CN101117423A - 热敏性共混物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了热敏性共混物，并披露了由热敏性共混物构成并用于固定细胞或组织的制品、基质和试剂盒、以及它们的使用方法。

Description

热敏性共混物及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求享受于2006年6月12所提交的题为“热敏性共混物及其应用”的第06300583.9号欧洲专利申请的权利，并采取引用的方式将其结合在本申请中。
背景技术
细胞生长的体内增殖和分化能力具有大量的应用。体内细胞生长发生在胞外基质中(ECM)，其是一个三维环境。例如，诸如培养皿表面之类的二维表面不能代表细胞在体内的生长情况。三维环境的一个功能是通过细胞基质和细胞与细胞之间的联系来方便地感知环境并对环境作出反应从而引导诸如迁移、增殖、异化、表型的维持以及凋亡。因此，期望把具有适当的多孔、大表面积以及孔与孔之间具有良好连接的材料用于细胞培养。尤其是为了实现与体内细胞生长具有可比性的有效的细胞培养，希望该材料可以允许细胞透过整个材料。
细胞培养一般通过在生物介质的存在情况下将细胞种植在培养基上来实现。在附着和增殖之后，培养好的细胞一般可以采用侵入性的方法来采集，例如机械刮擦法、超声法、化学或酶处理法，及其它们的组合方法。机械刮擦法会损伤细胞，并且在诸如小直径孔、多层或其它3维基质等受限制的空间中不方便使用。化学(例如EDTA)或生物(例如胰蛋白酶)处理法会伤害细胞并存在引入杂质的风险。例如，众所周知，胰蛋白酶会损害细胞功能。更甚地，采用这些方法来收获一些附着比较牢固的细胞是困难的，而且需要经历长时间、损害性的暴露。
因此，需要一种可以容易地、非侵入性并且有效地从培养基中采集活细胞的方法。由于其可以使操作、添加剂以及污染达到最小化，并允许完好无损地采集细胞以及有效地回收细胞及其产物，尤其是膜结合产物，非侵入性、非破坏性的采集细胞培养物的替换方法将会一个明显的进步。本文所描述的是便于细胞和组织固定及其随后生长的基质。此外，本申请所描述的基质可以方便地释放和分离培养在其中的细胞和组织。
发明内容
根据所公开的材料、化合物、组合物、制品、装置和方法的目的，本申请例举并主要描述了热敏性共混物(thermo-responsive blend)。本申请也对由该热敏性共混物组成并用于固定细胞或组织的基质、制品和试剂盒以及它们的使用方法作了描述。其它优点的一部分在以下说明书中描述，一部分从所述说明书将显而易见，或者可以从下述各个方面的实施中学习得到。以下所述的优点可以通过所附权利要求书中特别指出的要素和组合实现并获得。应当理解，前述一般性描述和下列具体描述仅仅是例举的和解释性的，而非限制性的。
附图说明
附图结合在说明书中并构成了说明书的一部分，其阐述了下述几个方面。
图1显示了45℃和20℃下聚苯乙烯/聚(N-异丙基丙烯酰胺)的共混物的水接触角，其中聚(N-异丙基丙烯酰胺)占共混物的0-25wt％。
图2显示了采用经溶液处理制成细胞培养基质的共混物，通过在2小时内将温度连续降低至4℃并在胰蛋白酶中暴露10分钟的CHO细胞的数量。
图3显示了采用经挤压/热压制成细胞培养基质的共混物，通过在2小时内将温度连续降低至4℃并在胰蛋白酶中暴露10分钟的CHO细胞的数量。
图4显示了在两个不同温度下，通过蒸发苯甲醚中的溶液而制备得到的由PS+PPO-PEO-PS共混物所构成的厚膜的水接触角。
图5显示了在两个不同温度下，通过挤压或热压所制备的由PS+PPO-PEO-PS共混物所构成的盘的水接触角。
图6为SEM图(放大500倍)，其显示了由5wt％的聚(N-异丙基丙烯酰胺)和95wt％PMMA所形成的纤维状材料的形态。
图7为SEM图(放大800倍)，其显示了用5wt％的聚N-异丙基丙烯酰胺)与95wt％PMMA所形成的纤维状材料的形态。
具体实施方式
通过参考以下对所披露主题的特定方面以及所包括实施例的具体描述并参考附图，可以更容易地理解本文所述的材料、化合物、组合物、制品，装置以及方法。
在本材料、化合物、组合物、制品，装置以及方法被披露和描述之前，应当理解下述各方面不限于特定的合成方法或特定的试剂，而是可以变化的。也应当理解本文所用的术语仅仅是出于描述特定方面的目的，并不是有意作任何限制。同样的，在整个说明书中参考了各公开出版物。因而这些出版物所公开的全部内容都采用参考的方式结合在本文中，以便更充分地描述与所披露主题相关的现有技术。对于引用文献所包含的、在提及所述引用的句子中的材料，所公开的引用文献单独并特别地通过引用的方式结合至本文。
说明书和权利要求书全文中，“包含(comprise)”以及该词的其它形式，例如“comprising”和“comprises”都是指包括但不限于，并不意味着排除例如其它添加剂、组分、整数或者步骤。
说明书和所附权利要求中所采用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非文中有明确的其它指示。因而，例如提及“组合物”则包括两种或更多所述组合物，提及“试剂”则包括两种或更多所述试剂的混合物，涉及“该层”则包括两层或更多所述层，等等。“可选的”或“可选地”的意思是接下来所描述的事例或环境可能发生或者也可能不发生，并且说明书包括事例或环境发生的例子以及它们不发生的例子。
本文所公开的特定的材料、化合物、组合物以及组分可商业获得或者易于采用本领域所公知的方法合成。例如，用于制备所公开的化合物以及组合物的原料和试剂也可以从商品供应商那里买到，或者可以通过本领域公知的方法制备。
同样的，本文公开的材料、化合物、组合物以及组分可以用于、可以结合用于、可以用于制备所公开的方法和组合物，或者是所公开的方法和组合物的产物。这些材料以及其它材料在本文中被公开了，并且可以理解当这些材料的组合、子集、相互作用、集合等等被公开之时，并没有明确地公开特定地引用这些化合物的每个不同的单独和集体组合和排列，其中每个均被特殊地考虑并描述。例如，如果公开了一种组合物，并讨论了可以对该组合物的组分数量进行大量修改，则对每个可能的组合和排列都进行了特殊的考虑，除非有相反的特定指示。这样，如果公开了一类组分A、B及C，并公开了一类D、E和F以及A-D组合的例子，那么即便它们不是每个都各自被描述，其也被单独和集合地考虑了。这样，在这个例子中，A-E、A-F、B-D、B-E、C-D、C-E和C-F中的每个组合都被特殊地考虑，并应当根据A、B和C；D、E和F；以及A-D的组合例子的公开被认为公开的。同样的，它们的任何子集或组合也被特定地预计到并被公开。这样，例如，A-E、B-F和C-E的小组被特定地考虑，并且应该根据A、B和C；D、E和F；以及A-D组合例子的公开被认为公开。本概念适用于本文所公开的所有方面的内容，包括但不仅限于制备或使用所公开的组合物的方法的步骤。这样，如果有多种可以实施的额外步骤，可以理解这些额外步骤各自都可用所公开方法的任何特定方面的内容或各方面的组合内容来实现，并且可以理解每种这些组合被特定地预计到并应当认为是公开了。
现在详细参考所公开的材料、化合物、组合物、制品以及方法的特定方面，在本文实施例和附图中阐述它们的例子。
1.热敏性共混物
此处所述的热敏共混物包括至少一种热敏聚合物和至少一种非热敏/非水溶性聚合物。根据下列具体描述，热敏性共混物的性质对温度变化敏感，其可被用于释放固定在包括该混合物的基质上的细胞或组织。共混物的每种组分都在下面作了描述。
a.热敏性聚合物
此处所述的共混物包括至少一种热敏性聚合物。术语“热敏性聚合物”在此处被定义为具有处于0℃-85℃之间的低临界溶解温度或高临界溶解温度。临界溶解温度的含义在下面定义。当一定的材料与水混合时，由于溶解性差，混合物在特定的温度下被分成两相，但是如果对其进行加热或冷却超过一定的温度，最终该材料完全溶于水中而转化为均匀溶液。该一定的温度被定义为“临界溶解温度”。如果当被加热时形成均匀溶液，该临界溶解温度被称为“高临界溶解温度”。如果当被冷却时形成均匀溶液，它被称为“低临界溶解温度”。
一方面，美国专利5284766中公开了一种热敏性聚合物，其通过引用的方式被结合在本文中。一方面，该热敏性聚合物包括以下的均聚物或共聚物：(甲基)丙烯酰胺、N取代的丙烯酰胺、N，N-双取代的(甲基)丙烯酰胺、N取代的(甲基)丙烯酰胺、N，N-双取代的(甲基)丙烯酰胺、乙烯基醚、烷基乙烯基醚、N-乙烯基己内酰胺，或者它们的组合物。另一方面，热敏性聚合物包括下列物质组成的均聚物或共聚物：丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，N-乙基丙烯酰胺，N-正丙基丙烯酰胺，N-正丙基甲烯酰胺，N-异丙基丙烯酰胺，N-异丙基甲基丙烯酰胺，N-环丙基丙烯酰胺，N-环丙基甲基丙烯酰胺，N-乙氧基乙基丙烯酰胺，N-乙氧基甲基丙烯酰胺，N-四氢化糠基丙烯酰胺，N-四氢化糠基甲基丙烯酰胺，N，N-二甲基(甲基)丙烯酰胺，N，N-乙基甲基丙烯酰胺，N，N-二乙基丙烯酰胺，1-(1-氧代-2-丙烯基)-吡咯烷，1-(1-氧代-2-丙烯基)-哌啶，4-(1-氧代-2-丙烯基)-吗啉，1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吡咯烷，1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-哌啶，4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吗啉，甲基乙烯基醚，以及它们的组合物。可以采用上述单体或其它单体的共聚物、接枝聚合物或共聚物或这些聚合物的混合物以便根据细胞类型调整临界溶解温度从而加强基质和细胞/组织之间的相互作用，或者控制基质材料的亲水或疏水性质。热敏性聚合物之间相互交联也是可能的。
一方面，热敏性聚合物包括N-异丙基丙烯酰胺的均聚物。在另一方面，热敏性聚合物包括聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷的嵌段共聚物、或者纤维素醚的衍生物。
一方面，热敏性聚合物包括至少一种疏水单元。该疏水单元可以是任何相对于没有疏水单元的热敏性聚合物而言其可以增加疏水能力性的基团或其一部分。当热敏性聚合物随后与非热敏性/非水溶性聚合物混合时，该疏水单元也可以增加该热敏性聚合物的亲和性。热敏性聚合物的疏水单元的性质可以与来自非热敏性/非水溶性的聚合物中的一种相同。术语“亲和性”是指当热敏性聚合物与非热敏性/非水溶性聚合物相互混合时，这两种组分之间的亲和力。期望生产出热敏性聚合物与非热敏性聚合物/非水溶性聚合物的均匀混合物以避免形成非均质基质。热敏性聚合物中包含疏水单元增加了热敏性聚合物的疏水性，其反过来增加了与同样是疏水的非热敏性聚合物/非水溶性聚合物产生均匀混合物的几率。该均匀混合物的产生还具有相当稳定的优点，并且在用溶剂例如水抽提的方法将细胞/组织从基质上移除时不会被溶解掉。
存在于热敏性聚合物中的疏水单元的性质和数量可以根据非热敏性/非水溶性聚合物的选择和整个混合物所期望的疏水性而改变，其可以影响所附细胞或组织的释放模式。该疏水单元与被用于生产非热敏性/非水溶性聚合物的单元可以相同，也可以不同。一方面，疏水单元可以从H2C＝CHR中衍生而来，其中R包括烷基、芳基、烷氧基、酰胺基或酯基。
此处所用的术语“烷基”是具有1-24个碳原子的支链或直链饱和碳氢基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、癸烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等等。“低级烷基”基团是指包括1-6个碳原子的烷基。此处所用的术语“芳基”是指任何基于碳原子的芳香基团，其包括但不限于苯、萘等等。术语“芳基”也包括“杂芳基”，其定义是在芳香环上结合至少一个杂原子的芳香基团。杂原子的例子包括，但不限于氮、氧、硫、以及磷。该芳基可以是被取代的或没有被取代的。该芳基可以被一个或多个包括但不限于烷基、炔基、烯基、芳基、卤素、硝基、氨基、酯基、酮基、醛基、羟基、羧酸基或烷氧基等基团所取代。术语烷氧基、酯基以及酰胺各自可以用-OR、-C(O)OR、以及-C(O)NRR’来表示，其中R和R’可以是上述烷基或芳基。一方面，疏水单元可以衍生至苯乙烯。
热敏性聚合物可以是包括疏水单元的共聚物、接枝聚合物、或嵌段共聚物。一方面，热敏性聚合物包括(1)N-异丙基丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷，或者聚环氧乙烷-聚环氧丙烷的嵌段共聚物及其组合和(2)苯乙烯的共聚物。在另一方面，热敏性聚合物包括聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)-聚苯乙烯的嵌段共聚物，聚(环氧丙烷)-聚苯乙烯嵌段共聚物，或者是聚(N-异丙基丙烯酰胺)-聚苯乙烯嵌段共聚物。
存在于热敏性聚合物中的疏水单元的量可以是不同的。当热敏性聚合物包括疏水单元时，该热敏性聚合物可以通过已知技术来制备，其包括但不限于原子转移自由基聚合(atom transfer radical polymerization)(ATRP)、可逆性添加链段转移聚合(reversible addition-fragmentation transfer polymerization)(RAFT)，硝酰基介导聚合(nitroxy mediated polymerization)(NMP)、阴离子聚合或通过反应性挤出的方法。
b.非热敏性/非水溶性聚合物
此处所述的共混物也包括了非热敏性/非水溶性聚合物。非热敏性/非水溶性聚合物为非上述所限定的热敏性聚合物的聚合物，其名义上不溶于水。
如下所述，非热敏性/非水溶性聚合物促进细胞粘附。这是因为这样一个事实，即非热敏性/非水溶性物质通常是疏水的，并且细胞一般都会附着在疏水表面。一方面，非热敏性/非水溶性聚合物包括聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚己酸内酯、聚氨酯、聚酰亚胺、聚酰胺-酰亚胺、聚丙交酯-共-乙交酯、聚烯烃、聚环烯烃、聚砜、聚(甲基)丙烯酸酯聚合物、聚乙烯基聚合物、以及它们的组合物。一方面，非热敏性/非水溶性聚合物是透明的。
c.共混物的制备
此处所述共混物可以通过已有技术来制备。一方面，共混物可以通过高温组合法来制备。热敏性和非热敏性/非水溶性聚合物在高温下混合以便共混物可以通过挤出而获得。例如，聚-N-异丙基丙烯酰胺(热敏性聚合物)能在270℃以上保持稳定，与聚苯乙烯的热稳定性(280℃)(非热敏性/非水溶性聚合物)相比具有优势。如下所述，共混物可以通过现有的注模机器模制形成具有一定形状的产品。被用于制备共混物的热敏性聚合物和非热敏性聚合物/非水溶性聚合物的数量将依赖于所选择的聚合物和所期望的细胞释放模式而改变。通过改变每种聚合物的量，可以增加或减少细胞粘附，以及通过改变温度对细胞释放进行微调。一方面，该共混物包含1-99重量％的热敏性聚合物、1-50重量％的热敏性聚合物、或者1-25重量％的热敏性聚合物。
II.用于细胞/组织固定的基质
此处所论述的是用所述共混物固定细胞或组织的基质。就细胞或组织的固定，具有大量的应用。以下将对这些应用进行描述。
一方面，此处所述的固定细胞或组织的基质包括：
纳米纤维网络，其中纳米纤维网络包括一种或多种所述的热敏性共混物；以及
包含第一外表面的基底，其中纳米纤维网络邻近基底的所述第一外表面。
另一方面，所述用于固定细胞或组织的基质包括：
纳米网络；以及
包括第一外表面的基底，其中纳米纤维网络邻近基底的所述第一外表面，并且其中基底包括一种或多种所述的热敏性共混物。
下面对基质的每种组分进行描述。
a.纳米纤维网络
所采用的术语“纳米纤维”意指一种包含直径约为1000纳米或更小的聚合物细纤维。所采用的术语“网络”意指纳米纤维的随意或定向空间分布，通过控制空间分布纤维之间形成相互联结的网，其中纤维间的间隔被选择以改善生长和培养的稳定性。该网络的纤维之间具有较小的空间，包括在其中形成有孔或通道的网络。孔或通道的尺寸可以依赖于所固定的细胞或组织而不同。一方面，纳米纤维网络的孔径大于0.2微米。另一方面，孔径小于1微米。在再一方面，孔径为0.2微米-300微米，该网络可以包括单层纳米纤维，单层连续纳米纤维，多层纳米纤维，多层连续纳米纤维，或垫。该网络可以是无纺的或网状的。该网络的物理性质包括但不限于质地、皱褶、粘着力、孔隙度、密实性、弹性、几何形状、交联度、比表面积、纤维直径、纤维溶解性/非溶解性、亲水性/疏水性、小纤维密度、以及纤维取向。
在特定方面，纳米纤维网络包括至少一种所述的热敏性共混物。它也可能具有两层或更多层不同的纳米纤维网络。不同的层可由所述不同的热敏性共混物构成，或者作为替换，一层或多层可由所述共混物以外的聚合物组成。例如，纳米纤维可以来自天然或合成纤维。天然纤维的例子包括但不限于蛋白、多聚糖、纤维素衍生物或者它们的混合物。合成纤维的例子包括但不限于聚酯、聚酰胺或它们的混合物。
其它方面，可以用于生产不含本文所述共混物的纳米纤维网络的聚合物材料包括加聚物以及缩合聚合物材料，例如聚烯烃、环状聚烯烃、聚缩醛、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、纤维素醚和酯、聚硫醚、聚亚芳基氧、聚环氧烷、环氧烷烃的共聚物和嵌段共聚物、聚乙烯基咔唑、聚砜、改性的聚砜聚合物以及它们的混合物。落入这些种类的优选材料包括聚乙烯、聚(6-己内酯)、聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-共-聚乙交酯、聚丙烯、聚硅氧烷、聚氯乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚醋酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸甲酯(以及其它(甲基)丙烯酸树脂)、聚(甲基)丙烯酰胺、聚苯乙烯、以及它们的共聚物(包括ABA型嵌段共聚物)、聚偏氟乙烯、聚偏氯乙烯、具有各种水解度(87％-99.5％)的交联和非交联形式的聚乙烯醇。
在特定方面，当基底包括一种或多种所述的热敏性共混物时，纳米纤维网络可以包含或不包含所述的热敏性共混物。在纳米纤维网络不包含所述热敏性共混物的情况下，纳米纤维可由上述任何聚合物所组成。
纳米纤维可采用已有技术来制造。聚合物的选择和/或纳米纤维的制造和/或将其引导至或定位于基质上的方法允许对纳米纤维网络的物理性质进行选择和控制。在构建细胞的细胞骨架网络和胞外基质蛋白的细胞信号基序的暴露，纳米纤维网络的物理性质是重要的考虑因素，所述物理性质包括纤维尺寸、纤维直径、纤维间距、基质密度、纤维质地以及弹性。可以被设计成期望参数的纳米纤维网络物理性质包括但不限于质地、皱褶、粘着力、孔隙度、密实性、弹性、几何形状、交联度、比表面积、纤维大小、纤维直径、纤维溶解性/非溶解性、亲水性/疏水性、小纤维密度。
可以改变和/或修饰纳米纤维网络的一种或多种物理性质，以便为固定细胞/组织而形成特定的环境。例如，纳米纤维网络的孔隙度可以被操纵以加强离子、代谢物和/或生物活性分子的扩散，和/或允许细胞穿入和透过纳米纤维网络以便在可以增加细胞和纳米纤维网络之间多点接触的环境中生长。纳米纤维网络相互之间的交联度可以被设计成便于细胞与细胞之间的接触。纳米纤维网络的弹性可以通过向制备纳米纤维的聚合物溶液中加入生物活性分子的方法来加以提升或降低。生产中空的或具有带鞘核心的纳米纤维也是可能的。
纳米纤维网络的质地和皱褶可以被操纵以便增加细胞的粘附。例如，可以选择均一或非均质纳米纤维来优化细胞的生长或分化活力。一方面，纳米纤维网络包括多种具有不同直径的纳米纤维和/或用不同聚合物制备的多种纳米纤维。其它方面，可以设计纳米纤维网络中纳米纤维的溶解性或不溶性以便控制可结合入纳米纤维网络中的生物活性分子的释放。例如，生物活性分子的释放速率由纳米纤维网络的纳米纤维的生物降解或生物溶解速率决定。其它方面，可以设计纳米纤维网络的亲水性或疏水性以便增加特定细胞间距。
一方面，纳米纤维网络可采用诸如电晕充电和摩擦起电等充电技术来制造。另一方面，可以采用电纺技术来制备纳米纤维。电纺工艺采用电场来控制聚合物的形成以及沉积。聚合物溶液通过电势而注入。该电势形成电荷平衡，所述电势平衡使得聚合物溶液流从诸如注射器等发射器的端部射出。电场中的聚合物喷射流被引导至接地的基底上，此时溶剂被蒸发并形成纤维。所获得的单一连续细丝以无纺织物的形式聚集在基底上。纳米纤维网络可被生产成具有随机或导向性定位。随机纤维可以组装到分层的表面中。一方面，纳米纤维包括可键合形成互锁网络的细纤维的随机分布。纳米纤维互锁网络中纤维之间具有相对小的间隔。这种间隔在纳米纤维网络中形成孔或通道以便离子、代谢物、蛋白和/或生物活性分子的扩散，以及细胞穿入并透过网络并且在促进细胞和纳米纤维网络之间多点附着的环境中生长。
其它方面，纳米纤维网络可以以定向的方式电纺。这种定向电纺允许制造包括单层纳米纤维或由连续纳米纤维所形成的单层的纳米纤维网络，其中该网络的高度为单个纳米纤维的直径。可以通过在电纺过程中控制纳米纤维在基质上的方向和/或定位来选择物理性质，所述物理性质包括孔隙度、密实性、小纤维密度、质地、皱褶以及单层网络纤维定位。优选地，孔的尺寸允许细胞透过和/迁移通过单层或多层纳米纤维网络。
各个单层纳米纤维网络的分层可以形成通道，其允许离子、代谢物、蛋白和或生物活性分子扩散，以及允许细胞透过网络并且在促进细胞和纳米纤维网络之间多点附着的环境中生长。
纳米纤维网络的形态和物理性质是可以变化的，其依赖于，聚合物的选择、聚合物链的构造以及所使用的溶剂。一方面，可以运用相分离技术来制造纳米纤维网络。该相分离方法总体上包括聚合物的溶解、相分离以及凝胶化、用水从凝胶中进行溶剂抽提、冷冻、然后在真空条件下冷冻干燥。通过改变聚合物和溶剂的比例可以控制纳米纤维的形态。
b.基底
所述的术语“基底”意指任何可以将纳米纤维沉积其上的表面。基底可以是为被沉积的纳米纤维网络提供结构支撑的任何表面。一方面，基底可以包括玻璃、纤维素或塑料。另一方面，基底可以是薄膜、织物垫、无纺垫或制品。
基底可以是多孔或无孔的。基底的多孔性由细胞穿透率来决定。细胞能够透过多孔基质但不能透过非多孔基质。基于纳米纤维网络的孔隙度，基底可以具有直径比纳米纤维网络的孔或大或小的孔。可以预计细胞能够透过并保持在基底和/或纳米纤维中。基底的孔尺寸可依赖于要固定的细胞或组织而不同。一方面，孔径大于0.2微米。另一方面，孔径小于1微米。再一方面，孔径是0.2微米-300微米。
一方面，基底可以由一种或多种所述的共混物组成。另一方面，基底可由一种或多种不包括热敏性共混物的聚合物组成。上述用于生产纳米纤维的任何聚合物都可被用于生产基底。这种聚合物的例子包括但不限于聚烯烃、环状聚烯烃、聚缩醛、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、纤维素醚和酯、聚硫醚、聚亚芳基氧、聚环氧烷、环氧烷烃的共聚物和嵌段共聚物、聚乙烯基咔唑、聚砜、改性的聚砜聚合物以及它们的混合物。落入这些种类的优选材料包括聚乙烯、聚(6-己内酯)、聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-共-聚乙交酯、聚丙烯、聚硅氧烷、聚氯乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚醋酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸甲酯(以及其它(甲基)丙烯酸树脂)、聚(甲基)丙烯酰胺、聚苯乙烯、以及它们的共聚物(包括ABA型嵌段共聚物)、聚偏氟乙烯、聚偏氯乙烯、具有各种水解度(87％-99.5％)的交联或非交联形式的聚乙烯醇。可以预计基底可以由不同的聚合物层构成或由两种或更多种聚合物的共混物构成。上述任何聚合物可以是纺织的或无纺的来生产基底。例如，基底可由织成垫子的尼龙纤维构成。
还可以预计，可以在没有纳米纤维网络的情况下单独使用基底以固定细胞。例如，基质可以包括至少一种所述共混物。另一方面，基质可单独由一种或多种上述共混物构成。基底可以采用现有技术制成任何期望的形状或物品，对此将在下面作详细说明。
c.生物活性分子
纳米纤维网络和/或基底可以包括一种或多种生物活性分子。一方面，纳米纤维的网络或基底包括一种或多种用于促进细胞/组织生长的化合物。另一方面，纳米纤维或基底进一步包括可以促进细胞或组织粘附于纳米纤维或基质上的化合物。
生物活性分子包括人或兽医治疗药物、保健品、维生素、盐、电解质、氨基酸、肽、多肽、蛋白、碳水化合物、脂、多糖、核酸、核苷酸、多聚核苷酸、糖蛋白、脂蛋白、糖脂类、粘多糖、蛋白多糖、生长因子、分化因子、激素、神经递质、信息素、抑素、前列腺素、免疫球蛋白、单核因子以及其它细胞因子、保湿剂、矿物质、电磁反应材料、光敏材料、抗氧化剂、可以代谢作为细胞能量来源的分子、抗原以及任何能够促使细胞或生理反应的分子。可以采用任何分子组合，以及这些分子的激动剂或拮抗剂。粘多糖包括糖蛋白、蛋白多糖以及透明质酸盐。多糖包括纤维素、淀粉、褐藻酸、chytosan或透明质酸盐。细胞因子包括但不限于cardiotrophin、基质细胞衍生因子、巨噬细胞趋化因子(MDC)、黑色素瘤生长刺激因子(MGSA)、巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)，2，3α，3β，4和5，白介素(IL)1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13，TNF-α以及TNF-β。用于本发明的免疫球蛋白包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD、IgE以及它们的混合物。氨基酸、肽、多肽以及蛋白可以包括任何类型的具有任何大小和复合性的分子，以及这些分子的组合。例子包括但不限于结构蛋白、酶、以及肽激素。
术语“生物活性分子”也包括纤维蛋白、粘附蛋白、粘附剂、去粘附剂、以及目标化合物。纤维蛋白包括胶原质以及弹性蛋白。粘附剂/去粘附剂包括纤连蛋白、昆布氨酸、凝血栓蛋白以及细胞黏合素C。粘附蛋白包括肌动蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、昆布氨酸、钙黏附蛋白、选择蛋白、胞内粘连分子1、2、3以及包括但不限于诸如α5β1、α6β1、α7β1、α4β2、α2β3以及α6β4之类的整联蛋白在内的细胞基质粘附受体。
术语“生物活性分子”也包括瘦素(leptin)、白血病抑制因子(LIF)、RGD肽、肿瘤坏死因子α和β、内皮抑素、血管抑制素、凝血栓蛋白、成骨蛋白-1、骨成形蛋白2和7、骨连接素、生长调节素样肽、骨钙素、干扰素α、干扰素αA、干扰素β、干扰素γ、干扰素1α以及白介素2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
本文所述术语“生长因子“意指能促进细胞或组织增殖的生物活性分子。用于本发明的生长因子包括但不限于转化生长因子α(TGF-α)，转化生长因子β(TGF-β)，包括AA、AB以及BB异型(PDGF)的血小板衍生生长因子，包括FGF酸性异型1和2、FGF基本型2以及FGF4、8、9以及10的纤维原细胞生长因子(FGF)，包括NGF2.5s、NGF7.0s以及βNGF和神经营养蛋白的神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子，软骨衍生因子，骨生长因子(BGF)，基本成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子(IGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，EG-VEGF，VEGF相关蛋白，Bv8，VEGF-E，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，胰岛素样生长因子(IGF)I和II，肝细胞生长因子(HGF)，神经胶质神经生长因子(GDNF)，干细胞因子(SCF)，角化细胞生长因子(KGF)，包括TGFsα、β、β1、β2以及β3的转化生长因子(TGF)，骨骼生长因子，骨基质源性生长因子，和骨源性生长因子以及它们的混合物。一些生长因子也可以促进细胞或组织的分化。例如TGF可以促进细胞或组织的生长和/或分化。一些优选的生长因子包括VEGF、NGFs、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、FGFb、FGFa、HGF以及BGF。
本文所述的术语“分化因子“意指可以促进细胞或组织分化的生物活性分子。该术语包括但不限于神经营养蛋白、集落刺激因子(CSF)、或转化生长因子。CSF包括粒细胞-CSF、巨噬细胞-CSF、粒细胞-巨噬细胞-CSF、红细胞生成素以及IL-3。一些分化因子也可以促进细胞或组织的生长。例如TGF和IL-3可以促进细胞分化和/或生长。
本文所述的术语“粘附剂”意指能促进细胞或组织附着在纤维表面上的生物活性分子，包括粘附剂。粘附剂的例子包括但不限于纤连蛋白、vitronectin以及昆布氨酸。
本文所述术语“去粘附剂”意指促进细胞或组织从纤维上分离的生物活性分子，包括去粘附剂。去粘附剂的例子包括但不限于凝血栓蛋白和肌腱蛋白C。
本文所述术语“目标化合物”意指作为信号分子的生物分子，所述信号分子诱导细胞或组织补充和/或粘附至纤维上，其包括目标化合物。目标化合物及其同源受体的例子包括含有源自纤连蛋白和整联蛋白的RGD肽的粘附蛋白、包含EGF和EGF受体的生长因子、以及包含胰岛素和胰岛素受体的激素。
生物活性分子可以在制备网络或基质时结合在纳米纤维网络或基底内，或者通过功能基团附着到网络或基质表面。在特定方面，一种或多种功能基团可以结合在纳米纤维或基底的外表面上。这些功能性表面可以将肽、多肽、脂、碳水化合物、多糖、氨基酸、核苷酸、核酸、多聚核苷酸、或者其它生物活性分子结合到纳米纤维或基底表面。一方面，功能基团通过等离子沉积法被沉积在纳米纤维或基底表面上。等离子沉积在纳米纤维或基底表面形成区域等离子区。然后，经过处理的表面与气态分子在反应腔室中反应，例如烯丙胺和/或烯丙醇。另一方面，功能基团在电纺工艺中被引入纳米纤维的表面。例如，十二烷胺、十二醛、十二烷基硫醇、或十二烷醇可以加入到聚合物溶液中。然后将聚合物溶液电纺至纳米纤维中，其中部分加入的胺、醛、巯基或醇基各自暴露在纳米纤维的外表面。
III.制备细胞/组织固定的基质
纳米纤维网络可以采用已有技术沉积在基底上。一方面，纳米纤维网络可以通过充电技术制备并沉积在基底上，例如电晕充电和摩擦充电技术。可替换地，该纳米纤维网络可以电纺至基底上以便纳米纤维网络邻接基底。另一方面，所形成的纳米纤维网络可以使用胶粘剂附着到基底上。
本文中的术语“邻接”包括纳米纤维网络与基底表面的密切接触。术语“邻接”也包括在纳米纤维网络和基底之间的一层或多层。例如，粘连蛋白可以在基底上沉积纳米纤维网络之前沉积在基底的外表面。一方面，细胞或组织不插入纳米纤维网络和基底之间。如上所述，电纺可以用于生产具有所希望的不同性质和定位的纳米纤维。一般而言，虽然不是禁止，但是基底的其它暴露表面不具有任何邻接到所述其它暴露表面上的组分。当将纳米纤维沉积在基底上时，纳米纤维以均匀的厚度均匀地分布在基底上。
可以预计两种或更多种纳米纤维网络可以层叠在基底上。例如，促进特定细胞或组织的细胞活性的不同纳米和/或微米环境可以通过将具有经选择的物理和/或化学性质的不同纳米纤维网络层叠在一起而构建。如上所述，物理和/或化学性质可以设计到各个纳米纤维网络上。单个纳米纤维网络的层叠可以形成允许离子、代谢物、蛋白和/或生物分子扩散的通道，也允许细胞透过基质并在促进细胞和纳米纤维网络之间多点接触的环境中生长。
IV.制品
基于制品的期望的最终用途，本文所述的任何共混物可以模制成各种形状和尺寸。例如，所述共混物可以采用已有技术挤压而成。一方面，共混物可以用于制备单个孔培养板、多孔培养板、微孔板、带腔室的培养玻片、多腔室培养玻片、盖玻片、杯子、烧瓶、试管、瓶子、灌注腔室、生物反应器或发酵罐。可以预计制品可以是能接受纳米纤维网络的基底。例如，共混物可以被挤出来生产培养板，其中在该点可以将一个或多个纳米纤维网络层叠在培养板上。
用本文所述共混物生产的制品整体上全部具有热敏性。这样，即便制品表面被刮擦或损坏，其热敏性也可以得到维持。总体上，用于细胞培养而涂覆的产品被设计成单一用途。如果在处理或细胞培养期间涂层被破坏，热敏性会消失。在本文所述制品中，制品大小被调节以诱导表面的热敏性；因而，刮擦不会对制品功能产生不利影响。因此，用本文所述共混物制备的制品可以被期望具有永久、耐用以及可逆的热敏性。
V.试剂盒
另一方面，本文描述了一种包括纳米纤维和基底的试剂盒。所述的任何纳米纤维网络和基底都可被用于此处。一方面，一种或多种制作前的纳米纤维网络可以被单独地包装起来并杀菌。除去包装之后，可以手工或机械地将一个或多个纳米网络组装在基底上。在多层纳米纤维网络情况下，每个纳米纤维网络都可以通过层叠而被应用于基底上以形成多层组合。基底可以是其形状构造用于接受纳米纤维网络的制品。
VI.应用
本文所述的基质可被用于固定细胞或组织。所述术语“固定”是指基质保留细胞或组织的能力。固定可以是从完全保留细胞或组织以便将细胞或组织锁定在纳米纤维网络或基底内至细胞或组织可以自由透过纳米纤维网络或基底的情况。将生物活性分子结合到纳米纤维网络或基底上可以决定细胞或组织在基质上的固定程度。
所述基质被用于大量应用中，这将在下面作描述。可以预计基质可被用于采用纳米纤维的多种已知的应用中，包括但不限于过滤器应用、制药应用、细胞培养、组织培养和组织工程。可以预计一种或多种细胞类型可以被沉积在基质上。细胞可以利用已知技术沉积在基质上。
一方面，本文描述了一种生长大量细胞的方法，包括(a)将父代细胞沉积在所述基质上，以及(b)培养带有所沉积细胞的基质以促进细胞生长。
另一方面，本文描述了一种分化细胞的方法，包括(a)将父代细胞沉积在所述基质上，以及(b)培养组装物(assembly)以促进细胞分化。
许多类型的细胞都可以固定在基质上，包括但不限于干细胞、定向干细胞、分化细胞以及肿瘤细胞。干细胞的例子包括但不限于胚胎干细胞、骨髓干细胞以及脐带干细胞。各种实施方式中的其它细胞例子包括但不限于造骨细胞、成肌细胞、成神经细胞、纤维原细胞、成神经胶质细胞、生殖细胞、肝细胞、软骨细胞、角化细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、结缔组织细胞、神经胶质细胞、上皮细胞、内皮细胞、激素分泌细胞、免疫系统的细胞以及神经元。
用于本文的细胞可以体外培养，从自然界中获取，基因工程化或通过任何其它方式产生。任何原核或真核细胞的天然来源都可以被采用。
诸如肿瘤细胞等非典型或恶性细胞也可以被用于此。在所述基质上培养的肿瘤细胞可以提供体内天然肿瘤环境的更准确的表达，以便评估药物治疗。肿瘤细胞在所述基质上的生长可以便于在类似于体内的环境中表征肿瘤的生化途径和活性，包括基因表达、受体表达、以及多肽产生，从而允许开发出特异性针对该肿瘤的药物。
已被基因工程化的细胞也可以被用于此。所述工程化包括程序化细胞来表达一个或多个基因，阻止一个或多个基因的表达，或者两者兼而有之。基因工程可以包括，例如往细胞中添加或从细胞中去除基因材料，改变已有的的基因材料，或者两者兼而有之。细胞被转染或其它工程化以表达基因的实施例可以采用瞬时转染或永久转染的基因，或者两者兼而有之。基因序列可以是完整长度的或者是部分长度的、克隆的或自然发生的。
通过改变和/或修饰所选的基质的物理和/或化学性质，该基质可以被设计用于促进特定细胞或组织的细胞生长。基质的物理性质和/或特性包括但不限于质地、皱褶、粘着力、孔隙度、弹性、密实性、几何形状以及小纤维密度，其可以被改变或修饰以促进期望的细胞活性，包括生长和/或分化。可以在基质中设计特定的纳米和/或微米环境。例如，可以改变和/或修饰基质的孔隙度和小纤维密度以允许细胞透过基质并在3维环境中生长。所述的任何生物活性分子可被各向同性地或有梯度地构造至基质中以提升期望的细胞活性，包括细胞粘附力、生长和/或分化。基质的物理和/或化学性质包括生长和分化因子，在其中生长的这些细胞可以构造以模拟体内的天然纳米环境或微米环境。
利用所设计的形式，可以获取细胞2维或3维的空间组织形式。通过构建特定的表面化学类型，细胞行为可以被限定于物理或化学超微结构，其可用于控制细胞生长和/或增殖等细胞活性。
在特定情况下，希望将细胞或组织从基质上去除。例如，可能会希望采集在37℃下生长在基质上的干细胞。一般而言，采集固定在基质上的细胞包括例如使用酶或化学物质等的侵入式技术。采用这些技术会毁坏有价值的细胞，或者会引入可能污染细胞的杂质。所述的共混物允许易于释放固定在基质上的细胞和组织。为了去除所固定的细胞，可以加热或冷却基质以超过上临界或下临界溶解温度。在加热或冷却步骤之后，可用溶液(例如，等渗溶液)冲洗以便收集细胞。
从基质中释放细胞的温度根据所选择的热敏性聚合物、非热敏性/非水溶性聚合物以及共混物中各聚合物的相对量而改变。不希望受到理论的束缚，疏水表面促进细胞粘附而亲水表面防止细胞附着。疏水度可以用水接触角来衡量，如果水接触角增大代表疏水度的增大。热敏性聚合物的存在降低了作为温度函数的共混物的疏水性(也就是水接触角)。例如，当温度从45℃降到20℃，由聚-N-异丙烯酰胺(重量比为2.5％)和聚乙烯组成的共混物的水接触角从44°减小到33°(附图1)。在另一例子中，当温度从45℃降到20℃，由聚-N-异丙烯酰胺(重量比为2.5％)和聚乙烯组成的共混物的水接触角从39°减小到17°(附图1)。在这些例子中，通过改变热敏性聚合物的量可以改变作为温度函数的细胞或组织从基质上释放的模式。因此，通过选择不同的量不同的热敏性聚合物和疏水性聚合物，可以在不同的温度范围内建立释放模式。由于一些细胞对特定的温度比较敏感，因此上述方法尤其具有吸引力。
另一方面，本文描述了一种生长组织的方法，包括(a)将作为组织前体的父代细胞沉积在所述基质上，并且(b)对沉积有细胞的基质进行培养以促进组织的生长。可以预计，在促进组织生长的条件下，可将有生活力的细胞沉积在所述基质上并培养。可以预计上述任何细胞在所述基质成长为组织(也就是工程化的)。本文所述的支持物可以支持许多不同类型的前体细胞，并且该基质可以引导新组织的发育。组织的产品在治伤领域有很多应用。依赖于对被用于生产纳米纤维和基底的材料进行的选择，可以实现组织的体内或体外生长。
在特定情况下，期望从基质上除去细胞或组织。例如，可能会希望采集在所述基质上生长的干细胞。除去细胞的已知侵入技术包括但不限于机械刮擦、超声、化学/酶处理、或者它们的组合。其它技术包括调整pH或温度或者添加离子以释放所附着的细胞。
另一方面，本文描述了确定已知细胞系和药物之间相互作用的方法，包括(a)将已知细胞系沉积在基质上；(b)所沉积的细胞与药物接触；并且(c)确定所沉积的细胞在接触药物时所产生的反应。
利用固定在所述的基质上的已知细胞系，当药物与所固定的细胞相互作用时，可以对几种药物的活性作筛选。依赖于细胞和所要测试的药物，可以采用多种技术来检测和测量细胞-药物之间的相互作用。例如，所述细胞可以代谢药物从而产生易于被检测的代谢物。可变换地，药物可以诱导细胞产生蛋白或其它生物分子。所述基质为细胞提供了在体外环境中更接近地模拟体内细胞性质的环境。基质可以被用于高通量分析中以分析药物/细胞的相互作用。高通量应用利用具有密度至约1536孔/板的多孔组织培养腔室。因而，增加每个孔中的细胞数可以提高所检测的信号。
另一方面，本文描述了分离溶液中的化合物的方法，包括：(a)使溶液与所述基质接触，其中该化合物被固定在所述的基质上；(b)在所固定的化合物从基质上除去。纳米纤维网络和/或基底可以被修饰以固定溶液中的特定生物分子。一般而言，在生物分子被固定在基质上的时候，由一种或多种生物分子组成的溶液与基质相接触。被固定的生物分子随后由溶液将其从基质上释放。该基质可以被修饰以便该基质与生物分子形成共价或非-共价结合(也就是离子、静电偶极力、范德华力)。另一方面，细胞可以被纯化。例如，通过测量单个固定在基质上的各个细胞的电性，可以利用它们不同的固有电性来对细胞群体进行分类和纯化。该应用可以用于特别感兴趣的干细胞，其中期望收获大量纯的干细胞。
实施例
下面对实施例进行说明以阐明所公开主题内容的方法和结果。这些实施例并不意味着包含了所述主题内容的所有方面，而是对有代表性方法及结果进行阐述。这些实施例并不意味着排除本发明的等同方式或各种变换方式，这些方式对本领域技术人员而言是明显的。
尽管已经努力确保各数字的准确性(例如数量，温度等)，但还是应当考虑一些错误和误差。除非有其它说明，份是指重量份，温度单位是℃或者是周围环境温度，压力为大气的压力或接近大气的压力。反应条件有许多组合和变化，例如组分的浓度、温度、压力以及其它反应范围和条件，其可被用于优化所述方法所获得的产品纯度以及产率。只需要合理的常规试验即可优化这些方法条件。
缩写表
ATRP          原子转移自由基聚合
CHO           中国仓鼠卵巢细胞
DMF           二甲基甲酰胺
EO            环氧乙烷
CST           低临界溶解温度
NIPAAM        N-异丙基丙烯酰胺
P127          聚丙二醇—环氧乙烷加聚物127(Pluronic 127)
PDI           多分散指数
PEO           聚环氧乙烷
PMMA          聚甲基丙烯酸甲酯
PO            环氧丙烷
PolyNIPAAm    聚(N-异丙基丙烯酰胺)
PPO           聚丙烯
PS            聚苯乙烯
ST(st)        苯乙烯
THF           四氢呋喃
UCST    高临界溶解温度
实施例1聚苯乙烯和聚(N-异丙基丙烯酰胺)共混物的制备
将聚合物在溶液中进行混合，并蒸发掉溶剂以得到固体共混物，从而制得聚苯乙烯和聚(N-异丙烯酰胺)(PolyNIPAAm)；Mn＝20000-25000，参见Aldrich535311)的共混物。当这两种聚合物的热性能(例如热稳定性)非常类似时，也可以采用其他例如挤压的混合技术。在这种条件下，诸如注模等现有的聚苯乙烯成形技术不会受到添加剂polyNIPAAm的显著影响。
由聚苯乙烯和聚(N-异丙基丙烯酰胺)所组成的共混物的水接触角变化见图1所示。在两个不同的温度下对不同组成的共混物的水接触角进行了测量，聚(N-异丙基丙烯酰胺)的量在0-25wt％内变化。聚苯乙烯/聚(N-异丙基丙烯酰胺)共混物在45℃比在20℃下明显更具强的疏水性。当共混物包括2.5wt％的聚(N-异丙基丙烯酰胺)，且当温度从45℃降到20℃时，水接触角会从4减小为33°。在含25wt％聚(N-异丙基丙烯酰胺)的情况下，对于同样的温度变化，水接触角会从39°减小到17°。
附图1显示了含约2.5wt％聚(N-异丙基丙烯酰胺)情况下的热敏性能。在45℃条件下的疏水状态中，共混物的可湿性非常接近于CellBindTM产品(康宁)的可湿性，这显示了该共混物具有合适的细胞培养性质。相反地，常规聚苯乙烯(PS)的疏水性太强(90°的水接触角)并且不具有热敏性能。
实施例2由共聚物所组成的共混物的制备以及表征
采用下列热敏性链段对聚合物共混物表面的热敏性能作了研究：(聚N-异丙烯酰胺)(PolyNIPAAm-LCST 32℃)，聚环氧丙烷(PPO-LCST 10-15℃)Aldrich参考号202355，Mn4000g/mol以及F Pluronic 127(Sigma参考号P2443)，聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)的嵌段共聚物(P127-LCST27℃)，Mn12600g/mol。聚苯乙烯(PS)-PNIPAAm的嵌段共聚物(PSPolyNIPAAm2)通过连续原子转移自由基聚合(ATRP)制备而成，即在80℃下以二溴代庚二酸二甲酯为引发剂并以溴化铜/五甲基二亚乙基三胺为催化剂聚合苯乙烯；然后在25℃下以氯化铜/三[2-(二甲氨基)乙基]胺为催化剂聚合N-异丙烯酰胺。，上述的制备利用美国专利5763548所述的技术进行，上述美国专利以引用的方式结合在本文中。P127-嵌段-PS(P127PS1)以及PPO-嵌段-PS按如下方法合成，即分别利用溶于苯甲醚的溴代异丁酰溴和三乙胺各自将商业出售的羟基封端的PPO和羟基封端的Pluronic127带有溴代异丁酸酸官能团，然后以溴化铜/五甲基二亚乙基三胺为催化剂在80℃条件下进行苯乙烯的原子转移自由基聚合。该嵌段共聚物显示出低的多分散指数(PDI)，其低于1.4(见表1)。
  样品   Mn(g/mol)  多分散指数(PDI)   摩尔组成   热敏性聚合物含量(wt％)
  PPOPS1   18100   1.3   (St)54-(PO)69-(St)54   45
  PPOPS2   11800   1.4   (St)23-(PO)69-(St)23   26
  P127PS1   41300   1.32   (St)146-(EO)101-(PO)56-(EO)101-(St)146   29
  PSPNIPAAm2   未测得   未测得   (NIPAAM)194-(St)213-(NIPAAM)194   66
St：苯乙烯重复单元
PO：环氧丙烷重复单元
EO：环氧乙烷重复单元
NIPAAm：N-异丙烯酰胺重复单元
在图2和3所代表的实施例中，聚苯乙烯和嵌段共聚物的共混物通过混合苯甲醚中的聚合物(20wt％聚合物含量)并蒸发溶剂以获得固体共混物而制得。该共混物然后在150℃真空条件下退火2小时。由于热敏性聚合物含量小于20wt％，包括PPO-PS和1279-PS共聚物的共混物是透明的。也可替换地采用其它诸如挤出或注模的混合技术。
如上所述，细胞粘附与去粘附与培养基质的疏水性或亲水性密切相关。固体表面的疏水性或亲水性可以用水接触角来表征。如果水接触角减小则亲水性增大。附图4显示了由聚苯乙烯和PS127-PS1热敏性嵌段共聚物组成的共混物的水接触角变化。该水接触角在两个不同温度下测量得到(对于不同的共混物组成，高于LCST或低于LCST)。所测得的聚苯乙烯/P127PS1(LCST27℃)共混物水接触角表现出明显的温度依赖性，其显示基质的亲水性是温度依赖的。这种几度接触角的疏水性温度依赖性对促进细胞释放来说已经足够了。还采用了其他热敏性共混物对几个角度的区别进行了测量。对于含20wt％PPOPS2(LCST10-15℃)的共混物，水接触角在22℃下为84°，在7℃下为77°。对于含30wt％PSPolyNIPAAm2(LCST32℃)的共混物而言，其水接触角在41℃下为95°，在20℃下为91°。
也可替换地采用其它诸如挤出或注模的混合技术。利用DSM midi-挤出器挤出后再经热压制得35mm大、1.5mm厚的样品。在本方法中采用了含聚(N-异丙基丙烯酰胺)、PPO和P127链段的共聚物。基于共混物的粘度，其挤出温度在140℃和170℃之间。挤压过程中，温度在130℃至150℃之间。
如附图5所示，用挤出/热压方法制备的共混物显示出更显著的热敏性行为。在低于和高于LCST条件下所测得的水接触角之差为6到20°之间。由于挤出过程中的所施加的剪切力，这种更强的热敏性行为可以暂时解释为低分子量热敏性共混物在表面的富集。
实施例3采用由通过溶液形式获得的共聚物所组成的共混物的细胞培养
采用通过将溶于苯甲醚的20wt％聚合物溶液蒸发制备得到的上述共混物，并采用CHOβ3细胞研究了细胞的培养和收集。该细胞系附着于塑料基质上并从而为细胞释放构建了良好的测试。采用适合于该细胞系的标准培养条件，1小时后，在含10％牛胎血清的培养基混合物中的附着率在48％和73％之间，其中48％为PS+PPOPS250/50wt％(大约25wt％的PPO)的附着率，而73％为PS+PPOPS270/30wt％(大约15wt％的PPO)的附着率。作为对比，经组织培养处理的聚苯乙烯孔典型地表现出80-85％的附着率。经胰蛋白酶处理与热释放后的细胞总数占在未处理的聚苯乙烯上所计细胞数的56-91％之间。2小时内将PS、PPO-PS以及P127-PS共聚物的温度降至4℃以后，将PS-PolyNIPAAm的温度降至室温以后，在经胰蛋白酶溶液处理之后所获得的细胞总数的69％(PS+PPOS270/30wt％)至高达96％(PS+P127-PS 50/50wt％)被释放掉，作为对照的聚苯乙烯基质则为12％。可见，热敏性共聚物对细胞释放具有重大影响。用胰蛋白酶溶液进行处理并不是必须的；因而可以不采用纯化步骤而细胞功能则不受影响。
实施例4采用通过挤出和热压法获得的共聚物所组成的共混物盘进行培养
采用上述通过挤出法和热压法所获得的共混物，利用CHOβ3细胞研究细胞的培养和收集。采用适合于该细胞系的标准培养条件，1小时后在含10％牛胎血清的培养基混合物中的附着率为：对PS+PPOPS270/30wt％而言为66％，PS+P127PS2 90/10wt％则为65％，PS+P127PS2 70/30wt％则为61％，PS+P127PS2 50/50wt％则为55％。作为对比，在采用相同方法制备的聚苯乙烯盘上1小时后的细胞附着率为29％。通过加入在4℃下热释放2小时后所计数的细胞数以及经胰蛋白酶处理后计数的细胞数而得到的细胞总数显示在附图3中，同时还显示了经热处理所释放的细胞比率。在未处理的聚苯乙烯上和在PS+P127PS2 90/10wt％以及PS+P127PS2 70/30wt％共混物上的细胞总数相同。在共混物PS+PPOPS2 70/30wt％上收集的细胞总数约为从未处理的聚苯乙烯上收集的细胞总数的一半。在共混物PS+P127PS 150/50wt％上收集的细胞数仅仅只有从未处理的聚苯乙烯上收集的细胞总数的4％。在4℃下保持2小时后所收集的细胞比例如下：PS+PPOPS2 70/30wt％为55％，PS+P127PS2 90/10wt％为48％，PS+P127PS2 70/30wt％为35％，而PS+P127PS1 50/50wt％则为85％。作为比较，在聚苯乙烯上4℃下保持2小时后所释放的细胞比例为9％。因而热敏性共聚物在低于LCST条件下对细胞释放具有显著作用。
实施例5沉积在尼龙机织网状物上的热敏性纳米纤维垫的制备
平均分子量为300000的聚(N-异丙烯酰胺)[25189-55-3](0.75g)搅拌溶解于17克二甲基甲酰胺(DMF)中，上述聚合物可以Scientific Polymer Products公司购买。在另一瓶中，14.25克购自Sigma Aldrich(参考号#18223-0)的平均分子量为120000的聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)[9011-14-7]粉末在搅拌和70℃加热下溶解于四氢呋喃(THF)中，然后冷却至室温。聚(N-异丙烯酰胺)/DMF溶液在搅拌条件下添加到PMMA/THF溶液中。该溶液是澄清的并且没有观察到相分离。该溶液装入配有金属针头的注射器中，并在针头与约10cm长的接地电极之间施加2KV/cm左右的电场来实现电纺。电纺纤维被收集在位于接地电极顶部用作临时基质的尼龙机织网状物上。附图6和7所示的SEM(扫描电子显维照片)图显示了所获得的含5wt％热敏性化合物的纤维状材料的形态。纳米纤维的直径小于1μm并且基本上无颗粒。干燥后的纳米纤维包含5wt％的热敏性化合物以及95％的疏水性聚合物。
在本申请全文中，引用了各种出版物。这些出版物全文所公开的内容以引用的方式结合在本申请中以便更完整地描述该化合物、组合物以及所述方法。
可以对本文所述的材料、方法和制品进行各种变化和变型方式。从对本文所公开的材料、方法以及制品的说明和使用可以看出所述材料、方法以及制品的其它实施方式是显而易见的。需要指出的是，所述说明和例子应当被认为是示例性的。

Claims (29)

1.一种热敏性共混物，其包括至少一种热敏性聚合物以及至少一种非热敏性/非水溶性聚合物。
2.如权利要求1所述的共混物，其中热敏性聚合物具有处于0℃到85℃之间的低临界溶解温度和高临界溶解温度。
3.如权利要求1所述的共混物，其中热敏性聚合物包括由下述物质组成的均聚物或共聚物：(甲基)丙烯酰胺、N取代的丙烯酰胺、N，N-双取代的(甲基)丙烯酰胺、N取代的(甲基)丙烯酰胺、N，N-双取代的(甲基)丙烯酰胺、乙烯基醚、烷基乙烯基醚、N-乙烯基己内酰胺，或者它们的组合物。
4.如权利要求1所述的共混物，其中热敏性聚合物包括下列物质组成的均聚物或共聚物：丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，N-乙基丙烯酰胺，N-正丙基丙烯酰胺，N-正丙基甲基丙烯酰胺，N-异丙基丙烯酰胺，N-异丙基甲基丙烯酰胺，N-环丙基丙烯酰胺，N-环丙基甲基丙烯酰胺，N-乙氧基乙基丙烯酰胺，N-乙氧基甲基丙烯酰胺，N-四氢化糠基丙烯酰胺，N-四氢化糠基甲基丙烯酰胺，N，N-二甲基(甲基)丙烯酰胺，N，N-乙基甲基丙烯酰胺，N，N-二乙基丙烯酰胺，1-(1-氧代-2-丙烯基)-吡咯烷，1-(1-氧代-2-丙烯基)-哌啶，4-(1-氧代-2-丙烯基)-吗啉，1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吡咯烷，1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-哌啶，4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吗啉，甲基乙烯基醚，以及它们的组合物。
5.如权利要求1所述的共混物，其中热敏性聚合物包括N-异丙基丙烯酰胺均聚物。
6.如权利要求1所述的共混物，其中热敏性聚合物包括聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷的嵌段共聚物、或者纤维素醚衍生物。
7.如权利要求1所述的共混物，其中非热敏性/非水溶性聚合物包括聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚己酸内酯、聚氨酯、聚酰亚胺、聚酰胺-酰亚胺、聚丙交酯-共-乙交酯、聚烯烃、聚环烯烃、聚砜、聚(甲基)丙烯酸酯聚合物、聚乙烯基聚合物、以及它们的组合物。
8.如权利要求1所述的共混物，其中热敏性聚合物包括N-异丙基丙烯酰胺均聚物，而非热敏性/非水溶性聚合物包括聚苯乙烯。
9.如权利要求1所述的共混物，其中热敏性聚合物包括至少一种疏水单元。
10.如权利要求9所述的共混物，其中疏水单元从H2C＝CHR中衍生而来，其中R包括烷基、芳基、烷氧基、酰胺基或酯基。
11.如权利要求9所述的共混物，其中疏水单元从苯乙烯衍生而来。
12.如权利要求1所述的共混物，其中热敏性聚合物包括下列物质的共聚物：(1)N-异丙基丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、或聚环氧乙烷-聚环氧丙烷的嵌段共聚物、或者它们的组合，以及(2)苯乙烯。
13.如权利要求1所述的共混物，其中热敏性聚合物包括聚环氧丙烷-聚环氧乙烷-聚苯乙烯的嵌段共聚物，聚环氧丙烷-聚苯乙烯嵌段共聚物，或者聚(N-异丙基丙烯酰胺)-聚苯乙烯的嵌段共聚物。
14.一种用于固定细胞或组织的基质，其中该基质包括权利要求1所述的共混物。
15.一种制品，其包括权利要求1所述的共混物。
16.一种用于固定细胞或组织的基质，其中该基质包括权利要求9所述的共混物。
17.一种制品，其包括权利要求9所述的共混物。
18.一种用于生长多个细胞的方法，其包括(a)将父代细胞沉积在权利要求14所述的基质上，和(b)对沉积了细胞的基质进行培养以促进细胞生长。
19.一种生长多个细胞的方法，其中(a)将父代细胞沉积在权利要求16所述的基质上，和(b)对沉积了细胞的基质进行培养以促进细胞生长。
20.一种分化细胞的方法，其中(a)将父代细胞沉积在权利要求14所述的基质上，和(b)对沉积了细胞的基质进行培养以促进细胞分化。
21.一种确定已知细胞系和药物之间相互作用的方法，其包括(a)将已知细胞系沉积权利要求14所述的基质上；(b)使所沉积的细胞与药物接触；以及(c)确定由所沉积的细胞在与药物接触时产生的反应。
22.一种将化合物从溶液中分离出来的方法，其包括(a)将权利要求14所述的基质与溶液接触，其中该化合物被固定在基质上；以及(b)将所固定的化合物从基质上去除。
23.一种组织生长方法，其包括(a)将作为组织前体的父代细胞沉积在如权利要求14所述的基质上，以及(b)对沉积由细胞的基质进行培养以促进组织的生长。
24.一种纳米纤维，其包括权利要求1所述的共混物。
25.一种纳米纤维，其包括权利要求9所述的共混物。
26.一种用于固定细胞或组织的基质，其包括：
a.纳米纤维网络，其中该纳米纤维网络包括一种或多种如权利要求1所述的共混物；以及
b.具有第一外表面的基底，其中纳米纤维网络邻接基底的第一外表面。
27.一种用于固定细胞或组织的基质，其包括：
a.纳米纤维网络；以及
b.具有第一外表面的基底，其中纳米纤维网络邻接基底的第一外表面，并且其中该基底包括一种或多种如权利要求1所述的共混物。
28.一种试剂盒，其包括(1)纳米纤维网络以及(2)基底，其中纳米纤维网络、基底、或纳米纤维网络和基底两者都包括一种或多种权利要求1所述的共混物。
29.一种热敏性聚合物，其包含至少一种疏水单元。
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