ES2915692T3 - Nanopartículas portadoras y composiciones, métodos y sistemas relacionados - Google Patents

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phenylboronic acid
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Mark Davis
Christopher Alabi
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California Institute of Technology CalTech
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Abstract

Una nanopartícula que comprende un polímero que contiene un poliol y un polímero que contiene un ácido fenilborónico, en donde el polímero que contiene el ácido fenilborónico está acoplado con el polímero que contiene el poliol con un enlace covalente reversible, y en donde la nanopartícula está configurada para presentar el polímero que contiene el ácido fenilborónico a un entorno externo a la nanopartícula, y en donde el polímero que contiene el poliol comprende una o más de las siguientes unidades estructurales de Fórmula (I), (II) o (III) **(Ver fórmula)** en donde A y B se obtienen del acoplamiento de A' y B' donde A' es independientemente: **(Ver fórmula)** o **(Ver fórmula)** en las que n es 1-20; y en donde B' es: **(Ver fórmula)** en las que q es 1-20; p es 20-200; y L es un grupo saliente; o en donde la unidad estructural de fórmula (III) es: **(Ver fórmula)** en la que n es 1-20; y en donde el polímero que contiene el ácido fenilborónico comprende al menos un grupo ácido fenilborónico terminal y tiene la fórmula general: **(Ver fórmula)** en donde: R3 y R4 son independientes (CH2CH2O)t, donde t es de 2 a 2000, X1 es -NH-C(=O)-, -S-S-, -C(=O)-NH-, -O-C(=O)- o -C(=O)-O-, Y1 es un grupo fenilo, en donde r=1, a=0 y b=1, y en donde el grupo funcional 1 y el grupo funcional 2 son iguales o diferentes y comprenden independientemente -B(OH)2, -OCH3, -(X1)-(Y1)-B(OH)2, -COOH, -NH2, u -OH.

Description

DESCRIPCIÓN
Nanopartículas portadoras y composiciones, métodos y sistemas relacionados
Campo
La presente descripción se refiere a nanopartículas portadoras y, en particular, a nanopartículas adecuadas para administrar compuestos de interés y composiciones, métodos y sistemas relacionados.
Antecedentes
La administración efectiva de compuestos de interés a células, tejidos, órganos y organismos ha sido un desafío en biomedicina, formación de imágenes y otros campos donde es deseable la administración de moléculas de varios tamaños y dimensiones a un objetivo predeterminado.
Ya sea para examen patológico, tratamiento terapéutico o para estudios de biología fundamental, se conocen y utilizan varios métodos para administrar diversas clases de biomateriales y biomoléculas que normalmente están asociadas con una actividad biológica y/o química de interés.
A medida que aumenta el número de moléculas adecuadas para ser utilizadas como agentes químicos o biológicos (p. ej., fármacos, productos biológicos, productos terapéuticos o agentes de formación de imágenes), se ha demostrado que el desarrollo de sistemas de administración adecuados para usar con compuestos de diversa complejidad, dimensiones y naturaleza química es particularmente desafiante (Davis Mark E., CZhao (Georgia) y Shin Dong M "Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer" en Nature 2008 vol. 7, páginas 771­ 782, Duncan Ruth "Polymer Conjugates as anticancer nanomedicines" Nature 2006 vol. 6, páginas 688-701, Allen Theresa M "Ligand-Targeted Therapeutics In Anticancer Therapy" en Natire 2002 vol. 2 páginas 750-763, Liu Yemin y Reineke Theresa M. "Hydroxyl Stereochemistry and Amine Number within Poly(glycoamidoamine)s Affect Intracellular DNA Delivery" en J.Am.Chem. Soc. 2005, 127, 3004-3015).
Las nanopartículas son estructuras útiles como portadores para administrar agentes con varios métodos de administración. Existen varios sistemas de administración de nanopartículas, que utilizan una variedad de estrategias diferentes para empaquetar, transportar y administrar un agente a objetivos específicos.
Resumen
En el presente documento se proporcionan nanopartículas y composiciones, métodos y sistemas relacionados que, en varias realizaciones, proporcionan una herramienta multifuncional para la administración eficaz y específica de un compuesto de interés. En particular, en varias realizaciones, las nanopartículas descritas en el presente documento se pueden usar como un sistema flexible para transportar y administrar una amplia gama de moléculas de varios tamaños, dimensiones y naturaleza química a objetivos predeterminados.
Según un primer aspecto, se describe una nanopartícula que comprende un polímero que contiene un poliol y un polímero que contiene un ácido fenilborónico según la reivindicación 1. En la nanopartícula, el polímero que contiene ácido borónico se acopla con el polímero que contiene un poliol y la nanopartícula está configurada para presentar el polímero que contiene ácido borónico a un entorno externo a la nanopartícula. En la nanopartícula, la nanopartícula puede transportar uno o más compuestos de interés, como parte o unidos al polímero que contiene un poliol y/o el polímero que contiene un ácido borónico. La reivindicación 1 define una nanopartícula que comprende un polímero que contiene un poliol y un polímero que contiene un ácido fenilborónico, en donde el polímero que contiene el ácido fenilborónico está acoplado con el polímero que contiene el poliol con un enlace covalente reversible, y en donde la nanopartícula está configurada para presentar el polímero que contiene el ácido fenilborónico a un entorno externo a la nanopartícula, y en donde el polímero que contiene el poliol comprende una o más de las siguientes unidades estructurales de Fórmula (I), (II) o (III) como se define en la reivindicación 1 y en donde el polímero que contiene el ácido fenilborónico comprende al menos un grupo ácido fenilborónico terminal y tiene la fórmula general (XXX): en donde R3 y R4 son independientemente, son independientemente (CH2CH2O)t , donde t es de 2 a 2000, X1 es -NH-C(=O)-, -S-S-, -C(=O)-NH-, -O-C(=O)- o -C(=O)-O-, Y1 es un grupo fenilo, en donde r=1, a=0 y b=1, y en donde el grupo funcional 1 y el grupo funcional 2 son iguales o diferentes y comprenden independientemente -B(OH)2 , -OCH3 , -(X1)-(Y1)-B(OH)2 , -COOH, -NH2 o -OH.
Según un segundo aspecto, se describe una composición según la reivindicación 6. La composición comprende una nanopartícula descrita en el presente documento y un vehículo y/o excipiente adecuados.
Se describe, pero no se reivindica, un método para administrar un compuesto a un objetivo. El método comprende poner en contacto el objetivo con una nanopartícula descrita en el presente documento, en donde el compuesto está comprendido en el polímero que contiene un poliol o en el polímero que contiene un ácido borónico de la nanopartícula descrita en el presente documento.
Según un tercer aspecto, se describe un sistema para administrar un compuesto a un objetivo según la reivindicación 8. El sistema comprende al menos un polímero que contiene un poliol y polímero que contiene un ácido borónico capaz de unión recíproca a través de un enlace covalente reversible, para ensamblarse en una nanopartícula descrita en el presente documento que comprende el compuesto.
Se describe, pero no se reivindica, un método para administrar un compuesto a un individuo. El método comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de una nanopartícula descrita en el presente documento, en donde el compuesto está comprendido en el polímero que contiene un poliol y/o en el polímero que contiene un ácido borónico.
Se describe, pero no se reivindica, un sistema para administrar un compuesto a un individuo. El sistema comprende, al menos un polímero que contiene un poliol y polímero que contiene un ácido borónico capaz de unión recíproca a través de un enlace covalente reversible, para ensamblarse en una nanopartícula descrita en el presente documento que une el compuesto que se va a administrar al individuo de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.
Según un cuarto aspecto, se describe un método para preparar una nanopartícula que comprende un polímero que contiene un poliol y un polímero que contiene un ácido borónico según la reivindicación 10. El método comprende poner en contacto el polímero que contiene polioles con el polímero que contiene un ácido borónico durante un tiempo y en condiciones para permitir el acoplamiento del polímero que contiene poliol con el polímero que contiene un ácido borónico.
Se describen varios polímeros que contienen un ácido borónico que se ilustran en detalle en las siguientes secciones de la presente descripción.
Se describen varios polímeros que contienen polioles, que se ilustran en detalle en las siguientes secciones de la presente descripción.
Las nanopartículas descritas en el presente documento y las composiciones, métodos y sistemas relacionados se pueden usar en varias realizaciones como una estructura molecular flexible adecuada para transportar compuestos de varios tamaños, dimensiones y naturaleza química.
Las nanopartículas descritas en el presente documento y las composiciones, métodos y sistemas relacionados se pueden usar en varias realizaciones como sistemas de administración que pueden proporcionar protección del compuesto transportado contra la degradación, el reconocimiento por el sistema inmunitario y la pérdida debido a la combinación con proteínas séricas o células sanguíneas.
Las nanopartículas descritas en el presente documento y las composiciones, métodos y sistemas relacionados se pueden usar en varias realizaciones como sistemas de administración caracterizados por la estabilización estérica y/o la capacidad de administrar el compuesto a objetivos específicos tales como tejidos, tipos de células específicos dentro de un tejido e incluso ubicaciones intracelulares específicas dentro de ciertos tipos de células.
Las nanopartículas descritas en el presente documento y las composiciones, métodos y sistemas relacionados pueden diseñarse en varias realizaciones, para liberar un compuesto transportado de una manera controlable, incluida la liberación controlada de múltiples compuestos dentro de una misma nanopartícula a diferentes velocidades y/o tiempos.
Las nanopartículas descritas en el presente documento y las composiciones, métodos y sistemas relacionados se pueden usar en varias realizaciones, para administrar compuestos con especificidad y/o selectividad mejoradas durante el direccionamiento y/o reconocimiento mejorado del compuesto por el objetivo en comparación con ciertos sistemas de la técnica.
Las nanopartículas descritas en el presente documento y las composiciones, métodos y sistemas relacionados se pueden usar en varias realizaciones en relación con aplicaciones en donde es deseable la administración controlada de un compuesto de interés, incluyendo, pero no limitadas a aplicaciones médicas, tales como aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y clínicas. Las aplicaciones adicionales comprenden el análisis biológico, aplicaciones veterinarias y la administración de compuestos de interés a organismos distintos de los animales y, en particular, a plantas.
Los detalles de una o más realizaciones de la descripción se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción detallada y los ejemplos a continuación. Otras características, objetos y ventajas serán evidentes a partir de la descripción detallada, ejemplos y dibujos, y de las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos, que se incorporan y constituyen parte de esta memoria descriptiva, ilustran una o más realizaciones de la presente descripción y, junto con la descripción detallada y los ejemplos, sirven para explicar los principios y las implementaciones de la descripción.
La figura 1 muestra una representación esquemática de una nanopartícula y un método relacionado para la formación relevante en ausencia de un compuesto que contiene ácido borónico. El panel A muestra una representación esquemática de un polímero que contiene un poliol (MAP, 4) y un compuesto de interés (ácido nucleico) según una realización descrita en el presente documento. El panel B muestra una nanopartícula formada tras el ensamblaje del polímero que contiene un poliol y el compuesto que se muestra en el panel A.
La figura 2 muestra una representación esquemática de una nanopartícula y un método de fabricación relacionado según una realización de la presente descripción. El panel A muestra un polímero que contiene un poliol (MAP, 4) y un polímero que contiene un ácido borónico (BA-PEG, 6) junto con una molécula de interés (ácido nucleico) según una realización de la presente descripción. El panel B muestra una nanopartícula estabilizada con BA-pegilado formada tras el ensamblaje de los polímeros y el compuesto que se muestra en el panel A.
La figura 3 muestra la formación de un complejo que comprende polímeros que contienen polioles y un compuesto de interés según una realización descrita en el presente documento. En particular, la figura 3, muestra los resultados de un ensayo de retraso en gel del MAP con ADN plasmídico según una realización de la presente descripción. Se carga una escalera de ADN en el carril 1. Los carriles 2-8 muestran el ADN de plásmido combinado con MAP de relación de cargas incrementada progresivamente. La relación de cargas se define como la cantidad de cargas positivas en el MAP dividida entre la cantidad de cargas negativas en el ácido nucleico.
La figura 4 muestra la formación de un complejo que comprende polímeros que contienen polioles y un compuesto de interés según una realización descrita en el presente documento. En particular, la figura 4 muestra los resultados de un ensayo de retraso en gel del MAP con ARNip según una realización de la presente descripción. Se carga una escalera de ADN en el carril 1. Los carriles 2-8 muestran el ARNip combinado con MAP de relación de cargas incrementada progresivamente.
La figura 5 muestra propiedades de nanopartículas según algunas realizaciones descritas en el presente documento. En particular, la figura 5 muestra un diagrama que ilustra un gráfico de tamaño de partículas (determinado a partir de mediciones de dispersión de luz dinámica (DLS)) frente a relación de cargas y potencial zeta (una propiedad que se relaciona con la carga superficial de la nanopartícula) frente a la relación de cargas para nanopartículas de MAP-plásmido de acuerdo con una realización de la presente descripción.
La figura 6 muestra propiedades de nanopartículas según algunas realizaciones descritas en el presente documento. En particular, la figura 6 muestra un diagrama que ilustra un gráfico de tamaño de partículas (DLS) frente a la relación de cargas y potencial zeta frente a la relación de cargas para nanopartículas de MAP-plásmido BA-PEGilado según una realización de la presente descripción.
La figura 7 muestra la estabilidad en solución salina de las nanopartículas de MAP-plásmido BA-PEGilado de acuerdo con una realización descrita en el presente documento. Gráfico A: 5:1 BA-PEG np 1X PBS después de 5 min; Gráfico B: 5:1 BA-PEG np, dializado 3X con 100 kDa 1X PBS después de 5 min; Gráfico C: 5:1 prePEGilado con BA-PEG 1X PBS después de 5 min; Gráfico D: 5:1 prePEGilado con bA-PEG, dializar 3X con 100kDa PBS después de 5 min.
La figura 8 muestra la administración de un agente a células humanas in vitro con nanopartículas de acuerdo con una realización descrita en el presente documento. En particular, la figura 8 muestra un diagrama que ilustra un gráfico de unidades relativas de luz (RLU) que son una medida de la cantidad de proteína luciferasa expresada desde el plásmido pGL3 que se ha administrado a las células frente a la relación de cargas para una transfección de MAP/pGL3 en células HeLa de acuerdo con una realización de la presente descripción.
La figura 9 muestra la administración de un agente a un objetivo con nanopartículas de acuerdo con una realización descrita en el presente documento. En particular, la figura 9, muestra un diagrama que ilustra un gráfico de supervivencia celular frente a la relación de cargas después de una transfección de MAP/pGL3 de acuerdo con una realización de la presente descripción. Los datos de supervivencia son para los experimentos que se muestran en la figura 8.
La figura 10 muestra la administración de múltiples compuestos a un objetivo con nanopartículas de acuerdo con una realización descrita en el presente documento. En particular, la figura 10 muestra un diagrama que ilustra un gráfico de unidades relativas de luz (RLU) frente al tipo de partícula para una cotransfección de partículas MAP que contienen pGL3 y siGL3 con una relación de cargas de 5+/- en células HeLa según una realización descrita en el presente documento. La expresión siCON indica un ARNip con una secuencia de control.
La figura 11 muestra la administración de un compuesto a un objetivo con nanopartículas de acuerdo con una realización descrita en el presente documento. En particular, la figura 11 muestra un gráfico de unidades relativas de luz (RLU) frente a la concentración de siGL3 para una administración de MAP/siGL3 con una relación de cargas de 5+/- en células HeLa-Luc según una realización de la presente descripción.
La figura 12 muestra una representación esquemática de una síntesis de un polímero que contiene un ácido borónico que presenta un ligando dirigido según algunas realizaciones descritas en el presente documento. En particular la figura 12, muestran un esquema para una síntesis de ácido borónico-disulfuro de PEG-transferrina de acuerdo con una realización de la presente descripción.
La figura 13 muestra una representación esquemática de una síntesis de una nanopartícula según algunas realizaciones descritas en el presente documento. En particular, la figura 13 muestra un esquema para una formulación de una nanopartícula con polímero de ácido múcico-campotecina (polímero de ácido múcico-CPT) en agua según una realización de la presente descripción.
La figura 14 muestra una tabla que resume los tamaños de partículas y los potenciales zeta de las nanopartículas formadas a partir del polímero de ácido múcico-CPT conjugado en agua, preparadas según una realización de la presente descripción.
La figura 15 muestra una representación esquemática de una síntesis de una nanopartícula según algunas realizaciones descritas en el presente documento. En particular, la figura 15 muestra una formulación de una nanopartícula con ácido borónico-PEGilado con polímero de ácido múcico-CPT y ácido borónico-disulfuro-PEG5000 en agua según una realización de la presente descripción.
Descripción detallada
En el presente documento se proporcionan nanopartículas y composiciones, métodos y sistemas relacionados que pueden usarse en relación con la administración de un compuesto de interés (en el presente documento también carga) comprendido en las nanopartículas.
El término "nanopartícula", como se usa en el presente documento, indica una estructura compuesta de dimensiones de nanoescala. En particular, las nanopartículas son típicamente partículas de un tamaño en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 nm, y generalmente son esféricas, aunque son posibles diferentes morfologías dependiendo de la composición de las nanopartículas. La parte de la nanopartícula que entra en contacto con un entorno externo a la nanopartícula generalmente se identifica como la superficie de la nanopartícula. En las nanopartículas descritas en el presente documento, la limitación de tamaño se puede restringir a dos dimensiones y, por lo tanto, las nanopartículas descritas en el presente documento incluyen una estructura compuesta que tiene un diámetro de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 nm, donde el diámetro específico depende de la composición de la nanopartícula y del uso previsto de la nanopartícula según el diseño experimental. Por ejemplo, las nanopartículas para usar en varias aplicaciones terapéuticas típicamente tienen un tamaño de aproximadamente 200 nm o menos, y las que se utilizan, en particular, para la administración asociada al tratamiento del cáncer típicamente tienen un diámetro de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nm.
Las propiedades deseables adicionales de la nanopartícula, tales como las cargas superficiales y la estabilización estérica, también pueden variar según la aplicación específica de interés. Las propiedades de ejemplo que pueden ser deseables en aplicaciones clínicas tales como el tratamiento del cáncer se describen en Davis et al, 2008, Duncan 2006 y Allen 2002. Un experto en la técnica puede identificar propiedades adicionales al leer la presente descripción. Las dimensiones y propiedades de las nanopartículas pueden detectarse mediante técnicas conocidas en la materia. Las técnicas de ejemplo para detectar dimensiones de partículas incluyen, pero no se limitan a dispersión de luz dinámica (DLS) y una variedad de microscopías tales como microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). Las técnicas de ejemplo para detectar la morfología de las partículas incluyen, pero no se limitan a TEM y AFM. Las técnicas de ejemplo para detectar cargas superficiales de la nanopartícula incluyen, pero no se limitan al método del potencial zeta. Las técnicas adicionales adecuadas para detectar otras propiedades químicas comprenden RMN de 1H, 11B y 13C y 19F, espectroscopias UV/Vis e infrarroja/Raman y espectroscopia de fluorescencia (cuando se utilizan nanopartículas en combinación con marcadores fluorescentes) y técnicas adicionales identificables por un experto en la técnica.
Las nanopartículas y las composiciones, métodos y sistemas relacionados que se describen en el presente documento se pueden usar para administrar un compuesto de interés y, en particular, un agente a un objetivo predeterminado.
El término "administrar" y "administración" como se usa en el presente documento indica la actividad de afectar a la ubicación espacial de un compuesto y, en particular, controlar dicha ubicación. En consecuencia, la administración de un compuesto en el sentido de la presente descripción indica la capacidad de afectar a la ubicación y al movimiento del compuesto en un momento determinado bajo un determinado conjunto de condiciones, de modo que la ubicación y el movimiento del compuesto en esas condiciones se alteran con respecto a la ubicación y movimiento que de otro modo tendría el compuesto.
En particular, la administración de un compuesto con respecto a un punto final de referencia indica la capacidad de controlar la ubicación y el movimiento del compuesto para que el compuesto finalmente se sitúe en el punto final de referencia seleccionado. En un sistema in vitro, la administración de un compuesto está normalmente asociada a una modificación correspondiente de las propiedades y actividades detectables químicas y/o biológicas del compuesto. En un sistema in vivo, la administración de un compuesto también está asociada típicamente con la modificación de la farmacocinética y posiblemente la farmacodinámica del compuesto.
La farmacocinética de un compuesto indica la absorción, distribución, metabolismo y excreción del compuesto del sistema, típicamente proporcionado por el cuerpo de un individuo. En particular, el término "absorción" indica el proceso de entrada de una sustancia en el cuerpo, el término "distribución" indica la dispersión o diseminación de sustancias a través de los fluidos y tejidos del cuerpo, el término "metabolismo" indica la transformación irreversible de los compuestos originales en metabolitos hijos y el término "excreción" indica la eliminación de las sustancias del cuerpo. Si el compuesto está en una formulación, la farmacocinética también comprende la liberación del compuesto de la formulación, lo que indica el proceso de liberación del compuesto, normalmente un fármaco, de la formulación. El término "farmacodinámica" indica los efectos fisiológicos de un compuesto en el cuerpo o en microorganismos o parásitos dentro o en el cuerpo y los mecanismos de acción del fármaco y la relación entre la concentración del fármaco y el efecto. Un experto en la técnica será capaz de identificar las técnicas y procedimientos adecuados para detectar características y propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de un compuesto de interés y en particular de un agente de interés tal como un fármaco.
El término "agente", como se usa en el presente documento, indica un compuesto capaz de presentar una actividad química o biológica asociada con el objetivo. La expresión "actividad química", como se usa en el presente documento, indica la capacidad de la molécula para realizar una reacción química. La expresión actividad biológica como se usa en el presente documento indica la capacidad de la molécula para afectar a la materia viva. Las actividades químicas de ejemplo de los agentes comprenden la formación de una interacción covalente o electrostática. Las actividades biológicas de ejemplo de los agentes comprenden la producción y secreción de moléculas endógenas, la absorción y metabolización de moléculas endógenas o exógenas y la activación o desactivación de la expresión génica, incluidas la transcripción y traducción de un gen de interés.
El término "objetivo", como se usa en el presente documento, indica un sistema biológico de interés que incluye organismos vivos unicelulares o pluricelulares o cualquier parte de los mismos e incluye sistemas in vitro o in vivo biológicos o cualquier parte de los mismos.
El término un "polímero" tal como se usa en el presente documento indica una molécula grande compuesta de unidades estructurales que se repiten conectadas típicamente por enlaces químicos covalentes. Un polímero adecuado puede ser lineal y/o ramificado, y puede adoptar la forma de un homopolímero o un copolímero. Si se usa un copolímero, el copolímero puede ser un copolímero aleatorio o un copolímero ramificado. Los polímeros de ejemplo comprenden polímeros dispersables en agua y, en particular, solubles en agua. Por ejemplo, los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a polisacáridos, poliésteres, poliamidas, poliéteres, policarbonatos, poliacrilatos, etc. Para usos y aplicaciones terapéuticas y/o farmacéuticas, el polímero debe tener un perfil de toxicidad bajo y, en particular, no ser tóxico o citotóxico. Los polímeros adecuados incluyen polímeros que tienen un peso molecular de aproximadamente 500000 o inferior. En particular, los polímeros adecuados pueden tener un peso molecular de aproximadamente 100000 e inferior.
La expresión "polímero que contiene un poliol" o "polímero de poliol(es)", como se usa en el presente documento, indica un polímero que presenta múltiples grupos funcionales hidroxilo. En particular, el polímero que contiene un poliol adecuado para formar las nanopartículas aquí descritas comprende polímeros que presentan al menos una parte de los grupos funcionales hidroxilo para una interacción de acoplamiento con al menos un ácido borónico de un polímero que contiene un ácido borónico.
El término "presentar" como se usa en el presente documento con referencia a un compuesto o grupo funcional indica la unión realizada para mantener la reactividad química del compuesto o grupo funcional tal como se une. En consecuencia, un grupo funcional presentado sobre una superficie es capaz de realizar en las condiciones apropiadas una o más reacciones químicas que caracterizan químicamente al grupo funcional.
Las unidades estructurales que forman polímeros que contienen polioles comprenden polioles monoméricos tales como pentaeritritol, etilenglicol y glicerina. Los polímeros de ejemplo que contienen polioles comprenden poliésteres, poliéteres y polisacáridos. Los poliéteres adecuados de ejemplo incluyen, pero no se limitan a dioles y, en particular, dioles con la fórmula general HO-((CH2)nO)p con n>1 y p> 1, tales como polietilenglicol, polipropilenglicol y poli(tetrametileneter)glicol. Los polisacáridos adecuados de ejemplo incluyen, pero no se limitan a ciclodextrinas, almidón, glucógeno, celulosa, quitina y p-glucanos. Los poliésteres adecuados de ejemplo incluyen, pero no se limitan a policarbonato, polibutirato y poli(tereftalato de etileno), todos terminados con grupos terminales hidroxilo. Los polímeros de ejemplo que contienen polioles comprenden polímeros de aproximadamente 500000 o menos peso molecular y en particular de aproximadamente 300 a aproximadamente 100000.
Varios polímeros que contienen polioles están comercialmente disponibles y/o pueden producirse utilizando técnicas y procedimientos identificables por un experto en la materia. Los procedimientos de ejemplo para la síntesis de un polímero de poliol de ejemplo se describen en Liu et al 2005, y otros se ilustran en los ejemplos 1 -4. Los procedimientos adicionales para preparar polímero que contiene polioles serán identificables por un experto en la técnica a la vista de la presente descripción.
La expresión "polímero que contiene un ácido borónico" o "polímero de BA" como se usa en el presente documento indica un polímero que contiene al menos un grupo ácido borónico presentado para unirse a un grupo hidroxilo de un polímero que contiene polioles. En particular, los polímeros que contienen ácidos borónicos de las nanopartículas descritas en el presente documento incluyen un polímero que comprende en al menos una unidad estructural un ácido borónico sustituido con alquilo o arilo que contiene un enlace químico de carbono a boro. Los polímeros de BA adecuados comprenden polímeros en donde el ácido borónico está en una unidad estructural terminal o en cualquier otra posición adecuada para proporcionar propiedades hidrófilas al polímero resultante. Los ejemplos de polímeros que contienen polioles comprenden polímeros de aproximadamente 40000 o menos peso molecular y en particular de aproximadamente 20000 o menos, o aproximadamente 10000 o menos.
Varios polímeros que contienen ácido borónico están disponibles comercialmente y/o pueden producirse usando técnicas y procedimientos identificables por un experto en la técnica. Los procedimientos de ejemplo para la síntesis de un polímero de poliol de ejemplo se describen en Liu y Reineke (2005) y otros nuevos se ilustran en los ejemplos 5-8. Un experto en la técnica podrá identificar procedimientos adicionales para preparar polímeros de BA en vista de la presente descripción.
En las nanopartículas descritas en el presente documento, los polímeros de poliol se acoplan con los polímeros de BA. El término "acoplado" o "acoplamiento" tal como se usa en el presente documento con referencia a la unión entre dos moléculas indica una interacción que forma un enlace covalente reversible. En particular, en presencia de un medio adecuado, un ácido borónico presentado en el polímero de BA interacciona con los grupos hidroxilo de los polioles a través de una interacción covalente por pares rápida y reversible para formar ésteres borónicos en un medio adecuado. Los medios adecuados incluyen agua y varias soluciones acuosas y medios orgánicos adicionales identificables por un experto en la técnica. En particular, cuando se ponen en contacto en un medio acuoso, los polímeros de BA y los polímeros de poliol reaccionan, produciendo agua como un producto secundario. La interacción del poliol y el ácido borónico es generalmente más favorable en soluciones acuosas, pero también se sabe que procede en medios orgánicos. Además, los ésteres cíclicos formados con 1,2 y 1,3-dioles son generalmente más estables que sus homólogos de ésteres acíclicos.
En consecuencia, en una nanopartícula descrita en el presente documento, al menos un ácido borónico del polímero que contiene un ácido borónico se une a grupos hidroxilo del polímero que contiene un poliol con un enlace covalente reversible. La formación de un éster borónico entre polímeros de BA y polímeros de polioles puede detectarse por métodos y técnicas identificables por un experto en la técnica, tales como la resonancia magnética nuclear de boro-11 (RMN 11B), valoración potenciométrica, técnicas de detección de UV/Vis y fluorescente, de manera que la técnica de elección depende de la naturaleza química específica y las propiedades del ácido borónico y el poliol que componen la nanopartícula.
Una nanopartícula que resulta de las interacciones de acoplamiento de un polímero de BA descrito en el presente documento con un polímero de poliol descrito en el presente documento presenta el polímero de BA en la superficie de la partícula. En varias realizaciones, las nanopartículas pueden tener un diámetro de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 nm y una morfología esférica, aunque las dimensiones y la morfología de la partícula están determinadas en gran medida por el polímero de BA específico y los polímeros de poliol utilizados para formar las nanopartículas y por los compuestos que son transportado en las nanopartículas de acuerdo con la presente descripción.
En varias realizaciones, el compuesto de interés transportado por la nanopartícula forma parte del polímero de BA y/o los polímeros de poliol. Los ejemplos de dichas realizaciones los proporcionan las nanopartículas en donde uno o más átomos de un polímero se reemplazan por un isótopo específico, p. ej. 19F y 10B, y por lo tanto son adecuados como agentes para formar imágenes del objetivo y/o proporcionar tratamiento de radiación al objetivo.
En varias realizaciones, el compuesto de interés transportado por la nanopartícula se une a un polímero, típicamente un polímero de poliol, a través de un enlace covalente o no covalente. Las nanopartículas en donde uno o más restos en al menos uno del polímero de poliol y el polímero de BA se unen a uno o más compuestos de interés proporcionan ejemplos de dichas realizaciones.
El término "unir", "unido" o "unión", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a conectar o unir mediante un enlace, conexión, fuerza o ligado con el fin de mantener juntos dos o más componentes, lo que abarca la unión directa o indirecta tal como por ejemplo, cuando un primer compuesto está directamente unido a un segundo compuesto, y las realizaciones en donde uno o más compuestos intermedios, y en particular moléculas, están dispuestos entre el primer compuesto y el segundo compuesto.
En particular, en algunas realizaciones, se puede unir un compuesto al polímero de poliol o al polímero de BA a través de un enlace covalente del compuesto a restos adecuados del polímero. Los enlaces covalentes de ejemplo se ilustran en el ejemplo 19 donde la unión del fármaco camptotecina al polímero de ácido múcico se realiza a través de un enlace de enlace éster biodegradable, y en el ejemplo 9, en donde la unión de transferrina a BA-PEG5000 se realiza a través de la pegilación de la transferrina.
En algunas realizaciones, el polímero puede diseñarse o modificarse para permitir la unión de un compuesto de interés específico, por ejemplo, añadiendo uno o más grupos funcionales capaces de unirse específicamente a un grupo funcional correspondiente en el compuesto de interés. Por ejemplo, en varias realizaciones se puede PEGilar la nanopartícula con un BA-PEG-X, donde X puede ser una maleimida o un grupo yodoacetilo o cualquier grupo saliente que reaccionará específicamente con un tiol o no específicamente con una amina. El compuesto para unir puede entonces reaccionar con los grupos maleimida o yodoacetilo después de la modificación para expresar un grupo funcional tiol. El compuesto para unir también se puede modificar con grupos aldehídos o cetonas y estos pueden reaccionar por una reacción de condensación con los dioles en los polioles para dar acetales o cetales.
En algunas realizaciones, un compuesto de interés se puede unir al polímero de poliol o polímero de BA a través de enlaces no covalentes tales como enlaces iónicos e interacciones intermoleculares entre un compuesto que se va a unir y un resto adecuado del polímero. Los enlaces no covalentes de ejemplo se ilustran en el ejemplo 10.
Un compuesto de interés se puede unir a la nanopartícula antes, durante o después de la formación de la nanopartícula, por ejemplo, mediante la modificación de un polímero y/o de cualquier compuesto unido en el material compuesto de partículas. Los procedimientos de ejemplo para llevar a cabo la unión de un compuesto en la nanopartícula se ilustran en la sección de Ejemplos. Los procedimientos adicionales para unir un compuesto a un polímero de BA, un polímero de poliol u otros componentes de la nanopartícula descrita en el presente documento (p. ej., un compuesto de interés introducido previamente) pueden ser identificados por un experto tras la lectura de la presente descripción.
En algunas realizaciones, al menos un compuesto de interés unido a un polímero de BA presentado sobre la nanopartícula descrita en el presente documento es un agente que puede usarse como ligando dirigido. En particular, en varias realizaciones, la nanopartícula une en el polímero de BA uno o más agentes para usar como ligando dirigido, y en el polímero de poliol y/o el polímero de BA, uno o más agentes para ser administrados a un objetivo de elección.
La expresión "ligando dirigido", como se usa en la presente descripción, indica cualquier molécula que se puede presentar en la superficie de una nanopartícula con el fin de acoplarse con un objetivo específico y, en particular, reconocimiento celular específico, por ejemplo, al permitir la unión del receptor celular de la nanopartícula. Los ejemplos de ligandos adecuados incluyen, pero no se limitan a vitaminas (p. ej., ácido fólico), proteínas (p. ej., transferrina y anticuerpos monoclonales), monosacáridos (p. ej., galactosa), péptidos y polisacáridos. En particular, los ligandos dirigidos pueden ser anticuerpos contra ciertos receptores celulares de superficie tales como anti-VEGF, moléculas pequeñas tales como ácido fólico y otras proteínas tales como holotransferrina.
La elección del ligando, como apreciará un experto en la técnica, puede variar dependiendo del tipo de administración deseada. Como otro ejemplo, el ligando puede ser un agente permeabilizador de membrana o permeable a la membrana tal como la proteína TAT del VIH-1. La proteína TAT es un activador transcripcional viral que es importada activamente al núcleo celular. Torchilin, V. P. et al., PNAS. 98, 8786 8791, (2001). Los ligandos dirigidos adecuados unidos a un polímero de BA típicamente comprenden un espaciador flexible tal como un poli(óxido de etileno) con un ácido borónico unido a su extremo distal (véase el ejemplo 9).
En varias realizaciones, al menos uno de los compuestos comprendidos o unidos al polímero de poliol y/o al polímero de BA (incluido un ligando dirigido) puede ser un agente y, en particular, un fármaco, para administrar a un objetivo, por ejemplo, un individuo, en el que se va a ejercer la actividad química o biológica, p. ej. la actividad terapéutica.
La selección de un polímero de poliol y un polímero de BA adecuado para formar una nanopartícula descrita en el presente documento se puede realizar en vista del compuesto y el objetivo de interés. En particular, la selección de un polímero adecuado que contiene un poliol y un polímero de BA adecuado para formar una nanopartícula descrita en el presente documento se puede realizar proporcionando polímeros de poliol y polímeros de BA candidatos, y seleccionando el polímero de poliol y el polímero de BA capaces de formar una interacción de acoplamiento en el sentido de la descripción, en donde el polímero de BA y el polímero de poliol seleccionados tienen una composición química tal que, en vista del compuesto de interés y el ligando dirigido comprendido o unido a los polímeros de poliol y/o los polímeros de BA, el polímero de poliol es menos hidrófilo que el polímero de BA. La detección del polímero de BA en la superficie de la nanopartícula y la presentación relacionada en el entorno externo a la nanopartícula se puede llevar a cabo mediante la detección del potencial zeta que puede demostrar la modificación de la superficie de la nanopartícula como se ilustra en el ejemplo 12 (véase en particular la figura 6). Los procedimientos adicionales para detectar la carga superficial de las partículas y la estabilidad de las partículas en soluciones salinas incluyen la detección de cambios en el tamaño de las partículas tales como los ejemplificados en el ejemplo 12 (véase en particular la figura 7) y procedimientos adicionales identificables por un experto.
En varias realizaciones, los polímeros que contienen polioles comprenden una o más de al menos una de las siguientes unidades estructurales
Figure imgf000008_0001
en donde
A es un resto orgánico de fórmula
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en la que
Ri y R2 se seleccionan independientemente de cualquier grupo orgánico o basado en carbono con un peso molecular de aproximadamente 10 kDa o menos;
X se selecciona independientemente de un grupo alifático que contiene uno o más de -H, -F, -C, -N u -O; e Y se selecciona independientemente de -OH o un resto orgánico que lleva un grupo hidroxilo (-OH) que incluye, pero no se limita a -CH2OH, -CH2CH2OH, -CF2OH, -CF2CF2OH y C(R1G1)(RG2)(R1G3)OH, con R1G1, R1G2 y R1G3 que son independientemente grupos funcionales de base orgánica,
y
B es un resto orgánico que une uno de R1 y R2 de un primer resto A con uno de los R1 y R2 de un segundo resto A.
El término "resto", tal como se usa en el presente documento, indica un grupo de átomos que constituyen una parte de una molécula o especie molecular más grande. En particular, un resto se refiere a un constituyente de una unidad estructural polimérica repetida. Los restos de ejemplo incluyen especies ácidas o básicas, azúcares, carbohidratos, grupos alquilo, grupos arilo y cualquier otro constituyente molecular útil para formar una unidad estructural polimérica. El término "resto orgánico" tal como se utiliza en el presente documento indica un resto que contiene un átomo de carbono. En particular, los grupos orgánicos incluyen compuestos naturales y sintéticos y compuestos que incluyen heteroátomos. Los restos orgánicos naturales de ejemplo incluyen, pero no se limitan a la mayoría de los azúcares, algunos alcaloides y terpenoides, carbohidratos, lípidos y ácidos grasos, ácidos nucleicos, proteínas, péptidos y aminoácidos, vitaminas y grasas y aceites. Los grupos orgánicos sintéticos se refieren a compuestos que se preparan por reacción con otros compuestos.
En varias realizaciones, se pueden unir uno o más compuestos de interés a (A), a (B) o a (A) y (B).
En varias realizaciones, R1 y R2 independientemente tienen la fórmula:
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en donde
d es de 0 a 100
e es de 0 a 100
f es de 0 a 100,
Z es un enlace covalente que une un resto orgánico con otro y, en particular, con otro resto A o un resto B como se define en el presente documento, y
Z1 se selecciona independientemente de -NH2, -OH, -SH y -COOH
En varias realizaciones, Z puede seleccionarse independientemente de -NH-, -C(=O)NH-, -NH-C(=O), -SS-, -C(=O)O-, -NH(=NH2+)- o -O-C(=O)-En varias realizaciones donde la unidad estructural A de un polímero que contiene un poliol tiene la fórmula (IV), X puede ser CvH2v+1, donde v = 0-5 e Y puede ser -OH
En algunas realizaciones, R1 y/o R2 tienen la fórmula (V) donde Z es -NH(=NH2+)- y/o Z1 es NH2.
En varias realizaciones, los polímeros que contienen un poliol de la partícula descrita en el presente documento (A) pueden seleccionarse independientemente de las fórmulas,
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Figure imgf000010_0001
en donde
el espaciador se selecciona independientemente de cualquier resto orgánico y, en particular, puede incluir grupos alquilo, fenilo o alcoxi que contienen opcionalmente un heteroátomo, tal como azufre, nitrógeno, oxígeno o flúor; el aminoácido se selecciona de cualquier grupo orgánico que tenga una amina libre y un grupo ácido carboxílico libre; n es de 1 a 20; y
Z1 se selecciona independientemente de -NH2, -OH, -SH y -COOH.
En varias realizaciones, Z1 es NH2 y/o el azúcar puede ser cualquier monosacárido tal como glucosa, fructosa, manitol, sacarosa, galactosa, sorbitol, xilosa o galactosa.
En varias realizaciones, en polímeros que contienen un poliol de la partícula descrita en el presente documento, una o más unidades estructurales (A) pueden tener independientemente la fórmula
Figure imgf000010_0002
En varias realizaciones, (B) puede estar formado por cualquier compuesto lineal, ramificado, simétrico o asimétrico que une los dos restos (A) a través de grupos funcionales.
En varias realizaciones, (B) puede estar formado por un compuesto donde al menos dos grupos reticulables unen los dos restos (A).
En algunas realizaciones, (B) contiene un grupo orgánico neutro, catiónico o aniónico cuya naturaleza y composición dependen de la naturaleza química del compuesto que se va a unir de forma covalente o no covalente
Los restos catiónicos de ejemplo de (B) para usar con carga aniónica incluyen, pero no se limitan a grupos orgánicos que llevan grupos amidinas, amonios cuaternarios, grupo amina primaria, grupo amina secundaria, grupos amina terciaria (protonados por debajo de sus pKa) e imidazolios
Los restos aniónicos de ejemplo contenidos en (B) para usar con carga catiónica incluyen, pero no se limitan a grupos orgánicos que llevan sulfonatos de fórmula XIX, nitratos de fórmula XX, carboxilatos de fórmula XXI y fosfonatos de fórmula XXII.
En particular, uno o más restos catiónicos o aniónicos (B) para usar con cargas aniónicas y cargas catiónicas respectivamente pueden tener independientemente una fórmula general de:
R 5 --- Grupo orgánico — r 5
(XII)
en donde R5 es un grupo electrofílico que se puede unir covalentemente a A cuando A contiene grupos nucleófilos. Los ejemplos de R5 en este caso incluyen pero no se limitan a -C(=O)OH, -C(=O)Cl, -C(=O)NHS, -C(=NH2+)OMe, -S(=O)OCl-, -CH2Br, ésteres alquílicos y aromáticos, alquinos terminales, tosilato y mesilato, entre varios otros. En el caso donde el resto A contiene grupos terminales electrófilos, R5 llevará grupos nucleófilos tales como -NH2 (aminas primarias), -OH, -SH, N3 y aminas secundarias.
En particular, cuando el resto (B) es un resto catiónico (B) para usar con carga aniónica, el "grupo orgánico" es un resto orgánico que puede tener una cadena principal con una fórmula general que consiste en CmH2m con m> 1 y otros heteroátomos y debe contener al menos uno de los siguientes grupos funcionales que incluyen amidinas de fórmula (XIII), amonios cuaternarios de formula (XIV), grupo de amina primaria de la fórmula (XV), grupo de amina secundaria de fórmula (XVI), grupos amina terciaria de fórmula (XVII) (protonados por debajo de sus pKa), e immidazolios de fórmula (XVIII)
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En realizaciones, cuando el resto (B) es un resto aniónico (B) para usar con carga catiónica, el "grupo orgánico" puede tener una cadena principal con una fórmula general que consiste en CmH2m con m> 1 y otros heteroátomos y debe contener al menos uno de los siguientes grupos funcionales que incluyen sulfonatos de fórmula (XIX), nitratos de formula (XX), carboxilatos de formula (XXI), y fosfonatos de fórmula (XXII)
Figure imgf000011_0001
(XIX) (XX) (XXI) (XXII)
En realizaciones en donde (B) está compuesto por carboxilatos (XXI), también se puede unir un compuesto que contiene grupos amina primaria o hidroxilo mediante la formación de un enlace peptídico o éster.
En realizaciones en donde (B) está compuesto por un grupo amina primaria de fórmula (XV), y/o grupo amina secundaria de fórmula (XVI), también se puede unir un compuesto que contiene grupos ácido carboxílico mediante la formación de un enlace peptídico.
En varias realizaciones, el resto (B) puede seleccionarse independientemente de
Figure imgf000012_0001
(X X I I I ) o (XXIV)
en los que
q es de 1 a 20; y en particular pueden ser 5
p es de 20 a 200; y
L es un grupo saliente.
La expresión "grupo saliente", como se usa en el presente documento, indica un fragmento molecular que sale con un par de electrones en la escisión del enlace heterolítico. En particular, un grupo saliente pueden ser aniones o moléculas neutras, y la capacidad de salida de un grupo saliente se correlaciona con el pKa del ácido conjugado, estando asociado el menor pKa con una mejor capacidad del grupo saliente. Los grupos salientes aniónicos de ejemplo incluyen haluros tales como Cl-, Br- y I- y ésteres de sulfonato, tales como para-toluenosulfonato o "tosilato" (TsO-). Los grupos salientes moléculas neutras de ejemplo son el agua (H2O), amoníaco (NH3) y alcoholes (ROH).
En particular, en varias realizaciones, L puede ser un cloruro (Cl), metoxi (OMe), t butoxi (OtBU) o N-hidrosuccinimida (NHS). En algunas realizaciones, la unidad estructural de fórmula (I) puede tener la fórmula
Figure imgf000012_0002
en la que
n es de 1 a 20 y en particular de 1 a 4.
En algunas realizaciones, el polímero que contiene poliol puede tener la fórmula
Figure imgf000013_0001
En algunas realizaciones, el polímero que contiene ácido borónico contiene al menos un grupo ácido borónico terminal y tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000013_0002
en donde
R3 y R4 pueden seleccionarse independientemente de cualquier polímero orgánico hidrófilo y, en particular, pueden ser independientemente cualquier poli(óxido de etileno) y polímeros de ion híbrido.
X1 puede ser un resto orgánico que contiene uno o más de -CH, -N o -B
Y1 puede ser un grupo alquilo de fórmula -CmH2m- con m> 1, posiblemente que contiene olefinas o grupos alquinilo, o un grupo aromático tal como fenilo, bifenilo, naftilo o antracenilo
r es de 1 a 1000,
a es de 0 a 3, y
b es de 0 a 3
y en donde el grupo funcional 1 y el grupo funcional 2 son iguales o diferentes y pueden unirse a un ligando dirigido, y en particular a una proteína, anticuerpo o péptido, o es un grupo terminal tal como -OH, -OCH3 o -(X1)-(Y1)-B(OH)2-. En algunas realizaciones, R3 y R4 son (CH2CH2O)t , donde t es de 2 a 2000 y en particular de 100 a 300
En algunas realizaciones X1 puede ser -NH-C(=O)-, -S-S-, -C(=O)-NH-, -O-C(=O)- o -C(=O)-O- y/o Y1 puede ser un grupo fenilo.
En algunas realizaciones, r puede ser 1, a puede ser 0 y b puede ser 1.
En algunas realizaciones, el grupo funcional 1 y el grupo funcional 2 son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de -B(OH)2 , -OCH3 , -OH.
En particular, el grupo funcional 1 y/o 2 de fórmula (XXX) puede ser un grupo funcional capaz de unirse a una carga y, en particular, a un ligando dirigido, tal como una proteína, un anticuerpo o un péptido, o puede ser un grupo terminal tal como -OH, -OCH3 o -(X)-(Y)-B(OH)2.
La expresión "grupo funcional", como se usa en el presente documento, indica grupos de átomos específicos dentro de una estructura molecular o parte de la misma que son responsables de las reacciones químicas características de esa estructura o parte de la misma. Los grupos funcionales de ejemplo incluyen hidrocarburos, grupos que contienen halógeno, grupos que contienen oxígeno, grupos que contienen nitrógeno y grupos que contienen fósforo y azufre, todos identificables por un experto en la técnica. En particular, los grupos funcionales en el sentido de la presente descripción incluyen un ácido carboxílico, amina, triarilfosfina, azida, acetileno, sulfonilazida, tioácido y aldehído. En particular, por ejemplo, un grupo funcional capaz de unirse a un grupo funcional correspondiente en un ligando dirigido puede seleccionarse para comprender las siguientes parejas de unión: grupo ácido carboxílico y grupo amina, grupos azida y acetileno, grupo azida y triarilfosfina, sulfonilazida y tioácido, y aldehído y amina primaria. Un experto en la técnica puede identificar grupos funcionales adicionales tras la lectura de la presente descripción. Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo funcional correspondiente" se refiere a un grupo funcional que puede reaccionar con otro grupo funcional. Por lo tanto, los grupos funcionales que pueden reaccionar entre sí pueden denominarse grupos funcionales correspondientes.
Un grupo terminal indica una unidad constitucional que es un extremo de una macromolécula o molécula de oligómero. Por ejemplo, el grupo terminal de un poliéster PET puede ser un grupo alcohol o un grupo ácido carboxílico. Los grupos terminales se pueden utilizar para determinar la masa molar. Los grupos terminales de ejemplo comprenden -OH, -COOH, NH2 y OCH3,
En algunas realizaciones, el polímero que contiene ácido borónico puede tener la fórmula
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en donde s es de 20 a 300.
Los agentes y ligandos dirigidos de ejemplo que se pueden unir a las nanopartículas de la presente descripción comprenden moléculas orgánicas o inorgánicas, incluidos polinucleótidos, nucleótidos, aptámeros, polipéptidos, proteínas, polisacáridos, complejos macromoleculares que incluyen, pero no se limitan a aquellos que comprenden una mezcla de proteínas y polinucleótidos, sacáridos y/o polisacáridos, virus, moléculas con radioisótopos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
El término "polinucleótido", como se usa en el presente documento, indica un polímero orgánico compuesto por dos o más monómeros que incluyen nucleótidos, nucleósidos o análogos de los mismos. El término "nucleótido" se refiere a cualquiera de varios compuestos que consisten en un azúcar ribosa o desoxirribosa unido a una base purina o pirimidina y a un grupo fosfato y esto es la unidad estructural básica de los ácidos nucleicos. El término "nucleósido" se refiere a un compuesto (tal como guanosina o adenosina) que consiste en una base purina o pirimidina combinada con desoxirribosa o ribosa y se encuentra especialmente en ácidos nucleicos. La expresión "análogo de nucleótido" o "análogo de nucleósido" se refiere respectivamente a un nucleótido o nucleósido en el que uno o más átomos individuales se han reemplazado por un átomo diferente o por un grupo funcional diferente. Por consiguiente, el término "polinucleótido" incluye ácidos nucleicos de cualquier longitud y, en particular, ADN, ARN, análogos y fragmentos de los mismos. Un polinucleótido de tres o más nucleótidos también se denomina "oligómero nucleotídico" u "oligonucleótido".
El término "aptámeros", como se usa en el presente documento, indica moléculas de ácido oligonucleico o péptido que se unen a un objetivo específico. En particular, los aptámeros de ácidos nucleicos pueden comprender, por ejemplo, especies de ácidos nucleicos que han sido modificadas mediante rondas repetidas de selección in vitro o de manera equivalente SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) para unirse a varios objetivos moleculares, tales como moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos e incluso células, tejidos y organismos. Los aptámeros son útiles en aplicaciones biotecnológicas y terapéuticas ya que ofrecen propiedades de reconocimiento molecular que rivalizan con las de los anticuerpos. Los aptámeros peptídicos son péptidos que están diseñados para unirse específicamente e interferir con interacciones proteína-proteína dentro de las células. En particular, los aptámeros peptídicos se pueden obtener, por ejemplo, de acuerdo con una estrategia de selección que deriva del sistema de dos híbridos de levadura (Y2H). En particular, de acuerdo con esta estrategia, un bucle de aptámero de péptido variable unido a un dominio de unión a factor de transcripción se analiza frente a la proteína diana unida a un dominio de activación de factor de transcripción. La unión in vivo del aptámero peptídico a su diana mediante esta estrategia de selección se detecta como expresión de un gen marcador de levadura secuencia abajo.
El término "polipéptido", como se usa en el presente documento, indica un polímero orgánico lineal, circular o ramificado compuesto por dos o más monómeros aminoácidos y/o análogos de los mismos. El término "polipéptido" incluye polímeros de aminoácidos de cualquier longitud, incluidas proteínas y péptidos de longitud completa, así como análogos y fragmentos de los mismos. Un polipéptido de tres o más aminoácidos también se denomina oligómero de proteína, péptido u oligopéptido. En particular, los términos "péptido" y "oligopéptido" normalmente indican un polipéptido con menos de 50 monómeros aminoácidos. Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido", "monómero aminoácido" o "resto de aminoácido" se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y aminoácidos artificiales e incluye isómeros ópticos tanto D como L. En particular, los aminoácidos no naturales incluyen estereoisómeros D de aminoácidos de origen natural (que incluyen unidades estructurales de ligandos útiles porque no son susceptibles a la degradación enzimática). La expresión "aminoácidos artificiales" indica moléculas que se pueden acoplar fácilmente entre sí usando la química de acoplamiento de aminoácidos convencional, pero con estructuras moleculares que no se parecen a los aminoácidos naturales. La expresión "análogo de aminoácido" se refiere a un aminoácido en el que se han reemplazado uno o más átomos individuales, ya sea por un átomo diferente, isótopo o por un grupo funcional diferente, pero por lo demás es idéntico al aminoácido original del que proviene el análogo. Todos estos aminoácidos pueden incorporarse sintéticamente en un péptido o polipéptido usando químicas de acoplamiento de aminoácidos convencionales. El término "polipéptido", como se usa en el presente documento, incluye polímeros que comprenden uno o más monómeros, o unidades estructurales distintas de un monómero aminoácido. Los términos monómero, subunidad o unidades estructurales indican compuestos químicos que, en condiciones apropiadas, pueden unirse químicamente a otro monómero de la misma o diferente naturaleza química para formar un polímero. El término "polipéptido" pretende además comprender un polímero en donde uno o más de las unidades estructurales están unidas covalentemente a otra por un enlace químico distinto del enlace amida o peptídico.
El término "proteína", como se usa en el presente documento, indica un polipéptido con una estructura secundaria y terciaria particular que puede participar en, pero no limitado a interacciones con otras biomoléculas, incluidas otras proteínas, ADN, ARN, lípidos, metabolitos, hormonas, quimiocinas y pequeñas moléculas. Las proteínas de ejemplo descritas en el presente documento son anticuerpos.
El término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína del tipo producido por las células B activadas después de la estimulación por un antígeno y puede unirse específicamente al antígeno promoviendo una respuesta inmunitaria en los sistemas biológicos. Los anticuerpos completos normalmente consisten en cuatro subunidades que incluyen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. El término anticuerpo incluye anticuerpos naturales y sintéticos, incluyendo, pero no limitados a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos de ejemplo incluyen IgA, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgM y similares. Los fragmentos de ejemplo incluyen Fab Fv, Fab' F(ab')2 y similares. Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que se une específicamente y, por lo tanto, se define como complementario de una única organización espacial y polar particular de otra biomolécula que se denomina un "epítopo". En algunas formas, los anticuerpos monoclonales también pueden tener la misma estructura. Un anticuerpo policlonal se refiere a una mezcla de diferentes anticuerpos monoclonales. En algunas formas, los anticuerpos policlonales pueden ser una mezcla de anticuerpos monoclonales donde al menos dos de los anticuerpos monoclonales se unen a un epítopo antigénico diferente. Los diferentes epítopos antigénicos pueden estar en el mismo objetivo, diferentes objetivos o una combinación. Los anticuerpos se pueden preparar mediante técnicas que son bien conocidas en la técnica, tales como la inmunización de un hospedante y la recogida de sueros (policlonal) o mediante la preparación de líneas celulares de hibridoma continuas y la recogida de la proteína secretada (monoclonal).
En varias realizaciones, los polímeros de poliol forman un complejo o enlace no covalente con uno o más compuestos de interés para ser administrados de acuerdo con la ilustración esquemática de las figuras 1 y 2.
En varias realizaciones, una estructura de nanopartículas comprende un agente y un polímero que contiene un poliol, donde el agente está unido a un polímero de poliol por un enlace covalente. Un ejemplo de un polímero de poliol conjugado con un agente se detalla en los ejemplos 16-21. En estas realizaciones, los polímeros de poliol conjugados con un agente (denominados en el presente documento "conjugado de polímero de poliol-agente") forman nanopartículas cuya estructura presenta sitios en su superficie para la interacción con moléculas de BA.
En varias de esas realizaciones, la nanopartícula comprende además polímeros de BA configurados para proporcionar estabilización estérica y/o funcionalidad de direccionamiento a la nanopartícula. En particular, en esas realizaciones, la adición de un polímero de BA permite minimizar la autoagregación y las interacciones no deseadas con otras nanopartículas, proporcionando así una mayor estabilidad salina y en suero. Por ejemplo, la estabilización estérica la proporciona en el presente documento el polímero de BA que tiene PEG, como se ilustra en la nanopartícula de ejemplo descrita en el ejemplo 12.
En tales realizaciones, la estructura de esta nanopartícula proporciona varias ventajas sobre los métodos de administración de agentes de la técnica anterior, tales como la capacidad de proporcionar la liberación controlada de uno o más agentes. Esta característica puede proporcionarse, por ejemplo, mediante el uso de un enlace éster biodegradable entre el agente y el polímero de poliol. Un experto en la técnica reconocerá otros enlaces potenciales adecuados para este fin. En estas realizaciones, otra ventaja es la capacidad de proporcionar el direccionamiento específico del agente a través del resto de polímero de BA.
En varias realizaciones, los polímeros de BA pueden comprender un ácido borónico fluorado (Ejemplo 7) o un ácido borónico fluorado escindible (Ejemplo 8) que puede ser usado como un agente de formación de imágenes en MRI u otras técnicas similares. Dicho agente de formación de imágenes puede ser útil para el seguimiento de la farmacocinética o la farmacodinámica de un agente administrado por la nanopartícula.
En varias realizaciones, una estructura de nanopartícula comprende un agente y un polímero de poliol, donde la nanopartícula es un liposoma modificado. En estas realizaciones, el liposoma modificado comprende lípidos conjugados con polímeros de poliol a través de un enlace covalente de manera que la superficie del liposoma presenta polímeros de poliol. En estas realizaciones, los liposomas modificados se forman de tal manera que los agentes que se van a administrar están contenidos dentro de la nanopartícula de liposoma.
El término "liposoma", como se usa en el presente documento, indica una estructura vesicular compuesta por lípidos.
Los lípidos suelen tener un grupo de cola que comprende una cadena hidrocarbonada larga y un grupo de cabeza hidrófilo. Los lípidos están dispuestos para formar una bicapa lipídica con un entorno acuoso interior adecuado para contener un agente que se va a administrar. Dichos liposomas presentan una superficie externa que puede comprender ligandos o moléculas dirigidas adecuados para el reconocimiento específico por receptores de superficie celular u otros objetivos de interés.
El término "conjugado", tal como se usa en el presente documento, indica que una molécula ha formado un enlace covalente con una segunda molécula e incluye uniones donde los átomos se unen covalentemente alternando enlaces simples y múltiples (p. ej., dobles) (p. ej., C=C-C=C-C) e influyen entre sí para producir la deslocalización de electrones.
En otras realizaciones más de la presente descripción, una estructura de nanopartícula comprende un agente y un poliol, donde la nanopartícula es una micela modificada. En estas realizaciones, la micela modificada comprende polímeros de poliol modificados para contener un bloque de polímero hidrófobo.
La expresión "bloque de polímero hidrófobo", como se usa en la presente descripción, indica un segmento del polímero que por sí solo sería hidrófobo.
El término "micela", como se usa en el presente documento, se refiere a un agregado de moléculas dispersas en un líquido. Una micela típica en solución acuosa forma un agregado con las regiones hidrófilas de "cabeza" en contacto con el disolvente circundante, secuestrando las regiones hidrófobas de una sola cola en el centro de la micela. En la presente descripción, la región de cabeza puede ser, por ejemplo, una región de la superficie del polímero de poliol, mientras que la región de cola puede ser, por ejemplo, la región del bloque de polímero hidrófobo del polímero de poliol.
En estas realizaciones, los polímeros de poliol con un bloque de polímero hidrófobo, cuando se mezclan con un agente para administrar, se disponen para formar una nanopartícula que es una micela modificada con agentes que se van a administrar contenidos dentro de la nanopartícula. Dichas realizaciones de nanopartículas presentan polímeros de poliol en su superficie que son adecuados para interactuar con polímeros de BA que tienen o no tienen funcionalidad de direccionamiento según realizaciones anteriores. En estas realizaciones, los polímeros de BA que se pueden usar para este propósito incluyen aquellos con unidades estructurales hidrófilas A e hidrófobas B en la fórmula (I) o (II). Esta interacción proporciona ventajas iguales o similares a las de otras realizaciones de nanopartículas mencionadas anteriormente.
En algunas realizaciones, las nanopartículas o componentes relacionados pueden estar comprendidos en una composición junto con un vehículo aceptable. El término "vehículo", como se usa en el presente documento, indica cualquiera de los diversos medios que actúan normalmente como disolventes, portadores, aglutinantes, excipientes o diluyentes para una nanopartícula comprendida en la composición como un principio activo.
En algunas realizaciones, cuando la composición se va a administrar a un individuo, la composición puede ser una composición farmacéutica y el vehículo aceptable puede ser un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, una nanopartícula puede incluirse en composiciones farmacéuticas junto con un excipiente o diluyente. En particular, en algunas realizaciones, se describen composiciones farmacéuticas que contienen nanopartículas, en combinación con uno o más vehículos compatibles y farmacéuticamente aceptables, y en particular con diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
El término "excipiente", como se usa en el presente documento, indica una sustancia inactiva utilizada como vehículo para los ingredientes activos de un medicamento. Los excipientes adecuados para las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento incluyen cualquier sustancia que mejore la capacidad del cuerpo de un individuo para absorber la nanopartícula. Los excipientes adecuados también incluyen cualquier sustancia que se pueda usar para aumentar el volumen de las formulaciones con nanopartículas para permitir una dosificación conveniente y precisa. Además de su uso en la cantidad de dosis unitaria, los excipientes se pueden usar en el procedimiento de fabricación para ayudar en la manipulación de las nanopartículas. Dependiendo de la vía de administración y la forma del medicamento, se pueden utilizar diferentes excipientes. Los excipientes de ejemplo incluyen, pero no se limitan a antiadherentes, aglutinantes, disgregantes de recubrimientos, cargas, aromatizantes (tales como edulcorantes) y colorantes, deslizantes, lubricantes, conservantes, sorbentes.
El término "diluyente", tal como se usa en el presente documento, indica un agente de dilución que se proporciona para diluir o transportar un principio activo de una composición. Los diluyentes adecuados incluyen cualquier sustancia que pueda disminuir la viscosidad de una preparación medicinal.
En ciertas realizaciones, las composiciones y, en particular, las composiciones farmacéuticas se pueden formular para la administración sistémica, lo que incluye la administración parenteral y más particularmente la administración intravenosa, intradérmica e intramuscular.
Las composiciones de ejemplo para la administración parenteral incluyen, pero no se limitan a soluciones acuosas estériles, soluciones o suspensiones inyectables que incluyen nanopartículas. En algunas realizaciones, una composición para administración parenteral se puede preparar en el momento de su uso disolviendo una composición en polvo, previamente preparada en forma liofilizada, secada por congelación, en un líquido acuoso biológicamente compatible (agua destilada, solución fisiológica u otra solución acuosa).
El término "liofilización" (también conocido como secado por congelación o criodesecación) indica un procedimiento de deshidratación que normalmente se usa para conservar un material perecedero o hacer que el material sea más conveniente para el transporte. La liofilización funciona congelando el material y luego reduciendo la presión circundante y añadiendo suficiente calor para permitir que el agua congelada en el material sublime directamente de la fase sólida a gas.
En aplicaciones farmacéuticas, la liofilización se usa a menudo para aumentar la vida en anaquel de productos tales como vacunas y otros productos inyectables. Al eliminar el agua del material y sellar el material en un vial, el material puede almacenarse, enviarse y luego reconstituirse fácilmente a su forma original para inyección.
En varias realizaciones, las nanopartículas descritas en el presente documento se administran a un objetivo predeterminado. En algunas realizaciones, el objetivo es un sistema biológico in vitro y el método comprende poner en contacto el objetivo con la nanopartícula descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para la administración de un agente a un individuo donde el método comprende formular una nanopartícula adecuada según varias realizaciones descritas. Las nanopartículas también pueden formularse en una composición farmacéuticamente aceptable según varias realizaciones descritas. El método comprende además administrar una nanopartícula a un sujeto. Para administrar la nanopartícula a un individuo, la nanopartícula o formulaciones de nanopartículas pueden administrarse por vía oral, parenteral, tópica o rectal. Se administran en formas adecuadas para cada vía de administración. Por ejemplo, las composiciones de nanopartículas se pueden administrar en forma de comprimidos o cápsulas, por inyección, inhalación, loción ocular, pomada, supositorio, infusión; vía tópica mediante loción o pomada; y vía rectal mediante supositorios.
El término "individuo", tal como se usa en el presente documento, incluye un único organismo biológico que incluye, pero no se limita a plantas o animales y, en particular, animales superiores y, en particular, vertebrados tales como mamíferos y, en particular, seres humanos.
Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", tal como se usan en el presente documento, significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente por inyección, e incluyen, pero no se limitan a inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradenal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal.
Las frases "administración sistémica", "administrado sistémicamente", "administración periférica" y "administrado de forma periférica", tal como se usan en el presente documento, significan la administración de una nanopartícula o composición de la misma que no sea directamente en el sistema nervioso central, de modo que entra en el sistema del individuo y, por lo tanto, está sujeta al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea.
Los niveles de dosificación reales del principio o agente activo en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden variar para obtener así una cantidad del principio activo que es efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un individuo, composición y modo de administración en particular, sin ser tóxica para el individuo.
Estos conjugados de polímeros terapéuticos pueden administrarse a seres humanos y otros animales para terapia por cualquier vía de administración adecuada, incluidas las vías oral, nasal, como por ejemplo un aerosol, rectal, intravaginal, parenteral, intracisternal y tópica como mediante polvos, pomadas o gotas, incluso bucal y sublingual.
Independientemente de la vía de administración seleccionada, el conjugado de polímero terapéutico, que se puede usar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.
En particular, en algunas realizaciones, el compuesto administrado es un fármaco para tratar o prevenir una afección en el individuo.
El término "fármaco" o "agente terapéutico" indica un agente activo que se puede usar en el tratamiento, prevención o diagnóstico de una afección en el individuo o usar para mejorar de otro modo el bienestar físico o mental del individuo.
El término "afección" como se usa en el presente documento indica un estado físico del cuerpo de un individuo, como un todo o de una o más de sus partes, que no se ajusta al estado físico del individuo como un todo o de una o más de sus partes, que se asocia con un estado de completo bienestar físico, mental y posiblemente social. Las afecciones descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a trastornos y enfermedades en donde el término "trastorno" indica una afección del individuo vivo que está asociada a una anomalía funcional del cuerpo o de cualquiera de sus partes, y el término "enfermedad" indica una afección del individuo vivo que altera el funcionamiento normal del cuerpo o de cualquiera de sus partes y que se manifiesta típicamente por signos y síntomas distintivos. Las afecciones de ejemplo incluyen, pero no se limitan a lesiones, discapacidades, trastornos (incluidos los trastornos mentales y físicos), síndromes, infecciones, conductas desviadas del individuo y variaciones atípicas de la estructura y funciones del cuerpo de un individuo o partes del mismo.
El término "tratamiento", tal como se utiliza en el presente documento, indica cualquier actividad que sea parte de una atención médica o trate una afección médica o quirúrgicamente.
El término "prevención", como se usa en el presente documento, indica cualquier actividad que reduce la carga de mortalidad o morbilidad de una afección en un individuo. Esta tiene lugar a niveles de prevención primaria, secundaria y terciaria, en donde: a) la prevención primaria evita el desarrollo de una enfermedad; b) las actividades de prevención secundaria están dirigidas al tratamiento temprano de la enfermedad, aumentando así las oportunidades de intervenciones para prevenir la progresión de la enfermedad y la aparición de síntomas; y c) la prevención terciaria reduce el impacto negativo de una enfermedad ya establecida al restaurar la función y reducir las complicaciones relacionadas con la enfermedad.
Los compuestos de ejemplo que pueden ser administrados por las nanopartículas descritas en el presente documento y que son adecuados como fármacos comprenden compuestos capaces de emitir radiaciones electromagnéticas (tales como isótopos de 10B) para su uso en tratamientos de radiación (tales como la captura de neutrones por boro). Los agentes terapéuticos adicionales comprenden cualquier agente terapéutico biológicamente activo, sintético o natural, lipófilo o hidrófilo, incluidos los conocidos en la técnica. The Merck Index, An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, 13.a Edición, 2001, Merck and Co., Inc., Whitehouse Station, N.J. Los ejemplos de dichos agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a productos farmacéuticos de molécula pequeña, antibióticos, esteroides, polinucleótidos (p. ej., ADN genómico, ADNc, ARNm, ARNip, ARNhp, miARN, oligonucleótidos antiparalelos, virus y polinucleótidos quiméricos), plásmidos, péptidos, fragmentos peptídicos, moléculas pequeñas (p. ej., doxorrubicina), agentes quelantes (p. ej., deferoxamina (DESFERAL), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)), productos naturales (p. ej., taxol, anfotericina) y otras macromoléculas biológicamente activas tales como, por ejemplo, proteínas y enzimas. Véase también la patente de EE. UU. N.° 6,048,736 que enumera los agentes activos (agentes terapéuticos) que pueden usarse como agente terapéutico con las nanopartículas descritas en el presente documento. Los agentes terapéuticos de molécula pequeña no solo pueden ser el agente terapéutico dentro de la partícula compuesta, sino que, en una realización adicional, pueden unirse covalentemente a un polímero en el material compuesto. En varias realizaciones, el enlace covalente es reversible (p. ej., a través de una forma de profármaco o un enlace biodegradable tal como un disulfuro) y proporciona otra forma de administrar el agente terapéutico. En varias realizaciones, los agentes terapéuticos que se pueden administrar con las nanopartículas descritas en el presente documento incluyen agentes quimioterapéuticos tales como epotilonas, fármacos basados en camptotecina, taxol o un ácido nucleico tal como un plásmido, ARNip, ARNhp, miARN, aptámeros oligonucleótidos antiparalelos o su combinación, y fármacos adicionales identificables por un experto tras la lectura de la presente descripción.
En algunas realizaciones, el compuesto administrado es un compuesto adecuado para la formación de imágenes de una célula o tejido del individuo. Los compuestos de ejemplo que pueden ser administrados por las nanopartículas descritas en el presente documento y que son adecuados para la formación de imágenes comprenden compuestos que contienen isótopos tales como isótopos de 19F para imágenes de RM, 18F o 64Cu para imágenes de PET, etc.
En particular, las nanopartículas descritas en el presente documento se pueden configurar para contener polímeros de BA que contienen 19F. Por ejemplo, los átomos de 19F se pueden incorporar en un compuesto de polímero de BA no escindible o escindible. Son posibles otros lugares para los átomos de 19F en el componente de polímero de BA, el componente de polímero de poliol o en el agente para administrar. Estas y otras variaciones serán evidentes para el experto en la técnica.
En varias realizaciones, las nanopartículas descritas en el presente documento se pueden usar para administrar productos químicos usados en la industria agrícola. En otra realización de la invención, el agente administrado por la nanopartícula descrita en el presente documento es un compuesto biológicamente activo que tiene utilidad microbicida y agrícola. Estos compuestos biológicamente activos incluyen los conocidos en la técnica. Por ejemplo, los compuestos biológicamente activos adecuados en agricultura incluyen, pero no se limitan a fertilizantes, fungicidas, herbicidas, insecticidas y mildiucidas. Los microbicidas también se utilizan en el tratamiento del agua para tratar los suministros de agua municipales y los sistemas de agua industrial, tales como las aguas de refrigeración, los sistemas de aguas blancas en la fabricación de papel. Los sistemas acuosos susceptibles al ataque o degradación microbiológica también se encuentran en la industria del cuero, la industria textil y la industria de recubrimientos o pinturas. Se describen ejemplos de tales microbicidas y sus usos, individualmente y en combinación, en las patentes de EE. UU. N.° 5,693,631, 6,034,081 y 6,060,466. Las composiciones que contienen agentes activos tales como los discutidos anteriormente se pueden usar de la misma manera que se conoce para el propio principio activo. En particular, debido a que dichos usos no son usos farmacológicos, el polímero del material compuesto no necesariamente tiene que cumplir con el perfil de toxicidad requerido en los usos farmacéuticos.
En determinadas realizaciones, las nanopartículas que comprenden polímeros de poliol y polímeros de BA también pueden estar comprendidas en un sistema adecuado para administrar cualquiera de los compuestos indicados en el presente documento y, en particular, agentes, usando una nanopartícula. En algunas realizaciones del sistema, las nanopartículas se proporcionan con componentes adecuados para preparar las nanopartículas para su administración a un individuo.
Los sistemas descritos en el presente documento se pueden proporcionar en forma de kits de partes. Por ejemplo, los polímeros de poliol y/o los polímeros de BA pueden incluirse como una molécula sola o en presencia de excipientes, vehículos o diluyentes adecuados.
En un kit de partes, los polímeros de poliol, los polímeros de BA y/o los agentes que se van a administrar están comprendidos en el kit de forma independiente posiblemente incluidos en una composición junto con un portador vehículo adecuado o agentes auxiliares. Por ejemplo, los polímeros de poliol y/o los polímeros de BA pueden incluirse en una o más composiciones solos y/o incluidos en un vector adecuado. Además, un agente que se va a administrar se puede incluir en una composición junto con un portador vehículo o agente auxiliar adecuado. Alternativamente, el agente puede ser suministrado por el usuario final y puede estar ausente del kit de partes. Además, los polímeros de poliol, los polímeros de BA y/o los agentes pueden incluirse en diversas formas adecuadas para la incorporación adecuada en una nanopartícula.
También se pueden incluir componentes adicionales y comprenden chip microfluídico, patrones de referencia, tampones y componentes adicionales identificables por un experto tras la lectura de la presente descripción.
En el kit de partes descrito en el presente documento, los componentes del kit se pueden proporcionar con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios con el fin de llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el kit puede contener las composiciones en recipientes separados. También se pueden incluir en el kit instrucciones, por ejemplo, instrucciones escritas o en audio, en papel o soporte electrónico, tal como cintas o CD-ROM, para llevar a cabo el ensayo. El kit también puede contener, dependiendo del método particular utilizado, otros reactivos y materiales envasados (tales como tampones de lavado y similares).
El experto en la materia puede identificar detalles adicionales relacionados con la identificación del agente portador o agente auxiliar adecuado de las composiciones y, en general, la fabricación y el envasado del kit, tras la lectura de la presente descripción.
En algunas realizaciones, se puede preparar una nanopartícula preparando los componentes individuales de la nanopartícula seguido de mezclamiento de los componentes en varios órdenes para llegar a una estructura de nanopartícula compuesta deseada. La preparación y mezcla de los componentes se lleva a cabo en soluciones adecuadas conocidas por los expertos en la técnica.
El término "mezclar", como se usa en el presente documento, indica la adición de una solución que comprende una molécula de interés con otra solución que comprende otra molécula de interés. Por ejemplo, una solución acuosa de polímeros de poliol se puede mezclar con una solución acuosa de polímeros de BA en el contexto de la presente descripción.
El término "solución", como se usa en el presente documento, indica cualquier muestra en fase líquida que contenga moléculas de interés. Por ejemplo, una solución acuosa de polímeros de poliol puede comprender polímeros de poliol diluidos en agua o cualquier solución tamponada, en particular soluciones acuosas.
En algunas realizaciones, se puede preparar una nanopartícula mezclando polímeros de poliol con un agente que se va a administrar (Figuras 1 y 2), formando una nanopartícula de polímero de poliol-agente. En otras realizaciones, se puede preparar una nanopartícula mediante la mezcla adicional de polímeros de BA con la nanopartícula de polímero de poliol-agente. En otras realizaciones, se prepara una nanopartícula mezclando polímeros de poliol con polímeros de BA, seguido de la mezcla del agente que se va a administrar. En otras realizaciones más, se prepara una nanopartícula mezclando simultáneamente polímeros de poliol, polímeros de BA y un agente que se va a administrar.
En algunas realizaciones, se prepara una nanopartícula formando un conjugado de polímero de poliol-agente de acuerdo con diversas realizaciones de la presente descripción, preparando así una nanopartícula compuesta por un conjugado de polímero de poliol-agente. En otras realizaciones, las nanopartículas compuestas por conjugados de polímero de poliol-agente pueden prepararse disolviendo las nanopartículas en una solución acuosa adecuada. En otras realizaciones más, las nanopartículas compuestas de conjugados de polímero de poliol-agente pueden prepararse mezclando conjugados de polímero de poliol-agente con polímeros de BA que proporcionan o no un ligando dirigido.
En algunas realizaciones, se puede preparar una nanopartícula mezclando polímeros de poliol con un bloque de polímero hidrofóbico con un agente para administrar, preparando así una micela modificada de acuerdo con las realizaciones de la presente descripción. En otras realizaciones, se puede preparar una nanopartícula mezclando adicionalmente la micela modificada con polímeros de BA. En otras realizaciones más, se puede preparar una nanopartícula mezclando polímeros de poliol con polímeros de BA, seguido de la mezcla de un agente para administrar, preparando así una nanopartícula que es una micela modificada.
En algunas realizaciones de la presente descripción, se puede preparar una nanopartícula mezclando lípidos conjugados con polímeros de poliol con polímeros de BA y/o agentes que se van a administrar, preparando así un liposoma modificado. En diversas realizaciones, se puede preparar una nanopartícula mezclando lípidos conjugados con polímeros de poliol con polímeros de BA, seguido de la mezcla de los agentes que se van a administrar. En otras realizaciones, se puede preparar una nanopartícula mezclando lípidos conjugados con polímeros de poliol con agentes que se van a administrar. En otras realizaciones, se puede preparar una nanopartícula mezclando lípidos conjugados con polímeros de poliol con agentes que se van a administrar, seguido de la mezcla de polímeros de BA, preparando así una nanopartícula que es un liposoma modificado.
La formación de nanopartículas según varias realizaciones de la presente descripción puede analizarse con técnicas y procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, en varias realizaciones, los ensayos de retraso en gel se usan para vigilar y medir la incorporación de un agente de ácido nucleico dentro de una nanopartícula. (Ejemplo 10). En varias realizaciones, se puede elegir un tamaño de nanopartículas y/o un potencial zeta adecuados utilizando métodos conocidos. (Ejemplo 11).
El experto en la materia puede identificar detalles adicionales relacionados con la identificación del agente portador o agente auxiliar adecuado de las composiciones y, en general, la fabricación y el envasado del kit, tras la lectura de la presente descripción.
Ejemplos
Todos los reactivos químicos se obtuvieron de proveedores comerciales y se usaron tal como se recibieron sin purificación adicional. Las muestras de polímero se analizaron en un sistema Viscotek GPC equipado con una matriz de detectores triples TDA 302 que consiste en un detector de índice de refracción diferencial (IR), un viscosímetro diferencial y un detector de dispersión de luz de ángulo bajo. Se utilizó una solución de ácido acético al 7.5% como eluyente a un caudal de 1 ml/min.
pGL3, un plásmido que contiene el gen de luciferasa de luciérnaga, y se extrajo se purificó de las bacterias que expresan pGL3. siGL3 se adquirió de Integrated DNA Technologies (secuencia proporcionada a continuación). siCON1 (secuencia proporcionada a continuación) se adquirió de Dharmacon. Se usaron células HeLa para determinar la eficacia de la administración de pADN o ARNip mediante el polímero catiónico de diamina del ácido múcico-DMS. Tabla 1: secuencias de ARNip
Figure imgf000020_0002
Ejemplo 1: Síntesis de éster dimetílico del ácido múcico, (1)
Se añadieron 5 g (22.8 mmol) de ácido múcico (Aldrich) a un matraz de fondo redondo de 500 ml que contenía 120 ml de metanol y 0.4 ml de ácido sulfúrico concentrado. Esta mezcla se dejó a reflujo a 85°C durante la noche con agitación constante. Posteriormente, la mezcla se filtró, se lavó con metanol y luego se recristalizó en una mezcla de 80 ml de metanol y 0.5 ml de trietilamina. Después de secar al vacío durante la noche, se obtuvieron 8.0 g (33.6 mmol, 71%) de éster dimetílico del ácido múcico. RMN 1H ((CD3)2SO) 54.88-4.91 (d, 2H), 4.78-4.81 (m, 2H), 4.28-4.31 (d, 2H), 3.77-3.78 (d, 2H), 3.63 (s, 6H). ESI/EM (m/z): 261.0 [M+Na]+
Figure imgf000020_0001
Ejemplo 2: Síntesis de diamina del ácido múcico protegida con N-BOC, (2)
Una mezcla de 8 g (33.6 mmol) de éster dimetílico del ácido múcico (1; Ejemplo 1), 12.4 ml (88.6 mmol) de trietilamina y 160 ml de metanol se calentaron a reflujo a 85°C en un matraz de fondo redondo de 500 ml con agitación constante durante 0.5 h antes de la adición de 14.2 g (88.6 mmol) de N-BOC-diamina (Fluka) disuelta en metanol (32 ml). A continuación, esta suspensión de reacción se devolvió a reflujo. Después de calentar a reflujo durante la noche, la mezcla se filtró, se lavó con metanol, se recristalizó en metanol y luego se secó al vacío para producir 9.4 g (19 mmol, 57%) de diamina del ácido múcico protegida con N-BOC. RMN 1H ((CD3)2SO) 57.66 (m, 2H), 6.79 (m, 2H), 5.13-5.15 (d, 2H), 4.35-4.38 (d, 2H), 4.08-4.11 (m, 2H), 3.78-3.80 (d, 2H), 2.95-3.15 (m, 8H), 1.38 (s, 18). ESI/EM (m/z): 517.1 [M+Na]+
Figure imgf000021_0001
Ejemplo 3: Síntesis de diamina del ácido múcico, (3)
Se transfirieron 8 g (16.2 mmol) de diamina del ácido múcico protegida con N-BOC (2; Ejemplo 2) a un matraz de fondo redondo de 500 ml que contenía HCl 3 M en metanol (160 ml) y se dejó refluir durante la noche a 85°C con agitación constante. Posteriormente, el precipitado se filtró, se lavó con metanol y se secó al vacío durante la noche para dar 5.7 g (15.6 mmol, 96%) de diamina del ácido múcico. RMN 1H ((CD3)2SO) 57.97 (m, 8H), 5.35-5.38 (m, 2H), 4.18-4.20 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 3.35-3.42 (m, 8H), 2.82-2.90 (m, 4H). ESI/EM (m/z): 294.3 [M]+, 317.1 [M+Na]+, 333.0 [M+K]+
Figure imgf000021_0002
Ejemplo 4: Copolímero de diamina del ácido múcico-DMS (MAP), (4)
Un tubo Eppendorff de 1.5 ml se cargó con una solución de 85.5 mg (0.233 mmol) de la sal de bis(hidrocloruro) del Ejemplo 3 (3) en 0.8 ml de NaHCO30.1 M. Se añadió dimetilsuberimidato^2HCl (DMS, Pierce Chemical Co., 63.6 mg, 0.233 mmol) y la solución se agitó con vórtice y centrifugó para disolver los componentes. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 h. Luego, la mezcla se diluyó a 8 ml con agua y el pH se llevó a 4 con la adición de HCl 1 N. Luego, esta solución se dializó con una membrana de diálisis de MWCO 3500 (tubo de diálisis plegado Pierce) en ddH2O durante 24 horas. La solución dializada se liofilizó a sequedad para dar 49 mg de un polvo blanco esponjoso. RMN 1H (500 MHz, dDMSO) 59.15 (bs), 7.92 (bs), 5.43 (bs), 4.58 (bs), 4.17 (bs), 3.82 (bs), 3.37 (bs), 3.28 (bs), 2.82 (bs), 2.41 (bs), 1.61 (bs), 1.28 (bs). RMN 13C (126 MHz, dDMSO) 5174.88 (s, 1H), 168.38 (s, 1H), 71.45 (s, 4H), 71.22 (s, 3H), 42.34 (s, 2H), 36.96 (s, 3H), 32.74 (s, 3H), 28.09 (s, 4H), 26.90 (s, 4H). Mw [GPC] = 2520, Mw/Mn = 1.15.
Figure imgf000021_0003
El polímero 4 es un ejemplo de un polímero catiónico de tipo A-B (la estructura que se repite es ABABAB....) que contiene un poliol.
Ejemplo 5: Ácido borónico-amida-PEG5000, (5)
Cuando un polímero del Ejemplo 4 se ensambla con ácidos nucleicos, p. ej. ARNip, formarán nanopartículas. Estas nanopartículas necesitarán tener estabilización estérica para ser utilizadas en mamíferos y, opcionalmente, podrían incluir agentes dirigidos. Para realizar estas dos funciones, las nanopartículas se pueden decorar con PEG para la estabilización estérica y ligandos dirigidos-PEG. Para ello se preparan compuestos de PEG que contienen ácidos borónicos. Por ejemplo, se puede sintetizar un PEG que contiene ácido borónico según el ejemplo siguiente.
Se disolvieron 332 mg de ácido 4-carboxifenilborónico (2 mmol) en 8 ml de SOCl2. A esto se añadieron unas pocas gotas de DMF y la mezcla se calentó a reflujo en atmósfera de argón durante 2 h. El exceso de SOCl2 se eliminó a presión reducida y el sólido resultante se disolvió en 10 ml de diclorometano anhidro. A esta solución se le añadieron 500 mg de PEG5000-NH2 (2 mmol) y 418 pl de trietilamina (60 mmol) disueltos en 5 ml de diclorometano a 0°C bajo atmósfera de argón. La mezcla resultante se calentó a temperatura ambiente y se continuó agitando durante la noche. El disolvente de diclorometano se eliminó a presión reducida y el líquido resultante se precipitó con 20 ml de éter dietílico. El precipitado se filtró, se secó y se volvió a disolver en ddH2O. A continuación, la solución acuosa se filtró con un filtro de 0.45 pm y se dializó con una membrana de diálisis de MWCO 3500 (tubo de diálisis plegado Pierce) en ddH2Ü durante 24 horas. La solución dializada se liofilizó a sequedad. RMN 1H (300 MHz, dDMSO) 57.92 - 7.77 (m), 4.44 (d), 4.37 (t), 3.49 (m), 2.97 (s).
Figure imgf000022_0001
Ejemplo 6: Ácido borónico-disulfuro-PEG5000, (6)
Una versión escindible (en condiciones reductoras) del compuesto de PEG del Ejemplo 5 también se puede sintetizar de la siguiente manera.
Se añadieron 250 mg de PEG5000-SH (0.05 mmol, LaySanBio Inc.) a un vial de vidrio equipado con una barra agitadora. A este se le añadieron 110 mg de aldritiol-2 (0.5 mmol, Aldrich) disueltos en 4 ml de metanol. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, después de lo cual se añadieron 77 mg de ácido mercaptofenilborónico (0.5 mmol, Aldrich) en 1 ml de metanol. La solución resultante se agitó durante 2 horas más a temperatura ambiente. Se eliminó el metanol al vacío y el residuo se volvió a disolver en 2 ml de diclorometano. Se añadieron 18 ml de éter dietílico a la solución de diclorometano y la mezcla se dejó reposar durante 1 h. El precipitado resultante se recogió mediante centrifugación, se lavó varias veces con éter dietílico y se secó. El sólido seco se volvió a disolver en agua, se filtró con un filtro de 0.45 ^ y se dializó con una membrana de diálisis de MWCO 3500 (tubo de diálisis plegado Pierce) en ddH2Ü durante 15 h. La solución dializada se liofilizó a sequedad. RMN 1H (300 MHz, dDMSO) 58.12 - 8.00 (m), 7.83 - 7.72 (m), 7.72 - 7.61 (m), 7.61 - 7.43 (m), 3.72 (d, J = 5.4), 3.68 - 3.15 (m), 3.01 - 2.83 (m).
Figure imgf000022_0002
Ejemplo 7: Síntesis de ácido (2,3,5,6)-tetrafluorofenil-borónico-PEG5000, (7)
Una versión fluorada del compuesto de PEG que contiene ácidos borónicos del Ejemplo 5 se puede sintetizar y utilizar como un agente de formación de imágenes con la nanopartícula terapéutica. Los átomos de flúor para la formación de imágenes se pueden incorporar como se describe e ilustra a continuación.
Se disuelve el ácido (2,3,5,6)-fluorocarboxifenilborónico en un exceso de SOCl2 (~100 eq) y se le añade unas gotas de DMF. La mezcla se calienta a reflujo en atmósfera de argón durante 2 h. El exceso de SOCl2 se elimina a presión reducida y el residuo resultante se disuelve en diclorometano anhidro. A esta solución, se añaden PEG5000-NH2 (1 eq) y trietilamina (30 eq) disueltos en diclorometano a 0°C en atmósfera de argón. La mezcla resultante se calienta a temperatura ambiente y se continúa agitando durante la noche. El disolvente diclorometano se elimina a presión reducida y el líquido resultante se hace precipitar con éter dietílico. El precipitado se filtra, se seca y se vuelve a disolver en ddH2O. A continuación, la solución acuosa se filtra con un filtro de 0.45 ^ y se dializa con una membrana de diálisis de MWCO 3500 (tubo de diálisis plegado Pierce) en ddH2O durante 24 horas. La solución dializada se liofiliza a sequedad.
Figure imgf000022_0003
El compuesto que contiene flúor es útil para proporcionar 19F en la nanopartícula. El 19F puede detectarse por espectroscopia de resonancia magnética usando una MRI estándar de un paciente. La adición del 19F permite obtener imágenes de las nanopartículas (se puede hacer solo para la formación de imágenes o con la adición de un agente terapéutico puede permitir formación de imágenes y terapia).
Ejemplo 8: Síntesis de ácido (2,3,5,6)-tetrafluorofenil-borónico-disulfuro-PEG5000, (8)
Una versión fluorada del compuesto de PEG escindible que contiene ácidos borónicos del Ejemplo 5 se puede sintetizar y utilizar como un agente de formación de imágenes con la nanopartícula terapéutica. Los átomos de flúor para la formación de imágenes se pueden incorporar como se describe e ilustra a continuación.
Se añaden 250 mg de PEG5000-SH (0.05 mmol, LaySanBio Inc.) a un vial de vidrio equipado con una barra agitadora. A este se le añaden 110 mg de aldritiol-2 (0.5 mmol, Aldrich) disueltos en 4 ml de metanol. La solución se agita a temperatura ambiente durante 2 h, después de lo cual se añaden 77 mg de ácido (2,3,5,6)-fluoro-4-mercaptofenilborónico (0.5 mmol) en 1 ml de metanol. La solución resultante se agita durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente. Se elimina el metanol al vacío y el residuo se vuelve a disolver en 2 ml de diclorometano. Se añaden 18 ml de éter dietílico a la solución de diclorometano y se deja reposar la mezcla durante 1 h. El precipitado resultante se recoge mediante centrifugación, se lava varias veces con éter dietílico y se seca. El sólido seco se vuelve a disolver en agua, se filtra con un filtro de 0.45 pm y se dializa con una membrana de diálisis de MWCO 3500 (tubo de diálisis plegado Pierce) en ddH2O durante 15 h. La solución dializada se liofiliza a sequedad.
Figure imgf000023_0001
Ejemplo 9: Síntesis de ácido borónico-PEG5000-Transferrina, (9)
Se podría colocar un agente dirigido en el otro extremo del PEG del ácido borónico en los compuestos de los Ejemplos 5-8, por ejemplo, de acuerdo con un enfoque ilustrado esquemáticamente en la Figura 12 con referencia a la unión de transferrina.
Por lo tanto, los componentes de un sistema que contiene ácidos nucleicos como el agente terapéutico podrían incluir una proteína como la transferrina (Figura 12), un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un péptido como RGD o LHRH, una molécula pequeña como folato o galactosa, etc.). Un agente dirigido de ácido borónico PEGilado se puede sintetizar como sigue.
En particular, para sintetizar el ácido borónico-PEG5000-Transferrina de acuerdo con el enfoque ilustrado esquemáticamente en la Figura 12, se llevó a cabo el siguiente procedimiento. Se añadió una solución de 10 mg (0.13 pmol) de holotransferrina humana (rica en hierro) (Sigma Aldrich) en 1 ml de tampón de PBS 0.1 M (p.H. 7.2) a 3.2 mg de OPSS-PEG5000-SVA (5 eq, 0.64 pmol, LaysanBio Inc.). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La transferrina PEGilada se purificó del OPSS-PEG5000-SVA sin reaccionar usando un Ultracel de MWCO 50000 (Amicon Ultra-4, Millipore) y de la transferrina sin reaccionar usando una columna de filtración en gel G3000SWxl (Tosoh Biosep) (confirmado por HPLC y análisis MALDI-TOF). A continuación, se incubaron 100 pg de transferrina PEGilada con OPSS-PEG5000 en 100 pl, a temperatura ambiente con 20 pl de ácido 4-mercaptofenilborónico (1 pg/pl, 20 pg, 100 eq) durante 1 h. Después de la incubación, la solución se dializó dos veces con un dispositivo YM-30000 NMWI (Millipore) para eliminar el exceso de 4-mercaptofenilborónico y el subproducto piridil-2-tiona.
Ejemplo 10: Formulación de partículas de MAP-ácido nucleico - Ensayo de retraso en gel
Como se representa en el diagrama en la Figura 1, se mezcló 1 pg de ADN plasmídico o ARNip en agua exenta de DNAsa y RNASa (0.1 pg/pl, 10 pl) con 10 pl de MAP en varias concentraciones en agua exenta de DNasa y RNasa para obtener relaciones de cargas (carga "+" en el polímero a carga " -" en ácido nucleico) de 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 y 3 para el plásmido (figura 3) y 0.5, 1, 1.5, 2, 3 y 5 para el ARNip (Figura 4). Las mezclas resultantes se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se cargaron 10 pl de las soluciones de 20 pl en un gel de agarosa al 1% con 3.5 pl de tampón de carga y el gel se sometió a electroforesis a 80 V durante 45 minutos como se muestra en las Figuras 3 y 4. El ácido nucleico que no está contenido dentro de la nanopartícula migrará sobre el gel. Estos resultados proporcionan una guía sobre las relaciones de cargas necesarias para la contención de ácidos nucleicos dentro de las nanopartículas.
Ejemplo 11: Tamaño de partículas y potencial Zeta de partículas de MAP-ácido nucleico
Se mezcló 1 pg de ADN plásmido en agua exenta de DNasa y RNasa (0.1 pg/pl, 10 pl) con 10 pl de MAP en diversas concentraciones en agua exenta de DNasa y RNasa para dar relaciones de cargas de 1, 1.5, 2, 2.5 y 3. Las mezclas resultantes se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de 20 pl se diluyó con agua exenta de DNasa y RNasa hasta 70 gl para medir el tamaño de las partículas. A continuación, esta solución de 70 gl se diluyó hasta 1400 gl con KCl 1 mM para medir el potencial zeta. Las mediciones del tamaño de partículas y del potencial zeta se realizaron en un instrumento de dispersión dinámica de luz (DLS) ZetaPals (Brookhaven Instruments). Los resultados se muestran en Figura 5.
Ejemplo 12: Estabilización del tamaño de partículas por pegilación con ácido borónico-PEG5k
Como se muestra en el diagrama de la Figura 2, se diluyeron 2 gg de ADN plasmídico en agua exenta de DNasa y RNasa (0.45 gg/gl, 4.4 gl) a 80 gl en agua exenta de DNasa y RNasa. Esta solución de plásmido se mezcló con 4.89 gg de MAP (0.5 gg/gl, 9.8 gl) y también se diluyó a 80 gl en agua exenta de DNasa y RNasa para dar una relación de cargas de 3 /- y una concentración final de plásmido de 0.0125 gg/gl. La mezcla resultante se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. A esta solución se le añadieron 480 gg de ácido borónico-PEG5K, (compuesto 6; Ejemplo 6), (20 gg/gl, 24 gl). Luego, esta mezcla se incubó más durante 30 minutos, se dializó dos veces en agua exenta de DNasa y RNasa con una membrana de 0.5 ml de MWCO 100000 (BIOMAX, Millipore Corporation) y se reconstituyó en 160 gl de agua exenta de DNasa y RNasa. La mitad de la solución se diluyó con 1.4 ml de KCl 1 mM para medir el potencial zeta (Figura 6). Tenga en cuenta que el potencial zeta de las nanopartículas que contienen BA muestra un potencial zeta más bajo que el de las nanopartículas que no lo contienen. Estos resultados respaldan la conclusión de que las nanopartículas que contienen BA tienen el BA localizado en el exterior de las nanopartículas. La otra mitad se usó para medir el tamaño de partículas. El tamaño de partículas se midió cada minuto durante 5 minutos, después de lo cual se añadieron 10.2 gl de 10X PBS de manera que la solución final de 90.2 gl estaba en 1X PBS. Luego se midió nuevamente el tamaño de partículas cada minuto durante otros 10 minutos como se muestra en Figura 7. Las nanopartículas que contienen BA separadas de los componentes que no son partículas (por filtración) son estables en PBS mientras que las partículas sin BA no lo son. Estos datos respaldan la conclusión de que las nanopartículas que contienen BA tienen el BA localizado en su exterior, ya que están estabilizadas contra la agregación en PBS.
Ejemplo 13: Transfección de partículas de MAP/ADNp en células HeLa
Se sembraron células HeLa a razón de 20000 células/pocillo en placas de 24 pocillos 48 h antes de la transfección y se cultivaron en medio complementado con FBS al 10%. Las partículas de MAP se formularon para contener 1 gg de pGL3 en 200 gl de Opti-MEM I en varias relaciones de cargas de polímero a ADNp (consulte el Ejemplo 9). Se retiró el medio de cultivo, las células se lavaron con PBS y se añadió la formulación de partículas. Posteriormente, las células se incubaron a 37°C y 5% de CO2 durante 5 h antes de la adición de 800 gl de medio de cultivo complementado con FBS al 10%. Después de 48 h de incubación, se analizó la viabilidad celular de una fracción de las células usando un ensayo MTS. Las células restantes se lisaron en 100 gl de 1X reactivo de lisis de cultivo celular de luciferasa. La actividad de la luciferasa se determinó añadiendo 100 gl de reactivo de ensayo de luciferasa a 10 ul de lisado celular y se cuantificó la bioluminiscencia usando un luminómetro Monolight. La actividad de la luciferasa se da posteriormente como unidades relativas de luz (RLU) por 10000 células. Los resultados se muestran en la Figura 8 y Figura 9.
Ejemplo 14: Cotransfección de partículas de MAP/ADNp y/o ARNip en células HeLa
Se sembraron células HeLa a razón de 20000 células/pocillo en placas de 24 pocillos 48 h antes de la transfección y se cultivaron en medio complementado con FBS al 10%. Las partículas de MAP se formularon para contener 1 gg de pGL3 y siGL3 50 nM en 200 gl de Opti-MEM I con una relación de cargas de 5+/-. Se utilizaron como controles partículas que contenían únicamente pGL3 o pGL3 y siCON. Se retiró el medio de cultivo, las células se lavaron con PBS y se añadió la formulación de partículas. Posteriormente, las células se incubaron a 37°C y 5% de CO2 durante 5 h antes de la adición de 800 gl de medio de cultivo complementado con FBS al 10%. Después de 48 h de incubación, se analizó la actividad de la luciferasa y la viabilidad celular de las células como se describe en el Ejemplo 13. Los resultados se muestran en la Figura 10. Dado que las RLU se reducen en las transfecciones con el siGL3 (secuencia correcta), tanto el siGL3 como el pGL3 deben administrarse conjuntamente.
Ejemplo 15: Transfección de MAP/siGL3 en células HeLa-LUC
Se sembraron células HeLa-LUC (que contienen el gen que codifica la proteína luciferasa de luciérnaga) a razón de 20 000 células/pocillo en placas de 24 pocillos 48 h antes de la transfección y se cultivaron en medio complementado con FBS al 10%. Las partículas de MAP se formularon para contener siGL350 y 100 nM en 200 gl de Opti-MEM I con una relación de cargas de 5 /-. Se eliminó el medio de cultivo, se lavaron las células con PBS y se añadió la formulación de partículas. Posteriormente, las células se incubaron a 37°C y 5% de CO2 durante 5 h antes de la adición de 800 gl de medio de cultivo complementado con FBS al 10%. Después de 48 h de incubación, se analizó la actividad de la luciferasa y la viabilidad celular de las células como se describe en el Ejemplo 13. Los resultados se muestran en la Figura 11. Dado que las RLU disminuyen con el aumento de la concentración de siGL3, estos datos sugieren que se puede producir la inhibición de un gen endógeno.
Ejemplo 16: Síntesis de diyoduro del ácido múcico, (10)
Se mezcló 1 g (2.7 mmol) de diamina de ácido múcico (Ejemplo 3) con 3.8 ml (27.4 mmol) de trietilamina y 50 ml de DMF anhidra antes de la adición gota a gota de 1.2 ml (13.7 mmol) de cloruro de yodoacetilo en un matraz de fondo redondo de 250 ml. Esta mezcla se dejó reaccionar durante la noche con agitación constante a temperatura ambiente. Posteriormente, el disolvente se eliminó con una bomba de vacío, el producto se filtró, se lavó con metanol y se secó al vacío para producir 0.8 g (1.3 mmol, 46 %) de diyoduro de ácido múcico. RMN 1H ((CD3)2SO) 58.20 (s 2H), 2H), 7.77 (s, 2H), 4.11 (m, 2H), 4.03 (m, 2H), 3.79 (m, 2H), 3.11 -3.17 (m, 2H), 1.78 (d, 2H). ESI/EM (m/z): 652.8 [M+Na]+
Figure imgf000025_0001
Ejemplo 17: Síntesis de dicisteína del ácido múcico, (11)
A 7 ml de carbonato de sodio desgasificado 0.1 M se añadieron 17 mg de L-cisteína y 0.4 g de diyoduro del ácido múcico. La suspensión resultante se llevó a reflujo a 150°C durante 5 h hasta que la solución se volvió transparente. A continuación, esta mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se ajustó a pH 3 mediante HCl 1 N. Luego se empleó la adición lenta de acetona para la precipitación del producto. Después de filtrar, lavar con acetona y secar al vacío, se obtuvieron 60 mg de producto bruto.
Figure imgf000025_0002
Ejemplo 18: Síntesis de dicisteína del ácido múcico, (11)
A 20 ml de tampón de fosfato de sodio desgasificado 0.1 M a pH 7.5 en un matraz de fondo redondo de 50 ml se añadieron 0.38 g de L-cisteína (3.2 mmol) y 0.40 g (0.6 mmol) de diyoduro del ácido múcico. La suspensión resultante se dejó a reflujo a 75°C durante la noche, se enfrió a temperatura ambiente y se liofilizó. Posteriormente se añadieron 80 ml de DMF a este polvo marrón claro liofilizado y se consiguió por filtración la separación del exceso de reactivo insoluble y las sales de fosfato del producto soluble. Se eliminó la DMF a presión reducida y el producto se secó al vacío para dar 12 mg (0.02 mmol, 3%) de dicisteína del ácido múcico.
Figure imgf000025_0003
Ejemplo 19: Síntesis de polímeros, (Poli(ácido múcico-DiCys-PEG)) (12)
Se secaron al vacío 12 mg (21.7 pmol) de dicisteína del ácido múcico y 74 mg (21.7 pmol) de PEG-DiSPA 3400 antes de añadir 0.6 ml de DMSO anhidro en atmósfera de argón en un matraz de fondo redondo de 2 bocas de 10 ml. Después de 10 min de agitación, se transfirieron 9 pl (65.1 pmol) de DIEA anhidro al recipiente de reacción en atmósfera de argón. Esta mezcla se agitó en atmósfera de argón durante la noche. A continuación, la solución que contenía el polímero se dializó usando un dispositivo centrífugo de membrana de 10 kDa y se liofilizó para dar 47 mg (58%) de poli(ácido múcico-DiCys-PEG).
Figure imgf000026_0001
Este polímero que contiene polioles es un polímero AB aniónico.
Ejemplo 20: Unión covalente de fármaco (camptotecina, CPT) al polímero de ácido múcico, (13)
Se disolvieron 10 mg (2.7 pmol de unidades de repetición) de poli(ácido múcico-DiCys-PEG) en 1.5 ml de DMSO anhidro en un frasco de vidrio. Después de agitar durante 10 min, se añadieron 1.1 pl de DIEA (6.3 pmol), 3.3 mg (6.3 pmol) de TFA-Gly-CPT, 1.6 mg (8.1 pmol) de EDC y 0.7 mg (5.9 pmol) de NHS a la mezcla de reacción. Después de agitar durante 8 h, se añadieron 1.5 ml de etanol y los disolventes se separaron a presión reducida. El precipitado se disolvió en agua y los materiales insolubles se eliminaron por filtración a través de un filtro de 0.2 pm. A continuación, la solución de polímero se dializó frente a agua mediante una membrana de 10 kDa y posteriormente se liofilizó para dar el conjugado de poli(ácido múcico-DiCys-PEG)-CPT.
Figure imgf000026_0002
Ejemplo 21: Formulación de nanopartícula con CPT-polímero de ácido múcico (13) en agua, (20)
Los diámetros efectivos del conjugado de poli(ácido múcico-DiCys-PEG) y poli(ácido múcico-DiCys-PEG)-CPT se midieron formulando los polímeros en agua bidestilada (0.1-10 mg/ml) y se evaluaron mediante dispersión de luz dinámica (DLS) utilizando un instrumento ZetaPALS (Brookhaven Instrument Co). Posteriormente se registraron y promediaron 3 operaciones sucesivas de 1 min cada una. Los potenciales zeta de ambos compuestos se midieron en una solución de KCl 1.1 mM utilizando un instrumento ZetaPALS (Brookhaven Instrument Co). Luego se realizaron 10 operaciones automáticas sucesivas con residuos objetivo de 0.012 y se promediaron los resultados (Figura 14). En particular, se midieron dos distribuciones para el conjugado de poli(ácido múcico-DiCys-PEG)-CPT, la distribución predominante era

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una nanopartícula que comprende un polímero que contiene un poliol y un polímero que contiene un ácido fenilborónico,
    en donde el polímero que contiene el ácido fenilborónico está acoplado con el polímero que contiene el poliol con un enlace covalente reversible, y
    en donde la nanopartícula está configurada para presentar el polímero que contiene el ácido fenilborónico a un entorno externo a la nanopartícula, y
    en donde el polímero que contiene el poliol comprende una o más de las siguientes unidades estructurales de Fórmula (I), (II) o (III)
    Figure imgf000029_0001
    en donde A y B se obtienen del acoplamiento de A' y B' donde A' es independientemente:
    Figure imgf000029_0002
    en las que n es 1-20; y
    en donde B' es:
    Figure imgf000029_0003
    (X X III) o (X X IV )
    en las que
    q es 1-20;
    p es 20-200; y
    L es un grupo saliente;
    o en donde la unidad estructural de fórmula (III) es:
    Figure imgf000030_0001
    en la que n es 1-20; y
    en donde el polímero que contiene el ácido fenilborónico comprende al menos un grupo ácido fenilborónico terminal y tiene la fórmula general:
    Figure imgf000030_0002
    en donde:
    R3 y R4 son independientes (CH2CH2O)t , donde t es de 2 a 2000,
    X i es -NH-C(=O)-, -S-S-, -C(=O)-NH-, -O-C(=O)- o -C(=O)-O-,
    Y i es un grupo fenilo,
    en donde r=1, a=0 y b=1, y
    en donde el grupo funcional 1 y el grupo funcional 2 son iguales o diferentes y comprenden independientemente -B(OH)2 , -OCH3 , -(X1)-(Y1)-B(OH)2 , -COOH, -NH2 , u -OH.
    2. La nanopartícula de la reivindicación 1, en donde la unidad estructural de fórmula (I) es:
    Figure imgf000030_0003
    o
    la unidad estructural de fórmula (II) es:
    Figure imgf000030_0004
    en la que n es 1-20, o
    en donde el polímero que contiene el poliol tiene una unidad que se repite de
    Figure imgf000031_0001
    fenilborónico es
    Figure imgf000031_0002
    en donde s = 100 a 300.
    4. La nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende un compuesto: en donde el compuesto forma parte del polímero que contiene el poliol y/o el polímero que contiene el ácido fenilborónico, o
    en donde el compuesto está unido al polímero que contiene el poliol y/o al polímero que contiene el ácido fenilborónico, y opcionalmente que comprende además un segundo compuesto, en donde el segundo compuesto es un agente terapéutico, tal como un agente quimioterapéutico de molécula pequeña.
    5. La nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una pluralidad de compuestos, en donde al menos un compuesto de la pluralidad de compuestos es un ligando dirigido, opcionalmente donde el ligando dirigido es una proteína, una molécula pequeña, un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo, tal como transferrina, ácido fólico y galactosa, y las nanopartículas comprenden además un agente terapéutico que se selecciona de camptotecina, una epotilona, un taxano o un polinucleótido o cualquier combinación de los mismos.
    6. Una composición que comprende la nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo y/o excipiente adecuado, opcionalmente en donde el vehículo y/o excipiente adecuado es un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable y la composición es una composición farmacéutica y opcionalmente en donde la nanopartícula comprende además 19F como parte de al menos un polímero que contiene un ácido borónico y en donde el al menos uno de los polímeros que contiene un ácido borónico tiene la fórmula
    Figure imgf000031_0003
    en donde s es 20-300,
    estando formulada la composición para la formación de imágenes in vivo mediante espectroscopía de RMN 19F, u opcionalmente en donde la nanopartícula comprende además 10B como parte de al menos un polímero que contiene un ácido borónico, estando formulada la composición para la terapia de activación de neutrones por boro in vivo. 7. La nanopartícula de la reivindicación 4 o 5, para usar en terapia o diagnóstico.
    8. Un sistema para administrar un compuesto a un objetivo, comprendiendo el sistema:
    al menos un polímero que contiene un poliol y al menos un polímero que contiene un ácido fenilborónico capaz de unión recíproca a través de un enlace covalente reversible,
    el al menos un polímero que contiene el poliol y el al menos un polímero que contiene el ácido fenilborónico para ser ensamblado con el compuesto en la nanopartícula de la reivindicación 4 o 5 para usar para administrar el compuesto al objetivo.
    9. La nanopartícula de la reivindicación 4 o 5, que comprende un compuesto, la nanopartícula para su uso como medicamento.
    10. Un método para preparar una nanopartícula según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el método:
    poner en contacto el polímero que contiene el poliol con el polímero que contiene el ácido fenilborónico durante un tiempo y en condiciones que permitan el acoplamiento del polímero que contiene el poliol con el polímero que contiene el ácido fenilborónico.
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