CN113855788A - 一种抗体纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗体纳米粒子及其制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明提供的抗体纳米粒子，包括聚乙二醇化抗HER‑2纳米抗体和与所述聚乙二醇化抗HER‑2纳米抗体通过化学键合的HCC纳米颗粒；所述HCC纳米颗为人血清白蛋白封装的二氢卟吩和过氧化氢酶。本发明提供的抗体纳米粒子实现了光敏剂的深部肿瘤靶向传递，能够诱导催化供氧并降低SK‑OV‑3细胞中HIF‑1α的表达，改善肿瘤乏氧微环境，诱导DCs成熟，在660nm激光下，基于抗体纳米粒子的PDT与抗CTLA‑4治疗可以抑制远处卵巢癌肿瘤的生长，防止肿瘤转移。

Description

一种抗体纳米粒子及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种抗体纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
卵巢癌是女性生殖系统的一种恶性肿瘤，发病率和死亡率都很高。目前，卵巢癌的主要治疗方案是化疗、放疗和手术治疗；然而，上述方法的局限性是容易复发，从而降低了患者的生存期。乏氧是实体瘤的典型特征，乏氧有助于卵巢癌的肿瘤侵袭和转移，还会增加线粒体裂变程度，降低卵巢癌细胞对化疗药物如顺铂的敏感性，从而导致对放疗、化疗的抵抗，从而直接限制多种临床肿瘤治疗方案的疗效。
光动力疗法(PDT)治疗卵巢等肿瘤的新兴疗法，具有诸多优点，主要包括两个过程：首先把光敏剂输送到肿瘤位置；然后用特定波长的光来激发光敏剂，将能量传递给周围的分子氧，产生细胞毒性活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，能够对肿瘤细胞和微血管造成不可逆的损伤，继而引发大量的炎症和免疫反应，这种连锁机制能够实现对肿瘤的长期抑制作用。但存在以下问题：既往的光敏剂对深部肿瘤的靶向性差，副作用较大；光传播深度有限；肿瘤内普遍存在的乏氧会减弱PDT的治疗效果并加重治疗后的乏氧。开发改善肿瘤乏氧、靶向肿瘤成像与治疗一体化的纳米探针是解决上述问题的方法之一。
纳米抗体(Nb)是一种天然单域抗体，是目前已知最小的功能性抗原特异性结合片段，易于通过基因工程生产。Nb在室温下具有高特异性、高亲和力、低免疫原性、高溶解性和高稳定性、组织渗透能力强，从而提高药物递送系统的功效。与传统抗体相比，Nb在靶向药物传递和肿瘤靶向方面具有优势，具有巨大的临床应用潜力，可以提高PDT中靶向深部组织肿瘤的性能。但是Nb血液清除速度快，限制了治疗应用，聚乙二醇化和与纳米颗粒结合是延长其血液半衰期的方法之一。HER2在大多数上皮性卵巢癌中呈过度表达，因此抗HER2-Nb结合光敏剂可以提高位于盆腔深部的卵巢癌的靶向性。
肿瘤的缺氧微环境是一个复杂的因素，它可能介导肿瘤对各种治疗应用的抵抗力。现有的光动力疗法用传统的光敏剂治疗后会加剧肿瘤的缺氧环境，对于卵巢癌肿瘤细胞的PDT治疗效果有限。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗体纳米粒子及其制备方法和应用，本发明提供的抗体纳米粒子可以改善肿瘤乏氧和促进免疫原性光动力疗法治疗卵巢癌，对于卵巢癌肿瘤细胞抑制效果优异。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种抗体纳米粒子，包括聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和与所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体通过化学键合的HCC纳米颗粒；
所述HCC纳米颗为人血清白蛋白封装的二氢卟吩和过氧化氢酶；
所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体由包括以下步骤的方法制备得到：构建质粒，将所述质粒转化到大肠杆菌Rosetta-gamiTM 2感受态细胞中诱导蛋白质表达，得到纳米抗体；所述质粒为N端为具有His6标签，C端为GGGGS-CCC-GSGSGS-LLQS序列的质粒，所述序列中包含未配对的半胱氨酸和微生物转谷氨酰胺酶结合的LLQS；将微生物转谷氨酰胺酶添加到含有所述纳米抗体、抗坏血酸和PEG-NH2的磷酸盐缓冲溶液中，启动Nb的位点特异性聚乙二醇化，得到聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体。
优选的，所述启动Nb的位点特异性聚乙二醇化后还包括纯化，所述纯化包括：利用α-氨基乙硫醇盐酸盐预处理后进行
Figure BDA0003159925320000021
纯化。
优选的，所述抗体纳米粒子中HCC纳米颗粒的质量分数为80～95％。
优选的，所述HCC纳米颗粒中二氢卟吩、过氧化氢酶和人血清白蛋白的质量比为0.5～1.5：0.5～1.5：3～5。
本发明提供了上述技术方案所述的抗体纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
构建质粒，将所述质粒转化到大肠杆菌Rosetta-gamiTM 2感受态细胞中诱导蛋白质表达，得到纳米抗体；所述质粒为N端为具有His6标签，C端为GGGGS-CCC-GSGSGS-LLQS序列的质粒，所述序列中包含未配对的半胱氨酸和微生物转谷氨酰胺酶结合的LLQS；
将微生物转谷氨酰胺酶添加到含有所述纳米抗体、抗坏血酸和PEG-NH2的磷酸盐缓冲溶液中，启动Nb的位点特异性聚乙二醇化后纯化，得到聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体；
将人血清白蛋白、谷胱甘肽和水混合，去除水后加入二氢卟吩和过氧化氢酶进行偶联，然后加入乙醇形成二硫键，得到HCC纳米颗粒；
利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)对HCC纳米颗粒进行活化，得到活化HCC纳米颗粒；
将所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和活化HCC纳米颗粒进行化学键合，得到抗体纳米粒子。
优选的，所述HCC纳米颗粒与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的质量比为1：2～4。
优选的，所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和活化HCC纳米颗粒的质量比为1：0.7～0.9。
优选的，所述化学键合的温度为10～30℃，时间为2～4h。
本发明提供了上述技术方案所述的抗体纳米粒子或上述技术方案所述制备方法得到的抗体纳米粒子在制备治疗卵巢肿瘤药物中的应用。
优选的，所述治疗卵巢肿瘤药物包括光动力疗法治疗卵巢肿瘤药物和/或免疫疗法治疗卵巢肿瘤药物
本发明提供了一种抗体纳米粒子(简写为Nb@HCC)，包括聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体(HER2-Nb)和与所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体通过化学键合的HCC纳米颗粒；所述HCC纳米颗为人血清白蛋白封装的二氢卟吩和过氧化氢酶；所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体由包括以下步骤的方法制备得到：将微生物转谷氨酰胺酶添加到含有纳米抗体、抗坏血酸和PEG-NH2的磷酸盐缓冲溶液中，启动Nb的位点特异性聚乙二醇化，得到聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体。在660nm激光照射下，本发明提供的抗体纳米粒子可以诱导SK-OV-3细胞和肿瘤组织产生大量活性氧(ROS))并触发SK-OV-3细胞的凋亡；Nb@HCC介导的PDT促进了损伤相关的分子模式(DAMPs)，即SK-OV-3细胞中的免疫原性细胞死亡和树突状细胞成熟；Nb@HCC在NIR照射下缓解乏氧并降低了HIF-1α的表达；Nb@HCC介导的PDT和抗CTLA-4治疗(即注射抗CTLA-4抗体)协同抑制远处肿瘤的进展，并诱导T细胞浸润；而且，Nb@HCC不会对主要器官造成损害，毒性和副作用较小；基于Nb@HCC的PDT与抗CTLA-4治疗不仅可以抑制远处肿瘤的生长，还可以防止肿瘤转移，对卵巢癌肿瘤细胞的治疗效果优异。
本发明提供了上述技术方案所述抗体纳米粒子的制备方法。本发明提供的制备方法，操作简单，生产成本低，适宜工业化生产。
附图说明
图1为Nb@HCC改善缺氧和增强PDT作为卵巢癌免疫治疗的原理图；
图2为Nb@HCC的形貌、流体动力学直径分布、紫外-可见光吸收光谱和荧光发射光谱，其中，A为Nb@HCC在TEM下的形态学特征，比例尺＝200nm，B为用DLS测量的Nb@HCC纳米颗粒的流体动力学直径分布图，C为Nb@HCC、HCC、游离的Ce6和HSA的紫外-可见光吸收光谱，D为Nb@HCC和游离Ce6的NIR荧光发射光谱；
图3为Nb@HCC的体外细胞摄取结果，其中，A为在CLSM下的SK-OV-3肿瘤细胞中，细胞摄取Ce6、HCC和Nb@HCC的荧光图像，蓝色信号表示DAPI染色，红色信号表示Ce6荧光(比例尺＝25μm)；B为SK-OV-3细胞通过流式细胞仪摄取Ce6、HCC和Nb@HCC的结果图；C为在CLSM下观察到的乳腺癌细胞MDA-MB-231摄取Ce6、HCC和Nb@HCC，蓝色信号表示DAPI染色，红色信号表示IR1048MZ荧光，比例尺＝25μm；D为用流式细胞仪分析的MDA-MB-231细胞摄取Ce6、HCC和Nb@HCC；E为流式细胞仪分析Ce6在Nb@HCC中2～36h的荧光强度；
图4为通过Nb@HCC调节乏氧测试结果，其中，A为由660nm激光照射，由溶液中含/不含100μM过氧化氢的Nb@HCC诱导的单线态氧的荧光强度图；B为在PBS中Nb@HCC催化产生O2结果图；C为在缺氧条件下，Nb@HCC处理的SK-OV-3细胞中单线态氧传感器绿色检测到的H2O2的不同荧光强度结果图；D为在常氧条件下，Nb@HCC处理的SK-OV-3细胞中单线态氧传感器绿色检测到的H2O2的不同荧光强度结果图；
图5为Nb@HCC在SK-OV-3细胞中的光动力效应图，其中，A为SK-OV-3细胞经过各种治疗后的ROS生成的CLSM图像，比例尺＝25μm；B为流式细胞计量化各种处理后SK-OV-3细胞的ROS生成图；C为在无激光照射下Nb@HCC的细胞毒性图；D为激光照射下Nb@HCC的细胞毒性图；E为用各种纳米颗粒(比例尺＝25μm)处理的K-OV-3细胞凋亡的流式细胞术分析图；F为用各种纳米颗粒(比例尺＝25μm)处理的K-OV-3细胞凋亡的CLSM图像；G为钙黄绿素AM/PI染色的活/死细胞；
图6为Nb@HCC介导的PDT后的免疫反应，其中，A为Nb@HCC介导的PDT后DC成熟机制的示意图，包括PDT诱导的ICD，引发DAMP(CRT、HMGB1和ATP)，从而导致DC成熟；B为SK-OV-3细胞表面CRT的定量分析；C为HMGB1的细胞外释放情况；D为ATP的细胞外分泌的测量结果；E为DC细胞外分泌的测量结果；F为基于生物标记物(CD80和CD86)，对SK-OV-3细胞Nb@HCC介导的PDT后DCs成熟的流式细胞术分析图；
图7为通过Nb@HCC调节SK-OV-3细胞和肿瘤中的缺氧结果图，其中，A为SK-OV-3细胞核中HIF-1α(绿色荧光)的表达模式，用CLSM测量，比例尺＝25μm；B为SK-OV-3切片肿瘤免疫染色后的HIF-1α表达模式，比例尺＝50μm；
图8为Nb@HCC介导的PDT结合抗CTLA-4治疗SK-OV-3肿瘤的抗肿瘤作用图，其中，A为Nb@HCC介导的PDT和抗CTLA-4疗法协同治疗转移性肿瘤进展的示意图；B为原发性肿瘤切除后采用不同治疗的小鼠右侧远处肿瘤的生长曲线；C为采用不同治疗方法的小鼠的生存曲线；
图9为Nb@HCC对转移性SK-OV-3肿瘤的抗肿瘤活性图，其中，A为用基于肿瘤浸润性T细胞的流式细胞术分析的CD8+CTL、CD4+效应T细胞(CD3+CD4+Foxp3-)和CD4+抑制性Tregs(CD3+CD4+FoxP3+)的比例；B为切除原发性肿瘤后，转移性肿瘤中CD8+CTL、CD4+效应T细胞和CD4+抑制性Tregs比例；Group1为手术组；Group2为手术+Nb@HCC组；Group3为手术+Nb@HCC+抗CTLA4组；Group4为Nb@HCC+Laser组；Group5为Nb@HCC+抗CTLA4组；Group6为Nb@HCC+Laser+抗CTLA4组；
图10为Nb@HCC的生物安全评估结果，其中，A为在尾静脉注射Nb@HCC后第7天对5种主要器官组织(心、肝、脾、肺、肾)染色结果，比例尺＝25μm；B为5种主要器官组织(心脏、肝、脾、肺、肾)中Nb@HCC的浓度结果；
图11为将Nb@HCC和其他对照单次静脉注射到小鼠体内，将2mg/kg的Ce6注射到健康小鼠体内的药代动力学结果。
具体实施方式
本发明提供了一种抗体纳米粒子，包括聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和与所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体通过化学键合的HCC纳米颗粒。
在本发明中，所述HCC纳米颗为人血清白蛋白封装的二氢卟吩和过氧化氢酶。在本发明中，所述抗体纳米粒子中HCC纳米颗粒的质量分数优选为85～95％，更优选为90％。在本发明中，所述HCC纳米颗粒中二氢卟吩、过氧化氢酶和人血清白蛋白的质量比优选0.5～1.5：0.5～1.5：3～5，更优选为为1：1：4。
在本发明中，所述抗体纳米粒子中聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体的质量分数优选为5～15％，更优选为10％。
在本发明中，所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体由包括以下步骤的方法制备得到：将微生物转谷氨酰胺酶添加到含有纳米抗体、抗坏血酸和PEG-NH2的磷酸盐缓冲溶液中，启动Nb的位点特异性聚乙二醇化，得到聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体由包括以下步骤的方法制备得到：构建质粒，将所述质粒转化到大肠杆菌Rosetta-gamiTM 2感受态细胞中诱导蛋白质表达，得到纳米抗体；所述质粒为N端为具有His6标签，C端为GGGGS-CCC-GSGSGS-LLQS序列的质粒，所述序列中包含未配对的半胱氨酸和微生物转谷氨酰胺酶结合的LLQS；将微生物转谷氨酰胺酶添加到含有所述纳米抗体、抗坏血酸和PEG-NH2的磷酸盐缓冲溶液中，启动Nb的位点特异性聚乙二醇化，得到聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体。
本发明构建质粒，将所述质粒转化到大肠杆菌Rosetta-gamiTM 2感受态细胞中诱导蛋白质表达，得到纳米抗体；所述质粒为N端为具有His6标签，C端为GGGGS-CCC-GSGSGS-LLQS序列的质粒，所述序列中包含未配对的半胱氨酸和微生物转谷氨酰胺酶结合的LLQS，具体的，优选包括以下步骤：构建质粒，将所述质粒转化到大肠杆菌Rosetta-gamiTM 2(DE3)感受态细胞中，使用Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH＝8.0)重悬离心的细胞(4000rpm，20min)，并在冰水浴中进行超声处理，将所得粗裂解物在4℃、16000rpm条件下离心30min，将所得上清液装入5mL His-Trap HP柱(GE Healthcare，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)中，然后在洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH＝8.0)中加入40～250mM线性梯度的咪唑以去除剩余的杂质和分离蛋白质，得到纳米抗体。在本发明中，所述质粒为N端为具有His6标签，C端为GGGGS-CCC-GSGSGS-LLQS序列的质粒，所述序列中包含未配对的半胱氨酸(C3-tag)和微生物转谷氨酰胺酶结合的LLQS(Q-tag)。
得到纳米抗体后，本发明将微生物转谷氨酰胺酶添加到含有所述纳米抗体、抗坏血酸和PEG-NH2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，启动Nb的位点特异性聚乙二醇化，得到聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体。在本发明中，所述混合液中抗坏血酸的浓度优选为优选为0.5～1.5M，更优选为1mM；PEG-NH2的浓度优选为优选为0.5～1.5mg/mL，更优选为1mg/mL；聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体的浓度优选为优选为2.5～3.5mg/mL，更优选为3mg/mL。在本发明中，所述微生物转谷氨酰胺酶的酶活力优选为0.5～1U/mL，更优选为0.7～0.8U/mL；本发明对应所述微生物转谷氨酰胺酶(mTGase)的来源没有特殊限定，在本发明的实施例中；所述微生物转谷氨酰胺酶优选购买于江苏一鸣生物有限公司。在本发明中，所述启动Nb的位点特异性聚乙二醇化的温度优选为室温。
在本发明中，所述启动Nb的位点特异性聚乙二醇化后优选还包括纯化，所述纯化包括：利用α-氨基乙硫醇盐酸盐预处理后进行
Figure BDA0003159925320000071
纯化。在本发明中，所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和α-氨基乙硫醇盐酸盐的质量比优选为1：3～4，更优选为1：5；所述预处理的温度优选为35～40℃，更优选为37℃；所述预处理的时间优选为0.5～1.5h，更优选为1h；所述预处理后优选还包括将所述预处理得到的活化产物进行PBS漂洗3次。在本发明中，所述
Figure BDA0003159925320000081
(GE Healthcare)纯化优选利用HiTrapTM脱盐柱进行。
本发明提供的抗体纳米粒子属于光敏剂，Nb@HCC可以调节肿瘤乏氧，表现为降低缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达。在SK-OV-3荷卵巢癌模型，研究了Nb@HCC介导的PDT和抗CTLA-4治疗的协同作用。在光动力660nm激光照射的下Nb@HCC可以诱导产生大量活性氧(ROS)并触发SK-OV-3细胞的凋亡。Nb@HCC介导的PDT促进了损伤相关的分子模式(DAMPs)，即SK-OV-3细胞中的免疫原性细胞死亡和树突状细胞成熟；Nb@HCC介导的PDT和抗CTLA-4治疗协同抑制远处肿瘤的进展，并诱导T细胞浸润。生物安全试验表明Nb@HCC不会对主要器官造成损害，毒性和副作用较小。Nb@HCC介导的PDT和抗CTLA-4疗法的组合可以抑制远处肿瘤的进展以获得显著的治疗效果。
本发明提供了上述技术方案所述抗体纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
将微生物转谷氨酰胺酶添加到含有纳米抗体、抗坏血酸和PEG-NH2的磷酸盐缓冲溶液中，启动Nb的位点特异性聚乙二醇化后纯化，得到聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体；
将人血清白蛋白、谷胱甘肽和水混合，去除水后加入二氢卟吩和过氧化氢酶进行偶联，然后加入乙醇形成二硫键，得到HCC纳米颗粒；
利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)对HCC纳米颗粒进行活化，得到活化HCC纳米颗粒；
将所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和活化HCC纳米颗粒进行键合，得到抗体纳米粒子。
本发明利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)对HCC纳米颗粒进行活化，得到活化HCC纳米颗粒。
本发明将微生物转谷氨酰胺酶添加到含有纳米抗体、抗坏血酸和PEG-NH2的磷酸盐缓冲溶液中，启动Nb的位点特异性聚乙二醇化后纯化，得到聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体。在本发明中，所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体的制备方法与上述技术方案所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体的制备方法相同，在此不再赘述。
本发明将人血清白蛋白(HSA)、谷胱甘肽(GSH)和水混合，去除水后加入二氢卟吩(Ce6)和过氧化氢酶(CAT)进行偶联，然后加入乙醇形成二硫键，得到HCC纳米颗粒。
在本发明中，所述血清白蛋白、谷胱甘肽、二氢卟吩和过氧化氢酶的质量比优选为1：0.3～0.4：0.05～0.15：0.15～0.15，更优选为1：0.335：0.1：0.1。在本发明中，所述CAT的酶活力优选≥35000单位/mg蛋白质。在本发明中，所述水优选为去离子水；所述血清白蛋白和水的质量比优选为10mg：0.5～1.5mL，更优选为10mg：1mL。本发明对于所述HSA、GSH、Ce6和CAT的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售商品即可；在本发明的实施例中，所述HSA和GSH优选购买于合肥博美生物技术有限公司；所述Ce6优选购买于J&KScientific Ltd.(中国)；所述CAT优选购买于上海阿拉丁工业公司。在本发明中，所述人血清白蛋白、谷胱甘肽和水混合后优选还包括将所述混合体系进行静置；所述静置的温度优选为室温；所述静置的时间优选为0.5～1.5h，更优选为1h。在本发明中，所述去除水优选利用3.5kDa分子量截断MWCO膜进行，所述去除水的时间优选为10～14h，更优选为12h。在本发明中，所述偶联优选在密封条件下进行，所述偶联时体系的pH值优选为8。在本发明中，所述血清白蛋白的质量与乙醇的体积之比优选为1mg：0.1～0.2mL，更优选为1mg：0.15mL。在本发明中，所述形成二硫键优选在搅拌条件下进行，本发明对于所述搅拌的速度没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速度即可；所述形成二硫键的温度优选为室温；所述形成二硫键的时间优选为25～35min，更优选为30min。所述形成二硫键后，本发明优选还包括将所述形成二硫键的悬浮液进行透析，得到HCC纳米颗粒；所述透析优选利用100kDa MWCO膜进行；所述透析的时间优选为22～26h，更优选为24h；所述透析的目的是除去悬浮液中的乙醇、游离Ce6、游离HSA和游离CAT。
在本发明中，所述HCC纳米颗粒优选以HCC纳米颗粒悬浮液形式存在，所述纳米颗粒HCC纳米颗粒悬浮液的浓度优选为0.5～1.5mg/mL，更优选为1mg/mL。在本发明中，所述HCC纳米颗粒与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的质量比优选为1：2～4，更优选为1:3。在本发明中，所述活化的温度优选为室温，所述活化的时间优选为20～30min，更优选为25min；所述活化过程中，HCC纳米颗粒中的硫醇基团被激活。所述活化后，本发明优选还包括将所述活化产物离心分离，将所得固体产物进行PBS洗涤，得到活化HCC纳米颗粒；所述PBS优选与上述PBS相同，在此不再赘述；所述洗涤的次数优选为2～4次，更优选为3次。
得到所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和所述活化HCC纳米颗粒后，本发明将所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和活化HCC纳米颗粒进行化学键合，得到抗体纳米粒子。
在本发明中，所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和活化HCC纳米颗粒的质量比优选为1：0.7～0.9，更优选为1:0.8。在本发明中，所述化学键合的温度优选为10～30℃，更优选为室温；所述化学键合的时间优选为2～4h，更优选为3h；所述键合过程中，聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体中的中的C3标签与活化HCC纳米颗粒中的硫醇基团之间形成杂二硫键。所述化学键合后，本发明优选还包括将所述键合产物离心分离以除未偶联的聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体，然后用PBS冲洗并重新悬浮在PBS中，得到抗体纳米粒子；所述PBS优选与上述PBS相同，在此不再赘述。
本发明提供了上述技术方案所述的抗体纳米粒子或上述技术方案所述制备方法得到的抗体纳米粒子在制备抗卵巢肿瘤药物中的应用。
在本发明中，所述抗卵巢肿瘤药物优选包括光动力疗法抗卵巢肿瘤药物和/或免疫疗法抗卵巢肿瘤药物。
本发明提供的Nb@HCC改善缺氧和增强PDT作为卵巢癌免疫治疗的原理图如图1所示。由图1可知，抗体纳米粒子显示出良好的生物相容性，能够诱导催化供氧并降低SK-OV-3细胞中HIF-1α的表达。此外，基于Nb@HCC的PDT可导致DAMPs，诱导DCs成熟，然后产生必要的免疫作用。在660nm激光下，基于Nb@HCC的PDT与抗CTLA-4治疗不仅可以抑制远处肿瘤的生长，还可以防止肿瘤转移。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
构建质粒，所述质粒带有N端His6标签和C端GGGGS-CCC-GSGSGS-LLQS(SEQ IDNO.1)序列，所述序列中包含未配对的半胱氨酸(C3-tag)和微生物转谷氨酰胺酶(mTGase；江苏一鸣生物有限公司)结合的LLQS(Q-tag)；将质粒转化到大肠杆菌Rosetta-gamiTM2(DE3)感受态细胞中诱导蛋白质表达，使用Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH＝8.0)重悬离心(4000rpm，20min)的大肠杆菌Rosetta-gamiTM2(DE3)感受态细胞，然后在冰水浴中进行超声处理，得到粗裂解物；将所述粗裂解物在4℃、16000rpm的速度下离心30min，将所得上清液装入5mL His-Trap HP柱(GE Healthcare，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)中，然后在含咪唑的Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH＝8.0，咪唑的线性梯度为40～250mM)进行洗脱以去除剩余的杂质和分离蛋白质，得到抗HER-2纳米抗体(简写为HER2-Nb)；
在室温下将mTGase(0.5～1U/mL)添加到含有1mM抗坏血酸、3mg/mL HER2-Nb和1mg/mLPEG-NH2的磷酸盐缓冲液(PBS)中，启动Nb的位点特异性聚乙二醇化，然后用5molα-氨基乙硫醇盐酸盐在37℃下预处理1h，然后在
Figure BDA0003159925320000111
纯化系统(GE Healthcare)的HiTrapTM脱盐柱上纯化，得到纯化的聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体。
将2mL去离子水溶液与含有20mg人血清白蛋白(HSA；合肥博美生物技术有限公司，合肥，中国)和6.7mg谷胱甘肽(GSH；合肥博美生物技术有限公司，合肥，中国)的溶液混匀，在室温下放置1h，然后将溶液中过量的GSH通过3.5kDa分子量截断(MWCO)膜对去离子水去除12h，加入2mg Ce6(J&KScientificLtd.，中国)和2mg CAT(≥35000单位/mg蛋白质，购自上海阿拉丁工业公司，中国上海)，在pH＝8.0时进行封装偶联，加入3mL乙醇进一步混合30min以重新形成二硫键，利用100kDaMWCO膜将悬浮液去离子水透析24h以去除乙醇、游离Ce6、游离HSA和游离CAT，得到HCC纳米颗粒；
室温下将1mg/mLHCC用1mmol 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB；Sigma-Aldrich Chemical Company,St Louis,MO,USA)活化处理25min，将所得活化的产物离心，然后用PBS溶液漂洗3次，得到活化HCC纳米颗粒。
将所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和活化HCC纳米颗粒按照质量比为5:4的比例混合，在25℃条件下键合3h，离心分离以除未偶联的聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体，然后用PBS冲洗并重新悬浮在PBS中，得到抗体纳米粒子(简写为Nb@HCC)；其中，1mgNb@HCC中Ce6、CAT、HAS和HER2-Nb的含量分别为150μg、150μg、600μg和100μg。
以下测试例中使用统计软件SPSS 20.0(IBM Corp.Armonk，NY，USA)分析实验数据，表示为平均值±标准偏差。两组间数据比较采用非配对t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)。双向方差分析用于比较不同时间点的多组数据。通过Kaplan-Meier方法估计存活率。在所有统计参考文献中，p<0.05的值表示具有统计学显著差异。
测试例1
Nb@HCC的表征
图2为Nb@HCC的形貌、流体动力学直径分布、紫外-可见光吸收光谱和荧光发射光谱，其中，A为Nb@HCC的TEM图，比例尺＝200nm，B为用DLS测量的Nb@HCC纳米颗粒的流体动力学直径分布图，C为Nb@HCC、HCC、游离的Ce6和HSA的紫外-可见光吸收光谱，D为Nb@HCC和游离的Ce6的NIR荧光发射光谱。由图2中A～B可知，Nb@HCC大小一致，其流体动力学直径多分散指数(PDI)约0.110，平均直径约为85±1.51nm，Nb@HCC均匀分散。由图2中C～D可知，在280和660nm的波长下检测到Nb@HCC的吸收峰值，这与HSA和Ce6的吸收带对应；Nb@HCC的荧光发射峰值与Ce6相似，从而确定在Nb@HCC合成后Ce6荧光没有显著变化。
测试例2
Nb@HCC的体外细胞摄取
(1)测试方法
(1.1)SK-OV-3细胞系(美国ATCC公司；马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)，有或没有荧光素酶报告基因，使用含有组合的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；Life Technology，Gaithersburg，MD，USA)：10％胎牛血清(FBS；Life Technology)和青霉素-链霉素混合物(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，Life Technology)在37℃条件下、5％CO2的培养箱中进行培养。
将SK-OV-3细胞以1×104个细胞/孔的密度接种于8孔板中，培养过夜。细胞分别用Ce6、HCC和Nb@HCC处理，Ce6的等效剂量为10μg/mL。处理2h后，用PBS冲洗细胞两次，然后用200μL4wt％多聚甲醛固定10min。使用10μg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在PBS中进行核染色10min，通过PBS冲洗去除游离DAPI。然后在共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)(TCSSP5，Leica，Wetzlar，Germany)下进行荧光图像捕获。将SK-OV-3细胞以5×105个细胞/孔的密度接种到12孔板中并培养过夜。在10μg/mL的等效Ce6剂量下，分别用游离Ce6、HCC和Nb@HCC处理细胞。处理2h后，用PBS冲洗细胞以去除任何游离的纳米颗粒，然后使用0.25％胰蛋白酶分离并重新悬浮在PBS中以使用流式细胞仪(BD FACSCalibur，Becton，Dickinson andCompany，Franklin Lakes，NJ，USA)进行测量。
(2)测试结果
图3为Nb@HCC的体外细胞摄取结果，其中，A为在CLSM下的SK-OV-3肿瘤细胞中，细胞摄取Ce6、HCC和Nb@HCC的荧光图像，蓝色信号表示DAPI染色，红色信号表示Ce6荧光，比例尺＝25μm；B为SK-OV-3细胞通过流式细胞仪摄取Ce6、HCC和Nb@HCC的结果图；C为在CLSM下观察到的乳腺癌细胞MDA-MB-231摄取Ce6、HCC和Nb@HCC，蓝色信号表示DAPI染色，红色信号表示IR1048MZ荧光，比例尺＝25μm；D为用流式细胞计分析仪的MDA-MB-231细胞摄取Ce6、HCC和Nb@HCC的结构图；E为流式细胞仪分析Ce6在Nb@HCC中2～36h的荧光强度。
由图3可知，与游离HCC和Ce6相比，Nb@HCC显著促进细胞摄取，红色荧光信号增加(图3中A)。流式细胞术分析表明，与游离HCC或Ce6处理相比，Nb@HCC处理后的荧光强度显著增强(图3中B)。选择没有HER-2表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231来验证Nb@HCC靶向HER-2的能力，MDA-MB231细胞几乎不摄取纳米颗粒，HER-2-Nb增强了Nb@HCC在SKOV-3细胞中的摄取率(图3中C～D)。Ce6对SKOV-3细胞吸收Nb@HCC的荧光强度在6h后达到峰值(图3中E)。表明，HER-2-纳米抗体能够提高SK-OV-3细胞中Nb@HCC的吸收效率。
测试例3
Nb@HCC改善肿瘤乏氧的作用
(1)测试方法
(1.1)SK-OV-3细胞的乏氧培养：将SK-OV-3细胞以2×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中孵育24h。为了诱导缺氧，用新鲜培养基更新培养基并进一步在含有94.5％N2(体积分数)、5％CO2和0.5％O2的厌氧室中培养。对照细胞在正常条件下培养，含有5％CO2和95％空气(含约20％O2)。
(1.2)细胞内H2O2分析：MAK164胞内H2O2试剂盒(美国Sigma-Aldrich)用于检测细胞内H2O2的变化。对于缺氧条件，SK-OV-3细胞在低氧室中培养12h。在10μg/mL的等效Ce6剂量下，将细胞分别与Ce6、HCC和Nb@HCC孵育4h。此后，将培养基更换为测定缓冲液并再孵育1h。PBS洗涤后，在CLSM下捕获荧光图像用于观察H2O2。
(1.3)对于常氧条件，将细胞与100μM H2O2孵育12h。细胞分别用PBS、HCC和Nb@HCC处理4h。随后，用测定缓冲液替换培养基并再孵育1h。用PBS洗涤后，通过CLSM荧光成像观察细胞内H2O2含量。
(2)测试结果
图4为通过Nb@HCC体外改善乏氧测试结果，其中，A为由660nm激光照射，由溶液中含/不含100μM过氧化氢的Nb@HCC诱导的单线态氧的荧光强度图；B为在PBS中Nb@HCC催化产生O2结果图；C为在缺氧条件下，Nb@HCC处理的SK-OV-3细胞中单线态氧传感器绿色(SOSG；Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA)检测到的H2O2的不同荧光强度结果图；D为在常氧条件下，Nb@HCC处理的SK-OV-3细胞中单线态氧传感器绿色(SOSG；ThermoFisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA)检测到的H2O2的不同荧光强度结果图。
肿瘤的缺氧微环境是一个复杂的因素，它可能介导肿瘤对各种治疗应用的抵抗力。这种微环境中的肿瘤细胞受大量H2O2影响，使用水溶性CAT将细胞内H2O2转化为O2可以改善治疗效果。由图4可知，在NIR的照射下，Nb@HCC与H2O2的结合可以显著诱导荧光强度(图4中A)；此外，在37℃下，将100μM H2O2(与细胞内浓度相似)添加到包含或不包含Nb@HCC的PBS中，使用氧气传感器检测检测到O2生成，结果表明Nb@HCC产生了大量O2(图4中B)；为了在细胞水平上识别Nb@HCC，在缺氧条件下将Nb@HCCs引入SK-OV-3细胞，结果表明，Nb@HCC显着降低了单线态氧的荧光强度，表明Nb@HCC提高了细胞摄取和细胞内催化作用。在常氧条件下，将100μM H2O2添加到SK-OV-3细胞中以进行进一步验证。Nb@HCC处理后单线态氧的荧光强度几乎降低，确定Nb@HCC可以分解细胞内的H2O2。然而，在其他对照组中没有观察到荧光强度的显著下降(图4中C和D)。
测试例4
Nb@HCC的体外光动力效应
(1)测试方法
(1.1)细胞毒性试验：对于CLSM下的荧光成像(For fluorescence imaging underCLSM)，SK-OV-3细胞接种到8孔室中载玻片上(每孔8×103个细胞)并培养12h。去除培养物后在室温下，将细胞与PBS、Ce6、HCC和Nb@HCC以5μg/mL Ce6的等效剂量再孵育2h。使用660nm、0.1W/cm2激光照射细胞5min，然后与2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA，20μM，Sigma-Aldrich)一起孵育30min。随后，在用1μM Hoechst 33342(Invitrogen，USA)染色后，在TCS SP5 CLSM下观察荧光图像。
(1.2)对于流式细胞术分析，将SK-OV-3细胞以5×104个细胞/孔的密度接种到24孔板中并培养12h。然后按照先前在CLSM研究中描述的方法处理和制备细胞。未经照照的Nb@HCC处理的细胞作为暗对比。DCFH-DA孵育30min后，细胞脱离和重悬后，通过流式细胞术(BD FACSCalibur)记录ROS的荧光信号。
(1.3)细胞活力测定：使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)检测试剂盒(北京阳光生物科技有限公司)在缺氧或常氧条件下、有/无辐照下评估Ce6、HCC和Nb@HCC对SK-OV-3细胞活力的影响。首先，评估没有照射下的细胞活力。SK-OV-3细胞被接种到96孔板，2×104个细胞/孔，培养12h。Ce6以0、0.2、0.5、1、2、5、10、20和50μg/mL的一系列指定剂量加入细胞，Ce6、HCC和Nb@HCC均孔中分别加入与Ce6等效剂量进行比较。孵育72h后，通过MTT法测量细胞活力并计算如下：细胞活力(％)＝(OD490样品-OD490空白)/(OD490对照-OD490空白)，其中，OD490为490nm波长下的光密度。涉及近红外线(NIR)照射的细胞活力测试与未照射的类似，不同之处在于将细胞孵育18h而不是12h。此外，加入上述等效剂量后培养4小时后，用NIR照射细胞5分钟。将细胞进一步温育72小时，然后通过MTT测定确定细胞活力。
(1.4)体外细胞凋亡研究：对于细胞凋亡研究，将SK-OV-3细胞以1×106细胞/孔的密度接种到6孔板中并培养过夜。Ce6、HCC和Nb@HCC，每一种都含有等效剂量10μg/mL Ce6，加入细胞24h。这些细胞随后接受了5min的NIR照射，或者在另外72h的孵育之前不接受照射。此后，用0.25％胰蛋白酶将细胞分离，并用PBS冲洗两次，然后使用膜联蛋白结合缓冲液(100μL/管)重悬。接下来，将5μLAlexa
Figure BDA0003159925320000161
488 Annexin V和1μLPI(100μg/mL)添加到样品中，并在25℃下孵育30min。接下来，每组加入400μL膜联结合蛋白缓冲液，将样品在冰上轻轻混合，然后立即通过流式细胞仪分析细胞凋亡。为了进行共聚焦显微镜成像，将细胞以PBS洗涤，用凋亡试剂盒染色并在CLSM下观察。
(1.5)活/死细胞染色：将SK-OV-3细胞以3×104细胞/孔的密度接种于8孔板中，培养过夜。在与细胞凋亡测定类似的方案下制备细胞。最后，细胞分别以2μM和50μg/mL的终浓度补充钙黄绿素AM(上海Yeasen公司)和碘化丙啶(PI；Yeasen)。处理10min后，荧光图像是在CLSM下捕获。
(2)测试结果
图5为Nb@HCC在SK-OV-3细胞中的光动力学效应图，其中，A为SK-OV-3细胞经过各种处理后的ROS生成的CLSM图像，比例尺＝25μm；B为流式细胞计量化各种处理后SK-OV-3细胞的ROS生成图；C为在无激光照射下Nb@HCC的细胞毒性图；D为激光照射下Nb@HCC的细胞毒性图；E为用各种纳米颗粒(比例尺＝25μm)处理的K-OV-3细胞凋亡的流式细胞术分析图；F为用各种纳米颗粒(比例尺＝25μm)处理的K-OV-3细胞凋亡的CLSM图像；G为钙黄绿素AM/PI染色的活/死细胞。多个数据组通过单向方差分析进行比较。双向方差分析用于比较不同时间点的数据。实验独立进行3次。。
由图5可知，Nb@HCC的光动力细胞毒性通过660nm激光照射SK-OV-3细胞进行评估，采用一个对照组(PBS激光处理)和四个实验组，包括Ce6照射、HCC有照射，Nb@HCC有照射，Nb@HCC没有照射。与其他实验组相比，仅在用Nb@HCC和0.1W/cm2激光照射5min处理的细胞中观察到增强的绿色荧光强度，证明纳米抗体介导的摄取增强也促进了细胞中ROS生成增加(图5中A)。流式细胞术显示了相同的模式，并确认了如上所述在CSLM中的ROS生成(图5中B)。MTT分析表明，在没有NIR照射的情况下处理Nb@HCC可能会适度限制细胞活力(图5中C)，这可能是由于CAT产生催化作用导致部分单线态氧产生。此外，照射处理Nb@HCC表现出浓度依赖性细胞毒性，优于照射处理的HCC或Ce6(图5中D)。进一步进行流式细胞术分析分析表明，Nb@HCC在660nmNIR照射下可以触发最大比例的凋亡细胞；未照射组中SK-OV-3细胞完整且大小均匀，凋亡率无明显差异。然而，在近红外照射后，Ce6、HCC和Nb@HCC组中的细胞凋亡都被诱导。HCC组诱导了比Ce6组更多的细胞凋亡，可能是CAT的催化作用导致ROS产生并增加细胞毒性。在存在HER-2-纳米抗体的情况下，Nb@HCC与辐射的组合导致所有组中细胞凋亡水平最高(图5中E和F)。
此外，使用钙黄绿素AM染色对活细胞和PI染色对凋亡细胞或晚期凋亡细胞进行研究，研究了PDT结果。观察到PI指示的红色荧光在具有照射组的Nb@HCC中和HCC组中，而其他组中的SK-OV-3细胞表达绿色荧光(图5中G)，诱导红色荧光强度最强出现在Nb@HCC组。这些结果揭示了Nb@HCC介导光动力效应诱导SK-OV-3细胞凋亡的潜力。因此，细胞摄取和联合NRI照射处理是Nb@HCC光动力细胞毒性的关键因素。
测试例5
Nb@HCC介导的PDT体外诱导ICD
(1)测试方法
(1.1)检测关键的免疫原性细胞死亡(ICD)生物标志物：基于钙网蛋白(CRT)的表面暴露，通过免疫荧光和流式细胞术评估PDT触发的ICD。对于免疫荧光分析，SK-OV-3细胞是以8×103个细胞/孔的密度接种于8孔板中，培养12h。随后将细胞用Ce6、HCC和Nb@HCC(1μg/mL的等效Ce6剂量)处理2h，同时用PBS处理作为阴性对照。然后使用660nm、0.1W/cm2激光照射细胞2min。未经照照的Nb@HCC处理的细胞用作暗对比。再孵育24h后，用PBS冲洗细胞并与抗CRT一抗孵育2h。此后，将细胞用PBS冲洗并与
Figure BDA0003159925320000181
488偶联的二抗(LifeTechnologies)孵育1h。最后，进行流式细胞术以观察免疫荧光信号。根据制造商标准的HMGB1 ELISA试剂盒和化学发光ATP测定试剂盒检查细胞外释放的HMGB1和ATP。简而言之，将SK-OV-3细胞以5×104细胞/孔的密度接种到24孔板中并培养12h。随后将细胞用PBS、Ce6、HCC和Nb@HCC处理2h，并使用660nm、0.1W/cm2激光照射2min。未经辐照的Nb@HCC处理的细胞用作暗对比。再孵育4h后，收集上清液并使用特定试剂盒检测以测量HMGB1和ATP的释放。
(1.2)体外诱导DCs成熟：雌性BALB/c小鼠(4～6周)购自湖南SJA实验动物有限公司，用于DCs生成。用含有2％FBS的PBS冲洗分离来自健康小鼠股骨和胫骨的骨髓细胞。为了收获未成熟的DC，将分离的细胞培养在X-VIVO15培养基(Lonza，瑞士)中，并添加了GM-CSF(20ng/mL)和IL-4(10ng/mL)。培养5天后，第6日将未成熟的DCs与经过PBS+Laser，Ce6+Laser,HCC+Laser和Nb@HCC+Laser(1μg/m L Ce6)处理的SKOV-3细胞共孵育。24小时后，DCs用抗小鼠CD80-Percp抗体和CD86-Percp抗体(eBioscience，美国)染色，然后通过流式细胞仪进行分析。并使用660nm、0.1W/cm2激光照射2min。在用抗小鼠CD80-Percp和抗小鼠CD86-Percp抗体(eBioscience，San Diego，CA，USA)染色后，通过流式细胞术检测最终的成熟DC。
(2)测试结果
图6为Nb@HCC介导的PDT后的免疫反应，其中，A为Nb@HCC介导的PDT后DC成熟机制的示意图，包括PDT诱导的ICD，引发DAMP(CRT、HMGB1和ATP)，从而导致DC成熟；B为SK-OV-3细胞表面CRT的定量分析；C为HMGB1的细胞外释放情况；D为ATP的细胞外分泌的测量结果；E为DC细胞外分泌的测量结果；F为基于生物标记物(CD80和CD86)，对SK-OV-3细胞Nb@HCC介导的PDT后DCs成熟的流式细胞术分析图，B～F中，(+)表示“+激光照射”。多组数据通过单向方差分析进行比较。实验独立进行三次。
先前的研究表明，诸如PDT、光热疗法(PTT)、放射疗法和化学疗法等癌症疗法可能会通过杀死肿瘤细胞来引发免疫原性信号，如危险相关分子模式(DAMP)，包括CRT、HMGB1和ATP，从而导致ICD。这种DAMP可以上调未成熟DCs的吞噬作用并诱导DCs的成熟。此外，DC在体内的抗原呈递作用可以刺激初始T细胞增殖和活化。DC成熟机制示意图如图6中A所示。本发明评估了SK-OV-3细胞在各种治疗后诱导的免疫原性信号及其相关的免疫反应。在辐照Nb@HCC组中检测到细胞表面暴露的CRT信号显著增加，而在其余组中观察到很少或没有CRT信号(图6中B)。通过ELISA研究了HMGB1的释放，以及通过基于荧光素/荧光素酶的发光测定，如图6中C和D所示，在光照射组中检测到Nb@HCC诱导的HMGB1释放和ATP分泌显著增加。此外，将Nb@HCC照射处理后的SK-OV-3细胞与未成熟的DC共培养，并使用CD80和CD86作为生物标志物进行DC成熟的分析。结果表明，Nb@HCC辐照组中成熟DCs(CD80+CD86+)的比例最大(图6中E和F)。结果表明，Nb@HCC介导的PDT可以显著增强SK-OV-3细胞中DAMPs的产生，从而刺激DC成熟。
测试例6
Nb@HCC调节乏氧的机制
(1)测试方法
缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)免疫染色：使用Alexa
Figure BDA0003159925320000191
488标记的抗HIF-1α抗体(ab190197，Abcam Inc.，Cambridge，UK)评估体外和体内缺氧水平。对于体外实验，SK-OV-3细胞在缺氧和常氧条件下孵育。对照组细胞用PBS单独处理，实验组细胞用HCC或Nb@HCC分别含10μg/mL Ce6处理4h。在厌氧室中获得低氧环境。对于体内实验，荷瘤小鼠用PBS、HCC或Nb@HCC处理。肿瘤切除后，将切片在空气干燥最少1h后，在20℃的丙酮中固定10min。组织切片用抗HIF-1α抗体和DAPI染色，用PBS冲洗两次并在CLSM下观察。
(2)测试结果
图7为分别通过Nb@HCC、PBS和Ce6调节SK-OV-3细胞和肿瘤中的乏氧结果图，其中，A为SK-OV-3细胞核中HIF-1α(绿色荧光)的表达模式，用CLSM测量，比例尺＝25μm；B为SK-OV-3切片肿瘤染色后的HIF-1α表达模式，比例尺＝50μm。
缺氧诱导因子1-α蛋白(HIF-1α)往往在乏氧环境下被上调加速肿瘤生长并促进其抵抗力。通过评估SKOV-3细胞与肿瘤中HIF-1α蛋白的表达证明Nb@HCC改善乏氧的能力。在低氧条件下孵育SKOV-3细胞，使得HIF-1α积累。相对于PBS与Ce6处理组，当Nb@HCC处理细胞后，HIF-1α荧光信号明显减弱，接近于常氧处理下的PBS，改善了缺氧状态(图7中A)。HIF-1α的免疫荧光染色证实，Nb@HCC高度缓解了SKOV-3肿瘤组织中的缺氧，而缺乏靶向作用的HCC处理组并不能达到明显效应(图7中B)。这些数据表明，Nb@HCC可以有效克服细胞和肿瘤水平的缺氧，而这正是改善肿瘤缺氧微环境促进光动力治疗有效途径。
测试例7
Nb@HCC与抗CTLA-4的体内抗肿瘤作用
(1)测试方法
(1.1)皮下肿瘤模型：4～6周龄的雌性BALB/c小鼠购自湖南SJA实验动物有限公司。动物实验按照南昌大学第一附属医院动物伦理委员会批准的方案进行。通过将含有1×106SK-OV-3细胞的100μLPBS皮下注射到小鼠的左侧区域来产生皮下肿瘤模型。第8天将1×105SK-OV-3细胞额外皮下注射到右侧区域建立远处肿瘤模型。
(1.2)动物治疗：在将SK-OV-3细胞皮下注射到右侧后的第二天，根据不同的治疗将小鼠分为7组：仅手术组(Surgery)、手术+Nb@HCC(Surgery+Nb@HCC)、手术+Nb@HCC+抗CTLA-4(Surgery+Nb@HCC+α-TTLA4)、HCC+激光(HCC+Laser)、Nb@HCC+激光(Nb@HCC+Laser)、Nb@HCC+抗CTLA-4(Nb@HCC+α-TTLA4)和Nb@HCC+激光+抗CTLA-4(Nb@HCC+Laser+α-TTLA4)。Ce6的应用剂量为5mg/kg，纳米颗粒处理后第1、4、7天注射抗CTLA-4。24h后，激光组小鼠的肿瘤区域暴露于660nmNIR激光(0.1W/cm2)30min，每2min间隔1min。最后，测量和分析右侧区域肿瘤的大小。
(2)测试结果
图8为Nb@HCC介导的PDT结合抗CTLA-4治疗SK-OV-3肿瘤的抗肿瘤作用图，其中，A为Nb@HCC介导的PDT和抗CTLA-4疗法协同抑制远端肿瘤生长的方法示意图；B为原发性肿瘤切除后采用不同治疗的小鼠右侧远端肿瘤的生长曲线；C为采用不同治疗方法的小鼠的生存曲线，其中，曲线由左到右依次为手术组(Surgery)、Surgery+Nb@HCC+α-CTLA4、Nb@HCC+Laser、α-CTLA4、Nb@HCC+α-CTLA4和Nb@HCC+Laser+α-CTLA4。不同时间点肿瘤体积比较采用双因素方差分析，采用Kaplan-Meier法计算各组生存率，P<0.05。
统的手术、化疗、放疗等无法阻止肿瘤的转移进行有效治疗。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)在免疫反应中起负调节作用，其抗体能够抑制免疫抑制性T调节细胞的活性。在体内治疗实验中，本发明引入CTLA4检查点阻断法，用于增强Nb@HCC光动力效应杀伤原位肿瘤后产生“肿瘤疫苗”对远端转移肿瘤形成抑制作用。如图8中A所示，SK-OV-3细胞被接种到小鼠的左侧区域模拟原发肿瘤。1周后将SK-OV-3细胞注射到同一只小鼠的右胁腹区，建立远处转移瘤或继发瘤模型。然后，通过手术干预、Nb@HCC介导的PDT或Nb@HCC和抗CTLA-4去除原发肿瘤。接下来，在治疗后第1、4和7天以20μg/只小鼠剂量静脉注射(i.v.)抗CTLA-4。随后，转移性肿瘤的大小被持续监控。
由图8中B可知，手术切除原发肿瘤后，小鼠远处转移性肿瘤引起快速进展。添加Nb@HCC静脉注射治疗或抗CTLA-4导致转移性卵巢肿瘤生长的轻微抑制，而Nb@HCC和抗CTLA-4的联合治疗显着减缓了转移性肿瘤的进展。仅通过Nb@HCC介导的PDT，原发肿瘤消除后转移性肿瘤被部分抑制。重要的是，对于原发性肿瘤被基于Nb@HCC的PDT与抗CTLA-4消除的小鼠，其转移肿瘤完全消失，达到很好的疗效，并且优于基于HCC的PDT与抗CTLA-4治疗组(图8中B)。这表明抗HER-2-Nb结合使得Nb@HCC有效聚集于SKOV-3肿瘤部位，从而产生增强的治疗效应。在另外一个组中，基于Nb@HC(不含CAT)的PDT和抗CTLA-4治疗只能前期抑制转移肿瘤的生长，表明纳米颗粒改善肿瘤乏氧促进治疗的重要性。值得注意的是，α-CTLA4单独治疗也有很好的疗效，仅次于联合治疗Nb@HCC介导PDT和α-CTLA4治疗。此外，基于Nb@HCC的PDT和抗CTLA-4治疗组中小鼠有2/3存活到80天)，而其他对照组中小鼠均在20～60天内死亡(图8中C)，证明Nb@HCC在杀伤SKOV-3肿瘤同时呈现出良好的生物安全性。
测试例8
免疫抗肿瘤机制研究
(1)测试方法
通过流式细胞术进行免疫细胞分析：为了评估右侧区域(远处肿瘤)肿瘤的DC成熟度，将小鼠安乐死，分离肿瘤，随后在37℃下用含有1mg/mL胶原酶I(Gibco，Carlsbad，CA，USA)、1,000U/mL透明质酸酶和DNase消化液处理30min。选用合适孔径的尼龙丝网过滤器分离细胞。用含1％FBS的PBS洗涤后，将单细胞悬液用荧光标记的抗CD3-FITC(Biolegend，USA)，抗CD8a-APC(Biolegend)和抗CD4-PerCP(Biolegend)抗体染色。在流式细胞术分析之前，用含有1％FBS的PBS再次冲洗细胞以消除任何未结合的抗体。为了评估调节性T细胞，将单细胞悬液与抗CD3-FITC、抗CD4-PerCP和抗Foxp3-PE抗体(eBioscience))一起孵育。数据通过流式细胞术记录并使用FCS Express软件进行分析。
(2)测试结果
图9为Nb@HCC对转移性SK-OV-3肿瘤的抗肿瘤活性图，其中，A为用基于肿瘤浸润性T细胞的流式细胞术分析的CD8+CTL、CD4+效应T细胞(CD3+CD4+Foxp3-)和CD4+抑制性Tregs(CD3+CD4+FoxP3+)的抑制性比例；B为切除原发性肿瘤后，转移性肿瘤中CD8+CTL、CD4+效应T细胞和CD4+抑制性Tregs的抑制性比例，Group1为手术组；Group2为手术+Nb@HCC组；Group3为手术+Nb@HCC+抗CTLA4组；Group4为Nb@HCC+Laser组；Group5为Nb@HCC+抗CTLA4组；Group6为Nb@HCC+Laser+抗CTLA4组。用单向分析法对多组患者进行了比较，*表示与其他组的比较，p<0.05。
免疫细胞进入肿瘤微环境中是与抗肿瘤免疫反应直接相关的重要参数。通过调查Nb@HCC介导的PDT与抗CTLA-4治疗的协同抗肿瘤作用及其机制，在第10天对转移性肿瘤中的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(CD8+T)和辅助性T细胞(CD4+T)进行了计数。CD8+T细胞(CD3+CD4-CD8+)直接杀死肿瘤细胞，而CD4+T细胞(CD3+CD4+CD8-)通过分泌细胞因子协调适应性免疫反应，并被抗原呈递DCs致敏。在本部分中，手术切除原发肿瘤后，Nb@HCC介导的PDT和抗CTLA-4治疗都不能分别促进CD8+T细胞浸润到转移性肿瘤中。相反地，基于Nb@HCC的PDT结合抗CTLA-4治疗原发肿瘤后，小鼠转移肿瘤中CD8+T细胞百分比高于Nb@HCC的PDT组或手术加抗CTLA-4组(图9中A)。与手术治疗组相比，其他治疗组转移肿瘤中辅助性T细胞的CD4+T百分比明显增加。
此外，CD4+辅助T细胞以Foxp3作为标记物，可以分为促进免疫反应的效应T细胞(CD3+CD4+Foxp3-)和抑制抗肿瘤免疫反应的调节T细胞(抑制性Tregs)(CD3+CD4+Foxp3+)。我们收集转移肿瘤中免疫细胞进行CD4和Foxp3共染色分析。当基于Nb@HCC的PDT消亡原发性肿瘤后，小鼠转移肿瘤中CD4+T细胞含量增加，但增加的辅助T细胞多数为免疫抑制性Tregs(图9中B)。尽管基于Nb@HCC的PDT已经产生免疫反应，但由于Treg的存在导致抗肿瘤免疫效应较低。实验表明CTLA-4阻断疗法可以大大降低转移肿瘤中抑制性Tregs含量。明显的是，基于Nb@HCC的PDT结合抗CTLA4诱导了最高百分比的CD8+T细胞含量以及低百分比的抑制性Tregs含量(图9中A、B)表明肿瘤特异性T细胞反应用于癌症免疫治疗。结果表明，Nb@HCC介导的PDT联合抗CTLA-4疗法通过针对SK-OV-3肿瘤的免疫原性PDT获得了显著的治疗效果。
测试例9
Nb@HCC的毒副作用
(1)测试方法
Nb@HCC的体内生物安全性：雌性BALB/c小鼠通过尾静脉注射用100μL PBS或Nb@HCC以5mg/kg Ce6的等效Ce6剂量处理。在注射后第1天和第7天，分别使用ALT、AST和ALP检测试剂盒根据血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)水平评估肝脏和肾脏相关毒性。注射后7天，将小鼠安乐死并解剖以收集主要器官，然后将其切片进行苏木精-伊红(HE)染色并在光学显微镜下观察(Olympus BX53，Tokyo，Japan)
(2)测试结果
Nb@HCC的毒副作用测试结果如表1和图10所示。图10为Nb@HCC的生物安全评估结果，其中，A为在尾静脉注射Nb@HCC后第7天对5种主要器官组织(心脏、肝、脾、肺、肾)染色结果，比例尺＝25μm；B为5种主要器官组织(心脏、肝、脾、肺、肾)中Nb@HCC的浓度。
表1静脉注射Nb@HCC后第1天和第7天BALB/c小鼠的血清参数水平
ALT(U/L) ALP(U/L) AST(U/L)
参考值 5.6～39.75 28.1～40.8 67.2～120.6
健康组 21.6±2.3 30.6±2.0 86.9±8.6
治疗后的1d 23.1±2.5 32.8±2.7 90.7±9.2
治疗后的7d 25.8±2.9 35.2±3.5 98.3±7.3
注：将这些数据与未经治疗的健康组进行了比较，血清参数：丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)和天冬氨酸转氨酶(AST)。
通过尾静脉注射后主要器官的HE染色和血清生化检测Nb@HCC的体内生物安全性。心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏这五个主要器官的HE染色表明Nb@HCC没有造成任何明显的损伤(图10中A)。此外，心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏5个主要器官中Nb@HCC的浓度检测结果表明Nb@HCC主要在肝脏和肾脏中浓聚和代谢(图10中B)。Nb@HCC治疗后第1天和第7天，结果与健康对照组相比，血清参数在正常参考范围内变化(表1)。ALT、AST、ALP的水平没有明显差异，这表明Nb@HCC在治疗后保持正常的肾和肝功能。这些数据表明Nb@HCC可以在小鼠体内正常代谢，对正常组织无毒副作用，表明Nb@HCC支持PDT在肿瘤治疗中的安全应用。
测试例10
Nb@HCC的药代动力学
将Nb@HCC和其他对照(Ce6、HCC)单次静脉注射到小鼠体内，将2mg/kg的Ce6注射到健康小鼠体内的药代动力学结果如图11所示。Nb@HCC被用来增强肿瘤细胞中活性光敏剂药物的传递，采用PEGs来增强药物循环和活动时间，延长循环半衰期。通过评估Nb@HCC的药代动力学性能，可以推断出血液循环时间相对较长的PEG修饰的Nb@HCC将适用于体内治疗。
Nb@HCC处理的细胞显示出大量的红色荧光，而HCC和Ce6的荧光几乎没有明显变化，这表明抗HER-2-Nb增强了SK-OV-3细胞对Nb@HCC的摄取。肿瘤内部供血不足和肿瘤细胞增殖的大量氧气消耗促进了肿瘤中乏氧微环境形成并影响卵巢癌治疗的效果。HIF-1α特异性纳米抗体(VHH16)能特异性结合HIF-1α，以进一步介导缺氧适应，表明Nb@HCC具有临床应用潜力。由于缺氧癌细胞通常含有高浓度的H2O2，水溶性CAT用于将细胞内H2O2转化为O2。CAT能够有效改善肿瘤细胞的产氧特性，从而有助于增强放射和免疫治疗的功效。乏氧实验表明与CAT结合的Nb@HCC具有出色的催化能力，可将细胞内的H2O2分解为O2，Nb@HCC高度缓解了SK-OV-3肿瘤组织中的乏氧程度。基于Nb@HCC的PDT有效改善肿瘤缺氧微环境，增强肿瘤治疗效果。
综上所述，在660nm激光照射下，Nb@HCC对SK-OV-3肿瘤细胞具有明显的光动力毒性。与传统PDT相比，基于Nb@HCC的PDT具有优异的性能。与手术、放疗、化疗等传统肿瘤治疗方案相比，基于Nb@HCC介导的PDT是毒性低、选择性高、微创的治疗方法。Nb@HCC用于增强深部肿瘤细胞中光敏剂药物的靶向传递。基于Nb@HCC的PDT和抗CTLA-4治疗的组合时，2/3的小鼠存活了80天，而其他治疗的小鼠在20～60天内死亡，从而确定了Nb@HCC在消除SK-OV-3肿瘤方面的优越功效，同时具有良好的生物相容性。基于Nb@HCC的PDT与抗CTLA-4的联合治疗方案显著逆转了转移性肿瘤的生长，并且转移性肿瘤中CD8+T细胞的百分比是手术切除原发小鼠肿瘤后最高。抗CTLA-4治疗严重降低了转移性肿瘤中抑制性Tregs的含量，抗CTLA-4调节肿瘤中的免疫抑制环境以提高治疗性能。此外，抗CTLA-4不仅可以调节耗竭样CD8+T细胞的特定亚群，还可以触发ICOS+Th1样CD4效应细胞群的扩增。由于Nb@HCC具有纳米级尺寸，纳米粒子从活体中迅速消除，这大大提高了治疗效果并减少了副作用。Nb@HCC的毒性作用较小，且不会损伤重要器官。本发明提供了一种新型的基于Nb@HCC的卵巢癌PDT疗法，Nb@HCC显示出良好的生物相容性，能够诱导催化供氧并降低SK-OV-3细胞中HIF-1α的表达。此外，基于Nb@HCC的PDT可导致DAMPs，诱导DCs成熟，然后产生必要的免疫作用。在660nm激光下，基于Nb@HCC的PDT与抗CTLA-4治疗不仅可以抑制远处肿瘤的生长，还可以防止肿瘤转移，对卵巢癌的PDT治疗效果优异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南昌大学第一附属医院
<120> 一种抗体纳米粒子及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Cys Cys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Leu Leu
1 5 10 15
Gln Ser

Claims (10)

1.一种抗体纳米粒子，包括聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和与所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体通过化学键合的HCC纳米颗粒；
所述HCC纳米颗为人血清白蛋白封装的二氢卟吩和过氧化氢酶；
所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体由包括以下步骤的方法制备得到：构建质粒，将所述质粒转化到大肠杆菌Rosetta-gamiTM 2感受态细胞中诱导蛋白质表达，得到纳米抗体；所述质粒为N端为具有His6标签，C端为GGGGS-CCC-GSGSGS-LLQS序列的质粒，所述序列中包含未配对的半胱氨酸和微生物转谷氨酰胺酶结合的LLQS；将微生物转谷氨酰胺酶添加到含有所述纳米抗体、抗坏血酸和PEG-NH2的磷酸盐缓冲溶液中，启动Nb的位点特异性聚乙二醇化，得到聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体纳米粒子，其特征在于，所述启动Nb的位点特异性聚乙二醇化后还包括纯化，所述纯化包括：利用α-氨基乙硫醇盐酸盐预处理后进行
Figure FDA0003159925310000011
纯化。
3.根据权利要求1或2所述的抗体纳米粒子，其特征在在于，所述抗体纳米粒子中HCC纳米颗粒的质量分数为80～95％。
4.根据权利要求1所述的抗体纳米粒子，其特征在在于，所述HCC纳米颗粒中二氢卟吩、过氧化氢酶和人血清白蛋白的质量比为0.5～1.5：0.5～1.5：3～5。
5.权利要求1～4任一项所述的抗体纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建质粒，将所述质粒转化到大肠杆菌Rosetta-gamiTM 2感受态细胞中诱导蛋白质表达，得到纳米抗体；所述质粒为N端为具有His6标签，C端为GGGGS-CCC-GSGSGS-LLQS序列的质粒，所述序列中包含未配对的半胱氨酸和微生物转谷氨酰胺酶结合的LLQS；
将微生物转谷氨酰胺酶添加到含有所述纳米抗体、抗坏血酸和PEG-NH2的磷酸盐缓冲溶液中，启动Nb的位点特异性聚乙二醇化后纯化，得到聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体；
将人血清白蛋白、谷胱甘肽和水混合，去除水后加入二氢卟吩和过氧化氢酶进行偶联，然后加入乙醇形成二硫键，得到HCC纳米颗粒；
利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)对HCC纳米颗粒进行活化，得到活化HCC纳米颗粒；
将所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和活化HCC纳米颗粒进行化学键合，得到抗体纳米粒子。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述HCC纳米颗粒与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的质量比为1：2～4。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇化抗HER-2纳米抗体和活化HCC纳米颗粒的质量比为1：0.7～0.9。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述化学键合的温度为10～30℃，时间为2～4h。
9.权利要求1～4任一项所述的抗体纳米粒子或权利要求5～8任一项所述制备方法得到的抗体纳米粒子在制备治疗卵巢肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述治疗卵巢肿瘤药物包括光动力疗法治疗卵巢肿瘤药物和/或免疫疗法治疗卵巢肿瘤药物。
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