KR950703003A - 미토게네시스 및 모토게네시스의 펩타이드 억제제(peptide inhibitors of mitogenesis and motogenesis) - Google Patents

미토게네시스 및 모토게네시스의 펩타이드 억제제(peptide inhibitors of mitogenesis and motogenesis) Download PDF

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Abstract

세포생물학 분야의 본 발명은 세포내 신호 형질 도입제와 상호작용하여 세포증식 및 운동성을 유도하는 신호 형질도입 통로를 방해할 수 있는 신규한 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 단일 아미노산 및 /또는 두개 이상의 아미노산 잔기의 예비형성된 펩타이드로부터 화학적으로 합성될 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 신생물성 질환의 치료에 유용하게 적용되는 것으로 밝혀졌다.

Description

미토게네시스 및 모토게네시스의 펩타이드 억제제(PEPTIDE INHIBITORS OF MITOGENESIS AND MOTOGENESIS)
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 티로신-포스포릴화된 펩타이드에 의한 HGF/SF 수용체에 대한 p85의 결합 억제 재조합 HGF/SF 수용체는 토끼 폴리클로날 항혈청을 사용하는 바쿨로비루스-감염된 sf9세포로부터 면역침전법에 의해 정제하고 냉 ATP로 포스포릴화시킨다. p85 발현하는 sf9세포의 용해물을 각 포스포펩타이드(10μM)로 예비-배양된다. 그런 다음, 용해물이 고정화된 재조한 HGF/SF수용체와 관련 되도록 한다. 관련시킨 다음, 착물을 세척하여 수용체-결합 p85를 실시예 4의 물질 및 방법에서 기술된 바와 같이 시힘관내 키나제 분석에 의해 검출한다. 포스포펩타이드를 많은 아미노산 말단 티로신에 의해 동정된다.
제2도 상이한 농도의 티로신-포스포릴화된 펩타이드를 사용한 HGF/SF수용체에 대한 p85의 결합 억제. p85에 대한 상대적 친화력을 정의하기 위해 HGF/SF수용체에 대한 p85의 결합을 효과적으로 초과-경쟁하는 포스포펩타이드(제1도)를 증가 농도(왼쪽에서 오른쪽으로 10nM, 100nM, lμM)에서 사용한다. 실험 조건은 제1도에 나타낸 바와 같다. 포스포펩타이드 1365를 p85 상호 작용에 대한 네가티브 조절제로서 사용한다.
제3도 티로신-포스포릴화된 펩타이드에 의한 HGF/SF 수용체에 대한 PI 3-키나제 완전효소의 결합억제 P85를 효과적으로 초과-경쟁하는 포스포펩타이드(제1도)는 HGF/SF수용체에 대한 PI3-키나제 완전효소의 결합억제하는 능력에 대해 분석한다. 3일 굶긴 A549 세포로부터의 시토솔릭 추출물을 고정화된 재조합 HGF/SF수용체와 배양하기 전에 포스포펩타이드(10μM) 각각으로 예비배양한다. 실시예 4의 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 PI 3-키나제 활성 분석에 의해 면역착들중 수용체-관련된 PI 3-키나제의 존재를 측정한다. PI 3-키나제 반응의 포스파티딜이노시톨-3-포스페이트(PIP) 생성들의 위치를 나타낸다.
제4도는 HGF/SF 수용체와 p85의 상호 작용에 대한 Tyr-Phe 돌연변이체의 효과 COS 7 세포를 지시된 위치에서 티로신 코돈이 각각 또는 배합으로 페닐알라닌 코돈으로 전환하는 야생형 HGF/SF 수용체(wt)또는 수용체들을 암호화하는 플라스미드로 형질 감염시킨다. COS 7세포는 의인성 HGF/SF 수용체를 발현한다. 그러나, 원숭이 단백질은 카복실-말단 사람 특이적 펩타이드에 대해 관련된 모노클로날 항체에 의해 인식되지 않는다. 이들 항체를 사용하여 형질감염된 COS 7세포로부터 사람 HGF/SF 수용체를 선택적으로 면역 침전시킨다. 고정화된 예비-포스포틸화된 수용체를 sf9 세포 발현 p85의 용해문과 배양한다. 판넬 A에서, 수용체 및 P85를 실시예 4의 물질 및 방법에 의해 기술된 시험관내 키나제 분석에 의해 표지화된다. 판넬 B에서 수용체 면역-착물중 p85의 존재를 항-p85 모노클로날 항체를 사용하여 임뮤노블롯(immunoblot)에 의해 측정된다.
제5도 HGF/SF수용체와 PI 3-키나제 완전효소의 상호 작용에 대한 Tyr-Phe 돌연변이의 생체내 효과 COS 7 세포 발현 야생형 또는 돌연변이된 수용체는 HGF/SF로 자극되고 용해된다. 수용체를 사람-특이적 모노클로날 항체로 면역침전시킨다. 판넬 A 및 B에서 수용체-관련 PI 3-키나제의 존재를 실시예 4의 물질 및 방법에 의해 기술된 PI 3-키나제 활성 분석에 의해 측정한다. PI 3-키나제 반응의 포스파티딜이노시톨-3-포스페이트(PIP)생성물의 위치를 나타낸다. 판넬 C 및 D는 임뮤노 블롯(사람-특이적 모노클로날 항체 사용)에 의해 PI 3-키나제 활성에 대해 시험된 샘플은 동량의 제조할 수용체를 함유한다. TK 수용체 돌연변이체는 1204위치에 아스파르트산을 아스파라긴 잔기로 전환시켜 수득된다. 이것을 카나제-불활성 HGF/SF 수용체를 생성한다.

Claims (24)

  1. 시토졸릭 신호 형질도입제에 결합할 수 있는, 사람 헤파토사이트 성장 인자 수용체의 세포내 영역 일부의 서열을 갖는 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 포스파티딜 이노시톨 3-키나제의 p85 아단위와 활성화된 헤파토사이트 성장 인자 수용체 사이의 결합을 억제할 수 있는 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, Shc 단백질과 활성화된 헤파토사이트 성장 인자 수용체 사이의 결합을 억제할 수 있는 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, Shc 단백질과 시토졸릭 신호 형질 도입제 사이의 결합을 억제할 수 있는 펩타이드.
  5. 시토졸릭 신호 형질 도입제에 결합할 수 있는 Shc 단백질 일부의 서열을 갖는 펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, Shc 단백질과 Grb2 단백질 사이의 결합을 억제할 수 있는 펩타이드.
  7. 제5항에 있어서, Grb2 단백질과 활성화된 헤파토사이트 성장 인자 수용체 사이의 결합을 억제할 수 있는 펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서 XN및 XC가 각각 0 내지 16개의 아미노산 서열인 서열 XN-YVN(또는 H)V-XC를 갖는 펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, XN및 XC가 HGF/SF 수용체 및 Shc 단백질중 YVN(또는 H)V 서열중 하나와 접할 수 있는 서열인 펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, Tyr*가 포스포릴화되거나 되지 않은 티로신 잔기인 H-Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr*-Val-Asn-Val-Gln-OH인 펩타이드.
  11. 제9항항에 있어서, Tyr*가 포스포릴화되거나 되지 않은 티로신 잔기인 H-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH인 펩타이드.
  12. 제9항에 있어서, Tyr*가 포스포릴화되거나 되지 않은 티로신 잔기인 H-Ile-Gly-Glu-His-Tyr*-Val-His-Val-Asn-OH인 펩타이드.
  13. 제9항에 있어서, Tyr*가 포스포릴화되거나 되지 않은 티로신 잔기인 H-Ile-Gly-Glu-His-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH인 펩타이드.
  14. 제9항에 있어서, Tyr*가 포스포릴화되거나 되지 않은 티로신 잔기인 H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH인 펩타이드.
  15. 제9항에 있어서, Tyr*가 포스포릴화되거나 되지 않은 티로신 잔기인 H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH인 펩타이드,
  16. 제9항에 있어서, Tyr*가 포스포릴화되거나 되지 않은 티로신 잔기인 H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH인 펩타이드.
  17. 제1항에 있어서, Tyr*가 포스포릴화되거나 되지 않은 티로신 잔기인 H-Tyr*-Asp-Ala-Arg-Val-His-Thr-Pro-OH, H-Tyr*-Asp-Ala-Thr-Phe-Pro-Glu-Asp-OH, H-Tyr*-Pro-Leu-Thr-Asp-Met-Ser-Pre-OH, H-Tyr*-His-Gly-Tyr-Leu-Leu-Asp-Asn-OH, H-Tyr*-Met-Lys-His-Gly-Asp-Leu-Arg-OH, H-Tyr*-Leu-A1e-Ser-Lys-Lys-Phe-Val-OH, H-Tyr*-Asp-Lys-Glu-Tyr-Tyr-Ser-Val-OH, H-Tyr*-Tyr-Ser-Val-His-Asn-Lys-Thr-OH, H-Tyr*-Ser-Val-Asn-Lys-Thr-Gly-OH, H-Tyr*-Pro-Asp-Val-Asn-Thr-Phe-Asp-OH, H-Tyr*-Leu-Leu-Gln-Gly-Arg-Arg-Leu-OH, H-Tyr*-Cys-Pro-Asp-Pro-Leu-Tyr-Glu-OH, H-Tyr*-Glu-Val-Met-Leu-Lys-Cys-Tyr-OH 및 H-Thr*-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Glu-OH인 펩타이드.
  18. 펩타이드를 단일 아미노산 및 /또는 두개 이상의 아미노산 잔기의 예비형성된 펩타이드로부터 화학적으로 합성함을 특징으로 하여 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 제조하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 예비 포스포릴화된 보호된 티로신 잔기를 고상 합성동안 직접 도입하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 보호된 예비형성된 펩타이드의 티로신 잔기가 펩타이드가 고체 지지체에 부착되는 동안 포스포릴화 되는 방법.
  21. 활성 성분으로서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 청구된 펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 치료법에 의해 인체 또는 동물체의 치료에서 사용하기 위한 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드.
  23. 신생물성 질환의 치료에 사용하기 위한 제22항에 따른 펩타이드.
  24. 신생물성 질환 치료용 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제17항중 어느 한 항에서 청구된 펩타이드의 용도.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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