CN113398257B - 一种融合膜包裹的仿生纳米乳及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种融合膜包裹的仿生纳米乳及其制备方法与应用，所述融合膜包裹的仿生纳米乳包括：提供仿生纳米乳，所述仿生纳米乳包括外壳和位于所述外壳内的内核，所述外壳由乳酸氧化酶和人血清白蛋白组成，所述内核由全氟化合物组成；提供融合膜，所述融合膜由工程化细胞膜和细菌外膜囊泡融合而成；将所述融合膜包裹在所述仿生纳米乳上，得到所述融合膜包裹的仿生纳米乳。本发明融合膜包裹的仿生纳米乳可同时实现肿瘤的光热治疗、饥饿治疗和免疫治疗相结合的协同治疗，因此在肿瘤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。

Description

一种融合膜包裹的仿生纳米乳及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医用纳米材料领域，尤其涉及一种融合膜包裹的仿生纳米乳及其制备方法与应用。
背景技术
免疫疗法作为一种新兴的癌症治疗方法，可以破坏肿瘤免疫耐受的微环境并引起肿瘤特异性的免疫反应，其副作用远小于传统的化疗和放疗。在过去的十年中，免疫检查点抑制剂已在各种类型的肿瘤上取得了显著的临床效果。但是，免疫检查点抗体的总体应答率相对较低。另外，这些抗体缺乏肿瘤靶向能力，注射后分布于全身各组织中，这可能会引起一定的副作用(例如细胞因子风暴)。抗体的高成本也给癌症患者带来沉重的经济负担。免疫疗法与光热疗法(PTT)的协同作用可实现超加和效应(1+1>2)，并通过PTT的免疫原性细胞死亡(ICD)效应显著提高应答率。然而，PTT会对正常组织造成不可避免的损害，这可能会限制其广泛的临床应用。
减毒的活细菌可以通过其固有的免疫原性和毒性来增强抗肿瘤免疫反应。此外，厌氧菌如鼠伤寒沙门氏菌由于其厌氧特性，可以在肿瘤中特异性生长。但是，减毒细菌仍具有感染的风险，这使其难以达到临床应用标准。作为替代方案，源自革兰氏阴性细菌膜的细菌外膜囊泡(OMV)比活细菌小得多(20-250nm)，并且更安全。OMV包含大多数细菌衍生的抗原，因此被用作细菌疫苗以引发抗细菌免疫反应。最近，OMV在癌症治疗中也引起了相当大的关注。然而，有研究表明大肠杆菌的OMV可以诱导干扰素-γ(IFN-γ)产生，而IFN-γ会上调免疫抑制性分子(如PD-L1)的表达，从而抑制T细胞介导的免疫反应并促进肿瘤细胞的免疫逃逸。
因此，现有的技术有待改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种融合膜包裹的仿生纳米乳及其制备方法与应用，旨在解决现有免疫检查点抑制剂临床效率低和肿瘤部位的靶向能力有限，光热治疗对正常组织有杀伤的问题。
本发明的技术方案如下：
一种融合膜包裹的仿生纳米乳的制备方法，其中，包括步骤：
提供仿生纳米乳，所述仿生纳米乳包括外壳和位于所述外壳内的内核，所述外壳由乳酸氧化酶和人血清白蛋白组成，所述内核由全氟化合物组成；
提供融合膜，所述融合膜由工程化细胞膜和细菌外膜囊泡融合而成；
将所述融合膜包裹在所述仿生纳米乳上，得到所述融合膜包裹的仿生纳米乳。
可选地，所述仿生纳米乳的制备方法，包括以下步骤：
将人血清白蛋白和水混合，然后加入全氟化合物和乳酸氧化酶，并搅拌，将搅拌后得到的混合液进行超声处理，获得所述仿生纳米乳。
可选地，所述细菌外膜囊泡通过以下方法提取得到：
培养细菌得到细菌菌液，将所述细菌菌液依次进行离心和过滤处理，然后通过超滤得到浓缩菌液，将所述浓缩菌液进行离心处理，得到细菌外膜囊泡。
可选地，所述融合膜通过以下方法制备得到：
分别将所述工程化细胞膜和细菌外膜囊泡冻干备用，然后将冻干后的工程化细胞膜和细菌外膜囊泡用PBS复溶后过脂质体挤出仪，获得融合膜。
可选地，所述将所述融合膜包裹在所述仿生纳米乳上，得到所述融合膜包裹的仿生纳米乳的步骤，具体包括：
将所述仿生纳米乳与融合膜混合均匀得到混合物，再用脂质体挤出仪对所述混合物挤压后，得到所述融合膜包裹的仿生纳米乳。
可选地，所述工程化细胞膜选自PD-1细胞膜、CTLA-4细胞膜和TIM-3细胞膜中的一种；
和/或，所述细菌外膜囊泡中的细菌选自沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、幽门螺杆菌中的一种。
一种融合膜包裹的仿生纳米乳，其中，所述融合膜包裹的仿生纳米乳包括仿生纳米乳和包裹在所述仿生纳米乳上的融合膜；
所述仿生纳米乳包括外壳和位于所述外壳内的内核，所述外壳由乳酸氧化酶和人血清白蛋白组成，所述内核由全氟化合物组成；
所述融合膜由工程化细胞膜和细菌外膜囊泡融合而成；
所述融合膜包裹的仿生纳米乳采用本发明所述的融合膜包裹的仿生纳米乳的制备方法制备得到。
可选地，所述融合膜包裹的仿生纳米乳的直径为100-160nm；
所述融合膜的厚度约为8-15nm。
一种本发明所述的融合膜包裹的仿生纳米乳在制备治疗肿瘤制剂中的应用。
可选地，所述治疗为同时采用光热治疗、饥饿治疗和免疫治疗。
有益效果：本发明提供的融合膜包裹的仿生纳米乳不含有光热剂，只在肿瘤血栓部位产生热量，避免了光热治疗对正常组织的损伤。该融合膜包裹的仿生纳米乳实现了肿瘤的光热治疗和饥饿治疗，引起肿瘤相关抗原释放，激活抗肿瘤免疫应答，提高免疫检查点抑制剂的疗效，在肿瘤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备得到的融合膜包裹的仿生纳米乳的TEM图；
图2为本发明实施例2中PHL对4T1肿瘤细胞的杀伤效果图；
图3为本发明实施例3中PHD@PSHM对肿瘤部位的血液光声信号的影响效果图；
图4为本发明实施例4中光热/免疫协同治疗对4T1肿瘤生长的抑制效果图；
图5为本发明实施例5中光热/免疫协同治疗引发的肿瘤细胞部位免疫细胞浸润效果图。
具体实施方式
本发明提供一种融合膜包裹的仿生纳米乳及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种融合膜包裹的仿生纳米乳的制备方法，其中，包括步骤：
S10、提供仿生纳米乳，所述仿生纳米乳包括外壳和位于所述外壳内的内核，所述外壳由乳酸氧化酶和人血清白蛋白组成，所述内核由全氟化合物组成；
S20、提供融合膜(SM)，所述融合膜由工程化细胞膜(PM)和细菌外膜囊泡融合而成；
S30、将所述融合膜包裹在所述仿生纳米乳上，得到所述融合膜包裹的仿生纳米乳。
本实施例中，所述乳酸氧化酶、人血清白蛋白和全氟化合物组成的仿生纳米乳中，人血清白蛋白是已经在临床中使用的药物，乳酸氧化酶是生物大分子，均具有良好的生物相容性，全氟化合物也具有良好的生物相容性。乳酸氧化酶、人血清白蛋白和全氟化合物通过乳化作用形成仿生纳米乳，其中乳酸氧化酶和人血清白蛋白构成仿生纳米乳的外壳，全氟化合物构成仿生纳米乳的内核。其中所述人血清白蛋白是乳化剂。其中所述乳酸氧化酶可以催化乳酸分解，产生有细胞毒性的双氧水。其中所述全氟化合物具有良好的生物相容性，对氧气具有较高的亲和力，通过预先灌充纯氧，并将其封装于仿生纳米乳的外壳内，可实现在肿瘤的乏氧部位中缓慢释放氧气，提供乳酸氧化酶催化反应的原料，从而改善其饥饿治疗效果。
本实施例中，细菌外膜囊泡(如沙门氏菌的细胞外囊泡)因其乏氧趋向性，可以将融合膜包裹的仿生纳米乳靶向到乏氧的肿瘤部位。通过富集到肿瘤组织并诱导局部炎症，从而破坏血管引起血细胞富集到肿瘤组织，而血细胞可以吸收近红外光，从而实现肿瘤光热治疗。光热治疗引起的抗肿瘤免疫反应可以协同增强免疫检查点(如PD-1检查点)抑制的效果，实现对远端肿瘤转移灶的有效抑制。
本实施例融合膜包裹的仿生纳米乳不含有光热剂，只在肿瘤血栓部位产生热量，避免了光热治疗对正常组织的损伤。该融合膜包裹的仿生纳米乳实现了肿瘤的光热治疗和饥饿治疗，引起肿瘤相关抗原释放，激活抗肿瘤免疫应答，提高免疫检查点抑制剂的疗效，在肿瘤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本实施例的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
步骤S10中，在一种实施方式中，所述仿生纳米乳的制备方法，包括步骤：
将人血清白蛋白(HSA)和水混合，然后加入全氟化合物和乳酸氧化酶，并搅拌，将搅拌后得到的混合液进行超声处理(可以用探头超声处理)，获得所述仿生纳米乳。
在一种实施方式中，所述仿生纳米乳的制备方法，包括步骤：
将人血清白蛋白和水混合，混合所得溶液浓度为20mg/mL，共60mg人血清白蛋白，然后加入200-400μL全氟化合物并搅拌，得到搅拌液。按照所述搅拌液与乳酸氧化酶溶液体积比为15：1-30：1加入100-300μL的2mg/mL溶于去离子水中的乳酸氧化酶，得到混合液。将上述混合液进行超声处理，获得所述仿生纳米乳。在上述用量比例下，可以控制仿生纳米乳的粒径均一，平均直径小于150nm。
在一种实施方式中，所述仿生纳米乳的制备方法，具体包括步骤：
将人血清白蛋白和水混合，混合所得溶液浓度为20mg/mL，共60mg人血清白蛋白，然后缓慢加入200-400μL全氟化合物并搅拌。按照体积比为15：1-30：1再加入100-300μL的2mg/mL溶于去离子水中的乳酸氧化酶，得到混合液。将上述混合液用探头超声(250-400W)处理6分钟，获得所述仿生纳米乳。
在一种实施方式中，所述全氟化合物可以选自全氟三丙胺、全氟三丁胺、全氟己烷、全氟-15-冠-5醚等中的一种，但不限于此。
在一种实施方式中，所述水为超纯水，超纯水几乎没有杂质，更有利于形成纯净的仿生纳米乳。
步骤S20中，在一种实施方式中，所述工程化细胞膜选自PD-1细胞膜、CTLA-4细胞膜和TIM-3细胞膜等中的一种。
在一种实施方式中，所述工程化细胞膜为PD-1细胞膜。PD-1高表达细胞膜可以通过PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1结合，实现PD-1/PD-L1免疫检查点的抑制。
在一种实施方式中，所述PD-1细胞膜通过以下方法提取得到：
将胰酶消化HEK293T细胞，然后在冰浴的条件下用均质仪均质，并离心后取上清，得到细胞膜碎片，所述细胞膜碎片依次过0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤膜，得到所述PD-1高表达细胞膜。
在一种实施方式中，所述PD-1细胞膜通过以下方法提取得到：
用胰酶消化HEK293T细胞，1500rpm离心5分钟，得到细胞后用PBS洗3遍，用HM缓冲液重悬之后，在冰浴的条件下用均质仪均质100下，并在1500rpm离心5分钟后除去未裂解干净的细胞沉淀，并用7500rpm离心20分钟除去细胞器沉淀，最后用20000rpm离心60分钟得到细胞膜碎片，并依次过0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤膜得到PD-1高表达细胞膜，冻干后储存在-80℃冰箱。
本实施例中，在冰浴的条件下，能够使得均质过程在接近0摄氏度的环境下进行，更有利于保持细胞各部分的活性，均质的目的是为了分离细胞膜，胰酶消化HEK293T细胞经过均质后裂解，然后进行离心去除细胞器沉淀，得到PD-1高表达细胞膜。
步骤S20中，在一种实施方式中，所述细菌外膜囊泡通过以下方法提取得到：
培养细菌得到细菌菌液，将所述细菌菌液依次进行离心和过滤处理，然后通过超滤得到浓缩菌液，将所述浓缩菌液进行离心处理，得到细菌外膜囊泡。
在一种实施方式中，所述细菌外膜囊泡中的细菌选自沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、幽门螺杆菌中的一种。
在一种实施方式中，所述沙门氏菌外膜囊泡通过以下方法提取得到：
培养沙门氏菌得到沙门氏菌菌液，将所述沙门氏菌菌液通过离心与过滤膜的方法去除细菌，然后通过超滤的方法浓缩沙门氏菌菌液；之后再在20000rpm下离心得到沙门氏菌外膜囊泡。
在一种实施方式中，所述沙门氏菌外膜囊泡通过以下方法提取得到：
用液体培养基培养沙门氏菌。准备2升的沙门氏菌细菌菌液，通过6000rpm离心10分钟去除细菌，共离心3次；离心完之后过0.22μm的滤膜去除细菌，然后用100KD的超滤管超滤浓缩；浓缩完之后再在20000rpm下离心60分钟得到沙门氏菌外膜囊泡，冻干后储存在-80℃冰箱。
步骤S20中，在一种实施方式中，所述融合膜通过以下方法制备得到：
分别将所述工程化细胞膜和细菌外膜囊泡冻干备用，然后将冻干后的工程化细胞膜和细菌外膜囊泡用PBS复溶后过脂质体挤出仪，获得融合膜。
在一种实施方式中，所述工程化细胞膜和细菌外膜囊泡按照质量比为1：1-5：1比例用PBS复溶。在该比例条件下，仿生纳米乳在体内能引起较强的免疫反应。
在一种实施方式中，所述融合膜通过以下方法制备得到：
将准备好的PD-1高表达细胞膜和沙门氏菌外膜囊泡冻干备用，然后按照比例用PBS复溶后过脂质体挤出仪，获得融合膜。
在一种实施方式中，所述融合膜通过以下具体方法提取得到：
将准备好的PD-1高表达细胞膜和沙门氏菌外膜囊泡冻干备用，然后按照质量比为1：1-5：1比例用PBS复溶后依次过0.45μm和0.22μm滤膜的脂质体挤出仪，获得融合膜。
在一种实施方式中，步骤S30具体包括：
将所述仿生纳米乳与融合膜混合均匀得到混合物，再用脂质体挤出仪对所述混合物挤压后，得到所述融合膜包裹的仿生纳米乳。
在一种实施方式中，按照1:1-1:5的质量比例，将所述仿生纳米乳与融合膜进行混合均匀。在该比例条件下，融合膜能完整地包覆在仿生纳米乳上。
在一种实施方式中，步骤S30具体包括：
将所述仿生纳米乳与融合膜各过0.22μm的滤膜之后将二者混合均匀得到混合物，再用0.2μm滤膜的脂质体挤出仪来回挤压20次，得到所述融合膜包裹的仿生纳米乳。其中，所述融合膜包裹在所述仿生纳米乳上。
本发明实施例提供一种如上所述的融合膜包裹的仿生纳米乳，其中，所述融合膜包裹的仿生纳米乳包括仿生纳米乳和包裹在所述仿生纳米乳上的融合膜；
所述仿生纳米乳包括外壳和位于所述外壳内的内核，所述外壳由乳酸氧化酶和人血清白蛋白组成，所述内核由全氟化合物组成；
所述融合膜由工程化细胞膜和细菌外膜囊泡融合而成；
所述融合膜包裹的仿生纳米乳采用本发明实施例所述的融合膜包裹的仿生纳米乳的制备方法制备得到。
本实施例中，所述融合膜包裹的仿生纳米乳是一种联合光热治疗、饥饿治疗与免疫治疗的融合膜包裹的仿生纳米乳。其中，细菌外膜囊泡泡引起肿瘤出血，可以实现光热治疗；乳酸氧化酶能催化乳酸分解产生双氧水，实现饥饿治疗；工程化细胞膜作为免疫检查点抑制剂可与光热治疗和饥饿治疗产生协同作用，实现对远端肿瘤转移灶的有效抑制。
在一种实施方式中，所述融合膜包裹的仿生纳米乳的直径为100-160nm，在此粒径范围内，能够使融合膜包裹的仿生纳米乳更好地实现肿瘤的靶向蓄积以及肿瘤的光热治疗、饥饿治疗与免疫治疗相结合的协同治疗。
在一种实施方式中，所述融合膜的厚度约为8-15nm，如10nm、12nm。
本发明实施例还提供一种如上所述的融合膜包裹的仿生纳米乳在制备治疗肿瘤制剂中的应用。其中，具体所述肿瘤治疗为同时采用光热治疗、饥饿治疗和免疫治疗。
通过本实施例所述融合膜包裹的仿生纳米乳可同时实现肿瘤的光热治疗、饥饿治疗和免疫治疗相结合的协同治疗，因此在肿瘤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本实施例所述融合膜包裹的仿生纳米乳的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
实施例1
本实施例融合膜包裹的仿生纳米乳(融合膜包裹的乳酸氧化酶-白蛋白-全氟三丁胺，记为PHL@PSHM)的制备步骤如下：
将人血清白蛋白和水混合，混合所得溶液浓度为20mg/mL，共60mg人血清白蛋白溶液，然后缓慢加入300μL全氟三丁胺并搅拌，得到搅拌液。按照体积比为20：1再加入300μL的2mg/mL溶于去离子水中的乳酸氧化酶，得到混合液。将上述混合液用探头超声(265W)处理6分钟，获得乳酸氧化酶-白蛋白-全氟三丁胺仿生纳米乳。
提取PD-1高表达的细胞膜：将胰酶消化HEK293T细胞，1500rpm离心5分钟得到细胞后用PBS洗3遍，用HM缓冲液重悬之后，在冰浴的条件下用均质仪均质100下，并在1500rpm下离心5分钟后除去未裂解干净的细胞沉淀，并用7500rpm离心20分钟除去细胞器沉淀，最后用20000rpm离心60分钟得到细胞膜碎片，该细胞膜碎片依次过0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤膜得到PD-1高表达的细胞膜，冻干后储存在-80℃冰箱。
提取沙门氏菌外膜囊泡：用液体培养基培养沙门氏菌。准备2升的沙门氏菌细菌菌液，通过6000rpm离心10分钟去除细菌，共离心3次；离心完之后过0.22μm细胞滤膜去除细菌，然后用100KD的超滤管超滤浓缩；浓缩完之后再在20000rpm下离心60分钟得到沙门氏菌外膜囊泡，冻干后储存在-80℃冰箱。
融合膜的制备：分别将准备好的PD-1高表达细胞膜和沙门氏菌外膜囊泡冻干备用，然后将冻干后的PD-1高表达细胞膜和沙门氏菌外膜囊泡按照5：1质量比例用PBS复溶后依次过0.45μm和0.22μm膜脂质体挤出仪，获得融合膜。
融合膜包裹的仿生纳米乳的制备：将仿生纳米乳与融合膜各过0.22μm的滤膜之后将二者混合均匀得到混合物，再用0.2μm滤膜的脂质体挤出仪来回挤压20次。
本实施例中制备得到的融合膜包裹的仿生纳米乳的TEM图如图1所示。从图1可知，融合膜包裹在仿生纳米乳上，其厚度约为10nm。
实施例2
饥饿治疗对4T1肿瘤细胞的毒性评价
采用标准的MTT法，评价饥饿治疗对4T1细胞存活率的影响。4T1细胞以每孔5×103密度接种到96孔板中，并置于37℃、5％CO2条件下培育24小时。接着，吸出96孔板中的旧培养基，分别加入含有0，10，25，50，75，100ng/mL LOx或充氧的全氟三丁胺-人血清白蛋白-乳酸氧化酶(PFTBA@HSA/LOx，PHL)的DMEM培养基。继续培养24小时后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μL含5mg/mL MTT的培养基溶液，继续培养12个小时。然后在Bio-TelEL养个孔中型酶标仪上检测每孔的OD值(检测波长为490nm)，用如下公式计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝(样品的OD490值/空白OD490值)×100％，实验结果见图2。
如图2所示，LOx组在0-100ng/mL浓度范围内对4T1细胞有较明显的毒性，而充氧PHL组的毒性更加显著，其中100ng/mL浓度细胞存活率仅24.2％，而同浓度下LOx组的细胞存活率有54.3％。说明全氟三丁胺的携氧能力增强了LOx介导的肿瘤细胞饥饿治疗。
实施例3
沙门氏菌外膜囊泡诱发肿瘤内出血的效果评价
雌性Balb/c小白鼠(3周,15-20g)，在小白鼠右后腿皮下注射2×106 4T1肿瘤细胞，建立小鼠皮下瘤模型。当肿瘤体积超过100mm3时，尾静脉注射1-3mg/kg剂量的融合膜包裹的仿生纳米乳PHL@PSHM，并进行光声成像实验。在荷瘤小鼠体内尾静脉注射药物后0，2，4，12，24小时，通过光声成像观测其肿瘤内800nm波长光声信号值的变化情况，并定量分析，实验结果见图3。
从图3的A和B可知，给药后随着时间的延长，肿瘤中800nm处的光声信号逐渐增强，并且1mg/kg和3mg/kg组在12小时肿瘤部位的光声信号达到最高值，随后逐渐下降。而2mg/kg组在24小时肿瘤部位的光声信号仍在增加，预示着更好的诱导肿瘤出血的效果。
实施例4
光热/饥饿/免疫协同治疗对4T1肿瘤生长的抑制效果评价
雌性Balb/c小白鼠(3周,15-20g)，在小白鼠后腿皮下注射2×106 4T1肿瘤细胞，建立小鼠皮下瘤模型。当肿瘤体积达60mm3时，进行治疗实验。单侧瘤和双侧瘤模型中，荷瘤小鼠均随机分为七组：(1)PBS组(空白对照)；(2)注射PHL+激光组；(3)注射PHL@PM组；(4)注射PHL@SM组；(5)注射PHL@SM+激光组；(6)注射PHL@PSHM组；(7)注射PHL@PSHM+激光组。每隔一天用游标卡尺测量肿瘤体积，同时监测小鼠的体重，并按照公式V＝AB2/2计算肿瘤体积(Tumor volume)，其中A是肿瘤的长径，B是肿瘤的短径(mm)。每次测量结果均通过处理前的起始肿瘤体积归一化，实验结果见图4。
图4的A和B图分别表示单侧瘤和双侧瘤模型中，不同治疗组肿瘤体积(Normalizedtumor volume)随时间(Day)的变化情况。如图4中A所示，注射PHL@PSHM+激光组能够显著抑制单侧皮下4T1乳腺癌肿瘤的生长，注射PHD@PSHM组和注射PHL@SM+激光组的抑瘤效果相当。如图4中B所示，注射PHD@PSHM后能显著抑制对侧肿瘤的生长，但肿瘤仍然会复发，而加入激光治疗后，能几乎完全抑制肿瘤的生长和复发。
实施例5
经过不同治疗组处理后14天，将各组小鼠解剖分离肿瘤组织，剪碎后用胶原酶I、胶原酶IV、DNA酶和透明质酸酶消化30分钟，随后加入红细胞裂解液，离心重悬后用细胞培养基淋洗，最终得到的细胞悬液中加入质量比为5％BSA后冰浴封闭10分钟。分别在肿瘤组织的淋巴细胞中加入荧光标记的抗体(Anti-CD3、Anti-CD4、Anti-CD8)，利用流式分析仪检测肿瘤组织的CD4+/CD8+T淋巴细胞浸润情况，实验结果见图5。
如图5所示，PBS组的CD8+T淋巴细胞含量较低，而注射PHL@PSHM+激光组的肿瘤组织内CD8+T淋巴细胞的含量分别提高了4.67倍。其他组也均相对PBS组有不同程度的提高，但低于PHL@PSHM+激光组。
综上所述，本发明融合膜包裹的仿生纳米乳可同时实现肿瘤的光热治疗、饥饿治疗与免疫治疗相结合的协同治疗，因此在肿瘤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。同时，本发明的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种融合膜包裹的仿生纳米乳在制备治疗肿瘤制剂中的应用，其特征在于，所述治疗包括激光治疗，所述的融合膜包裹的仿生纳米乳制备方法，包括步骤：
提供仿生纳米乳，所述仿生纳米乳包括外壳和位于所述外壳内的内核，所述外壳由乳酸氧化酶和人血清白蛋白组成，所述内核由全氟化合物组成；
所述仿生纳米乳的制备方法，包括以下步骤：
将人血清白蛋白和水混合，然后加入全氟化合物和乳酸氧化酶，并搅拌，将搅拌后得到的混合液进行超声处理，获得所述仿生纳米乳；所述全氟化合物为全氟三丁胺；
提供融合膜，所述融合膜由工程化细胞膜和细菌外膜囊泡融合而成；
所述工程化细胞膜为PD-1高表达细胞膜，所述细菌外膜囊泡中的细菌为沙门氏菌；
所述PD-1高表达细胞膜的制备方法为：将胰酶消化HEK293T细胞，然后在冰浴的条件下用均质仪均质，并离心后取上清，得到细胞膜碎片，所述细胞膜碎片依次过0 .8μm、0 .45μm、0 .22μm的滤膜，得到所述PD-1高表达细胞膜；
将所述融合膜包裹在所述仿生纳米乳上，得到所述融合膜包裹的仿生纳米乳。
2.根据权利要求1所述的融合膜包裹的仿生纳米乳在制备治疗肿瘤制剂中的应用，其特征在于，所述细菌外膜囊泡通过以下方法提取得到：
培养细菌得到细菌菌液，将所述细菌菌液依次进行离心和过滤处理，然后通过超滤得到浓缩菌液，将所述浓缩菌液进行离心处理，得到细菌外膜囊泡。
3.根据权利要求1所述的融合膜包裹的仿生纳米乳在制备治疗肿瘤制剂中的应用，其特征在于，所述融合膜通过以下方法制备得到：
分别将所述工程化细胞膜和细菌外膜囊泡冻干备用，然后将冻干后的工程化细胞膜和细菌外膜囊泡用PBS复溶后过脂质体挤出仪，获得融合膜。
4.根据权利要求1所述的融合膜包裹的仿生纳米乳在制备治疗肿瘤制剂中的应用，其特征在于，所述将所述融合膜包裹在所述仿生纳米乳上，得到所述融合膜包裹的仿生纳米乳的步骤，具体包括：
将所述仿生纳米乳与融合膜混合均匀得到混合物，再用脂质体挤出仪对所述混合物挤压后，得到所述融合膜包裹的仿生纳米乳。
5.根据权利要求1所述的融合膜包裹的仿生纳米乳在制备治疗肿瘤制剂中的应用，其特征在于，所述融合膜包裹的仿生纳米乳的直径为100-160nm；所述融合膜的厚度为8-15nm。
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