CN114344473A - 一种抗肿瘤药递送系统及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于制药技术领域，公开了一种抗肿瘤药递送系统及其制备方法和用途。所述的抗肿瘤药递送系统包括细胞、抗肿瘤药和氧化铝，所述的抗肿瘤药包载于所述的细胞内部，所述的细胞表面吸附有所述的纳米氧化铝。本发明的递送系统生物相容性好、安全性高，具有更高的载药量和包封率，进入体内后能实现药物的缓慢释放，此外，还能持久刺激树突状细胞的成熟，增加机体的免疫功能，从而提高抗肿瘤的效果。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种抗肿瘤药递送系统及其制备方法和用途。
背景技术
传统的癌症治疗方法是化学药物疗法，其中盐酸伊立替康是一种水溶性的喜树碱衍生物，在体内，可经羧酸酯酶被代谢活化为7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，通过抑制拓扑异构酶I的活性实现细胞毒作用，对于结肠癌、宫颈癌、肝癌等细胞内存在丰富的拓扑异构酶I的癌症疾病具有确切的疗效。然而，盐酸伊立替康的内酯环结构在生理环境下易转变为无药理活性且毒性较大的羧酸盐形式。此外，国内上市产品盐酸伊立替康注射剂亦存在食欲缺乏、恶心、呕吐、腹泻等不良反应，大大限制了该药在临床上的使用。
目前，关于盐酸伊立替康新型给药系统的研究和开发主要集中在脂质体、纳米粒及纳米胶束等剂型，但在应用过程中存在使用外源性材料作为载体导致的生物相容性较差以及载体材料后期降解等问题，故选择合适的载体材料，并利用制剂手段制备合适的递送系统，对于发挥药物临床疗效，降低毒副作用就显得尤为必要。
新兴的癌症治疗方法有肿瘤免疫疗法，目前正逐渐被应用于临床治疗中。其中佐剂在指导和增强抗原的免疫反应中起着极其重要的作用，可以诱导抗原递呈细胞激活和成熟，从而提高人体的保护能力。纳米氧化铝由于颗粒尺寸小，佐剂活性更强，常与抗原结合作为疫苗使用。然而一般疫苗通过皮下接种，但若不能被有效摄取，免疫效力仍然很弱，可见，为提高免疫应答，还迫切需要适宜的传递系统。
目前在盐酸伊立替康治疗过程中联合免疫治疗方法的相关报道主要集中在联合单抗及免疫调节剂，且多采用注射液剂型，存在制备成本较高，且仍然无法避免盐酸伊立替康的毒副作用等问题。
因此，开发一种适宜的药物递送系统，在化学治疗的基础上联合免疫治疗，对于通过提高机体的免疫应答能力以增强化疗药物的抗肿瘤临床疗效是具有重要意义的。
发明内容
鉴于以上现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种抗肿瘤药递送系统及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过以下技术方案获得的。
本发明的目的之一在于提供一种抗肿瘤药递送系统，所述的系统包括细胞、抗肿瘤药和氧化铝，所述的抗肿瘤药包载于所述的细胞内部，所述的细胞表面吸附有所述的纳米氧化铝。
优选地，所述的细胞选自红细胞、血小板、巨噬细胞和单核细胞中的一种或多种。
更优选地，所述的细胞为红细胞。
优选地，所述的抗肿瘤药选自伊立替康、阿霉素、多柔比星和吉他西滨中的一种或多种。
更优选地，所述的抗肿瘤药为伊立替康。进一步优选地，所述的抗肿瘤药为盐酸伊立替康。
优选地，所述的氧化铝的粒径为50nm～400nm。
更选地，所述的氧化铝的粒径为200nm～400nm。
优选地，所述的细胞包载所述的抗肿瘤药的载药量为1mg/mL～10mg/mL细胞。
更优选地，所述的细胞包载所述的抗肿瘤药的载药量可以为1mg/mL～5mg/mL细胞，也可以为3mg/mL～8mg/mL细胞，也可以为7mg/mL～10mg/mL细胞。在某个优选的实施方式中，为3.6mg/mL红细胞。
优选地，所述的氧化铝在所述的细胞表面的吸附量为10μg/100μL～1000μg/100μL细胞。
更优选地，所述的氧化铝在所述的细胞表面的吸附量可以为10～300μg/100μL细胞，也可以为200～500μg/100μL细胞，也可以为300～700μg/100μL细胞，也可以为600～1000μg/100μL细胞。在某个优选的实施方式中，为300μg/100μL红细胞。
本发明的目的之二在于提供根据上文所述的系统的制备方法，包括如下步骤：细胞包载抗肿瘤药得到载药细胞，所述的载药细胞与氧化铝溶液混合，进行孵育，获得所述的抗肿瘤药递送系统。
优选地，所述的抗肿瘤药与细胞的质量体积比为(5～50)mg：1mL。
更优选地，所述的抗肿瘤药与细胞的质量体积比可以为(5～25)mg：1mL，也可以为(20～40)mg：1mL，也可以为(30～50)mg：1mL。在某个优选的实施方式中，为16mg：1mL。
优选地，所述的氧化铝与细胞的质量体积比为(2.5～25)mg：1mL。
更优选地，所述的氧化铝与细胞的质量体积比可以为(2.5～25)mg：1mL，可以为(2.5～5.5)mg：1mL，也可以为(4.5～8.5)mg：1mL，也可以为(6.5～10.5)mg：1mL，也可以为(10～14.5)mg：1mL，也可以为(13～18.5)mg：1mL，也可以为(16.5～20)mg：1mL。在某个优选的实施方式中，为5mg/mL红细胞。
优选地，所述的氧化铝溶液的渗透压为200mOsm/L～400mOsm/L。
更优选地，所述的氧化铝溶液的渗透压可以为200mOsm/L～300mOsm/L，也可以为250mOsm/L～350mOsm/L，也可以为300mOsm/L～400mOsm/L。在某个优选的实施方式中，为300mOsm/L。
优选地，所述的氧化铝溶液为由氧化铝溶于水形成；所述的氧化铝溶液中，氧化铝的浓度为1mg/mL～10mg/mL。
更优选地，所述的氧化铝溶液的浓度为3mg/mL～7mg/mL。在某个优选的实施方式中，为5mg/mL。
优选地，所述的氧化铝溶液的表面电位为+10mV～+60mV。
更优选地，所述的氧化铝溶液的表面电位为+20mV～+40mV。在某个优选的实施方式中，为38mV。
优选地，所述的孵育温度为10℃～50℃。
更优选地，所述的孵育温度可以为10℃～20℃，也可以为15℃～30℃，也可以为20℃～35℃，也可以为30℃～45℃，也可以为40℃～50℃。在某个优选的实施方式中，为37℃。
优选地，所述的孵育时间为20min～60min。
更优选地，所述的孵育时间为20min～40min，也可以为30min～50min，也可以为40min～60min。在某个优选的实施方式中，为30min。
优选地，所述的细胞包载抗肿瘤药的方法为：采用低渗溶液以打开细胞的膜孔来负载抗肿瘤药，再采用高渗溶液以封闭细胞的膜孔来完成包覆，得到所述的载药细胞。
更优选地，所述的细胞包载抗肿瘤药的方法包括如下步骤：
1)采用低渗溶液预处理细胞，然后与抗肿瘤药溶液混合，进行第一次孵育，得到细胞混合液；
2)所述的细胞混合液与所述的高渗溶液混合，进行第二次孵育，得到所述的载药细胞。
进一步优选地，所述的低渗溶液预处理细胞的方法为：将低渗溶液与细胞混合。
进一步优选地，步骤1)中，所述的预处理的温度为-5℃～5℃。较佳地，所述的预处理的温度为-1℃～1℃。在某个优选的实施方式中，为0℃。
进一步优选地，步骤1)中，所述的预处理的时间为5min～30min。较佳地，所述的预处理的时间为5min～20min。在某个优选的实施方式中，为10min。
进一步优选地，步骤1)中，所述的低渗溶液为由氯化钠溶于水形成；所述的低渗溶液中，氯化钠的浓度为0.45wt％～0.80wt％。较佳地，为0.45wt％～0.60wt％，在某个优选的实施方式中，为0.60wt％。
进一步优选地，步骤1)中，所述的低渗溶液的渗透压为1mOsm/L～300mOsm/L。较佳地，所述的低渗溶液的渗透压可以为1mOsm/L～150mOsm/L，也可以为100mOsm/L～200mOsm/L，也可以为150mOsm/L～250mOsm/L，也可以为200mOsm/L～300mOsm/L。在某个优选的实施方式中，为200mOsm/L。
进一步优选地，步骤1)中，所述的抗肿瘤药溶液为由抗肿瘤药溶于水形成；所述的抗肿瘤药溶液中，抗肿瘤药的浓度为1mg/mL～20mg/mL。较佳地，所述的抗肿瘤药的浓度可以为1mg/mL～8mg/mL，也可以为5mg/mL～15mg/mL，也可以为12mg/mL～20mg/mL。在某个优选的实施方式中，为8mg/mL。
进一步优选地，步骤1)中，所述的第一次孵育的温度为-5℃～10℃。较佳地，所述的第一次孵育的温度可以为-5℃～1℃，也可以为0℃～8℃，也可以为7℃～10℃。在某个优选的实施方式中，为0℃。
进一步优选地，步骤1)中，所述的第一次孵育的时间为5min～40min。较佳地，所述的孵育时间为5min～25min，也可以为15min～30min，也可以为25min～40min。在某个优选的实施方式中，为20min。
进一步优选地，步骤2)中，所述的高渗溶液与所述的细胞混合液的体积比为1：(4～20)。较佳地，所述的高渗溶液与所述的细胞混合液的体积比可以为1：(4～10)，也可以为1：(8～17)，也可以为1：(16～20)。在某个优选的实施方式中，为1：4.3。
进一步优选地，步骤2)中，所述的高渗溶液的渗透压为1000mOsm/L～1500mOsm/L。较佳地，所述的高渗溶液的渗透压为1200mOsm/L～1400mOsm/L。在某个优选的实施方式中，为1300mOsm/L。
进一步优选地，步骤2)中，所述的高渗溶液为由氯化钾溶于水形成；所述的高渗溶液中，氯化钾的浓度为35mg/mL～150mg/mL。较佳地，为100mg/mL～150mg/mL。在某个优选的实施方式中，为111.8mg/mL。
进一步优选地，步骤2)中，所述的第二次孵育的温度为10℃～50℃。较佳地，所述的第二次孵育的温度可以为10℃～25℃，也可以为20℃～40℃，也可以为30℃～50℃。在某个优选的实施方式中，为37℃。
进一步优选地，步骤2)中，所述的第二次孵育的时间为10min～60min。较佳地，所述的孵育时间为10min～30min，也可以为20min～50min，也可以为40min～60min。在某个优选的实施方式中，为30min。
本发明的目的之三在于提供一种上文所述的系统在制备抗肿瘤药物中的用途。
优选地，所述肿瘤为结肠癌、宫颈癌或肝癌。
本发明的目的之四在于提供一种化学免疫联合制剂，所述的制剂包括上文所述的系统。
优选地，本发明的抗肿瘤药递送系统的用法用量为：对于小鼠而言，采用静脉给药方式，每3天给药一次，每次剂量为15mg/kg～25mg/kg。
本申请中的抗肿瘤药递送系统10日～14日为一个疗程。
本发明的抗肿瘤药递送系统，利用载体红细胞具有生物相容性好、可降解等优点，能将抗肿瘤药物包封进入红细胞内部，增强抗肿瘤药物在体内的稳定性，实现抗肿瘤药物的缓慢释放，减少给药剂量和给药次数，从而达到减毒、增效的目的；同时，由于载体红细胞具有较高的体表面积比、长循环等优点，通过静电相互作用将纳米氧化铝吸附于红细胞表面，能够减少网状内皮系统中巨噬细胞对于抗肿瘤药递送系统的吞噬清除作用，延长纳米氧化铝刺激机体免疫系统产生免疫应答的时间，进而达到通过提高机体的免疫应答能力以增强化疗药物的抗肿瘤临床疗效的目的。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的抗肿瘤药递送系统安全有效。与现有的抗肿瘤药制剂相比，如注射剂、脂质体和纳米粒，本发明制备的递送系统，在形态和渗透脆性上仿生天然红细胞，从而避免外源性载体材料降解造成的免疫原性反应，通过在红细胞表面吸附氧化铝，进一步实现长时间在体内循环而不被免疫系统捕获和清除。
(2)与现有的载药红细胞体系相比，本发明制备的递送系统具有更高的载药量和包封率，进入体内后能实现药物的缓慢释放，可以避免短时多次给药带来的副作用问题。
(3)本发明的抗肿瘤药递送系统能增强免疫刺激效果：与游离纳米氧化铝相比，吸附在红细胞表面的纳米氧化铝，一方面能显著减少被巨噬细胞的吞噬，实现更持久地刺激机体树突状细胞的成熟，另一方面避免高剂量的游离纳米氧化铝注射剂进入血液造成机体的免疫损伤。
(4)本发明的抗肿瘤药递送系统在化学药物治疗的基础上增强机体免疫功能：本发明制备得到的系统在治疗小鼠结肠癌的体内药效学试验中，对肿瘤生长抑制效果明显，抑制率达到74.0％，且显著增强机体免疫应答能力，促进小鼠脾脏细胞增殖，小鼠脾脏指数达到0.023，进一步刺激小鼠分泌IL-2，其中血清中细胞因子IL-2的含量，达到15.17pg/mL，在化疗药物治疗的基础上，增强机体的免疫功能，从而提高抗肿瘤的治疗效果。
(5)本发明的制备方法步骤简单：反应时间短，反应条件温和，不需要复杂设备，仅通过孵育、离心洗涤便可完成药物的包封和纳米氧化铝的吸附。
附图说明
图1显示为本发明的实施例4中NRBCs、CPT-11-RBCs和AN-CPT-11-RBCs的扫描电镜图。
图2显示为本发明的实施例5中NRBCs、CPT-11-RBCs和AN-CPT-11-RBCs的渗透脆性曲线图。
图3显示为本发明的实施例6中Control组、AN组和AN-CPT-11-RBC组被巨噬细胞在体外摄取后的激光共聚焦显微镜图。
图4显示为本发明的实施例7中Control组、CPT-11-Solution组、NRBCs组、CPT-11-RBCs组、AN组和AN-CPT-11-RBCs中各组的树突状细胞表面CD80、CD86表达因子的表达情况图。
图5显示为本发明的实施例8中经注射给药5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、1d、2d、4d、8d后，CPT-11-solution组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组的大鼠的血液中的CPT-11含量变化图。
图6显示为本发明的实施例8中经注射给药5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、1d、2d、4d、8d后，CPT-11-solution组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组的大鼠的血液中的SN-38含量变化图。
图7显示为本发明的实施例9中Control组、Model组、CPT-11-M组、CPT-11组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组中各组小鼠每隔2天测定的体重的曲线图。
图8显示为本发明的实施例9中Control组、Model组、CPT-11-M组、CPT-11组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组中各组小鼠的肿瘤体积的曲线图。
图9显示为本发明的实施例9中Control组、Model组、CPT-11-M组、CPT-11组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组中各组小鼠的肿瘤的实拍图。
图10显示为本发明的实施例9中给药结束后，Control组、Model组、CPT-11-M组、CPT-11组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组中各组小鼠的脾脏指数图。其中，**代表，P<0.01。
图11显示为本发明的实施例9中给药结束后，Control组、Model组、CPT-11-M组、CPT-11组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组中各组小鼠的血清中细胞因子IL-2的含量图。其中，**代表，P<0.01。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本申请的下述实施例中以盐酸伊立替康作为抗肿瘤药为代表，进行抗肿瘤药递送系统的制备和表征，抗肿瘤药不局限于盐酸伊立替康。
本申请实施例中，盐酸伊立替康(Irinotecan Hydrochloride，简记为CPT-11)，购买自上海源叶生物有限公司，含量是250mg，纯度为98％。
本申请实施例中，纳米氧化铝的粒径为300nm，纳米氧化铝简记为AN。
本申请实施例中，红细胞标记为NRBCs；载药红细胞标记为CPT-11-RBCs；载药红细胞吸附纳米氧化铝后，形成抗肿瘤药递送系统，标记为AN-CPT-11-RBC。
实施例1抗肿瘤药递送系统的制备
本实施例中，进行红细胞膜包载盐酸伊立替康得到载药红细胞，得到的载药红细胞标记为CPT-11-RBCs，并将载药红细胞(CPT-11-RBCs)与氧化铝溶液混合，制备得到抗肿瘤药递送系统，标记为AN-CPT-11-RBC。包括如下步骤：
(1)制备载体红细胞
取200g左右的SPF级别的SD雄性大鼠，用熔点毛细管(内径×管长＝(0.9-1.1)×100mm)于大鼠眼眶后静脉丛取血，每次取约0.2～0.4mL置于浸润有肝素钠的离心管中，于2000r/min、4℃离心4min，弃上层无色透明血浆及白细胞层后，加入500μL预冷的PBS溶液，洗涤2-3次，直至上清液澄清透明。下层得到载体红细胞(NRBCs)，用于后续实验操作，每100μL的载体红细胞中约含有108个红细胞。
(2)低渗溶液预处理红细胞
取0.1mL步骤(1)得到的载体红细胞与0.4mL的低渗溶液混合，在0℃下孵育10min，于2000r/min和4℃离心4min，弃上清液，得到预处理红细胞。其中，低渗溶液为0.6wt％的氯化钠水溶液，渗透压为200mOsm/L。
(3)红细胞膜包载盐酸伊立替康，得到载药红细胞
0.1mL步骤(2)得到的预处理红细胞中，加入0.2mL的盐酸伊立替康溶液，在0℃下进行第一次孵育20min；然后加入0.013mL的高渗溶液轻轻混匀，在37℃下进行第二次孵育30min，于2000r/min和4℃离心4min，吸取上清液备用，标记为上清液A；下层沉淀为制备获得的载药红细胞，标记为CPT-11-RBCs。
其中，盐酸伊立替康溶液是由盐酸伊立替康粉末溶于质量分数为0.6wt％的氯化钠溶液形成；盐酸伊立替康溶液中，盐酸伊立替康的浓度为8mg/mL；高渗溶液为浓度为111.8mg/mL的氯化钾溶液，渗透压为1300mOsm/L。
(4)抗肿瘤药递送系统的制备
将的纳米氧化铝粉末溶于PBS溶液中，超声处理30min，得到5mg/mL的纳米氧化铝溶液。纳米氧化铝溶液的渗透压为300mOsm/L，电位为38.1mV。
取100μL步骤(3)的载药红细胞(CPT-11-RBCs)，与500μL的纳米氧化铝溶液，在常温下进行孵育30min，于1600rpm/min和4℃离心5min，用500μL预冷的PBS溶液洗涤3次，收集每次洗涤的上清液备用，上清液标记为上清液B；下层为制备获得的抗肿瘤药递送系统，标记为AN-CPT-11-RBCs。
本实施例中，抗肿瘤药递送系统(AN-CPT-11-RBCs)中载药量为3.65mg/mL红细胞，氧化铝在红细胞表面的吸附量为305.87μg/100μL细胞。
实施例2载药量的测定
本实施例中，考察低渗溶液的处理时间、不同浓度盐酸伊立替康对载药量的影响。包括如下步骤：
(1)收集载药过程中的含药上清液
采用0.6wt％氯化钠水溶液作为低渗溶液，于0℃预处理红细胞5min、10min、20min、30min，其余步骤均同实施例1，制备抗肿瘤药递送系统。每个处理在制备过程中，均吸取如实施例1中步骤(3)中的上清液A和如步骤(4)中的上清液B进行混合，得到混合上清液，然后吸取0.2mL的混合上清液，加入0.8mL的甲醇，涡旋混匀，于12000rpm/min和4℃离心10min，得到混合溶液，然后通过高效液相色谱仪对混合溶液进行检测。
采用浓度分别为6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL盐酸伊立替康，其余步骤均同实施例1，制备抗肿瘤药递送系统。不同浓度的盐酸伊立替康在制备过程中，均吸取制备过程中如实施例1中步骤(3)中的上清液A和如步骤(4)中的上清液B进行混合，得到混合上清液，然后吸取0.2mL的混合上清液，加入0.8mL的甲醇，涡旋混匀，于12000rpm/min和4℃离心10min，得到混合溶液，然后通过高效液相色谱仪对混合溶液进行检测。
(2)高效液相色谱仪进样检测
吸取本实施例中步骤(1)中的经不同低渗处理时间和不同浓度盐酸伊立替康制备抗肿瘤药递送系统过程中得到的混合溶液，用0.22μm一次性滤膜过滤后，置于进样小瓶中，于高效液相色谱仪进样，测定上清液A和上清液B中游离盐酸伊立替康的含量。
高效液相色谱仪的测定条件为：
色谱仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；
色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)；
流动相：甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液(50：5：45)；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
检测波长：254nm；
进样量：20μL。
载药量＝加入的盐酸伊立替康总量-上清液中游离盐酸伊立替康含量。式中，上清液包括上清液A和上清液B。
包封率＝(载药量/加入的盐酸伊立替康总量)*100％。
本实施例中，0.6wt％低渗溶液对红细胞进行预处理时间对载药量的研究结果见下表1。
表1
从表1可知，在考察低渗溶液的预处理时间对载药量的影响试验中，发现低渗溶液的处理时间对载药量没有影响；但是随着处理时间的增加，载药量有所降低，故优选低渗溶液对红细胞的预处理时间为5～30min为宜，载药量为2.91～3.61mg/mL红细胞。
本实例中，不同浓度盐酸伊立替康溶液对载药量的研究结果见下表2。
表2
从表2可知，以不同浓度盐酸伊立替康溶液为对象进行载药量的影响实验中，发现不同浓度盐酸伊立替康溶液对载药量没有影响；但随着盐酸伊立替康溶液的浓度增加，载药量增加，优选载药量为2.83～4.51mg/mL红细胞。
实施例3抗肿瘤药递送系统中纳米氧化铝的吸附量测定
本实施例中，考察不同浓度的氧化铝纳米溶液对抗肿瘤药递送系统(AN-CPT-11-RBCs)的纳米氧化铝吸附量的影响。包括如下步骤：
(1)钙黄绿素标记的纳米氧化铝的制备
以1：10的质量比称取一定量的钙黄绿素(Calcein)粉末与纳米氧化铝粉末置于烧杯中，加入一定量的去离子水，于磁力搅拌器上混合搅拌45min，于1600rpm/min和4℃离心5min。加入去离子水洗涤2-3次，直至离心后的上清液接近无色，加入适量PBS溶液对钙黄绿素标记的纳米氧化铝进行重悬后，超声分散30min，得到钙黄绿素标记的纳米氧化铝溶液(Calcein-AN)。
(2)定量测定吸附纳米氧化铝的红细胞数
取本实施例中步骤(1)中制备得到浓度分别为1、2、3、4、5mg/mL的Calcein-AN替代实施例1中步骤(4)中的纳米氧化铝溶液，其余均同实施例1制备得到Calcein-AN-CPT-11-RBCs。
吸取50μL Calcein-AN-CPT-11-RBCs，加入至装有2mL PBS溶液的流式管中，以未经标记Calcein的AN-CPT-11-RBCs作为阴性对照，用流式细胞仪检测表面吸附纳米氧化铝的红细胞的比例。设置阴性对照组以找到细胞群和调节荧光通道的电压。结果详见表3中的纳米氧化铝吸附量。
(3)定量测定红细胞表面吸附的纳米氧化铝量
取本实施例中步骤(1)中得到不同浓度的Calcein-AN，以1：5的体积比与载药红细胞(CPT-11-RBCs)混合，得到Calcein-AN与CPT-11-RBCs的混合溶液，作为系列浓度的对照组，用于后续建立定量测定的标准曲线。
再取本实施例中步骤(1)中制备得到不同浓度的Calcein-AN，按实施例1中的步骤制备得到不同浓度钙黄绿素标记的Calcein-AN-CPT-11-RBCs。吸取100μL Calcein-AN-CPT-11-RBCs加入至500μL的PBS溶液中进行重悬，利用酶标仪在激发波长为494nm，发射波长为516nm处，测定各样品的荧光强度值，利用对照组样品建立定量测定的标准曲线，从而计算得到纳米氧化铝在红细胞上的吸附量。结果详见表3中表面吸附纳米氧化铝红细胞百分比。
吸附量(μg/100μL红细胞)＝根据标准曲线计算纳米氧化铝的吸附量(μg)/100μL红细胞。
本实施例中，不同浓度氧化铝纳米溶液对红细胞表面纳米氧化铝的吸附量研究结果见表3。
表3
从表3可知，AN-CPT-11-RBCs表面上的纳米氧化铝的吸附量为14～305μg/100μL红细胞，表面吸附纳米氧化铝的AN-CPT-11-RBCs的比例为25～73％。
实施例4 NRBCs、CPT-11-RBCs和AN-CPT-11-RBCs的形态研究
本实施例中，通过扫描电镜观察实施例1中的NRBCs、CPT-11-RBCs和AN-CPT-11-RBCs的形貌。包括如下步骤：
(1)固定液的配制
固定液包括：2.5wt％的戊二醛溶液；后固定液和乙醇溶液。各种固定液的制备方法如下：
用一定量的去离子水稀释质量分数为50％的戊二醛溶液到质量分数为2.5％。
以1：1的体积比混合0.6％的重铬酸钾溶液和0.4％的高锰酸钾溶液，配制得到后固定液备用。
用一定量去离子水和无水乙醇配制体积分数依次为30％、50％、70％、80％、85％、90％、95％、100％的乙醇溶液。
(2)扫描电镜样品的制备
1)各取50μL实施例1的NRBCs、CPT-11-RBCs和AN-CPT-11-RBCs，然后加入至含有1mL的本实施例中步骤(1)得到的2.5wt％的戊二醛溶液的离心管中，固定30min，于2000r/min和4℃离心4min，用PBS溶液洗涤2次样品，得到沉淀A。
2)向沉淀A中加入1mL的本实施例中步骤(1)得到的后固定液，悬浮固定5min，于2000r/min和4℃离心4min，用超纯水洗涤样品2次，得到沉淀B。
3)沉淀B中加入1mL的30％的乙醇溶液，悬浮固定5min，于2000r/min和4℃离心4min，弃上清，再依次用本实施例中步骤(1)得到的50％、70％、80％、85％、90％、95％和100％的乙醇溶液，进行前述悬浮固定操作，离心得到沉淀C。
4)用500μL的无水乙醇重悬沉淀C，吹打均匀后，滴在滤纸圆片上，放入真空干燥箱中干燥20min，收集滤纸片上的样品粉末于导电胶上，进行时长为45s的镀铂操作，放置于扫描电子显微镜下观察。
图1为本实施例中NRBCs、CPT-11-RBCs和AN-CPT-11-RBCs的扫描电镜图。
从图1可知，AN-CPT-11-RBCs、CPT-11-RBCs和NRBCs形态没有显著性差异，都是双面凹的圆饼状，且在AN-CPT-11-RBCs的表面可以观察到纳米氧化铝的吸附。
实施例5 NRBCs、CPT-11-RBCs和AN-CPT-11-RBCs的渗透脆性的研究
本实施例中，对实施例1的NRBCs、CPT-11-RBCs和AN-CPT-11-RBCs的渗透脆性进行测定。包括如下步骤：
(1)系列浓度氯化钠溶液的制备
配制1％的氯化钠溶液，用去离子水稀释为质量分数依次为0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％的氯化钠溶液，利用冰点渗透压仪，测定不同质量分数的氯化钠溶液的渗透压。
不同质量分数的氯化钠溶液的渗透压测定结果见下表4。
表4
(2)渗透脆性的测定
实验分组：以实施例1中的NRBCs、CPT-11-RBCs和AN-CPT-11-RBCs为研究对象。
每组取13份50μL，与500μL本实施例中步骤(1)得到的不同质量分数的氯化钠溶液混合，反复吹打均匀。在0℃在静置2h，于2000r/min和4℃离心4min，吸取上清液，然后向96孔板中加入100μL上清液，每个样品3份平行，测定各孔在OD值为540nm处的吸光度，计算溶血率，以溶血率为纵坐标，以渗透压为横坐标，绘制渗透脆性曲线。
A样品—各组样品在OD值为540nm处的吸光度值，
A316—各组样品经1％氯化钠溶液处理后的上清液在OD＝540nm处的吸光度值，
A0—各组样品经去离子水处理后的上清液在OD＝540nm处的吸光度值。
图2为本实施例中NRBC、CPT-11-RBCs和AN-CPT-11-RBCs的渗透脆性曲线图。
从图2可知，与NRBC相比，CPT-11-RBCs和AN-CPT-11-RBCs的渗透脆性曲线右移，表明在载药过程中，渗透压为162mOsm/L～220mOsm/L时，红细胞的抗张力强度能力有一定的下降。
实施例6巨噬细胞在体外摄取实验的研究
本实施例中，考察巨噬细胞对纳米氧化铝溶液以及AN-CPT-11-RBCs的摄取情况。包括如下步骤：
(1)巨噬细胞Raw 264.7的接种
将生长状态良好的巨噬细胞Raw 264.7从培养皿中吹打收集重悬，调整细胞密度为2×105个/mL，得到Raw 264.7细胞悬液。然后进行圆形爬片处理和不含圆形爬片处理。
不含圆形爬片处理：取灭菌12孔细胞培养板，准备9个孔，分成Control组、AN组和AN-CPT-11-RBCs组，每组设3个复孔。向上述各孔板中接种1mL的Raw 264.7细胞悬液。于37℃恒温培养箱中培养24h。其中，AN组为纳米氧化铝分散于1640培养基溶液获得，浓度为0.2mg/mL；AN-CPT-11-RBCs组为由66μL实施例1获得的AN-CPT-11-RBCs与1mL的1640培养基溶液混合得到；Control组为1640培养基溶液。
圆形爬片处理：另取灭菌12孔细胞培养板，准备9个孔，分成Control组、AN组和AN-CPT-11-RBCs组，每组设3个复孔。向上述各孔板中先加入圆形爬片，再接种1mL的Raw 264.7细胞悬液。于37℃恒温培养箱中培养24h。其中，AN组为纳米氧化铝分散于1640培养基溶液获得，浓度为0.2mg/mL；AN-CPT-11-RBCs组为由66μL实施例1获得的AN-CPT-11-RBCs与1mL的1640培养基溶液混合得到；Control组为1640培养基溶液。
(2)巨噬细胞体外摄取纳米氧化铝
按实施例3中步骤(2)得到经过标记的Calcein-AN和Calcein-AN-CPT-11-RBCs，用PBS稀释，使得AN组和AN-CPT-11-RBCs组中纳米氧化铝的浓度为0.2mg/mL。
向本实施例步骤(1)中的AN组和AN-CPT-11-RBCs组的孔板中加入各1mL的Calcein-AN和Calcein-AN-CPT-11-RBCs，置于37℃恒温培养箱中孵育2h后取出。
(3)巨噬细胞对纳米氧化铝的摄取检测
取出不含圆形爬片的12孔板，吸弃孔板中上清液，用PBS洗涤细胞2次，吹打收集各孔板中的细胞，通过流式细胞仪定量分析巨噬细胞的摄取情况。
取出含圆形爬片的12孔板，吸弃孔板中上清液，用PBS洗涤细胞2次。向孔板中加入1mL的4％多聚甲醛固定液，固定15min，吸弃上清液，用PBS洗涤细胞2次，取出细胞爬片。向载玻片上滴加一滴含DAPI的抗荧光淬灭封片液，将细胞爬片覆盖于上，制备得到观察样本，在激光共聚焦显微镜下定性分析巨噬细胞摄取情况。
本实施例中，巨噬细胞体外摄取纳米氧化铝的定量分析结果见下表5。
表5
从表5可知，Control组中的巨噬细胞未吞噬有荧光标记的纳米粒，故未检测到明显的荧光发光；AN组中巨噬细胞吞噬纳米粒后检测到的荧光强度约为3692.33，表明存在较多荧光标记的纳米粒被巨噬细胞吞噬；而AN-CPT-11-RBC组中巨噬细胞吞噬纳米粒后的荧光强度为838.66，与AN组相比，巨噬细胞对于纳米粒的吞噬量减少。
图3为本实施例中Control组、AN组和AN-CPT-11-RBC组经被巨噬细胞体外摄取后的激光共聚焦显微镜图。
从图3可知，激光共聚焦显微镜的观察结果也与流式细胞术的定量分析结果相符，Control组中仅能观察到蓝色荧光，表明巨噬细胞核被成功染色；AN组中的绿色荧光点多于AN-CPT-11-RBC组，表明巨噬细胞对游离的纳米氧化铝颗粒具有更强的吞噬能力。
定量和定性结果的综合分析均显示，通过将纳米氧化铝吸附在载药红细胞上，能在一定程度上减少巨噬细胞对于抗肿瘤药递送系统的吞噬，从而使得更多的纳米氧化铝具有发挥进一步作用的潜力。
实施例7树突状细胞体外刺激成熟实验
本实施例中，研究实施例1的CPT-11-RBCs、NRBCs和AN-CPT-11-RBCs在体外刺激树突状细胞成熟的能力。包括如下步骤：
(1)小鼠骨髓树突状细胞的培养
取6-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠，以颈椎脱臼法处死。在生物安全柜中，取小鼠的股骨和胫骨，用注射器吸取1640培养基冲洗小鼠骨髓腔，收集得到单细胞悬液，于800rpm/min离心5min，弃上清，得到细胞沉淀。
向细胞沉淀中加入1mL红细胞裂解液(购买自上海泰坦科技股份有限公司，规格为120mL)，混合均匀后于常温下裂解5min，加入15mL 1640培养基终止裂解，于800rpm/min离心5min，弃上清液，得到细胞。
用1mL 1640完全培养基重悬细胞，调整得到浓度为3×105个/mL的细胞悬液。
将细胞悬液接种于6孔板中，每孔板中的细胞数为1×106个。此时记作第0天。
分别在第1、3、5天加入新鲜的诱导培养基(将GM-CSF和IL-4各25uL加入50mL的RPMI 1640培养基中)，进行半量换液，第7天，得到纯化的小鼠树突状细胞，进行收集以待后续实验。
(2)将本实施例步骤(1)中纯化的小鼠树突状细胞用1640完全培养基重悬，接种至12孔板中，每孔1×106个细胞，准备18个孔，置于恒温培养箱中培养24h。
将18个孔分为6组，分别为Control组、CPT-11-solution组、AN组、NRBCs组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组。每组设置3个复孔。每组吸取50μL的样品，加入至接种有小鼠树突状细胞的12孔板中，共同孵育24h。其中，每组的具体情况如下：
Control组：为1640培养基溶液。
CPT-11-solution组：2mg/mL的盐酸伊立替康溶液，是由盐酸伊立替康粉末溶于质量分数为0.6wt％的氯化钠溶液形成。
AN组：5mg/mL的纳米氧化铝溶液，是由纳米氧化铝粉末溶于1640培养基溶液中形成。
NRBCs组：实施例1中步骤(1)得到的载体红细胞，每100μL的载体红细胞中约含有108个红细胞。
CPT-11-RBCs组：实施例1中步骤(3)得到的载药红细胞。
AN-CPT-11-RBCs组：实施例1中步骤(4)得到的抗肿瘤药递送系统。
孵育结束后，用PBS溶液洗涤18孔板中的细胞，吹打收集处理后的树突状细胞；利用CD86-PE、CD80-FITC荧光标记的抗体与处理后的树突状细胞共孵育，以对树突状细胞的表面分子进行标记。然后通过流式细胞仪分析树突状细胞表面分子的表达情况，进而分析成熟情况。树突状细胞表面CD80、CD86表达因子的上调是成熟的标志。
图4为本实施例中Control组、CPT-11-Solution组、NRBC组和CPT-11-RBCs组中各组的树突状细胞表面CD80、CD86表达因子的表达情况图。
从图4可知，Control组的树突状细胞由于未经刺激，故仅19.6％的树突状细胞呈现成熟状态；CPT-11-Solution组的树突状细胞，仅有22.4％呈现成熟状态，表明盐酸伊立替康溶液对树突状细胞的成熟没有刺激作用；NRBC组和CPT-11-RBCs组中的成熟树突状细胞占比分别约为42.0％和45.6％，这可能是由于红细胞的刺激所致；而AN组的成熟树突状细胞的占比约为63.8％，表明纳米氧化铝对树突状细胞的成熟具有较强的刺激效果；与其他组相比，AN-CPT-11-RBCs组的树突状细胞成熟的比例达到86.1％，表明吸附在载药红细胞表面的纳米氧化铝依旧能对树突状细胞的成熟产生刺激效果，且载药红细胞与纳米氧化铝的形成的抗肿瘤药递送系统能对树突状细胞产生更强的刺激效果，从而具备了进一步刺激机体的免疫应答的潜能。
实施例8体内药代动力学研究
本实施例中，研究实施例1的CPT-11-RBCs、AN-CPT-11-RBCs和盐酸伊立替康溶液在大鼠体内的药代动力学行为。包括如下步骤：
(1)大鼠尾静脉给药
分组：取9只体重为200g左右的SD雄性大鼠分为3组，每组3只，分别为CPT-11-solution组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组。
CPT-11-solution组：2mg/mL的盐酸伊立替康溶液，作为注射制剂。
CPT-11-RBCs组：载药红细胞(CPT-11-RBCs)形成的注射制剂，1mL注射制剂中盐酸伊立替康的含量约为2mg。具体制备方法为：按实施例1的方法从大鼠的眼眶静脉丛中取血约为1mL，其他同实施例1，制备得到0.5mL的CPT-11-RBCs(载药量约为4mg/mL红细胞)，用生理盐水稀释到1mL作为注射制剂。
AN-CPT-11-RBCs组：抗肿瘤药递送系统(AN-CPT-11-RBCs)形成的注射制剂，1mL注射制剂中盐酸伊立替康的含量约为2mg。具体制备方法为：按实施例1的方法从大鼠的眼眶静脉丛中取血约为1mL，其他同实施例1，制备得到0.5mL的AN-CPT-11-RBCs(载药量约为4mg/mL红细胞)，用生理盐水稀释到1mL作为注射制剂。
取各组的注射制剂，依次给每组的大鼠尾静脉回输给药1mL。
(2)采集不同时间点的血浆样品进样检测
注射完成后，分别在5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、1d、2d、4d、8d对各组大鼠眼眶取血约0.2mL，离心收集血浆40μL于离心管中，再加入10μL喜树碱溶液(内标参照溶液，浓度为2μg/mL)，混匀后再加入950μL甲醇沉淀蛋白，混合均匀涡旋1min，于12000rpm/min离心10min，用UPLC-MS/MS检测收集的上清液。记录样品峰和内标峰的面积，计算其比值，再根据标准曲线计算出血药浓度，绘制药代动力学曲线。
图5为本实施例中经注射给药5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、1d、2d、4d、8d后，CPT-11-solution组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组的大鼠的血液中的CPT-11含量变化图。
图6为本实施例中经注射给药5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、1d、2d、4d、8d后，CPT-11-solution组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组的大鼠的血液中的SN-38含量变化图。
从图5和图6可知，CPT-11-solution组中药物CPT-11及其代谢产物SN-38的半衰期分别为0.7d和0.5d，给药24h后，血浆中几乎检测不到CPT-11和SN-38；而CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组中CPT-11的血浆药物半衰期可达到3.14d和2.04d，与CPT-11-solution组相比，呈现出明显的缓释作用，在给药后第8d仍然能在血浆中检测到血药浓度，说明本发明制备的AN-CPT-11-RBCs可以实现盐酸伊立替康在体内的缓慢释放。
实施例9体内药效学研究
本实施例中，构建小鼠结肠癌模型，采用实施例1的CPT-11-RBCs、AN-CPT-11-RBCs和盐酸伊立替康溶液进行小鼠体内药效学研究。包括如下步骤：
(1)小鼠结肠癌模型构建及分组
收集处于对数生长期的小鼠结肠癌细胞CT26，调整细胞悬液浓度为1×108个/mL，将100μL细胞悬液接种至BALB/c小鼠的后肢背部，接种一周后，选择荷有肿瘤体积约为100mm3左右，且体重为20g左右的BALB/c雌性小鼠25只分为5组，每组5只，各组分别为：模型组(Model)、游离药物每天给药组(CPT-11-M)、游离药物组(CPT-11)、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组。
选择未经过造模的，体重为20g左右的BALB/c雌性小鼠5只，作为对照组(Control)。
Control组：每只小鼠尾静脉注射0.2mL的PBS溶液，每3天给药一次。
Model组：每只荷瘤小鼠尾静脉注射0.2mL的PBS溶液，每3天给药一次。
CPT-11-M组：每只荷瘤小鼠尾静脉注射0.2mL的浓度为665μg/mL的盐酸伊立替康溶液，每天给药一次。
CPT-11组：每只荷瘤小鼠尾静脉注射0.2mL的浓度为2mg/mL的盐酸伊立替康溶液，每3天给药一次。
CPT-11-RBCs组：按实施例1中的方法制备得到0.1mL的CPT-11-RBCs，用0.1mL的PBS稀释为体积为0.2mL的注射制剂，每只荷瘤小鼠尾静脉注射0.2mL的CPT-11-RBCs(载药量为4mg/mL红细胞)，每3天给药一次。
AN-CPT-11-RBCs组：按实施例2中的方法制备得到0.1mL的AN-CPT-11-RBCs，用0.1mL的PBS稀释为体积为0.2mL的注射制剂，每只荷瘤小鼠尾静脉注射0.2mL的AN-CPT-11-RBCs(载药量为4mg/mL红细胞)，每3天给药一次。
其中，每隔两天记录小鼠的体重及小鼠的荷瘤体积，进行为期15天的给药治疗，即在第13天给药后，于第15天对小鼠进行处理分析。
(2)体内药效学研究指标：
实验结束后，摘取脾脏，计算小鼠脾脏指数；摘眼球取血，测定小鼠血浆中细胞因子IL-2的含量变化。
式中，实验组肿瘤质量为CPT-11-M组、CPT-11组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组小鼠的肿瘤质量的总和。
图7为本实施例中Control组、Model组、CPT-11-M组、CPT-11组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组中各组小鼠每隔2天测定的体重的曲线图。
从图7可知，CPT-11-M组的小鼠体重并未出现明显增加趋势，反而呈下降趋势，这可能是每天给药产生了副作用；其余组小鼠的体重增长趋势与Control组相同，表明AN-CPT-11-RBCs能有效避免长期给药带来的体重下降情况的发生。
图8为本实施例中Control组、Model组、CPT-11-M组、CPT-11组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组中各组小鼠的肿瘤体积的曲线图。
图9为本实施例中Control组、Model组、CPT-11-M组、CPT-11组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组中各组小鼠的肿瘤的实拍图。
从图8和9可知，Model组中，小鼠的肿瘤体积增长较为明显；与Model组相比，CPT-11-M组和AN-CPT-11-RBCs组的肿瘤生长抑制效果较为明显，抑制率分别为67.9％和74.0％；CPT-11组和CPT-11-RBCs组中小鼠肿瘤生长抑制率为42.39％和59.42％。表明AN-CPT-11-RBCs能够在降低给药次数的同时，达到与盐酸伊立替康溶液每天给药治疗的相同效果，且纳米氧化铝的加入能具有刺激机体免疫应答的能力，增强CPT-11-RBCs在体内的抗肿瘤效果。
小鼠的脾脏是最大的免疫器官，在体液免疫和细胞免疫中发挥着重要作用。机体免疫功能表现亢进或抑制时，脾脏细胞也会出现相应的增殖或萎缩。因此，采用脾脏指数作为检测指标可在一定程度上反映机体对抗原的免疫应答水平，体现药物对机体免疫功能的影响。进一步，对小鼠血清中细胞因子IL-2的含量进行分析，因为IL-2主要由活化的T淋巴细胞产生，它在免疫应答中起重要作用，其主要生物活性是促进T淋巴细胞和NK细胞增殖，促进B细胞的分化和增殖。
图10为本实施例中给药结束后，Control组、Model组、CPT-11-M组、CPT-11组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组中各组小鼠的脾脏指数图。其中，**代表，P<0.01。
从图10可知，AN-CPT-11-RBCs组中，小鼠的脾脏指数为0.023，极显著高于其他各组；Control组中，小鼠的脾脏指数0.005。与CPT-11-RBCs组相比，纳米氧化铝的加入形成的AN-CPT-11-RBCs，能极显著增强机体的免疫功能，提高机体的免疫应答能力。
图11为本实施例中给药结束后，Control组、Model组、CPT-11-M组、CPT-11组、CPT-11-RBCs组和AN-CPT-11-RBCs组中各组小鼠的血清中细胞因子IL-2的含量图。其中，**代表，P<0.01。
从图11可知，AN-CPT-11-RBCs组中，小鼠血清中IL-2的含量为15.17pg/mL，极显著高于其他各组(P<0.01)；Control组中，小鼠血清中的IL-2的含量为5.52pg/mL。综合表明，AN-CPT-11-RBCs能通过提高小鼠血清中细胞因子IL-21的含量，增强免疫功能，从而提高抗肿瘤的疗效。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (11)
1.一种抗肿瘤药递送系统，其特征在于，所述的系统包括细胞、抗肿瘤药和氧化铝，所述的抗肿瘤药包载于所述的细胞内部，所述的细胞表面吸附有所述的纳米氧化铝。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的细胞选自红细胞、血小板、巨噬细胞和单核细胞中的一种或多种；
和/或，所述的抗肿瘤药选自伊立替康、阿霉素、多柔比星和吉他西滨中的一种或多种；
和/或，所述的氧化铝的粒径为50nm～400nm。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的细胞包载所述的抗肿瘤药的载药量为1mg/mL细胞～10mg/mL细胞；
和/或，所述的氧化铝在所述的细胞表面的吸附量为10～1000μg/100μL细胞。
4.根据权利要求1-3任一项所述的系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：细胞包载抗肿瘤药得到载药细胞，所述的载药细胞与氧化铝溶液混合，进行孵育，获得所述的抗肿瘤药递送系统。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗肿瘤药与细胞的质量体积比为(5～50)mg：1mL；
和/或，所述的氧化铝与细胞的质量体积比为(2.5～25)mg：1mL；
和/或，所述的氧化铝溶液的渗透压为200mOsm/L～400mOsm/L；
和/或，所述的孵育温度为10℃～50℃；
和/或，所述的孵育时间为20min～60min；
和/或，所述的氧化铝溶液为由氧化铝溶于水形成；所述的氧化铝溶液中，氧化铝的浓度为1mg/mL～10mg/mL；
和/或，所述的氧化铝溶液的表面电位为+10mV～+40mV。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的细胞包载抗肿瘤药的方法为：采用低渗溶液以打开细胞的膜孔来负载抗肿瘤药，再采用高渗溶液以封闭细胞的膜孔来完成包覆，得到所述的载药细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)采用低渗溶液预处理细胞，然后与抗肿瘤药溶液混合，进行第一次孵育，得到细胞混合液；
2)所述的细胞混合液与所述的高渗溶液混合，进行第二次孵育，得到所述的载药细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的预处理的温度为-5℃～5℃；
和/或，所述的预处理的时间为5min～30min；
和/或，所述的低渗溶液的渗透压为1mOsm/L～300mOsm/L；
和/或，所述的第一次孵育的温度为-5℃～10℃；
和/或，所述的第一次孵育的时间为5min～40min；
和/或，所述的高渗溶液的渗透压为1000mOsm/L～1500mOsm/L；
和/或，所述的高渗溶液与所述的细胞混合液的体积比为1：(4～20)；
和/或，所述的第二次孵育的温度为10℃～50℃；
和/或，所述的第二次孵育的时间为10min～60min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的低渗溶液为由氯化钠溶于水形成；所述的低渗溶液中，氯化钠的浓度为0.45wt％～0.80wt％；
和/或，所述的高渗溶液为由氯化钾溶于水形成；所述的高渗溶液中，氯化钾的浓度为35mg/L～150mg/L；
和/或，所述的抗肿瘤药溶液为由抗肿瘤药溶于水形成；所述的抗肿瘤药溶液中，抗肿瘤药的浓度为1mg/mL～20mg/mL。
10.一种权利要求1～3任一项所述的系统在制备抗肿瘤药物中的用途。
11.一种化学免疫联合制剂，其特征在于，所述的制剂包括权利要求1-3任一项所述的系统。
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