebességgel. Az eluált radioaktivitást Radiomatic A-100 radioaktív áramlási detektorral követjük (Packard Instrument Co.). Kontrollként egy szintetikus peptidet (I24K, Neosystem Laboratories) választunk el HPLC-vel, az előzőkben leírt módon, majd 214 nm-en elemezzük. Az I24K 24 aminosavat tartalmaz a Met fehéijeszekvenciából, a 1337-es izoleucintól az 1360-as lizinig, és így megfelelnek a várt, számunkra fontos foszfopeptidnek, azzal a különbséggel, hogy nincsenek foszforilezve.

Az Υ_Ι349, valamint az Y_13S6, és a p85 N-terminális, valamint C-terminális SH2 doménjei kölcsönhatásának elemzése, BIAcore felhasználásával

A konstrukciót és a BIAcore működtetésének elvét leírták [Jonsson, U. et al., Biotechniques, 11, 520-527 (1991); Jonsson U. and M. Malmquist, In F. Tumer (szerkesztők): Advances is Biosensor, 2, JAI Press, London (1992); Karlsson, R. et al., J. Immunoi. Meth., 145, 229-246 (1991)]. Az ezekben a kísérletekben használt SH2 doméneket egy Pharmacia-oszloppal sómentesítjük egy SMART kromatográfiás rendszerrel, azzal a céllal, hogy puffercserét hajtsunk végre a BIAcore-pufferhez képest, amelynek összetétele: 20 mmol/1 HEPES pH=7,4, 150 mmol/1 NaCl, 3,4 mmol/1 EDTA, 0,005% Tween 20 és 4 mmol/1 DTT. A szenzorcsip felszínére 50 pg/ml, 20 mmol/1 nátrium-acetát-pufferben (pH =4,0) készített avidint (Boehringer) immobilizálunk, 1:1 arányú N-hidroxi-szukcinimid (NHS) és N10

HU 219 813 Β etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid (EDC) eleggyel (Pharmacia). A fölöslegben levő reaktív csoportokat 1,0 mol/1 etanol-aminnal blokkoljuk. Az Y751 jelű biotinilezett foszfopeptidet (DMSKDESVDYVPMLDMK) injekciózzuk az avidin fölé 5 pg/s áramlási sebességgel, 50 másodpercig. A nemspecifikusan kötött anyagot egy rövid (4 másodperc) 0,1%-os SDS-impulzussal eltávolítjuk.

A GTS-SH2 dómén fúziós fehérjéket különböző koncentrációjú HGF/SF receptorfoszfopeptiddel keverjük össze, majd 40 percig 5 μΐ/perc sebességgel injekciózzuk a felszínre, állandó 25 °C-os hőmérséklet mellett. A felszínhez kötött anyagot 0,1%-os SDS 4 másodperces impulzusával távolítjuk el, ami a jelet alapszintre viszi vissza.

EREDMÉNYEK

Kompetíciós kísérletek szintetikus foszfopeptidekkel

A kezdeti vizsgálataink során szintetikus foszfopeptideket használtunk arra, hogy a p85-öt vagy a PI-3kinázt kiszorítsuk az in vitro asszociációs kísérletekben a rekombináns HGF/SF receptorral. A foszfopeptideket úgy terveztük meg, hogy a HGF/SF receptor citoplazmatikus részében levő összes lehetséges tirozint lefedjék. A foszfopeptideket az előzőkben felsoroltuk. Tizenhat foszfopeptid nyolc aminosavat tartalmaz, és az Nterminálison egy foszfotirozincsoporttal kezdődnek. Egy foszfopeptid tizenkét aminosavat tartalmaz, és két foszfotirozin található benne. A korábban PDGF-receptorral végzett munka azt az eredményt hozta, hogy a közvetlenül a foszfotirozin után álló négy aminosav lényeges az SH2-felismerési hely meghatározásához [Fantl, W. J. et al., Cell, 69, 413-423 (1992)].

Az 1. ábrán bemutatott kísérletben a p85 fehérjeforrásaként rekombináns bakulovírussal fertőzött rovarsejtek (Sf9) lizátumát használjuk [Otsu, M. et al., Cell, 65, 91 -104 (1991)]. Ezeket a lizátumokat megfelelően meghígítjuk (lásd Anyagok és módszerek), majd az egyes foszfopeptidekkel előinkubáljuk (10 pmol), mielőtt a HGF/SF rekombináns receptorral inkubáljuk. A receptort immunprecipitáljuk a teljes humán MET-cDNS-t hordozó rekombináns bakulovírussal fertőzött Sf9 sejtekből lizátumokkal [Bardelli, A. et al., Oncogene, 7, 1973-1978 (1992)]. Ezekben a sejtekben a receptor főleg a hasítatlan prekurzor formájában szintetizálódik (MET_Bac az ábrákon), amely azonban teljesen működőképes [Bardelli, A. et al., Oncogene, 7, 1973-1978 (1992)]. A receptort protein A-Sepharose-gyöngyökre immobilizáljuk, majd hideg ATP-vel előfoszforilezzük. Asszociáció után a gyöngyöket mossuk, majd a komplexeket foszforilezzük [γ-³²Ρ] ATP-vel. A foszforilezési reakció során mind a receptor mind a p85 jelzetté válik, és így kimutatható SDS-PAGE-val. Az 1. ábrán látható, hogy a foszfopeptidek közül csak három szorította le hatékonyan a p85-öt: H-Tyr*-Glu-Val-Met-Leu-LysCys-Trp-OH, H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-TyrOH, és a H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH. A H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr*-Tyr-Val-AsnVal-Lys-OH is teljesen megakadályozza a p85 kötődését, míg a H-Tyr*-Cys-Pro-Asp-Pro-Leu-Tyr-Glu-OH csak részben hatékony. A 2. ábrán bemutatott kísérletben azt akartuk durván meghatározni, hogy ezeknek a foszfopeptideknek mennyi a relatív affinitásuk a p85höz. A kísérletet ugyanúgy hajtottuk végre mint az előzőt, de a foszfopeptideket 10 nmol és 1 pmol közötti koncentrációkban alkalmaztuk. A p85 leszorításának hatékonysága legmagasabb volt a H-Tyr*-Glu-Val-MetLeu-Lys-Cys-Trp-OH esetében, ezt követte a H-Tyr*Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH, a H-Tyr*-Val-HisVal-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH és a H-Tyr*-Cys-Pro-AspPro-Leu-Tyr-Glu-OH.

A H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-Val-AsnVal-Lys-OH a p85-höz való affinitása szempontjából összemérhetőnek tűnt a H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-CysVal-Ala-OH-val.

Mivel a pl 10 katalitikus alegységgel való kölcsönhatás érintheti a p85 konformációját, ezek az eredmények nem tükrözhetik a p85 SH2 doménjének igazi tulajdonságait a komplexben. Ennek a lehetőségnek a kizárására ugyanazt a típusú kompetíciós kísérletet végeztük el, a ΡΙ-3-kináz-holoenzim forrásaként az A549 sejtek lizátumát használva. A holoenzim és a rekombináns receptor közötti asszociációt úgy tettük láthatóvá, hogy mértük a ΡΙ-3-kináz-aktivitást a receptorkomplexekben. A 3. ábrán látható, hogy a foszfopeptidek, amelyek képeseknek bizonyultak arra, hogy kiszorítsák a p85-öt, zavarják a ΡΙ-3-kináz-holoenzimnek a HGF/SF receptorhoz való kötődését is. A pontosság kedvéért meg kell jegyeznünk, hogy a mind az 1349-es, mind a 1356-os foszfotirozint tartalmazó foszfopeptid sokkal hatékonyabbnak tűnt a ΡΙ-3-kináz-holoenzimnek a HGF/SF receptorról való leszorításában, mint azok, amelyek csak egy ilyen csoportot tartalmaztak.

Ennek az első kísérletsorozatnak az eredményei azt sugallják, hogy feltehetőleg létezik egy kettős kötőhely a ΡΙ-3-kináz számára a HGF/SF receptorban, amely az 1307-1313 és az 1349-1356 foszfotirozinpárokat tartalmazza. Azt, hogy foszfotirozincsoportok párosával játszhatnak szerepet, a PDGF-receptomál mutatták ki, ahol a Tyr₇₄₀-ről és a Tyr₇₅₁-ről ismert, hogy a PI-3kináz kötési helyét jelentik [Fantl, W. J. et al., Cell, 69, 413-423 (1992); Kazlauskas, A. et al., Mól. Cell, Bioi., 12, 2534-2544 (1992)].

A ΡΙ-3-kináz-holoenzim asszociációja a HGF/SF receptor Tyr/Phe mutánsaival

A vad típusú receptor-cDNS-ből egy sorozat konstrukciót készítettünk helyspecifikus mutagenezissel, a szakterületen jártas szakember számára jól ismert módszerekkel. Ezeket a konstrukciókat tranziensen expreszszáljuk COS-7 sejtekben, hogy megkapjuk a megfelelő Tyr-Phe receptormutánsokat, azaz a Phe₁₀₀₃, Phe₁₃₀₇, Phe₁₃₁₃, Phe₁₃₄₉, Phe₁₃₅₆ és Phe₁₃₆₅ mutánsokat.

Az egyes aminosavak helyettesítése mellett néhány többszörös helyettesítést is elvégeztünk. Pontosabban, azokat a kétszeres mutánsokat állítottuk elő, amelyek ahhoz szükségesek, hogy megvilágítsuk a kompetíciós kísérletek eredményeit: a Phe|_3O7_₁₃₎₃ és a Phe₁₃₄₉_₁₃₅₆ mutánsokat.

A 4. ábrán láthatók egy, az 1. ábrán bemutatotthoz hasonló asszociációs kísérlet eredményei, amelyet ugyanazzal a p85-forrással (Sf9 sejtek expressziója) vé11

HU 219 813 Β géziünk el, és transzfektált COS-7 sejteket használtunk a vad típusú és mutáns HGF/SF receptorok forrásaként. A transzfektált COS-7 sejtek 1:1 arányban expresszálják az egyláncú receptorprekurzort, valamint a proteolitikusan processzált érett formát. Az asszociációs reakció után a mintákat kettéosztjuk, és eltérően dolgozzuk fel, így kapjuk az A és B paneleken látható eredményeket. Az A penelen mind a receptort mind a p85-öt kinázassay-vel tesszük láthatóvá. Ez a panel azt mutatja, hogy a mutáns receptorok mind aktívak, és összemérhető mennyiségben vannak jelen. Míg az összes többi mutáns (és különösen a Phe₁₃₄₉_₁₃₅₆ mutáns) még kötődik, és foszforilezi a p85-öt, csak a Phei₃₄₉_₁₃₅₆ kettős mutáns nem teszi ezt. A B panelből az asszociáció után a kinázassayt kihagytuk, a mintákat SDS-PAGE-val futtattuk és nitro-cellulóz-membránra vittük át. A Westem-blotot azután a p85-re specifikus monoklonális ellenanyagokkal kezeltük. Ez a kísérlet megerősíti, hogy csak a mutáns Phe₁₃₄₉_₁₃₅₆-nek veszett el a képessége arra, hogy kötődjön a p85-höz. Meg kell jegyeznünk, hogy az A és B panelt összehasonlítva, a Phe₁₃₅₆ mutáns, jóllehet még képes megkötni a p85-öt, úgy tűnik, hogy nem képes foszforilezni azt. Ez azt sugallja, hogy az ezzel a receptormutánssal képzett komplexben a p85 nem helyezkedik el pontosan a hatékony foszforilezéshez.

Az 5. ábra azt mutatja, hogy hasonló eredmények kaphatók in vivő. Ebben a kísérletben a receptort HF/SF stimuláció után transzfektált COS-7 sejtek lizátumaiból immunprecipitáljuk. A lízist és az immunprecipitációt nátrium-orto-vanadát jelenlétében hajtjuk végre, hogy ezzel megakadályozzuk a receptor defoszforileződését. Egy ΡΙ-3-kinázassay-t végzünk a receptorimmunprecipitátumokon, a Met fehérjetartalomra ekvalizálva, hogy meghatározzuk a receptorral komplexben kicsapódott endogén ΡΙ-3-kináz mennyiségét. Csak a Phei₃₄₉_i₃₅₆ kettős mutáns koprecipitálódott kevesebb ΡΙ-3-kináz-aktivitással, mint amennyi a vad típusú receptorhoz kapcsolódik. A Phe₁₃₄₉_₁₃₅₆ kettős mutánshoz kötött maradék aktivitás valószínűleg annak a következménye, hogy receptordimerek képződnek a COS-7 sejtekből származó endogén Met fehérjével. Ezt a magyarázatot alátámasztja az a tény is, hogy ugyanilyen mennyiségű reziduális kötődés van jelen azokban az immunprecipitátumokban is, amelyeket egy kinázinaktív mutánssal (TK-, 5. ábra) transzfektált COS-7 sejtekkel kapunk.

Ennek a második kísérletsorozatnak az eredményei azt mutatják, hogy az Y₎₃₄₉ és az Y₁₃₅₆ csoportok befolyásolják a ΡΙ-3-kináznak a HGF/SF receptorhoz való kötődését, míg az Y_13e7 és az Y₁₃₁₃ csoportok nem.

A vad típusú és mutáns receptorok foszfopeptidtérképezése

A mutáns receptorokkal kapott eredmények azt hozzák magukkal, hogy az 1349-es és 1356-os tirozinok in vivő foszforileződnek. Egy szintetikus pepiidet készítettünk (I24K), amely megfelel az ezt a két csoportot tartalmazó triptikus pepiidnek. Ennél a pepiidnél a vizes és szerves oldószerek kombinációjára volt szükség a legjobb termeléshez, és az elválasztásra használt HPLCoszlopról nagyon hosszú idő elteltével jött csak le (lásd a 6. ábra A paneljét). Ha ugyanezt az eljárást használjuk egy vad típusú, in vitro foszforilezett receptorból kapott triptikus emésztmény futtatására, kapunk egy olyan csúcsot, amelynek elúciós ideje nagyon közel van ahhoz, amit a nem foszforilezett I24K peptiddel kaptunk (6. ábra, B panel). Ez az új csúcs hiányzik a kettős mutánsból (6. ábra, C panel), és csökken a mennyisége az egyszeres mutánsokban (nem közölt eredmény). Mindegyik receptort COS-7 sejtekben expresszáltuk és in vitro foszforileztük a triptikus emésztés előtt.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az 1349-1356-os tirozinok valóban in vitro foszforilezési helyek, és az 5. ábrán bemutatott asszociációs kísérletekkel kombinálva erősen azt sugallják, hogy ugyanezek a tirozincsoportok in vivő is foszforilezési helyek. Az 1349-es és 1356-os foszfotirozincsoportoknak a p85 N- és C- SH2 doménjeihez való relatív affinitásának kiértékelése

Mivel két SH2 dómén van jelen a p85-molekulában, a ΡΙ-3-kináz-kötődés eltörléséhez eliminálni kell a két foszfotirozint a HGF/SF receptorból, ezért egy olyan modell a valószínű, amelyben az egyes SH2 domének kölcsönhatásba lépnek az egyes tirozinokkal [Kashaishian, A. et al., EMBO J., 11, 1372-1382; Kavanaugh, W. M. et al., Mól. Cell. Bioi., 12, 3415-3424 (1992)].

Ennek következtében érdekes dolog megmérni a két foszfopeptidnek a p85 N-terminális és C-terminális SH2 doménjéhez való relatív affinitását. Először a BIAcore-berendezéssel végzett biospecifikus kölcsönhatás-elemzéssel próbáltuk ezt megtenni [Jonsson, U. et al., Biotechniques, 11, 520-527 (1991); Jonsson U. and M. Malmquist, In F. Tumer (szerkesztők): Advances is Biosensor, 2, JAI Press, London (1992); Karlsson, R. et al., J. Immunoi. Meth., 145, 229-246 (1991)]. A foszfopeptideknek a mátrixhoz való közvetlen, illetve biotinilezés után a mátrixra immobilizált avidinhez való kötődése nem adott szignifikáns választ. Ez valószínűleg annak a ténynek a következménye, hogy ezekben a peptidekben az N-terminálison van a foszfotirozin, és az immobilizáció megzavarja a kötési képességét. Ezért az affinitási méréseket indirekt módon végeztük, mérve a foszfopeptideknek azt a tulajdonságát, hogy mennyire képesek az SH2 doméneknek egy immobilizált, a 751es foszfotirozint Y₇₅₁ tartalmazó foszfopeptiddel való kölcsönhatását gátolni egy humán PDGF-receptorban, és kimutattuk, hogy nagy affinitásuk van a két SH2 doménhez. A p85 N-terminális és C-terminális SH2 doménjeit különböző koncentrációjú Met foszfopeptiddel kevertük össze, majd immobilizált Y751 foszfopeptidekre injekcióztuk. A 7. ábrán láthatók ezeknek a kísérleteknek az eredményei, az Y751-es foszfopeptidhez való kötődés %-ában kifejezve. Jóllehet nem volt lehetséges ezeknél a kölcsönhatásoknál az abszolút affinitások meghatározása, azoknak az értékeknek az összehasonlítása, amelyeknél a maximális gátlás felét lehetett elérni, hasznos információkat nyújtott a relatív affinitásokról. Az adatok összefoglalása a C panelben látható. A legmagasabb látszólagos affinitást az Y,₃₁₃ foszfo12

HU 219 813 Β peptid mutatta, amely a kanonikus YXXM motívumot tartalmazza. Az Y₎₃₄₉ és Y₁₃5₆ foszfopeptidek, amelyek tartalmazzák a nem konvencionális YVXV kötőhelyet, szintén gátolják a p85 N-terminális és C-terminális SH2 doménjeinek az Y751 foszfopeptidhez való kötődését, 5 de magasabb koncentrációkban. Az összes foszfopeptid, de legnyilvánvalóbb módon az Y₁₃₁₃, magasabb affinitást mutat a C-terminális SH2-höz, mint az N-terminális SH2-höz. Ezek az adatok összhangban vannak azokkal az adatokkal, amelyeket a 2. ábrán bemutatott 10 kísérletben kaptunk, és azt mutatják, hogy legalábbis in vitro és a mi kísérleti körülményeink között, a Tyr-ValXxx-Val új kötési motívum (YVXV) két nagyságrenddel kisebb affinitással rendelkezik a p85-höz mint a kanonikus konszenzusszekvencia.

5. példa

A TPR-MET tyr-phe mutánsok transzformálóaktivitása

A 4. példában ismertetett kísérletekkel a HGF/SF re- 20 ceptor (amelyet a MET protoonkogén kódol) 1349-es és 1356-os pozícióiban levő tirozincsoportokat azonosítottuk mint dokkolási helyeket a ΡΙ-3-kináz és feltehetőleg további citoplazmatikus transzducerek begyűjtése és aktiválása számára. Amikor permanensen aktiválva vannak, akkor a transzducerek a mitogén szignálok folyamatos effektoraiként működnek, így hajtva végre a sejt onkogén transzformációját.

Abból a célból, hogy demonstráljuk a HGF/SF receptor 1349-es és 1356-os pozíciójában levő tirozincsoportok fontosságát az onkogén transzformációhoz vezető folyamatban, kihasználtuk a TPR-MET-molekulát, a MET protoonkogén permanensen aktivált formáját [Gonzatti-Haces et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 21-25 (1988)]. A TPR-MET az 1-es kromoszómán levő TPR-szekvencia és a 7-es kromoszómán levő MET-szekvencia közötti DNS-átrendeződésből származik. A TPR-MET-terméknek van egy konstitutív tirozinkináz-aktivitása, amely az NIH 3T3 fibroblasztok transzformálásáért felelős.

Hely specifikus mutagenezissel a TPR-MET-molekula 1349-es és 1356-os pozíciójában levő tirozincso15 portot fenil-alaninra mutáltattunk.

A TPR-MET vad típusú protoonkogént, valamint a mutált formákat, a TPR-MET-Phe|₃₄₉-et, a TPRMET-Phe ₁₃₅₆-ot és a TPR-MET-Phe₁₃₄₉_₁₃₅₆-ot használtuk egy fókuszképző vizsgálatban. Ebben a vizsgálatban Fisher-patkány ok fibroblasztjait transzfektálunk kalcium-foszfát-eljárással pXMT2-plazmidba [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)] klónozott különböző TPR-MET-konst25 rukciókkal. A sejteket 5% borjúmagzatszérumban növesztjük, majd a fókuszokat 10 nap elteltével megszámláljuk. Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaljuk össze és a 9. ábrán illusztráljuk.

	TPR MET	TPR-MET* Phe1349	TPR-MET* Phe1356	TPR-MET* Phe1349 1356
Transzformálóaktivitás (fókusz/gg DNS/105 sejt	800	600	40	0
Kinázaktivitás	+	+	+	+

Amint az a fenti táblázatból vagy a 8. ábrából látható, a Tyr₁₃₄₉, de főleg a Tyr¹³⁵⁶ mutációja lényeges csökkenést okoz a transzformálódó fókuszok számában.

Emellett, amikor mindkét Tyr csoportot fenil-alaninra mutáltatjuk, a TPR-MET transzformálóaktivitása teljesen megszűnik.

Ezek az adatok tovább igazolják, hogy ezeknek a helyeknek biológiai fontosságuk van, a mitogén szignál intracelluláris transzdukciójában.

A találmány szerinti foszfopeptidek, amelyek képesek az intracelluláris transzducereknek a HGF/SF receptor Tyr₁₃₄₉-es és Tyr₁₃₅₆-os csoportjaihoz való kötődését megakadályozni, ennélfogva potenciális inhibitorai az onkogén transzformációnak.

6. példa

Anyagok és módszerek

Sejtvonalak

Tüdőkarcinóma A549-es sejteket és COS-1 sejteket rutinszerűen szaporítunk 10% FCS-sel kiegészített RPMI táptalajban. A PA318 amfotróp víruspakoló sejtvonalat [Miller and Buttimore, Mól. Cell. Bioi., 6, 2895-2902 (1986)] és a Psi-2 ekotróp víruspakoló sejtvonalat [Mann et al., Cell, 33, 143-159 (1983)] Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajban tartjuk fenn, amelyet 10% FCS-sel egészítünk ki.

Monoklonális ellenanyagok és poliklonális antiszérumok

Anti-Shc poliklonális antiszérumot nyulak baktériumban expresszált Shc SH2 doménnel való immunizációjával állítunk elő. Egy PML peptid ellen anti-TAGszérumot készítünk [Pandolfi et al., Oncogene, 6, 1285-1292 (1991)]. A foszfotirozin elleni monoklonális ellenanyagokat az Upstate Biotechnologytól vásároljuk. Anti-MET ellenanyagokat a humán Met fehéije 19 C-terminális aminosavának megfelelő szintetikus peptidje ellen készítünk (Data Bank referenciaszám X54559).

Immunorecipitáció és Westem-blot-eljárások

Lizátumokat készítünk szérumra éheztetett és SF/HGF-fel kezelt A549 sejtekből. A sejteket jégen lizáltatjuk PY-pufferben (20 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,8, 50 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 NaF, 30 mmol/1 Na₄P₂O₇, 5 mmol/1 EGTA, 1 mmol/1 nátrium-orto-vanadát, 1 térfogat/térfogat% Triton X-100), amely frissen hozzáadott proteázinhibitorokat tartalmaz (1 mmol/1 fenil-metil-szul13

HU 219 813 Β fonil-fluorid, 10 mg/ml leupeptin és 5 mg/ml aprotinin). A lizátumokat centrifúgálással üledékmentesítjük (4 °Con), majd a fehérjekoncentrációt BCA-reagenssel határozzuk meg (Pierce). Az immunprecipitációs kísérletekhez a megfelelő ellenanyagokat Protein A-Sepharose-ra adszorbeáltatjuk (Pharmacia), majd sejtlizátumokkal inkubáljuk 1,5 óra hosszat 4 °C-on. Az immunkomplexeket háromszor mossuk jéghideg NET-pufferrel (50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,5,150 mmol/1 NaCl, 0,1% NP-40,1 mmol/1 EDTApH=8,0,0,25% zselatin), eluáljuk, majd 3 percig 95 °C-os redukáló Laemmli-pufferben tartva hővel denaturáljuk; a fehérjéket azután SDS-PAGE-val elválasztjuk. Az immunblotelemzéshez vagy a specifikus immunprecipitátumokat vagy 20-50 mg sejtösszlizátumot viszünk át nitro-cellulóz szűrőlapokra, SDS-PAGE után. Az aspecifikus aktivitás TBST-ben (20 mmol/1 TR1S-HC1 pH = 7,8, 150 mmol/1 NaCl, 0,02% Tween 20) oldott, 2%-os zsírmentes száraz tejjel való blokkolása után (1 óra inkubálás 22 °C-on) a szűrőlapokat 2 óra hosszat 22 °C-on TBST-ben hígított specifikus ellenanyagokkal hozzuk össze. Az alapos mosás után az immunkomplexeket torma-peroxidázzal konjugált fajspecifikus szekunder antiszérummal hozzuk össze (BioRad), amit erősített kemilumineszcenciareakció követ (ECLTM, Amersham). cDNS helyspecifikus mutagenezis és expresszió

A ΜΕΤ-cDNS klónozását korábban leírták [Ponzetto et al., Oncogene, 6, 553-559 (1991); EMBL Data-Bank referenciaszáma X54559]. A 2355-ös nukleotidtól a molekula végéig tartó 3’-fragmenst pSELECT™-1-plazmidban szubklónozzuk. A hely specifikus mutagenezist egy in vitro oligonukleotid helyspecifikus mutagenezis-rendszerrel végezzük (Altered Sites™ in vitro Mutagenesis System, Promega). Az oligonukleotidokat egy Applied Biosystem 391 berendezéssel szintetizáljuk meg. A mutáns kiónokat szekvenálással azonosítjuk (T7 szekvenálókít a Pharmaciától). A teljes méretű MET-cDNS-eket, amelyek a megfelelő Tyr-Phe mutációt tartalmazzák, a PMT2-vektorban rekonstruáljuk, amely a késői, fő adenovírus promotert tartalmazza. Mindegyik plazmidot lipofectinnel (GIBCO BRL) transzfektáljuk COS-1 sejtekbe. Az Y³¹⁷-F mutációt hordozó Shc-cDNS-t az LXSN emlősexpressziós vektorba klónozzuk. A mutáltatott cDNS-t egy idegen epitoppal jelezzük, a PML cDNS-nek [Pandolfi et al., Oncogene, 6, 1285-1292 (1991)] egy 162 bp méretű fragmensét leolvasási fázisban fuzionáltatva vele. A jelzett cDNS kódolja a PML-jelzett Shc 53 és 58 kD fehérjéket, alternatív iniciáció alkalmazásának következtében. Ennek a konstrukciónak a részletes leírását máshol közöljük [Salcini et al., publikálás alatt]. Az expressziós vektort együtt transzfektáljuk egy neomicinrezisztencia-génnel az A549 sejtekbe, kalcium-foszfát-technika alkalmazásával. A jelzett Shc fehérjéket expresszáló stabil sejtvonalakat G428-cal szelektáljuk.

In vitro kötési vizsgálatok GST-fuziós fehérje alkalmazásával

A Grb2-cDNS SH2 doménjének megfelelő régióját (a 256-os nukleotidtól az 551-es nukleotidpozícióig) polimeráz-láncreakcióval (PCR) izoláljuk, majd a pGEX-2T bakteriális expressziós plazmid BamHI-EcoRI hasítási helyére klónozzuk (Gst-Grb2). A GST-t, GST-Grb2-t vagy GST-Shc-t expresszáló baktériumok tenyészeteit [Segatto et al., Oncogene, 2105-2112 (1993)] 3-4 óra hosszat szaporítjuk 37 °C-on 1 mmol/1 IPTG-t tartalmazó LB táptalajban. A baktériumokat centrifugáljuk, újraszuszpendáljuk 1/100 térfogat jéghideg PY-pufferben, amely nem tartalmaz Triton™-t, majd ultrahangos besugárzással lizáltatjuk. 1% Triton X-100 hozzáadása után a lizátumokat centrifúgálással üledékmentesítjük. A rekombináns fehérjéket glutation-Sepharose™-re (Pharmacia) tisztítjuk, majd így használjuk a kötési vizsgálatokban. Minden egyes reakcióban körülbelül 5 pg, glutation-Sepharose-hoz kötött GST-t, GST-Grb2-t vagy GST-Shc-t inkubálunk 2 óra hosszat 4 °C-on 300 mg, PY-pufferben készített megfelelő sejtlizátummal. A fehéijekomplexeket ötször mossuk jéghideg PY-pufferrel, eluáljuk, majd denaturáljuk, 3 percig 95 °C-on tartva Laemmli-pufferben, SDS-PAGE-val elválasztjuk és immunblottal elemezzük.

Az Shc fehérjék túlexpressziója

Az LSHCSN plazmidot úgy állítjuk elő, hogy az Shc-t kódoló szekvenciát [Pelicci et al., Cell, 70, 93-104 (1992) az LXSN retrovírusplazmid EcoRI restrikciós hasítási helyére klónozzuk [Miller et al. (1989); D. Miller ajándéka]. Az LXsn vagy LSHCSN plazmidokat a PA317 retrovíruspakoló sejtvonal Y2-jébe transzfektáljuk a kalcium-foszfát-kicsapási eljárással [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)]. 48 óra elteltével az Y-2 felülúszókat használjuk a PA317 fertőzésére. A sejteket azután G418-at tartalmazó táptalajjal szelektáljuk, határhigítási körülmények között. Egy vírustermelő kiónt szelektálunk, az exogén Shc-expresszió magas szintje és a vírustiter alapján, majd a célsejtek fertőzésére használjuk.

B1A core-elemzés

Az SH2-domén-kölcsönhatások BIAcore-berendezéssel (Pharmacia) végzett kinetikai mérései elvégzésének alapelveit, valamint módszereit korábban részletesen publikálták [Panayotou et al., Mól. Cell. Bioi., 13, 3567-3576 (1993); Ponzetto et al., Mól. Cell. Bioi.; 13, 4600-4608 (1993)]. A tisztított GST-SH2 doméneket vagy érintetlen fehérjéket BIAcore-futtatópufferben sómentesítjük (20 mmol/1 HEPES pH=7,4, 150 mmol/1 NaCl, 3,4 mmol/1 EDTA, 0,005% Tween 20 és 4 mmol/1 DTT), majd avidinimmobilizált, biotinilezett foszfopeptidekre injekciózzuk. Az immobilizált foszfopeptidek mennyiségét normalizáljuk, az antifoszfotirozin ellenanyagok kötődését mérve. Az asszociációt egy fehérjekoncentráció-tartományban mérjük, és a megkötött anyag disszociációját vagy pufferáramban vagy 20 pmol/l versengő, nem biotinilezett foszfopeptid injekciózásával hagyjuk lejátszódni. A peptid- és fehéijekoncentrációkat egy Applied Biosystem aminosavelemzővel végzett aminosavelemzéssel végezzük el.

A sejtnövekedés és -motilitás

2,5 xlO³ sejtet szélesztünk 96 lukas lemezekre (Costar), 10% FCS-t (Flow) tartalmazó DMEM táptalaj14

HU 219 813 Β bán. 24 óra elteltével a táptalajt eltávolítjuk, és 5% FCS-t tartalmazó DMEM-mel helyettesítjük, amely nagyon eltérő mennyiségű SF/HGF koncentrációt (1-10 ng/ml) tartalmaz. A sejtszámot kristályibolyával való festés után kolorimetriás vizsgálattal határozzuk meg [Kueng et al., Anal. Biochem., 182, 16-19 (1989)]; a sejteket 595 nm-en egy Microplate Readerrel (Model 3550, BioRad) olvassuk le. A kemotaxisvizsgálatokhoz vaklukas Boyden-kamrákat és poli(vinil-pirrolidon)-mentes polikarbonátszűrőket (13 mm, 8 pm-es pórusok) vásárolunk a Nucleopore-tól. A kemotaxisvizsgálatokat az előzőkben leírt módon [Albini et al., Cancer Research, 47, 3239-3245 (1987)]. A sejteket 5[¹²⁵I]jód-2’-dezoxiuridinnel (3 pCi/ml, 1 n RPMI 1640 táptalaj plusz 10% FCS). 16-20 órás inkubálás után a sejteket tripszinizáljuk, majd háromszor mossuk FCS-mentes táptalajjal, 3 χ 10⁵ sejtet FCS-mentes táptalajban szuszpendálunk, majd a Boyden-kamrák felső részébe szélesztjük; az alsó kamrákba SF/HGF-et vagy nem tartalmazó, vagy 5-40 egység SF/HGF-et tartalmazó FCS-mentes táptalajt adunk. A Boyden-kamrákat 6 óra hosszat 37 °C-on 5% CO₂-t tartalmazó, vízzel telített atmoszférában inkubáljuk. A szűrőlapok felső részéhez kapcsolódó sejteket az inkubálás után mechanikusan eltávolítjuk, míg a szűrőlapokat az alsó félre vándorolt sejtekkel fixáljuk, és egy γ-számlálóval megmérjük.

Eredmények

Az Shc fehérjék az SH2 doménen keresztül kötik a tirozinen foszforilezett SF/HGF receptort

Az A549 tüdőkarcinóma-sejtek funkcionális SF/HGF receptorokat és három Shc izoformát, 46, 52 és 66 kD molekulasúlyban expresszálnak. Annak vizsgálatára, hogy a foszforilezett SF/HGF receptor és az Shc forma in vivő stabil komplexet képez-e, az SF/HGF-fel kezelt sejteket immunprecipitáljuk anti-Met ellenanyaggal és immunblotoljuk anti-Shc ellenanyagokkal. Az Shc fehérjék együtt csapódnak ki az SF/HGF receptorral (1A. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk tükörkísérletekben, amelyekben az SF/HGF-fel kezelt A549 sejtek lizátumaiból származó anti-Shc immunprecipitátumokat antireceptor (anti-Met) ellenanyagokkal mint próbával vizsgáljuk meg. Az Shc fehéijék együtt csapódnak ki az SF/HGF receptorral (1B. ábra). Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy az SF/HGF receptor és az Shc asszociálódik az SF/HGF-fel serkentett sejtekben.

Annak további igazolására, hogy az SF/HGF receptor és az Shc fehéijék közötti asszociáció erősen függ a receptor tirozinfoszforileződésétől, hasonló kísérleteket hajtottunk végre vagy vad típusú SF/HGF receptort, vagy egy kinázdefektív receptormutánst kódoló cDNS-t (Lys^ll0-A) tranziensen expresszáló COS-1 sejtlizátumokkal. Amint azt korábban leírták (Longati et al., in press), a COS-1 sejtekben túlexpresszált vad típusú receptor konstitutíven foszforileződik in vivő, míg a kinázinaktív Lys^ll0-A mutáns nem foszforileződik (2A. és 2B. ábrák). A transzfektált receptor és az endogén Shc közötti stabil komplexek csak a vad típusú tirozinfoszforilezett receptorokat expresszáló COS-1 sejtekben jöttek létre (2C. ábra). Az Shc-SF/HBF receptor-kölcsönhatást úgy is vizsgáltuk, hogy a komplexet in vitro is létrehoztuk, az Shc SH2 doménjét használva, amelyet baktériumban expresszáltunk GST fúziós fehérje formájában. Az immobilizált Shc-SH2 dómén stabilan asszociálódott az SF/HGF-fel kezelt A549 sejtekből oldatba vitt tirozin-foszforilezett receptorral, de nem asszociálódott a kontrollsejtekből oldatba vitt, nem foszforilezett receptorral (3 A. ábra). A kontroll-GST-fehéijével végrehajtott kötési vizsgálatok negatívak voltak. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az Shc SH2 doménje elegendő ahhoz, hogy az autofoszforilezett SF/HGF receptor in vitro kötődjön.

Az Shc fehérjék kötődnek az SF/HGF receptorfarok Y¹³⁴⁹ g_S γΐ355 foszfotirozinjeihez

A vad típusú és mutáns SF/HGF receptor foszfopeptidtérképezésével kimutattuk, hogy a receptor C-terminális farkában található két csoport (Y¹³⁴⁹ és Y¹³⁵⁶) foszforileződik a ligandum megkötésére adott válaszként [Ponzetto et al., Mól. Cell. Bioi., 13, 4600-4608 (1993)]. Ezeknek a helyeknek az Shc-vel való kölcsönhatásnak a közvetítésében játszott szerepét asszociációs kísérletekkel vizsgáljuk, receptormutánsokkal, amelyekben vagy az egyik, vagy a másik vagy mindkét tirozin fenil-alaninra van mutáltatva (Y¹³⁴⁹-F, Y¹³⁵⁶-F, vagy Y¹³⁴⁹, ^|356-F). Amint azt korábban igazoltuk, az ezeken a helyeken egyedi vagy kombinált mutációkat hordozó receptormolekulák természetes tirozinkinázaktivitással rendelkeznek [Ponzetto et al., Mól. Cell. Bioi., 13, 4600-4608 (1993)]. A COS-1 sejteket olyan konstrukciókkal transzfektáljuk, amelyek a receptormutánsokat expresszálják és anti-Shc ellenanyagokkal immunprecipitáljuk; az immunprecipitátumokat ant-Met receptor-ellenanyagokkal blotoljuk. Az Y'³⁴⁹-F és az Y^l356-F egyedi mutáns receptoroknak az endogén Shcvel való asszociációs képessége csak egy kicsit alacsonyabb, mint a vad típusú receptoré, illetve mint egy irreleváns (Y¹⁰⁰³-F) mutációt hordozó kontrollreceptoré. Ezzel szemben az Y¹³⁴⁹· i356.p kettős mutáns teljesen elvesztette azt a képességét, hogy megkösse az Shc fehérjéket (4. ábra).

Az Shc SH2 doménje és az Y¹³⁴⁹ vagy Υ·³⁵⁶ foszfotirozin közötti közvetlen kölcsönhatást real-time Biosensor elemzéssel erősítettük meg [Panayotou et al., Mól. Cell. Bioi., 13, 3567-3576 (1993); Felder et al., Mól. Cell. Bioi., 13, 1449-1455 (1993)]. A receptor farokszekvenciájából származó VNATY^1356VNVK szintetikus foszfopeptidet specifikusan köti az Shc affinitástisztított GST-SH2 doménje (5. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk az 1GEHY¹³⁴⁹*VHVN peptiddel. Mindkét esetben az affinitáskonstans, a disszociációs sebességi állandó (K_diss) és az asszociációs sebességi állandó (K_ass) arányából számítva, túl magas volt ahhoz, hogy pontosan meg lehetett volna határozni.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy az Shc alacsony affinitással kötődik az SF/HGF receptorfaroknak mind az 1349-es, mind az 1356-os tirozinjához.

Az Shc fehérjék túlexpressziőja fokozza az SF/HGF-re adott motogenikus választ

Az SF/HGF motogenikus hatású az epiteliális sejtekre, amelyek a serkentés után keresztülvándorolnak a

HU 219 813 Β vaklukú Boyden-kamrák szűrőlapjain [Giordao et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 90, 649-653 (1993)]. Az Shc hatását a motogenikus válaszra a fehérje A549 sejtekben való túlexpressziójával vizsgáltuk. A sejteket az Shc-cDNS-t hordozó amfotróp vírussal fertőzzük, majd a különböző fertőzöttsejt-populáció közül néhányat kiválasztunk, mivel magas szinten expresszálják az Shc-t, az anti-Shc ellenanyagokkal végzett Westem-blot-elemzés alapján.

Az Shc fehérjéket túlexpresszáló A549 sejtek motogenikus válasza jelentősen magasabb, mint amelyet a kontroll-, fertőzetlen sejtek adnak, illetve mint amelyet a csak a vektorral fertőzött sejtek adnak (6. ábra, alsó panel). Az Shc-t túlexpresszáló sejtek által az SF/HGF-re adott erősebb válaszok megfigyelhetők mindegyik vizsgált ligandumkoncentrációnál (6. ábra, felső panel).

A mitogénválaszt vagy a sejtszámok, vagy a timidinbeépülés alapján mérjük. Az Shc A549 sejtekben való túlexpressziója nincs hatással a sejtek növekedésére, sem az SF/HGF-re, sem a szérumra adott válaszként. Hasonlóképpen, az SF/HGF által a Ras-ra gyakorolt indukált guaninnukleotid-kicserélő aktivitást, amelyet az előzőkben leírt módon mérhetünk [Graziani et al., Journal of Biological Chemistry, 268, 9165-9168 (1993)], nem érintette jelentős mértékben az exogén Shc túlexpressziója.

Az Shc fehérjék az Y^3l7-en foszforileződnek az Sf/HGF receptorhoz való kötődés után

Annak meghatározására, hogy az Shc az SF/HGF receptorkináz aktiválódására adott válaszként foszforileződik-e, A549 sejteket serkentünk SF/HGF-fel, lizáljuk, immunprecipitáljuk anti-Shc-vel és immunblottoljuk antifoszfotirozin-ellenanyagokkal. A p46^Shc, p52^shc és p66^shc tirozinfoszforileződésében jelentős növekedés volt kimutatható az A549 sejtekben ötperces serkentés után (IC. ábra), jelezve, hogy az Shc az SF/HGF receptor egy szubsztrátja. Hasonló kísérleteket végeztünk az Sf/HGF receptorokkal transzfektált COS-1 sejtekkel. A vad típusú (konstitutíven aktív) receptorkinázt túlexpresszáló sejtekben az endogén Shc fehérjék tirozinfoszforilezve vannak. Az Shc azonban nem foszforileződött a Lys¹¹⁰-A kináznegatív receptorral transzfektált COS-1 sejtekben (2D. ábra).

Foszfopeptidtérképezéssel és mutációs elemzéssel ki lehetett mutatni, hogy az EGF-fel kezelt sejtekben az Shc fő foszforilezési pontja az Y³¹⁷ (Salchini et al., in preparation). Annak igazolására, hogy ugyanez a csoport SF/HGF kezelés után is foszforileződik, egy jelzett SHC-cDNS-t, amely az Y³¹⁷-F mutációt tartalmazza, A549 sejtekben expresszálunk. Ezekben a sejtekben SF/HGF kezelés után az Y³¹⁷-F mutáns, amely szelektíven immunprecipitálódott anti-„tag” ellenanyagokkal, nem volt foszforilezve a tirozinon (ID. ábra).

Az Y^il7-en foszforilezett Shc fehérjék specifikus komplexeket képeznek a Grb2 „adapterrel

Annak lehetőségét, hogy az SF/HGF indítja be egy Shc-Grb2 komplex képződését A549 sejtekben SF/HGF serkentést követően, úgy ellenőriztük, hogy az anti-Shc immunprecipitátumokat anti-Grb2 ellenanyagokkal Westem-blotban vizsgáltuk. Amint az 1E. ábrán látható, az SF/HGF-re adott válaszként foszforileződő Shc fehéije a Grb2-vel asszociálódik. Ezt az asszociálódást a Grb2 SH2 doménje közvetíti, amint az az in vitro kísérletekből látható, amelyeket a Grb2 (baktériumban GST fúziós fehérjeként expresszálva) immobilizált SH2 doménje és a kontroll- vagy SF/HGF-fel serkentett A549 sejtekből készített lizátumok felhasználásával végeztünk. A Grb2 fúziós fehérje által megkötött Shc mennyisége jelentősen fokozódik az SF/HGF serkentést követően (3B. ábra).

Ennek a kölcsönhatásnak a kinetikai paraméterei és disszociációs konstansai egy bioszenzor alkalmazásából származnak, amellyel a Grb2 GST-SH2 fúziós fehéije valós idejű kötődését mérik a DDPSY³¹⁷*VNVQ immobilizált tirozinfoszforilezett Shc peptiddel (7. ábra). A kapott adatokat használjuk arra, hogy kiszámítsuk a K^,. (2,6xlO⁵ M“ls-1) értékét, a 7C. ábrán látható módon. A K_dj_ss értékét mind pufferben, mind a versengő foszfopeptid jelenlétében méljük, hogy megelőzzük a visszakötődést. Amint a 7B. ábrán látható, a versengő foszfopeptid erős hatással van a disszociációs konstansra, amint azt korábban már megfigyelték más SH2 doménfoszfopeptid kölcsönhatások esetében [Panayotou et al., Mól. Cell. Bioi., 13, 3567-3576 (1993); Felder et al., Mól. Cell. Bioi., 13, 1449-1455 (1993)]. A kapott Kiérték 0,04 S^_1, ami 153 nmol teljes affinitást ad.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy az Shc fehérjék foszforileződése az Y³¹⁷ tirozinon az SF/HGF-re adott válaszként, meghatározzák a nagy affinitású dokkolási hely képződését a Grb2 „adapter” számára. A foszforilezett Shc fehérjék tehát úgy működhetnek mint összekötő molekulák az aktivált SF/HGF receptor és a Grb2 között. Érdekes módon, a Grb2 Shc2 dokkolási helye, az Y³¹⁷VNV, azonos az SF/HGF receptorfarokkal (8. ábra), az Y¹³⁵⁶VNV-vel, amelyről kimutatták, hogy közvetlenül köti a Grb2-t a ligandumserkentés hatására (Ponzetto et al., benyújtott közlemény).

Az Shc fehérjék nem képeznek konkatamereket

Az Y³¹⁷VNV Shc szekvencia azonos az SF/HGF receptorban található két Shc kötőhely egyikével (8. ábra). Ez a megfigyelés azt sugallja, hogy az Shc konkatamereket képez, egyéb Shc-molekulák Y³¹⁷ foszfotirozinjainak megkötésével. A bioszenzort használjuk az Shc SH2 doménnek az Shc-molekulán található DDPST^KVFQ foszfopeptidhez való kötődésének és az SF/HGF receptoron található VNATT¹³⁵⁶ WFK foszfopeptid kötődésének összehasonlítására. Az Shc-SH2 sokkal gyengébben kötődik az Shc eredetű foszfopeptidhez mint az SF/HGF receptorból származó foszfopeptidhez (5. ábra). Ezek az adatok azt sugallják, hogy az Y³¹⁷ N-terminális oldalán található aminosavakat (az Shc-ben) és az Y¹³⁵⁶ N-terminális oldalán található aminosavakat (az SF/HGF receptorban) az Shc SH2 doménje felismeri. Tehát az Shc-Shc asszociáció nem favorizált in vivő, és az Shc Y³¹⁷ foszfotirozincsoportja elérhető egyéb molekulák megkötésére, és nem közvetíti konkatamerek kialakulását.

Következtetések

Következtetésünk az, hogy egy körülbelül 4-20 aminosavból álló peptid, amely tartalmazza az Shc dokkolá16

HU 219 813 Β si helyét (Y³¹⁷VNV), főleg a H-Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr*Val-Asn-Val-Gln-OH (DDPSY*VNVQ), valamint egy 4-20 aminosavból álló peptid, amely tartalmazza a hepatocita növekedési faktor (Y¹³⁵⁶VNV) Tyr¹³⁵⁶-os felismerési motívumát, különösen a H-Val-Asn-Ala-ThrTyr*Val-Asn-Val-Lys-OH (VNATY*VNVK), amelyben Tyr* (Y*) egy foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozincsoportot jelent, képes megkötni a Grb2-SH2 domént. Tehát jól használhatók versengésre, és a Grb2 fehéije tirozinfoszforilezett receptorokkal, mint például az aktivált hepatocita növekedési faktor receptorral (HGF/SF), a PDGF-receptorra, az EGF-receptorral vagy egyéb, citoszólban levő tirozinfoszforilezett transzducerekkel, mint például az Shc vagy IRS-1 fehéije, való SH2 asszociációjának megelőzésére, és a mitogenezis, és ennek következtében a tumor elszaporodásának megelőzésére.

Másrészt, a hepatocita növekedési faktor Tyr¹³⁵⁶ vagy a Tyr¹³⁴⁹ felismerési motívumát tartalmazó peptidek (Y¹³⁵⁶VNV vagy Y^l349VHV), különösen az előzőkben említett H-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-LysOH (VNATY*VNVK), peptid és a H-Ile-Gly-Glu-HisTyr*-Val-His-Val-Asn-OH (IGEHY*VHVN) peptid, vagy egy olyan peptid, amely mindkét, az előzőkben említett tirozincsoportot tartalmazza, mint például a H-IleGIy-Glu-His-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-ValAsn-Val-Lys-OH (IGEHY*VHVNAT Y*VNVK), amelyben Tyr* (Y*) foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozincsoportot jelent, képesek megkötni az Shc-SH2 domént. így tehát hasznosak a versengésben, és az Shc fehéijék tirozinfoszforilezett receptorokkal, mint például az aktivált hepatocita növekedési faktor, az EGF-receptorok vagy egyéb citoszólos tirozinfoszforilezett transzducerek, mint például az IRS1, vagy citoszólos tirozinkinázok, mint például az Src való SH2 asszociációjának megelőzésére, ezzel megakadályozva a mitogenezist és a tumorsejtek elterjedését. Tehát a peptidek tumorellenes és antimetasztatikus hatásokat fejtenek ki.

Amint az előzőkben említettük, a találmány szerinti peptidet előnyösen beadhatjuk nem foszforilezett formában is, prodrugként; ebben az esetben a peptid biokémiailag transzformálódhat a foszforilezett formájává a sejtben, ahol a farmakológiai hatását kifejti.

Claims (21)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. A humán hepatocita növekedési faktor intracelluláris régiója egy részének szekvenciájával rendelkező peptid, azzal jellemezve, hogy egy citoszólos szignáltranszducerhez kötődik.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy képes a foszfatidil-inozitol-3-kináz és az aktivált hepatocita növekedési faktor receptora közötti kötődést gátolni.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy képes az Shc fehéije és az aktivált hepatocita növekedési faktor receptora közötti kötődést gátolni.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy képes az Shc fehérje és egy citoszólban levő szignál transzducer közötti kötődést gátolni.
5. 5. Az Shc fehéije egy részének szekvenciájával rendelkező peptid, azzal jellemezve, hogy a peptid képes egy citoszólban levő szignáltranszducerhez kötődni.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy képes az Shc fehéije és a Grb2 fehéije közötti kötődést gátolni.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy képes a Grb2 fehérje és az aktivált hepatocita növekedési faktor receptora közötti kötődést gátolni.
8. 8. Bármelyik előző igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája

   X_N-YVN(vagy H)V-Xc, amelyben X_N és X_c jelentése 0-16 aminosav.
9. 9. A 8. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy X_N és Xc olyan szekvenciák, amelyek a HGF/SF receptorban és az Shc fehérjében levő egyik YVN(vagy H)V szekvenciát határolják.
10. 10. A 9. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája H-Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr*-Val-AsnVal-Gln-OH, amelyben Tyr* jelentése egy foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozincsoport.
11. 11. A 9. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája H-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-AsnVal-Lys-OH, amelyben Tyr* jelentése foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozincsoport.
12. 12. A 9. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája H-Ile-Gly-Glu-His-Tyr*-Val-HisVal-Asn-OH, amelyben Tyr* jelentése foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozincsoport.
13. 13. A 9. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája H-Ile-Gly-Glu-His-Tyr*-Val-HisVal-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH, amelyben Tyr* jelentése foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozincsoport.
14. 14. A 9. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-ThrTyr-OH, amelyben Tyr* jelentése foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozincsoport.
15. 15. A 9. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-ThrTyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH, amelyben Tyr* jelentése foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozincsoport.
16. 16. A 9. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-ValAla-OH, amelyben Tyr* jelentése foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozincsoport.
17. 17. Az 1. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája az alábbiak egyikének felel meg:

    H-Tyr*-Asp-Ala-Arg-Val-His-Thr-Pro-OH

    H-Tyr*-Arg-Ala-Thr-Pre-Pro-Glu-Asp-OH

    H-Tyr*-Pro-Leu-Thr-Asp-Met-Ser-Pro-OH

    H-Tyr*-His-Gly-Thr-Leu-Leu-Asp-Asn-OH

    H-Tyr*-Met-Lys-His-Gly-Asp-Leu-Arg-OH

    H-Tyr*-Leu-Ala-Ser-Lys-Lys-Phe-Val-OH

    H-Tyr*-Asp-Lys-Glu-Tyr-Tyr-Ser-Val-OH

    H-Tyr*-Tyr-Ser-Val-His-Asn-Lys-Thr-OH

    H-Tyr*-Ser-Val-His-Asn-Lys-Thr-Gly-OH

    HU 219 813 Β

    Η-Tyr* -Pro-Asp-V al-Asn-Thr-Phe- Asp-OH

    H-Tyr*-Leu-Leu-Gln-Gly-Arg-Arg-Leu-OH

    H-Tyr*-Cys-Pro-Asp-Pro-Leu-Tyr-Glu-OH

    H-Tyr*-Glu-Val-Met-Leu-Lys-Cys-Trp-OH

    H-Tyr*-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Glu-OH 5 ahol Tyr* jelentése egy foszforilezett vagy nem foszforilezett tirozincsoport.
18. 18. Eljárás az előző igénypontok bármelyike szerinti peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a peptidet kémiai úton szintetizáljuk egyedi aminosavakból és/vagy előre elkészített peptidekből, amelyek kettő vagy több aminosavat tartalmaznak.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy előre foszforilezett, védett tirozincsoportot közvetlenül juttatunk be a molekulába egy szilárd fázisú szintézis során.
20. 20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy előre elkészített, védett peptid tirozincsoportját foszforilezzük, miközben a peptidet egy szilárd hordozóhoz kapcsoljuk.
21. 21. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy egy fiziológiailag elfogadható hordozót és hígítóanyagot, valamint aktív adalékanyagként az 1-17. igénypontok bármelyike szerint peptidet tartalmaz.