JP4796063B2 - 治療薬を送達するための方法および物 - Google Patents
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Description
特定の高分子としては、ポリエーテルイミド (PEI)、 ポリリシン(pLys)、およびポリアミドアミンデンドリマーがあり、これらは通常、水溶液中でDNAを濃縮し、細胞といった標的部位にDNAを送達する。
Luo, D. & Saltzman W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nature Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
別の態様において、組成物が提供されており、その組成物は以下の構造式:
-(X-Y-Z-O)q-(X'-Y'-Z'-O)p- を有する化学物質を含み、
ここで、X、Y、およびZは以下のものから独立して選択され、
R'は疎水基であり、
n、m、p、n'、m'、およびp'は1以上である。
別の態様において、薬剤送達組成物を作成する方法が提供されており、その方法は、高分子および薬剤を含む液体を提供し、その高分子に内部と外部とを有するミセルを形成させ、前記薬剤がミセルの内部と会合し、さらに、核酸をミセルの外部と会合させる工程を含む。
別の態様において、キットが提供されており、そのキットは、両性高分子ナノ粒子を含む容器、ナノ粒子の第1部分と会合している薬剤、ナノ粒子の第2部分と会合している核酸、および患者にナノ粒子を投与するための説明書を含む。
別の態様において、組成物が提供され、その組成物は、ナノ粒子、ナノ粒子の第1部分と会合する非核酸薬剤、およびナノ粒子の第2部分と会合する核酸を含む。
概略図であり縮尺して描かれたものではない添付図面と併せて、以下の本発明の非限定的な実施形態の詳細な説明を考慮することによって、本発明のさらなる利点、新規な特徴および目的が明らかになるだろう。図面では、いくつかの図面で記載されている一致またはほぼ一致する成分は通常、単一の数字で表されている。当業者に本発明を理解させるのに図解が必要ではない場合は、明確にするために、各図において全ての成分が表示されているわけでなく、また発明の各実施形態における全ての成分が表示されているわけでもない。本明細書の記載と参考文献として引用されている文書に矛盾する開示がある場合は、本明細書の記載に基づく。
本発明の物は、似たような条件下で従来使用されてきた遺伝子のキャリアに比べ、細胞毒性が低いであろう。それにも関わらず、ナノ粒子/DNA複合体は、イン・ビトロ(in vitro)で従来の技術と少なくとも同等の遺伝子発現レベルを有することが実験データから示されている。加えて、本発明のコア-シェルナノ粒子(core-shell nanoparticle)を用いることで遺伝子発現は増加する。様々な成分をプラスミドDNAと共に共送達することで、遺伝子導入効率を高めたり、薬剤と遺伝子治療の相乗効果を生み出すことができる。例えば、そのようなシステムを用いて、ナノ粒子の親水性外殻に核酸を結合させながら、その疎水性内核にパクリタキセルまたはシスプラチンといった抗癌剤を入れて運搬することができる。核酸成分は、標的細胞中のP糖タンパク質の mRNAに対するアンチセンス分子をコードするベクターであってもよい。これは、標的細胞によるP糖タンパク質発現を阻害し、癌細胞に共通して見られる特徴である多剤耐性をもたらす能力を奪うと考えられている。これは、抗癌剤の細胞毒性効果、および他の利点と相まって、遺伝子送達による治療効果を改善することができる。
本発明において、“ナノ粒子”とは、液体中に浮遊し、最大1μm以下の断面径を有する粒子を称する。ナノ粒子は、例えば、無機性または有機性、重合性、セラミック性、半導体、金属(すなわち金)性、非金属性、結晶性、非結晶性、またはその組み合わせである材料から作ることができる。本発明で使用されるナノ粒子は、典型的には断面のどの長さも250 nm 未満であり、より典型的には断面のどの長さも100nm 未満であり、ほとんどの場合は約2-30 nmの断面径である。本発明での使用に適したナノ粒子のあるクラスは、10-30 nmの断面径であり、あるクラスは2-10 nmの断面径である。本明細書で用いられているように、この用語は、生化学の分野で通常意味される定義を含んでいる。
“ミセル”とは、溶液中に存在、または形成される化学構造物で、水相と接触する親水性の領域と水相となじまない疎水性の領域を含む。典型的には、ミセルは疎水性の内核(コア)と親水性の表面から成る球状の形をしている。
"ゼータ電位"とは、ある粒子の他の粒子に対する親和性を表す計測値である。ゼータ電位は、粒子の周りの層と粒子が存在する溶液の部分との電位差を測定したものである。ゼータ電位は、通常ミリボルトの単位で計測される。
"臨界会合濃度" (CAC) は、分子の集まりが、秩序正しい構造に自己会合する濃度を示す。
設定条件下で2つの分子が1つの単位として一緒に移動する場合、その条件下で第1の分子は第2の分子と会合(associated with)しているといえる。例えば、2つの分子はお互いに固定されてもよい。2つの分子は、共有結合またはイオン結合によって結合されていてもよい。あるいは、ファンデルワールス力または磁気力でつながっていてもよい。あるいは、一方の分子が第2の分子または第2の分子の収集物(collection)中に物理的に包含されるかまたはトラップされていてもよい。
第1の分子は、第2の分子、またはそれが会合している物から“解離”することもあり得る。解離とは、第1の分子が第2の分子から独立して動くことができることを意味する。第2の分子または物が分解したり壊れたりして第1の分子との会合がなくなった場合もまた、第1の分子は第2の分子から解離され得る。
両性高分子とは、親水性と疎水性両方の性質を有する高分子のことである。
“生理学的条件”とは、イン・ビボ(in vivo)における化学的条件のことである。このような条件には、温度、圧力、pH、イオン強度等が含まれ得る。
1つの態様において、コア-シェルナノ粒子は、非核酸薬剤のような薬剤と核酸の両方に会合するであろう。図1に図示されている実施形態において、薬剤、核酸またはその両方を送達するためのコア-シェルナノ粒子は、グラフト化された高分子から作成できる。高分子化合物20 には、主鎖30、および主鎖30とは異なる性質を有する側鎖40がグラフトされていてもよい。例えば、側鎖40に疎水基を持ちながら、自身に極性を付加する極性官能基を主鎖に有していてもよい。例えば、疎水基には、コレステロール、PLA、PLGA 、およびポリフェノールが含まれ得る。示した実施形態において、多くの高分子分子20が自己会合してほぼ球状のコア-シェルナノ粒子を形成する。親水性の主鎖30は外殻の外周部に集まり、疎水性の側鎖40はコア-シェルナノ粒子の内部へ向かって延伸する。このやり方で自己会合するような分子20の成分の選択については、以下で記述する。疎水性の側鎖40 が内部に向いていながら、通常はコア-シェルナノ粒子の外側外殻に配向する親水性の主鎖30がコア-シェルナノ粒子の表面と実質的に平行な方向に並んでいてもよい。コア-シェルナノ粒子は、膜の透析や超音波処理といった技術を用いて形成することができ、ある条件下では自己会合も行われ得る
1つの態様では、薬剤と核酸の両方に会合でき、標的細胞に薬剤と核酸を共送達できるようなナノ粒子が提供される。図1を再び参照してみると、コア-シェルナノ粒子は外部表面32と、内部領域42を有するであろう。図1の黒い三角で表されている薬剤50のような化学物質は、少なくとも、内部領域42と外部表面32のいずれか、あるいは内部領域42または外部表面32の一部と会合し得る。 薬剤50は非核酸薬剤であってもよい。第2の化学種、例えばDNAのような核酸は、少なくとも外部表面32または内部領域42の一部と会合し得る。通常核酸は、薬剤と会合していない領域または表面と会合する。
図1で示されているように、薬剤50は内部領域42と会合してもよく、内部領域42もまた、グラフト重合された疎水性側鎖、高分子20の側鎖40によって占められている。DNA断片のような核酸60は、ナノ粒子10の外部表面32、特に高分子20の電荷を帯びた主鎖の部分と会合する。通常核酸は負電荷を帯びているため、核酸60をコア-シェルナノ粒子の外殻と会合させるためには、主鎖30 が正電荷を帯びていてもよい。薬剤と核酸は、ナノ粒子と共有結合またはイオン結合している必要はないが、共有結合またはイオン結合が用いられることもあり得る。化学物質は、ファンデルワース力または他の誘引力を介してコア-シェルナノ粒子の内部と会合してもよく、あるいは単にナノ粒子の内核に包含されていてもよい。コア-シェルナノ粒子は、薬剤が内核の一部を占めるように形成されてもよい。ナノ粒子自体が解離しない限り、拡散や他の機構を介して薬剤がコア-シェルナノ粒子の内部と会合しなくなることはないと言ってもよい。
コア-シェルナノ粒子は生分解性であってもよく、これにより、内核に包含されている化学種を解離させ、さらに内核が崩壊するときにイン・ビボ(in vivo)で放出させる。ナノ粒子の組成を変えることによって、様々な速度および各々な条件下でナノ粒子が崩壊するように調製することもできる。
図2は、コア-シェルナノ粒子を形成するのに使用される化合物(高分子でも可)の概略図である。高分子化合物20は、核酸との会合を促進するために親水性でありかつ正電荷を帯びているであろう主鎖 30 を含む。化合物は、薬剤(より疎水的な性質を持ち得る)と会合するために選ばれた側鎖またはグラフト重合鎖40も含み得る。例えば、これらの側鎖は、コレステロール、またはより疎水的な性質を有する非核酸薬剤との会合に用いられる他の官能基を含んでいてもよい。ある実施形態では、図2の高分子化合物は、図1で示されているようなコア-シェルナノ粒子を形成するために、溶液中に薬剤と共に含まれていてもよい。コア-シェルナノ粒子形成後に、DNA分子60のような核酸がコア-シェルナノ粒子の外部表面と会合してもよい。
1つの態様では、本発明の物は、ナノ粒子と会合している核酸と非核酸薬剤の両方を、ナノ粒子、またはナノ粒子を形成する高分子化合物と会合させることができる。1つの実施形態において、その両方が同時に会合できる。本発明の物は、薬剤、核酸およびその物自身の複合体を形成してもよい。その複合体は、患者、より特異的には患者の特定の組織型または細胞型に送達され得ることが好ましい。
本発明の物は、任意の形または大きさであってよく、エンドサイトーシスを介して細胞内に入り込める大きさであることが好ましい。その物は単一分子、あるいは共同作用する2以上の分子であってよいが、好ましい実施形態では、その物は、外部表面と内部空間を有するコア-シェルナノ粒子である。コア-シェルナノ粒子は、薬剤と核酸の両方に会合できる任意の材料から構成され得る。例えば、コア-シェルナノ粒子は、DNAのような核酸分子と会合する電荷を帯びた第1部分を含み得る。コア-シェルナノ粒子の第2部分は、非核酸薬剤と会合できる疎水性領域を含み得る。従って、コア-シェルナノ粒子を用いて、薬剤と核酸の両方を特定の組織または細胞といった標的に同時に送達することができる。
1つの実施形態において、コア-シェルナノ粒子は、水溶液中に懸濁できるような大きさである。コア-シェルナノ粒子は、生理学的条件下で水溶液中に懸濁できることが好ましい。コア-シェルナノ粒子はまた、核酸と薬剤の両方と会合しながら、細胞膜を通過できるような大きさであろう。このようにすれば、細胞または組織への薬剤と核酸の共送達が実現され得る。エンドサイトーシスを介して細胞内に入り込むために、ナノ粒子はそれが入る細胞より小さいことが好ましい。例えば、本発明の物は、直径約20 μm未満であり、好ましくは直径約5μm未満であることが好ましい。ある実施形態において、その物は、平均直径1 μm未満、500 nm未満、250 nm未満、100 nm未満、または50 nm未満のナノ粒子である。コア-シェルナノ粒子はまた、平均直径が10 nmより大きい、20 nmより大きい、50 nmより大きい、100 nmより大きい、または250 nmより大きくてもよい。
ある実施形態において、コア-シェルナノ粒子はほぼ球状の構造物である。球状の構造物は、外側の表面と、薬剤を包含するのに用いられ得る内側内核が含まれ得る。あるいは、外側の表面が薬剤と会合するのに用いられる場合は、内側の内核が核酸を包含するのに用いられてもよい。
現在、遺伝子治療に使用されあるいは使用が提案されている多くの非ウィルス系ベクターは一定の細胞毒性を示し、そのため患者の治療法としては必ずしも理想的ではない。1つの実施形態において、本発明は、既知の多くの非ウィルス系運搬ベクターより細胞毒性の低いコア-シェルナノ粒子を提供する。例えば、コア-シェルナノ粒子の有する細胞毒性は、ポリエーテルイミド (PEI) またはリポフェクトアミンより低いと考えられている。 コア-シェルナノ粒子のIC50は、160 mg/Lより大きい、250 mg/Lより大きい、または約500 mg/L以上であり得る。従って、コア-シェルナノ粒子は、送達運搬体の存在によって生じる細胞傷害または細胞死を引き起こすことなく、薬剤、核酸、またはその両方を細胞へ送達できるものであろう。
コア-シェルナノ粒子を形成するための材料は、治療を受ける標的に応じて選択してもよい。例えば、pH、温度または酵素濃度の局所的条件下で核酸や薬剤を放出するような材料が選ばれ得る。中枢神経系の治療のためには、血液脳関門を通過できる材料が好ましいであろう。
ある実施形態において、薬剤および/または核酸がナノ粒子と会合した後、薬剤および/または核酸がナノ粒子から解離することが望ましい。薬剤と核酸の両方がナノ粒子と会合している場合は、薬剤と核酸はナノ粒子から同時に、または異なるときに解離してもよい。薬剤および/または核酸は、しばしば生理学的条件下でナノ粒子から解離するであろう。“解離する”とは、共有結合またはイオン結合を壊して薬剤または核酸を放出することを含み得る。“解離する”とはまた、ナノ粒子から薬剤または核酸が拡散することも含み得る。解離を促進するために、イオン強度、pH、または電気状態といった因子を変化させてもよい。薬剤または核酸の分離を促進するために、付加的な化合物を、患者あるいは細胞または組織に直接投与してもよい。
別の実施形態において、本発明の物は、生分解により薬剤または核酸から解離され得る。生分解性のコア-シェルナノ粒子は、例えば細胞核のような標的で作用するように位置づけられたときに、核酸、薬剤、またはその両方の放出を促進するであろう。薬剤がナノ粒子の内部内核と会合している場合は、ナノ粒子が細胞に入り込んでからナノ粒子の生分解によりナノ粒子中に包含されていた薬剤が、細胞の細胞質に露出されることになる。同様に、ナノ粒子の崩壊は、DNAまたは他の核酸の放出を促し、標的細胞の核に核酸を導入することを可能とする。高分子としては、患者または患者の標的部位に存在する酵素により崩壊されるようなものが選ばれ得る。例えば、高分子の崩壊は加水分解により引き起こされるものでもよく、血漿中に存在する酵素により加速されるものでもよい。もちろん、拡散または他の手段で薬剤をナノ粒子から放出できる場合は、生分解性は必要ないであろう。コア-シェルナノ粒子の生分解性は、特異的な用途に合わせて調整することが可能である。例えば、ナノ粒子が生分解する前に標的にたどりつけるように、高分子を基盤とするナノ粒子の化学組成物を調整することができる。ナノ粒子が標的にたどりつくまで生分解せず、ナノ粒子が標的に達した後に生分解が起こるのが好ましい。他の実施形態において、薬剤または核酸を異なる時間間隔で、または長期間に亘り標的に送達するために、様々な生分解性を有するナノ粒子が用いられ得る。
ナノ粒子製造のための組成物は、ナノ粒子と会合するように設計された薬剤および/または核酸に応じて選択され得る。特定の組成物が薬剤および/または核酸と会合できるか否かを特定するために、当業者の間で通常行われている手法の1つを用いて、スクリーニング試験を行ってもよい。
薬剤の適合性を調べるために、本明細書述べられている技術(膜透析、溶解、または超音波処理)、あるいは当業者に既知の他の方法を用いて、まず薬剤の存在下でナノ粒子を形成してもよい。薬剤がナノ粒子に会合できるか否かを特定するため、まず最初に、ナノ粒子と会合していない任意の遊離薬剤を含む溶液から任意のナノ粒子を分離してもよい。例えば、ナノ粒子と薬剤の極性の違いに基づいた液体/液体抽出によって、ナノ粒子の大きさに基づいた限外ろ過によって、または、免疫測定や抗体を用いた他の試験を用いて遊離薬剤に関して溶液を分析することによって、分離を行ってもよい。一度ナノ粒子から分離されれば、薬剤の存在に関して残りの溶液を定量的に分析できるようになる。検出された量が溶液に加えた量と統計学的に大きく異なるならば、薬剤は上手くナノ粒子と会合しており、そのナノ粒子と薬剤は適合する。
ナノ粒子がDNA またはsiRNAのような核酸と会合できるか否かを特定するスクリーニング技術の1つに、ナノ粒子のゼータ電位を測定する方法がある。もしナノ粒子のゼータ電位が約+20 mV よりも大きいならば、ナノ粒子は核酸と会合するのに適している。ゼータ電位は、米国、ブルックヘーヴン(Brookhaven)社から購入できるゼータプラス(ZETAPLUS)のようなゼータ電位解析器を用いて、動的光散乱法で測定することができる。
1つの実施形態において、コア-シェルナノ粒子は高分子化合物から作られる。高分子化合物は、核酸と会合できる部分と薬剤と会合できる第2部分を含み得る。高分子化合物は、側鎖を有する高分子化合物でもよく、側鎖は主鎖上にグラフト重合されていてもよい。1つの実施形態では、高分子化合物は両親媒性の共重合体、より特異的にはカチオン性の両親媒性共重合体であってもよい。高分子主鎖は、連続した第三級アミンを含んでいてよく、少なくともその一部は四級化されていてもよい。例えば、主鎖は、ポリ(N-セバシン酸メチルジエタノールアミン) (PMDS)を含んでいてもよい。カチオン性の両親媒性共重合体を得るためには、例えばコレステロールのような親水基が高分子主鎖上にグラフト重合されてもよい。例えば、n- (2-ブロモエチル)カルバモイルコレステロールは、四級化反応によってPMDS上にグラフト重合することができる。前もって決められた薬剤と核酸を送達できるコア-シェルナノ粒子を作成することを目的として、グラフトする量を調整することができる。四級化する主鎖上の第三級アミンの割合は、1%を超えて100% 未満まで広範囲に亘り、例えば、10%を超えて、20%を超えて、30%を超えて、40%を超えて、50%を超えて、60%を超えて、または70%を超えて四級化してもよい。他の実施形態では、四級化の割合は、100%未満、90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、または10%未満であってもよい。1つの実施形態では、グラフト重合された疎水性コレステロール基の割合が約39.6%になるまで主鎖は四級化される。
高分子の主鎖は親水性であってもよく、DNAのような核酸と会合する電荷または極性を有する様々な機能性官能基が考えられる。例えば、主鎖は、エステル結合、ポリエステル基、またはポリエーテルを含んでいてよい。1つの実施形態では、高分子材料は、1または複数の以下に示す共重合体構造で表される:
式1:
R:H、またはアルキル基、またはその誘導体
R':疎水基 (すなわち、コレステロール、PLA、PLGA、およびポリフェノール等)
式2:
R: H、またはアルキル基、またはその誘導体
R':疎水基 (すなわち、コレステロール、PLA、PLGA、およびポリフェノール等)
式3:
R, R' :H、またはアルキル基、またはその誘導体
R", R"':疎水基 (すなわち、コレステロール、PLA、PLGA、およびポリフェノール等)
ポリ{(アジピン酸N-メチルジエタノールアミン)-co-アジピン酸[(コレステリルオキソカルボニルアミドエチル)メチル-ビス(エチレン) ブロミド] } [P(MDA-co-CEA)]を作成するためには、P(MDS-co-CES)の合成に通常使用されるClC=O(CH2)8C=OCの代わりに、アジピン酸ClC=O(CH2)4C=OClを用いることができる。
ゼータ電位は、粒子間の反発力または引力を測定したものである。キャリア/DNA複合体を細胞内に取り込ませるためには、複合体のゼータ電位は約20 mV よりも大きくなければならないと考えられている。本発明の物は、正のゼータ電位を有することが好ましく、ある実施形態において、20 mV、40 mV、60 mV、または80 mVよりも大きいゼータ電位であろう。ある実施形態において、薬剤と会合および/または核酸と会合した後のゼータ電位は正である。従って、ゼータ電位は、核酸、薬剤、およびコア-シェルナノ粒子を含む複合体に関して正の電荷を帯びているであろう。正のゼータ電位は、細胞への薬剤および核酸の輸送を促進させる。コア-シェルナノ粒子の内核に薬剤を封入すると、例えばゼータ電位を上昇または低下させて、粒子のゼータ電位を変化させるであろう。しかしながら、薬剤が粒子内に組み込まれた後にもゼータ電位が正電荷を保つことがしばしば好ましい。
本明細書で記載されている物は、当業者に既知の技術を用いて製造することができる。例えば、本発明のコア-シェルナノ粒子は、溶解、透析膜技術、または水/油のエマルジョン法によって作成することができる。
本発明のコア-シェルナノ粒子はまた、水中で高分子を溶解または分散させ、これを超音波処理することにより直接的に作成してもよい。実験結果から、膜透析法で作成した粒子の方が、溶解/超音波処理法で作成したものより、僅かにゼータ電位が高くなることが示されている。従って、膜透析法は溶解/超音波処理法よりも好ましいであろう。
別の実施例において、コア-シェルナノ粒子は、水中油滴型エマルジョン法を用いて作成してもよい。高分子、およびそれと会合している任意の薬剤は、DMSO、DMAc、DMF、THF、またはDCMのような有機溶媒に溶解させることができる。次に、この溶媒を水性溶媒に分散させ、さらに有機溶媒を、例えば抽出や蒸発により除去することができる。次に、ナノ粒子を、例えば遠心により濃縮してもよい。
水溶液中でコア-シェルナノ粒子がどの程度安定しているかを測る1つの方法は、ナノ粒子の臨界会合濃度(CAC)を測定することであろう。通常、CACが低いほど、より低濃度でナノ粒子がより安定となる。これは、例えば100mg/l未満、10mg/l未満、または2mg/l未満といった低濃度で核酸/薬剤複合体を患者に投与するような適用において、最も高く評価され得る。CACは、高分子が自己会合してコア-シェルナノ粒子になるときの濃度を示す。PEI、pLys、およびPAMAMのような水溶性高分子は、水に溶けるためCACは示さない。CACが約9.6 mg/lのpLys-g-PLGAやCACが約1.9 mg/lのp (MDS-co-CES)といった両親媒性の高分子に対して、CACが最も有用に適用できる。ナノ粒子のCACは、ナノ粒子と会合している薬剤の存在によって変化することもある。従って、高分子が、得られたナノ粒子によって送達される薬剤の存在下にあるときにCACを求める方が都合のよいであろう。
作成後、本発明のコア-シェル粒子を単離し、さらに乾燥して粉末状に形成してもよい。次に、この粉末を、患者に容易に投与できるようにするため、水溶液および/または薬剤として認可されているキャリア中に再構成させてもよい。
コア-シェル粒子は、正電荷を帯びた外側表面と疎水性の内側内核を有する高分子ミセルであってもよい。ナノ粒子の外側表面の厚さは任意であってよく、ナノ粒子粒径の50%未満、30%未満、20%未満、10%未満、または5%未満であり得る。同様に、ナノ粒子の内核に向かって伸びる疎水性グラフト鎖はいずれも、完全に内核を満たすか、または部分的にナノ粒子内核を満たしてもよい。例えば、疎水性グラフト鎖は、コア-シェルナノ粒子内部の使用可能な空間の100%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、または5%未満を占めてもよい。コア-シェルナノ粒子の内部と会合している任意の薬剤または核酸は、疎水性グラフト鎖と分子的に会合するか、あるいは単に封入により粒子に包含されていてもよい。
ある実施形態において、本発明の物を用いて、患者を治療することができる。例えば、患者を、ナノ粒子、DNAのような核酸、および薬剤を含む複合体を用いて治療することができる。このような治療として、例えば遺伝子治療が挙げられる。患者は、そのような複合体を用いた治療によって恩恵を受ける任意の哺乳類であってよい。例えば、患者は、遺伝子治療を用いて治療され得る特定の疾患の徴候を示す人、またはその疾患にかかりやすい人であってもよい。このような疾患として、例えば、遺伝病、ならびに癌および癌関連疾患が挙げられる。遺伝子治療が承認されている以下の疾患は、本発明により有効な治療が期待できるものの中に含まれると考えられる。
それら疾患には以下のものが含まれる。すなわち: AIDS、HIV-1に感染した無症候性患者、HIV 感染、HIV 感染(1卵性双生児)、脳感染、または膠芽腫、再発性多形膠芽腫、再発性小児脳腫瘍を含む脳腫瘍、または以下のタイプを含む癌、すなわち、進行癌、進行性中枢神経系悪性腫瘍、進行性腎細胞癌、転移性腎細胞癌、乳癌、(治療中、および化学療法後のケモプロテクション)、転移性乳癌 (難治性または再発性)、大腸癌、進行性大腸癌、転移性大腸癌、進行性の(ステージIV黒色腫、散在性悪性黒色腫、悪性黒色腫、転移性黒色腫)を含む黒色腫、転移性前立腺癌、 卵巣癌、再発性小児悪性星状膠細胞腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、嚢胞性線維症 (軽症の成人)、肺気腫、家族性高コレステロール血症、ファンコニー貧血、 ゴーシェ病、髄膜癌腫症、 進行性中皮腫、 軽度のハンター症候群 (ムコ多糖症タイプ II)、小児神経芽腫、再発性/難治性の神経芽腫、末梢動脈疾患、リウマチ、およびアデノシン分解酵素(ADA)欠損症による重症複合免疫不全症(SCID)。
核酸(すなわち、遺伝子)と薬剤の共送達は、例えば、アルツハイマー病、ALS、およびパーキンソン病といった神経変性疾患を扱う場合にも、有用であると考えられている。例えば、パーキンソン病の場合、グリア由来の神経栄養因子の遺伝子を、例えば塩酸アマンタジンのような非核酸薬剤と共に送達する治療も考えられる。塩酸アマンタジンは、ドーパミン産生神経細胞を活性化することで“窓”を開け、溜まっているドーパミンをシナプスへ放出することができると考えられている。従って、薬剤と核酸を共送達することで、ドーパミンを遺伝子治療で効率的に産生できると同時に、薬剤によってシナプスですぐに機能できる状態にすることができると考えられている。別の実施例では、シナプスにおけるドーパミンの化学変化を阻害する塩酸セレギリンという薬剤と、ドーパミンを産生する遺伝子を効果的に共送達できれば、パーキンソン病の治療技術にさらなる進歩が期待できると考えられる。
本発明の物を用いて、広範に亘る様々な薬剤を会合させることができる。患者細胞内への核酸導入を促進するために、薬剤のいくつかを核酸と共に投与してもよい。核酸によって治療されている疾患と同じまたは異なる疾患を治療するために、他の薬剤を用いてもよい。薬剤はまた、細胞を安定化するか、さもなければ遺伝子導入の前、間および後に細胞を保護する役割を果たすであろう。本発明の物と共に使用され得る幾つかの薬剤には、パクリタキセルおよびシスプラチンが含まれる。他にも、例えば、ドキソルビシン、テニポシド、エトポシド、ダウノマイシン、メソトレキセート、マイトマイシンC、インドメタシン、イブプロフェン、シクロスポリン、ビフェニル−ジメチル−ジカルボン酸、トリアムシノロンアセトニド、ベタメタゾン、アムホテリシンB、ケトコナゾール、イトラナゾール、ダウノマイシン、グリセオフルビン、フッ化ピリミジン、ドカイン、エピルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリプチシン、カンプトテシン、ドセタキセル、プレドニゾン、デキサメタゾン、ブレオマイシン、クロロキン(エンドソーム脱出剤)、イミダゾール(エンドソーム脱出剤)、ドキシサイクリン、及メチルプレドニゾンがある。
本発明の別の態様は、本発明の1または複数の組成物を、疾患を治療または予防するために組成物を使用するための使用説明書を含むキットにおいて提供する。このようなキットは、バイアル、チューブといった1または複数の容器類を密接に詰めるための、区画化された運搬ケースを含んでいてよい。各容器には治療に使用される個々の要素の1つが含まれるであろう。キットは、本発明の1または複数の組成物を、粉末状、懸濁状、または液状で含むであろう。説明書はまた、組成物からコア-シェルナノ粒子を形成するために提供されるものであってもよい。キットはまた、組成物の水性懸濁液を作成するため、ならびに、キット中に含まれているかまたは使用者により供給される薬剤および/または核酸を用いて複合体を形成するための説明書を含んでいてよい。説明書はまた、薬剤を経口的、静脈注射で、非経口的、局所的、皮下的に投与するために、あるいは脊髄点滴やポンプ、移植可能な送達装置を介して脳脊髄液に直接投与するための説明書も提供してよい。本発明に関する上記のまたは他の実施形態の機能および利益については、以下の実施例からさらなる理解を得ることができるだろう。以下の実施例は、本発明による利益を例証することを意図したものであり、発明の全範囲について例示しているわけではない。
PMDSは、以下のように作成した。5.958 gのN-メチルジエタノールアミン(0.05 mol)と50.5 gのトリエチルアミン(0.5 mol)を150 mLの丸底フラスコに入れた。撹拌しながら、11.945 gのセバシン酸ジクロリド (0.05 mol)を含む40mL THF (ナトリウムで乾燥)を氷浴中にあるフラスコに滴下した。1時間後、フラスコを氷浴から取り出し、室温で3日間反応を進めた。ロータリーエバポレーターを用いて、溶媒と残ったトリエチルアミンを除去した。粗生成物を20 mLのクロロホルムに溶解し、分画分子量3500の膜を用いてクロロホルムに対して透析した。ロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを除去し、最終生成物を真空乾燥機中に2日間おき乾燥させた。生成物の収率はおよそ75%であった。
高分子主鎖にグラフト重合される親水基として、N-(2-ブロモエチル) カルバモイルコレステロールが選ばれた。モレキュラーシーブで乾燥した50 mLのクロロホルムを、100 mL丸底フラスコ中に入れ、これを−30 ℃未満のドライアイスーアセトン浴中で冷却した。撹拌しながら、4.34 g のクロロギ酸コレステリル(cholesteryl chloroformate) (0.0097 mol) と2.18 gの2-ブロモエチルアミン臭化水素酸塩 (0.0106 mol)を加えた。その後、3mLの新たに乾燥したばかりのトリエチルアミンをフラスコに加えた。30分後、フラスコを取り出し、室温で12時間反応を進めた。有機溶媒は、1Nの NaCl飽和HCl水溶液20 mLで3回洗い、NaCI飽和水溶液30 mLで1回洗ってトリエチルアミンを除去した。有機層を回収し、5gの無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させた。次に、溶液をろ過し蒸留した。粗生成物を、無水エタノールを用いて1回、さらに無水アセトンを用いて2回再結晶化した。最終生成物を真空乾燥機中で24時間乾燥した。生成物の収率はおよそ78%であった。
このカチオン性両親媒性共重合体を薬剤とDNAの共送達に使用できるかどうかを評価するために、コア-シェルナノ粒子の内核にモデル薬剤を会合させた。モデル薬剤としてインドメタシンとピレンを選び、膜透析法によりコア-シェルナノ粒子中に封入した。UV分光光度計によって計測したインドメタシンとピレンの封入率は、それぞれ78.4 % と55.6 %であった。薬剤封入後に、粒子サイズは増大した(インドメタシンは83 nmから175 nmへ、およびピレンは83 nmから180 nmへ)。しかし、ナノ粒子のゼータ電位は、薬剤封入後に低下した (インドメタシンは84 mVから63 mVへ、およびピレンは84 mVから65 mVへ)。
電荷比、またはN/P比とは、高分子上の窒素の数を核酸(DNA)のリン酸基の数と比較して計算したものである。例えば、N/P比が3の複合体では、高分子中の窒素数は、DNA中のリン酸基数より3倍多いことになる。従って、N/P比が小さいほど、複合体と会合しているDNAの割合は高くなる。DNAの移動度を計測してみると、フリーな高分子でN/P比が3の場合、空のコア-シェルナノ粒子でN/P比が2の場合、インドメタシン封入コア-シェルナノ粒子でN/P比が3の場合、およびピレン封入コア-シェルナノ粒子でN/P比が3の場合に、大幅な遅れが認められた。空のコア-シェルナノ粒子のDNA結合能は、フリーの高分子や薬剤封入のコア-シェルナノ粒子よりもわずかに強く、これはおそらく、空のコア-シェルナノ粒子のゼータ電位が高いためと考えられる。
DNA結合過程における薬剤封入コア-シェルナノ粒子の構造健全性を評価するために、蛍光分光光度計を用いて封入されたピレンの微環境を調べた。様々なN/P比における、酢酸ナトリウムバッファー中のピレン、酢酸ナトリウムバッファー中のコア-シェルナノ粒子に封入されたピレン、およびコア-シェルナノ粒子/DNA複合体に封入されたピレンの蛍光スペクトルを、室温(22 ℃)でLS50B発光スペクトロメーター (パーキンエルマー(Perkin Elmer)社、米国)によって計測した。励起スペクトル中の333 nmのバンドと338 nm のバンドを比較したものである強度 (ピーク高さ) 比(I338/I333) を、図5に示すように解析した。ピレンがより疎水的な環境にいるときに、高い比率が得られた。I338/I333比は、ピレンがコア-シェルナノ粒子中に封入されるときに高まった。結果は、DNAの結合によってピレン微環境の疎水性がさらに増すことを示しており、これはDNA結合後も、ピレンがナノ粒子の内核にとどまることを示している。ピレン封入コア-シェルナノ粒子/DNA複合体のサイズは、N/P比0:1 から10:1で、150から300 nmに亘ることも分かった。これは、ピレン封入ナノ粒子がDNAを結合している間、崩壊しなかったことを示している。これらの知見は、安定なコロイド溶液の状態で、これらコア-シェルナノ粒子が薬剤とDNAを同時に運搬する能力があることを示すものである。
イン・ビボ(in vivo)における遺伝子送達に、本発明のコア-シェルナノ粒子が適切かどうかを調べるために、コア-シェルナノ粒子の細胞毒性を評価した。L929マウス繊維芽細胞 (ATCC、米国)を用いて、コア-シェルナノ粒子/DNA複合体を解析した。L929繊維芽細胞を、コア-シェルナノ粒子/DNA複合体中に3日間放置したところ、複合体のN/P比が5: 1 および15:1で、濃度が6、12、24、および48 g/mLでも顕著な細胞毒性は認められなかった。これとは対照的に、同じN/P比のPEI (分岐型、Mw = 25,000) /DNA複合体は、4つの濃度全てで細胞毒性を示し、これは48 g/mLで最も顕著であった (図 6)。従って、本明細書で述べられているコア-シェルナノ粒子は、核酸を送達する上で、PEI/DNA複合体よりも安全な運搬体を提供する。
HEK293細胞において(図 8)、遺伝子導入は、N/P比15:1で最大レベルに達した。10% FCSを加えたDMEM中、2.0 μg DNA量の下、様々なN/P比で、細胞をナノ粒子/DNA複合体と共に4時間培養した。N/P比が5:1よりも高くなると、ナノ粒子/DNA複合体の遺伝子導入レベルは、PEI/DNA複合体のそれよりも高くなった。明るい棒は、膜透析法で作成したナノ粒子を表す。暗い棒は、超音波処理により作成したナノ粒子を表す。コントロール(白い棒)は、N/P比 10: 1のPEIである。
別の実験では、モルモットの蝸牛管でイン・ビボ(in vivo)の遺伝子導入が行われた。SV 40初期プロモーター(クローンテック(Clontech)社、米国)下につながれた4.7 kbのGFPmut1変異体(pEGFP-Cl)をコードするGFPレポーター遺伝子を、使用した。N/P比5のコア-シェルナノ粒子/DNA複合体を、ゼラチンスポンジのゼルフォーム(Gelfoam)(アップジョン(Upjohn)社、カラマズー、ミシガン州)の一片に添加した。複合体を添加されたゼルフォームを、蝸牛窓膜 (RWM)に接触するように置いた。ラセン板縁、ライスネル膜、コルチ器官、および ラセン神経節領域を含む蝸牛内のほぼ全ての組織において、導入遺伝子GFPmut1の発現を、蛍光として観察した。図 10は、コア-シェルナノ粒子/GFP-プラスミド複合体の投与から7日後に観察された、幾つかの蝸牛組織における蛍光強度の増強を示す蛍光顕微鏡写真のコピーである。明るい部分が蛍光領域を示す。A列は、コア-シェルナノ粒子/DNA複合体の結果を示し; B列は、裸の(naked)DNAの結果、およびC列はコントロールの2日目の結果を示している
複合体の場合、14日を過ぎても持続している導入遺伝子の発現が観察される (図11参照)。結果から、ナノ粒子と会合していない裸の(naked)DNA を用いて同じ実験を行った場合には、導入遺伝子の発現がかなり弱まることが分かる。これらナノ粒子は、難聴治療におけるヒトの蝸牛の遺伝子治療に使用できることが期待される。
P(MDS-co-CES) の合成
PMDSの合成:5.958 gのN-メチルジエタノールアミン (0.05 mol) と50.5 gのトリエチルアミン (0.5 mol)を、150 mLの丸底フラスコに加えた。撹拌しながら、 11.945 g のセバシン酸ジクロリド (0.05 mol)を含むTHF (ナトリウムで乾燥) 40mLを、氷浴中にあるフラスコに滴下した。1時間後、フラスコを取り出し、室温で3日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて、溶媒と残ったトリエチルアミンを除去した。粗生成物を20 mLのクロロホルムに溶解し、分画分子量3500の膜を用いてクロロホルムに対して透析した。ロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを除去し、最終生成物を真空乾燥機中に2日間おき乾燥させた。収率はおよそ75%であった。
N-(2-ブロモエチル)カルバモイルコレステロールの合成:モレキュラーシーブで乾燥した50 mLのクロロホルムを、100 mL丸底フラスコ中に入れ、これを−30 ℃未満のドライアイスーアセトン浴中で冷却した。撹拌しながら、4.34 g のクロロギ酸コレステリル (0.0097 mol) と2.18 gの2-ブロモエチルアミン臭化水素酸塩 (0.0106 mol)を加えた。その後、3mLの乾燥したばかりのトリエチルアミンをフラスコに加えた。30分後、フラスコを取り出し、室温で12時間反応を進めた。有機溶媒は、1Nの NaCl飽和HCl水溶液20 mLで3回洗い、NaCI飽和水溶液30 mLで1回洗ってトリエチルアミンを除去した。有機層を回収し、5 gの無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させた。次に、溶液をろ過し蒸留した。粗生成物を、無水エタノールを用いて1回、さらに無水アセトンを用いて2回再結晶化した。最終生成物を真空乾燥機中で24時間乾燥した。収率はおよそ78%であった。
P(MDS-co-CES)の合成:2.85gのPMDS (0.01 mol) と5.5 gのN-(2- ブロモエチル) カルバモイルコレステロールを、50 mLの乾燥トルエンに溶解し、アルゴン雰囲気下120℃で4日間、加熱還流した。トルエンを除去するために、溶液をロータリーエバポレーターを用いて蒸留し、次に100 mLのジエチルエーテルを加えて生成物を沈殿させた。未反応のN-(2-ブロモエチル)カルバモイルコレステロールを完全に除去するために、生成物をジエチルエーテルでさらに4回洗った。収率はおよそ70%であった。
HepG2 またはHEK293細胞を、5% CO2雰囲気下、37℃で 10% ウシ胎児血清(FCS)を添加されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。細胞は、24-ウェルプレートに8×104 細胞/ウェルの濃度で(ルシフェラーゼ-プラスミド)、あるいは6-ウェルプレートに1×106 の濃度で(GFP-プラスミド)播種し、10% FCS添加のDMEM 0.5mL中で培養した。24時間後、培養液を新しい培養液に置換し、2.0 gのルシフェラーゼ-プラスミド、またはGFP-プラスミドを含む複合体を、各ウェルに加えた。4時間培養した後、10% FCS添加のDMEMで培養液を置換した。2日後、培養液を除去し、細胞を0.5 mLのPBSで洗った。次に、0.2mLのリポーター溶解バッファーを各ウェルに加え、細胞を溶解した。その後、細胞懸濁液に2回の凍結融解を繰り返し、14,000 rpmで5分間遠心した。ルミノメーター (バイオラッド(Bio-Rad)社、米国)で相対発光量(RLU)を測定し、 BCAプロテインアッセイ(バイオラッド、米国)を用いて、タンパク質含有量を定量した。GFP-陽性細胞は、フローサイトメーター (EPICS ELITE ESP、コールター(COULTER)社、米国)を用いて計測した。イン・ビボ( in vivo)の実験のために、250 〜300gの重さの白いモルモットを使用した。最初に、ケタミン(40mg/kg)と鎮痛薬のキシラジン (10mg/ kg)を組み合わせて、動物に麻酔をかけた。鼓室胞を露出するために、耳後方からのアプローチが取られた。鉗子を用いて鼓室胞に小さな穴を注意深く開け、蝸牛窓膜 (RWM)を直接見ることができるようにした。乾燥ゼルフォームの小さな一片を、RWMと直接接触するように溝に置いた。11.0 μlの複合体溶液、またはナノ粒子と会合していない裸の(naked)DNAをゼルフォームに注入した。ゼルフォームにベクター剤を注入することで近傍組織への溶液の拡散を防ぐことができる。切開部位を縫合した。手術に要した時間はおよそ20分であった。動物は、手術からそれぞれ2、4、7 および14日後に殺処分した。 頭部両側から傷口は一時的に接着した。骨鉗子を用いて各鼓室胞を開け、蝸牛を露出させた。あぶみ骨を除き、正円窓を通して蝸牛に4% パラホルムアルデヒドを注入して固定した。次に、蝸牛を、4% パラホルムアルデヒド中に4℃で一晩浸した。
完全に固定した後、試料を10% EDTA中で5日間 脱灰した。脱灰後、試料を PBS中に置き、段階的な濃度のアルコール溶液で徐々に脱水し、さらにキシレンで平衡化した。試料は、パラフィンに包埋し、ライカ(Leica)社のミクロトーム (RM2125RT)を用いて、7 μmの厚さで放射状に薄切した。組織片はキシレンでパラフィンを取り除き、シグマ(Sigma)社のマウント剤でマウントした後、共焦点顕微鏡(オリンパス社、日本)で観察した。
純度98%のクロロギ酸コレステリルは、米国のアルドリッチ(Aldrich)社から購入し、そのまま使用した。純度99% のN-メチルジエタノールアミン (アルドリッチ(Aldrich)社、米国) をナトリウムで精製し、真空蒸留した。純度97%のセバシン酸ジクロリド (アルドリッチ(Aldrich)社、米国) を、真空蒸留により精製した。トリエチルアミン(シグマ(Sigma)社、米国) は、まず塩化トルエンスルホニルで処理し、第二級アミンを除去した。次に、これを蒸留し、合成に使用する直前にナトリウムで乾燥させた。99%より高い純度を有する2-ブロモエチルアミン臭化水素酸塩は、米国のシグマ(Sigma)社から購入し、そのまま使用した。THF (メルク(Merck)社、 ドイツ)もまた、使用直前にナトリウムで乾燥した。
1.1 ポリ(セバシン酸N-メチルジエタノールアミン)(PMDS) の合成および特徴付け
5.958 g のN-メチルジエタノールアミン(0.05 mol) および50.5 gのトリエチルアミン(0.5 mol) を150 mL丸底フラスコに入れ、これをドライアイスーアセトン浴中で冷却した。撹拌しながら、11.945 g のセバシン酸ジクロリド (0.05 mol)を含むTHF(ナトリウムで乾燥)40mL をフラスコに滴下した。1時間後、フラスコを取り出し、室温でさらに3日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて、溶媒と残ったトリエチルアミンを除去した。粗生成物を20 mLのクロロホルムに溶解し、分画分子量3500の膜を用いてクロロホルムに対して透析した。続いて、ロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを透析液から除去し、最終生成物を真空乾燥機中に2日間おき乾燥させた。収率はおよそ75%であった。
図12および13で示すように、PMDSの構造を1H NMR および FTIRのスペクトルで特徴付けた。図12において、δ2.71-2.73 (シグナルa)の広いピーク、δ1.62 (シグナル b) およびδ1.32 (シグナルc とd)のピークは、セバシン酸の4つの異なる-CH2-基によるものである。δ4.17-4.19 (シグナルe) の3重線のピークとδ2.30-2.37 (シグナルf とg)の多重線のピークは、窒素原子に隣接した2つの異なる-CH2-基と-CH3基のプロトンに由来するものである。IR スペクトルからもまた、ポリエステルの形成がうまくいっていることが分かった。図13に示すように、-C=Oの伸縮振動は、カルボン酸ハロゲン化物のそれ(1805 cm-1)と比べてより低波長側(1736 cm-1)にシフトした。これはハロゲンの誘起効果によるものである。1172 cm-1におけるピークは、-C=Oの伸縮振動と同程度の強度を示しており、これはC-Oによるものであった。1HNMR および IRの結果から、PMDSの合成が成功していることが分かった。
1.2 N-(2-ブロモエチル)カルバモイルコレステロールの合成および特徴づけ
モレキュラーシーブで乾燥させたクロロホルム50 mL を含む100 mL丸底フラスコを、ドライアイスーアセトン浴(温度:−30℃未満)中で冷却した。撹拌しながら、4.34 g のクロロギ酸コレステリル (0.0097 mol) と2.18 gの2-ブロモエチルアミン臭化水素酸塩(0.0106 mol)を加えた。その後、3mLの乾燥したばかりのトリエチルアミンをフラスコに加えた。30分後、フラスコを取り出し、室温でさらに12時間反応を進めた。有機溶媒は、1Nの NaCl飽和HCl水溶液20 mLで3回洗い、NaCI飽和水溶液30 mLで1回洗ってトリエチルアミンを除去した。有機層を回収し、5gの無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させた。次に、溶液をろ過し蒸留した。粗生成物を、無水エタノールを用いて1回、さらに無水アセトンを用いて2回再結晶化した。最終生成物を真空乾燥機中で24時間乾燥した。薄層クロマトグラフィー(TLC)による解析から、トルエン:ヘキサン:メタノール(容積比8: 8:1)の混合溶媒を展開溶媒としたときの移動率(Rf) が0.68であることが示された。これは純粋な生成物が得られたことを示している。収率はおよそ78%であった。
1.3 ポリ{(セバシン酸N-メチルジエタノールアミン)-co-セバシン酸[(コレステリルオキソカルボニルアミドエチル)メチル-ビス (エチレン) 臭化アンモニウム]}(P(MDS-co-CES))の合成および特徴付け
2.85gのPMDS (0.01 mol) と5.5 gのN-(2- ブロモエチル) カルバモイルコレステロールを、50 mLの乾燥トルエンに溶解し、アルゴン雰囲気下120℃で4日間、加熱還流した。トルエンを除去するために、溶液をロータリーエバポレーターを用いて蒸留し、次に100 mLのジエチルエーテルを加えて生成物を沈殿させた。未反応のN-(2-ブロモエチル)カルバモイルコレステロールを完全に除去するために、生成物をジエチルエーテルでさらに4回以上洗った。収率はおよそ70%であった。
図16に、P(MDS-co-CES)の1H NMRスペクトルを示す。δ2.7-2.8 (シグナル a)、1.5-1.7 (シグナル b)、1.2-1.4 (シグナルcおよび d)、4.0-4.2 (シグナルe)、および2.2-2.4 (シグナルf および g)におけるピークは、 PMDS主鎖のプロトンに由来するものである。0.7 から1.2にかけて見られるたくさんのピークは、コレステロール基に由来するものである。加えて、δ5.38 のピークは、コレステロール基中の二重結合炭素(=CH-) (シグナルh)から生じるものである。高磁場δ0.7におけるピークは、環状炭化水素に直接結合したメチル基(シグナルi)を表す。P(MDS-co-CES)の1H NMRスペクトルから得られる情報は、コレステロール基がPMDS 主鎖にきちんとグラフト重合されていることを示している。図17は、P (MDS-co-CES)のIRスペクトルであり、これもまた四級化が上手くいっていることを示すものである。1252 cm-1 のピークは、アミンのC-N伸縮振動によるものである。このピークは、PMDSのIRスペクトルの1240 cm-1におけるピークに比べて、強度が強くかつシフトしている。これは第四級アンモニウム塩が形成されていることを示している。
グラフト重合度は、1HNMR スペクトルにおける、主鎖の水素とペンダント分子鎖の水素のピーク面積比を計算することから見積もることができる。これは、以下の式を用いて計算される;
Rg=(ΔAp NHm / NHp ΔAm) ×100%
Rg:グラフト重合度。PMDS 主鎖上の全アミン数に対する、N-(2-ブロモエチル)カルバモイルコレステロールにより四級化されたアミン数の比率として定義される
ΔAp:ペンダント分子鎖に由来する選ばれた部分のピーク面積
ΔAm:主鎖に由来する選ばれた部分のピーク面積
NHp:ペンダント分子鎖に由来する選ばれた官能基中の水素原子の数
NHm: 主鎖に由来する選ばれた官能基中の水素原子の数。
最初に、ペンダント分子鎖と主鎖から適切なプロトンを選ばなければならない;グラフト重合度を計算するのに、全てのプロトンが使用されるわけではない。選ばれるプロトンのシグナルは、他のプロトンのシグナルと重なっていてはならない。さらに、アミンの四級化による影響を受けているプロトンは使用すべきではない。主鎖とペンダント分子鎖にある幾つかのプロトンの化学シフトは、アミンの四級化による影響を受けていた。この合成法では、アミン基の一部のみが四級化された。従って、第四級アンモニウムに直接結合しているメチル基、またはメチレン基上の水素と、第三級アミンに結合しているそれとでは化学的環境が大きく異なる。第四級アンモニウムが有する正電荷の誘起効果のために、これらのプロトンは遮蔽されており、そのためにプロトンの化学シフト、δが増加した。化学シフトは、プロトンと第四級アンモニウム間の距離に依存して変化した。このように、PMDS主鎖のプロトンシグナルは、第三級アミンを四級化した後に複雑になった。例えば、P(MDS-co-CES)の1H NMRスペクトル (図 16) には、幾つかの新しいシグナルが、δ 4.6-4.7、4.4-4.5、3.7-3.9、および3.2-3.3に見られ、これは恐らく、 第四級アンモニウムに直接結合している基のプロトンによるものである。 従って、第三級アミンまたは第四級アンモニウムに隣接している基からプロトンを選ぶことは薦められない。主鎖のカルボニル基に隣接しているメチレン基のプロトン(図 16, シグナル a)、および二重結合に隣接しているメチリジン基(-CH=)のプロトン(図 16, シグナルh)や、ペンダント分子鎖のヘキサンと五員環に隣接しているメチル基のプロトン(図 16, シグナル i)は、グラフト重合度を見積もるのに適切であると考えられた。
シグナル a とシグナル hのピーク面積を用いて計算すると、P(MDS-co-CES)のグラフト重合度は39.6%と見積もられる。PMDS主鎖に対するペンダント分子鎖のモル比を変えると、P(MDS-co-CES)のコレステロール部と正電荷部のグラフト重合度を、変化させることができる。
合成した P (MDS-co-CES) の分子量を、示差屈折計(ウォーターズ(Waters) 410、マサチューセッツ、米国)を用いながら、GPC分析(ウォーターズ(Waters)2690、マサチューセッツ、米国)により求めた。使用された移動相は、流速1 mL/minのTHFであった。重量平均分子量と多分散度の測定は、一連のポリスチレンを標準試料として作成した検量線(ポリマーラボラトリー社(Polymer Laboratories Inc.)、マサチューセッツ、米国;1300から320,000に亘る分子量範囲)から計算した。P (MDS-co-CES)は、多分散度2.0で、9.1kDaの重量平均分子量を有していた。 この高分子の窒素含有率は、元素分析装置によって4.34%と測定された。
ピレン溶液(10 μg/mLアセトン中) を5 mLメスフラスコに分注し、アセトンを蒸発させた。濃度が 0.1 から50 mg/Lの各高分子水溶液5mLを、ピレン残渣を含むメスフラスコに加えた。従って、全ての高分子水溶液は濃度0.1 1 g/mLという過剰のピレンを含むことになった。溶液は、室温(22℃)で24時間平衡化した。次に、高分子溶液の蛍光スペクトルを、室温(22 ℃)でLS50B発光スペクトロメーター (パーキンエルマー(Perkin Elmer)社、米国)によって計測した。395 nmの発光波長で、300から360 nmの励起スペクトルが記録された。 励起波長、および発光波長の波長帯域は、4.5 nmであった。励起スペクトル中の333 nmのバンドと338 nm のバンドを比較したものである強度 (ピーク高さ) 比(I338/I333)を、高分子濃度との相関から解析した。図18に示すように、CAC 値 (1.9 mg/L) は、低濃度における点を通る水平な接線と、屈折するカーブに対する接線が交わる交点から求められた。
コア-シェルナノ粒子は膜透析法を用いて作成した。P(MDS-co-CES) (10 mg)、およびモデル薬剤としてインドメタシン(2 mg) またはピレン(2 mg) を、5 mL DMFに溶解した。次に、溶液を、分画分子量2000の透析膜を用いて、1 L の脱イオン水またはpH値が4.6 と5.6の酢酸ナトリウムバッファーに対して、室温で24時間透析した。最初の8時間は、毎時間に外液を取り替えた。溶液を、0.45 μm孔径のフィルターを用いてろ過した後、解析した。あるいは、解析を行う前に24時間凍結乾燥した。空のコア-シェルナノ粒子も、モデル薬剤を加えない同様のプロトコルで調製した。
4. 透過型電子顕微鏡(TEM)
0.01 (w/v) %リンタングステン酸を含む新たに調製したナノ粒子溶液を、カーボン膜でコートされた銅グリッドに一滴載せ室温(22℃)で空気乾燥した。透過型電子顕微鏡による観察は、加速電圧300k eVのフィリップス(Philips)社製CM300 顕微鏡(オランダ) を用いて行われた。図 19 は、濃度2 mg/mLの高分子溶液中で作成されたコア-シェルナノ粒子の典型的な透過型電子顕微鏡写真である。
空のコア-シェルナノ粒子、薬剤封入コア-シェルナノ粒子、および薬剤封入コア-シェルナノ粒子/DNA複合体、のサイズとゼータ電位を、ゼータ電位解析器(ゼータプラス(ZetaPlus)、ブルックヘーヴン、米国)を用いて動的光散乱法で測定した。ナノ粒子は、前述の方法で新たに調製した。薬剤封入ナノ粒子とDNA溶液を混合し、できた複合体を30分間放置してから測定を行った。サイズ測定は散乱角90°で行われた。
6. DNA結合過程における薬剤封入コア-シェルナノ粒子の安定性の評価
図 20は、ピレンを封入したコア-シェルナノ粒子/DNA複合体の有効径、およびゼータ電位の、N/P比との相関を示したものである。ピレン封入コア-シェルナノ粒子は、酢酸ナトリウムバッファー (0.02M、pH 4.6)中で作成した。DNA 溶液 (0.02M、pH 4.6の酢酸ナトリウムバッファー2mL中40 μg DNA) に、ナノ粒子を様々なN/P 比で加えた。ピレン封入コア-シェルナノ粒子/DNA複合体のサイズはN/P 比が上がると共に増加し、N/P 比 2で最大値300 nmに達した。N/P比3:1から10:1にかけては、N/P比が上がると共にサイズは減少した。複合体のゼータ電位は、N/P 比 4で定常的なレベルに達した。粒子サイズは、DNA結合過程において、僅かな範囲(150 nmから300 run)で変化するのみであり、これはピレン封入コア-シェルナノ粒子が崩壊していないことを示している。
ピレン、ピレン封入コア-シェルナノ粒子、およびピレン封入コア-シェルナノ粒子/DNA複合体の励起スペクトルは、LS50B発光スペクトロメーターで記録した。ピレン封入コア-シェルナノ粒子のI338/I333比は、DNA結合後に増加するのが観察された (図 5)。これは、ナノ粒子内核にピレンが保持されており、DNAの結合によってピレン微環境の疎水性が上がることを示している。これらの知見は、コア-シェルナノ粒子が、安定なコロイド溶液中で薬剤とDNAを同時に運搬できる能力を有することを示している。
7. 添加する薬剤の量と封入率
インドメタシンの添加量と封入率は、UV-VISスペクトロメーター (島津UV-2501、島津、日本)によって求めた。簡潔に言えば、乾燥凍結したナノ粒子、一定量をDMFに溶解し、その溶液を直接計測した。インドメタシンでは 318 nm、ピレンでは273 nmに波長が検出された。封入率は、理論上の薬剤含有量に対する実際の薬剤含有量の比率として計算された。
高分子、コア-シェルナノ粒子、または薬剤封入コア-シェルナノ粒子/DNA複合体の形成を、アガロースゲル電気泳動によって解析した。0.28 g のルシフェラーゼのプラスミドを様々なN/P 比で有するDNA複合体を、1.0 % アガロースゲルの各ウェルに載せ、100 Vで90分電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色した。得られた DNAの移動パターンをUV 照射下で観察した。
L929細胞を、10,000細胞/ウェルで96-ウェルプレート上にまいた。次にそのプレートをインキュベーターに入れ、さらに培養して細胞密度を高めた。試験を始める日の朝、ウェル中の培養液を新しい成長培養液100μl で置換した。次に、各ナノ粒子溶液を、50 μlずつ各ウェルに加えた。同量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS) をネガティブコントロールとして用いた。次に、プレートをインキュベーターに戻し、5% CO2雰囲気下、37℃で、24、48および72 時間培養した。各サンプルは、1プレートにつき4個の複製を用意した。各培養時間のため3枚のプレートが使われ、結果として1サンプルにつき16個の複製が用意された。指定の培養時間が経過してから、MTT 溶液20 μl を各ウェルに加えた。次に、プレートをインキュベーターに戻し、5% C02雰囲気下、37℃で3時間培養した。次に、各ウェルの成長培養液を除去した後、DMSOを150 μlずつ各ウェルに加え、取り込まれている紫色のホルマザン結晶を溶解した。各ウェルから100 μlずつ取り、新しい96ウェルプレートにトランスファーした。次に、マイクロプレートリーダー(パワーウェーブ(PowerWave)X、バイオ-テックインストゥルメント(Bio-Tek Instruments)社)を用いて550nmと690nmの吸光度を測定した。ホルマザン結晶の吸光度の値は、550nm と690nm の吸光度の差として求められた。結果は、ネガティブコントロールの吸光度に対するパーセンテージとして示された。
10. イン・ビトロ(In Vitro)の導入実験
HepG2 またはHEK293細胞を、5% CO2雰囲気下、37℃で 10% ウシ胎児血清(FCS)を添加されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。細胞は、24-ウェルプレートに8×104 細胞/ウェルの濃度で(ルシフェラーゼ-プラスミド)、あるいは6-ウェルプレートに1×106 の濃度で(GFP-プラスミド)まき、10% FCS添加のDMEM 0.5mL中で培養した。24時間後、培養液を新しい培養液に置換した。サイトメガロウィルス(CMV)プロモーターに制御された6.4 kbのホタルルシフィラーゼをコードするDNA 2.0 g、またはSV 40初期プロモーター下につながれた4.7 kbのGFPmut1変異体(pEGFP-Cl)をコードするGFPレポーター遺伝子を、各ウェルに加えた。4時間培養した後、10% FCS添加のDMEMで培養液を置換した。2日後、培養液を除去し、細胞を0.5 mLのPBSで洗った。次に、0.2mLのリポーター溶解バッファーを各ウェルに加え、細胞を溶解した。その後、細胞懸濁液に2回の凍結融解を繰り返し、14,000 rpmで5分間遠心した。ルミノメーター (バイオラッド(Bio-Rad)社、米国)で相対発光量(RLU)を測定し、ビシンコニン酸 (BCA)プロテインアッセイ(バイオラッド、米国)を用いて、タンパク質含有量を定量した。GFP-陽性細胞は、フローサイトメーター(EPICS ELITE ESP、コールター(COULTER)社、米国)を用いて計測した。
11.1複合体の調製
P(MDS-co-CES)/DNA 複合体は、P(MDS-co- CES) 溶液(1.35 mg/mL) 10 μl と、SV 40初期プロモーター(2.5 μg; クローンテック(Clontech)社、米国)下につながれた4.7 kbのGFPmut1変異体(pEGFP-Cl)をコードするGFP-プラスミド 1.0 μl を、酢酸ナトリウムバッファー(0.02 M, pH 4.6)中で穏やかに混合することにより調製した。溶液は、30分間放置してから使用した。
11.2動物の外科的処置および導入遺伝子複合体の送達
実験のために、250 〜300gの重さのアルビノモルモットを使用した。最初に、ケタミン(40mg/kg)と鎮痛薬のキシラジン (10mg/ kg)を組み合わせて、動物に麻酔をかけた。鼓室胞を露出するために、平易な耳後方からのアプローチが取られた。一組の鉗子を用いて鼓室胞に小さな穴を注意深く開け、蝸牛窓膜 (RWM)を直接見ることができるようにした。乾燥ゼルフォームの小さな一片を、RWMと直接接触するように溝に置いた。11.0 μlの複合体溶液、またはナノ粒子と会合していない裸の(naked)DNAをゼルフォームに注入した。ゼルフォームに、複合体または裸の(naked)DNAを注入することで近傍組織への溶液の拡散を防ぐことができる。切開部位を縫合した。手術に要した時間はおよそ20分であった。
DNA複合体または 裸の(naked)DNAを含むゼルフォームを移植した動物は、手術からそれぞれ2、4、7 および14日後に殺処分した。一時的に接着した傷口を、頭部両側から除いた。骨鉗子を用いて各鼓室胞を開け、蝸牛を露出させた。あぶみ骨を除き、正円窓を通して蝸牛に4% パラホルムアルデヒドを注入して固定した。次に、蝸牛窓膜を通して4% パラホルムアルデヒドを注入し、蝸牛を固定した。次に、蝸牛を、4% パラホルムアルデヒド中に4℃で一晩浸した。完全に固定した後、試料を10% EDTA中で5日間脱灰した。脱灰後、試料をPBSで洗い、徐々に濃度を上げていったアルコール溶液中で脱水してから、キシレンで平衡化した。試料は、パラフィンに包埋し、ライカ(Leica)社のミクロトーム (RM2125RT)を用いて、7μmの厚さで放射状に薄切した。
顕微鏡観察の前に、組織片はキシレンでパラフィンを取り除き、シグマ(Sigma)社のマウント剤でマウントした。次に、サンプルを共焦点顕微鏡(オリンパス社、日本)で観察した。画像はデジタルカメラで取り込んだ。
請求項において (上記明細書と同様)、“含む”、“ある” “運ぶ”、“有する”、“包含する”、“含まれる”等といった移行句は全て、解放されている、すなわち、含むがそれに限定はされないことを意味することが理解される。移行句 “..から成る”および“実質的に..から成る”のみが、米国特許庁特許審査手続便覧2111.03項記載のように、それぞれ閉じたまたは半閉じの移行句である。
Claims (34)
- 前記ナノ粒子が、非生理学的条件下で核酸および薬剤と会合しかつその会合を維持でき、さらに生理学的条件下で前記核酸および薬剤を解離できることを特徴とする請求項1記載の物質。
- 前記ナノ粒子が細胞膜を通過できることを特徴とする請求項1または2記載の物質。
- 前記核酸がDNAであることを特徴とする請求項1から3いずれか1項記載の物質。
- 前記薬剤が癌に対する薬剤であることを特徴とする請求項1から4いずれか1項記載の物質。
- ミセルを形成することを特徴とする請求項1から5いずれか1項記載の物質。
- 前記薬剤がミセルの内部と会合しており、核酸がミセルの外部と会合していることを特徴とする請求項6記載の物質。
- 前記ナノ粒子が、5mg/L より高い濃度で安定であることを特徴とする請求項1から7いずれか1項記載の物質。
- 前記ナノ粒子が、血液脳関門を通過できることを特徴とする請求項1から8いずれか1項記載の物質。
- 請求項1から9いずれか1項記載の物質と、薬剤として許容されるキャリアとを含む組成物。
- 20μmより小さい粒径を有することを特徴とする請求項11記載の高分子構造物。
- 10nmよりも大きくかつ1000 nmより小さい粒径を有することを特徴とする請求項11記載の高分子構造物。
- 40 mVよりも高いゼータ電位を示すことを特徴とする請求項11記載の高分子構造物。
- 100 mg/Lよりも低い臨界会合濃度を有することを特徴とする請求項11記載の高分子構造物。
- 9.6 mg/L以下の臨界会合濃度を有することを特徴とする請求項11記載の高分子構造物。
- 請求項11から16いずれか1項記載の高分子構造物と会合している非核酸薬剤を含む薬剤送達運搬体。
- 請求項11から16いずれか1項記載の高分子構造物と会合している核酸を含む核酸送達運搬体。
- 前記核酸が、DNA またはsiRNAであることを特徴とする請求項19記載の組成物。
- 前記ナノ粒子がミセルを形成することを特徴とする請求項19記載の組成物。
- 前記ナノ粒子が、極性領域および疎水性領域を含むことを特徴とする請求項19記載の組成物。
- 前記ナノ粒子が、ポリエーテルイミド(PEI) またはリポフェクトアミンよりも低い細胞毒性を有することを特徴とする請求項19記載の組成物。
- 前記ナノ粒子が、160 mg/L以上のIC50を有することを特徴とする請求項19記載の組成物。
- 前記複合体が、経口的に、局所的に、静脈注射で、経皮的に、または非経口的に送達されることを特徴とする請求項19記載の組成物。
- 核酸に対する薬剤の割合があらかじめ決められていることを特徴とする請求項26記載の方法。
- ミセルを乾燥する工程をさらに含むことを特徴とする請求項26記載の方法。
- ミセルを含む粉体を形成する工程をさらに含むことを特徴とする請求項28記載の方法。
- 請求項1記載の物質を含む容器;
ナノ粒子の第1部分と会合している薬剤;
ナノ粒子の第2部分と会合している核酸;および
ナノ粒子を患者に投与するための説明書;を含むことを特徴とするキット。 - 請求項1記載の物質を含む容器;および
非核酸薬剤および核酸を高分子に会合させるための説明書;を含むことを特徴とするキット。 - 前記高分子が、親水性主鎖および疎水性側鎖を含むことを特徴とする請求項31記載のキット。
- 前記高分子がペグ化されていることを特徴とする請求項31記載のキット。
- 請求項1記載の物質;
ナノ粒子の第1部分と会合している非核酸薬剤;および
ナノ粒子の第2部分と会合している核酸;を含むことを特徴とする組成物。
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WO2008109105A2 (en) * | 2007-03-06 | 2008-09-12 | Flagship Ventures | Methods and compositions for improved therapeutic effects with sirna |
EP2144600A4 (en) | 2007-04-04 | 2011-03-16 | Massachusetts Inst Technology | POLY (AMINIC ACID) TARGET MOLECULES |
EP2152241A4 (en) * | 2007-04-30 | 2012-11-14 | Agency Science Tech & Res | PROCESS FOR DELIVERING A PROTEIN INTO A CELL |
WO2008147807A2 (en) | 2007-05-23 | 2008-12-04 | Amcol International Corporation | Cholesterol-interacting layered phyllosilicates and methods of reducing hypercholesteremia in a mammal |
US8530244B2 (en) * | 2007-10-02 | 2013-09-10 | Terapia Celular, L'N, Inc. | Methods and materials for amplification of a signal in an immunoassay |
EP2620157A3 (en) | 2007-10-12 | 2013-10-16 | Massachusetts Institute of Technology | Vaccine nanotechnology |
BRPI0912159B8 (pt) * | 2008-05-13 | 2021-05-25 | Phaserx Inc | copolímero compreendendo um primeiro bloco que compreende uma unidade hidrofílica em ph fisiológico e um segundo bloco que compreende grupos hidrofóbicos, e uso do dito copolímero para liberação intracelular de um polinucleotídeo |
JP2011520901A (ja) * | 2008-05-13 | 2011-07-21 | ユニヴァーシティ オブ ワシントン | 治療剤の細胞内送達のためのミセル |
US20110129921A1 (en) * | 2008-05-13 | 2011-06-02 | University Of Washington | Targeted polymer bioconjugates |
AU2009246329B8 (en) | 2008-05-13 | 2013-12-05 | Phaserx, Inc. | Micellic assemblies |
US9006193B2 (en) * | 2008-05-13 | 2015-04-14 | University Of Washington | Polymeric carrier |
WO2010021770A1 (en) | 2008-08-22 | 2010-02-25 | University Of Washington | Heterogeneous polymeric micelles for intracellular delivery |
US8591905B2 (en) | 2008-10-12 | 2013-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Nicotine immunonanotherapeutics |
US8277812B2 (en) | 2008-10-12 | 2012-10-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Immunonanotherapeutics that provide IgG humoral response without T-cell antigen |
US9464300B2 (en) | 2008-11-06 | 2016-10-11 | University Of Washington | Multiblock copolymers |
EP2352522A4 (en) | 2008-11-06 | 2014-03-05 | Univ Washington | BISPECIFIC AUXILIARIES FOR INTRA-CELLULAR RELEASE |
CA2745926A1 (en) | 2008-12-08 | 2010-07-08 | Phaserx, Inc. | Omega-functionalized polymers, junction-functionalized block copolymers, polymer bioconjugates, and radical chain extension polymerization |
CA2754200A1 (en) * | 2009-03-02 | 2010-09-10 | Assistance Publique - Hopitaux De Paris | Injectable biomaterial |
JP2013503885A (ja) * | 2009-09-01 | 2013-02-04 | ノースウェスタン ユニバーシティ | 担体としてオリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子を使用する治療薬の送達 |
WO2011062965A2 (en) | 2009-11-18 | 2011-05-26 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Targeting monomers and polymers having targeting blocks |
US20110151566A1 (en) * | 2009-12-23 | 2011-06-23 | James Hedrick | Biodegradable polymers, complexes thereof for gene therapeutics and drug delivery, and methods related thereto |
EP3266873A1 (en) * | 2010-11-10 | 2018-01-10 | Nigel L. Webb | Nuclions and ribocapsids |
US9849512B2 (en) | 2011-07-01 | 2017-12-26 | Attostat, Inc. | Method and apparatus for production of uniformly sized nanoparticles |
US20140093946A1 (en) * | 2012-09-28 | 2014-04-03 | General Electric Company | System for optimizing the introduction of nucleic acids into cells using magnetic particles |
CN111450060A (zh) * | 2012-11-19 | 2020-07-28 | 新加坡科技研究局 | 用于引发对免疫原的免疫响应的方法 |
US9784730B2 (en) | 2013-03-21 | 2017-10-10 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Nanoparticle for targeting brain tumors and delivery of O6-benzylguanine |
KR101492168B1 (ko) | 2013-04-29 | 2015-02-11 | 한국과학기술연구원 | 양친매성 핵산분자, 이를 포함하는 핵산 복합체 및 이의 약물 전달체로서의 용도 |
EP3027221A1 (en) | 2013-07-30 | 2016-06-08 | PhaseRx, Inc. | Block copolymers and their conjugates or complexes with oligonucleotides |
US9949874B2 (en) * | 2014-06-06 | 2018-04-24 | Janssen Biotech, Inc. | Therapeutic agent delivery device with convergent lumen |
US20160129275A1 (en) * | 2014-11-06 | 2016-05-12 | Henry Keith Vickery | Magnetic hyperthermal ablation of tumor cells |
AU2015366355B2 (en) * | 2014-12-18 | 2020-05-28 | Dsm Ip Assets B.V. | Drug delivery system for delivery of acid sensitive drugs |
CA2974503A1 (en) | 2015-01-21 | 2016-07-28 | Phaserx, Inc. | Methods, compositions, and systems for delivering therapeutic and diagnostic agents into cells |
US9839652B2 (en) | 2015-04-01 | 2017-12-12 | Attostat, Inc. | Nanoparticle compositions and methods for treating or preventing tissue infections and diseases |
US11473202B2 (en) | 2015-04-13 | 2022-10-18 | Attostat, Inc. | Anti-corrosion nanoparticle compositions |
EP3283580A4 (en) | 2015-04-13 | 2019-03-20 | Attostat, Inc. | ANTI-CORROSION NANOPARTICLE COMPOSITIONS |
EP3115039B1 (de) * | 2015-07-09 | 2021-12-15 | beniag GmbH | Verfahren zum herstellen einer fusionsmischung zur übertragung eines geladenen moleküls in und/oder durch eine lipidmembran |
US10201571B2 (en) * | 2016-01-25 | 2019-02-12 | Attostat, Inc. | Nanoparticle compositions and methods for treating onychomychosis |
WO2018126084A1 (en) | 2016-12-30 | 2018-07-05 | Phaserx, Inc. | Branched peg molecules and related compositions and methods |
WO2018175445A1 (en) * | 2017-03-20 | 2018-09-27 | Northwestern University | Poly(lactic-co-glycolic acid) (plga) spherical nucleic acids |
CN109620968A (zh) * | 2017-10-09 | 2019-04-16 | 华东师范大学 | 一种用于基因治疗或转染的组合物及其制备方法和用途 |
US11646453B2 (en) | 2017-11-28 | 2023-05-09 | Attostat, Inc. | Nanoparticle compositions and methods for enhancing lead-acid batteries |
US11018376B2 (en) | 2017-11-28 | 2021-05-25 | Attostat, Inc. | Nanoparticle compositions and methods for enhancing lead-acid batteries |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1056984A (en) * | 1976-01-16 | 1979-06-19 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of National Defence Of Her Majesty's Canadian Government | Curable binding systems |
GB9623051D0 (en) * | 1996-11-06 | 1997-01-08 | Schacht Etienne H | Delivery of DNA to target cells in biological systems |
US20030134420A1 (en) * | 2000-02-18 | 2003-07-17 | Lollo Charles Peter | Methods and compositions for gene delivery |
DE60130743T2 (de) * | 2000-03-24 | 2008-07-17 | Biosphere Medical, Inc., Rockland | Mikrokugeln zur aktiven embolisierung |
AU2001245987A1 (en) | 2000-03-24 | 2001-10-08 | Biosphere Medical, Inc. | Compositions and methods for gene therapy |
US6852709B2 (en) * | 2000-05-31 | 2005-02-08 | Johns Hopkins University | Biologically useful polyphosphates |
US6696038B1 (en) * | 2000-09-14 | 2004-02-24 | Expression Genetics, Inc. | Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent |
US6998115B2 (en) * | 2000-10-10 | 2006-02-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof |
US20030129223A1 (en) * | 2000-10-11 | 2003-07-10 | Targesome, Inc. | Targeted multivalent macromolecules |
EP1401818A2 (en) * | 2001-05-30 | 2004-03-31 | Targesome, Inc. | Targeted multivalent macromolecules |
AU2003237763A1 (en) * | 2002-05-10 | 2003-11-11 | Johns Hopkins Singapore Pte Ltd | Cationic lipids for intracellular delivery of bioactive substances |
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