KR20110045031A - 캐리어 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템 - Google Patents

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Abstract

보론산을 함유하는 폴리머를 나노입자의 외부 환경에 제시하도록 구성된, 해당 보론산을 함유하는 폴리머에 결합된 폴리올을 함유하는 폴리머를 포함하는 캐리어 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템이 제공된다.

Description

캐리어 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템{CARRIER NANOPARTICLES AND RELATED COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 미국 가특허 출원 제61/188,855호(출원일: 2008년 8월 13일, 발명의 명칭: "Delivery System Utilizing Couplings Between Polyols and Boronic Acids", 문서 번호: CIT-5200-P)에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초 출원은 참조로 그의 전문이 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 캐리어 나노입자, 특히 대상 화합물을 전달하는 데 적합한 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템에 관한 것이다.
대상 화합물의 세포, 조직, 기관 및 유기체로의 효율적인 전달은, 각종 크기와 치수의 분자의 소정 표적에의 전달이 바람직한 생체 임상 의학, 영상 및 기타 분야에서 도전되어 왔다.
병리학적 조사에 대해서든지, 치료적 처치 혹은 기본적인 생물학적 연구에 대해서든지간에, 대상의 생물학적 및/또는 화학적 활성과 전형적으로 연관된 각종 부류의 생체재료 및 생체분자를 전달하는 수개의 방법이 공지되어 이용되고 있다.
화학 혹은 생물학적 제제(예컨대, 약물, 생물학적 제제, 치료제 혹은 조영제)로서 이용되기에 적합한 분자수가 증가함에 따라, 각종 복합도, 치수 및 화학적 속성을 지니는 화합물과 함께 이용하기에 적합한 전달 시스템의 개발은 특별히 도전해볼 만한 것으로 입증되었다.
나노입자는 각종 전달방법으로 제제를 전달하는 캐리어(carrier)로서 유용한 구조이다. 수개의 나노입자 전달 시스템이 존재하고 이것은 특정 표적에 제제를 포장, 이송 및 전달하는 상이한 전략의 배열을 이용한다.
본 발명에서는 수개의 실시형태에서 대상 화합물의 효율적이고도 특별한 전달을 위한 다기능 기구를 제공하는 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템이 제공된다. 특히, 수개의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 나노입자는 각종 크기, 치수 및 화학적 속성을 지니는 광범위한 분자를 미리 결정된 표적으로 운반하여 전달하기 위한 가요성 시스템으로서 이용될 수 있다.
제1측면에 따르면, 폴리올을 함유하는 폴리머와 보론산을 함유하는 폴리머를 포함하는 나노입자가 기재되어 있다. 해당 나노입자에 있어서, 상기 보론산을 함유하는 폴리머는 상기 폴리올을 함유하는 폴리머에 결합되고, 상기 나노입자는 해당 나노입자의 외부 환경에 보론산을 함유하는 폴리머를 제시하도록 구성되어 있다. 상기 나노입자에서, 대상으로 하나 이상의 화합물은 폴리올을 함유하는 폴리머 및/또는 보론산을 함유하는 폴리머에 부착된 일부로서 나노입자에 의해 운반될 수 있다.
제2측면에 따르면, 조성물이 기재되어 있다. 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 나노입자 및 적절한 비히클(vehicle) 및/또는 부형제를 포함한다.
제3측면에 따르면, 표적에 화합물을 전달하는 방법이 기재되어 있다. 해당 방법은 상기 표적을 본 명세서에 기재된 나노입자와 접촉시키는 단계를 포함하되, 해당 화합물은 본 명세서에 기재된 나노입자의 폴리올을 함유하는 폴리머 내에 혹은 보론산을 함유하는 폴리머 내에 포함되어 있다.
제4측면에 따르면, 화합물을 표적에 전달하는 시스템이 기재되어 있다. 해당 시스템은, 상기 화합물을 포함하는 본 명세서에 기재된 나노입자에 조립(assemble)될, 가역적 공유 결합을 통해 가역적으로 결합할 수 있는 폴리올을 함유하는 적어도 1종의 폴리머 및 보론산을 함유하는 적어도 1종의 폴리머를 포함한다.
제5측면에 따르면, 화합물을 개체에 투여하는 방법이 기재되어 있다. 해당 방법은 본 명세서에 기재된 나노입자의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 화합물은 상기 폴리올을 함유하는 폴리머 내 및/또는 상기 보론산을 함유하는 폴리머 내에 포함된다.
제6측면에 따르면, 화합물을 개체에 투여하는 시스템이 기재되어 있다. 해당 시스템은, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 객체에 투여될 상기 화합물을 부착하고 있는 본 명세서에 기재된 나노입자에 조립될, 가역적 공유 결합을 통해 가역적으로 결합할 수 있는 폴리올을 함유하는 적어도 1종의 폴리머 및 보론산을 함유하는 적어도 1종의 폴리머를 포함한다.
제7측면에 따르면, 폴리올을 함유하는 폴리머와 보론산을 함유하는 폴리머를 포함하는 나노입자를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 해당 방법은 상기 폴리올을 함유하는 폴리머를 상기 보론산을 함유하는 폴리머와 결합하는 것을 허용하는 조건 하에 일정 시간 동안 상기 폴리올을 함유하는 폴리머를 상기 보론산을 함유하는 폴리머와 접촉시키는 단계를 포함한다.
제8측면에 따르면, 수개의 보론산을 함유하는 폴리머가 기재되어 있고, 이것은 본 명세서의 이하의 발명의 실시하기 위한 구체적인 내용 부분에서 상세히 설명된다.
제9측면에 따르면, 폴리올을 함유하는 폴리올이 수종 기재되어 있고, 이것은 본 명세서의 이하의 발명의 실시하기 위한 구체적인 내용 부분에서 상세히 설명된다.
본 명세서에 기재된 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템은 각종 크기, 치수 및 화학적 속성을 지니는 화합물을 운반하기에 적합한 가요성 분자 구조로서 수개의 실시형태에서 이용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템은 운반된 화합물의 열화, 면역 시스템에 의한 인지, 그리고 혈청 단백질 혹은 혈액 세포와의 조합으로 인한 손실의 방지를 제공할 수 있는 전달 시스템으로서 수개의 실시형태에서 이용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템은 조직, 조직 내의 특정 세포 유형 및 소정의 세포 유형 내의 특정 세포내 위치 등과 같은 특정 표적에 화합물을 전달하는 입체구조 안정화(steric stabilization) 및/또는 능력을 특징으로 하는 전달 시스템으로서 수개의 실시형태에서 이용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템은, 상이한 속도 및/또는 시간에 동일한 나노입자 내의 다수의 화합물의 제어된 방출을 포함하는, 제어가능한 방식으로 운반된 화합물을 방출하는 수개의 실시형태로 설계될 수 있다.
본 명세서에 기재된 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템은, 당해 기술의 소정의 시스템에 비해서 표적에 의해 화합물의 증가된 인지 및/또는 표적화 동안의 선택성 및/또는 증가된 특이성으로 화합물을 전달하도록, 수개의 실시형태에서 이용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템은, 이들로 제한되지 않지만, 치료, 진단 및 임상 응용 등과 같은 의료 용도를 비롯한, 대상 화합물의 제어된 전달이 요망되는 응용과 관련하여 수개의 실시형태에서 이용될 수 있다. 추가의 응용은, 생물학적 분석, 수의 용도, 및 동물 이외의 유기체, 특히 식물에서의 대상 화합물의 전달을 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 상세는 첨부된 도면과 이하의 상세한 설명 및 실시예에 기술되어 있다. 기타 특성, 목적 및 이점 등은 상세한 설명, 실시예 및 도면으로부터, 또한 첨부된 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
본 명세서의 일부를 구성하고 본 명세서에 포함되는 첨부 도면은, 이하의 상세한 설명 및 실시예와 함께 본 발명의 하나 이상의 실시형태를 예시하고 있으며, 본 발명의 원리와 그의 구현예를 설명하는 역할을 하고 있다.
도 1 은 나노입자, 및 보론산 함유 화합물이 없이 관련된 형성을 위한 관련된 방법의 개략도로, 패널 A는 본 명세서에 기재된 일 실시형태에 따른 대상 화합물(핵산) 및 폴리올을 함유하는 폴리머(MAP, 4)의 개략도를 나타내고 있으며, 패널 B는 패널 A에 표시된 화합물과 상기 폴리올을 함유하는 폴리머의 조립 시 형성된 나노입자를 도시함;
도 2 는 본 발명의 일 실시형태에 따른 나논입자 및 관련된 그의 제조방법의 개략도로, 패널 A는 본 발명의 일 실시형태에 따라 대상 분자(핵산)와 함께 폴리올을 함유하는 폴리머(MAP, 4) 및 보론산을 함유하는 폴리머(BA-PEG, 6)를 도시하고 있으며, 패널 B는 패널 A에 도시된 화합물과 폴리머의 조립 시 형성된 BA-페길화된(PEGylated) 안정화 나노입자를 도시함;
도 3 은 본 명세서에 기재된 일 실시형태에 따른 폴리올을 함유하는 폴리머 및 대상 화합물을 포함하는 복합체의 형성을 도시한 도면으로, 특히, 도 3 은 본 발명의 일 실시형태에 따른 플라스미드 DNA에 의한 MAP 겔 지연 분석법의 결과를 나타내며, DNA 래더(ladder)는 레인 1 에 장전되고, 레인 2 내지 8 은 점차적으로 증가하는 전하비(charge ratio)를 지니는 MAP와 조합된 플라스미드 DNA를 나타내며, 전하비는 MAP에 대한 양 전하의 양을 핵산에 대한 음 전하의 양으로 나눈 값으로서 정의됨;
도 4 는 본 명세서에 기재된 일 실시형태에 따른 폴리올을 함유하는 폴리머 및 대상 화합물을 포함하는 복합체의 형성을 도시한 도면으로, 특히, 도 4 는 본 발명의 일 실시형태에 따른 siRNA에 의한 MAP 겔 지연 분석법의 결과를 나타내며, DNA 래더는 레인 1 에 장전되고, 레인 2 내지 8 은 점차적으로 증가하는 전하비를 지니는 MAP와 조합된 siRNA를 나타냄;
도 5 는 본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태에 따른 나노입자의 특성을 도시한 도면으로, 특히, 도 5 는 본 발명의 일 실시형태에 따른 MAP-플라스미드 나노입자에 대한 입자크기(동적 광산란(DLS: dynamic light scattering) 측정으로부터 결정됨) 대 전하비와 제타 전위(나노입자의 표면 전하와 관련된 특성) 대 전하비의 도표를 나타낸 도면;
도 6 은 본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태에 따른 나노입자의 특성을 도시한 도면으로, 특히, 도 6 은 본 발명의 일 실시형태에 따른 BA-페길화된 MAP-플라스미드 나노입자에 대한 입자크기(DLS) 대 전하비와 제타 전위 대 전하비의 도표를 나타낸 도면;
도 7 은 본 명세서에 개시된 실시형태에 따른 BA-페길화된 MAP-플라스미드 나노입자의 염 안정성을 도시한 도면으로, 플롯 A : 5분 후의 5:1 BA-PEG + np + 1X PBS; 플롯 B : 5분 후의 5:1 BA-PEG + np, 투석된 3X w/100kDa + 1X PBS; 플롯 C : 5분 후의 5:1 프레페길화된(prePEGylated) w/BA-PEG + 1X PBS; 플롯 D : 5분 후의 5:1 프레페길화된 w/BA-PEG, 투석된 3X w/10OkDa + PBS;
도 8 은 본 명세서에 기재된 일 실시형태에 따른 나노입자에 의한 시험관내 인간 세포에 대한 제제의 전달을 도시한 것으로, 특히, 도 8 은 본 발명의 일 실시형태에 따른 헬라 세포(HeLa cell) 내로의 MAP/pGL3 트랜스펙션(transfection)에 대한 세포에 전달된 pGL3 플라스미드로부터 발현된 루시페라제 단백질의 양의 척도인 RLU(relative light unit) 대 전하비의 그래프를 예시한 도면;
도 9 는 명세서에 기재된 일 실시형태에 따른 나노입자에 의한 표적에의 제제의 전달을 도시한 것으로, 특히, 도 9 는 본 발명의 일 실시형태에 따른 MAP/pGL3 트랜스펙션 후의 세포 생존성 대 전하비의 그래프를 나타낸 도면이고, 생존율 데이터는 도 8 에 도시된 실험에 대한 것임;
도 10 은 본 명세서에 기재된 일 실시형태에 따른 나노입자에 의한 표적에 대한 다수의 화합물의 전달을 도시한 것으로, 특히, 도 10 은 본 명세서에 기재된 일 실시형태에 따른 5+/-의 전하비에서의 pGL3 및 siGL3를 함유하는 MAP 입자의 헬라 세포 내로의 코트랙스펙션(co-transfection)에 대한 RLU 대 입자 유형의 그래프를 예시한 도면으로, siCON은 대조 서열을 지닌 siRNA를 나타냄;
도 11 은 본 명세서에 기재된 일 실시형태에 따른 나노입자를 이용해서 화합물을 표적에 전달하는 예를 도시한 것으로, 특히, 도 11 은 본 발명의 일 실시형태에 따른 5+/-의 전하비에서의 HeLa-Luc 세포 내로의 MAP/siGL3의 전달에 대한 RLU 대 siGL3 농도의 그래프;
도 12 는 본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태에 따라서 표적화 리간드를 제시하는 보론산을 함유하는 폴리머의 합성의 개략도를 도시한 것으로, 특히 도 12 는 본 발명의 일 실시형태에 따른 보론산-PEG 다이설파이드-트랜스페린의 합성에 대한 개략도;
도 13 은 본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태에 따른 나노입자의 합성의 개략도를 도시한 것으로, 특히, 도 13 은 본 발명의 일 실시형태에 따른 수중의 캄토테신 점액산 폴리머(Camptothecin Mucic Acid polymer)(CPT-점액산 폴리머)를 지닌 나노입자의 제조예를 나타낸 개략도;
도 14 는 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된, 수중 컨쥬게이트된 CPT-점액산 폴리머로부터 형성된 나노입자의 입자크기 및 제타 전위를 요약한 표를 나타낸 도면;
도 15 는 본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태에 따른 나노입자의 합성의 개략도를 도시한 것으로, 특히, 도 15 는 본 발명의 일 실시형태에 따른 수중 CPT-점액산 폴리머 및 보론산-다이설파이드-PEG5000을 지닌 보론산-페길화된 나노입자의 제조예를 나타낸 도면.
본 명세서에는 나노입자에 포함된 대상 화합물(여기서는 카고(cargo)라고도 칭함)을 전달하기 위하여 관련하여 이용될 수 있는 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템이 제공된다.
여기서 이용되는 바와 같은 "나노입자"란 용어는 나노규모 치수의 복합 구조체를 의미한다. 특히, 나노입자는 약 1 내지 약 1000㎚ 범위의 크기의 입자이고, 나노입자 조성물에 따라서 다른 형태도 가능하지만 통상은 구형이다. 나노입자의 외부 환경과 접촉하는 나노입자의 부분은 일반적으로 나노입자의 표면인 것으로 확인되고 있다. 본 명세서에 기재된 나노입자에서, 크기 제한은 2차원으로 제한될 수 있고, 따라서 본 명세서에 기재된 나노입자는 약 1 내지 약 1000㎚의 직경을 지니는 복합 구조체이고, 여기서, 특정 직경은 나노입자 조성물, 그리고 실험 설계에 따른 나노입자의 의도된 용도에 의존한다. 예를 들어, 수개의 치료 용도에 이용될 나노입자는 전형적으로 약 200㎚ 이하의 크기를 지니고, 특히 암 치료와 연관된 전달을 위해 이용되는 것은 전형적으로 약 1 내지 약 100㎚의 직경을 지닌다.
표면 전하 및 입체구조 안정화 등과 같은 나노입자의 추가의 바람직한 특성은 또한 대상으로 하는 구체적인 응용의 관점에서 다양할 수 있다. 암 치료 등과 같은 임상 응용에서 바람직할 수 있는 예시적인 특성은 문헌[Davis et al., 2008, Duncan 2006 and Allen 2002]에 기재되어 있고, 이들 문헌은 각각 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함된다. 추가의 특성은 본 명세서를 읽은 당업자에 의해 확인될 수 있다. 나노입자 치수 및 특성은 당업계에 공지된 기술에 의해 검출될 수 있다. 입자 치수를 검출하는 예시적인 기술로는, 이들로 제한되지는 않지만, 동적 광산란(DLS), 그리고 투과전자현미경(TEM: transmission electron microscopy) 및 원자력 현미경(AFM: atomic force microscopy) 등과 같은 각종 현미경법을 들 수 있다. 입자 형태를 검출하는 예시적인 기술로는 TEM 및 AFM을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 나노입자의 표면 전하를 검출하는 예시적인 기술로는 제타 전위 방법을 들 수 있지만, 이로써 제한되는 것은 아니다. 기타 화학적 특성을 검출하는 데 적합한 추가의 기술은 1H, 11B, 13C 및 19F NMR, UV/Vis 및 적외/라만 분광법, 형광 분광법(나노입자가 형광 표지와 조합하여 이용될 경우) 그리고 당업자에 의해 확인가능한 추가의 기술 등을 포함한다.
본 명세서에 기재된 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템은 규정된 표적에 대상 화합물, 특히 제제를 전달하는 데 이용될 수 있다.
여기서 이용되는 바와 같은 "전달하다" 및 "전달하는" 등의 용어는 화합물의 공간적 위치에 영향을 미치는, 특히 상기 위치를 제어하는 활동을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 의미에서 화합물을 전달하는 것이란, 소정 세트의 조건 하에 소정 시간에 화합물의 위치결정 및 움직임에 영향을 미쳐, 이러한 조건 하에서의 화합물의 위치결정 및 움직임은 다르게는 화합물이 가지고 있었던 위치결정 및 움직임에 대해서 변경되도록 하는 능력을 의미한다.
특히, 기준 종점에 관하여 화학식의 전달은, 화합물이 선택된 기준 종점 상에 궁극적으로 위치결정되도록 해당 화합물의 위치결정 및 움직임을 제어하는 능력을 나타낸다. 시험관내 시스템에 있어서, 화합물의 전달은 통상 화합물의 화학적 및/또는 생물학적으로 검출가능한 특성 및 활성의 대응하는 변형과 연관된다. 생체내 시스템에서, 화합물의 전달은 또한 전형적으로 화합물의 약물 동태학(pharmacokinetics), 가능하게는 약역학(pharmacodynamics)의 변형과 연관된다.
화합물의 약물 동태학은, 전형적으로 개체의 신체에 의해 제공되는, 시스템으로부터 화합물의 흡수, 분포, 대사 및 분비를 나타낸다. 특히 "흡수"란 용어는 신체로 들어오는 물질의 과정을 의미하며, "분포"란 용어는 신체의 체액 및 조직을 통한 물질의 분산 혹은 보급을 의미하고, "대사"란 용어는 모 화합물(parent compound)의 자식 대사 산물(daughter metabolites)로의 비가역적 전환을 의미하며, "분비"란 용어는 신체로부터의 물질의 제거를 의미한다. 화합물이 제제인 경우, 약물 동태학은 또한 화합물의 방출 과정을 나타내는 해당 제제로부터의 화합물의 유리, 전형적으로는 그 제제로부터 약물의 유리를 포함한다. "약역학"이란 용어는, 신체에 대한, 또는 해당 신체 내 혹은 신체 상에 있는 미생물 또는 기생 동물에 대한 화합물의 생리학적 효과, 및 약물 작용의 기전 그리고 약물 농도와 효과 간의 관계를 의미한다. 당업자는 대항 화합물, 특히 약물 등과 같은 대상 제제의 약물 동태학 및 약역학 특성과 성질을 검출하는 데 적합한 기술과 절차를 확인하는 것이 가능하다.
여기서 이용되는 바와 같은 "제제"란 용어는 표적과 관련된 화학적 혹은 생물학적 활성을 나타내는 능력을 지닌 화합물을 의미한다. 여기서 이용되는 바와 같은 "화학적 활성"이란 용어는 화학 반응을 수행하는 분자의 능력을 의미한다. 여기서 이용되는 바와 같은 "생물학적 활성"이란 용어는 살아있는 물질에 영향을 미치는 분자의 능력을 의미한다. 제제의 예시적인 화학적 활성은 공유 혹은 정전기적 상호작용의 형성을 포함한다. 제제의 예시적인 생물학적 활성은 내인성 분자의 생산과 분비, 내인성 및 외인성 분자의 흡수와 대상작용, 그리고 대상 유전자의 전사(transcription)와 번역(translation)을 포함한다.
여기서 이용되는 바와 같은 "표적"이란 용어는 단세포 혹은 세포 주위의 살아있는 유기체 혹은 그의 임의의 부분을 비롯한 대상으로 하는 생물학적 시스템을 의미하며, 이것은 시험관내 혹은 생체내 생물학적 시스템 혹은 그의 임의의 부분을 포함한다.
본 명세서에 기재된 나노입자에서, 보론산을 함유하는 폴리머는 해당 나노입자 내에 배열된 폴리올을 함유하는 폴리머에 결합되어, 해당 나노입자의 외부 환경에 제시된다.
여기서 이용되는 바와 같은 "폴리머"란 용어는 공유성 화학 결합에 의해 전형적으로 접속된 반복 구조 단위로 이루어진 거대 분자를 의미한다. 적절한 폴리머는 직쇄 및/또는 분지쇄일 수 있고, 이것은 호모폴리머 혹은 코폴리머의 형태를 취할 수 있다. 코폴리머가 이용될 경우, 해당 코폴리머는 랜덤 코폴리머 혹은 분지쇄 코폴리머일 수 있다. 예시적인 폴리머는 수-분산가능한, 특히 수 가용성 폴리머를 포함한다. 예를 들어, 적절한 폴리머로는, 이들로 제한되지는 않지만, 다당류, 폴리에스터, 폴리아마이드, 폴리에터, 폴리카보네이트, 폴리아크릴레이트 등을 들 수 있다. 치료적 및/또는 약제학적 용도 및 응용을 위하여, 폴리머는 특히 독성이나 세포독성이 없는 저 독성 프로파일을 지닐 필요가 있다. 적절한 폴리머는 약 500,000 이하의 분자량을 지니는 폴리머를 들 수 있다. 특히, 적절한 폴리머는 약 100,000 이하의 분자량을 지닐 수 있다.
여기서 이용되는 바와 같은 "폴리올을 함유하는 폴리머" 혹은 "폴리올(들) 폴리머"란 용어는 다수의 하이드록실 작용기를 제시하는 폴리머를 의미한다. 특히, 여기에 기재된 나노입자를 형성하는 데 적합한 폴리올을 함유하는 폴리머는 보론산을 함유하는 폴리머의 적어도 하나의 보론산과 결합 상호작용을 위하여 하이드록실 작용기의 적어도 일부를 제시하는 폴리머를 포함한다.
화합물 혹은 작용기와 관련하여 여기서 이용되는 바와 같은 "제시"(present)란 용어는 부착된 바와 같은 화합물 혹은 작용기의 화학적 반응을 유지하도록 수행된 부착(attachment)을 의미한다. 따라서, 표면 상에 제시된 작용기는 해당 작용기를 화학적으로 특징화하는 하나 이상의 화학 반응을 적절한 조건 하에서 수행하는 것이 가능하다.
폴리올을 함유하는 폴리머를 형성하는 구조 단위는 펜타에리트리톨, 에틸렌 글라이콜 및 글라이세린 등과 같은 모노머 폴리올을 포함한다. 예시적인 폴리올을 함유하는 폴리머는 폴리에스터, 폴리에터 및 다당류를 포함한다. 예시적인 적절한 폴리에터로는, 이들로 제한되지는 않지만, 다이올류, 특히 일반식 HO-(CH2CH2O)p-H를 지니는 다이올(p ≥ 1), 예컨대, 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리프로필렌 글라이콜 및 폴리(테트라메틸렌 에터) 글라이콜을 들 수 있다. 예시적인 적절한 다당류로는, 이들로 제한되지는 않지만, 사이클로덱스트린, 전분, 글라이코겐, 셀룰로스, 키틴 및 β-글루칸을 들 수 있다. 예시적인 적절한 폴리에스터로는, 이들로 제한되지는 않지만, 폴리카보네이트, 폴리뷰티레이트 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트를 들 수 있고, 이들은 모두 하이드록실 말단기로 종결되어 있다. 폴리올을 함유하는 예시적인 폴리머는 약 500,000 이하의 분자량, 특히 약 300 내지 100,000의 분자량을 지니는 폴리머를 포함한다.
폴리올을 함유하는 폴리머는 몇몇 개가 상업적으로 입수가능하고/하거나 당업자에 의해 확인가능한 기술 및 절차를 이용해서 제조될 수 있다. 예시적인 폴리올 폴리머의 합성을 위한 예시적인 절차는 문헌[Liu et al 2005]에 기재되어 있고, 그 밖에는 실시예 1 내지 4에 예시되어 있다. 폴리올을 함유하는 폴리머를 제조하는 추가의 절차는 본 명세서에 비추어 당업자에 의해 확인가능할 것이다.
여기서 이용되는 바와 같은 "보론산을 함유하는 폴리머" 혹은 "BA 폴리머"란 용어는 폴리올을 함유하는 폴리머의 하이드록실기에 결합하기 위하여 제시되는 적어도 하나의 보론산 기를 함유하는 폴리머를 의미한다. 특히, 본 명세서에 기재된 나노입자의 보론산을 함유하는 폴리머는 탄소 대 붕소 화학 결합을 함유하는 알킬 혹은 아릴 치환된 보론산을 적어도 하나의 구조 단위에 포함하는 폴리머를 포함한다. 적절한 BA 폴리머는 얻어지는 폴리머에 친수성 특성을 제공하도록 보론산이 말단 구조 단위에 혹은 기타 임의의 적절한 위치에 있는 폴리머를 포함한다. 예시적인 폴리올을 함유하는 폴리머는 약 40,000 이하의 분자량, 특히 약 20,000 이하, 또는 약 10,000 이하의 분자량을 지니는 폴리머를 포함한다.
보론산을 함유하는 폴리머는 몇몇 개가 상업적으로 입수가능하고/하거나 당업자에 의해 확인가능한 기술 및 절차를 이용해서 제조될 수 있다. 예시적인 폴리올 폴리머의 합성을 위한 예시적인 절차는 문헌[Liu and Reineke (2005)]에 기재되어 있고, 다른 새로운 것은 실시예 5 내지 8에 예시되어 있다. BA 폴리머를 제조하는 추가의 절차는 본 명세서에 비추어 당업자에 의해 확인가능할 것이다.
본 명세서에 기재된 나노입자에서, 폴리올 폴리머는 BA 폴리머에 결합되어 있다. 두 분자 사이의 부착과 관련하여 여기서 이용되는 바와 같은 "결합된" 혹은 "결합하는"이란 용어는 가역적 공유 결합을 형성하는 상호작용을 의미한다. 특히, 적절한 매질의 존재 하에, BA 폴리머 상에 제시된 보론산은 적절한 매질 내에서 보론산 에스터를 형성하기 위하여 신속하고도 가역적인 쌍과 같은 공유적 상호작용을 개재해서 폴리올의 하이드록실기와 상호작용한다. 적절한 매질은 물, 당업자에 의해 확인가능한 수개의 수성 용액 및 추가의 유기 매질을 포함한다. 특히, 수성 매질 중에서 접촉될 경우, BA 폴리머와 폴리올 폴리머는 반응하여, 부산물로서 물을 생성한다. 보론산 폴리올 상호작용은 일반적으로 수용액 내에서 더욱 바람직하지만, 유기 매질에서 처리되는 것도 공지되어 있다. 또한, 1,2-다이올 및 1,3-다이올에 의해 형성된 고리식 에스터는 일반적으로 그들의 아크릴 에스터 대응물보다 더욱 안정적이다.
따라서, 본 명세서에 기재된 나노입자에서, 보론산을 함유하는 폴리머의 적어도 하나의 보론산은 폴리올을 함유하는 폴리머의 하이드록실기에 가역적 공유 결합에 의해 결합된다. BA 폴리머와 폴리올 폴리머 간의 보론산 에스터의 형성은 붕소-11 핵자기공명(11B NMR), 전위차 적정, UV/Vis 및 형광 검출 기술 등과 같은 당업자에 의해 확인가능한 방법 및 기술에 의해 검출될 수 있고, 이에 따라, 해당 기술의 채택은 나노입자를 포함하는 폴리올 및 보론산의 특이적인 화학적 특성과 성질에 좌우된다.
본 명세서에 기재된 BA 폴리머의 본 명세서에 기재된 폴리올 폴리머와의 결합 상호작용에 기인하는 나노입자는 해당 입자의 표면에 BA 폴리머를 제시한다. 몇몇 실시형태에서, 나노입자의 치수와 형태가 해당 나노입자를 형성하는 데 이용되는 특정 BA 폴리머와 폴리올 폴리머에 의해 그리고 본 발명에 따른 나노입자 상에 담지된 화합물에 의해 크게 결정되지만, 나노입자는 약 1 내지 약 1000㎚의 직경과 구형 형태를 지닐 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 나노입자에 의해 담지되는 대상 화합물은 BA 폴리머 및/또는 폴리올 폴리머의 일부를 형성한다. 이러한 실시형태의 예는, 폴리머의 하나 이상의 원자가 특정 동위원소, 예컨대, 19F 및 10B로 교체되므로, 표적을 영상화(imaging)하고/하거나 표적에 방사선 처리를 제공하는 제제로서 적합한 나노입자에 의해 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 나노입자에 의해 담지되는 대상 화합물은 공유 혹은 비공유 결합을 통해서 폴리머, 전형적으로는 폴리올 폴리머에 부착된다. 이러한 실시형태의 예는, 폴리올 폴리머 및 BA 폴리머의 적어도 하나에서의 하나 이상의 모이어티(moiety)가 하나 이상의 대상 화합물을 부착하는 나노입자에 의해 제공된다.
여기서 이용되는 바와 같은 "부착하다", "부착된" 혹은 "부착"이란 용어는 2개 이상의 성분을 함께 유지하기 위하여 결합, 링크, 힘 혹은 타이에 의해 접속 혹은 연합하는 것을 의미하며, 또한 예를 들어, 제1화합물이 제2화합물에 직접 결합되도록 직접 혹은 간접 부착뿐만 아니라, 하나 이상의 중간체 화합물, 특히 분자가 제1화합물과 제2화합물 사이에 배치된 실시형태도 망라한다.
특히, 일부의 실시형태에서, 화합물은 폴리머의 적절한 모이어티에 화합물의 공유결합을 통해서 폴리올 폴리머 혹은 BA 폴리머에 부착될 수 있다. 예시적인 공유 결합은, 캄토테신의 점액산 폴리머에의 부착이 생분해성 에스터 결합 링크를 통해서 수행되는 실시예 19에 및 트랜스페린(transferrin)의 BA-PEG5000에의 부착이 트랜스페린의 페길레이션(pegylation)을 통해서 수행되는 실시예 9에 예시되어 있다.
일부의 실시형태에서, 폴리머는, 예를 들어, 대상 화합물 상에 대응하는 작용기를 특별히 결합시킬 수 있는 하나 이상의 작용기를 부가함으로써, 대상으로 하는 특정 화합물의 부착을 가능하게 하도록 설계 혹은 변형될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시예에서, 나노입자를 BA-PEG-X와 페길화하는 것이 가능하며, 여기서 X는 말레이미드 혹은 아이오도아세틸기, 또는 티올과 특이적으로 혹은 아민과 비특이적으로 반응하는 기타 이탈기일 수 있다. 이어서, 부착될 화합물은 티올 작용기를 발현하는 수식 혹은 변성(modification) 후에 말레이미드 혹은 아이오도아세틸기에 반응할 수 있다. 부착될 화합물은 또한 알데하이드 혹은 케톤기로 변성될 수 있고, 이들은 폴리올 상의 다이올류와의 축합 반응을 통해서 반응하여 아세탈 혹은 케탈을 부여할 수 있다.
일부의 실시형태에서, 대상 화합물은, 부착될 화합물과 폴리머의 적절한 모이어티 사이에서, 이온 결합 및 분자간 상호작용 등과 같은 비공유결합을 통해서 폴리올 폴리머 혹은 BA 폴리머에 부착될 수 있다. 예시적인 비공유 결합은 실시예 10에 예시되어 있다.
대상 화합물은, 예를 들어, 입상체 복합체 내의 폴리머 및/또는 임의의 부착된 화합물의 변성을 통해서, 나노입자의 형성 전, 형성 시 혹은 형성 후 나노입자에 부착될 수 있다. 나노입자 상에 화합물의 부착을 수행하는 예시적인 절차는 실시예 부분에 예시되어 있다. 본 명세서에 기재된 나노입자(예컨대, 이미 도입된 대상 화합물)의 BA 폴리머, 폴리올 폴리머 혹은 기타 성분에 화합물을 부착하는 추가의 절차는 본 명세서를 읽은 당업자에 의해 확인될 수 있다.
일부의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 나노입자 상에 제시된 BA 폴리머에 부착된 적어도 하나의 대상 화합물은 표적화 리간드로서 사용될 수 있다. 특히, 몇몇 실시형태에서, 나노입자는 표적화 리간드로서 사용될 하나 이상의 제제를 BA 폴리머 상에, 그리고 선택된 표적에 전달될 하나 이상의 제제를 폴리올 폴리머 및/또는 BA 폴리머 상에 부착한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "표적화 리간드"란 용어는, 예를 들어, 나노입자의 세포 수용체 부착을 가능하게 함으로써, 특정 표적, 특히 특정 세포 인식을 가능하게 할 목적을 위하여 나노입자의 표면 상에 제시될 수 있는 분자이면 어떠한 것이라도 의미한다. 적절한 리간드의 예로는, 이들로 제한되지는 않지만, 비타민(예컨대 엽산), 단백질(예컨대 트랜스페린 및 단클론성 항체), 단당류(예컨대 갈락토스), 펩타이드 및 다당류를 들 수 있다. 특히 표적화 리간드는 항-VEGF 등과 같은 소정의 표면 세포 수용체, 엽산 등과 같은 소분자, 및 홀로-트랜스페린(holo-transferrin) 등과 같은 기타 단백질에 대한 항체일 수 있다.
리간드의 채택은, 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 소망의 전달 유형에 따라 다양할 수 있다. 다른 예로서, 리간드는 HIV-1로부터의 TAT 단백질 등과 같은 막 침투성 혹은 막 투과성 제제일 수 있다. TAT 단백질은 세포 핵 내로 능동적으로 들어가는 바이러스 전사 활성이 있다. 이에 대해서는 문헌[Torchilin, V. P. et al., PNAS. 98, 8786 8791, (2001)]을 참조할 수 있다. BA 폴리머에 부착된 적절한 표적화 리간드는 전형적으로 그의 원위 단부에 부착된 보론산을 지닌 폴리(에틸렌옥사이드) 등과 같은 가요성 스페이서를 포함한다(실시예 9 참조).
몇몇 실시형태에서, 폴리올 폴리머 및/또는 BA 폴리머(표적화 리간드를 포함)에 부착되거나 포함되는 화합물의 적어도 하나는, 표적, 예를 들어, 개체에 전달되어 화학적 혹은 생물학적 활성, 예컨대, 치료 활성을 발휘시키게 될 제제 특히 약물일 수 있다.
본 명세서에 기재된 나노입자를 형성하기에 적합한 폴리올 폴리머 및 BA 폴리머의 선택은 대상 화합물 및 표적을 고려해서 수행될 수 있다. 특히, 본 명세서에 기재된 나노입자를 형성하기 위하여 적절한 폴리올을 함유하는 폴리머 및 적절한 BA 폴리머의 선택은 후보 폴리올 폴리머 및 BA 폴리머를 제공하고 본 명세서의 개시 내용의 의미에서 결합 상호작용을 형성하는 것이 가능한 폴리올 폴리머 및 BA 폴리머를 선택함으로써 수행될 수 있고, 여기서, 선택된 BA 폴리머 및 폴리올 폴리머는, 폴리올 폴리머 및/또는 BA 폴리머에 부착되거나 포함되는 표적화 리간드 및 대상 화합물을 감안해서, 폴리올 폴리머가 BA 폴리머보다 덜 친수성으로 되도록 하는 화학적 조성을 지닌다. 나노입자의 표면 상에서의 BA 폴리머의 검출 및 나노입자의 외부 환경에 대한 관련된 제시는 실시예 12(특히 도 6 참조)에 예시된 바와 같은 나노입자의 표면의 변성을 입증할 수 있는 제타 전위의 검출에 의해 수행될 수 있다. 염 용액 중의 입자의 안정성 및 입자의 표면 전하를 검출하는 추가의 절차는 실시예 12(특히 도 7 참조)에 예시된 것과 같은 입자 크기의 변화의 검출 및 당업자에 의해 확인가능한 추가의 절차를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 폴리올을 함유하는 폴리머는 이하의 구조 단위 (I) (II) 및 (III)의 적어도 하나를 하나 이상 포함한다:
Figure pct00001
상기 구조단위 중,
A는 이하의 식 (IV):
Figure pct00002
의 유기 모이어티이며,
상기 식 (IV) 중,
R1 및 R2는 독립적으로 분자량이 약 10kDa 이하인 임의의 탄소계 혹은 유기기로부터 선택되고;
X는 독립적으로 -H, -F, -C, -N 또는 -O 중 하나 이상을 함유하는 지방족 기로부터 선택되며;
Y는 독립적으로 -OH 또는 수산기(-OH)를 담지하는 유기 모이어티(예컨대, 이들로 제한되지는 않지만, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CF2OH, -CF2CF2OH 및 C(R1G1)(RG2)(R1G3)OH를 포함하며, 여기서, R1G1, RG2 및 R1G3는 독립적으로 유기계 작용기임)로부터 선택되고;
B는 첫번째의 A 모이어티의 R1 및 R2 중 하나를 두번째의 A 모이어티의 R1 및 R2 중 하나와 결합시키는 유기 모이어티이다.
여기서 이용되는 바와 같은 "모이어티"란 용어는 보다 큰 분자 혹은 분자종의 일부를 구성하는 원자 군을 나타낸다. 특히, 모이어티는 반복되는 폴리머 구조 단위의 구성요소를 지칭한다. 예시적인 모이어티로는 산 혹은 염기 종, 당, 탄수화물, 알킬기, 아릴기, 및 폴리머 구조 단위를 형성하는 데 이용가능한 기타 다른 분자 구성성분을 들 수 있다.
여기서 이용되는 바와 같은 "유기 모이어티"란 용어는 탄소 원자를 함유하는 모이어티를 의미한다. 특히, 유기기로는 천연 및 합성 화합물, 그리고 헤테로원자를 포함하는 화합물을 포함한다. 예시적인 천연 유기 모이어티로는, 이들로 제한되지는 않지만, 대부분의 당, 몇몇 알칼로이드 및 터페노이드(terpenoid), 탄수화물, 지질 및 지방산, 핵산 단백질, 펩타이드 및 아미노산, 비타민, 및 유지를 들 수 있다. 합성 유기기는 다른 화합물과의 반응에 의해 제조된 화합물을 지칭한다.
몇몇 실시형태에서, 대상으로 하는 하나 이상의 화합물은 (A)에, (B)에 혹은 (A) 및 (B)에 부착될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 이하의 식 (V)를 지닌다:
Figure pct00003
식 중,
d는 0 내지 100이고;
e는 0 내지 100이며;
f는 0 내지 100이고;
Z는 하나의 유기 모이어티를 다른 유기 모이어티에, 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 모이어티 A 혹은 모이어티 B에 결합하는 공유 결합이며;
Z1은 독립적으로 -NH2, -OH, -SH 및 -COOH로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, Z는 독립적으로 -NH-, -C(=O)NH-, -NH-C(=O), -SS-, -C(=O)O-, -NH(=NH2 +)- 또는 -O-C(=O)-로부터 선택될 수 있다.
폴리올을 함유하는 폴리머의 구조 단위 A가 식 (IV)를 지니는 몇몇 실시형태에서, X는 CvH2v +1일 수 있고, 이때 v는 0 내지 5이며, Y는 -OH일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, R1 및/또는 R2는, Z가 -NH(=NH2 +)-이고/이거나 Z1은 NH2인 식 (V)를 지닌다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 입자의 폴리올을 함유하는 폴리머에 있어서, (A)는 독립적으로 이하의 식 (VI), (VII) 및 (VIII)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00004
식 중,
스페이서는 독립적으로 임의의 유기기로부터 선택되고, 특히 황, 질소, 산소 혹은 불소 등과 같은 헤테로원자를 임의선택적으로 함유하는 알킬기, 페닐기 혹은 알콕시기일 수 있으며;
아미노산은 유리 아민(free amine) 및 유리 카복실산기(free carboxylic acid group)를 담지하는 임의의 유기기로부터 선택되고;
n은 1 내지 20이며;
Z1은 -NH2, -OH, -SH 및 -COOH로부터 독립적으로 선택된다.
몇몇 실시형태에서, Z1은 NH2이고/이거나 당은 글루코스, 프럭토스, 만니톨, 수크로스, 갈락토스, 솔비톨, 자일로스 혹은 갈락토스 등과 같은 단당류이면 어느 것이라도 가능하다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 입자의 폴리올을 함유하는 폴리머에 있어서, 하나 이상의 구조 단위 (A)는 독립적으로 이하의 (IX), (X) 및 (XI)을 지닐 수 있다:
Figure pct00005
몇몇 실시형태에서, (B)는 작용기를 통해서 두 (A) 모이어티를 결합하는 소정의 직쇄, 분지쇄, 대칭 혹은 비대칭 화합물에 의해 형성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, (B)는 적어도 2개의 가교가능한 기가 두 (A) 모이어티와 결합하고 있는 화합물에 의해 형성될 수 있다.
일부의 실시형태에서, (B)는 특성 및 조성이 공유결합 혹은 비공유결합적으로 이어질 화합물의 화학적 속성에 의존하는 중성, 양이온성 혹은 음이온성 유기기를 포함한다.
음이온성 카고와 함께 이용하기 위한 (B)의 예시적인 양이온성 모이어티로는, 이들로 제한되지는 않지만, 유기기 담지 아미딘기, 4차 암모늄, 1차 아민기, 2차 아민기, 3차 아민기(그들의 pKa 이하로 양자화됨) 및 이미다졸륨을 들 수 있다.
양이온성 카고와 함께 이용하기 위한 (B)의 예시적인 음이온성 모이어티로는, 이들로 제한되지는 않지만, 식의 설폰산염, 식의 질산염, 식의 카복실산염 및 인산염을 담지하는 유기기를 들 수 있다.
특히 음이온성 카고 및 양이온성 카고와 함께 이용하기 위한 하나 이상의 양이온성 혹은 음이온성 모이어티 (B)는 독립적으로 이하의 일반식 (XII)를 지닐 수 있다:
Figure pct00006
식 중, R5는 A가 친핵성 기를 함유할 경우 A에 공유결합적으로 연결될 수 있는 친전자성 기이다. 이 경우의 R5의 예로는, 이들로 제한되지는 않지만, -C(=O)OH, -C(=O)Cl, -C(=O)NHS, -C(=NH2 +)OMe; -S(=O)OCl-, -CH2Br, 알킬 및 방향족 에스터, 말단 알킨, 토실레이트 및 메실레이트를 들 수 있다. 모이어티 A가 친전자성 말단기를 함유할 경우, R5는 -NH2(1차 아민), -OH, -SH, N3 및 2차 아민 등과 같은 친전자성 기를 담지할 것이다.
특히, 모이어티 (B)가 음이온성 카고와 함께 이용하기 위한 양이온성 모이어티 (B)인 경우, "유기기"는 CmH2m(m ≥ 1) 및 기타 헤테로원자로 이루어진 일반식을 지닌 골격을 지닐 수 있고 식 (XIII)의 아민, 식 (XIV)의 4차 암모늄, 식 (XV)의 1차 아민기, 식 (XVI)의 2차 아민기, 식 (XVII)의 3차 아민기(그들의 pKa 이하로 양자화됨) 및 식 (XVIII)의 이미다졸륨을 포함하는 작용기의 적어도 하나를 함유해야만 하는 유기 모이어티이다:
Figure pct00007
실시형태들에서, 모이어티 (B)가 양이온성 카고와 함께 이용하기 위한 음이온성 모이어티 (B)인 경우, "유기기"는 CmH2m(m ≥ 1) 및 기타 헤테로원자로 이루어진 일반식을 지닌 골격을 지닐 수 있고 식 (XIX)의 설폰산, 식 (XX)의 질산염, 식 (XXI)의 카복실산염 및 식 (XXII)의 포스폰산염을 포함하는 작용기를 적어도 하나 함유해야만 한다:
Figure pct00008
(B)가 카복실산염 (XXI)으로 이루어진 실시형태에서, 1차 아민 혹은 하이드록실기를 함유하는 화합물은 펩타이드 혹은 에스터 결합의 형성을 통해서 부착될 수도 있다.
(B)가 식 (XV)의 1차 아민기 및/또는 식 (XVI)의 2차 아민기로 이루어진 실시형태에서, 카복실산기를 함유하는 화합물은 펩타이드 결합의 형성을 통해서 부착될 수도 있다.
몇몇 실시형태에서, 모이어티 (B)는 독립적으로 이하의 식 (XXIII) 또는 (XXIV)로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00009
식 중,
q는 1 내지 20이고; 특히 5일 수 있으며;
p는 20 내지 200이고;
L은 이탈기이다.
여기서 이용되는 바와 같은 "이탈기"란 용어는 불균일 결합 분해(heterolytic bond cleavage) 시 1쌍의 전자와 함께 이탈하는 분자 단편을 의미한다. 특히, 이탈기는 음이온 혹은 중성 분자일 수 있고, 이탈하는 이탈기의 능력은 컨쥬게이트 산의 pKa와 상관되며, 보다 낮은 pKa는 보다 양호한 이탈기 능력과 연관된다. 예시적인 음이온성 이탈기로는 Cl-, Br- 및 I- 등과 같은 할로겐 화합물, 및 파라-톨루엔설포네이트 혹은 "토실레이트"(TsO-) 등과 같은 설포네이트 에스터를 들 수 있다. 예시적인 중성의 분자 이탈기는 물(H2O), 암모니아(NH3) 및 알코올(ROH)이다.
특히, 몇몇 실시형태에서, L은 염소(Cl), 메톡시(OMe), t-뷰톡시(OtBU) 또는 N-하이드로숙신이미드(NHS)일 수 있다.
소정의 실시형태에서, 식 (I)의 구조 단위는 이하의 식 (XXV)를 지닐 수 있다:
Figure pct00010
소정의 실시형태에서, 식 (II)의 구조 단위는 이하의 식 (XXVI)를 지닐 수 있다:
Figure pct00011
소정의 실시형태에서, 식 (III)의 구조 단위는 이하의 식 (XXVII) 또는 (XXVIII)을 지닐 수 있다:
Figure pct00012
식 중,
n은 1 내지 20, 특히 1 내지 4이다.
일부의 실시형태에서, 상기 폴리올을 함유하는 폴리머는 이하의 식 (XXIX)을 지닐 수 있다:
Figure pct00013
일부의 실시형태에서, 상기 보론산을 함유하는 폴리머는 말단 보론산기를 적어도 하나 포함하고, 이하의 일반식 (XXX)를 지닌다:
Figure pct00014
식 중,
R3 및 R4는 독립적으로 친수성 유기 폴리머이고, 특히 독립적으로 임의의 폴리(에틸렌 옥사이드류) 및 쌍성 이온(zwitterionic) 폴리머일 수 있으며;
X1은 -CH, -N 혹은 -B를 하나 이상 포함하는 유기 모이어티이고;
Y1은 가능하게는 올레핀 혹은 알키닐기를 포함하는 식 -CmH2m-의 알킬기(m ≥ 1), 또는 페닐, 바이페닐, 나프틸 혹은 안트라세닐 등과 같은 방향족 기이며;
r은 1 내지 1000이고;
a는 0 내지 3이며;
b는 0 내지 3이고;
작용기 1 및 작용기 2는 동일하거나 상이하며, 표적화 리간드, 특히 단백질, 항체 혹은 펩타이드에 결합하는 것이 가능하거나, 또는 -OH, -OCH3 혹은 -(X1)-(Y1)-B(OH)2- 등과 같은 말단기이다.
일부의 실시형태에서, R3 및 R4는 (CH2CH2O)t이고, 이때 t는 2 내지 2000, 특히 100 내지 300이다.
일부의 실시형태에서, X1은 -NH-C(=O)-, -S-S-, -C(=O)-NH-, -O- C(=O)- 또는 -C(=O)-O-일 수 있고/있거나, Y1은 페닐기일 수 있다.
일부의 실시형태에서, r은 1일 수 있고, a는 0일 수 있으며, b는 1일 수 있다.
일부의 실시형태에서, 작용기 1 및 작용기 2는 동일하거나 상이하며, 독립적으로 -B(OH)2, -OCH3 및 -OH로부터 선택된다.
특히, 식 (XXXI)의 작용기 1 및/또는 2는 카고를 결합할 수 있는 작용기, 특히 단백질, 항체 혹은 펩타이드 등의 표적화 리간드일 수 있거나, 또는 -OH, -OCH3 혹은 -(X)-(Y)-B(OH)2 등의 말단기일 수 있다.
여기서 이용되는 바와 같은 "작용기"란 용어는 분자 구조 혹은 그의 일부의 특징적인 화학 반응을 담당하는 해당 분자 구조 혹은 그 일부 내에 있는 원자의 특정 기를 의미한다. 예시적인 작용기로는 탄화수소, 할로겐을 함유하는 기, 산소를 함유하는 기, 질소를 함유하는 기, 및 인 및 황을 함유하는 기를 들 수 있고, 이들은 모두 당업자에 의해 확인가능하다. 특히, 본 발명의 의미에서의 작용기는 카복실산, 아민, 트라이아릴포스핀, 아자이드, 아세틸렌, 설포닐아자이드, 티오산 및 알데하이드를 포함한다. 특히, 예를 들어, 표적화 리간드 내의 대응하는 작용기를 결합할 수 있는 작용기는 이하의 결합 파트너, 즉, 카복실산기와 아민기, 아자이드기와 아세틸렌기, 아자이드기와 트라이아릴포스핀기, 설포닐아자이드와 티오산, 및 알데하이드와 1차 아민을 포함하도록 선택될 수 있다. 추가의 작용기는 당업자가 본 명세서를 읽음으로써 확인가능하다. 여기서 이용되는 바와 같이, "대응하는 작용기"란 용어는 다른 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 의미한다. 따라서, 서로 반응할 수 있는 작용기는 대응하는 작용기라고도 지칭될 수 있다.
말단기는 거대분자(macromolecular) 혹은 올리고머 분자의 말단인 구성 단위를 의미한다. 예를 들어, PET 폴리에스터의 말단기는 알코올기 혹은 카복실산기일 수 있다. 말단기는 몰 질량을 결정하는 데 이용될 수 있다. 예시적인 말단기는 -OH, -COOH, NH2 및 OCH3를 포함한다.
일부의 실시형태에서, 보론산을 함유하는 폴리머는 이하의 식 (XXXI)을 지닐 수 있다:
Figure pct00015
식 중, s는 20 내지 300이다.
본 발명의 나노입자에 부착될 수 있는 예시적인 제제 및 표적화 리간드는 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 압타머(aptamer), 폴리펩타이드, 단백질, 다당류, 거대분자 복합체(이들로 제한되지 않지만 단백질과 폴리뉴클레오타이드의 혼합물을 포함함), 단당류 및/또는 다당류, 바이러스, 방사선 동위원소를 지닌 분자, 항체 혹은 항체 단편을 비롯한 유기 혹은 무기 분자를 포함한다.
여기서 이용되는 바와 같은 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 혹은 이들의 유사체를 포함하는 2개 이상의 모노머로 구성된 유기 폴리머를 지칭한다. "뉴클레오타이드"란 용어는 퓨린 혹은 피리미딘 염기에 그리고 포스페이트기에 접합된 리보스 혹은 데옥시리보스 당으로 이루어진 동시에 핵산의 염기성 구조단위인 수개의 화합물의 어느 것이라도 지칭한다. "뉴클레오사이드"란 용어는 데옥시리보스 혹은 리보스와 조합된 퓨린 혹은 피리미딘 염기로 구성된 동시에 특히 핵산 내에서 발견되는 화합물(구아노신 혹은 아데노신 등)을 지칭한다. "뉴클레오타이드 유사체" 혹은 "뉴클레오사이드 유사체"란 용어는 각각 하나 이상의 개별적인 원자가 상이한 원자 혹은 상이한 작용기로 대체되어 있는 뉴클레오타이드 혹은 뉴클레오사이드를 지칭한다. 따라서, "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 임의의 길이의 핵산, 특히 DNA, RNA, 이들의 유사체 및 단편을 포함한다. 3개 이상의 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드는 또한 "뉴클레오타이드 올리고머" 혹은 "올리고뉴클레오타이드"라고도 불린다.
여기서 이용되는 바와 같은 "압타머"란 용어는 특정 표적과 결합하는 올리고핵산 혹은 펩타이드 분자를 나타낸다. 특히, 핵산 압타머는, 예를 들어, 반복 횟수의 시험관내 선택을 통하여 유전 공학적으로 조작된 핵산 종, 또는 등가적으로 소분자, 단백질, 핵산 및 심지어 세포, 조직 및 유기체 등과 같은 각종 분자 표적에 결합하는 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 포함할 수 있다. 압타머는, 이들이 항체의 분자 인지 특성과 경쟁하는 분자 인지 특성을 제공하므로 생명공학기술 및 치료 응용에서 유용하다. 펩타이드 압타머는 세포 내부에서 단백질-단백질 상호작용부와 간섭하고 해당 상호작용부에 특이적으로 결합하도록 설계된 펩타이드이다. 특히, 펩타이드 압타머는, 예를 들어, Y2H(yeast two-hybrid) 시스템으로부터 유래된 선택 전략에 따라서 유래될 수 있다. 특히, 이 전략에 따르면, 전사 인자 결합 도메인에 부착된 다양한 펩타이드 압타머 루프는 전사 인자 활성화 도메인에 부착된 표적 단백질에 대해서 스크리닝된다. 이 선택 전략을 통해서 그의 표적에 펩타이드 압타머를 생체내 결합할 때, 하류 효모 표지 유전자의 발현으로부터 검출된다.
여기서 이용되는 바와 같은 "폴리펩타이드"란 용어는 2개 이상의 아미노산 모노머 및/또는 그의 유사체로 구성된 유기 직쇄, 원형 혹은 분지쇄 폴리머를 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 전체 길이 단백질 혹은 펩타이드뿐만 아니라 그의 유사체 및 단편을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 폴리머를 포함한다. 3개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드는 또한 단백질 올리고머, 펩타이드 혹은 올리고펩타이드라고도 불린다. 특히, "펩타이드" 및 "올리고펩타이드"란 용어는 통상 50개 미만의 아미노산 모노머를 지니는 폴리펩타이드를 나타낸다. 여기서 이용되는 바와 같이, "아미노산", "아미노산 모노머" 혹은 "아미노산 잔기"란 용어는 20개의 천연적으로 유래하는 아미노산, 비천연(non-natural) 아미노산 및 인공 아미노산의 어느 것이라도 지칭하며, D 및 L 광학 이성질체를 모두 포함한다. 특히, 비천연 아미노산은 천연적으로 유래하는 아미노산(이들은 효소 분해에 민감하지 않기 때문에 유용한 리간드 빌딩 블록을 포함함)의 D-입체이성질체를 포함한다. "인공 아미노산"이란 용어는 표준 아미노산 결합 화학을 이용해서 함께 용이하게 결합될 수 있지만, 천연 유래 아미노산과 유사하지 않은 분자 구조를 지니는 분자를 의미한다. "아미노산 유사체"란 용어는, 하나 이상의 개별의 원자가 상이한 원자인 동위원소로 치환되거나, 혹은 해당 유사체가 유래되는 원래의 아미노산과 동일하지만 상이한 작용기로 치환되어 있는 아미노산을 지칭한다.
이들 아미노산은 모두 표준 아미노산 결합 화학을 이용해서 펩타이드 혹은 폴리펩타이드 내에 합성적으로 편입될 수 있다. 여기서 이용되는 바와 같은 "폴리펩타이드"란 용어는 하나 이상의 모노머, 또는 아미노산 모노머 이외의 빌딩 블록을 포함하는 폴리머를 포함한다. 모노머, 서브유닛 혹은 빌딩 블록이란 용어는 적절한 조건 하에 동일 혹은 상이한 화학적 특성의 다른 모노머와 화학적으로 결합하여 폴리머를 형성할 수 있는 화학적 화합물을 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는, 또한, 하나 이상의 빌딩 블록이 아마이드 혹은 펩타이드 결합 이외의 화학적 결합에 의해 다른 빌딩 블록에 공유결합적으로 결합되어 있는 폴리머를 포함하도록 의도되어 있다.
여기서 이용되는 바와 같은 "단백질"이란 용어는, 이들로 제한되지 않지만, 기타 단백질, DNA, RNA, 지질, 대사산물, 호르몬, 케모카인 및 소분자를 비롯한 다른 생체 분자와의 상호결합에 관여할 수 있는 특정한 2차 및 3차 구조를 지니는 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 예시적인 단백질은 항체이다.
여기서 이용되는 바와 같은 "항체"란 용어는 항원에 의한 자극 후에 활성화된 B 세포에 의해 생산되고, 생물학적 시스템에서 면역 반응을 촉진시키는 상기 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 종류의 단백질을 의미한다. 완전 항체(full anitbody)는 전형적으로 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 4개의 서브유닛으로 이루어진다. 항체란 용어는, 이들로 제한되지는 않지만, 단클론성 항체, 다클론성 항체 혹은 이들의 단편을 비롯한 천연 및 합성 항체를 포함한다. 예시적인 항체로는 IgA, IgD, IgGl, IgG2, IgG3, IgM 등을 포함한다. 예시적인 단편으로는 Fab Fv, Fab' F(ab')2 등을 포함한다. 단클론성 항체는 "에피토프"(epitope)라고 칭해지는 다른 생체 분자의 단일의 특정 공간적 및 극성 구조에 특이적으로 결합함으로써 해당 구조에 대해 상보적인 것으로 규정되는 항체이다. 몇몇 형태에서, 단클론성 항체는 또한 동일한 구조를 지닐 수 있다. 다클론성 항체는 상이한 단클론성 항테의 혼합물을 지칭한다. 몇몇 형태에서, 다클론성 항체는 단클론성 항체의 적어도 2개가 상이한 항원성 에피토프에 결합하고 있는 단클론성 항체의 혼합물일 수 있다. 상이한 항원성 에피토프는 동일한 표적, 상이한 표적 혹은 이들의 조합 상에 있을 수 있다. 항체는 당업계에 충분히 공지된 기술, 예컨대, 숙주의 면역화 및 혈청의 수집(다클론성)에 의해, 또는 연속적인 하이브리도마 세포주를 준비하여 분비된 단백질(단클론성)을 회수함으로써, 준비될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 폴리올 폴리머는 도 1 및 도 2 의 개략도에 따라 전달될 하나 이상의 대상 화합물과 비공유 복합체 혹은 결합을 형성한다.
몇몇 실시형태에서, 나노입자 구조는 제제 및 폴리올을 함유하는 폴리머를 포함하며, 여기서 제제는 공유 결합에 의해 폴리올 폴리머에 결합되어 있다. 제제에 컨쥬게이트된 폴리올 폴리머의 예는 실시예 16 내지 21에 상세히 설명되어 있다. 이들 실시형태에서, 제제에 컨쥬게이트된 폴리올 폴리머(본 명세서에는 이것을 "폴리올 폴리머-제제 컨쥬게이트"라고 칭함)는, 그 구조가 BA 분자와의 상호작용을 위하여 그들의 표면 상에 부위를 제시하는 나노입자를 형성한다.
이들 실시형태의 몇몇에 있어서, 나노입자는 해당 나노입자에 입체구조 안정화 및/또는 표적화 작용기를 공하도록 구성된 BA 폴리머를 추가로 포함한다. 특히, 이들 실시형태에서, BA 폴리머의 첨가는 다른 나노입자와의 자체-응집 및 바람직하지 않은 상호작용을 최소화하는 것이 가능하므로, 증강된 염 및 혈청 안정성을 제공한다. 예를 들어, 입체구조 안정화는 여기에서는 실시예 12에 기재된 예시적인 나노입자에 의해 예시된 바와 같이 PEG를 지니는 BA 폴리머에 의해 제공된다.
이러한 실시형태에 있어서, 이 나노입자의 구조는, 하나 이상의 제제의 제어된 방출을 제공하는 능력 등과 같은, 종래 기술의 제제 전달 방법에 비해서 수개의 이점을 부여한다. 이 특성은, 예를 들어, 제제와 폴리올 폴리머 간의 생분해성 에스터 결합의 이용에 의해 제공될 수 있다. 당업자라면 이 목적을 위해 적합한 기타 잠재적인 결합을 확인할 수 있을 것이다. 이들 실시형태에서, 다른 이점은 BA 폴리머 모이어티를 통해서 제제의 특정 표적화를 제공하는 능력이다.
몇몇 실시형태에서, BA 폴리머는 MRI 혹은 기타 유사한 기술에서 조영제로서 이용되는 능력을 지니는 불소화 보론산(실시예 7) 혹은 불소화 분해성 보론산(실 시예 8)을 포함할 수 있다. 이러한 조영제는 나노입자에 의해 전달된 제제의 약물 동태학 혹은 약역학을 트래킹하는 데 유용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 나노입자 구조는 제제 및 폴리올 폴리머를 포함하되, 상기 나노입자는 변성된 리포솜(modified liposome)이다. 이들 실시형태에서, 변성된 리포솜은 해당 리포솜의 표면이 폴리올 폴리머를 제시하도록 공유 결합을 통해서 폴리올 폴리머에 컨쥬게이트된 지질을 포함한다. 이들 실시형태에서, 변성된 리포솜은 전달될 제제가 리포솜 나노입자 내에 함유되도록 형성된다.
여기서 이용되는 바와 같은 "리포솜"이란 용어는 지질로 구성된 소포 구조를 의미한다. 지질은 전형적으로 긴 탄화수소 사슬을 포함하는 테일기(tail group)와 친수성 헤드기(head group)를 지닌다. 지질은 전달될 제제를 함유하는 데 적합한 내부 수성 환경을 지니는 지질 이중층을 형성하도록 배열된다. 이러한 리포솜은, 세포 표면 수용체 혹은 기타 대상 표적에 의해 특이적인 인지를 위한 적절한 표적화 리간드 혹은 분자를 포함할 수 있는 외부면을 제시한다.
여기서 이용되는 바와 같은 "컨쥬게이트된"이란 용어는 하나의 분자가 제2분자와 공유결합을 형성하고 있고, 원자가 교대로 단일 및 다수(예컨대, 2중) 결합과 공유 결합하여(예컨대, C=C-C=C-C) 전자 비편재화(electron delocalization)를 발생하도록 서로 영향을 미치는 결합을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 나노입자 구조는 제제와 폴리올을 포함하되, 해당 나노입자는 변성된 마이셀(modified micelle)이다. 이들 실시형태에서, 변성된 마이셀은 소수성 폴리머 블록을 포함하도록 변성된 폴리올 폴리머를 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "소수성 폴리머 블록"이란 용어는 그 자체 상에 소수성을 지니는 폴리머의 단편을 의미한다.
여기서 이용되는 바와 같은 "마이셀"이란 용어는 지질 내에 분산된 분자의 응집체(aggregate)를 의미한다. 수성 용액 중의 전형적인 마이셀은 주변 용매와 접촉하여 친수성 "헤드" 영역을 지닌 응집체를 형성하여, 마이셀 중앙에 소수성 단일 테일 영역을 격리시킨다. 본 발명에서, 헤드 영역은, 예를 들어, 폴리올 폴리머의 표면 영역일 수 있는 한편, 테일 영역은, 예를 들어, 폴리올 폴리머의 소수성 폴리머 블록 영역일 수 있다.
이들 실시형태에서, 소수성 폴리머 블록을 지니는 폴리올 폴리머는, 전달될 제제와 혼합될 때, 나노입자 내에 함유된 전달될 제제를 지니는 변성된 마이셀인 해당 나노입자를 형성하도록 배열된다. 이러한 나노입자 실시형태는 이전의 실시형태에 따른 표적화 기능을 지니거나 지니지 않는 BA 폴리머와 상호작용하기에 적합한 그들의 표면 상에 폴리올 폴리머를 제시한다. 이들 실시형태에서, 이 목적에 사용될 수 있는 BA 폴리머는 식 (I) 또는 (II) 내에 친수성 A와 소수성 B를 지니는 것들을 포함한다. 이 상호작용은 전술한 다른 나노입자 실시형태에 대한 것과 동일 혹은 유사한 이점을 제공한다.
일부의 실시형태에서, 나노입자 혹은 관련된 성분은 허용가능한 비히클과 함께 조성물 내에 포함될 수 있다. 여기서 이용되는 바와 같은 "비히클"이란 용어는 활성 성분으로서 조성물 중에 포함되는 나노입자에 대해서 용매, 담체, 바인더, 부형제 혹은 희석제로서 통상 작용하는 각종 매질이면 어느 것이라도 지칭하는 것이다.
일부의 실시형태에서, 조성물이 개체에 투여되는 경우, 조성물은 약제학적 조성물일 수 있고, 허용가능한 비히클은 약제학적으로 허용가능한 비히클일 수 있다.
일부의 실시형태에서, 나노입자는 부형제 혹은 희석제와 함께 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 특히, 일부의 실시형태에서, 하나 이상의 상용가능하면서 약제학적으로 허용가능한 비히클과, 특히 약제학적으로 허용가능한 희석제 혹은 부형제와 조합하여 나노입자를 함유하는 약제학적 조성물이 개시되어 있다.
여기서 이용되는 바와 같은 "부형제"란 용어는 약물의 활성 성분용의 담체로서 이용되는 비활성 물질을 의미한다. 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물용의 적절한 부형제는 나노입자를 흡수하도록 개인의 신체 능력을 증강시키는 물질이면 어떠한 것이라도 포함한다. 적절한 부형제는 또한 편리하고 정확한 복용을 가능하게 하기 위하여 나노입자를 지니는 제제를 부피를 크게 하는 데 이용될 수 있는 물질이면 어느 것이라도 포함한다. 1회 투약량에서의 그들의 이용에 부가해서, 부형제는 나노입자의 취급에 도움을 주도록 제조 과정에서 이용될 수 있다. 투여 경로 및 약물의 형태에 따라서, 상이한 부형제가 이용될 수 있다. 예시적인 부형제로는, 이들로 제한되지는 않지만, 부착방지제(antiadherent), 바인더, 피복 붕해제(coatings disintegrant), 충전제, 향미제(감미료 등) 및 착색제, 유동성 개선제(glidant), 윤활제, 방부제, 흡수제를 들 수 있다.
여기서 이용되는 바와 같은 "희석제"라는 용어는 조성물의 활성 성분을 희석 혹은 담지하는 데 이용되는 희석 제제를 의미한다. 적절한 희석제는 의약 제제의 점도를 감소시킬 수 있는 물질이면 어느 것이라도 포함한다.
소정의 실시형태에서, 조성물, 특히, 약제학적 조성물은 비경구 투여, 특히 정맥, 피부내 및 근육내 투여를 비롯한 전신 투여를 위해 조제될 수 있다.
비경구 투여용의 예시적인 조성물로는, 이들로 제한되지는 않지만, 멸균 수용액, 주사가능한 용액 혹은 나노입자를 포함하는 현탁액을 들 수 있다. 일부의 실시형태에서, 비경구 투여용의 조성물은, 생물학적으로 상용성인 수성 액체(증류수, 생리학적 용액 혹은 기타 수용액) 중에 동결 건조된/냉동 건조된 형태로 미리 제조된 분말화된 조성물을 용해시킴으로써 사용 시 준비될 수 있다.
"동결건조"(냉동 건조 혹은 저온 건조로도 공지됨)란 용어는 전형적으로 부패하기 쉬운 재료를 보존하거나 재료를 더욱 수송하기 편하게 하는 데 이용되는 탈수 과정을 의미한다. 냉동 건조는 재료를 냉동시키고 나서 주변 압력을 낮추고 재료 중의 동결된 물을 고상에서 기체로 직접 승화시키기에 충분한 열을 가함으로써 행해진다.
약제학적 응용에서, 냉동 건조는 백신 혹은 기타 주사제 등과 같은 제품의 보관 수명을 증가시키는 데도 종종 이용된다. 재료로부터 물을 제거하여 해당 재료를 바이알에 밀봉시킴으로써, 상기 재료는 용이하게 보존, 출하되고, 나중에 주사를 위하여 그의 원래의 형태로 재구성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 나노입자는 규정된 표적으로 전달된다. 일부의 실시형태에서, 표적은 시험관내 생물학적 시스템이고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 나노입자를 표적과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부의 실시형태에서, 제제를 개체에 전달하기 위한 방법이 제공되며, 해당 방법은 각종 개시된 실시형태에 따라서 적절한 나노입자를 제조하는 단계를 포함한다. 나노입자는 또한 개시된 수개의 실시형태에 따라서 약제학적으로 허용가능한 조성물로 제형화될 수도 있다. 상기 방법은 나노입자를 대상에게 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 나노입자를 개체에 전달하기 위하여, 나노입자 혹은 나노입자 제형은 경구, 비경구, 국소 혹은 직장으로 부여될 수 있다. 이들은 각 투여경로에 적합한 형태로 전달된다. 예를 들어, 나노입자 조성물은 태블릿(정제) 혹은 캡슐 형태로, 주사, 흡입, 점안액, 연고, 좌제, 주입물로; 로션 혹은 연고에 의해 국소적으로; 그리고 좌제에 의해 직장으로 투여될 수 있다.
여기서 이용되는 바와 같은 "개체"(individual)란 용어는, 이들로 제한되지는 않지만, 식물이나 동물, 특히 고등동물, 특별히 포유류 등의 척추동물, 특히 인간을 비롯한 단일의 생물학적 유기체를 포함한다.
여기서 이용되는 바와 같은 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"이라는 어구는 통상 주사에 의해, 장관 및 국소 투여 이외의 투여의 형태를 의미하며, 이들로 제한되는 일없이, 정맥, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내(intracapsular), 안와내, 심장내, 인트라데날(intradennal), 복막내, 경기관(transtracheal), 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하(subarachnoid), 척수속, 인트라스테말(intrastemal), 주사 및 주입을 포함한다.
여기서 이용되는 바와 같은 "전신 투여", "전신으로 투여된", "말초 투여"(peripheral administration) 및 "말초에 투여된"이란 어구는, 나노입자 혹은 조성물이 개체의 시스템으로 들어가 대사 등 기타 처리되도록 중앙 신경 시스템으로 직접 이외에 그의 나노입자 혹은 조성물의 투여, 예를 들어, 피하 투여 등을 의미한다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 중의 활성 성분 혹은 제제의 실제 투약 레벨은, 개체에 독성을 주는 일없이, 특정 개체, 조성물 및 투여 형태에 대한 소망의 치료 반응을 달성하는 데 유효한 활성 성분의 양을 얻도록 변화시킬 수 있다.
이들 치료적 폴리머 컨쥬게이트는, 경구, 예를 들어, 분무에 의한 것과 같은 경비, 직장, 질내, 비경구, 수조내, 및 볼내 및 설하 등을 비롯한, 예를 들어, 분말, 연고 혹은 점적제로서, 국소적으로 등과 적절한 임의의 적절한 투여 경로에 의해 치료를 위한 인간 및 기타 동물에 투여될 수 있다.
선택된 투여 경로에 관계없이, 적절한 수화된 형태로 사용될 수 있는 치료적 폴리머 컨쥬게이트 및/또는 본 발명의 약제학적 조성물은, 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 약제학적으로 허용가능한 투약 형태로 제조된다.
특히 일부의 실시형태에서, 전달된 화합물은 개인의 병태(condition)를 치료 혹은 예방하기 위한 약물이다.
"약물" 혹은 "치료제"란 용어는 개체의 병태의 치료, 예방 혹은 진단에 이용될 수 있거나 혹은 다르게는 개체의 신체적 혹은 정신적 복지를 증진시키는 데 이용될 수 있는 활성제를 의미한다.
여기서 이용되는 바와 같은 "병태"란 용어는 통상, 완전한 신체적, 정신적 그리고 가능하게는 사회적 복지와 연관되는 개체의 물리적 상태에 전체로서 혹은 그의 부분의 하나 이상으로서 부합하지 않는 개체의 신체의 물리적 상태를 그의 전체로서 혹은 그의 부분의 하나 이상으로서 의미한다. 본 명세서에 기재된 병태는, 이들로 제한되지는 않지만, 장애와 질환을 포함하며, 여기서, "장애"란 용어는 신체의 혹은 그의 부분의 어느 곳의 기능적 이상과 연관된 살아있는 개체의 병태를 의미하며, "질환"이란 용어는 신체의 혹은 그의 일부의 어느 곳의 정상적인 기능이 손상되어 징후와 증상을 구별함으로써 전형적으로 나타나는 살아있는 개체의 병태를 의미한다. 예시적인 병태로는, 이들로 제한되지는 않지만, 개인의 신체 혹은 그의 일부의 구조와 기능의 개별적이고도 틀에 박히지 않은 변형을 지닌 상해, 무능력, 장애(정신적 및 신체적 장애를 포함함), 증후군, 감염, 비정상적인 거동을 들 수 있다.
여기서 이용되는 바와 같은 "치료"란 용어는 의학적으로 혹은 수술적으로 병태를 다루거나 의료 서비스의 일부인 어떠한 활동도 포함한다.
여기서 이용되는 바와 같은 "예방"이란 용어는 개체 내의 병태로부터의 사망률 혹은 이환률의 부담을 줄이는 어떠한 활동도 포함한다. 이것은 1차, 2차 및 3차 예방 레벨로 일어나며, 즉, a) 1차 예방은 질환의 발생을 피하는 것이고; b) 2차 예방은 조기 질환 치료를 목표로 해서 질환의 진전 및 증상의 각성을 예방하기 위하여 개입의 기회를 증가시키는 활동을 의미하며; c) 3차 예방은 기능을 회복시켜 질환 관련 합병증을 줄임으로써 이미 확립된 질환의 부정적인 영향을 줄이는 것이다.
본 명세서에 기재된 나노입자에 의해 전달될 수 있고 약물로서 적합한 예시적인 화합물은 방사선 치료(붕소 중성자 포획)에 이용될 전자기 방사선(10B 동위원소 등)을 방출할 수 있는 화합물을 포함한다. 추가의 치료제는 당업계에 공지된 것들을 비롯하여 친지성 혹은 친수성이면서 합성 혹은 천연 유래의 생물학적으로 활성인 치료제이면 어떠한 것이라도 포함한다. 이에 대해서는 문헌[Merck Index, An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, 13th Edition, 2001, Merck and Co., Inc., Whitehouse Station, N.J.]을 참조할 수 있다. 이러한 치료제의 예로는, 이들로 제한되지는 않지만, 소분자 조제약, 항생제, 스테로이드, 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 게놈 DNA, cDNA, mRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오타이드, 바이러스 및 키메라(chimeric) 폴리뉴클레오타이드), 플라스미드, 펩타이드, 펩타이드 단편, 소분자(예컨대 독소루비신), 킬레이트제(예컨대, 데페록사민(DESFERAL), 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)), 중성 제품(예컨대, 탁솔, 암포테리신), 및 예를 들어 단백질 및 효소 등과 같은 기타 생물학적으로 활성인 거대분자를 들 수 있다. 또, 본 명세서에 기재된 나노입자와 함께 치료제로서 이용될 수 있는 활성제(치료제)를 열거하고 있는 미국 특허 제6,048,736호 공보도 참조할 수 있다. 소분자 치료제는 복합체 입자 내에서 치료제일 뿐만 아니라, 추가의 실시형태에서는 복합체 내에서 폴리머에 공유 결합되어 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 공유결합은 (예컨대, 다이설파이드 등과 같은 생분해성 결합이나 전구약물 형태를 통해서) 가역적일 수 있고, 치료제를 전달하는 다른 방식을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 나노입자와 함께 전달될 수 있는 치료제로는 에포틸론(epothilone), 캄토테신계 약물, 탁솔 등과 같은 화학적 치료제, 또는 플라스미드, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 압타머 혹은 이들의 조합물, 및 본 명세서를 읽은 당업자에 의해 확인가능한 추가의 약물을 들 수 있다.
일부의 실시형태에서, 전달되는 화합물은 개체의 세포나 조직을 영상화하는 데 적합한 화합물이다. 본 명세서에 기재된 나노입자에 의해 전달될 수 있고 영상화에 적합한 예시적인 화합물은 MR 영상화용의 19F 동위원소, PET 영상화용의 18F 혹은 64Cu 등과 같은 동위원소를 함유하는 화합물을 포함한다.
특히, 본 명세서에 기재된 나노입자는 19F-함유 BA 폴리머를 함유하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 19F 원자는 비분해성 혹은 분해성 BA 폴리머 화합물 내에 편입될 수 있다. 19F 원자용의 기타 개소는 BA 폴리머 성분 상, 폴리올 폴리머 성분 상 혹은 전달될 제제 상에 가능하다. 이들 및 기타 변형예는 당업자에게 명확할 것이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 나노입자는 농업에 이용되는 화학물질을 전달하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 나노입자에 의해 전달된 제제는 살미생물성(혹은 살균성)(microbiocidal) 및 농업 효용성을 지니는 생물학적으로 활성인 화합물이다. 이들 생물학적으로 활성인 화합물은 당업계에 공지된 것을 포함한다. 예를 들어, 적절한 농업· 생물학적으로 활성인 화합물로는, 이들로 제한되지는 않지만, 비료, 살진균제, 제초제, 살충제 및 방미제(mildewcide)를 들 수 있다. 살균제는 또한 냉각수용의 도시용수 공급 및 산업용수 시스템, 제지에서의 백수 시스템(white water system)을 취급하는 수처리에서 이용된다. 미생물에 민감한 수성 시스템은 피혁 산업, 섬유 산업 및 코팅 혹은 도료 산업에서 발견된다. 이러한 살균제 및 그들의 용도의 예는, 미국 특허 제5,693,631호, 제6,034,081호 및 제6,060,466호 공보에 있어서, 개별적으로 조합해서 기재되어 있고, 이들 공보는 참조로 본 명세서에 포함된다. 전술한 것들과 같은 활성제를 함유하는 조성물은 활성제 자체에 대해서 공지된 것과 마찬가지 방식으로 이용될 수 있다. 명백하게는, 이들 용도는 약학적 용도가 아니기 때문에, 해당 복합체의 폴리머는 반드시 약제학적 용도에서 요구되는 독성 프로파일을 충족시킬 필요는 없다.
소정의 실시형태에서, 폴리올 폴리머 및 BA 폴리머를 포함하는 나노입자는, 나노입자를 이용해서 여기에 나타낸 화합물, 특히 제제의 어느 것이라도 전달하는 데 적합한 시스템에 포함된다. 해당 시스템의 소정의 실시형태에 있어서, 나노입자는 개체에 투여하기 위하여 나노입자를 제조하는 데 적합한 성분과 함께 제공된다.
본 명세서에 개시된 시스템은 키트의 부분의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 폴리올 폴리머 및/또는 BA 폴리머는 분자 단독으로서 혹은 적절한 부형제, 비히클 혹은 희석제의 존재 하에 포함될 수 있다.
키트의 부분에서, 적절한 비히클 담체 혹은 보조제와 함께 가능하게는 조성물에 포함되는 폴리올 폴리머, BA 폴리머 및/또는 전달될 제제는 독립적으로 키트 내에 포함된다. 예를 들어, 폴리올 폴리머 및/또는 BA 폴리머는 하나 이상의 조성물 단독 내에 포함될 수 있고/있거나 적절한 벡터 내에 포함될 수 있다. 또한, 전달될 제제는 적절한 비히클 담체 혹은 보조제와 함께 조성물 내에 포함될 수 있다. 대안적으로, 상기 제제는 최종 사용자에 의해 공급될 수 있고, 키트의 부분에 없을 수도 있다. 또한, 폴리올 폴리머, BA 폴리머 및/또는 제제는 나노입자 내로의 적절한 편입에 적합한 각종 형태로 포함될 수 있다.
추가의 성분이 포함될 수도 있고, 또한 미소유체 칩(microfluidic chip), 기준 표준, 완충제, 및 본 명세서를 읽은 당업자에 의해 확인가능한 추가의 성분을 포함한다.
본 명세서에 개시된 키트의 부분에 있어서, 해당 키트의 구성요소는, 본 명세서에 개시된 방법을 수행하기 위하여, 적절한 설명서와 기타 필요한 시약과 함께 제공될 수 있다. 일부의 실시형태에서, 상기 키트는 별도의 용기 내에 조성물을 수용할 수 있다. 설명서, 예를 들어, 평가를 수행하기 위하여, 테이프 혹은 CD-ROM 등의 전자 지지체 혹은 종이 상에 기록된 혹은 음성 설명서도 상기 키트 내에 포함될 수 있다. 상기 키트는 또 특정 사용방법에 따라 기타 포장된 시약 및 재료(세정 완충제 등)를 포함할 수도 있다.
조성물의 적절한 캐리어 제제 혹은 보조제의 확인, 그리고 키트의 일반적인 제조 및 포장과 관련된 추가의 상세는 본 명세서를 읽은 당업자에 의해 확인가능할 수 있다.
일부의 실시형태에서, 나노입자는 해당 나노입자의 개별적인 성분을 준비하고 나서 소망의 복합 나노입자 구조체에 도달하기 위한 각종 수순으로 성분들을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 성분들의 제조 및 혼합은 당업자에 의해 공지된 적절한 용액 중에서 수행될 수 있다.
여기서 이용되는 바와 같은 "혼합"이란 용어는 대상 분자를 포함하는 하나의 용액을 다른 대상 분자를 포함하는 다른 용액에 첨가하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 폴리올 폴리머의 수용액은 본 명세서의 본문에 있어서의 BA 폴리머의 수용액과 혼합될 수 있다.
여기서 이용되는 바와 같은 "용액"이란 용어는 대상 분자를 함유하는 임의의 액상 샘플을 나타낸다. 예를 들어, 폴리올 폴리머의 수용액은 물 혹은 임의의 완충 용액, 특히 수용액에 희석된 폴리올 폴리머를 포함할 수 있다.
일부의 실시형태에서, 나노입자는 폴리올 폴리머를 전달될 제제와 혼합하여( 도 1 및 도 2 ), 폴리올 폴리머-제제 나노입자를 형성함으로써 제조될 수 있다. 다른 실시형태에서, 나노입자는 BA 폴리머를 폴리올 폴리머-제제 나노입자와 더욱 혼합함으로써 제조될 수 있다. 다른 실시형태에서, 나노입자는 폴리올 폴리머를 BA 폴리머와 혼합하고 나서, 전달될 제제와 혼합함으로써 제조된다. 또 다른 실시형태에서, 나노입자는 폴리올 폴리머, BA 폴리머 및 전달될 제제를 동시에 혼합함으로써 제조된다.
일부의 실시형태에서, 나노입자는 본 명세서의 각종 실시형태에 따른 폴리올 폴리머-제제 컨쥬게이트를 형성하고 나서, 폴리올 폴리머-제제 컨쥬게이트로 이루어진 나노입자를 제조함으로써 제조된다. 다른 실시형태에서, 폴리올 폴리머-제제 컨쥬게이트로 이루어진 나노입자는 적절한 수용액 중에 나노입자를 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 폴리올 폴리머-제제 컨쥬게이트로 이루어진 나노입자는 폴리올 폴리머-제제 컨쥬게이트를 표적화 리간드를 제공하거나 제공하지 않는 BA 폴리머와 혼합함으로써 제조될 수 있다.
일부의 실시형태에서, 나노입자는 폴리올 폴리머를 전달될 제제를 지닌 소수성 폴리머 블록과 혼합하고 나서, 본 발명의 실시형태에 따른 변성된 마이셀을 제조함으로써 제조될 수 있다. 다른 실시형태에서, 나노입자는 변성된 마이셀을 BA 폴리머와 더욱 혼합함으로써 제조될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 나노입자는 폴리올 폴리머를 BA 폴리머와 혼합하고 나서, 전달될 제제를 혼합하여, 변성된 마이셀인 나노입자를 제조함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 일부의 실시형태에서, 나노입자는 폴리올 폴리머로 컨쥬게이트된 지질을 BA 폴리머 및/또는 전달될 제제와 혼합하여, 변성된 리포솜을 제조함으로써 제조될 수 있다. 각종 실시형태에서, 나노입자는 폴리올 폴리머로 컨쥬게이트된 지질을 BA 폴리머와 혼합하고 나서 전달될 제제를 혼합함으로써 제조될 수 있다. 다른 실시형태에서, 나노입자는 폴리올 폴리머로 컨쥬게이트된 지질을 전달될 제제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 다른 실시형태에서, 나노입자는 폴리올 폴리머로 컨쥬게이트된 지질을 전달될 제제와 혼합하고 나서 BA 폴리머를 혼합하여, 변성된 리포솜인 나노입자를 제조함으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자의 형성은 당업자에게 공지된 기술 및 절차에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 겔 지연 분석은 나노입자 내에 핵산 제제의 편입을 모니터링하고 측정하는 데 이용된다(실시예 10). 몇몇 실시형태에서, 적절한 나노입자 크기 및/또는 제타 전위는 공지된 방법(실시예 11)을 이용해서 채택될 수 있다.
조성물의 적절한 캐리어 제제 혹은 보조제의 확인, 그리고 키트의 일반적인 제조 및 포장에 관한 추가의 상세는 본 명세서를 읽은 당업자에 의해 확인될 수 있다.
실시예
본 명세서에 기재된 방법 및 시스템은 이하의 실시예에 더욱 예시되고, 이하의 실시예는 예시를 위해 제공되는 것인 바, 제한하는 것으로 의도된 것은 아니다. 당업자라면, 핵산 검출 방법 및 기타 표적, 예컨대, 단백질, 항원, 진핵 혹은 원핵 세포 등이 검출 방법에 대해 상세히 기재된 특성의 이용가능성을 확인할 수 있을 것이다.
모든 화학 시약은 시판 공급업체로부터 얻어졌으며, 또한 추가의 정제없이 입수된 그대로 이용되었다. 폴리머 샘플은 시차 굴절률(RI) 검출기, 차동 점도계 및 저각 광산란 검출기로 이루어진 TDA 302 삼중 검출기가 장비된 비스코텍(Viscotek) GPC 시스템에서 분석되었다. 7.5% 아세트산 용액이 1㎖/min의 유량으로 용리액으로서 이용되었다.
개똥벌레 루시페라제 유전자를 함유하는 플라스미드인 pGL3를, pGL3를 발현하는 박테리아로부터 추출하여 정제시켰다. siGL3(서열은 이하의 표 1에 제공됨)는 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈사(Integrated DNA Technologies)로부터 구입하였다. siCON1(서열은 이하의 표 1에 제공됨)은 다마콘사(Dharmacon)로부터 구입하였다. 양이온성 점액산 다이아민-DMS 폴리머에 의한 pDNA 혹은 siRNA 전달 효능을 판정하기 위하여 헬라 세포를 이용하였다.
Figure pct00016
실시예 1: 점액산 다이메틸에스터(1)의 합성
점액산(알드리치사 제품) 5g(22.8 m㏖)을, 메탄올 120㎖ 및 진한 황산 0.4㎖를 수용하는 500㎖ 둥근 바닥 플라스크에 가하였다. 이 혼합물을 일정한 교반 하에 85℃에서 하룻밤 환류시켰다. 해당 혼합물을 이어서 여과하고, 메탄올에 의한 세정 후, 메탄올 80㎖와 트라이에틸아민 0.5㎖의 혼합물로부터 재결정하였다. 진공 하에 하룻밤 건조 후, 점액산 다이메틸 에스터 8.0g(33.6m㏖, 71%)을 얻었다. 1H NMR((CD3)2SO) δ 4.88-4.91 (d, 2H), 4.78-4.81 (m, 2H), 4.28-4.31 (d, 2H), 3.77-3.78 (d, 2H), 3.63 (s, 6H). ESI/MS (m/z): 261.0 [M+Na]+
Figure pct00017
실시예 2: N- BOC -보호된 점액산 다이아민(2)의 합성
점액산 다이메틸 에스터(1; 실시예 1) 8g(33.6 m㏖), 트라이에틸아민 12.4㎖(88.6 m㏖) 및 메탄올 160㎖의 혼합물을, 메탄올(32㎖) 중에 용해된 N-BOC 다이아민(플루카사 제품) 14.2g(88.6 m㏖)의 첨가 전에 0.5시간 일정한 교반 하에 500㎖ 둥근 바닥 플라스크에서 85℃에서 환류 하에 가열하였다. 이 반응 현탁액을 이어서 환류에 복귀시켰다. 하룻밤 환류 후, 해당 혼합물을 여과, 메탄올에 의한 세정, 메탄올로부터의 재결정, 이어서 진공 하 건조를 행하여 N-BOC-보호된 점액산 다이아민 9.4g(19 m㏖, 57%)을 수득하였다. 1H NMR((CD3)2SO)) δ 7.66 (m, 2H), 6.79 (m, 2H), 5.13-5.15 (d, 2H), 4.35-4.38 (d, 2H), 4.08-4.11 (m, 2H), 3.78-3.80 (d, 2H), 2.95-3.15 (m, 8H), 1.38 (s, 18). ESI/MS (m/z): 517.1 [M+Na]+
Figure pct00018
실시예 3: 점액산 다이아민(3)의 합성
메탄올(160㎖) 중 3M HCl을 수용하는 500㎖ 둥근 바닥 플라스크에 N-BOC-보호된 점액산 다이아민(2; 실시예 2) 8g(16.2 m㏖)을 옮기고, 일정한 교반 하에 85℃에서 하룻밤 환류시켰다. 침전물을 이어서 여과하여, 메탄올로 세정 후 진공 건조시켜, 점액산 다이아민 5.7g(15.6 m㏖, 96%)을 수득하였다. 1H NMR((CD3)2SO) δ 7.97 (m, 8H), 5.35-5.38 (m, 2H), 4.18-4.20 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 3.35-3.42 (m, 8H), 2.82-2.90 (m, 4H). ESI/MS (m/z): 294.3 [M]+, 317.1 [M+Na]+, 333.0 [M+K]+
Figure pct00019
실시예 4: 점액산 다이아민 - DMS 코폴리머 ( MAP )(4)
1.5㎖ 에펜도르프 관(eppendorff tube)에 0.1M NaHCO3 0.8㎖ 중의 실시예 3의 비스(하이드로클로라이드)염(3) 85.5㎎(0.233 m㏖)의 용액을 충전하였다. 다이메틸수베르이미데이트-2HCl(DMS, 피어스 케미컬사(Pierce Chemical Co.) 제품, 63.6㎎, 0.233 m㏖)을 가하고 이 용액을 와류시키고(vortexed) 원심분리시켜 상기 성분들을 용해시켰다. 얻어진 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 이어서 상기 혼합물을 물 8㎖로 희석하고, 1N HCl의 첨가에 의해 pH를 4로 조정하였다. 이 용액을 이어서 ddH2O 중 3500 MWCO 투석막(피어스 주름부착 투석막)으로 24시간 동안 투석하였다. 투석된 용액을 동결 건조시켜 백색의 솜털 같은 분말 49㎎을 수득하였다. 1H NMR(5㎒, dDMSO) δ 9.15 (bs), 7.92 (bs), 5.43 (bs), 4.58 (bs), 4.17 (bs), 3.82 (bs), 3.37 (bs), 3.28 (bs), 2.82 (bs), 2.41 (bs), 1.61 (bs), 1.28 (bs). 13C NMR (1㎒, dDMSO) δ 174.88 (s, 1H), 168.38 (s, IH), 71.45 (s, 4H), 71.22 (s, 3H), 42.34 (s, 2H), 36.96 (s, 3H), 32.74 (s, 3H), 28.09 (s, 4H), 26.90 (s, 4H). Mw [GPC] = 2520, Mw/Mn = 1.15.
Figure pct00020
폴리머 4는 양이온성 A-B 타입(반복 단위는 ABABAB....임)의 폴리올을 함유하는 폴리머의 일례이다.
실시예 5: 보론산 - 아마이드 - PEG 5000 (5)
실시예 4의 폴리머가 핵산, 예컨대, siRNA에 조립되는 경우, 이들은 나노입자를 형성할 것이다. 이들 나노입자는 포유 동물에 사용될 입체구조 안정화를 지닐 필요가 있을 것이고, 임의선택적으로 이들은 표적화 제제를 포함할 수 있었다. 이들 두 기능을 수행하기 위하여, 나노입자는 입체구조 안정화용의 PEG와 PEG-표적화 리간드로 꾸며질 수 있다. 이렇게 하기 위하여, 보론산을 함유하는 PEG 화합물이 준비된다. 예를 들어, 보론산을 함유하는 PEG는 이하의 예에 따라서 합성될 수 있다.
4-카복시페닐보론산(2 m㏖) 332㎎을 SOCl2 8㎖에 용해시켰다. 이것에 DMF 수 방울을 가하고, 이 혼합물을 2시간 동안 아르곤 하에 환류시켰다. 과잉의 SOCl2를 감압 하에 제거하고, 얻어진 고형물을 무수 다이클로로메탄 10㎖ 중에 용해시켰다. 이 용액에, 0℃에서 아르곤 하에 다이클로로메탄 5㎖에 용해된 트라이에틸아민(60 m㏖) 418㎕ 및 PEG5000-NH2(2 m㏖) 500㎎을 가하였다. 얻어진 혼합물을 실온까지 가온시키고 교반을 하룻밤 계속하였다. 다이클로로메탄 용매를 감압 하에 제거하고, 얻어진 액체를 다이에틸 에터 20㎖로 석출시켰다. 얻어진 석출물을 여과시켜, 건조시키고 나서 ddH2O 중에 재용해시켰다. 이어서, 얻어진 수용액을 0.45㎛ 필터로 여과시키고, ddH2O 중의 3500 MWCO 투석막(피어스 주름부착 투석관)을 이용해서 24시간 투석하였다. 투석된 용액을 동결 건조시켰다. 1H NMR(3㎒, dDMSO) δ 7.92-7.77 (m), 4.44 (d), 4.37 (t), 3.49 (m), 2.97 (s).
Figure pct00021
실시예 6: 보론산 - 다이설파이드 - PEG 5000 (6)
실시예 5의 PEG 화합물의 분해성 버전(환원 조건 하)은 또한 다음과 같이 합성될 수 있다.
PEG5000-SH(0.05 m㏖, LaySanBio Inc.) 250㎎을 교반봉이 장착된 유리제 바이알에 가하였다. 이것에 메탄올 4㎖ 중에 용해된 알드리티올-2(0.5 m㏖, 알드리치사 제품) 110㎎을 가하였다. 이 용액을 실온에서 2시간 교반하고 나서, 메탄올 1㎖ 중의 머캅토페닐보론산(0.5 m㏖, 알드리치사 제품) 77㎎을 가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 추가의 2시간 동안 교반하였다. 진공 하에 메탄올을 제거하고, 잔사를 다이클로로메탄 2㎖ 중에 재용해시켰다. 다이에틸 에터 18㎖를 다이클로로메탄 용액에 가하고, 이 혼합물을 1시간 방치하였다. 얻어진 석출물을 원심분리를 통해서 회수하고 다이에틸에터로 수회 세척 후 건조시켰다. 건조된 고형물을 물에 재용해시키고, 0.45㎛ 필터로 여과시키고 나서, ddH2O 중 3500 MWCO 투석막(피어스 주름부착 투석관)으로 15시간 투석시켰다. 투석된 용액을 동결 건조시켰다. 1H NMR(3㎒, dDMSO) δ 8.12-8.00 (m), 7.83-7.72 (m), 7.72-7.61 (m), 7.61-7.43 (m), 3.72 (d, J= 5.4), 3.68-3.15 (m), 3.01-2.83 (m).
Figure pct00022
실시예 7: (2,3,5,6)- 테트라플루오로페닐 보론산 - PEG 5000 (7)의 합성
실시예 5의 보론산을 함유하는 PEG 화합물의 불소화 버전이 합성되어 치료적 나노입자를 지닌 조영제로서 이용될 수 있다. 영상화하기 위한 불소 원자는 이하에 설명되고 예시된 바와 같이 내포될 수 있다.
(2,3,5,6)-플루오로카복시페닐보론산을 과잉의 SOCl2(~ 100 eq.)에 용해시키고, 이것에 수 방울의 DMF를 가한다. 이 혼합물을 2시간 동안 아르곤 하에 환류시킨다. 과잉의 SOCl2를 감압 하에 제거하고, 얻어진 잔사를 무수 다이클로로메탄에 용해시킨다. 이 용액에, 다이클로로메탄 중에 용해된 PEG5000-NH2(1 eq.) 및 트라이에틸아민(30 eq.)을 0℃에서 아르곤 하에 가한다. 얻어진 혼합물을 실온까지 가온시키고 하룻밤 계속 교반하였다. 다이클로로메탄 용매를 감압 하에 제거하고, 얻어진 액체를 다이에틸 에터로 석출시켰다. 얻어진 석출물을 여과하고, 건조시켜 ddH2O에 재용해시켰다. 이어서 해당 수용액을 0.45㎛ 필터로 여과시키고, ddH2O 중의 3500 MWCO 투석막(피어스 주름부착 투석관)으로 24시간 투석시킨다. 투석된 용액을 동결 건조시킨다.
Figure pct00023
불소 함유 화합물은 나노입자 중의 19F를 제공하는 데 유용하다. 19F는 표준 환자 MRI를 이용해서 자기공명 분광법에 의해 검출될 수 있다. 19F의 첨가는 나노입자를 영상화하는 것이 가능하다(영상화만을 위해서 수행될 수 있거나, 치료제의 첨가에 의해서 영상화와 치료를 가능하게 한다).
실시예 8: (2,3,5,6)- 테트라플루오로페닐 보론산 - 다이설파이드 - PEG 5000 (8)의 합성
실시예 5의 보론산을 함유하는 분해성 PEG 화합물의 불소화 버전은 합성되어, 치료적 나노입자를 지니는 조영제로서 이용될 수 있다. 영상화를 위한 불소원자는 이하에 설명되고 예시된 바와 같이 내포될 수 있다.
PEG5000-SH(0.05 m㏖, LaySanBio Inc.) 250㎎을 교반봉을 장비한 유리제 바이알에 가한다. 이것에 메탄올 4㎖ 중에 용해된 알드리톨-2(0.5 m㏖, 알드리치사 제품) 110㎎을 가한다. 이 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 메탄올 1㎖ 중 (2,3,5,6)-플루오로-4-머캅토페닐보론산(0.5 m㏖) 77㎎을 가한다. 얻어진 용액을 실온에서 추가로 2시간 교반한다. 메탄올을 진공 하에 제거하고, 잔사를 다이클로로메탄 2㎖ 중에 재용해시킨다. 이 다이클로로메탄 용액에 다이에틸 에터 18㎖를 가하고 해당 혼합물을 1시간 동안 정치시킨다. 얻어진 석출물을 원심분리를 통해 회수하고, 다이에틸에터로 수회 세척하고 건조시켰다. 건조된 고형물을 물에 재용해시켜 0.45㎛ 필터로 여과시키고, ddH2O 중의 3500 MWCO 투석막(피어스 주름부착 투석관)으로 15시간 투석시킨다. 투석된 용액을 동결 건조시킨다.
Figure pct00024
실시예 9: 보론산 - PEG 5000 - 트랜스페린(9)의 합성
표적화제는, 예를 들어, 트랜스페린의 부착을 기준으로 해서 도 12 에 개략적으로 예시된 접근법에 따라, 실시예 5 내지 8의 화합물 중의 보론산으로부터 PEG의 타단부에 배치될 수 있었다.
이와 같이 해서, 치료제로서 핵산을 함유하는 시스템의 구성 성분, 예를 들어, 표적화 리간드는 단백질 유사 트랜스페린( 도 12 ), 항체 혹은 항체 단편, 펩타이드 유사 RGD 혹은 LHRH, 소분자 유사 엽산염 혹은 갈락토스 등일 수 있었다. 보론산 페길화된 표적화제는 다음과 같이 합성될 수 있다.
특히, 도 12에 개략적으로 나타낸 접근법에 따른 보론산 PEG5000-트랜스페린을 합성하기 위하여, 이하의 절차가 수행되었다. 0.1M PBS 완충액(p.H. 7.2) 1㎖ 중의 인간 홀로-트랜스페린(철 풍부)(시그마 알드리치사 제품) 10㎎(0.13μ㏖)의 용액을 OPSS-PEG5000-SVA(5eq, 0.64μ㏖, LaysanBio Inc.) 3.2㎎에 가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 2시간 교반하였다. 미반응된 OPSS-PEG5000-SVA로부터 울트라셀(Ultracel) 50,000 MWCO(Amicon Ultra-4, 밀리포어사(Millipore) 제품)를 이용해서, 그리고 미반응된 트랜스페린으로부터 겔여과칼럼 G3000SWxl(토소 바이오셉사(Tosoh Biosep) 제품)을 이용해서 페길화된 트랜스페린을 정제하였다(HPLC 및 MALDI-TOF 분석에 의해 확인됨). 이어서, 100㎕ 중의 OPSS-PEG5000 페길화된 트랜스페린 100㎍을 20㎕, 4-머캅토페닐보론산(1㎍/㎕, 20㎍, 100 eq.)에서 1시간 실온에서 배양하였다. 배양 후, 해당 용액을 YM-30,000 NMWI 장치(밀리포어사 제품)를 이용해서 2회 투석하여 과잉의 4-머캅토페닐보론산과 부산물로서의 피리딜-2-티온을 제거하였다.
실시예 10: MAP -핵산 입자의 형성 - 겔 지연 분석
도 1 에 도해된 바와 같이, DNA 분해효소 및 RNA 분해효소 무함유 수(DNAse and RNASe free water)(0.1㎍/㎕, 10㎕) 중의 플라스미드 DNA 혹은 siRNA 1㎍을 DNA 분해효소 및 RNA 분해효소 무함유 수 중의 각종 농도에서 MAP 10㎕와 혼합하여 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 및 5의 전하비(폴리머 상의 "+" 전하 대 핵산 상의 "-" 전하)를 얻었다. 얻어진 혼합물을 실온에서 30분 배양하였다. 20㎕ 용액 중 10㎕를 로딩 버퍼(loading buffer) 3.5㎕를 지닌 1% 아가로스 겔 상에 반입하고, 해당 겔을 도 3 및 도 4 에 도시된 바와 같이 45분 동안 80에서 전기영동시켰다. 나노입자 내에 함유되지 않은 핵산은 겔 상으로 이동할 것이다. 이들 결과는 나노입자 내의 핵산 오염물을 위해 필요한 전하비에 대한 지침을 제공한다.
실시예 11: MAP -핵산 입자의 입자 크기 및 제타 전위
DNA 분해효소 및 RNA 분해효소 무함유 수(0.1㎍/㎕, 10㎕) 중의 플라스미드 DNA 1㎍을 DNA 분해효소 및 RNA 분해효소 무함유 수 중의 각종 농도에서 MAP 10㎕와 혼합하여 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 및 5의 전하비를 얻었다. 얻어진 혼합물을 실온에서 30분 배양하였다. 이어서 이 혼합물 20㎕를 입자크기 측정을 위하여 DNA 분해효소 및 RNA 분해효소 무함유 수로 70㎕까지 희석시켰다. 이 70㎕ 용액을 이어서 제타 전위 측정을 위하여 1mM KCl로 1400㎕까지 희석하였다. 입자크기 및 제타 전위 측정은 ZetaPals 동적 광산란(DLS) 기기(브룩헤븐 인스트루먼트사 제품) 상에서 행하였다. 이 결과는 도 5 에 도시되어 있다.
실시예 12: 보론산 PEG 5k 를 이용한 페길레이션에 의한 입자 크기 안정화
도 2 에 도시된 바와 같이, DNA 분해효소 및 RNA 분해효소 무함유 수(0.45㎍/㎕, 4.4㎕) 중의 플라스미드 DNA 2㎍을 DNA 분해효소 및 RNA 분해효소 무함유 수 중에서 80㎕까지 희석하였다. 이 플라스미드 용액을 DNA 분해효소 및 RNA 분해효소 무함유 수 중의 80㎕까지 더욱 희석된 MAP(0.5㎍/㎕, 9.8㎕) 4.89㎍와 혼합하여, 0.0125㎍/㎕의 최종 플라스미드 및 3 +/- 전하비를 얻었다. 얻어진 혼합물을 실온에서 30분간 배양하였다. 이 용액에 보론산 PEG5K(화합물 6; 실시예 6)(20㎍/㎕, 24㎕) 480㎍을 가하였다. 이 혼합물을 이어서 30분간 더욱 배양하고, 0.5㎖ 100,000 MWCO 막(BIOMAX, 밀리포어사 제품)을 이용해서 DNA 분해효소 및 RNA 분해효소 무함유 수 중에 2회 투석하고, DNA 분해효소 및 RNA 분해효소 무함유 수 160㎕ 중에 재구성하였다. 해당 용액의 절반을 제타 전위 측정을 위하여 1mM KCl 1.4㎖로 희석하였다( 도 6 ). 단, BA 함유 나노입자의 제타 전위는 그렇게 하지 않은 나노입자보다 낮은 제타 전위를 보인다. 이들 결과는 BA 함유 나노입자가 나노입자의 외부 상에 편재화된 BA를 지닌다는 결론을 뒷받침한다. 나머지 절반을 이용해서 입자크기를 측정하였다. 해당 입자크기는 5분 동안 매 분마다 측정되었고, 그 후 최종 90.2㎕ 용액이 1X PBS 중에 있도록 10X PBS 10.2㎕를 가하였다. 이어서, 입자크기를 도 7 에 도시된 바와 같이 또 다른 10분 동안 매 분마다 재차 측정하였다. 비입자(non-particle) 성분으로부터 (여과에 의해) 분리된 BA 함유 나노입자는 PBS 중에서 안정적인 반면, BA를 함유하지 않은 입자는 그렇치 않았다. 이들 데이터는 BA 함유 나노입자가 PBS 중에서의 응집에 대해 안정화되므로 그들의 외부 상에 편재화된 BA를 지닌다는 결론을 뒷받침한다.
실시예 13: 헬라 세포 내로의 MAP / pDNA 입자의 트랜스펙션
헬라 세포를 트랜스펙션 전에 24웰 플레이트에서 48시간 20,000 세포/웰로 파종하고, 10% FBS가 보충된 배지에서 성장시켰다. MAP 입자는 pDNA에 대한 폴리머의 각종 전하비에서 Opti-MEM I 200㎕ 중 pGL3 1㎍이 얻어지도록 조성되었다(실시예 9 참조). 성장 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고 상기 입자 조성물을 첨가하였다. 해당 세포를 이어서 10% FBS가 보충된 성장 배지 800㎕의 첨가 전에 37℃, 5% CO2에서 5시간 동안 배양하였다. 48시간의 배양 후, 세포의 분획은 MTS 분석평가를 이용해서 세포 생존율을 위해 분석하였다. 나머지 세포를 1X 루시페라제 세포 배양 용해 시약 100㎕ 중에 용해시켰다. 루세페라제 활성은 세포 용해물 10㎕에 루시페라제 분석 시약 100㎕를 첨가함으로써 결정하였고, 생물 발광은 모노라이트 발광측정기(Monolight luminometer)를 이용해서 정량화하였다. 루시페라제 활성은 이어서 RLU/10,000 세포로서 기록되었다. 그 결과는 도 8 및 도 9 에 도시되어 있다.
실시예 14: 헬라 세포 내로의 MAP / pDNA 및/또는 siRNA 입자의 코- 트랜스펙션
헬라 세포를 트랜스펙션 전에 24웰 플레이트에서 48시간 20,000 세포/웰로 파종하고, 10% FBS가 보충된 배지에서 성장시켰다. MAP 입자는 5+/-의 전하비에서 Opti-MEM I 200㎕ 중 pGL31㎍ 및 siGL3 50 nM을 함유하도록 조성하였다. pGL3 혹은 pGL3 및 siCON만을 함유하는 입자를 대조군으로서 이용하였다. 성장 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고, 상기 입자 조성물을 첨가하였다. 이 세포를 계속해서 10% FBS가 보충된 성장 배지 800㎕의 첨가 전에 37℃, 5% CO2에서 5시간 배양하였다. 배양 48시간 후, 실시예 12에 기재된 바와 같이 세포를 루시페라제 활성 및 세포 생존율을 위해 분석 평가하였다. 그 결과는 도 10 에 도시되어 있다. RLU가 siGL3(보정 서열)에 의한 트랜스펙션에서 저하되므로, siGL3와 pGL3는 함께 전달될 필요가 있다.
실시예 15: 헬라- LUC 세포 내로의 MAP / siGL3 의 트랜스펙션
헬라-LUC 세포(개똥벌레 루시페라제 단백질에 대해 코드화하는 유전자를 함유함)를 트랜스펙션 전에 24웰 플레이트에서 20,000 세포/웰에 48시간 파종하고, 10% FBS가 보충된 배지에서 성장하였다. MAP 입자는 5 +/-의 전하비에서 Opti-MEM I의 200㎕ 중의 50 및 100 nM siGL3를 함유하도록 조성되었다. 성장 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고, 상기 입자 조성을 첨가하였다. 세포는 계속해서 10% FBS가 보충된 성장 배지 800㎕의 첨가 전에 37℃, 5% CO2에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 48시간 후, 실시예 12에 기재된 바와 같이 루시페라제 활성 및 세포 생존율에 대해 세포를 분석평가하였다. 그 결과는 도 11 에 도시되어 있다. RLU는 siGL3의 농도가 증가함에 따라 감소하므로, 이들 데이터는 내인성 유전자의 억제가 일어날 수 있는 것을 시사한다.
실시예 16: 점액산 다이아이오다이드(10)의 합성
점액산 다이아민(실시예 3) 1g(2.7 m㏖)을, 250㎖ 둥근 바닥 플라스크 중의 아이오도아세틸클로라이드 1.2㎖(13.7 m㏖)의 적가 전에 트라이에틸아민 3.8㎖(27.4 m㏖) 및 무수 DMF 50㎖와 혼합하였다. 이 혼합물을 실온에서 일정한 교번 하에 하룻밤 반응시켰다. 용매를 이어서 진공 펌프에 의해 제거하고, 생성물을 여과, 메타올에 의한 세정 및 진공 하 건조시켜, 점액산 다이아이오다이드 0.8g(1.3 m㏖, 46 %)을 수득하였다. 1H NMR((CD3)2SO) δ 8.20 (s 2H), 2H), 7.77 (s, 2H), 4.11 (m, 2H), 4.03 (m, 2H), 3.79 (m, 2H), 3.11-3.17 (m, 2H), 1.78 (d, 2H). ESI/MS (m/z): 652.8 [M+Na]+
Figure pct00025
실시예 17: 점액산 다이시스테인(11)의 합성
0.1M 탈기된 탄산나트륨 7㎖에 L-시스테인 17㎎과 점액산 다이아이오다이드 0.4g을 가하였다. 얻어진 현탁액을 용액이 투명하게 될 때까지 5시간 동안 150℃에서 환류시켰다. 이 혼합물을 이어서 실온까지 냉각시키고 1N HCl을 통해서 pH 3까지 조정하였다. 이어서 생성물의 침전을 위해 아세톤을 서서히 첨가하였다. 여과, 아세톤에 의한 여과 및 진공 건조 후, 조질의 생성물 60㎎을 얻었다.
Figure pct00026
실시예 17-1: 점액산 다이시스테인(11)의 합성
50㎖ 둥근 바닥 플라스크 중에 pH 7.5의 0.1M 탈기된 인산나트륨 완충액 20㎖에 L-시스테인(3.2 m㏖) 0.38g 및 점액산 다이아이오딘 0.40g(0.6 m㏖)을 첨가하였다. 얻어진 현탁액을 75℃에서 하룻밤 환류시키고, 실온까지 냉각 후 동결건조시켰다. DMF 80㎖를 이어서 이 동결건조된 밝은 갈색 분말에 첨가하고, 가용성 생성물로부터 불용성의 과잉의 시약과 인산염의 분리를 여과에 의해 수행하였다. DMF를 감압 하에 제거하고, 생성물을 진공 건조하여 점액산 다이시스테인 12㎎(0.02 m㏖, 3%)을 수득하였다.
Figure pct00027
실시예 18: 폴리머 합성( 폴리 ( 점액산 - DiCys - PEG ))(12)
점액산 다이시스테인 12㎎(21.7μ㏖) 및 PEG-DiSPA 3400 74㎎(21.7μ㏖)을, 2구 10㎖ 둥근 바닥 플라스크 내에 아르곤 하에 무수 DMSO 0.6㎖의 첨가 전에 진공 하에 건조하였다. 교반 10분 후, 상기 반응 용기에 아르곤 하에 무수 DIEA 9㎕(65.1μ㏖)를 옮겼다. 이 혼합물을 아르곤 하에 하룻밤 교반하였다. 상기 폴리머 함유 용액을 이어서 10 kDa 막 원심장치를 이용해서 투석시키고 동결건조시켜 폴리(점액산-DiCys-PEG) 47㎎(58%)을 수득하였다.
Figure pct00028
이 폴리올을 함유하는 폴리머는 음이온성 AB 폴리머이다.
실시예 19: 약물( 캄토테신 , CPT )의 점액산 폴리머에의 공유결합 부착(13)
폴리(점액산-DiCys-PEG) 10㎎(반복 단위 2.7μ㏖)을 유리 단지(glass jar) 중의 무수 DMSO 1.5㎖에 용해시켰다. 10분 교반 후, 이 반응 혼합물에 DIEA(6.3μ㏖) 1.1㎕, TFA-GIy-CPT 3.3㎎(6.3μ㏖), EDC 1.6㎎(8.1μ㏖) 및 NHS 0.7㎎(5.9μ㏖)을 가하였다. 8시간 교반 후, 에탄올 1.5㎖를 가하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 얻어진 석출물을 물에 용해시키고 불용성 물질을 0.2㎛ 필터를 통해 여과에 의해 제거하였다. 이어서, 폴리머 용액을 10 kDa 막을 통해서 물에 대해 투석하고, 계속해서 동결건조시켜 폴리(점액산-DiCys-PEG)-CPT 컨주게이트를 수득하였다.
Figure pct00029
실시예 20: 수중 CPT - 점액산 폴리머(13)에 의한 나노입자(20)의 형성
폴리(점액산-DiCys-PEG)와 폴리(점액산-DiCys-PEG)-CPT 컨주게이트의 유효 직경은, 재증류수(double distilled water)(0.1 - 10 ㎎/㎖) 중에 폴리머를 배합하고 ZetaPALS(브룩헤븐 인스트루먼트사) 기기를 이용해서 동적 광산란(DLS)을 통해서 평가함으로써 측정하였다. 각 1분에 대해 3회 연속 가동하여 계속해서 기록하고 평균하였다. 두 화합물의 제타 전위는 ZetaPALS(브룩헤븐 인스트루먼트사) 기기를 이용해서 1.1mM KCl 용액 중에서 측정하였다. 이어서, 0.012의 표적 잔사에서 10회의 연속적인 자동화 가동을 수행하고 그 결과를 평균하였다( 도 14 ). 특히, 폴리(점액산-DiCys-PEG)-CPT 컨주게이트에 대해서 두 분포가 측정되었고, 그 중, 우세한 분포(총 입자 모집단에 대해 60%)는 57㎚였다. 두번째의 작은 분포는 또한 233㎚에서 측정되었다.
실시예 21 : 수중 CPT - 점액산 폴리머 (13) 및 보론산 - 다이설파이드 -PEG 5000 (6)을 이용한 보론산 - 페길화된 나노입자의 형성
보론산 페길화된 폴리(점액산-DiCys-PEG)-CPT 나노입자는, 0.1 ㎎/㎖의 농도에서 재증류수 중에 상기 폴리머를 용해시키고 나서 또 수 중 폴리머 6(BA-PEG)의 첨가를 행하여 조성하여, 폴리(점액산-DiCys-PEG)-CPT 컨주게이트 중의 점액산 당 상의 다이올에 대한 BA-PEG의 비가 1:1이 되도록 하였다. 상기 혼합물은 30분 동안 배양하고, 그 후 ZetaPALS(브룩헤븐 인스트루먼트사) 기기를 이용해서 유효 직경과 제타 전위를 측정하였다.
실시예 22: 마우스에서의 pDNA 전달용의 표적화된 나노입자
플라스미드 pApoE-HCRLuc는 루시페라제를 발현하는 유전자를 함유하고 간 특이적 프로모터의 제어 하에 있다. 폴리머(MAP) 4(0.73㎎), 폴리머 6(73㎎) 및 폴리머 9(0.073㎎)는 물 5㎖에 조합하고 나서 pApoE-HCRLuc 플라스미드를 함유하는 물 1.2㎖를 가하였다(+3의 플라스미드에 대한 폴리머 4의 전하비를 얻었다). 이들 입자를 (물인 초기 조성으로부터 시작하여) D5W의 후속의 첨가와 함께 연속적인 회전 여과함으로써 D5W(수중 5% 글루코스)에 배치하였다. 누드 마우스들에 Hepa-1-6 간암 세포를 이식하고, 종양을 대략 200㎣의 크기까지 성장하도록 방치하였다. 표적화된 나노입자는 5㎎ 플라스미드/㎏ 마우스와 동일한 양으로 꼬리 정맥에서 정맥내 주사하였다. 마우스들을 주사 후 24시간 촬영하였다. 해당 마우스들은 독성의 징후를 보이지 않았고, 간의 영역이 아니라 종양의 영역에서 검출된 루시페라제 발현이 있었다.
요약하면, 수개의 실시형태에서, 보론산을 함유하는 폴리머에 결합된 폴리올을 함유하는 폴리머를 포함하는 캐리어 나노입자, 해당 나노입자의 외부 환경에 보론산을 함유하는 폴리머를 제시하도록 구성된 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템이 기재되어 있다.
위에서 기재된 실시예는 당업자에게 본 발명의 입자, 조성물, 시스템 및 방법의 실시형태를 어떻게 제조하고 이용하는 지에 대한 완전한 개시 및 설명을 부여하기 위해 제공되며, 이것은 본 발명자들이 그들의 개시내용으로 간주하는 범위를 제한하기 위하여 의도된 것은 아니다. 당업자에게 명백한 상기 개시내용을 수행하기 위한 전술한 형태의 변형은 이하의 특허청구범위의 범주 내인 것으로 의도되어 있다. 본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 당업자의 수준을 나타내는 것이다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌은 마치 각 문헌이 개별적으로 그의 전문이 참조로 포함되는 것처럼 동일한 정도로 참조로 포함된다.
배경기술, 발명의 내용, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 실시예에서 인용된 각종 문헌(특허, 특허출원, 저널 논문, 초록, 실험실 매뉴얼, 서적 혹은 기타 개시물)의 전체 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 명세서의 개시 내용은 특정 조성물 혹은 생물학적 시스템으로 제한되지 않고 물론 이것은 다양하게 변화될 수 있는 것으로 이해할 필요가 있다. 또한, 본 명세서에서 이용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 설명할 목적을 위한 것일 뿐 제한하는 것으로 의도되어 있지 않는 것으로 이해할 필요가 있다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용되는 바와 같이, 단수 형태는 내용에 달리 명확하게 기술된 경우를 제외하고 복수의 형태를 포함하는 것이다. "복수"라는 용어는 내용에 달리 명확하게 기술된 경우를 제외하고 2개 이상을 포함하는 것이다. 달리 규정된 경우를 제외하고, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 지닌다.
본 명세서에 기재된 것과 유사 혹은 등가의 방법 및 재료는 모두 본 명세서에 기재된 적절한 재료 및 방법의 구체적인 실시예의 시험을 위해 실제로 이용될 수 있다.
본 발명의 개시내용의 다수의 실시형태가 개시되어 있다. 그러나, 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나는 일없이 각종 변형이 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 다른 실시형태도 이하의 특허청구범위의 범주 내이다.
참고 문헌
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Claims (43)

  1. 폴리올을 함유하는 폴리머와 보론산을 함유하는 폴리머를 포함하는 나노입자로서,
    상기 보론산을 함유하는 폴리머는 가역적 공유 결합에 의해서 상기 폴리올을 함유하는 폴리머에 결합되어 있고,
    상기 나노입자는 해당 나노입자의 외부 환경에 대해서 상기 보론산을 함유하는 폴리머를 제시하도록 구성된 것인 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리올을 함유하는 폴리머는 이하의 구조단위 (I), (II) 및 (III) 중 적어도 하나를 1개 이상 포함하는 것인 나노입자:
    Figure pct00030

    상기 구조단위 중,
    A는 이하의 식 (IV):
    Figure pct00031
    의 유기 모이어티(organic moiety)이고,
    상기 식 (IV) 중,
    R1 및 R2는 독립적으로 분자량이 약 10kDa 이하인 임의의 탄소계 혹은 유기기로부터 선택되며;
    X는 독립적으로 -H, -F, -C, -N 또는 -O 중 하나 이상을 함유하는 지방족 기로부터 선택되고;
    Y는 독립적으로 -OH 또는 OH를 제시하는 유기 모이어티로부터 선택되며;
    B는 상기 폴리머 내에서 첫번째의 상기 유기 모이어티 A의 R1 및 R2 중 하나를 두번째의 상기 유기 모이어티 A의 R1 및 R2 중 하나와 결합시키는 유기 모이어티이다.
  3. 제2항에 있어서, R1 및 R2는 독립적으로 이하의 식 (V)를 지니는 것인 나노입자:
    Figure pct00032

    식 중,
    d는 0 내지 100이고;
    e는 0 내지 100이며;
    f는 0 내지 100이고;
    Z는 하나의 유기 모이어티를 다른 유기 모이어티에 결합하는 공유 결합이며;
    Z1은 독립적으로 -NH2, -OH, -SH 및 -COOH로부터 선택된다.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, X는 CnH2n +1이고, 이때 n은 0 내지 5이며;
    Y는 -OH인 것인 나노입자.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, A는 독립적으로 이하의 식 (VI), (VII) 및 (VIII)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나노입자:
    Figure pct00033

    식 중,
    스페이서는 독립적으로 임의의 유기기로부터 선택되고;
    아미노산은 유리 아민(free amine) 및 유리 카복실산기(free carboxylic acid group)를 담지하는 임의의 유기기로부터 선택되며;
    n은 1 내지 20이고;
    Z1은 독립적으로 -NH2, -OH, -SH 및 -COOH로부터 선택된다.
  6. 제5항에 있어서, A는 독립적으로 이하의 식 (IX), (X) 및 (XI)으로부터 선택되는 것인 나노입자:
    Figure pct00034
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, B는 이하의 식 (XXIII) 또는 (XIV)인 것인 나노입자:
    Figure pct00035

    식 중,
    q는 1 내지 20이고;
    p는 20 내지 200이며;
    L은 이탈기이다.
  8. 제2항에 있어서, 상기 식(I)의 구조 단위는 이하의 식 (XXV)인 것인 나노입자:
    Figure pct00036
  9. 제2항에 있어서, 상기 식(II)의 구조 단위는 이하의 식 (XXVI)인 것인 나노입자:
    Figure pct00037
  10. 제2항에 있어서, 상기 식(III)의 구조 단위는 이하의 식 (XXVII) 또는 (XXVIII)인 것인 나노입자:
    Figure pct00038

    식 중,
    n은 1 내지 20이다.
  11. 제1항에 있어서, 상기 폴리올을 함유하는 폴리머는 이하의 식 (XXIX)인 것인 나노입자:
    Figure pct00039
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보론산을 함유하는 폴리머는 말단 보론산기를 적어도 하나 포함하고, 이하의 일반식 (XXX)을 지니는 것인 나노입자:
    Figure pct00040

    식 중,
    R3 및 R4는 독립적으로 친수성 유기 폴리머이고;
    X1은 -C, -N 혹은 -B를 하나 이상 포함하는 유기 모이어티이며;
    Y1은 식 -CmH2m-의 알킬기 또는 방향족 기이고, 이때 m ≥ 1이며;
    r은 1 내지 1000이고;
    a는 0 내지 3이며;
    b는 0 내지 3이다.
  13. 제12항에 있어서, R3 및 R4는 (CH2CH2O)t이고, 이때 t는 2 내지 2000인 것인 나노입자.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, X1은 -NH-C(=O)-, -S-S-, -C(=O)-NH-, -O- C(=O)- 또는 -C(=O)-O-이고, Y1은 페닐기인 것인 나노입자.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, r=1, a=0 그리고 b=1인 것인 나노입자.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 작용기 1 및 작용기 2는 동일하거나 상이하며, 독립적으로 -B(OH)2, -OCH3 및 -OH로부터 선택되는 것인 나노입자.
  17. 제12항에 있어서, 상기 보론산을 함유하는 폴리머는 이하의 식 (XXXI)을 지니는 것인 나노입자:
    Figure pct00041

    식 중, s는 20 내지 300이다.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리올을 함유하는 폴리머 및/또는 보론산을 함유하는 폴리머의 일부를 형성하는 화합물을 추가로 포함하는 나노입자.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리올을 함유하는 폴리머 및/또는 보론산을 함유하는 폴리머에 부착되는 화합물을 추가로 포함하는 나노입자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제인 화합물을 추가로 포함하는 나노입자.
  21. 제20항에 있어서, 상기 치료제는 소분자 화학치료제(small molecule chemotherapeutic agent)인 것인 나노입자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 복수종의 화합물을 추가로 포함하고, 해당 복수 종의 화합물 중 적어도 1종의 화합물은 표적화 리간드(targeting ligand)인 것인 나노입자.
  23. 제22항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 단백질, 소분자, 완전한 항체(full antibody) 혹은 항체 단편(antibody fragment)인 것인 나노입자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 트랜스페린(transferrin), 엽산 및 갈락토스로부터 선택되고, 치료제를 추가로 포함하는 상기 나노입자는 캄토테신(camptothecin), 에포틸론(epothilone), 탁산(taxane) 혹은 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택되는 것인 나노입자.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재된 나노입자 및 적절한 비히클(vehicle) 및/또는 부형제를 포함하는 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물이고, 상기 적절한 비히클 및/또는 부형제는 약제학적으로 허용가능한 비히클 및/또는 부형제인 것인 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 나노입자는 보론산을 함유하는 적어도 1종의 폴리머의 일부로서 19F를 추가로 포함하고, 상기 보론산을 함유하는 적어도 1종의 폴리머는 이하의 식 (XXXII)을 지니며, 상기 조성물은 19F NMR 분광법을 통해서 생체내 영상화(in vivo imaging)를 위해 조제된 것인 조성물:
    Figure pct00042

    식 중, s는 20 내지 300이다.
  28. 제26항에 있어서, 상기 나노입자는 보론산을 함유하는 적어도 1종의 폴리머의 일부로서 10B를 추가로 포함하고, 상기 조성물은 생체내 보론 중성자 활성화 요법을 위하여 조제된 것인 조성물.
  29. 화합물을 표적에 전달하는 방법으로서,
    제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재된 나노입자를 상기 표적에 접촉시키는 단계를 포함하는, 화합물의 표적에의 전달방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 표적은 포유동물의 신체 내의 암 세포인 것인, 화합물의 표적에의 전달방법.
  31. 화합물을 표적에 전달하는 시스템으로서,
    상기 시스템은 가역적 공유 결합을 통해 가역적으로 결합할 수 있는 폴리올을 함유하는 적어도 1종의 폴리머 및 보론산을 함유하는 적어도 1종의 폴리머를 포함하되,
    상기 폴리올을 함유하는 적어도 1종의 폴리머 및 보론산을 함유하는 적어도 1종의 폴리머는 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재된 나노입자 내의 화합물과 조립되어(assembled) 상기 화합물을 표적에 전달하는 데 이용되는 것인, 화합물의 표적에의 전달시스템.
  32. 화합물을 개체에 투여하는 방법으로서,
    상기 화합물을 포함하는 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재된 나노입자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 화합물의 개체에의 투여방법.
  33. 화합물을 개체에 투여하는 시스템으로서,
    상기 시스템은 가역적 공유 결합을 통해 가역적으로 결합할 수 있는 폴리올을 함유하는 적어도 1종의 폴리머 및 보론산을 함유하는 적어도 1종의 폴리머를 포함하되,
    상기 폴리올을 함유하는 적어도 1종의 폴리머 및 보론산을 함유하는 적어도 1종의 폴리머는 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재된 나노입자 내의 화합물과 조립되어 개체에 투여되는 것인, 화합물의 개체에의 투여방법.
  34. 폴리올을 함유하는 폴리머와 보론산을 함유하는 폴리머를 포함하는 나노입자를 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은 상기 폴리올을 함유하는 폴리머를 상기 보론산을 함유하는 폴리머와 결합하는 것을 허용하는 조건 하에 일정 시간 동안 상기 폴리올을 함유하는 폴리머를 상기 보론산을 함유하는 폴리머와 접촉시키는 단계를 포함하는, 나노입자의 제조방법.
  35. 이하의 식 (XXX)의 보론산을 함유하는 폴리머:
    Figure pct00043

    식 중,
    R3 및 R4는 독립적으로 친수성 유기 폴리머이고;
    X1은 -CH, -N 혹은 -B를 하나 이상 포함하는 유기 모이어티이며;
    Y1은 식 -CmH2m-의 알킬기 또는 방향족 기이고, 이때 m ≥ 1이며;
    r은 1 내지 1000이고;
    a는 0 내지 3이며;
    b는 0 내지 3이다.
  36. 제35항에 있어서, R3 및 R4는 (CH2CH2O)t이고, 이때 t는 2 내지 2000인 것인, 보론산을 함유하는 폴리머.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, X1은 -NH-C(=O)-, -S-S-, -C(=O)-NH-, -0-C(=O)- 또는 -C(=O)-O-이고, Y1은 페닐기인 것인, 보론산을 함유하는 폴리머.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, r은 1이고, a는 0이며, b는 1인 것인, 보론산을 함유하는 폴리머.
  39. 제35항에 있어서, 상기 작용기 1과 작용기 2는 동일 혹은 상이하며, 독립적으로 -B(OH)2, -OCH3 및 -OH로부터 선택되는 것인, 보론산을 함유하는 폴리머.
  40. 제2항의 식 (I), (II) 및 (III)의 구조 단위의 적어도 하나를 1개 이상 포함하되,
    상기 식(I)의 구조 단위는 이하의 식 (XXV)인 것인, 폴리올을 함유하는 폴리머:
    Figure pct00044
  41. 제2항의 식 (I), (II) 및 (III)의 구조 단위의 적어도 하나를 1개 이상 포함하되, 상기 식 (II)의 구조단위는 이하의 식 (XXVI)인 것인, 폴리올을 함유하는 폴리머:
    Figure pct00045
  42. 제2항의 식 (I), (II) 및 (III)의 구조 단위의 적어도 하나를 1개 이상 포함하되, 상기 식 (III)의 구조단위는 이하의 식 (XXVII) 또는 (XXVIII)인 것인, 폴리올을 함유하는 폴리머:
    Figure pct00046

    식 중, n은 1 내지 20이다.
  43. 이하의 식 (XXIX)을 지니는 폴리올을 함유하는 폴리머:
    Figure pct00047
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