CN112691044B

CN112691044B - 正电荷修饰的固体脂质纳米粒及其制备方法

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Publication number: CN112691044B
Application number: CN201911006080.0A
Authority: CN
Inventors: 苏帝翰; 黄雪锋; 施炜亮
Original assignee: Shanghai Jahwa United Co Ltd
Current assignee: Shanghai Jahwa United Co Ltd
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2023-10-17
Anticipated expiration: 2039-10-22
Also published as: CN112691044A

Abstract

本发明提供了一种正电荷修饰的固体脂质纳米粒，其包含：1‑20重量％的非离子表面活性剂；0.3‑2重量％的阳离子聚合物；0.1‑0.5重量％的具有环状肽结构的生物表面活性剂；1‑10重量％的油脂；和水相。本发明还涉及正电荷修饰的固体脂质纳米粒的制备方法及其在化妆品中的应用。

Description

正电荷修饰的固体脂质纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及化妆品领域中活性物的透皮给予，具体涉及一种正电荷修饰的固体脂质纳米粒及其制备方法。

背景技术

在个人护理品领域，由于活性物原料的特殊物理化学结构，易受光照、温度、氧气等的影响而导致活性降低。在实际应用中活性物也会出现诸多问题，如产品体系中活性物易降解失活；皮肤表皮角质层的屏障作用使得活性物渗透率低；或在体内易被代谢降解，生物利用度低等，这些都导致开发、研究和实际应用中面临较大挑战。

因此，如何设计一种稳定性好、生物利用度高的活性物输送系统是功能性化妆品开发领域关注的重点。

迄今为止，皮肤递药纳米系统主要有脂质体、微乳与亚微乳、聚合物纳米粒子、固体脂质纳米粒与纳米结构脂质载体等。采用纳米技术制备的纳米粒，具有小尺寸效应、表面效应和界面效应等特性。与脂质体和微乳等包覆方法相比，活性物被包封于固体脂质纳米粒的固体脂质骨架中，而具有更好的稳定性和缓释效果。固体脂质纳米粒基于生物可降解，高熔点的天然或合成固体脂质为骨架材料所制成的纳米尺度的载体系统，其主要优点表现在具有良好的生理相容性，提高不稳定活性护肤成分的稳定性。

在涉及活性物固体脂质纳米粒(SLN)的专利中，如专利CN 104257632 A一种虾青素固体脂质纳米粒及其制备方法公开了虾青素固体脂质纳米粒，其内部为脂质核，外部为水相，增加了虾青素在水中的溶解度，从而提高了脂溶性成分虾青素在胃肠道中的吸收率和生物利用度；CN 106924501 A一种重楼总皂苷固体脂质纳米粒的制备方法公开了重楼总皂苷固体脂质纳米粒，改善了重楼总皂苷的生物相容性；CN 104688715 A一种白藜芦醇固体脂质纳米粒及其制备方法公开了白藜芦醇固体脂质纳米粒，不仅能够改善白藜芦醇的溶解性，而且提高了药物生物利用度。

精准护肤的兴起，目的是为了活性物能高效的进入细胞，发挥抵抗自由基、抑制黑色素生成、促进胶原蛋白表达、补充细胞能量等功效。通过载体表面修饰技术增强纳米粒的皮肤亲和性是提高其皮肤递药能力的一种有效手段。已有研究发现纳米粒的表面修饰有助于提高皮肤的亲和性和药物的皮肤渗透性：如利用壳聚糖修饰(CN 102793672 A)，其中壳聚糖是自然界中存在的唯一正电荷的碱性多糖，具有无毒，良好的生物相容性，但壳聚糖一般需要在酸性条件下溶解，包裹工艺制备不便；多肽修饰(CN109432432 A)，其为从鱼类分离得到的两亲性阳离子α螺旋结构具有穿膜作用的多肽，但这种多肽制备工艺复杂，价格昂贵；聚多巴胺修饰(CN 109330992 A)，其中聚多巴胺来源于直接提取自贻贝粘附蛋白或模拟合成多肽，同样原料来源具有局限性。

固体脂质纳米粒在药物学领域应用广泛，但通常纳米微粒表面由于缺少表面修饰而减弱了与细胞表面蛋白的相互作用，生物利用率有待提高。细胞外基质蛋白吸附材料与材料表面物理化学性质包括疏水性、电荷及拓扑结构密切相关，其中电荷作用对细胞与材料表面的相互作用具有很大程度的影响。

曾有研究人员发明了正电荷聚合物修饰膜蛋白纳米粒(CN 104582691 A)，达到了高效封装治疗性寡核苷酸并有效递送，但所述阳离子化白蛋白通常包含其中羧基被单个正电荷胺官能团替代的白蛋白缀合物，制备工艺复杂；专利EP1100464中描述了阳离子聚合物(如[1-(2,3-二油酰基)]-N,N,N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐)修饰的脂质纳米粒，其表面活性剂体系包含磷脂，脂肪酸，胆固醇等，可用于基因载体，但体系组分及工艺复杂；再者这两类阳离子聚合物都不在化妆品常用原料名录内，限制了其应用范围。

基于上述问题，开发具有稳定性好、生物利用度高的正电荷修饰的固体脂质粒在化妆品领域具有重要意义。

本发明意外地发现中通过采用化妆品常用的阳离子表面活性剂作为纳米粒制备过程中的表面稳定剂，制备得到具有正电荷修饰的固体脂质纳米粒。通过细胞摄取实验，阳离子表面修饰的固体脂质纳米粒可被细胞高效摄取。除此之外，本发明正电荷修饰的固体脂质纳米粒的制备方法简单，重复性好。

发明内容

一方面，本发明提供了一种正电荷修饰的固体脂质纳米粒，其包含：

1-20重量％的非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂选自多元醇酯的聚氧乙烯衍生物和环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物；

0.3-2重量％的阳离子聚合物；

0.1-0.5重量％的具有环状肽结构的生物表面活性剂；

1-10重量％的油脂，所述油脂的熔点高于35℃；和

水相。

在优选的实施方式中，本发明中采用的非离子表面活性剂选自：吐温20，吐温80，泊洛沙姆，或其任意两种或多种的组合。

在优选的实施方式中，本发明中采用的阳离子聚合物选自：双十八烷基二甲基氯化铵、椰油酰甘氨酸钠、十八烷基三甲基氯化铵，或其任意两种或多种的组合。

在优选的实施方式中，本发明中采用的具有环状肽结构的生物表面活性剂是枯草菌脂肽钠。

在优选的实施方式中，本发明所述固体脂质纳米粒中的油脂选自：单硬脂酸甘油酯，硬脂酸，山嵛酸甘油酯，霍霍巴酯类30，乳木果油，或其任意两种或多种的组合。

在优选的实施方式中，本发明所述固体脂质纳米粒还包含油溶性活性物或可乙醇溶解的活性物。在更优选的实施方式中，所述活性物选自：油溶性甘草，姜黄根提取物，白藜芦醇，羟基酪醇，维生素E，维生素E棕榈酸酯，维生素A棕榈酸酯，积雪草苷，黄芩苷，迷迭香提取物，或其任意两种或多种的组合。

另一方面，本发明还提供了一种制备固体脂质纳米粒的方法，所述方法包括：

a)将非离子表面活性剂、阳离子聚合物和具有环状肽结构的生物表面活性剂加入水中，制备水相；

b)制备包含油脂的油相；

c)合并得到的水相和油相，制备初乳；

d)将初乳经超声波破碎处理或经高压均质化；以及

e)冷却后得到稳定的正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

在优选的实施方式中，制备固体脂质纳米粒的方法还包括在步骤b)加入活性物。

在优选的实施方式中，制备固体脂质纳米粒的方法还包括超声波破碎处理10-30分钟。

附图简要说明

图1为正电荷修饰固体脂质纳米粒的透射电镜图。

图2为正电荷修饰固体脂质纳米粒的粒径分布图，平均粒径为92.3nm。

图3为硬脂胺-异硫氰基荧光素荧光标记固体脂质纳米粒的细胞摄取率比较。

发明详述

采用本发明方法正电荷修饰的固体脂质纳米粒，具有以下优点：

(1)本发明所述的固体脂质纳米粒，所包含的活性物为所有油溶性或醇溶性的原料，具有普适性。

(2)本发明所述的固体脂质纳米粒，内部为脂质核，外部为水相，实现了油溶性/醇溶性活性物在水体系中的均匀分散。

(3)本发明所述的固体脂质纳米粒，呈半透明状，乳液平均粒径、分散指数PDI指标良好，具有较好的稳定性。

(4)本发明所述的固体脂质纳米粒，表面被正电荷修饰，其可提高细胞摄取率及生物利用度。

(5)此外，本发明制备条件简单高效，绿色环保，重复性好，具有推广应用的价值。

本说明书全文中给出的每个界限包括下限或上限，就好像本文中明确写明下限或上限那样。本说明书全文中给出的每个范围包括落入所述较宽范围的每个较窄范围，就好像本文中明确写明这些较窄范围那样。

本文所用术语“纳米粒”是具有纳米级尺寸的颗粒(包括但不限于杆形颗粒、盘形颗粒、板形颗粒、四面体形颗粒等)。在本发明中，纳米粒的平均粒度约为1-1000纳米，优选2-750纳米。即，纳米粒的最大尺寸(如直径或长度)约为1至1000nm。纳米粒的合适粒度分布的非限制性例子是约2nm至750nm，或者约2nm至200nm以下，或者约2nm至150nm。

表面活性剂

通常将特性主要为亲水性的乳化剂加入水相中，而特性主要为亲脂性的乳化剂通常加入油相。本发明所述正电荷修饰的固体脂质纳米粒采用特性主要为亲水性的乳化剂。

本发明的一些实例中，所述表面活性剂为非离子表面活性剂或阳离子表面活性剂。

表面活性剂，是指能使溶液体系的界面状态发生明显变化的物质。由亲水亲油基团组成，在溶液的表面能定向排列。表面活性剂的分子结构具有两亲性：一端为亲水基团，另一端为疏水基团；亲水基团常为极性基团，如羧酸、磺酸、硫酸、氨基或胺基及其盐，羟基、酰胺基、醚键等也可作为极性亲水基团；而疏水基团常为非极性烃链。

非离子表面活性剂是在一种在水溶液中不产生离子的表面活性剂，其在水中的溶解是由于它具有对水亲和力很强的官能团。

本发明所用的一种类型的非离子型表面活性剂是多元醇酯的聚氧乙烯衍生物，其中多元醇酯的聚氧乙烯衍生物(1)衍生自(a)含有约8-22个，优选约10-14个碳原子的脂肪酸，和(b)选自山梨醇、脱水山梨糖醇、葡萄糖、α-甲基葡糖苷、每个分子平均约有1-3个葡萄糖残基的多聚葡萄糖、甘油、季戊四醇或其混合物的多元醇，(2)平均含有约10-120个，优选约20-80个氧乙烯单位；和(3)每摩尔多元醇酯的聚氧乙烯衍生物平均含有约1-3个脂肪酸残基。

多元醇酯的聚氧乙烯衍生物的例子包括但不限于PEG-80脱水山梨糖醇月桂酸酯、聚山梨酯20和聚山梨酯80。PEG-80脱水山梨糖醇月桂酸酯是用平均约80摩尔环氧乙烷乙氧化的月桂酸的脱水山梨糖醇单酯，它可购自特拉华州威尔明顿的UA公司(UniqemaAmericas of Wilmington，Del.)，其商品名为"Atlas G-4280"。聚山梨酯20是与约20摩尔环氧乙烷缩合的山梨醇和山梨醇酐的混合物的月桂酸单酯，它购自特拉华州威尔明顿的UA公司，其商品名为“吐温20”。聚山梨酯80是指聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，在药典中也称为聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯，其商品名为“吐温80”。

另一类合适的非离子型表面活性剂包括环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物。环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物(简称聚醚)是一种新型非离子型表面活性剂，是以环氧乙烷、环氧丙烷为主要原料，在起始剂、催化剂存在下聚合而成。

环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物的例子包括但不限于泊洛沙姆。泊洛沙姆是聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，商品名为普兰尼克(Pluronic)，是一类新型的高分子非离子表面活性剂。

阳离子表面活性剂主要是含氮的有机胺衍生物，由于其分子中的氮原子含有孤对电子，故能以氢键与酸分子中的氢结合，使氨基带上正电荷。

本发明所用的一种类型的阳离子表面活性剂是阳离子聚合物型表面活性剂。阳离子聚合物型表面活性剂的例子包括：双十八烷基二甲基氯化铵和十八烷基三甲基氯化铵。双十八烷基二甲基氯化铵也称为二硬脂基二甲基氯化铵，分子式为C₃₈H₈₀NCl。十八烷基三甲基氯化铵也称为硬脂基三甲基氯化铵，分子式为C₂₁H₄₆NCl。

另一类合适的阳离子表面活性剂包括氨基酸型表面活性剂。氨基酸型表面活性剂因其具有的优良表面性能越来越受到人们的重视，应用领域也越来越广泛。氨基酸型阳离子表面活性剂的例子包括椰油酰甘氨酸钠、月桂酰/椰油酰肌氨酸钠、月桂酰/椰油酰谷氨酸钠、椰油酰甘氨酸钠/钾等。

在优选的实施方式中，本发明的正电荷修饰的固体脂质纳米粒包含非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂以及具有环状肽结构的生物表面活性剂的组合。在一个具体的实施方式中，具有环状肽结构的生物表面活性剂是枯草菌脂肽钠。

在优选的实施方式中，本发明的正电荷修饰的固体脂质纳米粒不含非离子型、阴离子型和/或两性的表面活性剂。

可将任何合适量的非离子表面活性剂用于本发明的固体脂质纳米粒。在某些优选的实施方式中，本发明的固体脂质纳米粒包含至少约1重量％，例如，约1％至20％、约1％至15％、约1％至10％的非离子表面活性剂。在另一些优选的实施方式中，本发明的固体脂质纳米粒包含至少约5重量％，例如，约5％至20％、约5％至15％、约5％至10％的非离子表面活性剂。

可将任何合适量的阳离子表面活性剂用于本发明的固体脂质纳米粒。在某些优选的实施方式中，本发明的固体脂质纳米粒包含至少约0.3重量％，例如，约0.3％至5％、约0.3％至2％、约0.3％至1％的阳离子表面活性剂。在另一些优选的实施方式中，本发明的固体脂质纳米粒包含至少约0.5重量％，例如，约0.5％至5％、约0.5％至2％、约0.5％至1％的阳离子表面活性剂。

可将任何合适量的生物表面活性剂用于本发明的固体脂质纳米粒。在某些优选的实施方式中，本发明的固体脂质纳米粒包含至少约0.1重量％，例如，约0.1％至2％、约0.1％至1％、约0.1％至0.5％、约0.1％至0.2％的生物表面活性剂。在另一些优选的实施方式中，本发明的固体脂质纳米粒包含至少约0.2重量％，例如，约0.2％至2％、约0.2％至1％、约0.2％至0.5％的生物表面活性剂。

本文和整个申请中所用的所有百分数均为基于组合物总重量的活性物质的重量百分数，除非另有说明。

油相

油相中的所述一种或多种化合物优选包括一种或多种油。如本文所用，“油”意指一种或多种具有高于35℃熔点的疏水化合物。在更优选的实施方式中，“油”意指一种或多种具有高于40℃熔点的疏水化合物。在某些更优选的实施方式中，“油”意指一种或多种具有高于50℃熔点的疏水化合物。在某些更优选的实施方式中，“油”意指一种或多种具有高于60℃熔点的疏水化合物。

可用于油组分中或用作油组分的化合物的合适例子包括任何常温条件为固态的油脂。具体的非限制性例子包括但不限于：单硬脂酸甘油酯，硬脂酸，山嵛酸甘油酯，霍霍巴酯类30，乳木果油，或其中一种或两种组合。

单硬脂酸甘油酯是含有C16－C18长链脂肪酸与丙三醇进行酯化反应而制得，熔点78-81℃。其通常为乳白色似蜡固体，可溶于甲醇、乙醇、氯仿，丙酮和乙醚等溶液。

硬脂酸，即十八烷酸，熔点67～69℃，由油脂水解生产。硬脂酸不溶于水，稍溶于冷乙醇，加热时较易溶解。微溶于丙酮、苯，易溶于乙醚、氯仿、热乙醇、四氯化碳、二硫化碳。

山嵛酸甘油酯为白色或类白色粉末或硬蜡块，熔点65～77℃，在三氯甲烷中溶解，在水或乙醇中几乎不溶。

霍霍巴酯类是来源于霍霍巴的一种酯类，不溶于水，具有较好的触觉和延展性，是化妆品中出色的油剂和滋润剂。

乳木果油的提取源自“乳油木”，适用于各种化妆品的配方。

本发明的固体脂质纳米粒可以采用任何合适的油脂组分，只要这些油脂组分在常温条件下为固态。在本发明的某些实施方式中，可以采用的油脂包括合成油脂和天然油脂或植物油脂。在优选的实施方式中，本发明的固体脂质纳米粒可以采用化妆品领域可接受的任何合适的油脂组分。

可将任何合适量的油脂组分用于本发明的固体脂质纳米粒。在某些实施方式中，本发明的固体脂质纳米粒包含至少约1重量％，例如约1％-20％，优选约1％-10％，更优选约1％-5％的油脂组分。在另一些优选的实施方式中，本发明的固体脂质纳米粒包含至少约5重量％，例如，约5％至20％、约5％至10％的油脂组分。

活性物

在一个实施例中，本发明的固体脂质纳米粒包含附加的活性物。如本文所用，“附加的活性物”意指在皮肤上提供美容或治疗效果的化合物(例如合成的或天然的)，如治疗药物或美容剂。治疗药物的例子包括小分子、肽、蛋白质、核酸材料和营养物质(例如矿物质和提取物)。附加活性物的其他例子包括美白试剂、抗衰老剂、抗炎剂、抗痤疮剂、抗微生物剂、抗氧化剂、外用止痛药、维生素以及亮肤剂。

在优选的实施方式中，本发明的固体脂质纳米粒包含任何合适的油溶性活性物或任何合适的乙醇溶解的活性物。这种活性物实例可包括但不限于：油溶性甘草，姜黄根提取物，白藜芦醇，羟基酪醇，维生素E，维生素E棕榈酸酯，维生素A棕榈酸酯，积雪草苷，黄芩苷，迷迭香提取物，或其任意两种或多种的组合。

例如，合适的抗衰老剂的例子包括但不限于：无机防晒剂如二氧化钛和氧化锌；有机防晒剂；类视色素；α羟基酸及其前体如乙醇酸、丙酮酸，β羟基酸如β-羟基丁酸；四羟丙基乙二胺、N,N,N’,N’-四(2-羟丙基)乙二胺(THPED)；和植物提取物如绿茶、大豆、乳蓟、藻类、芦荟、当归、苦橙、咖啡、黄连、柚子、茯苓(hoellen)、忍冬、薏苡、紫草、桑树、芍药、葛根、nice和红花；以及它们的盐、衍生物和前药。抗炎剂的例子包括但不限于合适的甾族抗炎剂，例如皮质类固醇如氢化可的松。维生素的例子包括维生素E、维生素A、维生素C、维生素B以及它们的盐或衍生物，如抗坏血酸二葡糖苷和维生素E乙酸酯或棕榈酸酯。

本发明的固体脂质纳米粒中的附加活性物的量将取决于活性物、存在于组合物中的其他成分、以及组合物所需的有益效果。在一个实施例中，本发明的固体脂质纳米粒包含安全有效量的附加活性物，例如为所述纳米粒的约0.001重量％至约20重量％，如约0.01重量％至约10重量％。在一个具体的实施例中，本发明的固体脂质纳米粒包含安全有效量的附加活性物，例如为所述纳米粒的约0.5重量％。

制备方法

本发明人已发现，本发明制备的正电荷修饰的固体脂质纳米粒，可用于医学及化妆品领域的应用。

在本发明的某些实施方式中，将非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、生物表面活性剂以及其它水相组分组合，形成水相。在优选的实施方式中，采用70-90℃的恒温水浴条件来形成水相。例如，可以采用80℃的恒温水浴条件来形成水相。

在本发明的某些实施方式中，将油脂组分组合，形成油相。在优选的实施方式中，采用70-90℃的恒温水浴条件来形成油相。例如，可以采用80℃的恒温水浴条件来形成油相。在某些优选的实施方式中，将活性物加入油相。本发明所述的固体脂质纳米粒，所包含的活性物为所有油溶性或醇溶性的原料，具有普适性。

然后，可将制备的水相和油相进行组合，通过均质化处理制备初乳。在优选的实施方式中，可以将初乳经超声波破碎处理制备期望的乳液。所得乳液冷却后即可得到本发明所述的正电荷修饰的固体脂质纳米粒。在优选的实施方式中，可以将初乳经高压均质化处理，制备期望的乳液。所得乳液冷却后即可得到本发明所述的正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

在本发明的某些实施方式中，超声波破碎处理时间在10分钟以上。在更优选的实施方式中，超声波破碎处理时间在20钟以上。例如，在一些实施方式中，超声波破碎处理时间为10-30分钟。例如，在一些实施方式中，超声波破碎处理时间为20-60分钟。

本发明所述的固体脂质纳米粒，内部为脂质核，外部为水相，实现了油溶性/醇溶性活性物在水体系中的均匀分散。通过本发明方法制备得到的固体脂质纳米粒呈半透明状，乳液平均粒径、分散指数PDI指标良好，具有较好的稳定性。而且，由于本发明的固体脂质纳米粒的表面被正电荷修饰，其具有提高的细胞摄取率和生物利用度。

具体实施方式

下面结合具体实施例，以进一步阐述本发明。有必要在此指出的是，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。

实验材料

本发明所使用的的主要材料与物质来源如下：

实验仪器

本发明下述实施例中主要采用如下仪器：

1.恒温水浴锅上海恒一科学仪器有限公司HWS28型

2.称量天平METTLER TOLEDO PL602-S

3.均质机POLYTRON PT 3100D

4.超声波细胞破碎机SCIENTZ-IID

5.高压均质机GEA NIRO SOAVI PANDAPLUS2000

实施例

实施例1

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.01％硬脂胺-异硫氰基荧光素标记物、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例2

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例3

取10％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例4

取10％泊洛沙姆407，0.2％枯草菌脂肽钠、0.5％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例5

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％霍霍巴酯类30，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例6

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％乳木果油，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例7

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％硬脂酸，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例8

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％椰油酰甘氨酸钠加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例9

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％十八烷基三甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例10

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、0.5％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例11

取5％吐温-20，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例12

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，20min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例13

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经高压均质，压力20MPa，循环3次得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例14

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％白藜芦醇、1％乙醇、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例15

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％羟基酪醇、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例16

取的5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％视黄醇棕榈酸酯、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

实施例17

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠、1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％迷迭香提取物、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机5000rpm，5min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

比较例1

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机7000rpm，3min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

比较例2

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠，1％聚季铵盐-7加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机7000rpm，3min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

比较例3

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠，1％月桂基二甲基铵羟丙基水解小麦蛋白加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机7000rpm，3min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

比较例4

取5％泊洛沙姆407，0.1％枯草菌脂肽钠，1％椰油酰基甲基牛磺酸钠加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机7000rpm，3min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

比较例5

取5％泊洛沙姆407，1％椰油酰基甲基牛磺酸钠加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机7000rpm，3min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

比较例6

取5％月桂基葡糖苷，0.1％枯草菌脂肽钠，1％双十八烷基二甲基氯化铵加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机7000rpm，3min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

比较例7

取10％月桂基葡糖苷加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机7000rpm，3min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

比较例8

取5％聚甘油-10月桂酸酯加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机7000rpm，3min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

比较例9

取5％泊洛沙姆407，1％氢化卵磷脂加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机7000rpm，3min，初步乳化得到不透明乳悬液；再将初乳经超声波细胞粉碎机处理，600W，30min，得到乳液，冷却即制得正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

比较例10

取5％泊洛沙姆407，0.2％酸性壳聚糖加入到适量的纯水中，80℃恒温水浴，制成水相，有沉淀析出；另将0.5％维生素E、5％单硬脂酸甘油酯，80℃恒温水浴，制成油相。均质机7000rpm，3min，由于水相有析出现象，不能制得稳定的纳米颗粒。

测试例1稳定性实验

温度稳定性评价方法如下：将实施例1-17和比较例1-9制备的样品放置在25℃，4℃恒温箱环境中(因考虑活性物容易高温失活，实验设置不考虑高温环境，正常储存温度小于30℃)，考察1个月。观察样品是否出现析出或沉降的情况。如样品在1个月某个温度条件前后正常无变化，则表示“ok”，如出现沉降现象表示“沉积”，如颜色出现明显变化现象表示“变色”。结果如下表所示。

从上述实验结果可以看出：实施例1为负载的荧光标记物硬脂胺-异硫氰基荧光素，用于跟踪检测对细胞摄取率的影响。实施例2-4中脂质内核均为单硬脂酸甘油酯，当表面活性剂(泊洛沙姆，或枯草菌脂肽钠，或双十八烷基二甲基氯化铵)的量增加时，均能得到稳定的透明微乳。

实施例5，或7中，当改变其他脂质内核时，如霍霍巴酯类30，或硬脂酸，得到的乳液呈半透微乳，这可能与油脂的碳链长度和空间结构相关。而在实施例6中，当油脂换为乳木果油时，纳米粒在25℃稳定，但4℃放置时出现沉淀现象，这可能与乳木果油的熔点与长碳链相关。

实施例8，9中，当阳离子聚合物调整为椰油酰甘氨酸钠，或十八烷基三甲基氯化铵，得到的粒径较大的白色乳液，低温和常温稳定，但是由于粒径大而影响外观及透皮渗透效率。

实施例10中，当阳离子聚合物双十八烷基二甲基氯化铵的量减小到0.5％时，体系仍然稳定，得到半透明的乳液，说明正电荷表面修饰后，由于静电排斥力有助于纳米粒在体系中稳定。

实施例11中，当非离子表面活性剂泊洛沙姆调整为吐温20时，得到透明的乳液，说明此类非离子表面活性剂如吐温20，吐温80，泊洛沙姆都能形成稳定的胶束结构。

实施例12-13中，为调整初乳的再处理过程，调整超声时间至20min，或改变为高压均质，均能得到稳定的透明乳液。

实施例14-17中，当脂质内核中调整为不同的可相容的活性物添加剂时，均不影响脂质纳米粒的框架结构，体系稳定。

相反，比较例的结果不尽如人意。例如，比较例1中，不添加阳离子聚合物；比较例2-3中，阳离子聚合物调整为聚季铵盐-7或季铵化水解小麦蛋白，低温及常温放置均出现沉淀现象。比较例4中，阳离子聚合物换为椰油酰基甲基牛磺酸钠，得到白色乳液，无法得到较小粒径的乳液，此溶液不稳定。比较例5当不添加枯草菌脂肽钠时中，得到透明微乳，但在低温或常温长时间出现浑浊现象，说明枯草菌脂肽钠有助于稳定乳化结构。比较例6-7中，当非离子表面活性剂调整为月桂基葡萄糖苷，或其添加量调整为10％时，得到白色乳液，但粘度大，放置后凝固，类似膏霜状。比较例8中，非离子表面活性剂调整为聚甘油-10月桂酸酯时，能得到透明乳液，但是溶液不稳定。比较例9中，当表面活性剂体系调整为泊洛沙姆与氢化卵磷脂时，乳液呈白色，不稳定。比较例10中，酸性壳聚糖在体系中会有析出现象，不能制备稳定的纳米颗粒。

因此，从纳米粒的结构框架中可以看出，非离子表面活性剂体系与阳离子表面活性剂体系起到稳定乳化颗粒的重要作用，表面活性剂的选择具有特殊性；脂质内核与表面活性剂的选择部分决定了乳液的透明度，即碳链的长度或空间结构影响乳液颗粒的形成及其粒径大小；所包裹的活性物为任意油溶或醇溶的活性物；初步乳化后的再处理是得到固体脂质纳米粒的关键步骤。

测试例2形貌测试

取实施例2制备的固体脂质纳米粒，将其稀释10倍，取20ul溶液滴在铜网，磷酸钨染色，室温干燥成膜后，透射电镜观察形态。仪器检测采用场发射透射电镜(FEI TECNAI G2S-TWIN)测试，加速电压：20kV-200kV，透射电镜图见图1。从图1可以看出正电荷修饰后的固体脂质纳米粒形态呈球状或类球状，分布较均匀，尺寸大约为50nm。因为实际测试过程中纳米粒子可能脱水导致尺寸缩小，所以透射电镜观察到的尺寸可能比较实际尺寸偏小。

测试例3粒径测试

取实施例2制备的固体脂质纳米粒，将其用水稀释10倍，超声波清洗机(SB-3200DTDN)超声处理10min，取3ml样品对其进行粒径测试，仪器激光衍射法粒度分析仪MS2000，见图2。从图2的数据结果为有效粒径尺寸：92.3nm，分散指数0.26，结合图2中的粒径分布情况，说明正电荷修饰后的固体脂质纳米粒可提高其在水溶液中的分散稳定性。

测试例4纳米粒细胞摄取实验

取实施例1制备的固体脂质纳米粒，考察其成纤维细胞中的摄取情况。其具体操作步骤为：在24孔细胞培养板中，以5×10³个细胞/孔的密度接种细胞，培养板在37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时。待细胞贴壁后，用l mL新鲜培养液替换原有培养液，加入硬脂胺-异硫氰基荧光素荧光标记固体脂质纳米粒，及未经正电荷修饰的硬脂胺-异硫氰基荧光素固体脂质纳米粒，对照组为未包含硬脂胺-异硫氰基荧光素的固体脂质纳米粒。在37℃，5％CO₂培养箱中孵育24小时后，用PBS清洗细胞三次，消化、收集细胞，离心，去上清液，PBS洗涤3次，流式细胞仪检测细胞的内平均荧光强度，检测细胞标本个数为10⁴个，激发光谱为异硫氰基荧光素通道。从图3中可以看出，正电荷修饰后的样品组，其平均荧光强度明显高于未修饰组，说明正电荷修饰的纳米粒子能有效被细胞摄取。

取实例1中配制的维生素E固体脂质纳米粒，用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如精华液、乳霜、眼霜等。所述维生素E固体脂质纳米粒的用量为0.1％-10％(w/w)。优选的重量百分比为0.5％-10％(w/w)。

以下是含有维生素E固体脂质纳米粒的皮肤外用剂中的具体应用的实施例，及其这些剂型的配方和制备方法。以下各表中“-”表示无添加。

实施例18：面霜的制备

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实施例19：乳液的制备

实施例20：精华液的制备

实施例21：眼霜的制备

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Claims

1.一种正电荷修饰的固体脂质纳米粒，其包含：

1-20重量%的非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂选自：吐温20，吐温80，泊洛沙姆，或其任意两种或更多种的组合；

0.3-2重量%的阳离子聚合物，所述阳离子聚合物选自：双十八烷基二甲基氯化铵、椰油酰甘氨酸钠、十八烷基三甲基氯化铵，或其任意两种或更多种的组合；

0.1-0.5重量%的具有环状肽结构的生物表面活性剂，所述具有环状肽结构的生物表面活性剂是枯草菌脂肽钠；

1-10重量%的固体油脂，所述油脂的熔点高于60℃；和

水相。

2.如权利要求1所述的固体脂质纳米粒，其特征在于，所述油脂选自：单硬脂酸甘油酯，硬脂酸，山嵛酸甘油酯，或其任意两种或多种的组合。

3.如权利要求1所述的固体脂质纳米粒，其特征在于，所述固体脂质纳米粒还包含油溶性活性物或可乙醇溶解的活性物。

4.如权利要求3所述的固体脂质纳米粒，其特征在于，所述活性物选自：油溶性甘草，姜黄根提取物，白藜芦醇，羟基酪醇，维生素E，维生素E棕榈酸酯，维生素A棕榈酸酯，积雪草苷，黄芩苷，迷迭香提取物，或其任意两种或多种的组合。

5.一种制备如权利要求1所述的固体脂质纳米粒的方法，所述方法包括：

a) 将非离子表面活性剂、阳离子聚合物和具有环状肽结构的生物表面活性剂加入水中，制备水相；

b) 制备包含油脂的油相；

c) 合并得到的水相和油相，制备初乳；

d) 将初乳经超声波破碎处理或经高压均质化；以及

e) 冷却后得到稳定的正电荷修饰的固体脂质纳米粒。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤b)加入活性物。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤d)中超声波破碎处理时间为10-30分钟。