CN114870011A - 一种增强实体瘤内原卟啉ix蓄积的微针贴片及其制备方法 - Google Patents
一种增强实体瘤内原卟啉ix蓄积的微针贴片及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种增强实体瘤内原卟啉IX蓄积的微针贴片及其制备方法。该方法包括步骤:将白蛋白溶解至杜氏培养基中,以白蛋白为模板,加入CuCl2和CaCl2进行矿化,得到CCP纳米颗粒;分别通过一步碳二亚胺偶联法和静电吸附法将CAT和5‑ALA负载至CCP纳米颗粒表面,得到CCPCA纳米颗粒;将CCPCA纳米颗粒和微针基质溶液装载进进微针模具中,经真空干燥脱模,得到增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片。本发明的微针贴片可以通过CAT和5‑ALA的精准递送增加肿瘤内PpIX和O2水平,同时提供实时的双模态PpIX荧光成像和光声血氧成像的指导,提高对不同癌症的光动力学治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及微针贴片制备及生物医药领域,尤其涉及一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片及其制备方法。
背景技术
5-氨基酮戊酸(5-ALA)被肿瘤细胞选择性摄取并将其迅速生物合成为具有荧光性能的原卟啉IX(PpIX),可以用于荧光成像介导的肿瘤诊断。因此,基于5-ALA的光动力学治疗(5-ALA-PDT)的光化学反应主要发生在癌细胞中,避免了脱靶的毒副作用。虽然局部5-ALA-PDT已成为光化性角化病或基底细胞癌患者的主要治疗手段,但PpIX瘤内生物合成浓度有限且肿瘤滞留时间短,以及肿瘤的异质性、肿瘤乏氧微环境和强抗氧化系统等特点,限制了5-ALA-PDT在实体恶性肿瘤治疗方面的临床应用。另外,在临床实际应用中,5-ALA-PDT的治疗方案目前缺乏无创的分子影像指导,例如:瘤内最大PpIX的浓度的时间点、瘤内的氧气浓度、激光照射次数等参数。因此,迫切需要开发更有效的精准诊疗方案来解决5-ALA-PDT的临床瓶颈,以提高其生物安全性,并推动其进一步临床应用。
瘤内高效地生成PpIX是5-ALA-PDT的重要条件,而5-ALA的高极性和亲水性限制了其通过被动扩散透过角质层和细胞膜,导致在口服和透皮给药中极低的5-ALA生物利用度。另一方面,肿瘤细胞摄取的5-ALA转化为PpIX的效率至关重要,因为它决定了PpIX瘤内生成的最高浓度以及肿瘤滞留的时间。由于瓦博格效应,肿瘤细胞的呼吸功能障碍会导致PpIX和Fe2+供应失衡,研究表明可以通过供应外源性5-ALA、引入铁螯合剂、降低亚铁螯合酶表达、抑制血红素加氧酶活性等不同策略来上调肿瘤细胞内PpIX的生物合成。然而,胞内PpIX浓度的快速增加,会触发血红素合成反馈调节机制,导致PpIX的排出增强并用于合成血红素,使得细胞内PpIX的累积浓度不足,从而达不到理想的肿瘤治疗效果。研究表明抑制原癌的Ras/MEK信号通路可以通过下调缺氧诱导因子(HIF)-1α(HIF-1α)来降低亚铁螯合酶(FECH)的活性,从而增强细胞内PpIX的累积。因此,给肿瘤细胞持续供氧气(O2),可以通过调控Ras/MEK信号通路,提高细胞内PpIX的累积浓度,同时克服5-ALA-PDT的肿瘤缺氧问题。然而,HIF-1α表达的抑制需要较长的时间,而PpIX在体内的代谢较快(大约在4小时内达到合成的最高峰,在12小时内迅速清除),因此需要有效的策略来延长肿瘤PpIX的滞留时间。微针递送系统可以直接穿透角质层,进行药物透皮递送。纳米药物递送系统可以实现药物的缓释。因此,本发明设计和合成了一种微针贴片,通过同时实现5-ALA和过氧化氢酶(CAT)的递送,从而上调PpIX生理合成浓度并延长其肿瘤内滞留时间的实际效果,从而提高5-ALA-PDT的疗效。
肿瘤内高浓度单线态氧(1O2)的生成是5-ALA-PDT发挥治疗作用的关键。然而,在5-ALA-PDT临床试验报告的不良事件中,诸如治疗部位邻近组织的疼痛、水肿和脱皮等,都与1O2在正常组织中的高积累有关。这是由于PDT反应过程中产生的1O2会引发氧化损伤以及蛋白质和多核苷酸的二次修饰,从而使膜细胞器更加脆弱并进一步诱导细胞凋亡或坏死。为了增强5-ALA-PDT的抗肿瘤疗效并减轻毒副作用,迫切需要更精准的5-ALA-PDT的诊疗方案,尤其需要实时评估肿瘤组织内的PpIX和O2浓度,并根据无创的分子影像来制定激光照射参数,优化治疗参数。
因此,现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片及其制备方法,旨在解决现有5-ALA-PDT中由于缺乏特异性递送策略而导致的肿瘤乏氧,PpIX合成浓度低,实体肿瘤治疗效率低下等的问题。
本发明的技术方案如下:
一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的制备方法,其中,包括如下步骤:
将白蛋白溶解至杜氏培养基中,加入CuCl2和CaCl2进行原位矿化,得到CCP纳米颗粒;
分别通过一步碳二亚胺偶联法和静电吸附法将CAT和5-ALA负载至所述CCP纳米颗粒表面,得到CCPCA纳米颗粒;
将CCPCA纳米颗粒和微针基质溶液装载进微针模具中,经真空干燥脱模后,得到增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片。
可选地,所述将白蛋白溶解至杜氏培养基中,加入CuCl2和CaCl2进行原位矿化,得到CCP纳米颗粒的步骤,具体包括:
将白蛋白溶解在杜氏培养基中,然后加入CuCl2溶液,在37℃下矿化24小时,随后加入CaCl2溶液,在37℃下继续矿化24小时,得到CCP纳米颗粒。
可选地,所述白蛋白可以为人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)。
可选地,所述CuCl2溶液浓度为0.1M,所述CaCl2溶液浓度为1M,所述CuCl2溶液与所述CaCl2溶液加入的体积相同。
可选地,所述分别通过一步碳二亚胺偶联法和静电吸附法将CAT和5-ALA负载至所述CCP纳米颗粒表面,得到CCPCA纳米颗粒的步骤,具体包括:
将所述CCP纳米颗粒分散于缓冲液中,得到CCP纳米颗粒溶液;
将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶液加入至所述CCP纳米颗粒溶液中,在室温和黑暗条件下搅拌第一预定时间后,加入N-羟基丁二酰亚胺溶液,进行反应;
向所述反应后体系中加入CAT,搅拌第二预定时间后,得到CCPC纳米颗粒;
将所述CCPC纳米颗粒分散在5-ALA溶液中,在室温和黑暗条件下搅拌第三预定时间后,得到所述CCPCA纳米颗粒。
可选地,所述CCPCA纳米颗粒中,CAT与CCP纳米颗粒的质量比为0~0.1,5-ALA与CCP纳米颗粒的质量比为0~0.1。
可选地,所述CCPCA纳米颗粒中,CAT的载药量在0~7.9%,5-ALA的载药量在0~6.8%。
可选地,所述将CCPCA纳米颗粒和微针基质溶液装载进微针模具中,经真空干燥脱模后,得到增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的步骤,具体包括:
提供微针模具;
将CCPCA纳米颗粒分散在水中,得到CCPCA纳米颗粒悬浮液;
将所述CCPCA纳米颗粒悬浮液加入所述微针模具中,进行真空干燥,将微针基质溶液注入到所述微针模具中,经真空干燥脱模后,得到增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片。
可选地,所述微针基质溶液包括透明质酸钠和超活性透明质酸(HA),所述透明质酸钠和超活性透明质酸的重量比为1:(1~5)。
一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片,其中,所述微针贴片包括:贴片和位于所述贴片上的多个阵列设置的微针;
所述贴片内装载有微针基质;
所述微针内装载有CCPCA纳米颗粒;其中,所述CCPCA纳米颗粒包括CCP纳米颗粒和负载于所述CCP纳米颗粒表面的CAT和5-ALA;
所述微针贴片采用本发明所述的方法制备得到。
可选地,所述微针基质包括透明质酸钠和超活性透明质酸,所述透明质酸钠和超活性透明质酸的重量比为1:(1~5)。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明通过纳米缓释与微针递送策略的结合,实现了高效精准透皮递送CAT和5-ALA的共递送能力。在给与相同浓度5-ALA(10.8μg mL-1)的条件下,所述CCPCA纳米颗粒在A375黑色素瘤细胞内诱导PpIX蓄积的含量(141.4±1.7ng/106个细胞)分别为不负载CAT的CCPA组(72.4±7.7ng/106个细胞)和游离5-ALA组(35.1±3.3ng/106个细胞)的1.9倍和4.0倍。相比静脉注射或单纯的微针递送5-ALA的方法,本发明基于纳米诊疗设计的MN-CCPCA微针贴片可显著增加肿瘤部位PpIX的积累,其在皮下U87脑胶质瘤内PpIX最大荧光强度分别为尾静脉注射5-ALA组和微针递送5-ALA组的5.3倍和2.7倍。其在皮下4T1乳腺癌细胞内PpIX最大荧光强度分别为尾静脉注射5-ALA组和微针递送5-ALA组的4.3倍和3.2倍。
2、本发明上调PpIX蓄积的策略为增加内源性和外源性PpIX合成,并最大地减少PpIX在癌细胞的流出。MN-CCPCA微针贴片可通过逆转肿瘤乏氧,调控PpIX相关的合成酶,规避PpIX的负反应调控过程,其分子机制是CAT催化细胞内源性过氧化氢持续升高O2水平,抑制HIF-1α的表达,进而降低FECH表达,从而限制PpIX在线粒体的流出并引发血红素短缺的负反馈效应,增加ALA合成酶(ALAS)的表达,使得CCPCA纳米颗粒递送的外源性5-ALA和癌细胞合成的内源性5-ALA能够同时转化成PpIX,从而进一步导致细胞中PpIX的积累增加。
3、本发明成功提供了一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片,通过逆转肿瘤乏氧,增加肿瘤部位PpIX合成的最大生理浓度,同时也延长了PpIX达到的最大累积峰值的时间(PpIX在胶质母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌中的最大肿瘤滞留时间分别延长至12、12、24小时,显著高于游离5-ALA的4小时),可提供更长的治疗窗口,使其在一次给药前提下,可用于多次重复的PDT。
4、本发明可以针对多种浅表肿瘤(乳腺癌,脑胶质瘤,黑色素瘤)制定个性化治疗方案,可借助荧光和光声仪器,同时提供实时的PpIX荧光成像和光声血氧成像的指导,显著提高癌症的治疗效果。
附图说明
图1为实施例1中一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的应用示意图。
图2中a为实施例1中得到的CCPCA NPs的透射电镜图,图2中b为实施例1中得到的MN-CCPCA微针贴片的扫描电镜图。
图3中a为实施例1中MN-CCPCA微针贴片负载CCPCA NPs前的高分辨扫描电镜图,图3中b为实施例1中MN-CCPCA微针贴片负载CCPCA NPs后的高分辨扫描电镜图。
图4为实施例1中得到的CCPCA NPs中5-ALA的包封率和载药量。
图5为实施例1中得到的CCPA和CCPCA NPs的热失重曲线。
图6为实施例1中得到的不同浓度(0~160mg/mL)的CCPCA NPs在1mM H2O2条件下催化产生溶解氧的量化值。
图7为实施例1中得到的CCPCA NPs中CAT与体外等量CAT催化10mM H2O2的催化动力学对比图。
图8为实施例1中得到的CCPCA NPs在中性(pH=7.4)和弱酸性(pH=6.0)降解释放Ca2+(a)和Cu2+(b)的量化曲线。
图9为实施例1中得到的MN-CCPCA微针贴片的力学性能测试图。
图10为实施例1中得到的MN-CCPCA微针贴片在小鼠表皮(a)和大鼠表皮(b)穿透角质层的苏木精伊红染色图。
图11为实施例中得到的不同纳米颗粒在细胞中蓄积PpIX的量化值。
图12为实施例中添加等量5-ALA条件下,不同组在A375肿瘤细胞产生PpIX荧光半定量值。
图13为实施例中不同组调控PpIX合成的相关酶在细胞内的表达情况。
图14为实施例得到的不同微针组在活体A375黑色素瘤中产生PpIX的荧光半定量值。
图15为实施例得到的不同微针组在活体A375黑色素瘤中血氧饱和度的实时量化值。
图16为实施例得到的不同微针组在活体A375黑色素瘤中,利用PDT后,得到(a)肿瘤体积抑制曲线和(b)肿瘤照片。
图17为实施例得到的不同给药方式组在活体U87脑胶质瘤中产生PpIX的荧光半定量值。
图18为实施例得到的不同给药方式组在活体U87脑胶质瘤中,利用PDT后,得到的(a)肿瘤体积抑制曲线和(b)肿瘤照片。
图19为实施例得到的不同给药方式组在活体4T1三阴性乳腺肿瘤中产生PpIX的荧光半定量值。
图20为实施例得到的不同给药方式组在活体4T1三阴性乳腺肿瘤中,利用PDT后,得到的(a)肿瘤体积抑制曲线和(b)肿瘤照片。
具体实施方式
本发明提供一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片及其制备方法,为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的制备方法,其中,包括如下步骤:
S1、将白蛋白(作为模板)溶解至杜氏培养基中,加入CuCl2和CaCl2进行原位矿化,得到CCP纳米颗粒(记为CCP NPs);
S2、分别通过一步碳二亚胺偶联法和静电吸附法将CAT和5-ALA负载至所述CCP纳米颗粒表面,得到CCPCA纳米颗粒(记为CCPCA NPs);
S3、将CCPCA纳米颗粒和微针基质溶液装载进微针模具中,经真空干燥脱模后,得到增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片(记为MN-CCPCA)。
本实施例中,所述MN-CCPCA具有高效精准透皮递送CAT和5-ALA的共递送能力。所述CCPCA NPs具有良好的弱酸性pH(6.0~7.4)降解能力,催化肿瘤内过氧化氢(H2O2)产生O2的能力。所述MN-CCPCA可通过逆转肿瘤乏氧,调控PpIX相关的合成酶并规避PpIX的负反应调控过程,其具体分子机制是CAT持续升高内源性O2水平,抑制HIF-1α的表达,进而降低FECH表达,从而限制PpIX在线粒体的流出并引发血红素短缺的负反馈效应,增加ALAS的表达,导致线粒体中PpIX的积累增加。本实施例所述MN-CCPCA可以通过CAT和5-ALA的精准递送增加肿瘤内PpIX和O2水平,同时提供实时的双模态PpIX荧光成像和光声血氧成像的指导,从而优化基于5-ALA的PDT参数,提高对三种不同(乳腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤)癌症的PDT疗效,并降低副作用。
步骤S1中,在一种实施方式中,所述白蛋白可以为人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)等蛋白。
在一种实施方式中,将白蛋白溶解至杜氏培养基中,加入CuCl2和CaCl2进行原位矿化,得到CCP纳米颗粒的步骤,具体包括:
将HSA溶解在无糖的杜氏培养基中,然后加入CuCl2溶液(溶剂为去离子水),在37℃下矿化24小时,随后加入CaCl2溶液(溶剂为去离子水),在37℃下继续矿化24小时,得到CCP纳米颗粒。带负电荷的HSA倾向于集中吸附Ca2+和Cu2+,造成离子局部过饱和并提供成核位点,从而诱导CCP NPs的原位矿化。
在一种实施方式中,所述CuCl2溶液浓度为0.1M,所述CaCl2溶液浓度为1M,所述CuCl2溶液与所述CaCl2溶液加入的体积相同。
步骤S2中,在一种实施方式中,所述分别通过一步碳二亚胺偶联法和静电吸附法将CAT和5-ALA负载至所述CCP纳米颗粒表面,得到CCPCA纳米颗粒的步骤,具体包括:
将所述CCP纳米颗粒分散于缓冲液(如PBS缓冲液,pH调至约7.4)中,得到CCP纳米颗粒溶液;
将EDC·HCl溶液(溶剂可以为二甲基亚砜)加入至所述CCP纳米颗粒溶液中,在室温和黑暗条件下搅拌第一预定时间(1~2小时)后,加入N-羟基丁二酰亚胺溶液(溶剂可以为二甲基亚砜)反应(时间可以为5~15分钟,如10分钟),随后加入CAT溶液(浓度约为0.2mg/mL,溶剂为去离子水),搅拌第二预定时间(时间可以为5~7小时,如6小时)后,得到CCPC纳米颗粒;
将所述CCPC纳米颗粒分散在5-ALA溶液(5-ALA分散于缓冲液中,该缓冲液可以为0.1mM PBS溶液,pH调节至约7.0)中,在室温和黑暗条件下搅拌第三预定时间(时间可以为1-3小时,如2小时)后,得到所述CCPCA纳米颗粒。
在一种实施方式中,所述CCPCA纳米颗粒中,CAT与CCP纳米颗粒的质量比为0~0.1,5-ALA与CCP纳米颗粒的质量比为0~0.1。
在一种实施方式中,所述CCPCA纳米颗粒中,CAT的载药量在0~7.9%,5-ALA的载药量在0~6.8%。
步骤S3中,使用两步微成型工艺将CCPCA纳米颗粒和微针基质溶液装载进微针模具中。在一种实施方式中,所述将CCPCA纳米颗粒和微针基质溶液装载进微针模具中,经真空干燥脱模后,得到增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的步骤,具体包括:
提供微针模具(所述微针模具的材质可以为PDMS);
将CCPCA纳米颗粒分散在水中,得到CCPCA纳米颗粒悬浮液;
将所述CCPCA纳米颗粒悬浮液加入所述微针模具中,进行真空干燥,将微针基质溶液注入到所述微针模具中,经真空干燥脱模后,得到增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片。
在一种实施方式中,所述微针基质溶液包括透明质酸钠(分子量可以为但不限于5kDa)和超活性透明质酸(分子量可以为但不限于100kDa),所述透明质酸钠和超活性透明质酸的重量比为1:(1~5)。
本发明实施例提供一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片(MN-CCPCA),其中,所述微针贴片包括:贴片和位于所述贴片上的多个阵列设置的微针;
所述贴片内装载有微针基质;
所述微针内装载有CCPCA纳米颗粒;其中,所述CCPCA纳米颗粒包括CCP纳米颗粒和负载于所述CCP纳米颗粒表面的CAT和5-ALA;
所述微针贴片采用本发明实施例所述的方法制备得到。
在一种实施方式中,所述微针基质包括透明质酸钠和超活性透明质酸,所述透明质酸钠和超活性透明质酸的重量比为1:(1~5)。
本实施例中,MN-CCPCA主要由5-氨基酮戊酸(5-ALA),过氧化氢酶(CAT),具有肿瘤酸降解的磷酸铜钙纳米颗粒,超活透明质酸和透明质酸纳构成,可通过调控PpIX相关合成酶,最大限度地在肿瘤部位富集PpIX。该MN-CCPCA可通过CAT催化内源性过氧化氢持续产氧,显著逆转肿瘤缺氧,并通过下调HIF-1α和FECH,释放“血红蛋白缺乏”的假信号,降低PpIX合成血红素的速率,同时上调ALAS,促进内源性和外源性5-ALA的合成,提高PpIX在肿瘤部位的蓄积。相比单纯微针递送5-ALA,通过微针透皮给药和纳米缓释系统的策略结合,分别延长PpIX在胶质母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌中的最大肿瘤滞留时间至12、12、24小时,最大富集时间点的荧光强度分别提高2.2、2.7、3.2倍。该MN-CCPCA可以通过荧光成像和光声成像监测体内肿瘤氧饱和度和PpIX实时代谢动力学,同时优化多种浅层实体瘤的治疗参数,实现可重复的基于5-ALA-PDT高效精准的PDT,具有极大的临床转化优势。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
下述实施例所用不同成分和功能的纳米粒子按如下步骤制得:
步骤1:将100mg HSA溶解在10mL不含葡萄糖的杜氏培养基中,然后加入100μLCuCl2溶液(浓度为0.1M,溶剂为去离子水)。将该系统密封并在37℃下矿化24小时。随后,将100μL CaCl2溶液(浓度为1M,溶剂为去离子水)添加到系统中,并在37℃下继续矿化24小时。之后,通过用离心(12000rpm,10分钟),分离收集得到CCP NPs。
步骤2:将2mg CCP NPs分散于2mL 0.1mM PBS缓冲液(pH调至7.4)中,得到CCP NPs溶液,将2mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)直接溶于100μLDMSO中,加入到上述CCP NPs溶液中。在室温和黑暗条件下搅拌激活1小时后,将2mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于100μL DMSO中,加入搅拌激活后的反应液中。然后加入0.2mg/mL CAT搅拌6小时,所得产物经12000rpm离心10分钟,分离收集得到CCPC NPs。
步骤3:随后将2mg CCPC NPs分散在2mL的0.1mg/mL 5-ALA溶液(0.1mM PBS溶液,pH调节至7.0)中,然后在室温和黑暗条件下搅拌2小时。随后通过离心(12000rpm,10分钟),分离和收集得到CCPCA NPs。
同时,在其它相同的条件下,只采取步骤1,3,得到CCPA NPs。
下述实施例所用MN-CCP,MN-CCPC,MN-CCPA,MN-CCPCA按如下步骤制得:
分别将对应的不同纳米颗粒(即CCP NPs、CCPC NPs、CCPA NPs、CCPCA NPs)分散在600μL去离子水中,得到纳米颗粒悬浮液。取100μL纳米颗粒悬浮液(10mg mL-1)加入到每个PDMS微针模具内,然后置于真空干燥箱中,连续抽真空5次(每次3分钟)后,将800μL的微针基质溶液(包括透明质酸钠和超活性透明质酸,超活性透明质酸浓度为180mg/mL,所述透明质酸钠和超活性透明质酸的重量比为1:5)注入到每个PDMS微针模具内,37℃下干燥13小时脱模,最后在室温下避光储存在干燥器中。
实施例1:一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的制备
将100mg HSA溶解在10mL不含葡萄糖的杜氏培养基中,然后加入100μL CuCl2溶液(浓度为0.1M,溶剂为去离子水)。将该系统密封并在37℃下矿化24小时。随后,将100μLCaCl2溶液(浓度为1M,溶剂为去离子水)添加到系统中,并在37℃下继续矿化24小时。之后,通过离心(12000rpm,10分钟)分离得到CCP NPs。
取2mg CCP NPs分散于2mL 0.1mM磷酸盐缓冲液(PBS,pH调至7.4)中,得到CCP NPs溶液,将2mg EDC·HCl直接溶于100μL DMSO中,加入到上述CCP NPs溶液中。在室温和黑暗条件下搅拌激活1小时后,将2mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于100μL DMSO中后,加入搅拌激活后的反应液中反应10分钟。然后加入CAT溶液(浓度为0.2mg/mL,溶剂为去离子水)搅拌6小时,所得产物经12000rpm离心10分钟,分离收集得到CCPC NPs。
将2mg CCPC NPs分散在2mL的0.1mg/mL 5-ALA溶液(0.1mM PBS溶液,pH调节至7.0)中,然后在室温和黑暗条件下搅拌2小时。随后,通过离心(12000rpm,10分钟)分离和收集得到CCPCA NPs。
将CCPCA NPs分散在600μL去离子水中,得到CCPCA NPs悬浮液。取100μL的CCPCANPs悬浮液(10mg mL-1)沉积在每个PDMS微针模具的表面上。将该装置置于真空干燥箱中,连续抽真空5次(每次3分钟)后,将800μL的微针基质溶液(包括透明质酸钠和超活性透明质酸,超活性透明质酸浓度为180mg/mL,所述透明质酸钠和超活性透明质酸的重量比为1:5)注入到每个PDMS微针模具内,37℃下干燥13小时后脱模,最后在室温下避光储存在干燥器中。
图1为本实施例1中一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的应用示意图。具体应用步骤如下:将制备好的微针贴片压在小鼠肿瘤处,应用10分钟后移除微针贴片,利用IVIS荧光成像光谱系统和Vevo LAZR-X光声成像实时监测肿瘤部位PpIX的荧光强度和血氧饱和度(sO2)。并根据前述两种参数进行可重复的激光照射,记录肿瘤体积变化(每两天进行一次记录)。
结合图1所示,CAT在体内通过催化内源性过氧化氢持续产氧,显著逆转肿瘤缺氧,并通过下调HIF-1α和FECH,释放“血红蛋白缺乏”的假信号,降低PpIX合成血红素的速率,同时上调ALAS,促进内源性和外源性5-ALA的合成,进一步提高PpIX在肿瘤部位的积累。这种MN-CCPCA可以通过PpIX荧光/光声成像监测体内PpIX实时代谢动力学和肿瘤氧饱和度,同时优化多种浅层实体瘤(乳腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤)的治疗参数,实现基于5-ALA-PDT的可重复的高效精准的PDT。
图2中a和b分别为所述CCPCA NPs的透射电镜图和MN-CCPCA的扫描电镜图。从图可以看出CCPCA NPs具有良好的分散性,MN-CCPCA的微针阵列排列均匀。从图3对比CCPCA NPs装载微针前后的高分辨扫描电镜图可以看出,微针表面由光滑变为凹凸不平状。
接着研究了CCPCA NPs的一些基本性质,图4为CCPCA NPs中5-ALA的包封率和载药量。5-ALA与CCP的质量比为0~0.1区间时,5-ALA的载药量在0~6.8%,随着5-ALA投药比的增大,其载药量相应增大。图5为CCPA和CCPCA NPs的热失重曲线,表明CAT与CCP的质量比为0~0.1区间时,CAT的载药量在0~7.9%,随着CAT投药比的增大,其载药量相应增大。
接着对CCPCA NPs中CAT催化H2O2产生O2能力进行验证,图6为在1mM H2O2条件下,不同浓度CCPCA NPs催化H2O2产生溶解氧随时间的变化情况;图7为CCPCA NPs中CAT与体外等量CAT催化10mM H2O2的动力学对比图,证明CCPCA NPs中CAT的活性与等量的游离CAT相当。
接着对CCPCA NPs的酸响应降解能力进行了验证,图8中a、b为得到的CCPCA NPs在中性(pH=7.4)和弱酸性(pH=6.0)降解释放Ca2+和Cu2+的量化曲线。将1mL CCPCA NPs溶液(浓度为1mg/mL,溶剂为去离子水)放置于透析袋,并浸入pH值分别为6.0、7.4的9mL磷酸盐缓冲液中,每隔一段时间取1mL溶液用于检测,并同时向该缓冲液中补充1mL对应pH值的磷酸盐缓冲液。如图8所示,CCPCA NPs在pH 6.0条件下表现出更好的Ca2+和Cu2+释放效果,显示出极好的酸响应降解性能。
接着研究了MN-CCPCA的透皮递送能力。图9为MN-CCPCA的力学性能测试图,表明可提供0.39牛顿/针的透皮穿透能力。图10为MN-CCPCA贴片在(a)小鼠表皮和(b)大鼠表皮穿透角质层的苏木精伊红染色图,提示MN-CCPCA可以直接穿透小鼠和大鼠的角质层,透皮递送CAT和5-ALA。
然后研究了MN-CCPCA在细胞和活体肿瘤中蓄积PpIX的生物效应。图11为不同组在A375肿瘤细胞产生PpIX的质量对比数据,在给与相同浓度5-ALA(10.8μg mL-1)的条件下,所述CCPCA组细胞内PpIX含量(141.4±1.7ng/106个细胞)分别为不负载CAT的CCPA(72.4±7.7ng/106个细胞)和游离5-ALA组(35.1±3.3ng/106个细胞)的1.9倍和4.0倍。
然后通过高内涵荧光显微镜实时监测了活体细胞生成PpIX的动态荧光值,如图12所示,5-ALA组和CCPA组的PpIX浓度分别在孵卵后6和10小时达到最大值,然后随着时间的推移逐渐降低。CCPCA组在24小时PpIX强度最大,表明基于纳米载体的设计使MN-CCPCA中5-ALA的暴露时间延长,PpIX在细胞内滞留时间也随之延长。
图13为CCPCA组调控PpIX相关合成酶表达的蛋白免疫印迹表达情况,MN-CCPCA可通过逆转肿瘤乏氧,调控PpIX相关的合成酶,规避PpIX的负反应调控过程,其分子机制是CAT催化细胞内源性过氧化氢持续升高O2水平,抑制HIF-1α的表达,进而降低FECH表达,从而限制PpIX在线粒体的流出并引发血红素短缺的负反馈效应,增加ALAS的表达,导致细胞中PpIX的积累增加。
图14为本实施例1一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片在小鼠A375皮下瘤模型治疗中,使用IVIS光谱系统追踪得出的基于不同纳米载体设计的微针在肿瘤内不同时间点PpIX累积的荧光量化值。所述MN-CCPCA在A375皮下瘤模型中的PpIX最大荧光强度为不负载CAT的MN-CCPA组的2.2倍,证明同时递送CAT和5-ALA可显著延长PpIX的合成效率和滞瘤时间。
图15为本实施例1一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片在小鼠A375皮下瘤模型治疗中,使用光声系统追踪的给药不同时间血氧饱和度(sO2)累积的量化值。所述MN-CCPCA与空白微针对照组相比,在24小时内,MN-CCPCA使肿瘤中sO2水平提高了2.3倍。即便在24小时进行激光照射消耗氧气后,MN-CCPCA组在48小时sO2水平仍是对照组的1.68倍,
图16为本实施例1一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片在小鼠A375皮下瘤模型治疗中,利用3次重复的PDT得到的肿瘤体积抑制对比曲线和肿瘤大小的对比照片。其具体表征方式为:将30只肿瘤为70mm3的A375模型肿瘤小鼠平均分为6个实验组,即空白微针组、不载CAT和5-ALA的MN-CCP组、载CAT的MN-CCPC组、同时载CAT和5-ALA的MN-CCPCA组、未载CAT并照射激光的MN-CCPA(+)组,同时载CAT和5-ALA并照射激光的的MN-CCPCA(+)组。给药剂量为50mg/kg CCPCA NPs,3.4mg/kg 5-ALA(每枚微针贴片)。对激光治疗组的小鼠用波长635nm的激光分别在6,12,24h照射10分钟(200mW/cm2)。用游标卡尺量取在不同天数(0,2,4,6,8,10,12,14)各组中老鼠肿瘤的体积。如图15所示,从肿瘤体积变化可以看出,MN-CCPCA(+)组小鼠肿瘤体积明显减小,表现出良好的PDT疗效,证明同时提高肿瘤内PpIX和O2水平可极大地增加PDT效率。
图17为本实施例1一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片在小鼠U87皮下瘤模型治疗中,使用IVIS光谱系统追踪得出的不同给药方式在肿瘤内不同时间点PpIX累积的荧光量化。所述MN-CCPCA在皮下U87脑胶质瘤内PpIX最大荧光强度分别为尾静脉注射5-ALA组和微针递送5-ALA组的5.3倍和2.7倍。
图18为本实施例1一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片在小鼠U87皮下瘤模型治疗中,通过改进5-ALA递送方法,利用3次重复的PDT得到的肿瘤体积抑制对比曲线和肿瘤大小的对比照片。其具体表征方式为:将20只肿瘤为100mm3的U87模型肿瘤小鼠平均分为4个实验组,即空白微针并照射激光的MN(+)组、尾静脉注射5-ALA并照射激光的5-ALA i.v(+)组、微针递送5-ALA并照射激光的MN-5-ALA(+)组、使用纳米诊疗设计的微针系统并照射激光的MN-CCPCA(+)组。给药剂量为50mg/kg CCPCA NPs,3.4mg/kg 5-ALA。对激光治疗组的小鼠用波长635nm的激光分别在6、12、24小时照射10分钟(200mW/cm2)。用游标卡尺量取在不同天数(0,2,4,6,8,10,12,14)各组中老鼠肿瘤的体积。如图15所示,从肿瘤体积变化可以计算出,5-ALA i.v(+)组、MN-5-ALA(+)组和MN-CCPCA(+)组的肿瘤生长抑制率分别为19.1%、79.7%和95.2%,MN-CCPCA(+)组小鼠肿瘤体积明显减小,表现出良好的PDT疗效,表明改进5-ALA递送策略可极大地增加PDT效率。
图19为本实施例1一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片在小鼠4T1乳腺癌皮下肿瘤皮下瘤模型治疗中,使用IVIS光谱系统追踪得出的不同给药方式在肿瘤内不同时间点PpIX累积的荧光量化。所述MN-CCPCA在皮下4T1乳腺癌皮下肿瘤内PpIX最大荧光强度分别为尾静脉注射5-ALA组和微针递送5-ALA组的4.3倍和3.2倍。
图20为本实施例1一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片在小鼠4T1乳腺癌皮下瘤模型治疗中,通过改进5-ALA递送方法,利用PDT的得到肿瘤体积抑制对比曲线和肿瘤大小的对比照片。其具体表征方式为:将20只肿瘤为100mm3的4T1模型肿瘤小鼠平均分为4个实验组,即空白微针并照射激光的MN(+)组、尾静脉注射5-ALA并照射激光的5-ALA i.v(+)组、微针递送5-ALA并照射激光的MN-5-ALA(+)组、使用纳米诊疗设计的微针系统并照射激光的MN-CCPCA(+)组。对激光治疗组的小鼠用波长635nm的激光分别在、12、24、36小时照射10分钟(200mW/cm2)。给药剂量为50mg/kg CCPCA NPs,3.4mg/kg 5-ALA。用游标卡尺量取在不同天数(0,2,4,6,8,10,12,14)各组中老鼠肿瘤的体积。如图20所示,从肿瘤体积变化可以计算出,5-ALA i.v(+)组、MN-5-ALA(+)组和MN-CCPCA(+)组的肿瘤生长抑制率分别为27.5%、51.1%和92.3%,MN-CCPCA(+)组小鼠肿瘤体积明显减小,表现出良好的PDT疗效,表明改进5-ALA递送策略可极大地增加PDT效率。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
将白蛋白溶解至杜氏培养基中,加入CuCl2和CaCl2进行原位矿化,得到CCP纳米颗粒;
分别通过一步碳二亚胺偶联法和静电吸附法将CAT和5-ALA负载至所述CCP纳米颗粒表面,得到CCPCA纳米颗粒;
将CCPCA纳米颗粒和微针基质溶液装载进微针模具中,经真空干燥脱模后,得到增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片。
2.根据权利要求1所述的增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的制备方法,其特征在于,所述将白蛋白溶解至杜氏培养基中,加入CuCl2和CaCl2进行原位矿化,得到CCP纳米颗粒的步骤,具体包括:
将白蛋白溶解在杜氏培养基中,然后加入CuCl2溶液,在37℃下矿化24小时,随后加入CaCl2溶液,在37℃下继续矿化24小时,得到CCP纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的制备方法,其特征在于,所述白蛋白为人血清白蛋白或牛血清白蛋白;所述CuCl2溶液浓度为0.1M,所述CaCl2溶液浓度为1M,所述CuCl2溶液与所述CaCl2溶液加入的体积相同。
4.根据权利要求1所述的增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的制备方法,其特征在于,所述分别通过一步碳二亚胺偶联法和静电吸附法将CAT和5-ALA负载至所述CCP纳米颗粒表面,得到CCPCA纳米颗粒的步骤,具体包括:
将所述CCP纳米颗粒分散于缓冲液中,得到CCP纳米颗粒溶液;
将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液加入至所述CCP纳米颗粒溶液中,在室温和黑暗条件下搅拌第一预定时间后,加入N-羟基丁二酰亚胺溶液,进行反应;
向所述反应后体系中加入CAT,搅拌第二预定时间后,得到CCPC纳米颗粒;
将所述CCPC纳米颗粒分散在5-ALA溶液中,在室温和黑暗条件下搅拌第三预定时间后,得到所述CCPCA纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述的增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的制备方法,其特征在于,所述CCPCA纳米颗粒中,CAT与CCP纳米颗粒的质量比为0~0.1,5-ALA与CCP纳米颗粒的质量比为0~0.1。
6.根据权利要求1所述的增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的制备方法,其特征在于,所述CCPCA纳米颗粒中,CAT的载药量在0~7.9%,5-ALA的载药量在0~6.8%。
7.根据权利要求1所述的增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的制备方法,其特征在于,所述将CCPCA纳米颗粒和微针基质溶液装载进微针模具中,经真空干燥脱模后,得到增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的步骤,具体包括:
提供微针模具;
将CCPCA纳米颗粒分散在水中,得到CCPCA纳米颗粒悬浮液;
将所述CCPCA纳米颗粒悬浮液加入所述微针模具中,进行真空干燥,将微针基质溶液注入到所述微针模具中,经真空干燥脱模后,得到增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片。
8.根据权利要求1所述的增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片的制备方法,其特征在于,所述微针基质溶液包括透明质酸钠和超活性透明质酸,所述透明质酸钠和超活性透明质酸的重量比为1:(1-5)。
9.一种增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片,其特征在于,所述微针贴片包括:贴片和位于所述贴片上的多个阵列设置的微针;
所述贴片内装载有微针基质;
所述微针内装载有CCPCA纳米颗粒;其中,所述CCPCA纳米颗粒包括CCP纳米颗粒和负载于所述CCP纳米颗粒表面的CAT和5-ALA;
所述微针贴片采用权利要求1~8任一项所述的方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的增强实体瘤内PpIX蓄积的微针贴片,其特征在于,所述微针基质包括透明质酸钠和超活性透明质酸,所述透明质酸钠和超活性透明质酸的重量比为1:(1-5)。
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