PL179628B1 - Peptydy b ed ace inhibitorami m itogenezy i m otogenezy, sp o só b ich wytwarzania, i zawierajacy je srodek farm aceutyczny PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku sąpeptydy będące inhibitorami mitogenezy i motogenezy, sposób ich wytwarzania i zawierający je środek farmaceutyczny. Wynalazek dotyczy nowych peptydów zdolnych do interakcji z wewnątrzkomórkowymi przekaźnikami sygnałowymi, a przez to do zakłócania szlaków przekazywania sygnałów prowadzących do proliferacji komórek i nadania im ruchliwości.

Polipeptydowe czynniki wzrostowe pośredniczą w odpowiedziach fizjologicznych przez wiązanie receptorów powierzchniowych komórki z enzymem kinazą tyrozynową (przeglądu prac dokonali A. Ullrich i J. Schlessinger w Celi, 61. 203 - 211 (1990).

Po związaniu tych ligandów, receptory czynnika wzrostu ulegają dimeryzacji, po której następuje autofosforylacja określonych reszt tyrozyny.

Wśród wewnątrzkomórkowego środowiska białek znajdują się cząsteczki o określonych funkcjach biologicznych, służące jako substraty dla zaktywowanych przez ligandy receptorów kinazy tyrozynowej.

Nagromadzone w ciągu kilku ostatnich lat dowody eksperymentalne wskazują na to, że po związaniu się z receptorem, te substratowe cząsteczki „przestawiają” się w postać aktywną i stają się częścią wykorzystywanego przez czynniki wzrostowe decydującego szlaku sygnałowego, z ograniczeniem proliferacji komórek.

Wykazano, że szereg cząsteczek cytoplazmatycznych, pośredniczących w odpowiedzi komórki na czynniki wzrostowe, oddziaływuje wzajemnie z aktywnymi receptorami, poprzez swoją domenę regionu 2 homologii SRC (SH2) [C.A. Koch i in., Science, 252, 668 - 674 (1991)].

Domena SH2 jest to konserwatywny moduł białka o mniej więcej 100 aminokwasach, znajdowany w znacznie zróżnicowanej grupie cytoplazmatycznych białek sygnałowych.

Białka z domenami SH2 często mają jeszcze inną, odmienną sekwencję o około 50 resztach, a mianowicie domenę SH3, co do której przypuszcza się, że również bierze udział w regulowaniu interakcji białko-białko w trakcie przekazywania sygnału [patrz: S.G. Clark i in., Naturę, 356. 340 - 344 (1992), jak również zamieszczone tam odnośniki].

Autofosforylacja receptora, następująca po wiązaniu ligandu, działa jako cząsteczkowy „przełącznik”, dzięki któremu tworzą się miejsca wiążące dla domeny SH2 cytoplazmatycznych białek sygnałowych [D. Anderson i in., Science, 979 - 982 (1990)], które w ten sposób stają się celem aktywacji.

Domeny SH2 bezpośrednio rozpoznają fosfotyrozynę [M. Matsuda i in., Science, 248, 1537- 1539(1990)].

179 628

Jednakże, wysoki stopień powinowactwa wiązania domeny SH2 wymaga tego, aby fosfotyrozyna znajdowała się w otoczeniu specficznej sekwencji aminokwasów, jak to pierwotnie sugerowano na podstawie przebadania miejsc wiążących SH2 [L.C. Cantley i in., Celi, 64,281 -302(1991)].

I tak, na przykład, białka zawierające SH2, takie jak 3 - kinaza fosfatydyloinozytolowa (PI) (3-kinaza PI), białko aktywujące GTP-azę Ras (Ras GAP) i fosfolipaza C-γ (PLC-γ), wszystkie one wiążą się z różnymi miejscami autofosforylacji receptora β dla czynnika wzrostowego pochodzącego z płytek krwi (PDGF) [A. Kashishian i in., EMBO J., 11, 1373 - 1382 (1992); W.J. Fantl i in., Celi, 69, 413 - 423 (1992],

Miejsca autofosforylacji, działające jako swoiste miejsca „cumowania” dla 3-kinazy PI, PLC-γ i Ras GAP, zidentyfikowano także w przypadku receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGF-R), receptora czynnika stymulującego kolonizację 1 (CSF - 1 R) oraz receptora czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-R) [L.C. Cantley i in., Cell, 64. 281 - 302 (1991); M. Mojammadi i in., Mol. Celi. Biol., 11, 5068 - 5078 (1991); M. Reedijk i in., EMBO J., 41, 1365 - 1372 (1992); D. Rotin i in., EMBO J. 11, 559 - 567 (1992)]. Wykazano, że względnie krótkie sekwencje peptydów, odpowiadające miejscom fosforylacji receptora PDGF, hamowały interakcję między aktywnym receptorem PDGF a 3-kinazą PI (J.A. Escobedo i in., Mol. Celi. Biol., H 1125 - 1132.

Reszty znajdujące się tuż przy C-końcu w stosunku do fosfotyrozyny, zwłaszcza reszty w pozycjach +1, +2 i +3, wydają się nadawać selektywność specyficznym domenom SH2.

Tak więc, w receptorze PDGF zidentyfikowano motyw rozpoznawania dla podjednostki p85 3-kinazy PI. Sekwencja ta ma wzór: Tyr-Met/Val-Xxx-Met (ΥΜΧΜ lub YVXM), w którym Xxx i X oznaczają jakąkolwiek resztę aminokwasu w kodzie, odpowiednio, trój literowym lub jednoliterowym [S.M. Domchek i in., Biochemistry, 31, 9865 - 9870 (1992)].

Identyfikowanie nowych członków rodziny cząsteczek zawierających SH2, jak również odnośnego motywu rozpoznawania, postępuje szybko naprzód.

Przedstawiono bezpośredni współudział tych cząsteczek, jeśli chodzi o wywoływanie odpowiedzi biologicznej na obecność ligandu. Zdarza się to w przypadku białka Grb2, które asocjuje, poprzez swą domenę SH2, z receptorem EGF po stymulacji przez ligand.

Mikroiniekcja białka Grb2 i H-ras do komórek ssaka doprowadziła do stymulacji syntezy DNA, a przez to do efektu mitogennego [E.J. Lowenstein i in., Celi, 70, 431 - 442 (1992)].

Wyniki te wskazują na to, że Grb2 odgrywa rolę decydującą w mechanizmie kontroli przekazywania sygnału przez ras, za którą odpowiedzialny jest czynnik wzrostu.

Aczkolwiek większość wysiłków badaczy w ciągu ostatnich kilku lat skoncentrowana była na badaniu interakcji między cytoplazmatycznymi białkami przekazującymi sygnały, oraz na możliwie jak najlepszym scharakteryzowaniu receptorów EFF i PDGF, twórcy niniejszego wynalazku zogniskowali swoją uwagę na receptorze czynnika wzrostu hepatocytów (HGF).

HGf, znany także jako ‘czynnik rozpraszający” (SF), jest to białko heterodimeryczne, wydzielane przez komórki pochodzenia mezodermalnego [M. Stoker i in., Naturę, 327, 239 242 (1987); K.M. Weidner i in., J. Celi. Biol., 111. 2097 - 2108 (1990)].

Czynnik ten indukuje cały szereg aktywności biologicznych w komórkach nabłonkowych, włączając w to mitogenezę, satymulację ruchliwości komórek oraz wzmożenie nacieczenia matriks zewnątrzkomórkowej [T. Nakamura i in., Biochem. Biophys, Res. Comm, 122, 1450 - 1459 (1984); M. Stoker i in., Naturę, 327, 239 - 242 (1987); K.M. Weidner i in., J. Celi BioL, 111. 2097 - 2108 (1990); J. S. Rubin i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88, 415 - 419 (1991).

HGF/SF jest również morfogenem in vitro [C.D. Stern i in., Development, 110. 1271 1284 (1990); Montesano i in., Celi, 66, 697 - 711 (1991)], a także silnie działającym czynnikiem naczyniotwórczym in vitro i in vivo [M.F. Bussolino i in., J. Celi Biol.. 119, 629 - 641 (1991)].

179 628

Podczas gdy działanie biologiczne HGF/SF zmienia się w zależności od komórki docelowej, w przekazywaniu sygnału HGF/SF pośredniczy pojedynczy receptor, kinaza tyrozynowa kodowana protoonkogenem MET (patrz : praca przeglądowa autorstwa P.M. Comoglio w: „Hepatocyte Growth Factor - Scatter Factor (HGF/SF) and the C-Met Receptor”, red. I.D. Goldberg i E.M. Rosen, wyd. Birkhauser Verlag, Bazyleja, Szwajcaria).

Receptor HGF, znany także jako pl90^MET, jest to heterodimeryczny receptor złożony z zewnątrzkomórkowej podjednostki a i przezbłonowej podjednostki β [S. Giordano i in. Naturę, 339. 155 - 156 (1989)], przy czym obie te podjednostki pochodzą z proteolitycznego rozszczepienia zwyczajnego, jednołańcuchowego prekursora o 170 kDa [S. Giordano i in., Oncogene 4, .1383 - 1388 (1989)].

Fibroblasty NIH3T3, transfekowane ludzkim MET cDNA wyrażają funkcjonalne receptory i odpowiadają na HGF/SF zwiększoną ruchliwością i nacieczeniem matriks zewnątrzkomórkowej [S. Giordano i in., PNAS, 90, 649 - 653 (1993)].

Zaobserwowano niekontrolowaną aktywność receptora HGF/SF skierowaną wobec kinazy tyrozynowej w liniach komórek transformowanych w następstwie rearanżacji chromosomalnych [Park i in., Celi, 45, 895 - 904 (1986)], nadekspresji genów [S. Giordano i in., Naturę, 339. 155 - 186 (1989)], defektywnej obróbki potranslacyjnej [Mondina i in., Mol. Celi. Biol., H, 6084 - 6092 (1991)] i postępowania zwanego „autocrine loop”.

Nadekspresję receptora zauważono w szeregu ludzkich nowotworów nabłonkowych [Di Renzo i in., Oncogene, 6, 1997 - 2003 (1991); Di Renzo i in., Oncogene, 7, 2549 - 2553 (1992); Prat i in., Int. J. Cancer, 49. 323 - 328 (1991)].

Uwydatnia to potencjał onkogenny receptora HGF/FS.

Niewiele wiadomo na temat szlaków przenoszenia sygnałów wyzwalanych przez HGF/SF.

Plejotropowa odpowiedź biologiczna wywoływana przez czynnik sugeruje, że mamy tu do czynienia z więcej niż jednym mechanizmem aktywacji.

Twórcy niniejszego wynalazku już poprzednio wykazali, że receptor HGF SF asocjuje, in vitro, po autofosforylacji z 3 - kinaząPI, ras-GAP, PLC-γ i Src-pokrewnymi kinazami tyrozynowymi [A. Bardelli i in., Oncogene, 7, 1973 - 1978 (1992)]. Asocjację 3-kinazy PI z aktywnym receptorem stwierdzono także in vivo w komórkach stymulowanych HGF/SF [A. Graziani i in., J. Biol. Chem., 266, 22087 - 22090 (1991)].

Ostatnio, twórcy wynalazku wykazali także fakt aktywowania przez HGF/SF Ras przez zwiększenie liczby obrotów między jego stanem GDP a CTP, na drodze stymulowania czynnika wymiany nukleotydu guaninowego [A. Grazioni i in., J. Biol. Chem., w druku (1993)].

Obecnie stwierdzono, że receptor HGF/SF asocjuje z białkami Shc i Gbr2. Gen Shc ssaków koduje trzy szeroko wyrażane, zachodzące na siebie białka o 66, 46 i 52 kDa (p66^Shc, p46^Shc i p52^shc) zawierające C-końcową domenę SH2 i N-końcowy region o homologii kolagenu [Pelicci i in., Celi, 70, 93 - 104 (1992)]. p46^She i p52^she kodowane są przez ten sam transkrypt przy użyciu dwóch różnych ATG. p66^she kodowany jest przez alternatywnie cięty i składany transkrypt (Migliaccio i in., publikacja w przygotowaniu). Dowody eksperymentalne wskazują na to, że białka Shc biorą udział w przekazywaniu sygnałów generowanych przez receptory kinazy tyrozynowej. Białka Shc ulegają szybkiej fosforylacji z udziałem tyrozyny w odpowiedzi na aktywację receptorów EGF (Pellici i in., tamże) oraz PDGF (dane nie opublikowane), Erb-B-2 {Segatto i in., Oncogene, 2105 - 2112 (1993)], Src i Fps [McGlade i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8869 - 8873 (1992)]. Nadekspresja białek Shc wywołuje wyrastanie neurytów w komórki feokromocytomowe PC 12, a efekt tego rodzaju blokowany jest przez ekspresję dominantowo-negatywnego mutantu Ras [Rozakis-Adcock, Naturę, 360, 689 - 692 (1992)]. Po stymulacji komórek przez pewne czynniki wzrostowe, białka Shc tworzą stabilne kompleksy z adapterem Grb2/Sem5 [Lowenstein i in., Celi, 70, 431 - 442 (1992); Rozakis-Adcock i in., tamże]. Wspomniany tu adapter znany jest z aktywowania funkcji Ras przez włączenie SoS, czynnika wymiany nukleotydu guaninowego [Li i in., Naturę, 363. 85 - 87 (1993); Gale i in., Naturę, 363. 88 - 92 (1993); Rozakis-Adcock i in.,

179 628

Naturę, 363, 83 - 85 (1993); Egan i in., Naturę, 363. 45 - 51 (1993); Simon i in., Celi, 73, 169 177 (1993); Oliver i in., Celi, 73, 179 -191 (1993)] do błony.

Z powyższego wynika jasno, że interakcja między aktywnym receptorem kinazy tyrozynowej a cząsteczką cytosolowego przekaźnika sygnałów stanowi decydujący etap na szlaku przenoszenia sygnału prowadzącego do proliferacji komórek i nadania im ruchliwości.

Ponieważ te odpowiedzi biologiczne stanowią najbardziej wyróżniającą cechę charakterystyczną wzrostu i rozprzestrzeniania się nowotworu, notuje się w tej dziedzinie wiedzy potrzebę przeszkodzenia temu wzajemnemu oddziaływaniu.

Twórcy niniejszego wynalazku dokonali syntezy grupy fosfopeptydów zdolnych do interakcji z wewnątrzkomórkowymi przekaźnikami sygnałów, uszkadzających szlak prowadzący do proliferacji komórek i nadania im ruchliwości oraz wynikającego z tego naciekania do matriks zewnątrzkomórkowej.

Te właściwości biologiczne można wykorzystać do zahamowania wzrostu komórek nowotworowych i do zapobieżenia przerzutowemu rozprzestrzenianiu się nowotworu.

Twórcy niniejszego wynalazku dokonali także następujących odkryć:

(1) Białka Shc wiążą się z fosforylowanym w reszcie tyrozyny receptorem SF/HGF poprzez domenę SH2.

(2) Białka Shc wiąźą się z miejscami fosforylacji Y¹³⁴⁹ oraz Y¹³⁵⁶ fosfotyrozyny końcowego fragmentu receptora SF/HGF.

(3) Nadekspresja białek Shc zwiększa motogenną odpowiedź na SF/HGF.

(4) Białka Shc ulegają fosforylacji w miejscu Y³¹⁷ po związaniu się z receptorem SF/HGF.

(5) Białka Shc fosforylowane w miejscu Y³¹⁷ tworzą specyficzne kompleksy z białkiem Grb2, oraz (6) Miejsce cumowania białka Grb2 na Shc (Y³¹⁷VNV) ma taką samą sekwencję, jak miejsca wiązania przekaźnika sygnałów na receptorze HGF/SF (YVNV).

Tak więc, twórcy niniejszego wynalazku przeprowadzili syntezę peptydów od miejsca cumowania Grb2 na Shc i od miejsc cumowania Shc, obejmujących motywy rozpoznawania γΐ349 vhv oraz Y¹³⁵⁶VNV na receptorze czynnika wzrostowego hepatocytów. Peptydy te są zdolne do zakłócania szlaków prowadzących do proliferacji komórek i nadania im ruchliwości oraz wynikającego z tego naciekania do matriks zewnątrzkomórkowej.

Zgodnie z tym, wynalazek w dalszym ciągu dotyczy peptydu o sekwencji części białka Shc, który to peptyd może wiązać się z cytosolowym przekaźnikiem sygnałów. Peptyd, ogólnie, zdolny jest do hamowania wiązania się białka Shc z białkiem Grb2 lub białka Grb2 z aktywnym receptorem czynnika wzrostowego hepatocytów.

Ponadto, wynalazek niniejszy dotyczy peptydu o sekwencji części wewnątrzkomórkowego regionu receptora ludzkiego czynnika wzrostu hepatocytów, który to peptyd może wiązać się z cytosolowym przekaźnikiem sygnałów.

Peptyd, ogólnie, jest zdolny do hamowania wiązania się białka Shc, lub podjednostki p85 3-kinazy fosfatydyloinozytowej, z aktywnym receptorem czynnika wzrostu hepatocytów, lub Shc z innymi cytosolowymi przekaźnikami sygnałów.

Peptydy według niniejszego wynalazku są to, ogólnie, cząsteczki zawierające tyrozynę, oferujące miejsca fosforylacji tyrozyny. Peptydy te mają długość, na przykład, od 4 do 20 aminokwasów, na przykład od 8 do 12 aminokwasów.

Peptydy te, ogólnie, reprodukują potencjalne motywy rozpoznawania dla domen SH₂ wewnątrzkomórkowych przekaźników sygnałów.

Peptydy mogą zawierać od 4 do 20 aminokwasów i mają sekwencję wyrażoną wzorem X_n-YVN (lub H) V-X_c, w którym X_ni X_c każdy oznacza sekwencje zawierające od 0 do 16 aminokwasów.

Korzystnie, X_N i X_c oznaczają sekwencje, które flankują jedną z sekwencji YVN (lub H) V w receptorze HGF/SF i białku Shc. Interakcja przekaźnika z aktywnym receptorem kinazy tyrozynowej umożliwia włączenie i zaktywowanie samego przekaźnika.

179 628

Aktywacja receptora HGF/SF może mieć zarówno charakter fizjologiczny (co oznacza, że może wynikać z wiązania ligandu wraz z dimeryzacją receptora) jak i konstytutywny (co oznacza, że receptor jest w sposób trwały aktywowany, nawet w nieobecności ligandu). Aktywacja konstytutywna zachodzić może w przypadku postaci receptora nie zawierających domeny wiązania ligandu zewnątrzkomórkowego, na przykład w przypadku receptora onkogennego, lub w następstwie translokacji chromosomałnej (jak ma to miejsce w przypadku fuzji TPR-MET opisanej w niniejszym opisie). Większość wewnątrzkomórkowych przekaźników sygnałów funkcjonuje w sposób skorelowany ze wzrostem komórki i transformacją onkogenną [W. J. Fantl i in., Celi, 69, 413 - 423 (1992); M. Reedijk i in., Mol. Celi. Biol., W, 5601 - 5608 (1990); E. J. Lowenstein i in., Celi, 70,431 - 442 (1992)].

Stąd też, hamowanie wiązania się z aktywnym receptorem kinazy tyrozynowej lub tworzenia się wiązania między Shc a innymi przekaźnikami, stanowi środek do hamowania mitogenezy komórkowej i motogenezy komórkowej, wobec czego peptyd według wynalazku może przeciwdziałać się rozwojowi nowotworu.

Korzystny wariant sposobu realizacji wynalazku stanowi peptyd wybrany spośród następujących peptydów:

Pozycja tyrozyny w sekwencji receptora HGF/SF	Fosfopeptydy
Kod trój literowy	Kod jednoliterowy
971	H-Tyr -Asp-Ala-Arg-Val-His-Thr-Pro-OH	Y*DARVHTP
1003	H-Tyr -Arg-Ala-Thr-Phe-Pro-Glu-Asp-OH	Y*RATFPED
1026	H-Tyr -Pro-Leu-Thr-Asp-Met-Ser-Pro-OH	y’pltdmsp
1093	H-Tyr -His-Gly-Thr-Leu-Leu-Asp-Asn-OH	Y*HGTLLDN
1159	H-Tyr -Met-Lys-His-Gly-Asp-Leu-Arg-OH	y‘mkhgdlr
1192	H-Tyr -Leu-Ala-Ser-Lys-Lys-Phe-Val-OH	Y*LASKKFV
1230	H-Tyr -Asp-Lys-Glu-Tyr-Tyr-Ser-Val-OH	y’dkeyysv
971 I	H-Tyr -Asp-Ala-Arg-Val-His-Thr-Pro-OH	y‘darvhtp
1234	H-Tyr -Tyr-Ser-Val-His-Asn-Lys-Thr-OH	y’ysvhnkt
1235	H-Tyr -Ser-Val-His-Asn-Lys-Thr-Gly-OH	y‘svhnktg
1284	H-Tyr -Pro-Asp-Val-Asn-Thr-Phe-Asp-OH	y’pdvnted
1295	H-Tyr -Leu-Leu-Gln-Gly-Arg-Arg-Leu-OH	y‘llqgrrl
1307	H-Tyr -Cys-Pro-Asp-Pro-Leu-Tyr-Glu-OH	y‘cpdplye
1313	H-Tyr -Glu-Val-Met-Leu-Lys-Cys-Trp-OH	Y*EVMLKCW
1349	H-Tyr -Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH	Y*VHVNATY
1349-1356	H-Tyr -Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr -Val-AsnVal-Lys-OH	y‘vhvnaty‘vnvk
1356	H-Tyr -Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH	Y*VNVKCVA
1365	H-Tyr -Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Glu—OH	Y*PSLLSSE

w których to wzorach Tyr* oznacza fosforylowaną lub niefosforylowaną resztę tyrozyny.

Spośrod znanych wewnątrzkomórkowych przekaźników sygnałów, 3-kinaza PI, jak wykazano, wiąże receptor HGF albo in vitro, albo in vivo, po stymulacji z udziałem ligandu. Motyw jej rozpoznawania na receptorze HGF/SF nie został, jak dotychczas, określony.

W poprzedniej pracy, wykonanej z zastosowaniem receptora PDGF, wykazano, że czteroaminokwasowa sekwencja o wzorze Tyr-Xxx-Xxx-Met (ΥΧΧΜ), w którym Xxx lub X

179 628 oznaczają dowolną resztę aminokwasu w kodzie, odpowiednio, trójliterowym lub jednoliterowym, stanowi obowiązkową zgodną sekwencję dla 3-kinazy PL

W receptorze HGF zawarty jest potencjalny motyw rozpoznawania Tyr-Glu-Val-Met (Y₁₃₁₃EVM), który może przedstawiać miejsce wiązania dla 3-kinazy PI,

Nieoczekiwanie, wyniki prac eksperymentalnych przedstawione w dalszej części niniejszego opisu wykazują, że chociaż syntetyczny fosfopeptyd, zawierający zgodną sekwencję Y₁₃₁₃WVM, jest zdolny do wiązania się z 3-kinaząPI, to tyrozynę 1313 można wyeliminować bez wpływu na wiązanie 3-kinazy PI.

W przeciwieństwie do tego, przy użyciu zarówno syntetycznych fosfopeptydów według wynalazku, jak i mutantów Tyr-Phe receptora, twórcy niniejszego wynalazku zidentyfikowali miejsca wiążące dla 3-kinazy PI w dwu fosfotyrozynach, w pozycjach 1349 i 1356, jak to wykazano posługując się danymi odnoszącymi się do hamowania, otrzymanymi przy zastosowaniu fosfopeptydów H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH, H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH i H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH.

Reszty te pozwalają zidentyfikować Tyr-Val-(Asn lub His)-Val[YN (N lub Η) V] jako nowy motyw rozpoznawania dla 3-kinazy PI i odpowiednich fosfopeptydów można z powodzeniem używać jako inhibitorów wiązania receptora HGF z 3-kinazą PI.

Szczególnie korzystnym wariantem sposobu realizacji niniejszego wynalazku jest więc fosfopeptyd o wzorze H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH lub H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH lub H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH, w których to wzorach Tyr* wskazuje resztę fosforylowanej tyrozyny.

Dalszym korzystnym sposobem realizacji niniejszego wynalazku jest peptyd o wzorze H-Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr*-Val-Asn-Val-Gln-OH (DDPSY*VNVQ), w którym to wzorze Tyr* (Y*) oznacza fosforylowaną, lub niefosforylowaną, tyrozynę.

Peptydom według wynalazku można nadać postać farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Do odpowiednich należą sole zasadowe, takie jak sole utworzone z metalami alkalicznymi (na przykład sole sodowe lub potasowe) i sole amoniowe, a także kwaśne sole addycyjne, takie jak chlorowodorek lub octan.

Syntezę peptydów według wynalazku można przeprowadzić z wykorzystaniem metody typowej, takiej jak, na przykład, jedna z metod opisanych przez J. A. Escobedo i in., w Mol. Celi. Biol., U, 1125 - 1132 (1991) lub przez C. W. Turcka wPepide Res„ 5, 156 - 160 (1992), na przykład z udziałem wstępnie zabezpieczonej reszty tyrozyny.

W szczególności, omawiane peptydy wytworzyć można z zastosowaniem metod syntezy w fazie ciekłej lub w fazie stałej, które to metody są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie techniki [Schroeder i in., „The Peptides”, tom I, wyd. Academic Press (1965); Bodanszky i in., „Peptide Synthesis”, Interscience Publishers (1966); McOmie (red.) „Protective Group in Organie Chemistry”, Plenum Press (1973) lub Barany i in.., „The Peptides : Analysis, Synthesis, Biology”, 2, rozdział 1, Academic Press (1980)].

Zgodnie z powyższym, wynalazek obejmuje swym zakresem sposób wytwarzania peptydów według wynalazku, polegający na chemicznej syntezie peptydu z pojedynczych aminokwasów i/lub wstępnie utworzonych peptydów złożonych z dwu lub większej ilości reszt aminokwasów.

W przypadku, gdy pożądane jest otrzymanie peptydu, w którym reszta tyrozyny jest fosforylowana, w trakcie syntezy w fazie stałej można wprowadzić wstępnie ufosforylowaną. zabezpieczoną resztę tyrozyny, względnie resztę tyrozyny zabezpieczonego wstępnie utworzonego peptydu można poddać fosforylacji gdy peptyd przytwierdzony jest do stałego nośnika.

W przypadku syntezy w fazie stałej, posłużyć się można jakimkolwiek ręcznym czy automatycznym sentetyzatorem peptydów.i peptydy można składać stopniowo, montując peptyd przy użyciu nośnika z żywicy, z zastosowaniem strategii albo Boc, albo Fmoc.

Wszystkie odczynniki zastosowane jako związki wyjściowe są dostępne w handlu lub można je wytworzyć i oczyścić zgodnie ze sposobami postępowania znanymi w tej dziedzinie techniki.

179 628

W przypadku wytwarzania fosfopeptydu, w celu uniknięcia rozszczepienia grupy fosforanowej podczas odblokowywania zabezpieczonych peptydów, stosuje się roztwór kwasu trifluorometanosulfonowego i kwasu trifluorooctowego, zawierający stosowną mieszaninę zmiataczy.

Odblokowane peptydy poddaje się oczyszczaniu metodą chromatografii cieczowej wysokosprawnej z odwróconymi fazami na kolumnie C18-Vydac (Hesperia Calif.) w 0,1% kwasie trifluorooctowym, z zastosowaniem liniowego gradientu acetonitrylu, przy czym wyodrębnia się je za pomocą liofilizacji. Wszystkie fosfopeptydy otrzymuje się jako polihydratowane politrifluorooctany. Zawartość peptydu we wszystkich otrzymanych tak produktach wynosi od 65 do 90%, a ich czystość chromatograficzna wynosi ponad 95% (pik HPLC względne całkowanie przy λ = 225 nm). Analizie aminokwasów poddano kwaśne hydrolizaty (110°C, w ciągu 22 godzin w 6 N HC1 + 0,1% fenolu).

Alternatywnie, wpierw można przeprowadzić syntezę peptydu zawierającego tyrozynę niefosforylowaną, po czym do reszty tyrozyny można wprowadzić grupę fosforanową i to z wykorzystaniem albo metod enzymatycznych, albo metod chemicznych (i w tym ostatnim przypadku, inne grupy funkcyjne podatne na zajście reakcji ze środkiem fosforylującym należy zabezpieczyć we właściwy sposób).

W niniejszym opisie, użyto skrótów, odnoszących się do aminokwasów i grupy zabezpieczających, opartych na zaleceniach IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature [patrz : Eur. J. Biochem., tom 138, 9 - 37 (1984)]. W szczególności, w całym tekście użyto następujących skrótów:

Boc = tert-butyloksykarbonyl;

tBu = tert-butyl;

Bzl = benzyl;

OZ = 4-chlorobenzyloksykarbonyl;

DPCDI = diizopropylokarbodiimid;

DCM = dichlorometan;

DMF = dimetyloformamid;

Dnp = dinitrofenyl;

Fmoc = 9-fluorenylometoksykarbonyl;

RP-HPLC = chromatografia cieczowa wysokosprawna z odwróconymi fazami;

Trt = trifenylometyl.

Zdolność fosfolipidów według wynalazku do hamowania wiązania się wewnątrzkomórkowych przekaźników z receptorem kinazy tyrozynowej lub z białkiem Shc, ocenić można na podstawie eksperymentów nad inhibicją współzawodniczą, tak, jak to przedstawiono w części doświadczalnej, dotyczącej wiązania się z receptorem kinazy tyrozynowej. Dalszego dowodu biologicznego znaczenia miejsc autofosforylacji na receptorze kinazy tyrozynowej dostarcza test tworzenia ogniska, opisany w części doświadczalnej.

W szczególności, badanie to pokazuje, jak aktywność dotyczącą transformowania natywnego aktywowanego receptora HGF można skutecznie zahamować przez zmutowanie specyficznych miejsc autofosforylacji, o których mowa, na receptorze (mutacja Tyr-Phe).

Peptyd odtwarzający jedno z miejsc fosforylacji receptora HGF/SF lub Shc może więc przeszkadzać w wiązaniu przekaźników, hamując tym samym dalsze przekazywanie sygnału mitogennego i sygnału motogennego.

Toteż, peptydy według wynalazku można stosować do leczenia ludzi lub zwierząt, na przykład do leczenia choroby nowotworowej.

Peptydy według wynalazku występują bądź w postaci fosforylowanej, bądź w postaci niefosforylowanej. Ogólnie, postacią aktywną peptydów jest forma fosforylowana, jednakże można z pożytkiem podawać choremu peptyd w postaci niefosforylowanej i pozwolić peptydowi ufosforylować się już w organizmie chorego. Wynika to z tego, że peptydy mogą być łatwiej pobierane przez komórki wtedy, gdy występują w postaci niefosforylowanej.

179 628

Peptydy według wynalazku można podawać pacjentowi jakąkolwiek dogodną drogą podawania pozajelitowego, czy to jako takie, czy we właściwy sposób skoniugowane, w celu zwiększenia trwałości z punktu widzenia oddziaływania enzymów, a także biorąc pod uwagę przenikalność do komórek.

Wyboru sposobu stosowania, a mianowicie podawania drogą podskórną dożylną lub domięśniową dokonuje się na podstawie rozważenia takich czynników, jak wielkość dawki, częstotliwość podawania i szeregu innych, do których należy, na przykład, cel stosowania leku i masa ciała oraz wiek pacjenta poddawanego kuracji, a także ogólny stan chorego. Podaje się dawkę terapeutycznie skuteczną. Typowo, jednakże, peptyd podaje się w ilości wynoszącej od 10 do 1000 pg/dawkę korzystniej w dawce wynoszącej od 50 do 500 pg, i to dla każdej drogi podawania.

Peptyd można sformułować w kompozycję farmaceutyczną która zawiera także farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik. Zastosować w tym przypadku można jakikolwiek odpowiedni nośnik lub rozcieńczalnik, w zależności od wybranej drogi podawania.

Figura 1. Hamowanie wiązania się p85 z receptorem HGF/FS przez peptydy z fosforylowaną tyrozyną

Rekombinantowy receptor HGF/SF poddano oczyszczaniu metodą immunoprecypitycji z zakażonych bakulowirusem komórek Sf9 przy użyciu króliczej surowicy odpornościowej monoklonalnej i fosforylowano przy użyciu zimnego ATP. Lizaty komórek Sf9 wyrażające p85 wstępnie inkubowano z każdym fosfopeptydem (lOpM). Następnie lizaty pozostawiono do zasocjowania z unieruchomionymi rekombinantowymi receptorami HGF/SF. Po zasocjowaniu otrzymany kompleks przemyto i związaną z receptorem p85 wykrywano z zastosowaniem testu kinazowego in vitro, jak to opisano w części „Materiały i metody” w przykładzie 4. Fosfopeptydy identyfikowano poprzez numer N-końcowej tyrozyny.

Figura 2. Hamowanie wiązania się p85 z receptorem HGF/SF przy różnych stężeniach peptydów z fosforylowaną tyrozyną.

Użyto fosfopeptydów o wysokiej skuteczności konkurencyjnego wyłączania wiązania się p85 z receptorem HGF/SF (fig. 1), w stężeniach wzrastających (10 nM, 100 nM, 1 μΜ - od lewej do prawej), w celu określenia ich względnego powinowactwa do p85. Warunki, w których przeprowadzono eksperyment, były takie same, jakie opisano odnośnie do fig. 1. Jako kontroli negatywnej dla interakcji p85 użyto fosfopeptydu 1365.

Figura 3. Hamowanie wiązania się holoenzymu 3-kinazy PI z receptorem HGF/SF przez peptydy z fosfoiylowaną tyrozyną.

Badaniu poddano fosfopeptydy o wysokiej skuteczności konkurencyjnego wyłączania p85 (fig. 1), pod względem ich zdolności do przeszkadzania wiązaniu się holoenzymu 3-kinazy PI z receptorem HGF/SF. Cytosolowe ekstrakty z komórek A549 po ich trzydniowym głodzeniu inkubowano wstępnie z każdym z fosfopeptydów (10 μ M), po czym inkubowano z unieruchomionym rekombinantowym receptorem HGF/SF. Obecność zasocjonowanej z receptorem 3-kinazy PI w kompleksach odpornościowych ustalano w teście aktywności 3-kinazy PI. Jak to opisano w części „Materiały i metody” w przykładzie 4. Wskazano pozycję fosfatydyloinozytolo-3-fosforanu (PIP) utworzonego w reakcji z udziałem 3-kinazy PI.

Figura 4. Wpływ mutacji Tyr-Phe na wzajemne oddziaływanie receptora HGF/SF i p85.

Komórki COS 7 transfekowano plazmidami kodującymi receptor HGF/SF dzikiego typu (wt) lub receptory, w których kodon tyrozyny we wskazanej pozycji był przekształcony w kodon fenyloalaniny, indywidualnie lub w kombinacji. Komórki COS 7 wyrażają andogenny receptor HGF/SF. Jednakże, białko małpie nie jest rozpoznawane przez monoklonalne przeciwciało przeciw C- końcowemu peptydowi swoistemu dla ludzi. Przeciwciał tych użyto do wybiórczej immunoprecypitacji ludzkiego receptora HGF/SF z transfekowanych komórek COS 7. Unieruchomiono, wstępnie ufosforylowane receptory inkubowano z lizatami komórek Sf9 wyrażających p85, Na rysunku A, tak receptor jak i p85 były znakowane in vivo testem kinazowym, jak to opisano w części „Mateiały i metody” w przykładzie 4. Na rysunku B,

179 628 obecność p85 w kompleksie odpornościowym receptora ustalono metodą immunoblottingu przy użyciu monoklonalnych przeciwciał anty-p85.

Figura 5. In vivo wpływ mutacji Tyr-Phe na wzajemne oddziaływanie receptora HGF/SF i holoenzymu 3-kinazy PI.

Komórki COS 7, wyrażające receptory dzikiego typu lub zmutowane, stymulowano HGF/SF i zlizowano. Receptory wydzielono za pomocą immunoprecypitacj i z monoklonalnymi przeciwciałami swoistymi dla ludzi. Na rysunkach A i B obecność zasocjowanej z receptorem 3-kinazy PI została ustalona w teście aktywności 3-kinazy PI, jak to opisano w części „Materiały i metody” w przykładzie 4. Wskazano pozycję fosfotydyloinozytolo-3-fosforanu (PIP) utworzonego w reakcji z udziałem 3-kinazy PL Rysunki C i D pokazują, przez immunoblot (z użyciem monoklonalnych przeciwciał swoistych dla ludzi), ze próbki przebadane pod względem aktywności 3-kinazy PI zawierały równoważne ilości receptora rekombinantowego. Otrzymano mutanta receptora TK' za pomocą przekształcenia reszty kwasu asparaginowego w pozycji 1204 w resztę asparaginy. Wynikiem tego jest utworzenie receptora HGF/SF nieaktywnego w stosunku do kinazy.

Figura 6. Identyfikacja Y_I349 i Y]356 jako miejsce in vitro fosforylacji w receptorze HGF/SF za pomocą mapowania fosfopeptydem trypsynowym.

Profil A pokazuje wyniki analizy, wykonanej metodą HPLC przy 214 nm, syntetycznego, niefosforylowanego peptydu (I24K), który odpowiada peptydowi trypsynowemu zawierającemu miejsca tyrozyny Y₁₃₄₉ i Y₁₃56 w receptorze HGF/SF. I24K eluuje się z kolumny HPLC po upływie 65 minut. Rysunki B i C pokazują profile elucji radio-HPLC fosfopeptydów trypsynowych, pochodzących od in vitro [γ - ³²P] ATP-fosforylowanego receptora dzikiego typu (B) i zmutowanego receptora Phe₁₃₄₉ . _]356 (C).

Figura 7. Ocena względnego powinowactwa fosfotyrozyny 1313, 1349 i 1356 do domen N- i C- SH2 p85.

Powinowactwo oznaczono metodą biospecyficznej analizy interakcji przy użyciu aparatu BIAcore [U. Jonsson, L. Fagerstam, H. Roos, J. Ronnberg, Sjolander, E. Stenber, R. Stahlberg, C. Urbaniczky, H. Ostlin i Malmąuist: „Surface plasmon resonance and microfluidics for real time biospecific interaction analysis”, Biotechniąues, U, 520 - 527 (1991); U. Jonsson i M. Malmąuist: „Real time Biospecific analysis. The integration of surface plasmon resonance detection, generał biospecific interface chemistry and microfluidics into one analytical system”, w : F. Turner (red.) Advances in Biosensors, tom 2, str. 291 - 336, wyd. 2 JAI Press, Londyn (1992); R. Karlsson, A. Michaelsson i L. Mattsson: „Kinetic analysis of monoclonal antybody - antigen interactions with a new biosensor based analytical system”. J. Immunol. Meth.. 145, 229-246(1991)].

Powinowactwo względne oznaczono przez pomiar zdolności fosfopeptydów do hamowania interakcji domen SH2 z unieruchomionym fosfopeptydem (DMSKDESVDY*VPMLDMK) obejmującym Y₇₅₁ w receptorze ludzkiego PDGF. Rysunki A i B pokazują wyniki tych pomiarów, wyrażone jako % zahamowania wiązania z fosfopeptydem Y751. Rysunek C pokazuje stężenia fosfopeptydu potrzebne do osiągnięcia półmaksymalnego zahamowania wiązania.

Figura 8. Test tworzenia ognisk z różnymi produktami konstrukcji TPR-MET.

W TPR-MET¹³⁴⁹, TPR-MET Phe¹³⁵⁶ i TPR-MET Phe¹³⁴⁹’ ¹³⁵⁶, reszty tyrozyny odpowiadające Tyr₁₃₄₉ i/lub Tyr_I356 receptora HGF/SF zostały zmutowane do fenyloalaniny.

Figura 9. SF/HGF indukuje fosforylację Shc i asocjację z receptorem SF/HGF oraz Grb2.

Komórki A549, albo kontrolne, albo wyrażające cDNA Shc z mutacją Υ³¹⁷_^ F (A549/Y317F) hodowane aż do stadium zlania się, po czym przetrzymano w podłożu bez surowicy w ciągu 24 godzin, a następnie zlizowano. Tam, gdzie to wskazano znaczkiem (+), komórki stymulowano w ciągu 5 minut czystym SF/HGF użytym w ilości 200 jedn/ml. Kompleksy odpornościowe, wytrącone z pierwszym przeciwciałem (IPP) rozdzielono (9% SDS - PAGE) i analizowano metodą immunoblottingu z drugim przeciwciałem (WB), jak to pokazano. Strzałki wskazują endogenne formy Shc (p46, p52, p56), łańcuch β receptora

179 628

SF/HGF (pl45), transfekowanego znakowanego mutanta Shc (izoformy p53 i p58) oraz białe Grb2 (p23).

Figura 10. Asocjacja i fosforylacja tyrozyny Shc zależą od aktywności receptora SF/HGF względem kinazy.

Lizaty komórek COS 1 przejściowo wyrażających cDNA receptora SF/HGF dzikiego typu (WT) lub zmutowanego receptora obarczonego defektem kinazowym (LYS’) poddano immunoprecypitacji albo z monoklonalnym przeciwciałem anty-Met (A i B), albo z poliklonalnymi surowicami anty-Shc (C i D), a następnie analizie techniką Western blotting i sondowaniu przeciwciałami albo anty-Met, albo anty P-Tyr, tak, jak to pokazano. Strzałki wskazują białko prekursorowe (pl70), które w komórkach COS-1 stanowi przeważającą w pełni funkcjonalną formę receptora SF/HGF [Ponzetto i in., Mol. Celi. Biol., 13, 4600 - 4608 (1993)]. p46, p52 i p56 są to izoformy Shc.

Figura 11. Wiązanie się domen SH2 Shc i Grb2 z białkami solubilizowanymi z komórek potraktowanych SF/HGF.

Sporządzono lizaty ze zlewających się monowarstw nie stymulowanych (-) lub stymulowanych SF/HGF (+) komórek A549. Eksperymenty przeprowadzono nad asocjacją wykonywano w ten sposób, że inkubowano całkowite białko komórkowe z rekombinantowym GST-SH2.Shc (A) lub GST-SH2.Grb2 (B), unieruchomionym na Glutathione Sepharose. Białka związane wyeluowano i poddano analizie techniką Western blotting, z użyciem wskazanych przeciwciał.

Figura 12. Mapowanie miejsc wiązania Shc na receptorze SF/HGF.

Komórki COS-1, wyrażające receptory SF/HGF, albo (WT), albo zmutowane Y-^F, w resztach wskazanych nad każdą ścieżką poddano koimmunoprecypitacji z przeciwciałami anty-Shc, a następnie błottingowi i uwidoczniono przy użyciu przeciwciał anty-Met. Strzałka wskazuje prekursora receptora (pl70).

Figura 13. Domena SH2 Shc wiąże się z miejscem cumowania receptora SF/HGF (Y¹³⁵⁶), ale nie ze swym własnym (Y³¹⁷).

Shc-SH2, w tych samych stężeniach, wstrzyknięto na dwie powierzchnie biosensorą na których były unieruchomione dwa fosfopeptydy. Y1356P pochodzi z sekwencji VNATY^I3>6VNVK końcowego segmentu receptora; Y317P pochodzi z sekwencji DDPSY³¹⁷-VNVQ. Należy zauważyć, że oba te peptydy zawierają ten sam rdzeń (YVNV), ale różne sekwencje „w górę”, Początkowy szybki wzrost odpowiedzi wynika z „efektu objętościowego” spowodowanego wstrzyknięciem roztworu.

Figura 14. Nadekspresja Shc wzmaga odpowiedź mitogennąna SF/HGF.

Komory Boydena (typu „blind-well”) wyposażono w filtry poloiwęglanowe (o porach wielkości 8 pm) pokryte żelatyną. Komórki oznakowano, z zastosowaniem 5- [¹²⁵J] jodo-2'-dezoksyurydyny (patrz : część „Metody”) i umieszczono w komorze górnej. Natomiast komora dolna została napełniona podłożem nie zawierającym surowicy, uzupełnionym oczyszczonym SF/HGF, użytym we wskazanych stężeniach. Inkubację prowadzono w ciągu 6 godzin, w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inkubacji komórki, które przywarły do górnej strony filtra, usunięto mechanicznie. Natomiast komórki, które przewędrowały na dolną stronę filtra utrwalono i skwantyfikowano przy użyciu licznika promieniowania γ (osie Y: związany CPM). Rysunek dolny przedstawia fbtomikrografię o małym powiększeniu (4 x) komórek, które przewędrowały na dolną stronę filtra w obecności SF/HGF znajdującego się w ilości 40 jedn/ml. Komórki zakażone były albo retrowirusem z sDNA SHC (SHC - plXSN)), albo pustym wirusem (MOCK).

Figura 12. Domena SH2 Grb2 wiąże się z miejscem cumowania Y³¹⁷ Shc.

Rysunek A: sensorogramy otrzymane po wstrzyknięciu Gst-SH2.Grb2 w szeregu różnych stężeń na unieruchomiony fosfopeptyd pochodzący z sekwencji Shc DDPSY³¹⁷VNVQ.

Rysunek B: wpływ konkurencyjnego peptydu na szybkość dysocjacji. Pod koniec wstrzykiwania Grb2, wstrzyknięto bufor lub 20 M roztwór niebiotynylowanego fosfopeptydu.

Rysunek C: analiza danych uwidocznionych na rysunku A.

179 628

Wykresy po stronie lewej przedstawiają szybkość wiązania w funkcji względnej odpowiedzi dla sześciu różnych sensorogramów. Po stronie prawej przedstawiono nachylenie każdej linii naniesionej na wykres w funkcji stężenia : nowe nachylenie podaje wartość stałej szybkości asocjacji.

Figura 16. Model wzajemnego oddziaływania receptora SF/HGF i zawierających SH2 cząsteczek adapterowych Shc i Grb2.

Grb2 wiąże się, z wysokim powinowactwem, z miejscem cumowania Y¹³⁵⁶VNV na końcowym segmencie receptora. Adaptorowa cząsteczka Shc może oddziaływać wzajemnie albo z fosfotyrozyną Y¹³⁴⁹ albo z fosfotyrozyną Y¹³⁵⁶. Po związaniu się, Shc ulega transfosforylacji z udziałem receptora w miejscu Y³¹⁷, w wyniku czego odtwarza się miejsce cumowania dla Grb2 o wysokim powinowactwie. Tak więc, receptor może aktywować odpowiedź motogenną poprzez szlak Shc, bez zakłócania odpowiedzi mitogennej, w której rolę pośrednika gra Ras, pobudzanej przez Grb2-SoS.

Wynalazek objaśniają następujące przykłady.

Przykład 1. Otrzymywanie H-Tyr*Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH (Wzór 1).

0,89 g (0,5 mmola) żywicy [Fomoc-Tyr(+Bu)-4-(oksymetylo)fenoksymetylo-kopoli(styren-1% diwinylobenzenowej)] (0,56 mmola/g) poddano obróbce w następującym cyklu obejmującym etapy od (1) do (5).

(1) DMF, ' (2) piperydyna (20%) w DMF, (3) DMF, (4) wstępnie utworzony estrer 1-hydroksybenzotiazolu (2,0 mmola) i Fmoc-aminokwasu w DMF

Objętości przemy wek i odczynników wynosiły od 10 do 20 ml.

Każdy etap powtarzano tyle razy, ile to było potrzebne albo do całkowitego przereagowania żywicy (etapy 2 i 4), albo do wyparcia poprzedniego odczynnika z żywicy (etapy 1, 3 i 5). Po każdym cyklu pobierano próbki żywicy i sprawdzano pod względem zajścia reakcji do końca próbą ninhydrynową. Estry 1-hydroksybenzotriazolu i Fmoc-aminokwasów otrzymywano tuż przed ich użyciem, na drodze reakcji 2,0 mmola Fmoc-aminokwasu, 2,0 mmola 1-hydroksybenzotriazolu i 2,0 mmola DPCDI w środowisku DMF.

Cykl reakcji (1) do (5) powtarzano dla każdej reszty aminokwasu tak, aby uzyskać sekwencje o wzorze I.

Następujące zabezpieczone aminokwasy dodawano w poniżej podanym porządku:

Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH i Boc-Tyr (PO3Bzl2)-OH.

Po zakończeniu ostatniego cyklu, (peptydylo)żywicę przemyto kilkakrotnie DMC, po czym wysuszono.

W wyniku tego postępowania otrzymano 0,54 g produktu (w odniesieniu do żywicy wyjściowej).

1,0 g (peptydylo)żywicy mieszano w ciągu 3 godzin, w temperaturze 0°C, z 20 ml mieszaniny złożonej z kwasu trifluorometanosulfonowego, kwasu trifluorooctowego, disulfidu dimetylowego i etanoditiolu (20 : 50 :3 :3 : 1). Odblokowany peptyd wytrącono przy użyciu 1 litra eteru dietylowego i zebrano za pomocą odsączenia.

Surowy peptyd poddano oczyszczaniu metodą RP-HPLC na kolumnie C18-Vydac (Hesperia, CA) (2,2 x 25 cm) w 0,1% kwasie trifluorooctowym, z zastosowaniem liniowego gradientu acetonitrylu od 0 do 65%, w ciągu 90 minut.

Frakcje zawierające produkt w czystej postaci połączono, po czym odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem acetonitryl i pozostały roztwór zliofilizowano. Otrzymano 132 mg związku o wzorze I, którego czystość chromatograficzna (HPLC) wynosiła 95,7%. Stosunki ilościowe aminokwasów: Ala 1 (1); Asp 1,07 (1); His 0,96 (1); Thr ),91 (1); Tyr 1,88 (2); Val 2,03 (2).

Zawartość peptydu: 73,7%.

179 628

Spektroskopia mas (FAB): m/z 1044,4 [M-H]'.

Przykład 2. Otrzymywanie H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH (Wzór II).

Przy użyciu 0,5 mmola żywicy [Fmoc-Ala-4-(oksymetylo)fenoksymetylo-kopoli(styren-1% diwinylobenzenowej)] i przy dodawaniu zabezpieczonych aminokwasów w następującym porządku: Fmoc-Val-OH, Fmoc-Cys(trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asn-OH,Fmoc-Val-OH, Boc-Tyr-OH, zmontowano na żywicy defosfopeptyd w taki sam sposób, jaki opisano w przykładzie 1.

Po zakończeniu ostatniego cyklu, przeprowadzono fosforylację reszty tyrozyny bezpośrednio na peptydzie wciąż jeszcze związanym z żywicą, za pomocą podziałania na (peptydylo)żywicę roztworem 30 równoważników IH-tetrazolu i 10 równoważników Ν,Ν-diizopropylofosforoamidynu di-tert-butylu w DMF, w ciągu godziny, w temperaturze 25°C, a następnie roztworem 20 równoważników wodoronadtlenku tert-butylu w toluenie, w ciągu godziny, w temperaturze 25°C. Rozszczepienie, usunięcie grupy zabezpieczających i oczyszczenie produktu surowego przeprowadzono na 1,0 g (peptydylo)żywicy w sposób opisany w przykładzie 1.

Stosunki ilościowe aminokwasów: Ala 1 (1); Asp 1,02 (1); Cys nie oznaczono (1); Lys 0,99 (1); Tyr 0,95 (1); Val 2,98 (3).

Zawartość peptydu: 68,9%.

Spektroskopia mas (FAB): m/z 973,4 [M-H]'.

Przykład 3. Otrzymywanie H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-ValLys-OH (wzór III).

0,74 g (0,5 mmola) żywicy [Boc-Lys(ClZ)-4-(oksymetylo)-fenyloacetamidometylokopoli(styren -1% diwinylobenzenowej)] (0,68 mmola/g) poddane obróbce w następującym cyklu obejmującym etapy od (1) do (7):

(l)DCM, (2) kwas trifluorooctowy (50%) w DCM, (3) DCM, (4) diizopropyloetyloamina (5%) w DMF, (5) DMF, (6) wstępnie utworzony ester 1 -hydroksybenzotriazolu i Boc-aminokwasu w DMF, (7) DMF.

Każdy etap powtarzano tyle razy, ile to było potrzebne albo do całkowitego przereagowania żywicy (etapy 2, 4 i 6), albo do wyparcia poprzedniego odczynnika z żywicy (etapy 1, 3, 5 i 7).

Po każdym cyklu pobierano próbki żywicy i sprawdzano pod względem zajścia reakcji do końca stosując próbę ninhydrynową. Estry 1-hydroksybenzotriazolu i Boc-aminokwasów otrzymywano tuż przed ich użyciem na drodze reakcji 2,0 mmola Boc-aminokwasu, 2,0 mmola 1-hydroksybenzotriazolu i 2,0 ml DPCDI w środowisku DMF.

Cykl reakcji (1) do (7) powtarzano dla każdej reszty aminokwasu tak, aby uzyskać sekwencję o wzorze III.

Następujące zabezpieczone aminokwasy dodawano w poniżej podanym porządku:

Boc-Val-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Val-OH, Boc-Tyr(PO3Bzl2)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Val-OH, Boc-His-(Dnp)-OH, Boc-Val-OH i BocTyr(PO3Bzl2)-OH.

Po zakończeniu syntezy, usunięto grupę zabezpieczającą His-(Dnp) za pomocą podziałania 15 ml 1 M roztworu tiofenolu w DMF bezpośrednio na peptydzie wciąż jeszcze związanym z żywicą po czym (peptydylo)żywicę przemyto kilkakrotnie DCM, a następnie wysuszono.

W wyniku tego postępowania otrzymano 1,51 g (peptydylo)-żywicy.

Rozszczepienie, usunięcie grup zabezpieczających i oczyszczenie produktu surowego przeprowadzono na 1,0 g wyjściowej (peptydylo)żywicy w sposób opisany w przykładzie 1. W wyniku tego otrzymano 196 mg związku o wzorze III, o czystości chromatograficznej

179 628 (HPLC) wynoszącej 95,9%. Stosunki ilościowe aminokwasów: Ala 1 (1); Asp 1,99 (2); His 1,05 (1); Lys 0,97 (1); Thr 0,93 (1); Tyr 1,85 (2); Val 4,01 (4).

Zawartość peptydu: 71,1%.

Spektroskopia mas (FAB): m/z 1564,62 [M-H]'.

Przykład 4. Materiały i metody

Odczynniki, komórki, przeciwciała.

Wszystkie odczynniki, jeżeli tego inaczej nie zaznaczono, zostały dostarczone przez firmę Sigma Chemical Co. Białko A, kowalencyjnie związane z Sepharose, dostarczyła firma Pharmacia LKB Biotechnology Inc. Wszystkie izotopy promieniotwórcze otrzymano z firmy Amersham Corp. Komórki raka płuc A549 oraz komórki COS-7, dostarczone przez ATCC (CCL 185) (American Type Culture Collection), hodowane były na podłożu DMEM, uzupełnionym 10% płodowej surowicy cielęcej (Flow Laboratories, Inc.) w atmosferze 5% CO₂, nasyconej H₂O). Komórki Spodoptera frugiperda (Sf9), pochodzące z ATCC (CRL 1711), hodowano w postaci hodowli jednowarstwowych z zastosowaniem podłoża SF-900 (GIBCO BRL). Surowice odpornościowe i monoklonalne przeciwciała anty-Met były utworzone w odpowiedzi na syntetyczny peptyd, odpowiadający 19 C-końcowym aminokwasem sekwencji ludzkiego MET [M. Prat i in., Mol. Celi. Biol., 11 (12), 5954 - 5962 (1991)]. Przeciwciała przeciw p85 opisali Otsu i wsp. [M. Otsu i in., Celi, 65, 91 - 104 (1991)].

Syntezę fosfopeptydów syntetycznych przeprowadzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w przykładach 1-3.

Ekspresja receptora HGF/SF i cDNA p85 w komórkach owadów z zastosowaniem bakulowirusów jako wektorów.

Rekombinantowy receptor HGF/SF oraz bakulowirusy p85 skonstruowano sposobem poprzednio opisanym [A. Bardelli i in., Onkogene, 7, 1973 - 1978 (1992); M. Otsu i in., Celi, 65, 91 - 104 (1991), po czym użyto do zakażenia komórek SI9 H. Piwnica-Worms i in., J. Virol., 64, 61 - 6 (1990)].

Białka sprzężone GST z domeną SH2.

Domeny N- i C-SH₂ podjednostki p85 bydlęcej 3-kinazy PI (aminokwasy 314-431 i 612 - 722) otrzymano na drodze polimerazowej reakcji łańcuchowej i wklonowano do bakteryjnego wektora ekspresji [D.B. Smith i K.S. Johnson, Gene, 67, 31 -40 (1988)].

Białka sprzężone typu S-transferazy glutaminowej (GST) - SH2 oczyszczono z lizatów bakteryjnych za pomocą glutationowej chromatografii powinowactwa [G. Panayotou i in., EMBO J., 11, 4261 - 4272 (1992)]. Do oznaczenia stężenia białek rekombinantowych użyto analizy aminokwasów, przeprowadzanej z wykorzystaniem analizatora Applied Biosystems 420A. Ukierunkowana pod względem miejsca mutageneza i ekspresja w komórkach COS 7 dDNA MET.

Już poprzednio doniesiono o klonowaniu cDNA MET [C. Ponzetto i in., Oncogene, 6, 553 - 559 (1991), EMBL Data Bank numer sprawy Χ54559], Fragment 3'-końcowy, od nukleotydu 2355 do końca subklonowano w pSELECT™-!. Ukierunkowanej względem miejsca mutagenezy dokonano przy wykorzystaniu układu do in vitro ukierunkowanej względem miejsca mutagenezy z użyciem oligonukleotydów (Altered Sites™ in vitro Mutagenesis System, Promega). Oligonukleotydy syntetyzowano przy użyciu aparatu Applied Biosystem 391. Klony mutantowe identyfikowano za pomocą sekwencj onowania (zestaw do sekwencj onowania T7 z firmy Pharmacia). Pełnowymiarowe cDNA MET z odpowiednią mutacją Tyr-Phe rekonstruowano w wektorze PMT2, który zawiera głównego późnego promotora adenowirusa. Wszystkie plazmidy transfekowano lipofektyną (GIBCO BRL) w komórkach COS 7.

Eksperymenty nad asocjacją in vitro.

Komórki Sf9, wyrażające rekombinantowego receptora HGF/SF (w przybliżeniu 4 χ 10⁶ komórek/miejsce), po upływie 36 godzin od zakażenia, poddano lizie w buforze A (10 mM bufor Tris-HCl, pH 7,5, 10% gliceryna, 1% Triton Χ-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA), uzupełnionym 0,2 mM fluorkiem fenylometylosulfonylu, 1 μ g/ml leupeptyny, 0,1 TIU/ml aprotyniny i 1 μ g/ml pepstatyny. Otrzymane lizaty sklarowano za pomocą wirowania przy

179 628

15000 χ g, w temperaturze 4°C, w ciągu 15 minut, po czym utworzone supernatanty poddano immunoprecypitacji po 2-godzinnej inkubacji w obecności przeciwciał anty-Met przyłączonych do Protein A-Sepharose. Utworzone kompleksy odpornościowe przemyto trzykrotnie buforem A, jeden raz buforem B (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA), oraz jeden raz buforem C (25 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-l-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) (bufor o pH 7,2), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂). Próbki poddano wstępnej fosforylacji za pomocą inkubowania w ciągu 15 minut w temperaturze 25°C, w buforze C z 10 μ M nieznakowanego ATP, po czym przemyto trzykrotnie zimnym buforem A, uzupełnionym 1 mM ortowanadanem sodowym. Asocjację unieruchomionego receptora z p85 wyrażonym z udziałem bakulowirusa przeprowadzono sposobem poprzednio opisanym [A. Bardelli i in., Onoogene, 7, 1973 - 1978 (1992)]. Przy przeprowadzeniu eksperymentów nad asocjowaniem z udziałem holoenzymu 3-kinazy PI, używano, jako źródła 3-kinazy PI komórek A549 (w ilości około 2 χ 10⁶ komórek/miejsce) utrzymywanych w ciągu trzech dni w podłożu bez surowicy. Komórki A549 zhomogenizowano (przy użyciu homogenizatora Dounce'a) w buforze MOPS (20 mM kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy) (pH 7,5), 1 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA, 200 mM sachoroza, 1 mM ortowanadan sodowy) wzbogaconym 0,2 mM fluorkiem fenylometylosulfonylu, 1 μ g/ml leupeptyny, 0,1 TIU/ml aprotyniny i 1 μ g/ml pepstatyny. Otrzymane homogenaty wirowano przy 100000 x g, w ciągu 20 minut, w temperaturze 4°C,

W celu sprawdzenia zdolności fosfopeptydów do blokowania asocjacji z receptorem, otrzymane lizaty komórek wstępnie inkubowano z fosfopeptydarni w ciągu godziny, w temperaturze 4°C, po czym inkubowano z unieruchomionym rekombinantowym receptorem HGF/SF. Po przeprowadzonej asocjacji, kompleksy odpornościowe przemyto trzykrotnie buforem A, dwukrotnie buforem D (0,5 M LiCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6) i dwukrotnie buforem B.

Obecność podjednostki p85 3-kinazy PI w receptorowym immunoprecypitacie ustalono z wykorzystaniem następujących metod: i) znakowanie receptora i zasocjowanych białek przy użyciu [γ - ³²P] ATP w in vitro teście kinazowym; ii) technika Western immunoblott; iii) test aktywności 3-kinazy PI.

Eksperymenty nad asocjacją in vivo.

Transfekowane komórki COS 7, wyrażające mutanty receptora HGF/SF, stymulowano w ciągu 10 minut, w temperaturze 37°C, przy użyciu HGF/SF (w ilości 12 ng/ml), po czym zlizowano w buforze A w obecności 1 mM roztworu ortowanadanu sodowego. Następnie lizaty tak otrzymane sklarowano za pomocą wirowania przy 15000 x g, w temperaturze 4°C, w ciągu 15 minut. Otrzymane supernatanty poddano immunoprecypitacji po przeprowadzeniu dwugodzinnej inkubacji z przeciwciałami anty-Met swoistymi dla białka ludzkiego, przyłączonymi do protein A - Sepharose. Utworzone w ten sposób kompleksy przemyto dwukrotnie buforem A, dwukrotnie buforem D i dwukrotnie buforem B. Obecność w kompleksie zasocjowanej z receptorem 3-kinazy PI ustalono z wykorzystaniem testu aktywności 3-kinazy PI, sposobem opisanym przez Whitmana i wsp [M. Whitman i in., Naturę, 315, 239 242 (1985)].

Test kinazowy in vitro.

Białka zasocjowane z receptorem znakowano w 20 μΐ buforu C, w temperaturze 25°C, w ciągu 15 minut, przy użyciu 10 μ Ci [γ - ³²P] (aktywność promieniotwórcza właściwa 7000 Ci/Mm; Amersham). Reakcję zatrzymano za pomocą dodania 1 ml buforu A o temperaturze lodu. Bufor ten nie zawierał inihibitorów proteazy. Próbki przemywano trzykrotnie zimnym buforem A. Oznakowane kompleksy odpornościowe eluowano z Protein A-Sepharose wrzącym buforem Laemmli'ego. Następnie, otrzymane supernatanty poddano elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z 8% siarczanu dodecylo-sodowego (SDS-PAGE).

179 628

Technika Western immunoblotting.

Immunoprecypitaty po zasocjowaniu solubilizowano we wrzącym buforze Laemmli'ego, poddano rozdzielaniu na 8% SDS-PAGE i za pomocą transferu elektroforetycznego przeniesiono na filtry nitrocelulozowe (Hi-bond, Amersham). Następnie filtry te inkubowano ze wskazanymi przeciwciałami i specyficzne wiązanie wykrywano metodą wzmocnionej chemiluminescencji (System EKC™, Amersham).

Mapowanie trypsynowym fosfopeptydem.

Z żeli poliakryloamidowych wycięto pasma ³²P-znakowanego produktu, odpowiadające in vitro fosforylowanym receptorom HGF/SF dzikiego typu i mutantowym, po czym poddano je dalszej obróbce sposobem opisanym poprzednio [R. Ferracini i in., J. Biol. Chem. 266, 19558 - 19564 (1991)]. Produkty trawienia peptydów trypsyną rozpuszczono w 100% dimetyloformamidzie, po czym rozcieńczono do 50% buforem wsadowym HPLC (0,1% kwas trifluorooctowy w wodzie) i poddano rozdzielaniu metodą chromatografii cieczowej wysokosprawnej (HPLC) na kolumnie Reverse Phase C₂/C_lg Superpack Pep-S (Pharmacia), z zastosowaniem gradientu acetonitrylu (0 - 32% w ciągu 70 minut), w obecności 0,1% kwasu trifluorooctowego, przy szybkości przepływu 1 ml/minutę. Postęp elucji promieniotwórczości śledzono stosując urządzenie Radiomatic A-100 Radioactive Flow Detector (Packard Instrument Co.). Jako kontroli użyto peptydu syntetycznego (124K), Neosystem Laboratories), który poddano rozdzielaniu metodą HPLC jak wyżej i azanlizowano przy 214 run. I24K zawiera 24 aminokwasy, od izoleucyny 1337 do lizyny 1360, sekwencji białka Met, i w ten sposób odpowiada on prognozowanemu fosfopeptydowi trypsynowemu, będącemu przedmiotem zainteresowania, a tą tylko różnicą, że nie jest on fosforylowany.

Analiza interakcji Y₁₃₄₉ i Yi₃₅₆ z domenami N- i C-SH2 p85 przy użyciu biosensora BIAcore.

Szczegóły budowy i zasada działania biosensora BIAcore są opisane w literaturze fachowej [U. Jonsson i in., Biotechniąues, U, 520 - 527 (1991); U. Jonsson i M. Malmąuist w: F. Turner (red.) „Advances in Biosensor, tom 2, JAI Press, Londyn (1992); R. Karlsson i in., J. Immunol. Meth., 145, 229 - 246 (1991)]. Domeny SH2 stosowane w opisywanych tu eksperymentach odsolono z wykorzystaniem kolumny Pharmacia w układzie chromatograficznym SM ART, w celu uzyskania wymiany buforu na bufor roboczy BIAcore, składający się z 20 mM Hepes, pH 7,4,150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA 0,005% Tween 20 i 4 mM DTT. Na chropowatej powierzchni sensora, po aktywacji przy użyciu mieszaniny N-hydroksysukcynoimidu (NHS) i chlorowodorku N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC (Pharmacia), unieruchomiono awidynę (Boehringer) w stężeniu 50 μ g/ml w 20 mM buforze z octanem sodowym, pH 4,0, przy czym wspomniane składniki powyższej mieszaniny użyto we wzajemnym stosunku ilościowym 1:1. Nadmiarowe grupy aktywne zablokowano 1,0 M roztworem etanoloaminy. Na awidynę nastrzykiwano biotynylowany fosfopeptyd Y751 (DMSKDESVDYVPMLDMK) przy szybkości przepływu wynoszącej 5 μ g/sekundę, w ciągu 50 sekund. Substancje, które nie uległy związaniu w sposób specyficzny, usunięto za pomocą 0,1% SDS o krótkotrwałych (4 sekundy) impulsach.

Białka sprzężone GST z domeną SH2 zmieszano z całą serią stężeń fosfopeptydowych receptorów HGF/SF i nastrzykiwano na powierzchnię, przy szybkości przepływu wynoszącej 5 μΐ/minutę, w ciągu 40 sekund, w stałej temperaturze wynoszącej 25°C. Następnie usunięto substancje, które uległy związaniu z powierzchnią za pomocą 0,1% SDS o 4-sekundowych impulsach, z doprowadzeniem sygnału do poziomu tła.

Eksperymenty nad współzawodnictwem z zastosowaniem syntetycznych fosfopeptydów.

W początkowej fazie badań przeprowadzanych przez twórców niniejszego wynalazku stosowano syntetyczne fosfopeptydy do wyłączenia przez konkurencję wiązania się p85 lub 3-kinazy PI z rekombinantowym receptorem HGF/SF, przy czym próby te wykonywano in vitro w ramach doświadczeń nad asocjacją z udziałem wspomnianego receptora. Zamierzano pokryć fosfopeptydarni całość wchodzących w grę reszt tyrozynowych obecnych w cytoplazmatycznej części receptora HGF/SF. Wykaz omawianych tu fosfopeptydów przedstawiono w

179 628 powyższej części niniejszego opisu, w punkcie zatytułowanym „Korzystny wariant sposobu realizacji wynalazku itd.” na str. 10. Spośród wykazanych fosfopeptydów, szesnaście zawierało osiem reszt aminokwasowych i rozpoczynało się od reszty fosfotyrozyny na N-końcu. Jeden fosfopeptyd liczył dwanaście aminokwasów i obejmował dwie reszty fosfotyrozyny. We wcześniejszej pracy, przeprowadzonej z udziałem receptora PDGF, wykazano, że cztery aminokwasy znajdujące się bezpośrednio w dół od fosfotyrozyny mają ważne znaczenie, jeśli chodzi o określenie miejsca rozpoznawania SH2 [W. J. Fantl i in., Celi, 69, 413 - 423 (1992)].

W eksperymencie przedstawionym na fig. 1, twórcy wynalazku użyli lizatów komórek owadzich (Sf9) zakażonych rekombinantowym bakulowirusem jako źródła białka p85 [M. Otsu i in., Celi, 65. 91 - 104 (1991)]. Lizaty te, po odpowiednim rozcieńczeniu (patrz: Materiały i metody) inkubowano wstępnie z każdym z fosfopeptydów (10 μ M). po czym inkubowano z rekombinantowym receptorem HGF/SF. Następnie przeprowadzono immunoprecypitację receptora z lizatów komórek Sf9 zakażonych rekombinantowym bakulowirusem, z pełnowymiarowym cDNA ludzkiego MET [A. Bardelli i in., Oncogene, 7, 1973 - 1978 (1992)]. W komórkach tych, receptor syntetyzowany jest przeważnie w postaci nie rozszczepionego prekursora (na figurach oznaczony jako MET_Bac), który, jednakże, jest w pełni funcjonalny [(A. Bardelli i in., Oncogene, 7, 1973 - 1978 (1992)]. Receptor unieruchomiono na kuleczkach Protein-A Sepharose i wstępnie ufosforylowano przy użyciu zimnego ATP. Po zasocjowaniu, kuleczki przemyto i utworzone kompleksy fosforylowano przy użyciu [γ _ ³²P]-ATP. W trakcie zachodzenia reakcji fosforylacji zarówno receptor jak i p85 zostały oznakowane, a tym samym stały się wykrywalne w analizie SDS-PAGE. Figura 1 pokazuje, że tylko trzy spośród fosfopeptydów w skuteczny sposób wyłączały konkurencyjnie p85: H-Tyr*-Glu-Val-Met-Leu-Lys-Cys-Trp-OH, H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH i H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH.

Także fosfopeptyd H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH całkowicie zapobiegał wiązaniu się p85, podczas gdy fosfopeptyd H-Tyr-Cys-Pro-AspPro-Leu-Tyr-Glu-OH okazał się skuteczny jedynie częściowo. W eksperymencie przedstawionym na fig. 2, twórcy wynalazku poszukiwali możliwości określenia z grubsza względnego powinowactwa tych fesfolipidów do p85. Eksperyment ten przeprowadzono tak, że poprzedni, z tym, że fosfopeptydów użyto w stężeniach zmieniających się w zakresie od 10 nM do 1 μ M. Skuteczność konkurencyjnego wiązania się p85 z receptorem była najwyższa w przypadku fosfopeptydu o wzorze H-Tyr*-Glu-Val-Met-Leu-Lys-Cys-Trp-OH, po czym, kolejno, w przypadku H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH, H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH oraz H-Tyr*-Cys-Pro-Asp-Pro-Leu-Tyr-Glu-OH.

Pod względem powinowactwa do p85 fosfopeptyd H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH wydawał się porównywalny z fosfopeptydem o wzorze H-Tyr*-Val-Asn-VA1-Lys-Cys-Val-Ala-OH.

Ponieważ interakcja z katalityczną podjednostkąpl 10 mogłaby wpływać na konformację p85, otrzymane wyniki mogłyby nie odzwierciedlać prawdziwych właściwości domen SH2, w p85, w kompleksie. Aby wyeliminować taką możliwość, twórcy wynalazku przeprowadzili serię takich samych eksperymentów nad wzpółzawodnictwem, przy użyciu lizatów komórek A549 jako źródła holoenzymu 3-kinazy PI. Asocjację holoenzymu z receptorem rekombinantowym uwidoczniono pomiarem aktywności 3-kinazy PI w kompleksach z receptorem. Figura 3 pokazuje, ze fosfopeptydy, które okazały się zdolne do konkurencyjnego wyłączania p85, również przeszkadzają wiązaniu się holoenzymu 3-kinazy PI z receptorem HGF/SF. W szczególności należy zauważyć, że fosfopeptyd obejmujący zarówno fosfotyrozynę 1349 jak i fosfotyrozynę 1356 wydaje się być bardziej skuteczny jeśli chodzi o rugowanie holoenzymu 3-kinazy PI z receptora HGF/SF, od takich fosfopeptydów, które mieszczą w sobie tylko jedną z reszt tego rodzaju.

Wyniki pierwszej serii eksperymentów sugerowały, że istnieje możliwość obecności podwójnego miejsca wiązania dla 3-kinazy PI w receptorze HGF/SF, złożonego z par fosfotyrozyn, a mianowicie 1307 - 1313 i 1349 - 1356. To, że zaangażowana może być w takich

179 628 sytuacjach para reszt fosfotyrozyny, zostało wykazane odnośnie do receptora PDGF, w przypadku którego poznano, ze Tyr₇₄₀ i Tyr₇₅₎ tworzą miejsca wiązania 3-kinazy PI. [W. J. Fantl i in., Celi, 69, 413 - 423 (1992); A. Kazlauskas i in., Mol. Celi. Biol., 12, 2534 - 2544 (1992)]. Asocjacja p85 lub holoenzymu 3-kinazy PI z mutantami Tyr-Phe- receptora HGF/SF.

Wykonano serię konstrukcji za pomocą ukierunkowanej względem miejsca mutagenezy cDNA receptora dzikiego typu, zgodnie z typowymi metodami dobrze znanymi fachowcom w tej dziedzinie techniki. Konstrukcje te były przejściowo wyrażane w komórkach COS 7, w wyniku czego otrzymywano odpowiednie mutanty Tyr-Phe receptora: Phe₁₀₀₃, Phe₁₃₀₇, Phe₁₃₁₃, Phe₁₃₄₉, Phe₁₃₅₆ i Phe₁₃₆₅. Oprócz zamiany pojedynczego aminokwasu, dokonano także zamian wielokrotnych. W szczególności, autorzy wynalazku otrzymali dwa mutanty o podwójnych miejscach, potrzebne do dalszego wyjaśniania wyników eksperymentów przeprowadzonych nad współzawodnictwem : mutant Phe₁₃₀₇ - ₁₃₁₃ i mutant Phe₁₃₄₉.₁₃₅₆.

Figura 4 przedstawia wyniki eksperymentów przeprowadzonych nad asocjacją podobne do wyników pokazanych na fig. 1, przeprowadzonych przy użyciu tego samego źródła p85 (wyrażające komórki Sf9) oraz lizatu transfekowanych komórek COS 7 jako źródła receptorów dzikiego typu i zmutowanych. Transfekowane komórki COS 7 wyrażają prekursora receptora o jednym łańcuchu, jak również proteolitycznie przetworzonej formy dojrzałej, w stosunku 1 : 1. Po reakcji asocjacji, próbki podzielono na dwie części i poddano odmiennej obróbce, w rezultacie czego otrzymano wyniki przedstawione na rysunkach A i B. Na rysunku A zarówno receptor jak i p85 uwidoczniono za pomocą testu kinazowego. Rysunek ten pokazuje, że wszystkie zmutowane receptory są aktywne i że występują w ilościach porównywalnych. Podczas gdy wszystkie inne mutanty (a w szczególności Phe₁₃₀₇ - ₁₃₁₃) ciągle wiążąi fosrforylująp85, to sam tylko podwójny mutant Phe₁₃₄₉ . ₁₃₅₆ nie przejawia aktywności tego rodzaju. Na rysunku B, po zasocjowaniu, test kinazowy został pominięty i próbki poddano analizie metodą SDS-PAGE i przeniesiono na nitrocelulozę. Przy analizowaniu z zastosowaniem techniki Western blott używano monoklonalnych przeciwciał swoistych dla p85. Wyniki tego eksperymentu potwierdzają obserwację, że jedynie mutant Phe₁₃₄₉ - ₁₃₅₆ utracił zdolność wiązania się z p85. Należy zauważyć, że przy porównywaniu rysunków A i B wydaje się, że mutant Phe₁₃₅₆, aczkolwiek ciągle zdolny do wiązania się z p85, obarczony jest tym defektem, że nie może fosforylować p85. Nasuwa to przepuszczenie, że w kompleksie z tym mutantem receptora, p85 nie zajmuje pozycji odpowiedniej do skutecznego ufosforylowania.

Figura 5 pokazuje, że podobne wyniki można uzyskać także in vivo. W eksperymencie tym receptor poddano immunoprecypitacji z lizatów transfekowanych komórek COS 7 po stymulowaniu z udziałem HGF/SF. Lizę i immunoprecypitację prowadzono w obecności ortowanadanu sodowego w celu zapobieżenia odfosforylowaniu receptora. Następnie przeprowadzono test aktywności 3-kinazy PI z udziałem produktu immunoprecypitacji receptora, z korektą na zawartość białka Met, w celu ilościowego ujęcia ilości endogennej 3-kinazy PI współwytrąconej w kompleksie z receptorem. Jedynie podwójny mutant, Phe₁₃₄₉ . ₁₃₅₆ współwytrącał się z ilością akty wności 3-kinazy PI mniejszą od ilości zasocjowanej z receptorem dzikiego typu. Resztkowa aktywność związana z podwójnym mutantem Phe₁₃₄₉ . ₁₃₅₆ jest prawdopodobnie wynikiem tworzenia się dimerów receptora z endogennym białkiem Met z komórek COS 7. Interpretację taką podtrzymuje fakt, że taka sama ilość resztkowego połączenia obecna jest także w przypadku immunoprecypitatów otrzymanych z komórek COS 7 transfekowanych mutantem nieaktywnym w stosunku do kinazy (TK‘, fig. 5).

Wyniki tej drugiej serii eksperymentów wskazują na to, że reszty Y₁₃₄₉ i Y1356 pośredniczą w wiązaniu się 3-kinazy PI z receptorem HGF/SF, podczas gdy reszty Y|₃₀₇ i Y1313 nie biorą w tym udziału.

Mapowanie receptorów dzikiego typu i zmutowanych z udziałem fosfopeptydów.

Wyniki doświadczeń przeprowadzonych z zastosowaniem receptorów zmutowanych nasuwają wniosek, że tyrozyny 1349 i 1356 ulegają fosforylacji in vivo. Skonstruowano syntetyczny peptyd (I24K), odpowiadający peptydowi trypsynowemu obejmującemu obie te reszty. W przypadku tego peptydu okazało się niezbędne użycie kombinacji rozpuszczalników

179 628 wodnych i organicznych do uzyskania najlepszego odzysku produktu. Eluował się on z kolumny HPLC, użytej do rozdzielenia poszczególnych substancji; bardzo późno (patrz rysunek A na fig. 6). W przypadku zastosowania takiego samego sposobu postępowania do rozdziału produktów trawienia trypsyną otrzymanych w przypadku użycia receptora dzikiego typu, który uległ fosforylacji in vitro, otrzymano pik elucji bardzo bliski pikowi niefosforylowanego peptydu I24K (fig. 6, rysunek B). Tego nowego piku brak w przypadku dwumiejscowego mutanta (fig. 6, rys. C) i jest on pomniejszony w przypadku mutanta jednomiejscowego (nie pokazano). Wszystkie receptory wyrażano w komórkach COS 7 i poddawano ufosforylowaniu przed trawieniem trypsyną.

Otrzymane wyniki wskazują na to, że tyrozyny 1349 - 1356 rzeczywiście są miejscami fosforylacji in vitro oraz, łącznie z wynikami eksperymentu przeprowadzonego nad asosjacją przedstawionymi na fig. 5, nasuwają silną sugestię, że te same reszty tyrozyny są miejscami fosforylacji także in vivo. Ocena względnego powinowactwa fosfotyrozyny 1349 i fosfotyrozyny 1356 do domen N- i C-SH2 p85.

Obecność dwu domen SH2 w cząsteczce p85 oraz potrzeba wyeliminowania dwu fosfotyrozyn w receptorze HGF/SF dla uniemożliwienia wiązania 3 kinazy PI, sugerują taki model, w którym każda domena SH2 oddziałowuje wzajemnie z jednąz dwu tyrozyn [A. Kashishian i in., EMBP J„ Π, 1373 - 1382; W. M. Kavanaugh i in., Mol. Celi. Biol., 12, 3415 - 3424 (1992)]. Jest więc rzeczą interesującą zmierzenie względnego powinowactwa obu tych fosfopeptydów do domen N- i C-SH2 p85. Autorzy niniejszego zgłoszenia usiłowali początkowo dokonać tego przy zastosowaniu biospecyficznej analizy interakcji przy użyciu aparatu BIAcore [U. Jonsson i in., Biotechniąues, 11. 520 - 527 (1991); U. Jonsson i M. Malmąuist w : P. Turner (red) „Advances in Biosensora”, tom 2, JAI Press, Londyn (1992); R. Karlsson i in., J. Immunol. Meth., 145, 229 - 246 (1991)]. Jednakże, sprzęganie fosfopeptydów z matrycą albo bezpośrednio albo, po biotynylowaniu, poprzez związanie z unieruchomioną na matrycy awidyną nie doprowadziło do uzyskania jakiejś wyraźniejszej odpowiedzi. Wynika to przypuszczalnie z tego, że w peptydach tych fosfotyrozyna znajduje się na N-końcu i unieruchamianie zakłóca realizację jej zdolności do wiązania się. Dlatego też, twórcy wynalazku przeprowadzili pomiary powinowactwa w sposób niebezpośredni, a mianowicie poprzez zmierzenie zdolności fosfopeptydów do hamowania interakcji domen SH2 z fosfopeptydem unieruchomionym i zawierającym fosfotyrozynę 751 (Y₇₅i) w receptorze ludzkiego PDGF i co do którego wykazano, że odznacza się wysokim powinowactwem do obu domen SH2. Domeny N- i C-SH2 p85 zmieszano z serią stężeń fosfopeptydów Met i wstrzyknięto na unieruchomiony fosfopeptyd Y751. Na fig. 7 pokazano wyniki tych pomiarów, wyrażone jako % zahamowania wiązania z fosfopeptydem Y751. Aczkolwiek nie było rzeczą możliwą wyprowadzenie z tych wzajemnych oddziaływań powinowactwa absolutnego, to jednak pożyteczne informacje można uzyskać z porównania wartości dla zaobserwowanego zahamowania na poziomie półmaksymalnym. Podsumowanie otrzymanych danych przedstawiono na rys. C. Najwyższe pozorne powinowactwo wykazuje fosfopeptyd Y₁₃₁₃, zawierający obowiązkowy motyw ΥΧΧΜ. Fosfopeptydy Y₁₃₄₉ i Y₁₃₅₆, obejmujące nietypowe miejsce wiązania YVXV, także hamują wiązanie się domen N- i C-SH2 p85 z fosfopeptydem Y751, jednakże przy wyższych stężeniach. Wszystkie fofopeptydy, ale w sposób bardziej oczywisty Y_l313, przejawiają większe powinowactwo do domeny C-SH2 niż do domeny N-SH2. Dane te są zgodne z danymi otrzymanymi w eksperymencie-przedstawionym na fig. 2 i wskazują na to, że co najmniej in vitro i w przyjętych przez twórców niniejszego wynalazku warunkach prowadzenia doświadczenia, nowy motyw wiązania, Tyr-Val-Xxx-Val (YVXV), ma powinowactwo do p85 o dwa rzędy wielkości mniejsze niż obowiązkowa sekwencja zgodna.

Przykład 5. Transformująca aktywność mutantów ter-phe TPR-MET.

W eksperymentach opisanych w przykładzie 4, reszty tyrozyny w pozycjach 1349 - 1356 receptora HGF/SF (kodowanego przez protoonkogena MET) zostały zidentyfikowane jako miejsca cumowania zaangażowane we włączaniu i aktywowaniu 3-kinazy PI, a przypuszczalnie także dodatkowych przekaźników cytoplazmatycznych. W przypadku trwałego aktywo

179 628 wania, przekaźniki działają jako czynne w sposób ciągły efektory sygnału mitogennego, doprowadzając w ten sposób do onkogennej transformacji komórki.

W celu wykazania wpływu i znaczenia reszt tyrozynowych w pozycjach 1349 i 1356 receptora HGF/SF w procesie prowadzącym do transformacji onkogennej czyli zezłośliwienia komórki, twórcy niniejszego wynalazku wykorzystali zastosowanie cząsteczki TPR-MET, trwale zaktywowanej postaci protoonkogenu MET [Gonzatti-Haces i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85. 21 - 25 (1988)]. TPR-MET pochodzi z rearanżacji między sekwencjami TPR z chromosomu 1, a sekwencjami MET z chromosomu 7. Otrzymany produkt, TPR-MET wykazuje konstytutywną aktywność kinazy tyrozynowej, odpowiedzialne za transformację fibroblastów NIH 3T3.

Na drodze mutagenezy ukierunkowanej względem miejsca, twórcy niniejszego wynalazku przeprowadzili mutację reszty tyrozyny w pozycjach 1349 - 1356 cząsteczki TPR-MET do fenyloalaniny.

Protoonkogenu TPR-MET dzikiego typu, jak również zmutowanych form TPR-MET-Phe]₃₄₉, TPR-MET-Phe₁₃₅₆ i TPR-MET-Phe₁₃₄₉.₁₃₅₆ użyto do przeprowadzenia testu tworzenia ognisk. W teście tym, fibroblasty szczurów Fisher transfekowano z udziałem fosforanu wapniowego różnymi produktami konstrukcji TPR-MET klonowanymi w plazmid pXMT2 [Sambrook i in., Molecular Cloning. A Laboratory Manuał (wydanie drugie), str. 16.22, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. Hodowlę komórek prowadzono w podłożu DMEM, zawierającym 5% płodowej surowicy cielęcej i po upływie 10 dni liczono ogniska. Otrzymane wyniki zreasumowano w następującej tabeli i zilustrowano na fig. 9.

	TPR - MET	TPR - MET’ Phe1349	TPR-MET' Phe1356	TPR-MET* Phe1349’1356
Aktywność transfom^ująca (ogniska/pg DNA/10 komórek)	800	600	40	8 j
Aktywność kinazy	+	+	+	+

Jak można to ocenić na podstawie danych zamieszczonych w powyższej tabeli, lub na podstawie fig. 8, mutacja Tyr₁₃₄₉, ale szczególnie Tyr₁₃₅₆, doprowadza do istotnego zmniejszenia się liczby ognisk transformacji nowotworowej.

Co więcej, w przypadku zmutowania obu reszt Tyr do fenyloalaniny (Phe), transformująca aktywność TPR/MET ulega całkowitemu unicestwieniu.

Dane te dostarczają dalszego dowodu bilogicznego znaczenia tych miejsc z punktu widzenia wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnału mitogennego.

Fosfopeptydy według wynalazku, zdolne do zapobiegania wiązaniu się przekaźników wewnątrzkomórkowych z Tyr₁₃₄₉ i Tyr_]356 receptora HGF/SF, są więc potencjalnymi inhibitorami transformacji nowotworowej.

Przykład 6. Materiały i metody.

Linie komórkowe. Komórki raka płuc A549 i komórki COS-1 hodowano w sposób rutynowy w podłożu RPMI, uzupełnionym 10% FCS. Linię komórek upakowanych wirusem amfotropowym PA317 [Miller i Buttimore, Mol. Celi. Biol., 6, 2895 - 2902 (1986)] oraz linię komórek upakowanych wirusem ekotropowym Psi-2 [Mann i in., Celi, 33, 153 - 159 (1983)], utrzymywano w podłożu Eagle'a zmedyfikowanym metodą Dulbecco, uzupełnionym 10% FCS.

Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne surowice odpornościowe.

Poliklonalne surowice odpornościowe anty-Shc otrzymywano za pomocą uodporniania królików wyrażonym w bakteriach białkiem Shc z domeną SH2. Surowicę anty-TAG otrzymywano w odpowiedzi na peptyd PML [Pandolfi i in., Oncogene, 6, 1285 - 1292 (1991)]. Monoklonalne przeciwciała przeciw fosfotyrazynie otrzymano z firmy Upstate Biotechnology. Przeciwciała anty-Met indukowano w odpowiedzi na syntetyczny peptyd odpowiadający 19

179 628

C-końcowym aminokwasom ludzkiego białka Met (Bank danych, numer sprawy Χ54559). Immunoprecypitacja i technika Western blott.

Lizaty otrzymywano z komórek A549 hodowanych w podłożu bez surowicy i poddawanych działaniu SF/HGF. Komórki lizowano na lodzie, w buforze PY (20 mM Tris-HCl, pH 7,8, 50 mM NaCl, 50 mM NaF, 30 mM Na₄P₂O₇, 5 mM EGTA, 1 mM ortowanadan sodowy, 1% obj/obj Triton Χ-100), zawierającym świeżo dodane inhibitory proteazy (1 mM fluorek fenylometylosulfonylu, 10 mg/ml leupeptyny i 5 mg/ml aprotyniny). Lizaty klarowano przez wirowanie w temperaturze 4°C, a stężenie białka oznaczano przy użyciu odczynnika BCA (Pierce).

W przypadku przeprowadzania eksperymentów nad immunoprecypitacją, odpowiednie przeciwciała adsorbowano na Protein A Sepharose (Pharmacia), po czym inkubowano razem z lizatami komórek w ciągu 1,5 godziny w temperaturze 4°C. Otrzymane kompleksy odpornościowe przemyto trzykrotnie buforem NET (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% NP-40, 1 mM EDYA, pH 8,0, 0,25% żelatyny) o temperaturze lodu, po czym wyeluowano i zdenaturowano przez ogrzewanie w ciągu 3 minut w temperaturze 95 °C w redukującym buforze Laemmli'ego. Następnie rozdzielono białka z wykorzystaniem metody elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylo-sodowym (SDS-PAGE).

W przypadku analizy metodą immunoblottingu, albo poszczególne immunoprecypitaty, albo 20 - 50 mg całkowitych lizatów komórkowych, po SDS-PAGE, transferowano elektroforetycznie na filtry nitrocelulozowe. Po zablokowaniu niespecyficznej aktywności przy użyciu 2% roztworu mleka odtłuszczonego w proszku w TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,8, 150 mM NaCl, 0,02% Tween 20) (jednogodzinna inkubacja w temperaturze 22°C), filtry poddano sondowaniu przy użyciu dwoistych przeciwciał rozcieńczonych w TBST, w ciągu 2 godzin, w temperaturze 22°Ć. Po wyczerpującym przemyciu, kompleksy odpornościowe wykrywano przy użyciu peroksydazy z chrzanu sprzężonej z gatunkowo swoistą surowicą odpornościową z „wtórnymi” przeciwciałami (Bio Rad), po czym następowała reakcja z wzmocnioną chemiluminescencją (ECL™, Amersham). Ukierunkowana względem miejsca mutageneza i ekspresja cDNA.

Klonowanie cDNA MET zostało opisane już poprzednio [Ponzetto i in., Oncogene, 6, 553 - 559 (1991)], MBL Data- Bank nr sprawy Χ54559). 3'-końcowy fragment, od nukleotydu 2355 do końca, subklonowano w pSELECT™-l. Mutagenezę ukierunkowaną względem miejsca przeprowadzono przy użyciu układu do in vitro ukierunkowanej względem miejsca mutagenezy z zastosowaniem oligonukleotydów (Altered Sites™ in vitro Mutagenesis System, Promega). Oligonukleotydy syntetyzowano przy użyciu aparatu Applied Biosystem 391. Klony mutantowe identyfikowano za pomocą sekwencj onowania (zestaw do sekwencj onowania T7 z firmy Pharmacia). Pełnowymiarowe cDNA MET z odpowiednią mutacją Tyr-Phe rekonstruowano w wektorze PMT2, który zawiera głównego późnego promotora adenowirusa. Wszystkie plazmidy transfekowano lipofektyną (GIBCO BRL) w^t komórkach COS 1. cDNA Shc z mutacją Y³¹⁷-^F wklonowano w wektor ekspresji ssaczej LXSN. Zmutowany cDNA oznakowano przy użyciu zewnętrznego epitopu na drodze ligowania z zachowaniem ramki odczytu z fragmentem o 162 bp cDNA PM. (Pandolfi i in., tamże). Znakowany cDNA koduje białka Shc znakowane PML o 53 i 58 kDa, jako rezultat alternatywnego sposobu inicjacji. Szczegółowy opis takiej konstrukcji przedstawiono w innym miejscu (Salcini i in., w przygotowaniu). Wektor ekspresji kotransfekowano z genem oporności na neomycynę do komórek A549 z udziałem fosforanu wapniowego. Trwałe linie komórek, wyrażających znakowane białka Shc, wyselekcjonowano z wykorzystaniem G418.

Badania nad in vitro wiązaniem przy użyciu białka sprzężonego GST.

Region Grb2 cDNA odpowiadający jego domenie SH2 (od nukletydu w pozycji 256 do nukleotydu w pozycji 551) wyodrębniono na drodze polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) i wklonowano do miejsc BamHl-EcoRI bakteryjnego plazmidu ekspresyjnego pGE.X-2T (GST-Grb2). Hodowle bakterii wyrażających GST, GST-Grb2 lub GST-She [Segatto i in., Oncogene, 2105 - 2112 (1993)] rosły w ciągu 3 - 4 godzin w temperaturze 37°C,

179 628 w podłożu LB zawierającym 1 mM IPTG. Bakterie odwirowano, po czym zawieszono w 1/100 objętości buforu PY bez Triton™, o temperaturze lodu, a następnie zlizowano za pomocą naddźwiękawiania. Białka rekombinantowe poddano oczyszczaniu na Glutathione Sepharose™ (Pharmacia) i stosowano w tej postaci do badań nad wiązaniem. W każdej reakcji, około 5 μ g GST, GST-Gbr2 lub GST-SHc, związanego z Glutathione Sepharose, inkubowano w ciągu 2 godzin, w temperaturze 4°C, z 300 mg odpowiedniego lizatu komórek, sporządzonego z buforze PY. Kompleksy białkowe przemyto pięciokrotnie buforem PY o temperaturze lodu, po czym wyeluowano i zdenaturowano za pomocą ogrzewania w ciągu 3 minut, w temperaturze 96°C. W buforze Laemmli'ego, a następnie rozdzielono metodą SDS-PAGE i poddano analizie metodą immunoblottingu.

Nadekspresja białek Shc.

Skonstruowano plazmid LSHCSN za pomocą wklonowania sekwencji kodującej Shc [Pelicci i in., Celi., 70, 93 - 104 (1992)] w miejsce restrykcyjne EcoRI plazmidu retrowirusa LXSN [Miller i in., (1989), przekazany przez D, Millera)]. Plazmidy LXSN lub LSHCSN transfekowano do Y2 linii komórek upakowanych retrowirusem PA317 z zastosowaniem metodologii opartej na wytrącaniu fosforanu wapniowego [Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Po upływie 48 godzin, supematantów Y-2 użyto do zainfekowania PA317. Następnie dokonano selekcji komórek przy użyciu podłoża zawierającego G418, w warunkach rozcieńczenia granicznego. Wyselekcjonowano jeden klon produkujący wirusa, na podstawie wysokiego poziomu ekspresji egzogennego Shc oraz miana wirusa, i zastosowano do zakażenia komórek docelowych.

Analiza z zastosowaniem aparatu BIAcore.

Podstawowe zasady działania, jak również sposób postępowania przy dokonywaniu kinetycznych pomiarów interakcji z udziałem domeny SH2, opisane są w przypadku stosowania aparatu BIAcore (Pharmacia) w sposób szczegółowy poprzednie [Panayotou i in., Mol. Celi. Biol., 13, 3567 - 3576 (1993)]; Ponzetto i in., Mol. Celi. Biol., 13,4600 - 4608 (1993)].

Oczyszczone domeny GST-SH2 lub białka nienaruszone odsolono przy użyciu buforu roboczego BIAcore (20 mM Hepes, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005% Tween 20 i 4 mM DTT), po czym wstrzyknięto na unieruchomione na awidynie, biotynylowane fosfopeptydy. Ilość unieruchomionych fosfopeptydów znormalizowano przez pomiar związania przeciwciał przeciwfosfotyrozynowych. Stopień zasocjowania zmierzono dla całej serii stężeń białka. Umożliwiono dysocjację związanego materiału, albo w przepływie buforu, albo za pomocą wstrzyknięcia 20 μ M konkurencyjnego fosfopeptydu niebiotynylowanego.

Stężenie peptydu i białka obliczono z wyników analizy aminokwasów przeprowadzonej przy użyciu analizatora aminokwasów Applied Biosystem.

Oznaczanie wzrostu i ruchliwości komórek.

Komórki, w ilości 2,5 χ 10³, umieszczono na 96-dołkowych płytkach (Costar) w podłożu DMEM, zawierającym 10% FCD (Flow). Po upływie 24 godzin usunięto podłoże i zastąpiono je podłożem DMEM zawierającym 5% FCS i SF/HGF w szerokim zakresie stężeń (od 1 do 10 ng/ml). Liczbę komórek ustalono po przeprowadzeniu barwienia fioletem krystalicznym z oznaczeniem kolorymetrycznym [Kueng i in., Anal. Biochem., 182, 16 - 19 (1989)]. Dołki odczytywano przy 595 nm w aparacie Microplate Reader Model 3550 (Bio-Rad). Badania nad chemotaksją przeprowadzano w komorach Boydena typu „blind-well” i przy użyciu filtrów poliwęglanowych bez poliwinylopirolidonu 13 mm, pory 8 μ m) dostarczonych przez firmę Nucleopore. Pomiary dotyczące chemotaksji przeprowadzano sposobem poprzednio opisanym [Albini i in., Cancer Research, 47, 3239 - 3245 (1897)]. Komórki znakowano 5-[^l25J]-jodo-2'-dezoksyurydyną(3 μ Ci/ml, 1 N RPMI 1640 jako podłoże, z uzupełnieniem w postaci 10% FCS). Po upływie 16 - 20-godzinnej inkubacji, komórki poddano działaniu trypsyny i przemyto trzykrotnie podłożem nie zawierającym FCS. Komórki, w ilości 3 χ 10⁵ zawieszono w podłożu nie zawierającym FCS i umieszczono w górnej części komór Boydena; do części dolnych komór wprowadzono podłoże bez FCS albo z dodatkiem, albo bez dodatku

179 628

SF/HGF (w ilości 5-40 jedn/ml). Inkubację w komorach Boydena prowadzono przez 6 godzin w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂, nasyconej H₂O. Po zakończeniu inkubacji, komórki przywarte do górnej strony filtra usunięto mechanicznie, po czym filtry wraz z komórkami, które przemieściły się na stronę dolną utrwalono i policzono przy użyciu licznika promieniowania γ obecne komórki.

Białka Shc wiążąsię z receptorem SF/HGF z fosfoiylowaną tyrozyną poprzez domenę SH2.

Komórki A549 raka płuc wyrażają funkcjonalne receptory SF/HGF oraz trzy izoformy Shc o 46, 52 i 66 kDa. W celu zbadania, czy receptor SF/HGF z ufosforylowaną tyrozyną i Shc tworzą in vivo stabilny kompleks, lizaty komórek potraktowanych SF/HGF poddano immunoprecypitacji z anty-Met i immunoblottingowi z przeciwciałami anty-Shc. Figura 1A pokazuje białka Shc współstrącone z receptorem SF/HGF. Podobne wyniki otrzymano w eksperymentach, stanowiących odbicie lustrzane powyższych, w których immunoprecypitaty anty-Shc pochodzące z lizatów komórek A549 potraktowanych SF/HGF poddano sondowaniu z przeciwciałami przeciw receptorowi (anzy-Met). Białka Shc współstrącały się z receptorem SF/HGF (fig. IB). Wyniki pokazują że w komórkach ze stymulowanym SF/HGF, receptor SF/HGF i Shc są ze sobązasocjowane.

W celu dalszego upewnienia się, że asocjacja receptora SF/HGF z białkami Shc bezwzględnie zależy od fosforylacji tyrozyny receptora, przeprowadzono podobne eksperymenty przy użyciu lizatów komórek COS-1, przejściowo wyrażających cDNA albo receptora SF/HGF dzikiego typu, albo zmutowanego receptora, obarczonego defektem kinazowym (Lys^lll0_uA). Jak to poprzednio opisano (Longati i in., w druku), receptor dzikiego typu, syntetyzowany w nadmiernej ilości w komórkach COS-1, ulega konstytutywnie fosforylacji in vivo, podczas gdy bierny w stosunku do kinazy mutant Lys¹¹¹⁰ Ά nie jest fosforylowany (fig. fig. 2A i 2B). Trwałe kompleksy utworzone przez transfekowany receptor i endogenne Shc zdarzały się jedynie w komórkach COS-1 wyrażających dzikiego typu receptory z fosforylowaną tyrozyną (fig. 2C).

Badano także interakcje Shc - receptor SF/HGF za pomocą rekonstytuowania kompleksu in vitro z wykorzystaniem domeny SH2 białka Shc, wyrażanej w bakteriach jako białko sprzężone GST. Unieruchomiona domena Shc-SH2 tworzyła stabilną formę zasocjowanąz receptorem z fosfoiylowaną tyrozyną solubilizowanym z komórek A549 potraktowanych SF/GHF, ale nie z receptorem niefosforylowanym, solubilizowanym z komórek kontrolnych (fig. 3A). Badania przeprowadzone nad wiązaniem się, wykonane z udziałem kontrolnego białka GST, dały wyniki negatywne. Tak więc, otrzymane wyniki wykazują że domena SH2 białka Shc wystarcza do związania autofosforylowanego receptora SF/HGF in vitro. Białka Shc wiążą się z fosfotyrozynami Y¹³⁴⁹ i Y¹³⁵⁶ końcowego segmentu receptora SF/HGF.

Za pomocą fosfopeptydowego mapowania receptora SF/HGF dzikiego typu i zmutowanego wykazano, że dwie reszty znajdujące się w C-końcowym segmencie receptora (Y¹³⁴⁹ i Y¹³⁵⁶) zostająufosforylowane w odpowiedzi na związanie ligandu [Ponzetto i in. (1993) tamże]. Możliwość angażowania się tych miejsc w pośredniczeniu interakcji z Shc zbadano w eksperymentach przeprowadzonych nad asocjacją z udziałem mutantów receptora, w których albo jedna, albo obie omawiane tyrozyny zmutowano do fenyloalaniny (Y^l349+F, γ*356_».ρ ]ub Y¹³⁴⁹, 13=6.^ρ) jak to poprzednio wykazano, cząsteczki receptora z mutacją pojedynczą lub kombinowaną we wspomnianych miejscach zostają obdarzone aktywnością natywnej kinazy tyrozynowej [Ponzetto i in., (1993) tamże]. Komórki COS-1 transfekowano produktami konstrukcji wyrażającymi mutanty receptora, po czym poddane immunoprecypitacji z przeciwciałami anty-Shc. Otrzymane immunoprecypitaty poddano blottingowi z przeciwciałami przeciw receptorowi Met. Zdolność pojedynczych zmutowanych receptorów Y¹³⁴⁹-*- p lub γΐ356_^ρ _asocjowania z endogennym Shc była jedynie nieznacznie mniejsza od zdolności wykazywanej przez receptora dzikiego typu lub zdolności wykazywanej przez receptora kontrolnego z obojętną w tym przypadku mutacją (Y¹⁰⁰³-¹’-F). I na odwrót, podwójny mutant Y¹³⁴⁹, 135^f^ całkowicie utracił swoją zdolność wiązania białek Shc (fig. 4).

179 628

Bezpośrednio wzajemne oddziaływanie domeny SH2 Shc i fosfotyrozyny Y¹³⁴⁹ lub Y¹³⁵⁶ potwierdzone zostało wynikami analizy na bieżąco typu Biosensor [Panayotou i in., tamże; Felder i in., Mol. Celi. Bio., 13, 1449 - 1455 (1993)]. Syntetyczny fosfopeptyd VNATY¹³⁵⁶* VNVK, wywodzący się z sekwencji końcowego segmentu receptora, związano w sposób swoisty z poddaną oczyszczeniu metodą powinowactwa domeną GST-SH2 Shc (fig. 5). Podobne wyniki otrzymano w przypadku peptydu IGEHY¹³⁴⁹* VHVN. W obu przypadkach, stała powinowactwa, obliczona ze stosunku stałej dysocjacji (F_dys) do stałej asocjacji (K^), była zbyt wysoka, aby możliwe było jej dokładne ustalenie.

Wyniki te unaoczniają że powinowactwo wiązania się Shc czy to z tyrozyną 1349, czy z tyrozyną 1356, zawartą w końcowym segmencie receptora SF/HGF, jest niewielkie. Nadekspresja białek Shc wzmacnia motogenną odpowiedź na SF/HGF.

SF/HGF wywiera motogenny wpływ na komórki nabłonkowe tak, że po stymulacji wędrują one poprzez filtry komór Boydena typu „blind-well” [Giordano i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 649 - 653 (1993)]. Wpływ Shc na odpowiedź motogenną badano poprzez nadekspresję białka w komórkach A549. Komórki zakażano amfotropowym retrowirusem z cDNA Shc. Na podstawie wyników analizy przeprowadzonej techniką Western blotting przy użyciu przeciwciał anty-Shc, wybrano szereg rozmaitych zakażonych w masie populacji komórek z uwagi na wysoki poziom ekspresji Shc.

Motogenną odpowiedź komórek A549, w których dochodzi do nadekspresji białek Shc, była znacząco wyższa od odpowiedzi wywołanej w kontrolnych komórkach niezakażonych lub komórkach zakażonych samym wektorem (fig. 6, rysunek dolny). Wyższe odpowiedzi na SF/HGF komórek z nadekspresją Shc zaobserwowano dla wszystkich przebadanych stężeń ligandu (fig. 6, rysunek górny).

Odpowiedź mitogenną mierzono albo poprzez liczbę komórek, albo poprzez włączanie tymidyny. Nadekspresja komórek A549 nie wywierała żadnego wpływu na wzrost komórek w odpowiedzi czy to na SF/HGF czy surowicę. Podobnie, indukowana przez SF/HGF aktywność czynnika wymiany nukleotydu guaninowego w stosunku do Ras, zmierzona w sposób poprzednio opisany [Graziani i in., J. Biol. Chem., 268, 9165 - 9168 (1993)], nie była naruszana przez nadekspresję egzogennych Shc. Białka Shc, po związaniu z receptorem SF/HGF, ulegają fosforylacji w miejscu Y³¹⁷.

W celu ustalenia, czy Shc jest fosforylowane w odpowiedzi na zaktywowanie receptora SF/HGF kinazy, komórki A549 poddano stymulowaniu przez rekombinantowy SF/HGF, po czym zlizowano i poddano immunoprecypitacji z anty-Shc, a następnie przeprowadzono ich immunoblotting z przeciwciałami przeciw fosfotyrozynie. Po upływie 5 minutowej stymulacji komórek A549, wykryć można było znaczy wzrost poziomu ufosforylowania tyrozyny p46^Shc, p52^shc i p66^Shc (fig. 1C) co wskazuje na to, że Shc jest substratem receptora SF/HGF. Podobne doświadczenia przeprowadzone z udziałem komórek COS-1 transfekowanych receptorem SF/HGF. W przypadku komórek z nadekspresją receptora dla kinazy dzikiego typu (a więc konstytutywnie aktywnego) endogenne białka Shc były fosforylowane w reszcie tyrozyny. Jednakże, Shc nie ulegał fosforylacji w przypadku komórek COS-1 transfekowanych receptorem Lys¹¹¹⁰-^, nieaktywnym w stosunku do kinazy (fig. 2D).

Za pomocą mapowania fosfopeptydowego i analizy mutacji wykazano, że głównym miejscem fosforylacji Shc w komórkach potraktowanych EGF jest Y³¹⁷ (Salcini i in., w przygotowaniu). Aby upewnić się, że ta sama reszta jest także fosforylowana po potraktowaniu SF/HGF, znakowany cDNA SHC z mutacją Y³¹⁷j-F wyrażono w komórkach A549. W komórkach tych, po potraktowaniu SF/HGF, mutant Y³¹⁷-^F, wybiórczo otrzymany w immunoprecypitacie z zastosowaniem przeciwciał anty-”tag”, nie ulegał fosforylacji w reszcie tyrozyny (fig. ID). Białka Shc fosforylowane w miejscu Y³¹⁷ tworzą specyficzne kompleksy z „adaptorem” Grb2.

Możliwość stymulowania przez SF/HGF tworzenia kompleksu Shc-Grb2 w komórkach A549 w następstwie stymulacji SF/HGF, przebadano za pomocą sondowania Westem-blotów immunoprecypitatów anty-Shc przeciwciałami anty-Grb2. Jak to pokazano na fig. 1E, białko

179 628

Shc ufosforylowane w odpowiedzi na SF/HGF zostaje zasocjowane z Grb2. W asocjowaniu tym pośredniczy domena SH2 Grb2, jak to wykazano za pomocą in vitro eksperymentów przy użyciu unieruchomionej domeny SF2 Grb2 (wyrażonego w bakteriach jako białko sprzężone GST), oraz lizatów cytoplazmatycznych sporządzonych z komórek kontrolnych i komórek A549 stymulowanych SF/HGF. Ilość Shc związanego przez białko sprzężone Grb2 wyraźnie wzrasta po stymulacji przez SF/HGF (fig. 3B).

Parametry kinetyczne i stałe równowagi dysocjacji dla tych interakcji otrzymano przy użyciu biosensora do mierzenia na bieżąco wiązania się białka sprzężonego Grb2 GST-SH2 z unieruchomionym peptydem Shc z fosforylowaną tyrozyną DDPSY^3I7*VNVQ (fig. 7). Otrzymanych danych użyto do obliczenia (2,6 χ 10⁵ M'¹ s'¹), jak to pokazano na fig. 7C. Stałą K_dys zmierzono zarówno w buforze jak i obecności konkurencyjnego fosfopeptydu w celu zapobieżenia powtórnemu wiązaniu się. Jak to pokazano na fig. 7B, dodanie konkurencyjnego fosfopeptydu wywiera drastyczny wpływ na szybkość dysocjacji, jak już poprzednio zaobserwowano w przypadku innych interakcji domena SH2 - fosfopeptyd [Panayotou i in. (1993), tamże; Felder i in., (1993), tamże]. Otrzymana tu wartość K_dys wynosiła 0,04 S'¹, co daje ogólną wartość powinowactwa wynoszącą 153 nM.

Powyższe dane wskazują na to, że fosforylacja białej Shc w reszcie tyrozyny Y³¹⁷ w odpowiedzi na SF/HGF determinuje tworzenie się miejsca cumowania dla „adaptora” Grb2 o wysokim powinowactwie. Stąd też, fosforylowane białka Shc mogą funkcjonować jako cząsteczki mostkujące pomiędzy zaktywowanym receptorem SF/HGF a Grb2. Jest rzeczą interesującą że sekwencja aminokwasów miejsca cumowania Shc dla Grb2, a mianowicie Y³¹⁷VNV, jest identyczna z sekwencją znajdującą się w końcowym segmencie receptora SF/HGF (fig. 8), a mianowicie Y¹³⁵⁶VNV, co do której wykazano, że bezpośrednio wiążę Grb2 po stymulacji ligandem (Ponzetto i in., przesłano do druku). Białka Shc nie tworzą konkatamerów.

Sekwencja Y³¹⁷ VNV Shc jest identyczna z sekwencją jednego z dwóch miejsc wiążących Shc, obecnych w receptorze SF/HGF (fig. 8). Obserwacja ta nasuwa sugestię, że Shc może tworzyć konkatamery przez wiązanie fosfotorozyny Y³¹⁷ innej cząsteczki Shc. Użyto biosensora do porównania wiązania się domeny SH2 Shc z fosfopeptydem DDPSY—VNVQ, obecnym na cząsteczce Shc, i z fosfopeptydem VNATY®^VNVK, obecnym na receptorze SF/HGF. Shc Sh2 wiąże się o wiele słabiej z fosfopeptydem wywodzącym się z Shc, niż z fosfopeptydem wywodzącym się z receptora SF/HGF (fig. 5). Dane te wskazują na to, że aminokwasy znajdujące się przy N-końcu zarówno Y³¹⁷ (w Shc) jak i Y¹³⁵⁶ (w receptorze SF/HGF) są rozpoznawane przez domenę SH2 Shc. Tak więc, asocjacja Shc-Shc nie jest faworyzowana in vivo, a reszta fosfotyrozyny Y³¹⁷ Shc dostępna jest raczej do wiązania się z innymi cząsteczkami niż do pośredniczenia w tworzeniu konkatamerów.

Wnioski

Reasumując, należy stwierdzić, że zarówno peptyd o długości, na przykład, od 4 do 20 aminokwasów, obejmujący miejsce cumowania Shc (Y³¹⁷VNV), a w szczególności peptyd H-Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr*-Val-Asn-Val-Gln-OH (DDPSY*VNVQ) jak i pepty o długości, na przykład, od 4 do 20 aminokwasów, obejmujący motyw rozpoznawania Tyr¹³⁵⁶ receptora czynnika wzrostu hepatotytów (Yⁱ³⁵⁶VNV), a w szczególności peptyd H-Val-Asn-Ala-ThrTyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH (VNATY*VNVK), w których to wzorach Tyr* (Y*) oznacza fosforylowaną lub niefosforylowaną resztę tyrozyny, są zdolne do wiązania domeny Grb2-SH2. Stąd też, są one użyteczne jeśli chodzi o działanie konkurencyjne i zapobieganie asocjowaniu SH2 białka Grb2 z receptorami zawierającymi fosforylowaną tyrozynę, takimi jak aktywny receptor czynnika wzrostu hepatocytów (HGF/SF czyli receptor HGF/SF, receptor PDGF, receptor EGF albo z innymi cytosolowymi przekaźnikami zawierającymi fosforylowaną tyrozynę, takimi jak białko Shc lub IRS-1, zapobiegając w ten sposób mitogenezie, a przez to proliferacji nowotworu.

Z drugiej strony, peptydy zawierające motyw rozpoznawania Tyr¹³⁵⁶ lub Tyr¹³⁴⁹ receptora czynnika wzrostu hepatocytów, (odpowiednio Y¹³⁵⁶VNV lub Y^I349VHV), a zwłaszcza

179 628 wspomniane powyżej peptydy H-Val-Asn-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH (VNATY*VNVK) i H-Ile-Gly-Glu-His-Tyr-Val-His-Val-Asn-OH (IGEHY*VNVN), albo peptyd zawierający obie wspomniane powyżej reszty tyrozyny, taki jak H-Ile-Gly-Glu-His-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH (IGEHY*VHVNATY*VNVK), w których to wzorach Tyr* (Y*) oznacza fosforylowaną lub niefosforylowaną resztę tyrozyny, są zdolne do wiązania domenyShc-SH2. Stąd też, są one użyteczne jeśli chodzi o działanie konkurencyjne i zapobieganie asocjowaniu SH2 białka Shc z receptorami zawierającymi fosforylowaną tyrozynę, takimi jak aktywny receptor czynnika wzrostu hepatocytów, receptory EGF lub z innymi cytosolowymi przekaźnikami zawierającymi fosforylowaną tyrozynę, takimi jak IRS-1 lub cytosolowe kinazy tyrozyno we, takie jak Src, zapobiegając w ten sposób mitogenezie, a zwłaszcza motogenezie, a przez to zapobiegając rozprzestrzenianiu się komórek nowotworowych.

Tak więc, peptydy wywierają działanie przeciwnowotworowe i przeciwprzerzutowe.

Jak powyżej wspomniano, peptyd według wynalazku można korzystnie stosować w postaci niefosforylowanej, jako prolek; w tym przypadku peptyd może ulec biochemicznemu przekształceniu w postać fosforylowaną, w obrębie komórki, gdzie wywiera on swe działanie farmakologiczne.

179 628

179 628 e ι i I I e

Φ &

$ e

971

1003

102β

1093

1159

1194

1230

1234

1235

1284

1295

1307

1313

1349

1358

1365 1349-1356

179 628

1349-1356

0*® <- ΜΕΤ^ aME» ¢8¾¾ «η» < ρ85

179 628

A to to

1349

1356

1349-1356

179 628

WT

1003

1307-1313

1349

1356

1365 1349-1356

•Ό CO cn

- WT

- 1003

- 1307-1313 ~ 1349 ~ 1356 ~ 1365 ~ 1349-1356

179 628

< ORI

179 628

Jl

Ο 10 20 30 40 50 60 70 80 czas elucji, min

179 628

100

eTuezbjftz oSeuieuiAsneih %

Peptyd (μΜ)

BTuezbjMZ o9sujeuiZs^eui %

179 628

179 628

ο

I

179 628

179 628

Be

WB:

HGF

Ά549

A549

GST-SHC a MET aSHC

179 628

LL co ΙΌ CO

^_p170

ΙΡΡ:

WB:

<xSHC o. MET

179 628

(nu)

BupSiSzft zpajAOdpo

179 628

Badanie wywołanej oddziaływaniem SF/HGF migracji komórek w komorze Boydena

179 628

179 628

¹³⁵⁶ YVNV

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Peptydy będące inhibitorami mitogenezy i motogenezy, mające sekwencję o wzorze X_nYVN (lub H) V-X_c, w którym każdy z X_n i X_c oznacza sekwencję zawierającą 0-16 aminokwasów, Y jest fosforylowane, przy czym peptydy te hamują wiązanie pomiędzy (A) podjednostkami 85 3-kinazy fosfatydyloinozytolowej z aktywnym receptorem czynnika wzrostu hepatocytów.
2. 2. Peptydy według zastrz. 1, hamujące wiązanie się (B) białka Shc z aktywnym receptorem czynnika wzrostu hepatocytów, (C) białka Shc z białkiem Grb2 i/lub (D) białka Grb2 z aktywnym receptorem czynnika wzrostu hepatocytów
3. 3. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że X_N i X_c oznaczają sekwencje, które flankują jedną z sekwencji YVN (lub Η) V w receptorze HGF/SF i białku Shc.
4. 4. Peptyd według zastrz. 3, znamienny tym, że przedstawia go wzór H-Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr*-Val-Asn-Val-Gln-OH, w którym Tyr* oznacza resztę fosforylowanej tyrozyny.
5. 5. Peptyd według zastrz. 3, znamienny tym, że przedstawia go wzór H-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH, w którym Tyr* oznacza resztę fosforylowanej tyrozyny.
6. 6. Peptyd według zastrz. 3, znamienny tym, że przedstawia go wzór H-Ile-Gly-Glu-His-Tyr*-Val-His-Val-Asn-OH, w którym Tyr* oznacza resztę fosforylowanej tyrozyny.
7. 7. Peptyd według zastrz. 3, znamienny tym, że przedstawia go wzór H-Ile-Gly-Glu-His-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH, w którym Tyr* oznacza resztę fosforylowanej tyrozyny.
8. 8. Peptyd według zastrz. 3, znamienny tym, że przedstawia go wzór H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH, w którym Tyr* przedstawia resztę fosforylowanej tyrozyny.
9. 9. Peptyd według zastrz. 3, znamienny tym, że przedstawia go wzór H-Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-OH, w którym Tyr* oznacza resztę fosforylowanej tyrozyny.
10. 10. Peptyd według zastrz. 3, znamienny tym, że przedstawia go wzór H-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH, w którym Tyr* oznacza resztę fosforylowanej tyrozyny.
11. 11. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że ma budowę przedstawioną wzorami: H-Tyr*-Asp-Ala-Arg-Val-His-Thr-Pro-OH H-Tyr*-Arg-Ala-Thr-Phe-Pro-Glu-Asp-OH H-Tyr’-Pro-Leu-Thr-Asp-Met-Ser-Pro-OH H-Tyr*-His-Gly-Thr-Leu-Leu-Asp-Asn-OH H-Tyr*-Met-Lys-His-Gly-Asp-Leu-Arg-OH H-Tyr*-Leu-Ala-Ser-Lys-Lys-Phe-Val-OH H-Tyr*-Asp-Lys-Glu-Tyr-Tyr-Ser-Val-OH H-Tyr*-Tyr-Ser-Val-His-Asn-Lys-Thr-OH H-Tyr*-Ser-Val-His-Asn-Lys-Thr-Gly-OH H-Tyr*-Pro-Asp-Val-Asn-Thr-Phe-Asp-OH H-Tyr*-Leu-Leu-Gln-Gly-Arg-Arg-Leu-OH H-Tyr*-Cys-Pro-Asp-Pro-Leu-Tyr-Glu-OH H-Tyr*-Glu-Val-Met-Leu-Lys-Cys-Trp-OH H-Tyr*-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Glu-OH, w których to wzorach Tyr* oznacza resztę fosforylowanej tyrozyny.

    179 628
12. 12 .Sposób wytwarzania nowego peptydu mającego sekwencję o wzorze X_nYVN (lub H) V-X_c, w którym każdy z X_n i X_c oznacza sekwencję zawierającą 0-16 aminokwasów, Y jest fosforylowane, znamienny tym, że prowadzi się syntezę w fazie stałej, wychodząc z pojedynczych aminokwasów i bezpośrednio wprowadza się resztę fosforylowanej zabezpieczonej tyrozyny.
13. 13. Sposób wytwarzania nowego peptydu mającego sekwencję o wzorze X_nYVN (lub H) V-X_c, w którym każdy z X_n i X_c oznacza sekwencję zawierającą 0-16 aminokwasów, Y jest fosforylowane, znamienny tym, że prowadzi się syntezę w fazie stałej, wychodząc ze wstępnie utworzonego peptydu z dwóch lub więcej reszt aminokwasów a resztę tyrozyny w zabezpieczonym wstępnie utworzonym peptydzie fosforyluje się po przyłączaniu peptydu do stałego nośnika.
14. 14. Środek farmaceutyczny zawierający substancję czynną i fizjologicznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera nowy peptyd mający sekwencję o wzorze X_nYVN (lub H) V-X_c, w którym każdy z X_n i X_c oznacza sekwencję zawierającą 0-16 aminokwasów, Y jest fosforylowane.

    * * *