CN113527672A - 一种胍基衍生物及其基因递释系统 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药学与生物技术领域，涉及具有高转染效率和良好生物相容性的胍基衍生物及其基因递释系统，具体涉及式I结构的1,3‑间苯二甲酰胍修饰的阳离子材料及其包载基因形成的基因复合物，以及上述基因复合物分散于高分子聚合物溶液形成的水凝胶基因递释系统。所述的的水凝胶基因递释系统可用于制备治疗癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的药物以及用于病毒感染性疾病的免疫保护。

Description

一种胍基衍生物及其基因递释系统
技术领域
本发明属于药学与生物技术领域，涉及具有高转染效率和良好生物相容性的胍基衍生物及其基因递释系统，具体涉及1,3-间苯二甲酰胍修饰的阳离子材料，及其包载基因形成的基因复合物，以及上述基因复合物分散于高分子聚合物溶液形成的水凝胶基因递释系统。
背景技术
现有技术公开了基因治疗是指利用非生物或生物学方法将基因导入到患者器官、组织和细胞中，通过表达蛋白、干扰蛋白表达或影响细胞通路，以纠正或改善细胞内病理状态，从而达到治疗疾病的目的。将基因导入细胞的非生物学方法包括显微注射、基因枪、电穿孔和超声导入等，这些方法适用于体外基因导入，难以应用于体内基因导入。生物学方法是通过基因载体包载携带基因，进入目的细胞达到基因转染的目的。目前包载基因的载体主要分为两类：病毒载体和非病毒载体；病毒载体利用病毒可以感染宿主细胞的特点，具有较高的转染效率，目前大部分进入临床研究的基因载体为病毒载体，但病毒载体也存在着诸多问题，如制备工艺复杂、基因携载量低、免疫原性强以及潜在的致病性和致瘤性等，使其广泛应用受到了限制；非病毒载体由化学合成得到，具有质量及批次间差异可控、免疫原性低以及基因携载量高等优点，具有较好的应用前景；与病毒载体相比，非病毒载体存在转染效率低的缺点，限制了其应用，因此提高非病毒载体的转染效率是基因治疗研究中的重点。
研究显示，非病毒载体在递送基因的过程中需要克服以下生理屏障：①血液屏障保护基因有效规避血液中网状内皮系统的吞噬和核酸酶的降解；②细胞屏障携带基因跨越两亲性细胞膜进入胞内；③胞内转运屏障协助基因内涵体/溶酶体逃逸，跨越核膜，实现基因转染，其中每一道生理屏障都直接影响到基因的转染效率；业内认为，理想的基因载体需要克服上述生理性屏障，才能将基因递送至细胞内特定部位，发挥基因治疗的目的。
功能性基团修饰是克服上述生理屏障的常用策略，通过对现有非病毒载体进行疏水基、穿膜肽、寻靶分子、咪唑基、胍基、融合蛋白和核定位信号肽等功能性基团修饰，以增强基因压缩、基因入胞、内涵体/溶酶体逃逸和核膜跨越等能力。作为疏水基团，苯基修饰可提高基因复合物的稳定性，并有助于非病毒载体携带基因跨越细胞膜，通过与基因和生物膜的磷酸基形成氢键，胍基修饰有助于非病毒载体压缩基因、跨越细胞膜和核膜。
基于现有技术的基础与现状，本申请的发明人拟提供具有高转染效率和良好生物相容性的胍基衍生物及其基因递释系统，本发明基于苯基的疏水作用、以及平面结构的间苯双胍基与磷酸基的分子识别作用，设计了一种可用于基因递送的功能性基团—1,3-间苯二甲酰胍，将其通过化学键与阳离子材料连接得到一种新型非病毒载体，包载基因形成的基因复合物，并将基因复合物分散于高分子聚合物溶液形成的水凝胶基因递释系统，用于提高基因转染效率。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的基础与现状，提供具有高转染效率和良好生物相容性的胍基衍生物及其基因递释系统，具体涉及1,3-间苯二甲酰胍修饰的阳离子材料，及其包载基因形成的基因复合物，以及上述基因复合物分散于高分子聚合物溶液形成的水凝胶基因递释系统。
本发明基于苯基的疏水作用、以及平面结构的间苯双胍基与磷酸基的分子识别作用，设计了一种可用于基因递送的功能性基团—1,3-间苯二甲酰胍，将其通过化学键与阳离子材料连接得到一种新型非病毒载体，包载基因形成的基因复合物，并将基因复合物分散于高分子聚合物溶液形成的水凝胶基因递释系统，用于提高基因转染效率。
本发明的一种可用于基因递送的功能性分子—1,3-间苯二甲酰胍，将其通过化学键与阳离子材料连接得到一类新型非病毒载体，命名为R-BGG，结构如下式：
Figure BDA0002556279030000031
R-BGG的结构式
其中，BGG代表1,3-间苯二甲酰胍；R代表阳离子材料，可以是聚酰胺-胺、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、壳聚糖、聚丙烯亚胺、聚氨酯、聚磷腈、聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯、精蛋白、精胺和阳离子脂质；X代表连接基团，可以是碳氮键(-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-CH2-CH2-、-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-或-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-)、酰胺键(-NH-CO-)、亚胺键(-N＝C-)、脲(-NH-CO-NH-)、硫脲(-NH-CS-NH-)或脒(-N＝CH-NH-)；n可以是1～100之间的任意数字。
更具体的，本发明按下式合成路线合成了5-溴甲基-N,N’-二叔丁氧羰基-1,3-间苯二甲酰胍，通过聚酰胺-胺5代(G5)的氨基与上述化合物的溴甲基反应，脱保护基后得到G5-BGG；基于上述反应原理，BGG可用于多种阳离子材料的化学修饰，得到一类新型非病毒载体；
本发明中，G5-BGG的合成：
按下式所示的合成路线，得到5-溴甲基-N,N’-二叔丁氧羰基-1,3-间苯二甲酰胍，通过乙二胺为核心的聚酰胺-胺型树枝状聚合物5代(G5)的氨基与上述化合物的溴甲基反应，脱保护基后得到G5-BGG；作为对照组，同时合成了G5-BEN和G5-GUA，1H NMR表征各化合物的分子结构；
Figure BDA0002556279030000041
G5-BGG、G5-BEN和G5-GUA的合成路线图
本发明进行了G5-BGG/pDNA细胞学评价，
细胞摄取试验考察G5-BGG/pDNA复合物入胞能力，绿色荧光蛋白转染试验和虫荧光素酶定量转染试验考察G5-BGG/pDNA复合物细胞转染效率，包载治疗基因pORF-hTRAIL后，MTT法考察G5-BGG/pORF-hTRAIL复合物细胞学抗肿瘤效果。
本发明进行了载G5-BGG/pDNA水凝胶递释系统体内抗肿瘤作用和安全性评价，
构建PVA与对苯二硼酸交联的PVA水凝胶，包载G5-BGG/pORF-hTRAIL复合物，瘤旁注射考察载G5-BGG/pORF-hTRAIL水凝胶基因递释系统体内抗肿瘤作用和安全性评价。
本发明的新型非病毒载体可压缩DNA、siRNA、mRNA、shRNA、lncRNA或反义核苷酸等基因药物形成基因复合物，具有较高基因压缩、细胞摄取和跨越核膜的能力，呈现高的基因转染效率和良好的生物相容性。
本发明的BGG基因复合物的给药方式可以是注射给药、鼻粘膜给药、肺部给药、皮肤给药、眼部给药或口腔粘膜给药，用于癌症、感染性疾病、遗传性疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的治疗。
本发明构建的BGG基因复合物，可分散于具有生物相容性的高分子聚合物溶液，形成水凝胶基因递释系统，在生物体内的给药方式可以是注射给药、鼻粘膜给药、肺部给药、皮肤给药、眼部给药或口腔粘膜给药，用于癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的治疗。
本发明提供了所述的BGG和G5-BGG的制备方法、G5-BGG包载基因形成基因复合物的细胞学评价，以及上述基因复合物构建的水凝胶基因递释系统用于肿瘤治疗的物质基础，本发明经试验，结果表明：G5-BGG转染效率显著高于阳性对照PEI 25K；G5-BGG包载治疗基因pORF-hTRAIL显著抑制体外肿瘤细胞的生长，载G5-BGG/pORF-hTRAIL水凝胶基因递释系统显著抑制皮下瘤裸鼠模型肿瘤的生长。
附图说明
图1：基因复合物粒径电位表征，其中，
G5-BGG与pGL3形成的复合物粒径显著小于其他三种材料与pGL3形成成的复合物的粒径，质量比为12时G2-AM能压缩pGL3形成粒径150nm左右的纳米粒，Zeta电位在20mV左右。
图2：琼脂糖凝胶电泳图，其中，
G5-BGG、G5和G5-GUA与pGL3的质量比为1:1时，可完全压缩基因；G5-BEN与pGL3的质量比为2:1时，可完全压缩基因。
图3：G5、G5-GUA、G5-BEN和G5-BGG材料细胞毒性，其中，
图A、B、C分别为HEK293T、HeLa和SGC7901细胞。G5、G5-GUA、G5-BEN和G5-BGG浓度为100μg/mL及以下时，HEK 293T、HeLa和SGC 7901细胞的存活率均在85％以上。
图4：G5-BGG/pGL3复合物细胞摄取，其中，
图A、C、E为流式细胞摄取半定量数据，图B、D、F流式细胞摄取荧光曲线图，图A、B为HEK293T细胞，图C、D为HeLa细胞，图E、F为SGC 7901细胞，三种细胞中G5-BGG/pGL3均摄取最高，摄取量与G5/pGL3、G5-GUA/pGL3和G5-BEN/pGL3摄取量有显著性差异(***p<0.001)；G5-BGG/pGL3摄取量高于阳性对照PEI 25K。
图5：G5-BGG/pEGFP-N2对HEK293T细胞定性转染图片，其中，
不同修饰比G5-BGG均具有较高转染效率，转染效率高于G5、G5-GUA、G5-BEN和阳性对照PEI 25K。
图6：PEI 1800-BGG/pEGFP-N2对HEK293T细胞定性转染图片，其中，
PEI 1800-BGG的转染效率显著PEI 1800，与阳性对照PEI 25K相当。
图7：G5-BGG/pGL3定量转染和血清稳定性，其中，
图A、C、D分别为HEK 293T、HeLa和SGC 7901细胞定量转染结果图，在三种细胞中，同一质量比条件下，转染效率G5-BGG>G5-BEN>G5-GUA>G5；在适宜质量比时，G5-BGG的转染效率可优于阳性对照PEI 25K，图B为G5-BGG/pGL3在不同百分浓度血清条件下对HEK293T细胞的定量转染结果图，血清浓度在0％～40％(v/v)范围内，G5-BGG/pGL3转染效率无明显变化；血清浓度在60％～100％(v/v)范围内，G5-BGG/pGL3转染效率略下降。
图8：G5-BGG/pTRAIL复合物细胞学药效，其中，
图A为给药后HeLa细胞存活率，G5-BGG/pTRAIL对HeLa细胞的抑制率为77.8％，高于G5/pTRAIL(10.1％)、G5-GUA/pTRAIL(17.9％)和G5-BEN/pTRAIL(21.7％)，存在的显著性差异(***p<0.001)；G5-BGG/pTRAIL抑制率高于阳性对照PEI 25K/pTRAIL；图B为给药后SGC7901细胞存活率，抑制率为G5-BGG/pTRAIL(71.1％)，高于G5/pTRAIL(2.2％)、G5-GUA/pTRAIL(19.4％)和G5-BEN/pTRAIL(21.7％)，存在的显著性差异(***p<0.001)；G5-BGG/pTRAIL抑制率高于阳性对照PEI 25K/pTRAIL。
图9：PVA水凝胶的表征与基因复合物的释放，其中，
图A为PVA溶液和PVA水凝胶照片；图B、C分别为弹性模量(G’)和粘性模量(G”)随strain、frequency变化图，两图中均显示PVA交联后G’在103数量级，大于G”(102数量级)，形成了PVA水凝胶；而strain小于0.1、frequency小于1rad/s时，PVA溶液的G’和G”值均小于1，且G”>G’，为溶液状态；图D为基因复合物自PVA水凝胶中累积释放量，在前2h释放40％，后缓慢释放，72h时累积释放量为81％，说明PVA水凝胶可缓慢释放基因复合物。
图10：载G5-BGG/pTRAIL水凝胶基因递释系统对抗HeLa皮下移植瘤药效与体内安全性评价，其中，
图A为给药后肿瘤体积变化曲线，G5-BGG组抑瘤效果显著优于其他组(n＝6，***p<0.001)；图B为肿肿瘤重量数据，G5-BGG组瘤重最小，与其他组相比存在显著性差异；图C、D、E、F分别是给药后2天小鼠体内谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿肌酐(CR)、尿酸(UA)指标数据，各组之间差异不显著。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1 5-溴甲基-N,N’-二叔丁氧羰基-1,3-间苯二甲酰胍的合成
将5-甲基间苯二甲酸(10g，55.54mmol)溶于150mL甲醇中，后逐滴缓慢加入4mL浓硫酸，80℃条件下回流6h后冷却至室温，缓慢加入饱和NaHCO3溶液至pH 8.0左右。二氯甲烷萃取，分液漏斗分离收集二氯甲烷，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤三次，无水硫酸镁干燥除去有机相中水分，减压干燥除去有机溶剂，得到中间体5-甲基间苯二甲酸甲酯(10.6g，50.94mmol)，产率为91.72％。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.40(H,s,Ph-H),7.96(2H,s,Ph-H),3.88(6H,s,-OCH3),2.38(3H,s,-CH3)ppm。
将5-甲基间苯二甲酸甲酯(8g，38.45mmol)溶于200mL四氯化碳中，加入7.2g溴代琥珀酰亚胺(NBS)和0.16g过氧化二苯甲酰(BPO)作为引发剂，氮气保护条件下90℃条件下回流反应8h，冷却至室温。减压蒸馏出去有机溶剂，所得固体用冰乙醇洗涤三次，真空干燥的到中间体5-溴甲基间苯二甲酸甲酯(7.2g，25.18mmol)，产率为65.48％。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.61(1H,s,Ph-H),8.26(2H,s,Ph-H),4.55(2H,s,-CH2Br),3.97(6H,s,-OCH3)ppm。
将5-溴甲基间苯二甲酸甲酯(6g，20.98mmol)溶于100mL冰醋酸中，再缓慢加入100mL40％氢溴酸，120℃条件下反应12h后冷却至室温，将反应体系逐滴滴加至1000mL冰水中，减压过滤的到固体粗产物，粗产物用乙腈重结晶，真空干燥后的到中间体5-溴甲基间苯二甲酸(3.2g，12.41mmol)，产率为59.13％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝13.20(2H,s,-COOH),8.41(1H,s,Ph-H),8.26(2H,s,Ph-H),4.88(2H,s,-CH2Br)ppm。
将5-溴甲基间苯二甲酸(1g，3.88mmol)溶于5mL氯仿中，冰盐水浴使体系温度降到0℃以下，无水和氮气保护条件下逐滴缓慢1.2mL草酰氯并在滴加过程中始终保持反应体系温度在0℃以下，反应过夜。将反应后体系减压蒸发至体系剩余2mL左右，得到中间体5-溴甲基间苯二甲酰氯，不做纯化直接用于后续反应。
将Boc-胍(2g，12.56mol)溶于5mLN,N二甲基甲酰胺中，加入1.5mLN,N-二异丙基乙胺(DIEA)，冰水浴和氮气保护条件下逐滴滴加上述5-溴甲基间苯二甲酰氯，并在滴加过程中保持反应体系温度不高于4℃，滴加结束后室温条件下反应12h。反应结束后将反应体系减压蒸发出去可挥发性溶剂，剩余液体加入10倍量的水，用乙酸乙酯萃取，分液漏斗分离收集有机相，有机相使用无水硫酸钠干燥。粗产物通过200目硅胶柱色谱分离纯化(洗脱液：石油醚/乙酸乙酯＝8/1)，得到白色固体5-溴甲基-N,N’-二叔丁氧羰基-1,3-间苯二甲酰胍(276mg，0.51mmol)，产率为13.18％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝11.03(2H,s,-NH-),9.68(2H,s,＝NH),8.76(1H,s,Ph-H),8.63(2H,m,Ph-H),8.30(2H,s,-NH-),4.84(2H,s,-CH2Br),1.48(18H,s,-Boc)ppm。
实施例2 G5-BGG、G5-GUA和G5-BEN的合成
将五代乙二胺为核心的聚酰胺-胺型树枝状聚合物(G5)和5-溴甲基-N,N’-二叔丁氧羰基-1,3-间苯二甲酰胍分别溶解于甲醇和N,N-二甲基甲酰胺中，混匀后加入少量DIEA，氮气保护60℃搅拌12h，减压蒸发有机溶剂，得到黄色粘稠状固体，然后将固体溶解在含有50％三氟乙酸的二氯甲烷中，并将溶液在室温下搅拌6小时后减压蒸发有机溶剂，后加入适量水溶解，10％NaOH溶液将体系pH调节至8左右后透析(截流分子量500～1000Da)，透析液先用二甲基亚砜，后换为水，冻干得到产物，通过核磁共振氢谱确定其修饰比例为1，简写为G5-BGG。核磁图谱为1H-NMR(400MHz,D2O):δ＝8.04(3H,s,Ph-H),3.92(10H,s,-NH-CH2-)3.47-3.20(520H,m,-NH-CH2-),3.13-2.49(1014H,m,-CH2-CH2-),2.38(504H,s,-CH2CO-)ppm。
通过相同的方法按不同摩尔比的G5和5-溴甲基-N,N’-二叔丁氧羰基-1,3-间苯二甲酰胍反应，得到不同修饰比的材料，修饰比18、38和95，分别简写为G5-BGG(18)、G5-BGG(38)和G5-BGG(95)，核磁共振氢谱结果如下：G5-BGG(18)1H-NMR(400MHz,D2O):δ＝8.44-7.66(52H,m,Ph-H),3.76(24H,s,-NH-CH2-)3.42-3.04(520H,m,-NH-CH2-),3.02-2.43(825H,m,-CH2-CH2-),2.31(504H,s,-CH2CO-)ppm；G5-BGG(38)1H-NMR(400MHz,D2O):δ＝8.53-7.55(114H,m,Ph-H),3.82(54H,s,-NH-CH2-)3.60-3.08(514H,m,-NH-CH2-),3.08-2.44(803H,m,-CH2-CH2-),2.32(504H,s,-CH2CO-)ppm；G5-BGG(95)1H-NMR(400MHz,D2O):δ＝8.48-7.81(286H,m,Ph-H),3.76(104H,s,-NH-CH2-)3.49-3.03(520H,m,-NH-CH2-),3.03-2.40(742H,m,-CH2-CH2-),2.29(504H,s,-CH2CO-)ppm。
将G5、1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和DIEA溶于水中，室温条件下反应24h后用水深度透析，冻干后得到G5-GUA。G5-GUA的修饰比例采用游离氨基定量方法确定，修饰比为3，作后续实验对照品。
将G5溶解在甲醇中，后加入适量苄溴和DIEA，氮气保护60℃搅拌6h，减压蒸发有机溶剂后透析(截流分子量500～1000Da)，透析液先用二甲基亚砜，后换为水，冻干得到G5-BEN，通过核磁共振氢谱确定其修饰比例为2，作后续实验对照品。核磁谱图为1H-NMR(400MHz,D2O):δ＝8.03(8H,s,Ph-H),3.90(35H,s,-NH-CH2-),3.44-3.18(520H,m,-NH-CH2-),3.13-2.48(1014H,s,-CH2-CH2-),2.37(504H,s,-CH2CO-)ppm。
实施例3 PEI 1800-BGG的合成
将PEI 1800和5-溴-N,N’-二叔丁氧羰基-1,3-间苯二甲酰胍溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌条件下加入醋酸钯(Pd(OAc)2)、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(BINAP)和碳酸铯(CsCO3)，氮气保护，120℃反应过夜。所得混合物经8000rpm离心5min后，吸取上清液，弃沉淀。在冰浴条件下在上清液中加入含有50％三氟乙酸的二氯甲烷中，室温搅拌过夜。减压蒸发有机溶剂，后加入适量蒸馏水溶解，用10％的NaOH溶液将体系pH调节至8左右后透析(截留分子量500-1000Da)，透析液先用二甲基亚砜，后用蒸馏水，收集透析袋中液体，冻干得PEI 1800-BGG，通过核磁共振氢谱确定其修饰比例为1。1H NMR(400MHz,D2O)δ7.83(3H,s,Ph-H),3.19(s,34H,-NH-CH2-),2.93–2.10(m,140H,-CH2CH2-)ppm。
实施例4 G5-BGG/pDNA复合物的制备和表征
基因复合物制备方法为将pGL3溶液与载体材料溶液等体积混合，pGL3终浓度为40μg/mL，立刻涡旋30s，室温放置30min，得新鲜制备的复合物溶液，材料浓度根据质量比调整。复合物中载体与pGL3的比例用质量比表示，用马尔文的NanoZS粒径仪分别测量各样品的粒径和Zeta电位，结果如图1所示。
实施例5琼脂糖凝胶电泳阻滞实验
琼脂糖凝胶电泳阻滞实验考察载体材料对pGL3的压缩能力，具体实验方案如下：称取0.3g琼脂糖于锥形瓶中，加入30ml的1×TAE缓冲液，在微波炉(中高火)中非连续加热2-3次，至Agarose全部溶解。室温冷却至50℃加入3μLgel red，混合均匀后灌胶，插入梳子。室温放置40min或稍长时间，待胶凝固后拔出梳子。将电泳槽中预先倒入1×TAE，放入胶，液体没过胶面即可。随后，将样品(制备方法同上)分别加至样品槽中进行电泳[电泳条件：电压120V，1×TAE，40min，每孔10μl]。DNA条带在紫外下观察并拍照，结果如图2所示。
实施例6材料细胞毒性实验
铺96孔细胞培养板，每孔加入200μl含10％血清的DMEM培液，含有3×103cells/孔，37℃，5％CO2条件下培养过夜，将材料加入96孔板中，每孔20μl，每个样品设置3个复孔，放入细胞培养箱中孵育4h，换含10％血清的DMEM培液继续培养至48h，配制5mg/mL的MTT溶液，0.22μm的滤膜过滤，加入到96孔板中，每孔20μl，培养4h后，弃去细胞培养液，每孔加入200μl DMSO，室温放置10min后，摇晃，使紫色结晶完全溶解，酶标仪测定490nm波长下的吸光度，结果如图3所示。
实施例7细胞摄取实验
TOTO-3标记pGL3质粒制备：取10μLTOTO储备液(1mM)，溶于500μL的PBS中，得TOTO工作液。另取500μL0.8mg/mL的DNA溶液，加入上述TOTO工作液中，涡旋混匀，室温放置30min，得TOTO-3标记的DNA溶液，浓度为0.4mg/mL，4℃保存。使用时稀释至所需浓度，激发波长为642nm，发射波长为660nm；
按照实施例4，使用不同材料和TOTO-3标记的pGL3质粒制备不同材料的基因复合物(质量比为12:1)；将细胞用胰酶消化、重悬、计数，使用完全培养液将细胞密度稀释为1×105个/mL，于12孔板中每孔加1ml细胞悬液，培养过夜使细胞贴壁；加入新鲜基因复合物，孵育4h后胰酶消化细胞，PBS重悬，流式细胞仪检测，结果如图4所示，在HEK 293T、HeLa和SGC7901三种细胞中，G5-BGG/pGL3均摄取最高。
实施例8绿色荧光蛋白质粒的细胞转染实验
将细胞以2×104个/孔接种到48孔板上，每孔含0.5mLDMEM培液(含10％血清)，培养过夜至细胞汇合度达到70％-80％，每孔将原细胞培液替换为450μL新鲜细胞培液后加入新鲜制备的G5-BGG/pEGFP-N2、G5-BGG(18)/pEGFP-N2、G5-BGG(38)/pEGFP-N2、G5-BGG(95)/pEGFP-N2、G5/pEGFP-N2、G5-GUA/pEGFP-N2、G5-BEN/pEGFP-N2、PEI 1800/pEGFP-N2、PEI1800-BGG/pEGFP-N2和PEI 25K/pEGFP-N2复合物(质量比为12)，每孔50μl，含2μg pEGFP-N2质粒，37℃培养4h后，换成新鲜的细胞培液，37℃继续培养至48h，置荧光显微镜下观察，结果如图5和图6所示。
实施例9虫荧光素酶定量转染实验及血清稳定性考察
细胞定量转染实验：将细胞以2×104个/孔接种到48孔板上，每孔含0.5mL DMEM培液(含10％血清)，培养过夜至细胞汇合度达到70％-80％，每孔将原细胞培液替换为450μL新鲜细胞培液后加入新鲜制备的载体材料/pGL3复合物(质量比为4:1、8:1、12：1和16:1)，每孔50μl，含2μgpGL3，37℃培养4h后，换成新鲜细胞培液，37℃继续培养至48h，然后弃去培养液，每孔加入100μl的细胞裂解液，放置1-2min，用移液器吹打辅助细胞裂解，然后将细胞裂解液转移至1.5mL的离心管中，15000×g，4℃，离心2min，取上清液转移至EP管中待测定。
血清稳定性考察：将细胞以2×104个/孔接种到48孔板上，每孔含0.5mL DMEM培液(含10％血清)，培养过夜至细胞汇合度达到70％-80％。配置不同百分浓度血清的DMEM培养液，每孔将原细胞培液替换为450μL不同血清浓度细胞培液后加入新鲜制备的载体材料/pGL3复合物(质量比为12)，每孔50μl，含2μg pGL3，37℃培养4h后，换成新鲜细胞培液，37℃继续培养至48h，然后弃去培养液，每孔加入100μl的细胞裂解液，放置1-2min，用移液器吹打辅助细胞裂解，然后将细胞裂解液转移至1.5mL的离心管中，15000×g，4℃，离心2min，取上清液转移至EP管中待测定。
根据Promega试剂盒操作指南，将虫荧光素酶底物配制成工作溶液，然后取40μl上清液置于测试管中，加入90μl虫荧光素酶底物，放入超弱发光分析仪中测定发光强度，采集时间为10s，时间间隔为0.1s，然后用MicroBCA法测定细胞的总蛋白含量，转染结果用单位质量总蛋白所发出的荧光强度表示(RLU/mg protein)。结果如图7所示，三种细胞中G5-BGG转染效率最高，在40％血清浓度及以下，G5-BGG/pDNA较稳定，转染效率无明显变化。
实施例10细胞药效实验
用pORF-hTRAIL作为治疗基因进行体外细胞凋亡实验研究以评价BGG修饰的载体材料包载治疗基因后杀伤肿瘤细胞的能力。将HeLa细胞和SGC 7901细胞以3×103个/孔的密度接种到96孔板上，每孔含200μLDMEM培液(10％血清)，培养过夜至细胞汇合度达到70％-80％，每孔换成180μL新鲜的细胞培液，然后加入新鲜制备的载体材料/pORF-hTRAIL基因复合物(HeLa细胞质量比为12，SGC 7901细胞的质量比为4)，每孔20μL，含0.8μgpORF-hTRAIL，37℃培养6h或12h后换成新鲜培养液，继续培养至48h，配制5mg/mL的MTT溶液，0.22μm的滤膜过滤，加入到96孔板中，每孔20μl，培养4h后，弃去细胞培养液，每孔加入200μlDMSO，室温放置10min后，摇晃，使紫色结晶完全溶解，酶标仪测定490nm波长下的吸光度，根据吸光度计算细胞存活率，结果如图8所示，G5-BGG/pTRAIL组细胞存活率最低。
实施例11水凝胶基因递释系统的构建及表征
配置聚乙烯醇(PVA，Mw 89000-98000)溶液，浓度为10％；配置对苯二硼酸溶液，浓度为10mg/mL。制备基因复合物，将基因复合物与10％PVA溶液等体积混合，混匀后加入1/2体积的对苯二硼酸溶液，加入后对苯二硼酸与PVA即交联形成水凝胶，流变仪测定PVA溶液及PVA水凝胶模量值，结果如图9所示；
四甲基罗丹明(TRITC)标记小牛胸腺的制备：取2mg小牛胸腺溶解到1mL0.2M的Na2CO3缓冲液(pH9.7)中，加入TRITC 1mg，4℃反应8h。反应液用G15凝胶柱分离，收集前段红色部分，冻干，的TRITC标记的小牛胸腺，激发波长为541nm，发射波长为567nm；
使用PBS将G5-BGG配置为20mg/mL，质粒浓度为1.6mg/mL。1.5mL的EP管中加入150μL TRITC标记的小牛胸腺，再逐滴滴加150μLG5-BGG溶液，涡旋30s后静置30min。将300μL基因复合物与等体积10％PVA(Mw89000-98000)溶液混合均匀，混匀后加入300μL 10mg/mL的对苯二硼酸溶液，静置30min使充分交联形成凝胶。在凝胶中加入3mL PBS，在不同的时间点每次取出1mL释放液，在补充1mLPBS。将取出的溶液用十二烷基硫酸钠(SDS)溶液破坏其中基因复合物，酶标仪测定荧光强度，计算释放量，结果如图9所示。
实施例12体内药效学实验及体内安全性考察
HeLa细胞皮下瘤模型构建：将HeLa细胞用胰酶消化，PBS洗涤后定容至每毫升4×107个细胞，每只裸鼠右侧近腋窝皮下注射100μL，至肿瘤体积大小为100mm3(瘤体积＝肿瘤长径×肿瘤短径2÷2)左右时开始给药。
体内给药样品制备：使用PBS将各材料配置为20mg/mL，质粒浓度为1.6mg/mL。1.5mL的EP管中加入220μL质粒，再逐滴滴加220μL材料溶液，涡旋30s后静置30min。将440μL基因复合物与等体积10％PVA(Mw89000-98000)溶液混合均匀。配置对苯二硼酸溶液，浓度为10mg/mL。
给药方式：每只裸鼠瘤旁注射100μL的PVA/基因复合物的混合溶液，同一位置再注射50μL对苯二硼酸，PVA与对苯二硼酸可交联形成凝胶，可使基因复合物在瘤旁缓慢释放，达到持续治疗的目的。仅给药1次，给药前测量肿瘤瘤径和裸鼠体重，之后每两天测量瘤径。给药后第14天将老鼠处死，将肿瘤称重。结果见附图10。
体内安全性使用正常未荷瘤ICR小鼠考察，基因复合物制备和给药方式同上。给药后两天后对每只小鼠取血，3000rpm离心5min后取血清。体内安全性选择肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和肾功能指标尿肌酐(CR)、尿酸(UA)反应。血清中四种物质浓度使用全自动生化分析仪测定，结果如图10所示。

Claims (14)

1.一种非病毒载体，其特征在于，所述的非病毒载体的结构如式I所示：
Figure FDA0002556279020000011
式I中：
R代表阳离子材料，选自聚酰胺-胺、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、壳聚糖、聚丙烯亚胺、聚氨酯、聚磷腈、聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯、精蛋白、精胺或阳离子脂质；
X代表连接基团，选自碳氮键(-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-CH2-CH2-、-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-或-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-)、酰胺键(-NH-CO-)、亚胺键(-N＝C-)、脲(-NH-CO-NH-)、硫脲(-NH-CS-NH-)或脒(-N＝CH-NH-)；
n是1～100之间的任意数字。
2.按权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述的非病毒载体的结构如式II所示：
Figure FDA0002556279020000012
式II中：
PAMAM为乙二胺为核心的聚酰胺-胺型树枝状聚合物，枝化代数是1～8之间的任意代数；n是1～100之间的任意数字。
3.一种基因复合物，其特征是，由权利要求1或2所述的非病毒载体包载报告基因、治疗基因或基因疫苗，形成基因复合物。
4.按权利要求3所述的基因复合物，其特征是，所述的基因复合物包载的报告基因、治疗基因或基因疫苗是DNA、siRNA、mRNA、shRNA、lncRNA或反义核苷酸。
5.按权利要求1或2所述的非病毒载体，其特征是，所述的非病毒载体具有压缩基因、细胞摄取、内涵体/溶酶体逃逸和跨越核膜的能力。
6.按权利要求3所述的基因复合物，其特征是，所述基因复合物的给药方式是注射给药、鼻粘膜给药、肺部给药、皮肤给药、眼部给药或口腔粘膜给药。
7.权利要求3所述的基因复合物在制备用于治疗癌症、感染性疾病、遗传性疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的药物中的用途。
8.权利要求3所述的基因复合物在制备用于病毒感染性疾病的免疫保护制剂中的用途，其中，递送基因疫苗诱导呼吸道粘膜免疫。
9.一种水凝胶基因递释系统，其特征是，由权利要求3所述的基因复合物分散于具有生物相容性的高分子聚合物溶液中，形成水凝胶基因递释系统。
10.按权利要求9所述的水凝胶基因递释系统，其特征在于，所述的具有生物相容性的高分子聚合物，选自聚乙烯醇、聚乳酸、聚乙二醇、聚乳酸(羟基乙酸)-聚乙二醇-聚乳酸(羟基乙酸)嵌段共聚物、聚磷酸酯、聚碳酸酯、甲壳质、壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、纤维素、琼脂、淀粉衍生物、葡聚糖衍生物、胶原、明胶、血纤蛋白、蚕丝蛋白、聚磷腈、聚乙醇酸、聚己内酯、聚反丁烯二酸丙二醇酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸低聚乙二醇)、卡波姆或泊洛沙姆中的任意一种或者几种。
11.按权利要求9所述的水凝胶基因递释系统，其特征是，所述的水凝胶基因递释系统缓慢释放基因复合物。
12.按权利要求9所述的水凝胶基因递释系统，其特征是，其给药方式是注射给药、鼻粘膜给药、肺部给药、皮肤给药、眼部给药或口腔粘膜给药。
13.权利要求9所述的水凝胶基因递释系统在制备用于治疗癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的药物中的用途。
14.权利要求9所述的水凝胶基因递释系统在制备用于病毒感染性疾病的免疫保护制剂中的用途，其中，递送基因疫苗诱导呼吸道粘膜免疫。
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