JP4604161B2 - フェニルアラニン誘導体 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は新規なフェニルアラニン誘導体、組成物、およびＳＨ２ドメインのホスホプロテインとの結合を阻害する際におけるこれら誘導体の使用方法に関する。本発明はさらに当該フェニルアラニン誘導体を製造するのに適した前駆体も提供する。
【０００２】
（発明の背景）
医薬産業は、癌、自己免疫疾患のような増殖性の疾患、および乾癬のような異常増殖性皮膚障害の治療および予防のための新たな種類の化合物を探求している。これらの疾患または障害は多くの人々に影響を及ぼし、苦痛および場合によっては死に至らしめる。
【０００３】
これらの疾患または障害のいくつかは、シグナル伝達に影響を与え得る。シグナル伝達は、正常な細胞のホメオスタシスにとって重大であり、これは細胞外メッセージ（例えば、成長因子、ホルモンおよび神経伝達物質の形成における化学的メッセージ）を受容体（例えば細胞表面受容体）を通じて細胞内部へ伝達するプロセスである。タンパク質−チロシンキナーゼは、この生物学的機能において中心的な役割を果たす。その中でも、これらの酵素は特定のチロシン残基のリン酸エステル化を触媒して、チロシンリン酸エステル化残基を形成する。この種の酵素の例には、ＰＤＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＨＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３およびｅｒｂ−Ｂ４のようなＥＧＦ受容体ファミリー、ｓｒｃキナーゼファミリー、ＦａｋキナーゼおよびＪａｋキナーゼファミリーのメンバーが挙げられる。チロシンリン酸エステル化タンパク質は、増殖および成長から分化に至る特定の範囲の代謝プロセスに関係する。
【０００４】
タンパク質-チロシンのリン酸エステル化は、いくつかの目標酵素の活性を調節することに関連するとして知られ、またＳｒｃ相同領域またはＳＨ２ドメイン(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5891 (1990)を参照されたい)と呼ばれる特定のアミノ酸配列を含む様々なタンパク質を通じたシグナル伝達に関連する特定の複雑なネットワークを生成することに関連するとして知られている。チロシンキナーゼの過剰発現または制御不全による、このタンパク質−チロシンのリン酸エステル化における機能不全は、様々な腫瘍形成および（異常）増殖性障害（例えば、癌、炎症、自己免疫疾患）、異常増殖性皮膚障害（例えば、乾癬）およびアレルギー／喘息によって明らかになる。
【０００５】
細胞のシグナリングおよび形質転換において役割を果たすタンパク質を含むＳＨ２−および／またはＳＨ３−には、それらに限られるわけではないが、以下のものが挙げられる：Ｓｒｃ、Ｌｃｋ、Ｅｐｓ、ｒａｓ ＧＴＰアーゼ−活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ホスホリパーゼ Ｃ、ホスホイノシトール−３（Ｐｌ−３）キナーゼ、Ｆｙｎ、Ｌｙｋ、Ｆｇｒ、Ｆｅｓ、ＺＡＰ−７０、Ｓｅｍ−５、ｐ８５、ＳＨＰＴＰ１、ＳＨＰＴＰ２、コルクスクリュー（ｃorkscrew）、Ｓｙｋ、Ｌｙｎ、Ｙｅｓ、Ｈｃｋ、Ｄｓｒｃ、Ｔｅｃ、Ａｔｋ／Ｂｐｋ、Ｉｔｋ／Ｔｓｋ、Ａｒｇ、Ｃｓｋ、テンシン（ｔensin）、Ｖａｖ、Ｅｍｔ、Ｇｒｂ２、ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｃｒｋ、ＣｒｋＬ、Ｓｙｐ、Ｂｌｋ、１１３ＴＦ、９１ＴＦ、Ｔｙｋ２、とりわけ、Ｓｒｃ、ホスホリパーゼ ｃ、ホスホイノシトール−３（ｐｌ−３）キナーゼ、Ｇｒｂ２、ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｃｒｋ、ＣｒｋＬ、Ｓｙｐ、Ｂｌｋ、１１３ＴＦ、９１ＴＦ、およびＴｙｋ２。単独のＳＨ２と二つのＳＨ３ドメインを含む哺乳動物のＧｒｂ２タンパク質、２６キロダルトン（ｋＤ）タンパク質がＳｏｓ交換因子に存在するプロリンに富んだ配列と結合するという知見によって、活性化された受容体キナーゼとＲａｓとの間に直接の関連が確立された。
【０００６】
ヒトの腫瘍におけるｒａｓ−調節タンパク質の重要性は、ＢＣＲ−Ａｂｌが媒介する腫瘍形成におけるＧｒｂ２の重大な役割によっても強調される（J. Exp. Med., 179, 167-175 (1994))。
【０００７】
ＳＨ２ドメインとリガンドを有するホスホチロシン（“ｐｔｙｒ”）との結合の中心は、形のよいポケット（pocket）における二価にイオン化したｐｔｙｒのリン酸エステルと二つの不変のアルギニン残基との相互作用である。これらアルギニン−リン酸エステルの相互作用は、リン酸エステル基の除去によって高い親和性結合が通常的に失われるような結合の全てにとって特に重要である。
【０００８】
ｐｔｙｒファーマコフォアはＳＨ２ドメイン−リガンド相互作用において主要な役割を果たすが、ｐｔｙｒ残基は、リン酸エステル結合の酵素的な不安定性および二価にイオン化したリン酸化学種の細胞浸透性の弱さのために、インビボでの応用を意図した阻害剤の適切な成分ではない。
【０００９】
前述のように、ホスホチロシンペプチド結合サイトの構造を模倣する能力を有する分子が必要とされ、さらにタンパク質（例えば調節タンパク質）のＳＨ２ドメイン、例えばＧｒｂ２のそれとリン酸エステル化された部分を有するタンパク質の相互作用を断つ能力のある化合物も必要とされている。ＳＨ２ドメインの結合を阻害する分子の合成における適切な出発材料または前駆体もまた必要とされている。増殖性の疾患または状態の治療または予防、さらに診断、アッセイおよび試験において使用するのに適した化合物もさらに必要とされている。
【００１０】
本発明のこれらの長所は、以下に記載する本発明の実施態様の詳細な説明から明らかになろう。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、式Ｉ：
【００１２】
【化３０】

【００１３】
［式中：
Ａは、カルボキシル、カルボキシアルキル、ジカルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアルキル、ジアルコキシカルボニルアルキル、あるいは式ＩＩのマロニル基：
【００１４】
【化３１】

【００１５】
（式中、Ｒ₁およびＲ₂は、同一であっても異なっていてもよく、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され；Ｒ₃は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アリールおよびアルコキシからなる群から選択される）であり；
Ｂは、式ＩＩＩ：
【００１６】
【化３２】

【００１７】
（式中、Ｐはアミン保護基であり；Ａｒ₁およびＡｒ₂はアリール基である）；あるいは式ＩＶ：
【００１８】
【化３３】

【００１９】
（式中、Ｘは、ＮＨまたはＯであり；Ｒ₄は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルまたはアミン保護基であり；Ｒ₅は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される）を有し；
Ｃは、水素、ヒドロキシル、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルおよびアルコキシカルボニルアルキルからなる群から選択され；
アリール、ヘテロアリールならびにアリールアルキルおよびアルキルアリールのアリール部分は、非置換であっても、アルキル、ヒドロキシ、ハロ、ケト、アミノおよびアルコキシからなる群から選択される置換基で置換されていてもよい；ただし、（ｉ）Ａがカルボキシルまたはカルボキシアルキルであり、Ｃが水素であり、Ｂが式ＩＶ（式中、Ｒ₄は水素またはアルキルカルボニルであり、ＸはＮＨである）を有する場合、Ｒ₅は水素ではない；ならびに（ｉｉ）Ａがカルボキシルまたはカルボキシアルキルであり、Ｃが水素またはヒドロキシであり、Ｂが式ＩＶ（式中、Ｒ₄は水素またはアルキルカルボニルであり、ＸはＯである）を有する場合、Ｒ₅は水素でもアルキルでもない］の化合物を提供する。
【００２０】
本発明は、さらに、以下の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を包含する、式ＶＩＩ：
【００２１】
【化３４】

【００２２】
（式中、Ｒ₂はアルキルであり、Ｐはアミン保護基であり、Ａｒ₁およびＡｒ₂はアリールである）の化合物の製造方法を提供する：
（ａ）ｐ−ハロトルエンをジアルキルマロネートおよびハロゲン化銅（Ｉ）と接触させることで、ｐ−ハロトルエンをｐ−トリル−マロン酸ジアルキルエステルに変換する工程；
（ｂ）ｐ−トリル−マロン酸ジアルキルエステルをハロゲン化して（４−ハロメチルフェニル）−マロン酸ジアルキルエステルを得る工程；および
（ｃ）（４−ハロメチルフェニル）−マロン酸ジアルキルエステルをベンジル−６−オキソ−２，３−ジアリール−４−モルホリンと接触させて、式ＶＩＩの化合物を得る工程。
【００２３】
本発明は、さらに、以下の工程（ａ）および（ｂ）を包含する、式ＶＩＩＩ：
【００２４】
【化３５】

【００２５】
（式中、Ｒ₂はアルキルであり、Ｐはアミン保護基である）の化合物の製造方法を提供する：
（ａ）式ＶＩＩの化合物を還元して、式ＩＸ：
【００２６】
【化３６】

【００２７】
の化合物を得る工程；および
（ｂ）式ＩＸの化合物をアミン保護剤と反応させて式ＶＩＩＩの化合物を得る工程。
【００２８】
本発明は、さらに、式Ｉの化合物と共有結合するコンジュガント（conjugant）を含むコンジュゲート（conjugate）を提供する。
【００２９】
本発明は、さらに、式Ｘ：
Ｗ−Ｙ−（ＡＡ）_n−Ｚ （Ｘ）
［式中、ｎは０〜１５であり；
Ｙは、フェニル環、アミン末端およびカルボキシル末端を有するフェニルアラニル基であり、フェニル環は、ヒドロキシル、カルボキシル、ホルミル、カルボキシアルキル、カルボキシアルキルオキシ、ジカルボキシアルキル、ジカルボキシアルキルオキシ、ジカルボキシハロアルキル、ジカルボキシハロアルキルオキシおよびホスホノアルキル、ホスホノハロアルキルからなる群から選択される１つ以上の置換基を有し、置換基のアルキル部分は、非置換であっても、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ、アミノアルキル、アルキル、アルコキシおよびケトからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；
Ｗは、Ｙの窒素に結合する部分であり、アルキルカルボニル、オキサリル、カルボキシアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、ヘテロシクリルアルキルカルボニル、アリールアルキルヘテロシクリルアルキルカルボニル、アリールオキシカルボニルおよびアリールアルコキシカルボニルからなる群から選択され、置換基のアリールおよびアルキル部分は、非置換であっても、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ、アミノアルキル、アルキル、アルコキシおよびケトからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；Ｗのヘテロシクリル部分は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される少なくとも４個のヘテロ原子を含み；
ＡＡは、そのアミン末端がＹのカルボキシル末端に結合されるアミノ酸であり；
Ｚは、アリールアルキルアミノまたはアリールヘテロシクリルアルキルアミノである（ただし、フェニルアラニルのフェニル環が、アルキルアミド基に対してパラ位にホスホノアルキルまたはホスホノハロアルキル置換基を含み、オルトおよびメタ位が置換されていない場合、Ｗはアリールアルキルアミノでない）］の化合物またはその塩を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、（ａ）医薬上許容される担体および式Ｘの化合物を含む組成物、（ｂ）ＳＨ２ドメインまたはサンプルまたはＳＨ２ドメインを含有する物質と式Ｘの化合物とを接触させる工程を含む、ＳＨ２ドメインがホスホプロテインのようなタンパク質と結合することを阻害する方法、および（ｃ）医薬における式Ｘの化合物の使用を提供する。式Ｘの化合物は、ホスホプロテインの哺乳動物のＳＨ２ドメインへの結合の阻害に応答する状態を治療するための医薬の製造における使用を見出す。本発明はさらに、以下の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を包含する、物質におけるＳＨ２ドメインの存在を決定する方法を提供する：
（ａ）物質のサンプルをＳＨ２結合化合物に暴露して、第一の結合結果を得る工程；
（ｂ）物質の別のサンプルを、コンジュゲートまたは式Ｘの化合物に暴露して、第二の結合結果を得る工程；および
（ｃ）第一の結果と第二の結合結果を比較して、物質中にＳＨ２ドメインが存在するか否かを決定する工程。
【００３１】
本発明はさらに、本発明の化合物を哺乳動物に投与する工程を含む、ＳＨ２ドメインの結合を伴う哺乳動物における疾患、状態または状況を予防または治療する方法を提供する。本発明はさらに、治療と併せて本発明の化合物を哺乳動物に投与する工程を包含する、疾患、状態または状況に罹患した哺乳動物に行った治療の治療効果を高める方法を提供する。
【００３２】
本発明は、特定の実施態様および手順に関連して以下に記載され、開示されているが、そのことは本発明をそれら特定の実施態様に限定することを意図していない。むしろ、そのことは本発明の趣旨および範囲内にあるような代替的な実施態様および改良全てを包含することを意図している。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明は様々な応用、特に哺乳動物の体内の様々な疾患または状態の治療または予防に有用な、特定の新規なフェニルアラニンコンジュゲートを提供する。それらのコンジュゲートの特定の例はフェニルアラニンペプチドコンジュゲートである。本発明は、フェニルアラニンペプチドコンジュゲートの合成に簡便に用いられ得るフェニルアラニン前駆体をさらに提供する。それ故、本発明は、式Ｉの前駆体を提供する：
【００３４】
【化３７】

【００３５】
［式中：
Ａは、カルボキシル、カルボキシアルキル、ジカルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアルキル、ジアルコキシカルボニルアルキル、あるいは式ＩＩのマロニル基：
【００３６】
【化３８】

【００３７】
（式中、Ｒ₁およびＲ₂は、同一であっても異なっていてもよく、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され；Ｒ₃は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アリールおよびアルコキシからなる群から選択される）であり；
Ｂは、式ＩＩＩ：
【００３８】
【化３９】

【００３９】
（式中、Ｐはアミン保護基であり；Ａｒ₁およびＡｒ₂はアリール基である）；あるいは式ＩＶ：
【００４０】
【化４０】

【００４１】
（式中、Ｘは、ＮＨまたはＯであり；Ｒ₄は、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルまたはアミン保護基であり；Ｒ₅は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される）を有し；
Ｃは、水素、ヒドロキシル、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルおよびアルコキシカルボニルアルキルからなる群から選択され、
アリール、ヘテロアリールならびにアリールアルキルおよびアルキルアリールのアリール部分は、非置換であってもアルキル、ヒドロキシ、ハロ、ケト、アミノおよびアルコキシからなる群から選択される置換基で置換されていてもよい；ただし、（ｉ）Ａがカルボキシルまたはカルボキシアルキルであり、Ｃが水素であり、Ｂが式ＩＶ（式中、Ｒ₄は水素またはアルキルカルボニルであり、ＸはＮＨである）を有する場合、Ｒ₅は水素ではない；ならびに（ｉｉ）Ａがカルボキシルまたはカルボキシアルキルであり、Ｃが水素またはヒドロキシであり、Ｂが式ＩＶ（式中、Ｒ₄は水素またはアルキルカルボニルであり、ＸはＯである）を有する場合、Ｒ₅は水素でもアルキルでもない］。
【００４２】
上述した様々な基のアルキル部分は、例えば１から約１２個の炭素原子、好ましくは１から６個の炭素原子、より好ましくは１から４個の炭素原子のような任意の適切な数の炭素原子を有し得る。上述した様々な基のアリール部分は、例えば１から３個の環、好ましくは１または２個の環、より好ましくは１個の環のような任意の数の芳香環を有し得る。それ故、例えば、本発明は式Ｉの化合物を提供する［式中、Ａが、カルボキシル、カルボキシルＣ₁−Ｃ₆アルキル、ジカルボキシＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシカルボニル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシカルボニルＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆ジアルコキシカルボニルＣ₁−Ｃ₆アルキル、あるいは式ＩＩのマロニル基（式中、Ｒ₁およびＲ₂は、同一であっても異なっていてもよく、水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アリール、アリールＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルアリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され；Ｒ₃は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アリールおよびＣ₁−Ｃ₆アルコキシからなる群から選択される）であり；
Ｂが、式ＩＩＩ（式中、Ｐはアミン保護基であり；Ａｒ₁およびＡｒ₂は、アリール基である）を有するか；またはＢが式ＩＶ（式中、Ｘは、ＮＨまたはＯであり；Ｒ₄は、水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アリール、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルアリール、アリールＣ₁−Ｃ₆アルキルまたはアミン保護基であり；Ｒ₅は、水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アリール、アリールＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルアリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される）を有し；
Ｃが、水素、ヒドロキシル、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルカルボニル、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルカルボニルオキシ、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシカルボニルおよびＣ₁−Ｃ₆アルコキシカルボニルＣ₁−Ｃ₆アルキルからなる群から選択され；アリール、ヘテロアリールならびにアリールアルキルおよびアルキルアリールのアリール部分は、非置換であっても、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、ヒドロキシ、ハロ、ケト、アミノおよびＣ₁−Ｃ₆アルコキシからなる群から選択される置換基で置換されていてもよい］。
【００４３】
Ｂの不斉炭素は、任意の適切なコンフィグレーションを有し得る。具体的には、ＢはＲ、ＳまたはＲおよびＳのコンフィグレーションを有し得る。それ故、式ＩＩＩのＢは以下の構造を有し得る：
【００４４】
【化４１】

【００４５】
式Ｉの化合物の特定の実施態様においては、式中Ｂは式ＩＩＩを有し、Ａｒ₁およびＡｒ₂は、必要に応じてアルキル、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アミノアルキルまたはアルコキシ置換基で置換され得るフェニルである。Ｐは、アミン保護基である。当業者に公知の任意の適切なアミン保護基を用いることができ、例えば、アミン保護基はフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）、カルボベンゾキシ（Ｃｂｚ）およびカルバモイルからなる群から選ばれる。好ましくは、アミン保護基はＦｍｏｃ、ｔ−Ｂｏｃ、またはＣｂｚであり、そしてより好ましくはＦｍｏｃである。
【００４６】
式ＩＶのＢは以下の構造を有し得る。
【００４７】
【化４２】

【００４８】
（式中、ＸはＮＨまたはＯであり；Ｒ₄は水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アリール、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルアリール、アリールＣ₁−Ｃ₆アルキルまたはアミン保護基であり；Ｒ₅は水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アリール、アリールＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルアリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される）。式ＩＶａのＢを有する化合物が好ましい。
【００４９】
いくつかの好ましい実施態様においては、式Ｉの化合物は式ＩＶａを有し、かつＸはＯである。特定の実施態様においては、Ｒ₄は水素である。式Ｉの化合物のいくつかの好ましい実施態様においては、Ｂは式ＩＶａを有し、ＸはＯであり、かつＲ₄はアミン保護基である。当業者にとって公知の任意の適切なアミン保護基が用いられ得、例えば、アミン保護基はＦｍｏｃ、ｔ−Ｂｏｃ、Ｃｂｚおよびカルバモイルからなる群から選ばれる。好ましくは、アミン保護基はＦｍｏｃ、ｔ−ＢｏｃまたはＣｂｚであり、より好ましくはＦｍｏｃである。
【００５０】
式Ｉの化合物のいくつかの実施態様においては、Ｂは式ＩＶａまたはＩＶｂを有し、ＸはＮＨまたはＯであり、Ｒ₄はアミン保護基であり、かつＲ₅は水素である。式Ｉの化合物の特定の好ましい実施態様においては、Ｂは式ＩＶａまたはＩＶｂを有し、ＸはＮＨまたはＯであり、Ｒ₄はアミン保護基であり、Ｒ₅は水素であり、かつＡは式ＩＩのマロニル基（式中、Ｒ₁およびＲ₂は水素である）である。Ｒ₃が水素であることはさらに好ましい。
【００５１】
式Ｉの化合物の特定の実施態様においては、Ｃは水素である。式Ｉの化合物のいくつかの実施態様においては、ＣはＣ₁−Ｃ₆のアルキルオキシカルボニルであり、例えば、Ｃはｔ−Ｂｏｃである。それ故、本発明の特定の実施態様には、式Ｉの化合物［式中、Ｂは式ＩＶａまたはＩＶｂであり、ＸはＮＨまたはＯであり、Ｒ₄はアミン保護基であり、Ｒ₅は水素であり、かつＡは式ＩＩのマロニル基（式中、Ｒ₁およびＲ₂は水素であり、Ｃは水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルオキシカルボニルである）である］が挙げられる。
【００５２】
式Ｉの化合物のいくつかの実施態様においては、ＣはＣ₁−Ｃ₆アルキルカルボニルオキシであり、例えば、Ｃはアセトキシである。それ故、本発明の特定の実施態様には、式Ｉの化合物［式中、Ｂは式ＩＶａまたはＩＶｂを有し、ＸはＮＨまたはＯであり、Ｒ₄はアミン保護基であり、Ｒ₅は水素であり、かつＡは式ＩＩのマロニル基（式中、Ｒ₁およびＲ₂は水素であり、ＣはＣ₁−Ｃ₆アルキルオキシカルボニルである）である］が挙げられる。
【００５３】
式Ｉの化合物の好ましい例には、式中Ａは式ＩＩ（式中、Ｒ₁およびＲ₂はｔｅｒｔ−ブチルであり、かつＲ₃は水素である）であり、Ｃは水素であり、Ｂは式ＩＶａ（式中、ＸはＯであり、Ｒ₄はＦｍｏｃであり、かつＲ₅は水素である）である化合物；式中Ａはｔ−ブトキシカルボニルメチルであり、Ｃはｔ−ブトキシカルボニルであり、Ｂは式ＩＶａ（式中、ＸはＯであり、Ｒ₄はＦｍｏｃであり、かつＲ₅は水素である）である化合物；および、式中Ａはｔ−ブトキシカルボニルメチルであり、Ｃはアセトキシであり、Ｂは式ＩＶａ（式中、ＸはＯであり、Ｒ₄はＦｍｏｃであり、かつＲ₅は水素である）である化合物が挙げられる。
【００５４】
式Ｉの化合物は当業者にとって公知の方法によって製造され得る。本発明は式Ｉの化合物、特に式ＶＩＩＩの化合物の製造方法を提供する。本発明は式ＶＩＩＩの化合物（式中Ｒ₂はアルキルであり、Ｐはアミン保護基である）の製造方法を提供し、該方法は、
（ａ）式（ＶＩＩ）の化合物（式中、Ｐはアミン保護基である）を還元して式ＩＸの化合物を得る工程；および（ｂ）式ＩＸの化合物をアミン保護剤と反応させて式ＶＩＩＩの化合物を得る工程、を含む。
【００５５】
本発明はさらに、式ＶＩＩの化合物（式中、Ｒ₂はアルキルである）の製造方法も提供する。該方法は、
（ａ）ｐ−ハロトルエンをジアルキルマロネートおよびハロゲン化銅（Ｉ）と接触させることで、ｐ−ハロトルエンをｐ−トリル−マロン酸ジアルキルエステルに変換する工程；
（ｂ）ｐ−トリル−マロン酸ジアルキルエステルをハロゲン化して（４−ハロメチルフェニル）−マロン酸ジアルキルエステルを得る工程；および
（ｃ）（４−ハロメチルフェニル）−マロン酸ジアルキルエステルをベンジル−６−オキソ−２，３−ジアリール−４−モルホリンと接触させて、式ＶＩＩの化合物を得る工程、を包含する。
【００５６】
本発明の方法の一実施態様は図１に図示される。それ故、例えば、ｐ−ヨードトルエンを、水素化ナトリウムのような塩基の存在下でマロン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルおよび塩化第一銅と接触させる。ｐ−トリル−マロン酸ジアルキルエステルを生成するこの反応は、溶媒、好ましくはジオキサンおよびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）を含む溶媒のような乾燥極性溶媒中で、約８０から約１２０(Ｃ、好ましくは約９０から約１１０℃の温度下で行う。終点において、反応混合物を室温（２０−２５℃）まで冷却し、続いてアンモニウム塩で停止させる。次いで、ジアルキルエステルを反応混合物から単離する。好ましくは、反応混合物を酢酸エチルのような抽出溶媒で抽出し、食塩水で洗浄し、乾燥する。次いで、抽出溶媒を、例えば蒸留によって除去し、得られたジアルキルエステルをクロマトグラフカラムで精製する。
【００５７】
上記のように製造されたｐ−トリル−マロン酸ジアルキルエステルは公知のハロゲン化剤、例えばＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）によってハロゲン化し得る。それ故、ｐ−トリル−マロン酸ジアルキルエステルをＣＣｌ₄のような適切な溶媒中、ＮＢＳおよび過酸化物とともに混合する。反応は、高温、好ましくは溶媒の還流温度で行う。生成した沈殿を除去し、所望の生成物を反応混合物の液体部から単離する。液体部を非極性溶媒で、好ましくは繰り返し抽出してもよく、合わせた非極性溶媒抽出物を乾燥させる。得られた生成物、すなわち（４−ブロモフェニル）マロン酸ジアルキルエステルを、好ましくはクロマトグラフカラムで精製する。
【００５８】
上述のように合成した（４−ブロモフェニル）マロン酸ジアルキルエステルを、適切な塩基の存在下、ベンジル−６−オキソ−５，６−ジアリール−４−モルフォリン−カルボキシレートと接触させて、ベンジル−３−［ジアルキルオキシカルボニルメチル）フェニルメチル］−６−オキソ−５，６−ジアリール−４−モルフォリン−カルボキシレートを製造することができる。ＨＭＰＡを含むテトラヒドロフランのような極性溶媒をこの反応を行うために用いる。反応は低温、好ましくは約−７８℃で行う。リチウムビス（トリメチルシリル）アミドが適切な塩基の一例である。反応が完結した後、反応混合物をアンモニウム塩溶液で停止させる。所望の生成物を酢酸エチルのような非極性溶媒中に、好ましくは繰り返して抽出する。非極性溶媒抽出物を水洗し、乾燥し、濃縮する。生成物はクロマトグラフカラムで精製することができる。
【００５９】
４−（ジアルキルオキシカルボニルメチル）−フェニルアラニンはベンジル−３−［ジアルキルオキシカルボニルメチル）フェニルメチル］−６−オキソ−５，６−ジアリール−４−モルフォリン−カルボキシレートを還元することで製造することができる。還元は水素および適切な触媒によって、例えば水素とパラジウム黒を用いて行うことができる。還元は少量の酸（例えば、酢酸）を含むテトラヒドロフラン−エタノール混合物のような溶媒中で行うことができる。水素圧は約４５から約２５ｐｓｉに維持し得、還元は室温下で行うことができる。得られた生成物はエーテルで洗浄することで精製することができる。所望の立体化学の生成物は、ベンジル−６−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルフォリンの立体化学を選択することで得ることができる。それ故、ベンジル−３−［ジアルキルオキシカルボニルメチル）フェニルメチル］−６−オキソ−５，６−ジアリール−４−モルフォリン−カルボキシレートは、ベンジル（２Ｒ，３Ｓ）（−）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルフォリンを選択することにより得ることができる。
【００６０】
Ｎ−Ｆｍｏｃ−４−（ジアルキルオキシカルボニルメチル）−フェニルアラニンは、４−（ジアルキルオキシカルボニルメチル）−フェニルアラニンをアミン保護剤、例えばＦｍｏｃ−ＯＳｕと反応させることで合成することができる。重炭酸ナトリウムのような塩基を反応に用いることができる。反応は例えばジオキサンおよび水を含む溶媒中、室温下で行うことができる。反応は完結するまで行う。反応の終点で、反応混合物を好ましくは０℃に冷却し、酸性化する。次いで、生成物を有機溶媒中、例えば酢酸エチル中に、好ましくは繰り返し抽出する。合わせた有機抽出物を水洗し、乾燥し、濃縮する。得られた粗生成物はクロマトグラフカラム、例えばシリカゲルカラムで精製することができる。
【００６１】
本発明は式Ｉの化合物と共有結合したコンジュガントを含むコンジュゲートをさらに提供する。本発明のコンジュゲートは哺乳動物、好ましくはヒトの様々な疾患または状態の治療または予防における特定の用途も見出すことができる。ここで、コンジュゲートのフェニルアラニル部分は相互作用するかまたは相互作用を促進し、あるいは他のリガンドが疾患または状況の出発点または進行を招くドメインまたは受容体サイトと相互作用または結合することを防ぐ。このようなドメインの例にはＳＨ２ドメインが挙げられる。このような疾患または状況の例には癌および自己免疫疾患のような増殖性疾患が挙げられる。このコンジュゲートはまた、診断、アッセイ、スクリーニングおよび試験における用途も見出す。
【００６２】
コンジュガントは、上述のコンジュゲートを与える任意の適切な材料であり得る。コンジュガントはアミノ酸または核酸、例えば天然または合成のペプチドまたはヌクレオチドであり得る。コンジュガントは天然または合成ポリマー、例えば炭水化物ポリマーであり得る。好ましいコンジュゲートはアミノ酸を含むもので、例えば下記式Ｘのコンジュゲートである。
【００６３】
それ故、本発明は、式：
Ｗ−Ｙ−（ＡＡ）_n−Ｚ （Ｘ）
［式中、ｎは０〜１５であり；
Ｙは、フェニル環、アミン末端およびカルボキシル末端を有するフェニルアラニル基であり、フェニル環は、ヒドロキシル、カルボキシル、ホルミル、カルボキシアルキル、カルボキシアルキルオキシ、ジカルボキシアルキル、ジカルボキシアルキルオキシ、ジカルボキシハロアルキル、ジカルボキシハロアルキルオキシおよびホスホノアルキル、ホスホノハロアルキルからなる群から選択される１つ以上の置換基を有し、置換基のアルキル部分は、非置換であっても、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ、アミノアルキル、アルキル、アルコキシおよびケトからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；
Ｗは、Ｙの窒素に結合する部分であり、アルキルカルボニル、オキサリル、アルキルアミノオキサリル、アリールアミノオキサリル、アリールアルキルアミノオキサリル、アルコキシオキサリル、カルボキシアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、ヘテロシクリルアルキルカルボニル、アリールアルキルヘテロシクリルアルキルカルボニル、アリールオキシカルボニルおよびアリールアルコキシカルボニルからなる群から選択され、置換基のアリールおよびアルキル部分は、非置換であっても、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ、アミノアルキル、アルキル、アルコキシおよびケトからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；Ｗのヘテロシクリル部分は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される少なくとも４個のヘテロ原子を含み；
ＡＡは、そのアミン末端がＹのカルボキシル末端に結合されるアミノ酸であり；
Ｚは、アリールアルキルアミノまたはアリールヘテロシクリルアルキルアミノである（ただし、フェニルアラニルのフェニル環が、アルキルアミド基に対してパラ位にホスホノアルキルまたはホスホノハロアルキル置換基を含み、オルトおよびメタ位が置換されていない場合、Ｗはアリールアルキルアミノでない）］の化合物またはその塩を提供する。
【００６４】
上述した様々な基のアルキル部分は任意の適切な数の炭素原子、例えば１から約１２個の炭素原子、好ましくは１から６個の炭素原子、より好ましくは１から４個の炭素原子を有し得る。上述した様々な基のアリール部分は任意の数の芳香環、例えば１から３個の６員環、好ましくは１または２個の環、より好ましくは１個の環を有し得る。それ故、例えば本発明は式ＸＩ［式中、Ｙが、フェニル環、アミン末端およびカルボキシル末端を有するフェニルアラニル基であり、フェニル環は、ヒドロキシル、カルボキシル、ホルミル、カルボキシＣ₁−Ｃ₆アルキル、カルボキシＣ₁−Ｃ₆アルキルオキシ、ジカルボキシＣ₁−Ｃ₆アルキル、ジカルボキシＣ₁−Ｃ₆アルキルオキシ、ジカルボキシハロＣ₁−Ｃ₆アルキル、ジカルボキシハロＣ₁−Ｃ₆アルキルオキシおよびホスホノＣ₁−Ｃ₆アルキル、ホスホノハロＣ₁−Ｃ₆アルキルからなる群から選択される１つ以上の置換基を有し、置換基のアルキル部分は、非置換であっても、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ、アミノＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシおよびケトからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；
Ｗは、Ｙの窒素に結合する部分であり、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルカルボニル、オキサリル、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルアミノオキサリル、アリールアミノオキサリル、アリールＣ₁−Ｃ₆アルキルアミノオキサリル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシオキサリル、カルボキシＣ₁−Ｃ₆アルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、ヘテロシクリルＣ₁−Ｃ₆アルキルカルボニル、アリールＣ₁−Ｃ₆アルキルヘテロシクリルＣ₁−Ｃ₆アルキルカルボニル、アリールオキシカルボニルおよびアリールＣ₁−Ｃ₆アルコキシカルボニルからなる群から選択され、置換基のアリールおよびアルキル部分は、非置換であても、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ、アミノＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシおよびケトからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；Ｗのヘテロシクリル部分は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される少なくとも４個のヘテロ原子を含み；
ＡＡは、そのアミン末端がＹのカルボキシル末端に結合されるアミノ酸であり；
Ｚは、アリールＣ₁−Ｃ₆アルキルアミノまたはアリールヘテロシクリルＣ₁−Ｃ₆アルキルアミノである］の化合物またはそれらの塩を提供する。この化合物は、Ｄ、Ｌまたはそれらの混合物であり得る。
【００６５】
式Ｘの好ましい化合物には、式中、Ｙが式ＸＩ
【００６６】
【化４３】

【００６７】
［式中、
Ｄは、式ＸＩＩ、ＸＩＩＩまたはＸＩＶ：
【００６８】
【化４４】

【００６９】
（式中、Ｒ₃およびＲ₄は、同一であっても異なっていてもよく、水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、アリール、アリールＣ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルカリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され；Ｒ₅およびＲ₆は、同一であっても異なっていてもよく、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノおよびＣ₁−Ｃ₆アルコキシからなる群から選択される）を有し；
Ｅは、水素、ヒドロキシ、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルカルボニル、カルボキシルおよびＣ₁−Ｃ₆アルキルカルボニルＣ₁−Ｃ₆アルキルからなる群から選択される］を有するものが挙げられる。
【００７０】
本発明の化合物の特定の例には、式Ｘの化合物（式中、Ｄは式ＸＩＩ、ＸＩＩ、またはＸＩＩＩを有し、Ｅは水素、ヒドロキシまたはカルボキシルである）が挙げられる。いくつかの実施態様においては、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆は水素である。特定の実施態様では、式中、Ｄは式ＸＩＩを有し、Ｅはヒドロキシまたはカルボキシルであり、Ｒ₃、Ｒ₅およびＲ₆は水素である化合物；およびＤは式ＸＩＩＩを有し、Ｅは水素であり、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₅は水素、ヒドロキシ、アルキルオキシ、ハロ、ケトまたはアルキルであり、好ましくはＲ₅は水素である化合物が挙げられる。
【００７１】
特定の実施態様においては、ＷはＣ₁−Ｃ₆アルキルカルボニル、好ましくはＣ₁−Ｃ₃アルキルカルボニル、例えばアセチルである。いくつかの別の実施態様においては、Ｗはオキサリルまたはカルボキシメチルカルボニルである。いくつかの他の実施態様においては、Ｗはテトラゾリルカルボニル、好ましくはテトラゾリルメチルカルボニルである。いくつかの実施態様においては、Ｗはアリールメチルオキシカルボニル、好ましくはアミノフェニルメチルオキシカルボニル、より好ましくは３−アミノフェニル−１−メチルオキシカルボニルであり得る。Ｗはアリールオキシカルボニル、好ましくはナフチルオキシカルボニル、より好ましくはアミノナフチルオキシカルボニルでもあり得る。アミノナフチルオキシカルボニルの例は６−アミノ−１−ナフチルオキシカルボニルである。
【００７２】
本発明は式Ｘの化合物（式中、Ｗはアリールメチルテトラゾリルメチルカルボニル、例えばフェニルメチルテトラゾリルメチルカルボニルである）も提供する。本発明はさらに式Ｘの化合物（式中、Ｗはアルコキシフェニルメチルテトラゾリルメチルカルボニル、例えばメトキシフェニルメチルテトラゾリルメチルカルボニルである）を提供する。
【００７３】
Ｚがアリールアルキルアミノである式Ｘの化合物の実施態様において、Ｚのアリール部分が、式：
【００７４】
【化４５】

【００７５】
（式中、Ｑ₁は、水素、またはヒドロキシル、ハロ、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ、アミノおよびＣ₁−Ｃ₆アシルアミノからなる群から選択される置換基である）を有する。
【００７６】
Ｚのアリール部分は、好ましくはアリールの１−または２−位でＺのアルキルアミノ部分に結合する。式ＸＩの好ましい化合物は、式中Ｑ₁が水素またはメチルである化合物である。式ＸＩの好ましい化合物は、式中Ｚがナフチルプロピルアミノである化合物である。
【００７７】
式中、Ｚがアリールヘテロシクリルアルキルアミノである式Ｘの化合物の態様において、Ｚのヘテロシクリル部分は、式
【００７８】
【化４６】

【００７９】
（式中、Ｑ₂は、水素、またはヒドロキシル、ハロ、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ、アミノおよびＣ₁−Ｃ₆アシルアミノからなる群から選択される置換基であり、ＦおよびＧは、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される）を有する。好ましいＦはＣであり、好ましいＧはＮである。式Ｘの好ましい化合物は式中Ｑ₂が水素またはメチルである化合物である。
【００８０】
式Ｘの化合物におけるアミノ酸セグメントまたは単位の数は０から１５であり得る。より小さいｎ値を有する化合物が好ましい。例えば、式中ｎが１−１０の化合物が好ましく；式中ｎが１−３の化合物がより好ましく；式中ｎが２の化合物がさらに好ましい。
【００８１】
式Ｘの化合物には任意の適切なアミノ酸が挙げられ得る。例えば、アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、メチオニン、システイン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、プロリン、トランス−３−ヒドロキシプロリンおよびトランス−４−ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、チロシン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロへキシルグリシン、４−アミノシクロヘキシルグリシン、４−アシルアミノシクロヘキシルグリシン、トリプトファン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リシン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロへプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニンおよびα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む群、好ましくはそれらからなる群から選ばれ得る。
【００８２】
好ましくは、アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、４−アミノシクロヘキシルグリシン、４−アシルアミノシクロヘキシルグリシン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸およびグルタミンからなる群から選ばれる。
【００８３】
式Ｘの化合物は、フェニルアラニン部分（Ｙ）に結合した第一のアミノ酸（ＡＡ₁）およびＡＡ₁に結合したアスパラギンを含み、ＡＡ₁が、シクロへキシルグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、４−アミノシクロへキシルグリシン、４−アセチルアミノシクロヘキシルグリシン、ロイシンおよびイソロイシンからなる群から選択されることがさらに好ましい。式Ｘの好ましい化合物は式中ＡＡ₁がシクロヘキシルグリシンである化合物である。
【００８４】
式Ｘの化合物のさらなる例は図２に示される。式Ｉの化合物は当業者にとって公知の方法によって製造され得る。例えば、この化合物は固相または液相ペプチド合成法によって製造され得る。それ故、この化合物はアミノ酸またはペプチドを本発明の前駆体と反応させることで製造され得る。合成方法のいくつかの実施態様は実施例において例示する。
【００８５】
本発明はさらに、医薬的に許容される担体および有効な（例えば、治療上または予防上有効な）量の少なくとも一つの上述した化合物、特に式Ｘの化合物を含む組成物を提供する。本発明はさらに、サンプルまたはＳＨ２ドメインを含有する物質と式Ｘの化合物とを接触させる工程を含む、ＳＨ２ドメインのホスホプロテインとの結合を阻害する方法を提供する。
【００８６】
本発明は、ホスホプロテインの哺乳動物のＳＨ２ドメインとの結合の阻害に応答する状況の治療のための医薬の製造における式Ｘの化合物の使用を開示する。本発明は医薬における式Ｘの化合物の使用をさらに教示する。式Ｘの化合物は、Ｇｒｂ２−ＳＨ２ドメイン阻害剤としての使用を見出す。
【００８７】
本明細書に記載される医薬的に許容し得る（例えば薬理学的に許容し得る）担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤または希釈剤は当業者に周知であって、一般に容易に入手可能である。医薬的に許容し得る担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であるもの、および使用条件下で有害な副作用または毒性を有しないものであることが好ましい。
【００８８】
担体の選択は特定の活性薬剤および組成物を投与するために使用される特定の方法によりある程度決定されるだろう。従って、本発明の医薬組成物の広範な種々の適当な製剤が存在する。以下に述べる経口、エアロゾル、非経口、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、包膜内、直腸および膣投与のための製剤は単に例示であって、決して限定されるものではない。
【００８９】
経口投与に適した製剤は、（ａ）液剤（例えば、有効量の化合物が希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはオレンジジュース）に溶解したもの）；（ｂ）カプセル剤、カシェ剤(sachet)、錠剤、ロゼンジ剤およびトローチ剤（これらはそれぞれ所定量の活性成分を固体または顆粒として含む）；（ｃ）散剤；（ｄ）適切な液体中の懸濁剤；および（ｅ）適当な乳剤を含み得る。液体製剤は、医薬的に許容し得る界面活性剤、懸濁剤または乳剤を添加しているか添加していない、水およびアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコールおよびポリエチレンアルコール）のような希釈剤を含み得る。カプセル剤形態は、例えば、界面活性剤、滑沢剤および不活性充填剤（例えば、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウムおよびコーンスターチ）を含有する通常の硬質または軟質シェル型(hard- or soft-shelled)ゼラチンタイプのものであり得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝化剤、崩壊剤、湿潤剤、保存剤、香味剤および薬理学的に適合性の担体のうちの１つ以上を含むことができる。ロゼンジ剤形態は、香味料（通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント）中に活性成分を含むことができ、ならびに香錠剤は、不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）中に活性成分を含み、そして乳剤、ゲル等は、活性成分に加えて、当該分野で公知のような担体を含有する。
【００９０】
本発明の化合物は、単独でまたは他の適当な構成成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にすることができる。これらのエアロゾル製剤は、加圧された許容し得る推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等）中に入れてもよい。また、これらはネブライザまたはアトマイザのような非加圧製剤用の医薬として製剤化され得る。
【００９１】
非経口投与に適した製剤としては、水性および非水性の、等張性の無菌注射液剤（これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができる）、ならびに水性および非水性の無菌懸濁剤（これは、懸濁化剤、可溶化剤、粘稠化剤、安定化剤および保存剤を含むことができる）が挙げられる。医薬的に許容し得る界面活性剤（例えば、石鹸または洗剤）、懸濁化剤（例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロース）または乳化剤および他の医薬的アジュバントを添加してまたは添加しないで、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノールまたはヘキサデシルアルコール）、グリコール類（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、グリセロールケタール類（例えば、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール）、エーテル類（例えば、ポリ（エチレングリコール）４００）、オイル、脂肪酸、脂肪酸エステルまたはグリセリドまたはアセチル化脂肪酸グリセリドを含む、無菌液体または液体混合物のような、医薬的担体における生理的に許容し得る希釈剤中で化合物を投与し得る。
【００９２】
非経口用製剤に使用することができるオイルとしては、石油、動物油、植物油または合成油が挙げられる。オイルの特定の例としては、ピーナツ油、大豆油、ごま油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ワセリンおよび鉱物油が挙げられる。非経口製剤に使用するのに適当な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは適当な脂肪酸エステルの例である。非経口製剤に使用するのに適当な石鹸としては、脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム塩およびトリエタノールアミン塩が挙げられ、適当な界面活性剤としては、（ａ）カチオン性界面活性剤（例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライドおよびアルキルピリジニウムハライド等）、（ｂ）アニオン性界面活性剤（例えば、スルホン酸アルキル、スルホン酸アリールおよびスルホン酸オレフィン、硫酸アルキル、硫酸オレフィン、硫酸エーテルおよび硫酸モノグリセリドならびにスルホスクシネート等）、（ｃ）非イオン性界面活性剤（例えば、脂肪酸アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミドおよびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー等）、（ｄ）両性界面活性剤（例えば、アルキル−β−アミノプロピオネートおよび２−アルキル−イミダゾリン第四級アンモニウム塩等）ならびに（ｅ）それらの混合物が挙げられる。
【００９３】
非経口製剤は、典型的には、溶液中に約０．５〜約２５重量％の活性成分を含む。このような製剤において、適当な保存剤および緩衝剤を使用することができる。注射部位での刺激を最小限にするかまたは除去するために、このような組成物は、１以上の非イオン性界面活性剤を含有していてもよい。このような製剤中の界面活性剤の量は、典型的には、約５〜約１５重量％の範囲である。適当な界面活性剤としては、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノオレイン酸ソルビタン）およびプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成されるエチレンオキシドと疎水性基剤との高分子量付加体が挙げられる。非経口製剤は、単回用量または多回用量のシールされた容器（例えば、アンプルおよびバイアル）中に存在することができ、使用直前に注射用の無菌液体担体（例えば、水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時調合注射液剤および懸濁剤は、前述した種類の無菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
【００９４】
本発明の化合物は注射可能な製剤に製造されてもよい。注射可能な組成物に必要とされる有効な医薬担体は、当業者に周知である（例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982)およびASHP Handbook on Injectable Drugs, Toisell, 4th ed., pages 622-630 (1986)参照）。
【００９５】
さらに、本発明の化合物は、種々の基剤（例えば、乳化基剤または水溶性基剤）と混合することにより坐剤に製造することができる。膣投与に適した製剤は、活性成分に加えて、当該分野で適切であることが公知であるような担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡状物またはスプレー剤として提供されてもよい。
【００９６】
適当な用量および投与計画は、当業者に公知の従来の用量反応域検出技術によって決定することができる。一般に、治療は、化合物の最適用量よりも少量の投薬量で開始される。その後、投薬量は、その状況下での最適の効果に達するまで、少量ずつ増加される。便利のために、所望であれば、１日の全投与量は一日の間で部分に分割され投与されてもよい。特定の化合物を適当な投与量でかつ適当に投与することにより、本発明は広い範囲の応答を提供する。典型的には、投与量は約０．００１〜約１０００ｍｇ／処置される動物のｋｇ体重／日の範囲である。好ましい投与量は約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲であり、さらに好ましい投与量は約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【００９７】
式Ｘの化合物は、それらがインビボでの使用中に出くわす酵素に対してまたは該酵素の存在下で安定であるという利点を有する。式Ｘの化合物はインビトロおよびインビボでの適用において用途を見出すことができる。例えば、該化合物は、分子のプローブ(probe)としての用途ならびに細胞または組織の受容体または結合部位を同定、単離および／または定量するためのアッセイにおける用途を発見することができる。式Ｘの化合物はまた、ＳＨ２ドメインを伴う種々の疾患または状況(condition)の治療における効能を研究するためのインビボの用途を発見することができる。
【００９８】
本発明はさらに、本発明の化合物の使用によって哺乳動物における疾患、状態(state)もしくは状況の予防方法または治療方法を提供する。１つの実施態様では、該方法は疾患、状態または状況の予防を含む。別の実施態様では該方法は既存の疾患、状態または状況の治療を含む。
【００９９】
好ましくは、該方法はホスホプロテインと結合しているＳＨ２ドメインの阻害を含む。ＳＨ２ドメインは１以上の以下のタンパク質を含んでもよい。：Ｓｒｃ、Ｌｃｋ、Ｅｐｓ、ｒａｓＧＴＰａｓｅ−活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ホスホリパーゼＣ、ホスホイノシトール−３（Ｐｌ−３）キナーゼ、Ｆｙｎ、Ｌｙｋ、Ｆｇｒ、Ｆｅｓ、ＺＡＰ−７０、Ｓｅｍ−５、ｐ８５、ＳＨＰＴＰ１、ＳＨＰＴＰ２、コルクスクリュー、Ｓｙｋ、Ｌｙｎ、Ｙｅｓ、Ｈｃｋ、Ｄｓｒｃ、Ｔｅｃ、Ａｔｋ／Ｂｐｋ、Ｉｔｋ／Ｔｓｋ、Ａｒｇ、Ｃｓｋ、テンシン、Ｖａｖ、Ｅｍｔ、Ｇｒｂ２、ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｃｒｋ、ＣｒｋＬ、Ｓｙｐ、Ｂｌｋ、１１３ＴＦ、９１ＴＦ、Ｔｙｋ２、特にＳｒｃ、ホスホリパーゼＣ、ホスホイノシトール（phoshoinositol）−３（ｐｌ−３）キナーゼ、Ｇｒｂ２、ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｓｈｃ、Ｎｃｋ、Ｃｒｋ、ＣｒｋＬ、Ｓｙｐ、Ｂｌｋ、１１３ＴＦ、９１ＴＦおよびＴｙｋ２。
【０１００】
該方法は哺乳動物に１以上の本発明の化合物を投与する工程を含む。疾患、状態、状況は、癌（例えば、乳癌もしくは卵巣癌）または腫瘍（例えば固形腫瘍（例えば脳腫瘍、前立腺腫瘍等））、慢性骨髄性白血病を含む白血病、リンパ腫、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、糖尿病、肥満症、あるいは心血管疾患であり得る。
【０１０１】
本発明はさらに、治療と組み合わせて化合物を投与する工程を含む、哺乳動物に施される治療の治療効果を高める方法を提供する。組み合わせるとは、例えば治療薬剤の投与前、投与と同時または投与後に、該阻害剤を任意の適当な方法で使用することができることを意味する。ＳＨ２ドメイン結合阻害剤が当業者に公知の他の治療と組み合わせて使用される場合、相乗効果が観察される。この阻害剤は化学療法治療の細胞毒性を強める。癌治療はこの組み合わせ治療に特に適当である。
【０１０２】
癌は任意の多くの機構を伴い得る。ヒト乳癌の大部分は、連続的な細胞内増殖を達成する手段としての増殖因子受容体の活性化を経由するＲａｓシグナル経路の活性化による。例えば、癌はＨｅｒ−２／ｎｅｕの過剰発現を伴い得る。癌はＢＣＲ−ＡｂｌまたはｅｒｂＢ−２受容体の発現によりもたらされ得る。ｐ１８５ ｅｒｂＢ−２過剰発現によって形質転換される細胞において、Ｇｒｂ２機能にそのＳＨ２ドメインで作用している治療剤は、ｒａｓ経路へのシグナル伝達の流れを妨げて、その後癌表現型の逆転をもたらし得る。
【０１０３】
治療的処置には化学療法、放射線療法および／または生物学的療法を挙げることができる。化学療法の例には、癌治療剤（例えばアルキル化剤、ホルモン剤、代謝拮抗剤、天然産物および多種多様な薬剤の使用が挙げられる。癌治療剤の特定の例には、パクリタキセル、５−フルオロウラシルおよびドキソルビシンが挙げられる。生物学的療法の例には、タンパク質（例えば、抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）または組み換え型タンパク質）の使用が挙げられる。抗体の例はハーセプチンであり、それはｅｒｂＢ−２受容体阻害を目的としている。実施態様では、治療効果を高めることには、哺乳動物における細胞生存因子をブロックすることおよび／または細胞アポトーシスを誘発する（例えば、強化するかまたは加速する）ことが挙げられる。治療はインビボおよび／またはインビトロで実行され得る。
【０１０４】
本発明はさらに、哺乳動物におけるＭＡＰキナーゼ活性を阻害する方法を提供する。ＭＡＰキナーゼは、細胞増殖および分化の調節において重大な役割を果たすタンパク質キナーゼカスケードにおいて機能する。ＭＡＰキナーゼは増殖因子、サイトカインおよびホルモンを含む種々のシグナルによってＧｒｂ２および他のシグナルタンパク質を介して活性化される。例えば、細胞内ＭＡＰキナーゼのトレオニンおよびチロシンのリン酸エステル化の状態は、ＭＡＰキナーゼのリン酸エステル化されたトレオニンおよびチロシン残基を特異的に認識するポリクローナル抗体を用いる増殖因子ヘレグリン（ＨＲＧ）で処理されたＭＤＡ−４５３細胞中で決定される。ＭＡＰキナーゼ活性の用量依存的な阻害はＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中で観察される。ＭＡＰキナーゼ阻害のＩＣ₅₀値は化合物１２６について１２．５μＭであり、細胞増殖阻害と一致する。
【０１０５】
Ｇｒｂ２ ＳＨ２結合阻害剤は、活性化されたＰＴＫ受容体とＧｒｂ２の会合または結合を阻害するのに効果的である。ＰＴＫ受容体を含むホスホチロシン化された（phosphotyrosinylated）タンパク質と固有のＧｒｂ２タンパク質の相互作用はＧｒｂ２を免疫沈降させることおよび抗ホスホチロシンウェスタンブロッティングを用いて共沈されるホスホチロシン化されたタンパク質の量を検出することによってモニタリングされ得る。例えば、化合物１２６、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＢＴ−４７４およびＳＫＢｒ３については、過剰発現したｐ１８５ｅｒｂＢ−２に対応するバンドを含むリン酸エステル化されたタンパク質を大量に示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＥＧＦＲの過剰発現に対応する１７０キロダルトンで、リン酸エステル化されたタンパク質を低いレベルで適度に示す。ｅｒｂＢ−２を発現するよう操作されたＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞は増殖阻害もまた示す。
【０１０６】
本発明の化合物は細胞分裂停止効果を発揮する。例えば、化合物１２６はｅｒｂＢ−２受容体過剰発現を介するＧｒｂ２活性を有するＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を阻害する。腫瘍増殖阻害はまた、化合物１２６を投与した無胸腺マウス中のＭＤＡ−４５３／Ｍ１乳癌異種移植片でもまた見られる。本発明の化合物は毒性を含まないか、または実質的に含まない。例えば、ヒト乳癌細胞株ＢＴ−４７４細胞を導入されたメスのヌードマウスにおいて、全身的な毒性は化合物１２６に関して観察されない。
【０１０７】
【実施例】
以下の実施例は本発明をさらに具体的に説明するが、勿論、いかなる場合でも発明の範囲を限定して解釈すべきではない。
【０１０８】
実施例１
本実施例は式Iの特定の化合物の製造方法および特徴づける方法を具体的に示す。合成手順は図１において図解で例示する。
【０１０９】
ｐ−トリル−マロン酸 ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２）
ＨＭＰＡ（３．５ｍｌ）を含む無水ジオキサン（５０ｍｌ）中の水素化ナトリウム（６０％，１．２ｇ，３０ｍｍｏｌ）懸濁液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルマロン酸（６．４８８ｇ，３０ｍｍｏｌ）およびｐ−ヨードトルエン（１）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。得られた溶液に臭化銅（Ｉ）（５．１６３ｇ，３６ｍｍｏｌ，１．２当量）を添加し、混合物を還流温度に加熱した。その後反応混合物を室温に冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液（３０ｍｌ）を添加して反応をクエンチし、生成物を酢酸エチル（５０ｍｌ×３）で抽出し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させ、得られた油状の残渣をクロマトグラフィーで精製して、ｐ−トリル−マロン酸 ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル５．０７２ｇ（収率５５．２％）を白色固体として得た。¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.275 (2H, d, J = 8.06 Hz), 7.161 (2H, d, J = 8.05 Hz), 4.397 (1H, s), 2.344 (3H, s), 1.471 (18H, s) ppm. FABMS (⁺Ve), m/z 307 [MH⁺], 251 [MH⁺ - C₄H₈], 195 [MH⁺ - 2C₄H₈]. Anal. calcd. for C₁₈H₂₆O₄: C, 70.6; H, 8.6. Found: C, 70.34; H, 8.62.
【０１１０】
（４−ブロモメチルフェニル）−マロン酸 ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３）
ｐ−トリル−マロン酸 ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５．６９５ｇ，１６．６ｍｍｏｌ）を８０ｍｌのＣＣｌ₄に溶解した。この溶液にＮ−ブロモスクシンイミド（３．３０９ｇ，１６．６ｍｍｏｌ，１当量）および過酸化ベンゾイル（２２０ｍｇ）を添加し、反応混合物をアルゴン下還流させた；反応混合物をその後室温に冷却し、形成された沈殿物を濾取しヘキサンで洗浄した。合わせた有機層を乾燥し、得られた残渣をクロマトグラフィーで精製して（４−ブロモメチルフェニル）−マロン酸 ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４．２５５９ｇ、収率５９．５％）を白色固体として得た。¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.379 (4H, s), 4.493 (2H, s), 4.435 (1H, s), 1.473 (18H, s) ppm. FABMS (⁺Ve), m/z 387 [MH⁺, ⁸¹Br], 385 [MH⁺, ⁷⁹Br], 331 [MH⁺ - C₄H₈, ⁸¹Br], 329 [MH⁺ - C₄H₈, ⁷⁹Br], 275 [MH⁺ - 2C₄H₈, ⁸¹Br], 273 [MH⁺ - 2C₄H₈, ⁷⁹Br]. Anal. calcd. for C₁₈H₂₅BrO₄: C, 56.1; H,6.5; Br, 20.7. Found: C, 55.52; H, 6.38; Br, 21.85.
【０１１１】
ベンジル （３Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３−［４−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル）フェニルメチル］−（−）−６−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリン−カルボキシレート（４）
アルゴン雰囲気下、−７８℃に冷却したベンジル （２Ｒ，３Ｓ）−（−）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリン−カルボキシレート（２．６８８ｇ，６．９４ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（６０ｍｌ）およびＨＭＰＡ（４．６ｍｌ）溶液に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（１．０Ｍヘキサン溶液，７．２９ｍｌ，７．２９ｍｍｏｌ，１．０５当量）を添加した。反応混合物を−７８℃で１時間撹拌した。２−（４−ブロモメチルフェニル）−マロン酸 ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．６７５５ｇ，６．９４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を、−７８℃でゆっくりとシリンジで添加し、混合物を最初−７８℃で２時間撹拌し、次いで温度を室温に上昇させ、混合物を一晩撹拌した。次いで混合物をＮＨ₄Ｃｌ水溶液（１０ｍｌ）でクエンチし、水（３５ｍｌ）で希釈した。混合物を酢酸エチルで繰り返し抽出し、合わせた有機抽出物を水、ＮＨ₄Ｃｌ水溶液およびブラインで連続して洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。濃縮およびシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル，６：１〜３：１）による精製により、ベンジル （３Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３−［４−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル）フェニルメチル］−（−）−６−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート（１．８８ｇ，収率３９．２％）を白色固体として得た。¹H NMR (CDCl₃) (二つの配座異性体が23℃で5:7の比で観察された) δ: 7.462〜7.354 (3H, m, 重なっている), 7.285〜7.046 (10 H, m, 重なっている), 6.914〜6.720 (4H, m, 重なっている), 6.546 (2H, m, 重なっている); 主要な配座異性体: 5.374 (1H, d, J = 2.69 Hz, -PhCHOOC-), 5.172〜5.045 (3H, m, 重なっている, -OOCCH-N, -PhCHN-, OCH₂Ph), 4.960 (1H, d, J = 13.19 Hz, OCH₂Ph), 4.655 [1H, s, (tBuOOC)₂CH-], 3.606〜3.518 (1H, dd, J = 8.06, 13.43 Hz, -CH₂-CHNCOO), 3.455〜3.358 (1H, m, -CH₂-CHNCOO), 1.420 (9H, s), 1.394 (9H, s) ppm; 少数の配座異性体: 5.708 (1H, d,
J = 2.20 Hz, -PhCHOOC-), 5.172〜5.045 (4H, m, 重なっている, -OOCCH-N, -PhCHN-, OCH₂Ph), 4.626 [1H, s, (tBuOOC)₂CH-], 3.606〜3.350 (2H, m, 重なっている, -CH₂-CHNCOO), 1.421 (9H, s), 1.397 (9H, s) ppm; FABMS (⁺ve), m/z 580.5 [MH⁺ -2 C₄H₈], 536.5 [MH⁺ - 2C₄H₈ - CO₂], 492.5 [MH⁺ - 2C₄H₈ - 2CO₂]. Anal. calcd. for C₄₂H₄₅NO₈: C, 72.9; H, 6.6; N, 2.0. Found: C, 72.62; H, 6.69; N, 1.85.
【０１１２】
４−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル）−Ｌ−フェニルアラニン（５）
ベンジル （３Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３−［４−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル）フェニルメチル］−（−）−６−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリンカルボキシレート（１．７８ｇ，２．５７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ−ＥｔＯＨ混合物（１：１，１５ｍｌ，ＡｃＯＨを２滴添加して反応を促進した）中に溶解させて高圧下（４５ｐｓｉ〜２０ｐｓｉまたは３１０ｋＰａ〜約１３８ｋＰａ）室温で（２４時間）パラジウム黒（２００ｍｇ）で水素化した。混合物を濾過して固体をＭｅＯＨで洗浄した。有機層を合わせて濃縮し、白色の粘着性固体を得た。固体をエーテルで徹底的に洗浄して１，２−ジフェニルエタンを除き、減圧下乾燥して４−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル）−Ｌ−フェニルアラニンを白色粉体（８４２ｍｇ，８６．３％）として得た。¹H NMR (DMSO) δ: 7.251 (4H, s), 4.590 (1H, s), 3.422〜3.316 (3H, m, OOCCH-N, -NH₂), 3.17〜3.01 (1H, m, -CH₂-CHNCOO), 2.943〜2.785 (1H, m, -CH₂-CHNCO),
1.416 (18H, S) ppm; FABMS (⁺Ve), m/z 268 [MH⁺ -2 C₄H₈]. Anal. calcd. for C₂₀H₂₉NO₆: C, 63.3; H, 7.7; N, 3.7. Found: C, 63.26; H, 7.82; N, 3.52.
【０１１３】
Ｎ−Ｆｍｏｃ−４−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル）−Ｌ−フェニルアラニン（６）
４−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル）−Ｌ−フェニルアラニン（８１８ｍｇ，２．１６ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（７２７ｍｇ，２．１６ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ₃（９０６ｍｇ，１０．８ｍｍｏｌ，５当量）の４８ｍｌのジオキサン−水（１：１）混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、０．２ＭＨＣｌ（１８０ｍｌ）で酸性にした。反応生成物を酢酸エチルで抽出し（３０ｍｌｘ３）、合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）そして濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＤＣｌ₃−ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）で精製してＮ−Ｆｍｏｃ−４−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル）−Ｌ−フェニルアラニンを白色固体として得た（６５０ｍｇ，５０．７％）。¹H NMR (DMSO) δ: 12.704 (1H, s, br), 7.786 (2H, d, J = 7.32 Hz), 7.760 (1H, d, J = 8.54 Hz), 7.658 (2H, t, J = 7.81 Hz), 7.435〜7.200 (4H, m), 7.254 (4H, s), 4.586 (1H, s), 4.274〜4.081 (4H, m), 3.111〜3.040 (1H, dd, J = 4.40, 13.67 Hz), 2.913〜2.815 (1H, dd, J = 10.75, 13.92 Hz), 1.390 (1H, s), 1.380 (1H, s). FABMS (⁺Ve), m/z 602 [MH⁺], 546 [MH⁺ - C₄H₈], 490 [MH⁺ -2 C₄H₈]. Anal. calcd. for C₂₀H₂₉NO₆: C, 66.90; H, 6.5; N, 2.3. Found: C, 69.40; H, 6.67; N, 2.24.
【０１１４】
実施例２
本実施例は式Ｘの実施態様の製造方法を具体的に示す。反応を図４〜１４に図示する。
【０１１５】
化合物８
化合物７（４５．５ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２ｍｌ）溶液にＮ−Ｆｍｏｃ−４−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル）−Ｌ−フェニルアラニン（６０．１ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ．Ｈ₂Ｏ（１３．５ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＣＤＩ（１５．６μｌ，０．１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２ｍｌ）中室温で（１０分）反応させることで形成される活性エステル溶液を添加した。次いで、反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を高減圧下で除去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃−ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ混合物）で精製して目的の生成物である化合物８を白色泡状体として得た（収率１００％）。¹H NMR (CDCl₃) δ: 8.01 (2H, m), 7.81〜7.71 (6H, m), 7.50〜6.95 (12H, m), 6.58 (1H, s), 5.56 (3H, m), 4.69 (1H, m), 4.55〜4.40 (1H, m), 4.40 (1H, s), 4.31 (2H, d, J = 6.84 Hz), 4.09 (1H, m), 3.34 (1H, m), 3.12〜2.88 (5 H, m), 2.63 (1H, dd, J = 4.4, 15.1 Hz), 2.05〜1.11 (12H, m), 1.46 (18H, s) ppm. FABMS (⁺Ve), m/z 1009 [MH⁺].
【０１１６】
化合物９
化合物８（０．０５ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（２ｍｌ）溶液にピペリジン（４０μｌ，０．４ｍｍｏｌ，８当量）を添加し、溶液を室温で３時間撹拌した。反応の終わりに、溶媒と過剰のピペリジンを高減圧下で除いた。得られた残渣を無水ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させた。得られた溶液にジイソプロピルエチルアミン（１３μｌ，０．０７５ｍｍｏｌ，１．５当量）を添加し、次いでｔｅｒｔ−ブチルオキサリルクロライド（９．５μｌ，０．０７５ｍｍｏｌ，１．５当量）を添加した。溶液を室温で一晩撹拌した。混合物を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃−ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ混合物）で精製して生成物２２．８ｍｇ（収率５０％）を白色泡状体として得た。¹H NMR (CDCl₃) δ: 8.02 (2H, m), 7.81〜7.21 (13H, m), 6.69 (1H, s),6.38 (1H, s), 4.67 (2H, m), 4.40 (1H, s), 3.43〜2.88 (7 H, m), 2.56 (1H, dd, J = 4.88, 14.89 Hz),
2.05〜0.94 (12H, m), 1.464 (18H, s), 1.457 (9H, s) ppm. FABMS (⁺Ve), m/z 914 [MH⁺], HR-FABMS calcd for C₅₀H₆₇N₅O₁₁ m/z 913.4837 (M+), 914.4915 (MH+), found 913.4837, 914.4915.
【０１１７】
化合物１０
化合物８（０．０５ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（２ｍｌ）溶液にピペリジン（４０μｌ，０．４ｍｍｏｌ，８当量）を添加して、溶液を室温で３時間撹拌した。反応の終わりに、溶媒および過剰のピペリジンを高減圧下で除いた。残渣を無水アセトニトリル（３．０ｍｌ）に溶解してＮ−アセチルイミダゾール（５５ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ，１０当量）で処理した。溶液を室温で一晩撹拌した。溶媒を除き、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃−ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ混合物）で精製して生成物（３８．９ｍｇ、収率９４％）を白色泡状体として得た。¹H NMR (CDCl₃) δ: 8.03 (2H, m), 7.81 (1H, m), 7.63 (3H, m), 7.46〜7.05 (9H, m), 6.65 (2H, m), 4.67 (2H, m), 4.40 (1H, s), 3.34 (2H, m), 3.12〜2.89 (5 H, m), 2.55 (1H, dd, J = 4.60, 15.1 Hz), 1.806 (3H, s), 2.04〜1.15 (12H, m), 1.46 (18H, s) ppm. FABMS (⁺Ve), m/z 828 [MH⁺], 772 [MH⁺ - C₄H₈], HR-FABMS calcd for C₄₆H₆₁N₅O₉ m/z 827.4469 (M+), 828.4548(MH+), found 827.4469, 828.4548.
【０１１８】
化合物１１
化合物１０（２２．３ｍｇ，０．０２４４ｍｍｏｌ）のＴＦＡ−Ｈ₂Ｏ−トリエチルシラン（１．８５ｍｌ−０．１ｍｌ−５０μｌ）溶液を室温で１時間撹拌し、次いで溶媒を高減圧下で蒸発させた。水（５ｍｌ）を添加して、混合物を再び蒸発させて残存しているＴＦＡを除いた。本手順を２回繰り返した。得られた粗生成物をＭｅＣＮ：Ｈ₂Ｏ（１：１，さらに０．１％ＴＦＡ６ｍｌを加えた）に溶解させて、濾過し、AdvantageＣ₁₈カラム（２５０ｍｍｘ２０ｍｍ径）を用いて流速：１０ｍｌ／分で線状勾配５％Ｂから１００％Ｂまで４０分以上かけてＨＰＬＣによって精製した；溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液；溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡ ＭｅＣＮ溶液。化合物１１（９．４ｍｇ，５２％）を白色固体として得た。¹H NMR (DMSO) δ: 8.82 (1H, s), 8.08 (1H, m), 8.00 (1H, d, J = 7.33 Hz), 7.89 (1H, m), 7.74 (1H, m), 7.53〜7.20 (10H, m), 6.92 (1H, s), 4.73 (1H, m), 4.60 (1H, s), 4.36 (1H, m), 3.25〜2.93 (6H, m), 2.69 (1H, dd, J = 6.75, 15.4 Hz), 2.52 (1H, m), 2.08〜1.12 (12H, m) ppm. FABMS (^-Ve), m/z 744 [M-H], 700 [M-H- CO₂], HR-FABMS calcd for C₃₈H₄₃N₅O₁₁ m/z 745.2959 (M), 744.2881(M-H), found 745.2959, 744.2881.
【０１１９】
化合物１２
１０（３８．４ｍｇ，０．０４７ｍｍｏｌ）のＴＦＡ−Ｈ₂Ｏ−トリエチルシラン（１．８５ｍｌ−０．１ｍｌ−５０μｌ）溶液を室温で１時間撹拌した。溶媒を高減圧下で蒸発させた。５ｍｌの水を添加して、混合物を再び蒸発させて残存しているＴＦＡを除いた。本手順を２回繰り返した。得られた粗生成物をＭｅＣＮ：Ｈ₂Ｏ（１：１，さらに０．１％ＴＦＡ１０ｍｌを加えた）に溶解させて、濾過し、AdvantageＣ₁₈カラム（２５０ｍｍｘ２０ｍｍ径）を用いて流速：１０ｍｌ／分で線状勾配５％Ｂから１００％Ｂまで４０分以上かけてＨＰＬＣによって精製した；溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液；溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡ ＭｅＣＮ溶液。化合物１２（２４．５ｍｇ，７３％）を白色固体として得た。¹H NMR (DMSO) δ: 8.25 (2H, m), 8.08 (1H, m), 7.99 (1H, m), 7.90 (1H, m), 7.74 (1H, m0, 7.51〜7.18 (10H, m), 6.90 (1H, s), 4.65 (1H, m), 4.60 (1H, s), 4.36 (1H, m), 3.35〜2.98 (5H, m), 2.82〜2.56 (3H, m), 1.78 (3H, s), 2.08〜1.12 (12H, m) ppm. FABMS (^-Ve), m/z 714 [M-H], 670 [M-H- CO₂], 626 [M-H- 2CO₂], HR-FABMS calcd for C₃₈H₄₅N₅O₉ m/z 715.3217 (M), 714.3139(M-H), found 745.2959, 744.2881.
【０１２０】
化合物１３
化合物７（６３．６ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２ｍｌ）溶液に、無水ＤＭＦ（２ｍｌ）中室温（１０分）でＮ−Ｆｍｏｃ−［３−アセトキシ−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−Ｌ−フェニルアラニン（７８．３ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ．Ｈ₂Ｏ（１８．９ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＣＤＩ（２１．８μｌ，０．１４ｍｍｏｌ）によって形成された活性エステル溶液を添加した。次いで、合わせた反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を高減圧下で除いて得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃−ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ混合物）で精製して化合物１３（１２３．７ｍｇ，収率９１．４％）を白色泡状体として得た。¹H NMR (CDCl₃) δ: 8.03 (2H, m), 7.82〜7.23 (17 H, m), 7.17 (1H, d, J = 7.81 Hz), 6.95 (2H, m), 6.79 (1H, s), 6.26 (1H, s), 4.69 (1H, m), 4.46〜4.34 (3H, m), 4.14 (1H, m), 3.42 (2H, s), 3.41〜3.32 (2H, m), 3.14〜2.94 (4H, m), 2.64〜2.45 (2H, m), 2.27 (3H, s), 2.06〜1.11 (12H, m) ppm, 1.42 (9H, s). FABMS (⁺Ve), m/z 966 [MH⁺], 949 [MH⁺-NH₃].
【０１２１】
化合物１４
化合物１３（６１．４ｍｇ，０．０６４ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（２．５ｍｌ）溶液にピペリジン（５０μｌ，０．５１ｍｍｏｌ，８当量）を添加し、溶液を室温で３時間撹拌した。溶媒および過剰のピペリジンを高減圧下で除いた。得られた残渣を無水ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させて、溶液にジイソプロピルエチルアミン（２２μｌ，０．１２６ｍｍｏｌ，２当量）を添加し、次いでｔｅｒｔ−ブチルオキサリルクロライド（１６μｌ，０．１２６ｍｍｏｌ，２当量）を添加した。溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃−ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ混合物）で精製して化合物１４を５１ｍｇ（収率９２％）白色泡状体として得た。¹H NMR (CDCl₃) δ: 8.04〜7.00 (12H, m), 6.79 (1H, s), 6.70 (1H, d, J = 1.22 Hz), 6.46 (2H, m), 4.80〜4.60 (2H, m), 3.53 (2H, s), 3.45〜2.76 (7H, m), 2.56 (1H, dd, J = 4.88, 15.13 Hz), 2.28 (3H, s), 2.18〜1.15 (12H, m), 1.50 (9H, s), 1.46 (9H, s). FABMS (⁺Ve), m/z 872 [MH⁺].
【０１２２】
化合物１５
化合物１３（６１．４ｍｇ，０．０６４ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（２．５ｍｌ）溶液にピペリジン（５０μｌ，０．５１ｍｍｏｌ，８当量）を添加し、溶液を室温で３時間撹拌した。溶媒および過剰のピペリジンを高減圧下で除いた。残渣を無水アセトニトリル（３．０ｍｌ）に溶解させてＮ−アセチルイミダゾール（６９．３ｍｇ，０．６３ｍｍｏｌ，１０当量）で処理した。溶液を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下３０℃で除き、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃−ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ混合物）で精製して生成物、化合物１５（４１ｍｇ、収率８２％）を白色泡状体として得た。¹H NMR (CDCl₃) δ: 8.033 (2H, m), 7.81 (1H, m), 7.68 (1H, m), 7.57〜7.33 (6H, m), 7.26〜6.95 (5H, m), 6.42 (1H, s),6.27 (1H, d, J = 7.3 Hz), 4.66 (2H, m), 3.42 (2H, s), 3.37〜3.31 (2H, m), 3.14〜2.87 (5H, m), 2.55 (1H, dd, J = 4.88, 15.13 Hz), 2.28 (3H, s), 1.83 (3H, s), 2.07〜1.12 (12H, m), 1.42 (9H, s). FABMS (⁺Ve), m/z 786 [MH⁺], 769 [MH⁺-NH₃].
【０１２３】
化合物１６
フェネチルアミン（１００μｌ，０．６ｍｍｏｌ，１０当量）を含む化合物１４（５１ｍｇ，０．０５８ｍｍｏｌ）のベンゼン（３ｍｌ）溶液を室温で２．５時間撹拌し、ベンゼンを蒸発させた。残渣をＴＦＡ−水−トリエチルシラン混合物（３．７ｍｌ：０．２ｍｌ：０．１ｍｌ）で１時間処理し、次いで室温で高減圧下で乾燥させた。水（５ｍｌ）を混合物に添加し、混合物を再び乾燥して残存しているＴＦＡを除いた。本手順を２回繰り返した。得られた粗生成物をＭｅＣＮ：Ｈ₂Ｏ（１：１、さらに０．１％ＴＦＡ１０ｍｌを加えた）に溶解させて、濾過し、AdvantageＣ₁₈カラム（２５０ｍｍｘ２０ｍｍ径）を用いて流速：１０ｍｌ／分でそして線状勾配５％Ｂから１００％Ｂまで４０分以上かけてＨＰＬＣによって精製した；溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液；溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡ ＭｅＣＮ溶液。化合物１６（１７．７ｍｇ，４２．５％）を白色固体として得た。¹H NMR (DMSO) δ: 9.33 (1H, s, -OH), 8.83 (1H, m), 8.46 (1H, d, J = 7.81 Hz), 8.32 (1H, s), 8.09 (1H, m), 7.92 (2H, m), 7.74 (1H, m), 7.57〜7.45 (6H, m), 7.28〜7.13 (5H, m), 6.96 (2H, m), 6.69 (1H, s), 6.59 (1H, dd, J = 7.82 Hz), 4.67 (1H, m), 4.40 (1H, m), 3.40 (2H, s), 3.31 (2H, q, J = 6.35 Hz), 3.20〜3.01 (5H, m), 2.87 (1H, dd, J = 10.50, 15.20Hz), 2.76〜2.68 (3H, m), 2.65〜2.33 (1H, dd, J = 6.34, 14.90 Hz), 1.96〜1.18 (12H, m). FABMS (^-Ve), m/z 819.5 [M-H], 775.4 [M- H-CO₂]. HR-FABMS calcd for C₃₇H₄₃N₅O₁₀ m/z 716.2932 (M-H).
【０１２４】
化合物１７
フェネチルアミン（１００μｌ，０．６ｍｍｏｌ，１０当量）を含む化合物１５（４１ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）のベンゼン（３ｍｌ）溶液を室温で２．５時間撹拌し、ベンゼンを蒸発させた。得られた残渣をＴＦＡ−水−トリエチルシラン混合物（３．７ｍｌ：０．２ｍｌ：０．１ｍｌ）で１時間処理し、次いで室温で高減圧下で乾燥させた。水（４ｍｌ）を混合物に添加し、そして混合物を再び乾燥して残存しているＴＦＡを除いた。この手順を２回繰り返した。得られた粗生成物をＭｅＣＮ：Ｈ₂Ｏ（１：１、さらに０．１％ＴＦＡ１０ｍｌを加えた）に溶解させて、濾過し、AdvantageＣ₁₈カラム（２５０ｍｍｘ２０ｍｍ径）を用いて流速：１０ｍｌ／分で線状勾配５％Ｂから１００％Ｂまで４０分以上かけてＨＰＬＣによって精製した；溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液；溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡ ＭｅＣＮ溶液。生成物１０６Ｃ−９６を白色固体として得た（２４．７．７ｍｇ，６９％）。¹H NMR (DMSO) δ:9.29 (1H, s, br, -OH), 8.20 (2H, m), 8.08 (1H, m), 7.96 (1H, d, J = 7.82 Hz), 7.90〜7.87 (1H, m), 7.74 (1H, m), 7.53〜7.33 (6H, m), 6.96 (1H, d, J = 7.81 Hz), 6.90 (1H, s), 6.70 (1H, s), 6.64 (1H, d, J = 7.81 Hz), 4.61 (1H, m), , 4.36 (1H, m), 3.41 (2H, s), 3.17 (2H, m), 3.07〜2.93 (3H, m), 2.75〜2.56 (3H, m), 1.78 (3H, s), 1.98〜1.14 (12H, m). FABMS (⁺Ve), m/z 710 [M+ Na⁺], 688 [MH⁺], 671 (MH⁺-NH₃). HR-FABMS calcd for C₃₇H₄₆N₅O₈ (MH⁺) m/z 688.3346.
【０１２５】
式Xの化合物(18〜20)を製造するさらなる実施例は図３に記載されている。
【０１２６】
実施例３
本実施例は式Iの化合物のいくつかの製造方法を例示する。含まれる反応は図１４で図示される。
【０１２７】
２−カルボキシメチル-5-メチル-安息香酸を発表された方法(J. Org. Chem., 4689 (1962))に従って調製した。
【０１２８】
２−Ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−５−メチル安息香酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２１）
０℃に保った２−カルボキシメチル−５−メチル−安息香酸（２．５４４ｇ，１３．１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（７０ｍｌ）懸濁液にｔｅｒｔ−ブチル２，２，２−トリクロロアセトイミデート（acetimidate）（１１．４７ｍｇ，５２．４ｍｍｏｌ，２当量）シクロヘキサン（８５ｍｌ）溶液を添加した。次いでＢＢｒ₃（０．５２ｍｌ）を添加し、反応混合物を室温に昇温して１６時間撹拌した。固体ＮａＨＣＯ₃を添加して反応をクエンチし、固形沈殿物を濾過してエーテルで洗浄した。合わせた洗浄有機層を蒸発乾固し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−５−メチル安息香酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル３．３４５ｇ（８３．３％）をオイルとして得た。¹H NMR (CDCl₃): 7.718 (1H, s), 7.227 (1H, d, J = 7.57 Hz), 3.910 (2H, s), 2.362 (3H, s), 1.584 (9H, s), 1.443 (9H, s). FABMS (⁺Ve), m/z 307 [MH⁺], 251 [MH⁺ - C₄H₈], 195 [MH⁺ - 2C₄H₈]. Anal. calcd. for C₁₈H₂₆O₄: C, 70.6; H, 8.6. Found: C, 70.82; H, 8.53.
【０１２９】
２−Ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−５−ブロモメチル安息香酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２２）
２−Ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−５−メチル安息香酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４．７５１，１５．５ｍｍｏｌ）をＣＣｌ₄（７５ｍｌ）に溶解させた。溶液にＮ−ブロモスクシンイミド（２．９０ｇ，１６．３ｍｍｏｌ，１．０５当量）および過酸化ベンゾイル（１８０ｍｇ）を添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下一晩還流させた；それから反応混合物を室温まで冷却し、固形沈殿物を濾過してヘキサンで洗浄し、合わせた有機層を蒸発させて残渣をクロマトグラフィーで精製して２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−５−ブロモメチル安息香酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル２．２８６ｇ（収率３８．３％）をオイルとして得た。¹H NMR (CDCl₃): 7.920 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.460 (1H, dd, J = 1.95, 7.81 Hz), 7.193 (1H, d, J = 7.81 Hz), 4.500 (2H, s), 3.953 (2H, s), 1.590 (9H, s), 1.444 (9H, s). FABMS (⁺Ve), m/z 387 [MH⁺, ⁸¹Br], 385 [MH⁺, ⁷⁹Br], 331 [MH⁺ - C₄H₈, ⁸¹Br], 329 [MH⁺ - C₄H₈, ⁷⁹Br], 275 [MH⁺ - 2C₄H₈, ⁸¹Br], 273 [MH⁺ - 2C₄H₈, ⁷⁹Br]. Anal. calcd. for C₁₈H₂₅BrO₄: C, 56.1; H, 6.5; Br, 20.7. Found: C, 56.27; H, 6.60; Br, 20.75.
【０１３０】
ベンジル （３Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３−｛［３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル）フェニル］−メチル｝−（−）−６−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリン−カルボキシレート（２３）．
アルゴン雰囲気下、−７８℃に冷却したベンジル （２Ｒ，３Ｓ）−（−）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリン−カルボキシレート（２．２９８ｇ，５．９３ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（５０ｍｌ）およびＨＭＰＡ（４．０ｍｌ）溶液に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（１．０Ｍヘキサン溶液，６．２３ｍｌ，６．２３ｍｍｏｌ，１．０５当量）を添加した。反応混合物を−７８℃で１時間撹拌した。２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−５−ブロモメチル安息香酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．２８６ｇ，５．９３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液を−７８℃でゆっくりとシリンジで添加し、混合物を−７８℃で２時間撹拌した。それから温度を室温に昇温し、一晩撹拌した。反応混合物をＮＨ₄Ｃｌ水溶液（１０ｍｌ）でクエンチして水（３５ｍｌ）で希釈した。混合物を酢酸エチル（５０ｍｌｘ３）で抽出し、合わせた有機層を水、ＮＨ₄Ｃｌ水溶液およびブラインで連続的に洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。濃縮およびシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、６：１〜３：１）による精製でベンジル （３Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３−｛［３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）フェニル］−メチル｝−（−）−６−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリン−カルボキシレート（２．８１８８ｇ，収率６８．７％）を白色泡状体で得た。¹H NMR (CDCl₃) (二つの配座異性体が23℃で2:5の比で観察された) δ: 7.834 (1H, d, J = 1.96 Hz), 7.417〜7.317 (2H, m, 重なっている), 7.230〜7.046 (10 H, m, 重なっている), 6.757〜6.589 (4H, m, 重なっている), 6.502 (1H, d, J = 7.3 Hz, 重なっている); 主要な配座異性体: 5.352 (1H, dd, J = 2.93, 6.59 Hz, -OOCCH-N), 5.113 (1H, d, J = 12.2 Hz, OCH₂Ph), 4.931 (1H,
d, J = 12.20 Hz, OCH₂Ph), 4.881 (1H, d, J = 2.93 Hz, COOCHPh-), 4.520 (1H, d, J = 2.93 Hz, PhCHN-), 4.037 (1H, d, J = 16.84 Hz, -CH₂COOtBu), 3.874 (1H, d, J = 17.09 Hz, NCH₂COOtBu), 3.743 (1H, dd, J = 6.84, 13.92 HZ), 3.440 (1H, dd, J = 2.93, 13.91 HZ), 1.523 (9H, s), 1.452 (9H, s少数の配座異性体: 7.747 (1H, s), 5.708 (1H, d, J = 2.20 Hz, -PhCHOOC-), 7.417〜7.317 (2H, m, 重なっている), 7.230〜7.046 (10 H, m, 重なっている), 6.757〜6.589 (4H, m, 重なっている), 6.502 (1H, d, J = 7.3 Hz, 重なっている), 5.248 (1H, dd, J = 3.66, 7.72 Hz, -OOCCH-N), 5.287 (1H, d, J = 11.97 Hz, OCH₂Ph ), 5.117 (1H, d, J = 12.5 Hz, OCH₂Ph ), 5.047 (1H, d, J = 2.93 Hz, COOCHPh-), 4.811 (1H, d, J = 2.93 hz, NCHPh-), 3.986 (1H, J = 16.60 Hz, -CH₂COOtBu), 3.896 (1h, d, J = 17.09 Hz, -CH₂COOtBu), 3.512 (1H, dd, J = 7.32, 13.91 Hz), 3.383 (1H, dd, J = 3.42, 13.91 Hz), 1.557 (9H, s), 1.542 (9H, s); FABMS (^-Ve) m/z 690 [M- H], 634 [M-H-C₄H₈]. Anal. calcd. for C₄₂H₄₅NO₈: C, 72.9; H, 6.6; N, 2.0. Found: C, 73.07; H, 6.70; N, 1.95.
【０１３１】
（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−Ｌ−フェニルアラニン（２４）
ベンジル （３Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３−｛［３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−メチル）フェニル］−メチル｝−（−）−６−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリン−カルボキシレート（２．７３８８ｇ，３．９６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ−ＥｔＯＨ混合物（２：１，２４ｍｌ）に溶解させてパラジウム黒（２５０ｍｇ）で高圧下（４５ｐｓｉ〜２０ｐｓｉまたは３１０ｋＰａ〜約１３８ｋＰａ）、室温で水素化した（２４時間）。反応の終わりに、パラジウム黒を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。合わせた有機層を濃縮して白色粘着性固体を得た。本粗生成物を徹底的にエーテルで洗浄して１，２−ジフェニルエタンを除き、減圧下乾燥して（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−Ｌ−フェニルアラニン（８５１ｍｇ，５６．６％）を白色粉体として得た。¹H NMR (DMSO) δ: 7.700 (1H, s), 7.376 (1H, d, J = 76.6 Hz), 7.206 (1H, d, J = 6.6 hz), 3.876 (2H, s), 3.45〜3.25 (2H, m), 3.154 (1H, dd, J = 4.15, 14.16 Hz), 2.851 (1H, dd, J = 7.56, 14.16 Hz), 1.514 (9H, s), 1.386 (9H, s) ppm; FABMS (⁺Ve) m/z 380 [MH⁺ ], 324 [MH⁺ -C₄H₈], 268 [MH⁺ -2C₄H₈]. Anal. calcd. for C₂₀H₂₉NO₆: C, 63.3; H, 7.7; N, 3.7. Found: C, 63.53; H, 7.72; N, 3.68.
【０１３２】
Ｎ−Ｆｍｏｃ−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−Ｌ−フェニルアラニン（２５）
（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−Ｌ−フェニルアラニン（８３０ｍｇ，２．２４ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（７５４ｍｇ，２．２４ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ₃（１．５ｍｇ，１７．９ｍｍｏｌ，８当量）のジオキサン−水（１：１、５０ｍｌ）混合物を室温で一晩撹拌し、反応混合物を０℃に冷却して０．２ＭＨＣｌ（１８０ｍｌ）で酸性にした。反応生成物を酢酸エチル（５０ｍｌｘ３）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄して、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＣＤＣｌ₃−ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）で精製してＮ−Ｆｍｏｃ−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−Ｌ−フェニルアラニン（１．０３２，７８．４％）を泡状体として得た。¹H NMR (DMSO): 12.729 (1H, s, br), 7.874 (2H, d, J = 7.57 Hz),7.804 (1H, d, J = 8.55 Hz), 7.754 (1H, s), 7.627 (2H, m), 7.450〜7.194 (6H, m), 4.30〜4.10 (4H, m), 3.861 (2H, s), 3.119 (1H, dd, J = ,4.39, 14.16 Hz), 2.910 (1H, dd, J = 11.48, 13.18 Hz), 1.489 (9H, s), 1.372 (9H, s). FABMS (⁺Ve), m/z 602 [MH⁺], 490 [MH⁺ -2 C₄H₈]. HR-FABMS calcd for C₂₀H₂₉NO₆: 601.2676.
【０１３３】
実施例４
本実施例は式Iの他の実施態様のいくつかの製造方法を例示する。含まれる反応は図１５で図示される。
【０１３４】
［４−メチル−２−（フェニルメトキシ）フェニル］酢酸を発表された方法(G. W. Rewcastle et al., J. Med. Chem., 32, 793-799 (1989))に従って調製した。
【０１３５】
［４−メチル−２−（フェニルメトキシ）フェニル］酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２６）
［４−メチル−２−（フェニルメトキシ）フェニル］酢酸（１０．２５ｇ，４０ｍｍｏｌ）のトルエン（７０ｍｌＤＭＦ２滴を含む）溶液にオキサリルクロライド（４．０ｍｌ，４６ｍｍｏｌ，１．１５当量）を滴下し、混合物を室温で５時間撹拌し、次いで４４ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノールを添加し、得られた溶液を室温で２０時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ−ヘキサン，１：４０〜１：２５）によって精製して所望の生成物［４−メチル−２−（フェニルメトキシ）−フェニル］酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１１．７０ｇ，収率９２．８％）をオイルとして得た。¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.521〜7.364 (5H, m), 7.147 (1H, d, J = 7.81 Hz), 6.810 (2H, m), 5.118 (2H, s), 3.629 (2H, S), 2.391 (3H, s), 1.461 (9H, s) ppm.
【０１３６】
（２−ヒドロキシ−４−メチルフェニル）酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２７）
［４−メチル−２−（フェニルメトキシ）フェニル］酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１０．６７ｇ，３４．２ｍｍｏｌ）のエタノール（１２５ｍｌ）溶液にパラジウム黒（２００ｍｇ）を添加し、混合物を３０℃で１０時間水素化した（水素風船を用いて）。出発物質が完全に消失した後（ＴＬＣによって検出される）、固体を濾過し、溶媒を蒸発させて（２−ヒドロキシ−４−メチルフェニル）酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステルの粗生成物（７．３２ｇ、９６％）を白色固体として得た。¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.931 (1H, s, br), 6.955 (1H, d, J = 7.56 Hz), 6.799 (1H, s), 6.688 (1H, d, J = 7.81 Hz), 3.551(2H, S), 2.299 (3H, s), 1.472 (9H, s) ppm.
【０１３７】
（２−アセトキシル−４−メチルフェニル）酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２８）
（２−ヒドロキシ−４−メチルフェニル）酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４．４５ｇ，２０ｍｍｏｌ）のピリジン（６．５ｍｌ）溶液に無水酢酸（acetyl anhydride）（５．１ｇ，５０ｍｍｏｌ）を室温で添加し、得られた溶液を室温で一晩撹拌した。ピリジンおよび残存している無水酢酸（acetyl anhydride）を３０℃で高減圧をかけて除いた。トルエン（２０ｍｌ）を残渣に添加し、トルエンを蒸発させて残存しているピリジンを除いた。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して生成物（２−アセトキシル−４−メチルフェニル）酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４，９５ｇ，９４％）をオイルとして得た。¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.175 (1H, d, J = 7.81 Hz), 7.008 (1H, d, J = 7.81 Hz), 6.904 (1H, s), 3.420 (2H, S), 2.341 (3H, s), 2.308 (3H, s), 1.430 (9H, s) ppm.
【０１３８】
（２−アセトキシル−４−ブロモメチルフェニル）酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２９）
２−（２−アセトキシル−４−メチルフェニル）酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４．９ｇ，１８．５ｍｍｏｌ）のＣＣｌ₄（５０ｍｌ）溶液にＮ−ブロモスクシンイミド（３．２９ｇ，１８．５ｍｍｏｌ，１当量）および過酸化ベンゾイル（１００ｍｇ）を添加し、反応混合物をアルゴン下３時間還流させた。次いで反応混合物を室温に冷却した。固体沈殿物を濾過し、ヘキサンで洗浄し、合わせた有機層を蒸発させ、得られた残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ，５０：１〜４０：１）で精製して（２−アセトキシル−４−ブロモメチルフェニル）酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．４６７ｇ、収率３８．８％）をオイルとして得た。¹H NMR (CDCl₃) δ: 7.290 (1H, d, J = 7.81 Hz), 7.230 (1H, dd, J = 1.71, 7.81 Hz), 7.158 (1H, d, J = 1.71 Hz), 4.467 (2H, s),
3.462 (2H, S), 2.320 (3H, s), 1.430 (9H, s) ppm. FABMS (⁺Ve), m/z 345 [MH⁺, ⁸¹Br], 343 [MH⁺, ⁷⁹Br], 389 [MH⁺ - C₄H₈, ⁸¹Br], 387 [MH⁺ - C₄H₈, ⁷⁹Br]. Anal. calcd. for C₁₅H₁₉BrO₄: C, 52.5; H, 5.6; Br, 23.3. Found: C, 52.30; H, 5.50; Br, 23.44.
【０１３９】
ベンジル （３Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３−｛［３−アセトキシル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）フェニル］−メチル｝−（−）−６−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリン−カルボキシレート（３０）
アルゴン雰囲気下、−７８℃に冷却したベンジル （２Ｒ，３Ｓ）−（−）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−４−モルホリン−カルボキシレート（２．４７ｇ，６．３９ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（４０ｍｌ）およびＨＭＰＡ（４．４ｍｌ）溶液に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（１．０Ｍヘキサン溶液，６．７０ｍｌ，６．７０ｍｍｏｌ，１．０５当量）を添加した。反応混合物を−７８℃で１時間撹拌した。（２−アセトキシル−４−ブロモメチルフェニル）酢酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．１９２ｇ，６．３９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液をシリンジにより−７８℃でゆっくりと添加し、反応を−７８℃で２時間進行させた。次いで温度を室温に昇温して、混合物を一晩撹拌した。反応混合物をＮＨ₄Ｃｌ水溶液（１０ｍｌ）でクエンチして３５ｍｌの水で希釈した。次いで混合物を酢酸エチルで抽出して（５０ｍｌｘ３）、合わせた有機層を水、ＮＨ₄Ｃｌ水溶液およびブラインで連続して洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。濃縮およびシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル，６：１〜３：１）による精製でベンジル （３Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３−｛［３−アセトキシル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）フェニル］−メチル｝−（−）−６−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリン−カルボキシレートを白色泡状体として得た（２．０７０ｇ，収率５０．０％）。¹H NMR (CDCl₃) (二つの配座異性体が23℃で2.7:1の比で観察された) δ: 7.396 (1H, m, 重なっている), 7.279〜6.959 (12H, m, 重なっている), 6.869〜6.696 (3H, m, 重なっている;主要な配座異性体: 6.50 (2H, d, J = 7.32 Hz), 5.317 (1H, dd, J = 2.68, 6.10 Hz, -CHNCOO), 5.030 (2H, s, OCH₂Ph), 4.999 (1H, d, J = 2.93 Hz, -PhCHOOC-), 4.315 (1H, d, J = 3.18 Hz, -PhCHN-), 3.777 (1H, dd, J = 5.86, 13.67 Hz, -CH₂-CHNCOO), 3.547〜3.30 (3H, m, 重なっている, tBuOOCCH₂-, -CH₂-CHNCOO), 2.313 (3H, s), 1.411 (9H, s) ppm;少数の配座異性体: 6.586 (2H, d, J = 7.08 Hz), 5.25 (1H, m, -CHNCOO), 5.134 (2H, s, OCH₂Ph), 5.063 (1H, d, J = 2.93 Hz, -PhCHOOC), 4.484 (1H, d, J = 2.69 Hz, PhCHN-), 3.597〜3.30 (4H, m, 重なっている, tBuOOCCH₂-, -CH₂-CHNCOO), 2.329 (3H, s), 1.590 (9H, s) ppm; FABMS (⁺Ve) m/z 594 [MH⁺ - C₄H₈], 550 [MH⁺ - C₄H₈ - CO₂]. Anal. calcd. for C₄₂H₄₅NO₈: C, 72.1; H, 6.1; N, 2.2. Found: C, 72.10; H, 6.15; N, 2.13.
【０１４０】
［３−アセトキシル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−Ｌ−フェニルアラニン（３１）
ベンジル （３Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３−｛［３−アセトキシル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）フェニル］−メチル｝−（−）−６−オキソ−５，６−ジフェニル−４−モルホリン−カルボキシレート（１．５０ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ−ＥｔＯＨ混合物（１：２，１８ｍｌ）に溶解させてパラジウム黒（２００ｍｇ）で高圧下（５０ｐｓｉ〜２０ｐｓまたは３４５ｋＰａ〜約１３８ｋＰａｉ）、室温で全ての出発物質が目的生成物に転換されるまで水素化した。混合物を濾過し、得られた固体をＭｅＯＨで洗浄した。合わせた有機層を濃縮して白色粘着性固体を得た。固体を徹底的にエーテルで洗浄して１，２−ジフェニルエタンを除き、減圧下乾燥して、３−アセトキシル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−Ｌ−フェニルアラニンを白色粉体として得た（８５７ｍｇ，１００％）。¹H NMR (DMSO) δ: 8.35 (1H, s, br), 7.274 (1H, d, J = 7.57 Hz), 7.122 (1H, d, J = 7.57 Hz), 7.049 (1H, s), 4.155 (1H, m), 3.448 (2H, s), 3.320 (2H, m), 3.093 (2H, d, J = 6.10 Hz), 2.263 (3H, s), 1.385 (9H, s) ppm; FABMS (^-Ve) m/z 336 [M-H]. Anal. calcd. for C₁₇H₂₃NO₆: C, 60.5; H, 6.9; N, 4.2. Found: C, 59.09; H, 6.83; N, 3.32.
【０１４１】
Ｎ−Ｆｍｏｃ−［３−アセトキシル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−Ｌ−フェニルアラニン（３２）
［３−アセトキシル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−Ｌ−フェニルアラニン（８５７ｍｇ，２．１６ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（７２７ｍｇ，２．１６ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ₃（９０６ｍｇ，１０．８ｍｍｏｌ，５当量）のジオキサン−水（１：１、４８ｍｌ）混合物を室温で一晩撹拌した；反応混合物をそれから０℃に冷却して０．２ＭＨＣｌ（１８０ｍｌ）で酸性にした。生成物を酢酸エチルで抽出し（３０ｍｌｘ３）、合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＤＣｌ₃−ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）で精製してＮ−Ｆｍｏｃ−［３−アセトキシル−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−Ｌ−フェニルアラニン（５１０ｍｇ，３９．５％）を白色固体として得た。¹H NMR (DMSO) δ: 12.70 (1H, s, br), 7.884 (2H, d, J = 7.33 Hz), 7.773 (2H, m), 7.433〜7.043 (8H, m), 4.365〜4.102 (4H, m), 3.405 (2H, s), 3.200 (2H, m), 2.925〜2.80 91H, m), 2.206 (3H, s), 1.356 (9H, s) ppm. FABMS (^-Ve) m/z 711.6 [M-H=NBA], 558.5 (M-H). HR-FABMS calcd for C₃₂H₃₂NO₆ [M-H] m/z 558.2128.
【０１４２】
実施例５
本実施例は式Ｘのさらなる実施態様の製造方法を例示する。含まれる反応は図１６で図示される。
【０１４３】
実施例６
本実施例は、Ｇｒｂ２ ＳＨ２ドメイン結合阻害剤としての式Ｘの化合物の生物学的活性を例示する。
【０１４４】
細胞株をAmerican Type Culture Collection(Rockville, MD)、Lombardi Cancer Center、Georgetown University Medical Centerから得た。細胞を常套的手法で改良最小必須培地(improved minimal essential medium IMEM, Biofluids, Rockville, MD)中１０％ウシ胎仔血清を用いて維持した。培養を加湿インキュベーター中３７℃および５％ＣＯ₂で維持した。
【０１４５】
(Biacore結合アッセイ)
ＳＨ２ドメイン結合阻害を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって決定した。ペプチド結合阻害の溶液ＩＣ₅₀値を、Yao et al., J. Med. Chem., 42, 25-35 (1999)中に記載されているのと同様にして測定した。化合物１１、１２および２０ａはそれぞれ１５５ｎＭ、５００ｎＭおよび１１７ｎＭのＩＣ₅₀平均値を有していた。
【０１４６】
（Ｇｒｂ２阻害剤による細胞増殖および増殖阻害アッセイ）
Ｇｒｂ２阻害剤のタンパク質合成への影響を二つの増殖アッセイによって決定した。第一のアッセイ（細胞増殖阻害アッセイ）は、殺細胞活性を直接的に測定するためにプラスチック上で実行した。得られた結果を図１７に示す。ｅｒｂＢ−２シグナルを増幅した細胞（例えばＭＤＡ−４５３細胞）を、試験された阻害剤での処理により阻害する。Ｇｒｂ２の活性化を利用しないかまたはＧｒｂ２の下流の活性化を有する細胞（例えばＭＤＡ−２３１（変異ｒａｓタンパク質を含む））は、試験されたＧｒｂ２阻害剤での処理により阻害されない。
【０１４７】
第二のアッセイ（９６−ウェルプレート中での細胞増殖のための可溶のテトラゾリウム／フォルマザン（ＸＴＴ）アッセイ）を実行した。細胞（２，０００−４，０００細胞／ウェル）をＩＭＥＭ培地中で１０％ＦＢＳを用いて増殖し、濃度を増加させたＧｒｂ２阻害剤（１−５０μＭ）で処理した。６−８日培養後、ＸＴＴ（１．０ｍｇ／ｍｌ、さらにＰＭＳを１．５３ｍｇ／ｍｌで加えた）をそれぞれのウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。４５０ｎｍでの吸収をDynatech Model MR700で測定した。得られた結果は、本発明の化合物が殺細胞活性を有することを示した。
【０１４８】
(ＭＡＰキナーゼの阻害)
ＭＡＰキナーゼは細胞増殖および分化の調節において重大な役割を果たすタンパク質キナーゼカスケードにおいて機能する。ＭＡＰキナーゼを、Ｇｒｂ２および他のシグナルタンパク質を介して増殖因子、サイトカインおよびホルモンを含む広範な種々のシグナルにより活性化した。ＭＡＰキナーゼ特異的抗体により増殖因子ヘレグリン（ＨＲＧ）で処理されたＭＤＡ−４５３細胞におけるＭＡＰキナーゼの阻害を測定した。１〜２ｘ１０⁶個の細胞を１００ｍｍディッシュに１０％ＦＢＳでプレーティングした。細胞を氷冷ＰＢＳで二度洗浄し、１ｍｌのリシスバッファ［Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（５０ｍＭ，ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ₂（５ｍＭ）、１％トリトンＸ−１００、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、ＥＧＴＡ（５ｍＭ）、ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、アプロチニン（approtinin）（５０μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（５０μｇ／ｍｌ）およびオルトバナジン酸ナトリウム（２ｍＭ）］中で溶解させた。タンパク質濃度をＢＣＡ法（Pierce、Rockford、IL)により決定した。タンパク質（５０μｇ）を８〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Novex、San Diego、CA）に曝し、ニトロセルロース膜に移した。ＭＡＰキナーゼの活性化を特異的な抗体、すなわちリン酸−ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ抗体（New England BioLabs）で検出し、ＥＣＬ（Amersham、Arlington Heights、IL）を用いて視覚化した。得られたブロッティングの結果は６０％以上の阻害が化合物１１で達成されたことを確認した。
【０１４９】
Ｇｒｂ２結合阻害をまた、ＥＬＩＳＡアッセイを実行することにより決定した。得られた結果を図１９に示す。化合物１１および１２はＧｒｂ２の結合を阻害するのに効果的であった。
【０１５０】
別のセットの実験において、Biacore結合アッセイをELISAアッセイと比較し、二つのアッセイの間に優れた一致が観察された。
【０１５１】
実施例７
本実施例は本発明の化合物の利点を例示する。化学療法薬と組み合わせて使用した場合、相乗効果が観察された。
【０１５２】
化合物１２６はＨＢＣ ＢＴ−４７４およびＭＤＡ−４５３細胞株のコロニー形成を阻害した。軟寒天コロニー形成を以下のように試験した。細胞懸濁液（１０，０００細胞／ｍｌ）を０．３３％アガロースと混合し、１％アガロースを含む層の表面にプレーティングした。次の日に、１ｍｌの培養培地と混合された、異なる濃度の阻害剤を層表面に添加して２週間インキュベートした。８０μｍより大きく形成されたコロニーの数を、Bausch and Lomb画像解析システムで数えた。組み合わせ療法において、化学療法薬を１ｍｌの培養培地と混合し、層表面に添加し、２週間インキュベートした。
【０１５３】
図２０は、化合物１２６を化学療法薬と組み合わせてＨＢＣ ＢＴ−４７４細胞株に使用した場合観察される相乗効果を表す。阻害剤と組み合わせてパクリタキセル（図中の“ＴＸＴ）、ドキソルビシン（“ＤＯＸ”）および５−フルオロウラシル（“５−Ｆｕ”）を用いた治療は、化学療法薬単独について観察されるよりも、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−過剰発現している癌細胞の優れた阻害を示した。
【０１５４】
本明細書で引用された関連文献は、ここに引用されることによってそれらの全てが組み込まれる。本発明はいくつかの実施態様を強調して記載されてきたが、その実施態様の変更を使用してもよいことおよび本発明を特に本明細書に記載されるのとは別のやり方で実施してもよいことが意図されていることは当業者にとって明らかだろう。従って、本発明は特許請求の範囲によって定義されるように、発明の趣旨および範囲内に含まれる全ての変更を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、化合物１−５を製造する経路を図示する。
【図２】 図２は、本発明の式Ｘの化合物のいくつかの実施態様を図示する。
【図３】 図３は、本発明の式Ｘの化合物のいくつかの別の実施態様、特に化合物１８−２０を図示する。
【図４】 図４は、化合物８を合成する反応スキームを図示する。
【図５】 図５は、化合物９を製造するための反応スキームを図示する。
【図６】 図６は、化合物１０を製造するための反応スキームを図示する。
【図７】 図７は、化合物１１を製造するための反応スキームを図示する。
【図８】 図８は、化合物１２を製造するための反応スキームを図示する。
【図９】 図９は、化合物１３を製造するための反応スキームを図示する。
【図１０】 図１０は、化合物１４を製造するための反応スキームを図示する。
【図１１】 図１１は、化合物１５を製造するための反応スキームを図示する。
【図１２】 図１２は、化合物１６を製造するための反応スキームを図示する。
【図１３】 図１３は、化合物１７を製造するための反応スキームを図示する。
【図１４】 図１４は、化合物２１−２５を製造するための反応スキームを図示する。
【図１５】 図１５は、化合物２６−３２を製造するための反応スキームを図示する。
【図１６】 図１６は、化合物３３−３８を製造するための反応スキームを図示する。
【図１７】 図１７ａ−ｃは、化合物１１、１２、３６および３８による、ヒトの乳癌細胞の成長および増殖の阻害を図示する。図１７ａは、ヒトの乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４５３の増殖阻害を図示する；図１７ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３の成長阻害を図示する；図１７ｃは乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２５３の成長の欠如を図示する。
【図１８】 図１８は、図１７で参照される化合物＃１２６およびＡの式を図示する。
【図１９】 図１９は、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を図示し、本発明の化合物がＧｒｂ２阻害効果を有することを示す。
【図２０】 図２０は、Ｇｒｂ２阻害剤（化合物＃１２６）を特定の化学療法薬とともに組み合わせた治療の相乗効果を図示する。

Claims (10)

1. 式：
   Ｗ−Ｙ−（ＡＡ）_ｎ−Ｚ
   ［式中、ｎは１〜１５であり；
   Ｙは、フェニル環、アミン末端およびカルボキシル末端を有するフェニルアラニル基（radical）であり、該フェニル環は、ジカルボキシアルキル、ジカルボキシハロアルキルおよびジカルボキシハロアルキルオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基を有し、該置換基のアルキル部分は、非置換であっても、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ、アミノアルキル、アルキル、アルコキシおよびケトからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；
   Ｗは、Ｙの窒素に結合する部分であり、アルキルカルボニル、オキサリル、アルキルアミノオキサリル、アリールアミノオキサリル、アリールアルキルアミノオキサリル、アルコキシオキサリル、カルボキシアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、ヘテロシクリルアルキルカルボニル、アリールアルキルヘテロシクリルアルキルカルボニル、アリールオキシカルボニルおよびアリールアルコキシカルボニルからなる群から選択され、Ｗのアリールおよびアルキル部分は、非置換であっても、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ、アミノアルキル、アルキル、アルコキシおよびケトからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；Ｗのヘテロシクリル部分は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される少なくとも４個のヘテロ原子を含み；
   ＡＡは、そのアミン末端がＹのカルボキシル末端に結合されるアミノ酸であり；および
   Ｚは、アリールアルキルアミノである］の化合物またはその塩。
2. ｎが１〜１５であり；
   Ｙが、フェニル環、アミン末端およびカルボキシル末端を有するフェニルアラニル基であり、該フェニル環は、ジカルボキシＣ_１−Ｃ_６アルキル、ジカルボキシハロＣ_１−Ｃ_６アルキルおよびジカルボキシハロＣ_１−Ｃ_６アルキルオキシからなる群から選択される１つ以上の置換基を有し、該置換基のアルキル部分は、非置換であっても、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ、アミノアルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシおよびケトからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；
   Ｗは、Ｙの窒素に結合する部分であり、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルカルボニル、オキサリル、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルアミノオキサリル、アリールアミノオキサリル、アリールＣ_１−Ｃ_６アルキルアミノオキサリル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシオキサリル、カルボキシＣ_１−Ｃ_６アルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、ヘテロシクリルＣ_１−Ｃ_６アルキルカルボニル、アリールＣ_１−Ｃ_６アルキルヘテロシクリルＣ_１−Ｃ_６アルキルカルボニル、アリールオキシカルボニルおよびアリールＣ_１−Ｃ_６アルコキシカルボニルからなる群から選択され、Ｗのアリールおよびアルキル部分は、非置換であっても、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシル、アミノ、アミノＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシおよびケトからなる群から選択される置換基で置換されていてもよく；およびＷのヘテロシクリル部分は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される少なくとも４個のヘテロ原子を含み；
   ＡＡは、そのアミン末端がＹのカルボキシル末端に結合されるアミノ酸であり；および
   Ｚは、アリールＣ_１−Ｃ_６アルキルアミノである、請求項１に記載の化合物またはその塩。
3. Ｙが、式ＸＩ：
   

   

   ［式中、
   Ｄは、式ＸＩＩＩ：
   

   

   （式中、Ｒ_３およびＲ_４は、同一であっても異なっていてもよく、水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アリール、アリールＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルカリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され；およびＲ _５ は、水素、ハロ、ヒドロキシ、アミノおよびＣ_１−Ｃ_６アルコキシからなる群から選択される）を有し；
   Ｅは、水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルカルボニル、カルボキシルおよびＣ_１−Ｃ_６アルキルカルボニルＣ_１−Ｃ_６アルキルからなる群から選択される］を有する請求項２に記載の化合物またはその塩。
4. ＺがアリールＣ _１ −Ｃ _６ アルキルアミノである請求項１に記載の化合物またはその塩。
5. Ｚのアリール部分が式：
   

   

   （式中、Ｑ _１ は、水素、またはヒドロキシル、ハロ、Ｃ _１ −Ｃ _６ アルキル、Ｃ _１ −Ｃ _６ アルコキシ、アミノおよびＣ _１ −Ｃ _６ アシルアミノからなる群から選択される置換基である）を有する請求項４に記載の化合物またはその塩。
6. ＡＡで表されるアミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、メチオニン、システイン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、プロリン、トランス−３−ヒドロキシプロリンおよびトランス−４−ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、チロシン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロへキシルグリシン、トリプトファン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リシン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロへプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸およびα，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニンおよびα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンからなる群から選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物またはその塩。
7. 化合物が、式：
   

   

   または、
   

   

   である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物またはその塩。
8. 医薬的に許容し得る担体および請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物またはその塩を含む医薬組成物。
9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物またはその塩を含有する薬剤であって、ＳＨ２ドメインとホスホプロテインとの結合を阻害するための薬剤。
10. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物またはその塩を含有する薬剤であって、癌を治療するため、または化学療法を包含する癌治療の化学療法効果を向上させるための薬剤。

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