CN111888471A - 一种硫化铜光热响应局部释放体系及其应用 - Google Patents

一种硫化铜光热响应局部释放体系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种硫化铜光热响应局部释放体系及其应用，属于医药技术领域。该释放体系为包载有硫化铜的红细胞，通过采用低渗‑重封闭法进行红细胞包载CuS，获得载药红细胞，然后将RGD修饰在载药红细胞表面，完成红细胞表面的修饰，使其具有靶向肿瘤部位的功能。本发明的释放体系制成的肿瘤治疗药物，能够主动靶向到肿瘤，并对980 nm激光响应，实现硫化铜快速释放，同时实现在肿瘤部位聚集，进一步提高硫化铜的光热治疗效果。

Description

一种硫化铜光热响应局部释放体系及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种硫化铜光热响应局部释放体系及其应用。
背景技术
光热疗法是利用具有较高光热转换效率的材料，将其注射入人体内部，并对激光响应，形成光热转化，提高肿瘤部位温度，并将肿瘤杀死的一种治疗肿瘤的新方法，具有很大的发展潜力。该方法可以减少患者所经受的疼痛，治疗时间短(大约几分钟)，治疗效果明显。
硫化铜(CuS)是一种光热转换材料，其结构具有增强光吸收能力的特性，可以大幅的提高激光的吸收效率，进而使光热转换能力得到很大的提高，具有成本低、毒性低、高热转换率的特点，在癌症治疗方面有重要的研究意义和广阔的应用前景。为了进一步提高肿瘤的光热治疗效果，虽然提高硫化铜的给药浓度是一个有效的途径，但也带来了副作用增加的风险。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种硫化铜光热响应局部释放体系及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种硫化铜光热响应局部释放体系，该释放体系为包载有硫化铜的红细胞；在红细胞表面修饰有RGD。
上述体系的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，采用低渗-重封闭法进行红细胞包载CuS，获得载药红细胞；
步骤2，将RGD修饰在载药红细胞表面，即得。
进一步地，步骤1中采用低渗-重封闭法进行红细胞包载CuS的具体过程如下：
a.纳米硫化铜的制备：以巯基乙酸为表面模板，氯化铜和硫代乙酰胺为反应物，在50℃的条件下保温2小时，合成硫化铜纳米粒子；
b.低渗：将红细胞重悬于硫化铜溶液中，红细胞与硫化铜溶液按1：1等比例混合，然后置于透析袋中，并置于低渗缓冲液中，4℃条件下放置24小时；
c.高渗：将透析袋从低渗溶液中转移到重密封高渗缓冲溶液中，在37℃下放置30分钟；
d.等渗：在PBS缓冲液中洗涤两次以除去未包封的硫化铜，最终获得包载有硫化铜的红细胞。
进一步地，步骤b中硫化铜溶液中硫化铜的浓度为5mg/mL，pH为7.4；步骤b中红细胞与低渗缓冲液的体积比为1：50，低渗缓冲液的组成为：15mM NaH2PO4·2H2O、15mMNaHCO3、2mM ATP、3mM还原型谷胱甘肽、20mM葡萄糖、5mM NaCl，72mOsm/Kg；步骤c中重封闭高渗缓冲溶液的组成为：250mM NaCl、12.5mM葡萄糖、12.5mM丙酮酸钠、12.5mM肌苷、12.5mMNaH2PO4·2H2O、0.63mM腺嘌呤、550mOsm/Kg。
进一步地，步骤2中将RGD修饰在载药红细胞表面的具体过程如下：
a.制备DSPE-PEG-biotin：将35mg DSPE-PEG-NH2和7mg NHS-biotin于5mL甲醇中反应2小时，然后用氮气吹干，再在去离子水中用3500D MWCO的透析袋透析，然后冷冻干燥；
b.将500μL红细胞重悬于4mL PBS中，并与0.5mg DSPE-PEG-biotin搅拌30分钟。将获得的红细胞-生物素RBC–biotin洗涤两次，重悬于4mL PBS中，连续搅拌加入1mg抗生物素蛋白溶液avidin，4℃反应60分钟，然后将RBC–biotin–avidin洗涤2次除去未结合的avidin；
c.制备生物素化的RGD：RGD和sulfo-NHS-LC-biotin混合反应；
d.将RBC–biotin–avidin和生物素化的RGD混合60分钟，PBS洗涤2次，4℃保存，即完成红细胞表面的修饰。
上述硫化铜光热响应局部释放体系在制备肿瘤治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.CuS激光响应靶向释放：通过980nm激光照射肿瘤组织部位，红细胞破裂，CuS释放，激光照射CuS释放是研究成功的关键。将CuS的释放与980nm激光照射相关联，实现CuS释放使得肿瘤组织局部位置高热，实现光热治疗的结合。
2.提高生物相容性：红细胞具有良好的生物相容性，异于其他化学合成载体对动物体的危害，CuS被包载后，显著提高其生物相容性。
3.本发明通过运用980nm激光照射使得红细胞破裂，CuS释放，肿瘤局部高热，造成肿瘤细胞死亡，提高了光热治疗效果，有效抑制肿瘤生长。
4.光热疗法减少患者所经受的疼痛，治疗时间短(大约几分钟)，治疗效果明显，材料无毒无害，对人体副作用小。
5.本发明的前期动物模拟实验研究结果，为CuS激光响应释放的光热治疗方法早日进入临床提供基础，也为更好抑制肿瘤生长等问题提供了一个新思路。
附图说明
图1中A为CuS@ER在体外980nm激光照射后CuS释放示意图；B为CuS@ER在体内980nm激光照射后CuS释放示意图。
图2为CuS@ER的表征及细胞毒性分析结果。其中：A为纳米CuS的TEM表征图；B为CuS@ER的SEM表征图；C为CuS@ER的紫外吸收分光光谱图；D为CuS@ER在不同浓度下的细胞毒性研究；
图3为CuS@ER在980nm激光照射后的考察结果。其中：A为激光照射时间对温度的影响；B为重复循环激光照射与CuS光热转化效率；C为激光照射前后的细胞形态；D为1分钟内CuS释放浓度变化。
图4为CuS@ER的活体成像及荧光强度分析结果。其中：A为尾静脉注射荧光标记的CuS@ER药物，激光照射后的小动物活体成像图；B为激光照射不同时间下对图(A)的肿瘤部位荧光强度分析；C为激光照射后肿瘤内Cu2+浓度与时间的关系；
图5为荷瘤小鼠肿瘤部位温度研究及肿瘤H&E染色分析。其中：A为激光(Laser)照射2分钟后荷瘤小鼠肿瘤部位温度监测图；B为不同激光照射时间对荷瘤小鼠肿瘤部位温度的影响；C为4组(PBS、Laser、CuS+Laser、CuS@ER+Laser)的肿瘤H&E病理染色图；
图6为小鼠尾静脉注射CuS@ER并激光照射后治疗28天的效果。其中：A为给药并激光照射治疗后28天时间内肿瘤体积大小的变化图；B为各组肿瘤消失情况；C为45天内荷瘤小鼠存活情况；D为给药并激光照射治疗28天时间，荷瘤小鼠体重的变化图。
图7为小鼠尾静脉注射CuS@ER并激光照射后治疗45天的效果。其中：A为治疗并观察45天后各组心肝脾肺肾组织的H&E病理染色图；B为荷瘤小鼠各项血液指标；C为荷瘤小鼠各项生化指标。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本发明提供了一种硫化铜光热响应局部释放体系(CuS@ER)，该释放体系为包载有纳米硫化铜的红细胞，在红细胞表面修饰有生物素化的RGD。
首先采动物全血红细胞，经低渗-重封闭方法包封浓度为5mg/mL的CuS，形成载药红细胞(CuS@ER)。具体过程如下：
a.纳米CuS制备：以巯基乙酸作为表面模板，氯化铜和硫代乙酰胺为反应物，在50℃的条件下保温2小时，合成硫化铜纳米粒子；
b.低渗：将红细胞重悬于CuS溶液中，红细胞与CuS溶液按1：1等比例混合，而后置于透析袋中，并置于低渗缓冲液中，4℃条件下放置24小时；
c.高渗：将透析袋从低渗溶液中转移到重密封高渗缓冲溶液中，在37℃下放置30分钟；
d.等渗：在PBS缓冲液中洗涤两次以除去未包封的CuS，最终获得包载有CuS的红细胞(CuS@ER)。
所述步骤b中CuS溶液的浓度为5mg/mL，pH为7.4；所述步骤b中红细胞与低渗缓冲液的体积比为1：50，透析时间为24小时；所述低渗缓冲液采用15mM NaH2PO4·2H2O，15mMNaHCO3，2mM ATP，3mM还原型谷胱甘肽，20mM葡萄糖，5mM NaCl，72mOsm/Kg；所述步骤c中重封闭高渗缓冲溶液采用250mM NaCl，12.5mM葡萄糖，12.5mM丙酮酸钠，12.5mM肌苷，12.5mMNaH2PO4·2H2O，0.63mM腺嘌呤，550mOsm/Kg；所述步骤d中等渗缓冲溶液为PBS磷酸缓冲溶液。
然后在红细胞表面修饰有生物素化的RGD。具体过程如下：
a.制备DSPE-PEG-biotin：将35mg DSPE-PEG-NH2和7mg NHS-biotin于5mL甲醇中反应2小时，然后用氮气吹干，再在去离子水中用3500D MWCO的透析袋透析，然后冷冻干燥；
b.将500μL红细胞重悬于4mL PBS中，并与0.5mg DSPE-PEG-biotin搅拌30分钟。将获得的红细胞-生物素(RBC–biotin)洗涤两次，重悬于4mL PBS中，连续搅拌加入1mg抗生物素蛋白溶液(avidin)，4℃反应60分钟，然后将RBC–biotin–avidin洗涤2次除去未结合的avidin；
c.制备生物素化的RGD(RGD为一种肿瘤新生血管靶向的肽)：RGD和sulfo-NHS-LC-biotin混合反应；
d.将RBC–biotin–avidin和生物素化的RGD混合60分钟，PBS洗涤2次，4℃保存。即完成红细胞表面的修饰，使其具有靶向肿瘤部位的功能。
将上述硫化铜光热响应局部释放体系(CuS@ER)，经静脉注射入体内，通过980nm激光照射肿瘤部位，靶向于肿瘤部位的CuS@ER受到响应，红细胞破裂，CuS释放，从而发挥治疗效果。所述激光照射时间为0-6分钟，选用激光照射波长为980nm，直接照射于肿瘤位置。
图1为体内外980nm激光照射后CuS释放过程。如图A所示，首先采动物全血红细胞，经低渗-重封闭方法包封浓度为5mg/mL的CuS，形成载药红细胞(CuS@ER)，在980nm激光照射条件下，CuS自CuS@ER中释放。如图B所示，CuS@ER通过尾静脉注射进入小鼠体内，靶向抵达肿瘤部位，980nm激光照射荷瘤小鼠肿瘤位置，产生激光响应性，红细胞孔道打开，CuS释放，造成局部肿瘤位置高热，灼伤肿瘤细胞，从而达到光热治疗肿瘤效果。
将得到的红细胞包载硫化铜(CuS@ER)进行表征及细胞毒性分析，结果如图2所示。图2中，A为纳米CuS的透射电镜图(TEM)、B为CuS@ER的扫描电镜图(SEM)、C为CuS@ER的紫外分光光谱图，均可以看出CuS被成功包载于ER中；D为CuS及CuS@ER在浓度分别为5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL时的细胞毒性分析，可以看出CuS溶液浓度越高对细胞的毒性越大，而CuS经红细胞包载形成CuS@ER后，浓度的增加对细胞毒性研究结果几乎无影响，表明CuS@ER无细胞毒性。
考察红细胞包载硫化铜(CuS@ER)在980nm激光照射后，其温度、释放率、细胞形态、释放浓度的影响，结果如图3所示。图3中，A为激光照射6分钟测量荷瘤小鼠肿瘤部位温度变化情况，结果表明，前2分钟CuS@ER组温度上升速度较快，2分钟后温度趋于稳定几乎不再上升，证明激光2分钟为较优时间；B为激光照射1次2分钟后CuS的光热效率可达65％，且可循环控制；C为激光照射前后细胞形态变化图，从图中可以看出照射前细胞形态完好，照射后细胞出现死亡，细胞皱缩失去原有的形态，表明激光照射会引起红细胞的破裂，释放CuS；D为1分钟内CuS的释放浓度变化，可以看出，30秒时间内释放速率较快，呈持续快速释放状态，30秒后浓度几乎不增加，趋于稳定状态。
实施例2
体内释药机制研究
1.活体成像及荧光强度分析研究
如图4所示，A为尾静脉分别注射单纯CuS药物及CuS@ER混合药物后，980nm激光照射2分钟，进行活体成像分析，从图中可以直观看出，CuS@ER组的荧光强度显著强于单纯CuS组，表明以红细胞为载体的CuS@ER比单纯CuS药物对激光有更好的响应；B为对不同时间条件下对小动物活体成像的荧光强度分析，可以看出CuS@ER组的荧光强度明显高于CuS组，且激光照射2分钟为较优时间选择，2分钟后荧光强度趋于稳定，表明2分钟后CuS释放率下降；C为给药及激光照射治疗结束后的30分钟时间内肿瘤内Cu2+变化情况，可以看出，注射CuS@ER的小鼠体内的Cu2+远远大于注射单纯CuS药物的，表明通过红细胞对CuS包载后，CuS可以更好靶向于肿瘤部位且进行缓慢释放。
2.荷瘤小鼠肿瘤部位温度研究及肿瘤H&E染色分析
如图5所示，A为激光照射2分钟后荷瘤小鼠温度监测分析结果；B为激光照射持续时间对肿瘤部位温度的影响，激光照射时间越长温度越高，但激光照射2分钟后，温度上升趋势不显著，温度趋于稳定；C为各组H&E染色结果，观察到CuS@ER+Laser组中细胞的凋亡显著多于对照组及Laser组、CuS+Laser组，表明能够有效遏制肿瘤细胞的生长。
3.动物实验
在小鼠尾静脉注射CuS@ER溶液后，经980nm激光照射2分钟，红细胞破裂孔道打开，CuS释放，每3天给药并激光照射1次，连续治疗5次。
如图6所示，A、B、D分别为经过28天治疗和观察，CuS@ER+Laser组肿瘤生长情况较对照组明显得到抑制，表明能够有效遏制肿瘤的生长；C为连续观察小鼠45天的生存情况，在45天时CuS@ER+Laser组存活率达到90％，对照组及单纯放疗组小鼠均未存活。
4.器官、血液、生化指标分析
经过45天治疗观察后，取出小鼠心肝脾肺肾器官组织，进行H&E病理染色分析。
如图7所示，图A显示几种组织的细胞形态和结构仍保持完整，B为血液指标分析，C为生化指标分析，其结果均证明CuS@ER联合激光疗法没有潜在毒性，可用于体内生物学研究。

Claims (7)

1.一种硫化铜光热响应局部释放体系，其特征在于：该释放体系为包载有硫化铜的红细胞；在红细胞表面修饰有RGD。
2.权利要求1所述释放体系的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，采用低渗-重封闭法进行红细胞包载CuS，获得载药红细胞；
步骤2，将RGD修饰在载药红细胞表面，即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1中采用低渗-重封闭法进行红细胞包载CuS的具体过程如下：
a. 纳米硫化铜的制备：以巯基乙酸为表面模板，氯化铜和硫代乙酰胺为反应物，在50℃的条件下保温2小时，合成硫化铜纳米粒子；
b. 低渗：将红细胞重悬于硫化铜溶液中，红细胞与硫化铜溶液按1：1等比例混合，然后置于透析袋中，并置于低渗缓冲液中，4℃条件下放置24小时；
c. 高渗：将透析袋从低渗溶液中转移到重密封高渗缓冲溶液中，在37℃下放置30分钟；
d. 等渗：在PBS缓冲液中洗涤两次以除去未包封的硫化铜，最终获得包载有硫化铜的红细胞。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤b中硫化铜溶液中硫化铜的浓度为5 mg/mL，pH为7.4；步骤b中红细胞与低渗缓冲液的体积比为1：50，低渗缓冲液的组成为：15mM NaH2PO4·2H2O、15mM NaHCO3、2mM ATP、3mM还原型谷胱甘肽、20mM葡萄糖、5mM NaCl，72mOsm / Kg；步骤c中重封闭高渗缓冲溶液的组成为：250mM NaCl、12.5mM葡萄糖、12.5mM丙酮酸钠、12.5mM肌苷、12.5mM NaH2PO4·2H2O、0.63mM腺嘌呤、550mOsm / Kg。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2中将RGD修饰在载药红细胞表面的具体过程如下：
a. 制备DSPE-PEG-biotin：将35mg DSPE-PEG-NH2和7mg NHS-biotin于5mL甲醇中反应2小时，然后用氮气吹干，再在去离子水中用3500 D MWCO的透析袋透析，然后冷冻干燥；
b. 将500μL红细胞重悬于4mL PBS中，并与0.5mg DSPE-PEG-biotin搅拌30分钟。
6.将获得的红细胞-生物素RBC–biotin洗涤两次，重悬于4mL PBS中，连续搅拌加入1mg抗生物素蛋白溶液avidin，4℃反应60分钟，然后将RBC–biotin–avidin洗涤2次除去未结合的avidin；
c. 制备生物素化的RGD：RGD和sulfo-NHS-LC-biotin混合反应；
d. 将RBC–biotin–avidin和生物素化的RGD混合60分钟，PBS洗涤2次，4℃保存，即完成红细胞表面的修饰。
7.权利要求1所述的硫化铜光热响应局部释放体系在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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