CN115887383B

CN115887383B - 一种二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115887383B
Application number: CN202211245298.3A
Authority: CN
Inventors: 陈攀; 王晖
Original assignee: Hunan Cancer Hospital
Current assignee: Hunan Cancer Hospital
Priority date: 2022-10-12
Filing date: 2022-10-12
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2042-10-12
Also published as: CN115887383A

Abstract

本发明提供了一种二硫卡钠‑铜磷酸钙纳米粒及其制备方法与应用，该二硫卡钠‑铜磷酸钙纳米粒包括铜磷酸钙纳米粒和二硫卡钠，铜磷酸钙纳米粒由人血清蛋白调控钙离子在DMEM培养基中经生物矿化制得，铜磷酸钙纳米粒在生物矿化过程中包载铜离子，二硫卡钠吸附于所述铜磷酸钙纳米粒表面，二硫卡钠‑铜磷酸钙纳米粒诱导细胞中钙离子过载。该纳米粒通过响应肿瘤细胞溶酶体弱酸性微环境，纳米粒快速被降解，释放出大量Ca²⁺，降解后铜离子可与DTC结合生成CuET，CuET可诱导内质网应激，导致大量Ca²⁺从内质网释放到细胞质中，这种外源Ca²⁺的大量引入和胞内Ca²⁺的大量释放可高效诱导胞内Ca²⁺过载，进而诱导肿瘤细胞凋亡，为诱导肿瘤细胞凋亡提供了一种简单高效的纳米Ca²⁺制剂。

Description

一种二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及纳米材料和纳米生物医药领域，具体涉及一种二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒及其制备方法与应用。

背景技术

癌症是影响人类生命健康和社会发展的重大问题。据统计，2020年全球患癌人数将增加到1500万。中国每年有近130万人死于癌症，癌症死亡人口已占总死亡人口的1/5。临床上治疗癌症的主要手段如化疗、放疗、手术切除等往往因为严重毒副作用、耐药性及术后复发转移等导致治疗失败。因此，寻找一种新型治疗方式具有重大临床意义。

亚细胞细胞器靶向纳米制剂因其精准给药、最大化治疗指标和减少脱靶副作用等优点而受到越来越多的关注。线粒体作为哺乳动物细胞的动力室和能量提供者，不仅对细胞存活和增殖至关重要，而且还负责一系列信号传导过程，包括细胞通信和信号转导，分化，细胞凋亡和衰老。目前已提出了激活线粒体凋亡途径的各种策略用于癌症治疗，其中Ca²⁺超载是诱导癌细胞凋亡最有效的手段之一，通过上调Ca²⁺浓度，引起线粒体膜电位降低、三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate,ATP)水平降低、线粒体形态改变、线粒体呼吸紊乱等一系列线粒体紊乱效应。因此，调控细胞内Ca²⁺浓度可能是精确癌症治疗的有效策略。

目前，已报道的肿瘤微环境(TME)响应的胞内Ca²⁺纳米制剂，包括纳米碳酸钙(CaCO₃)，过氧化钙(CaO₂)，硫化钙(CaS)和磷酸钙(CaP)等，然而，Ca²⁺纳米制剂仍存在多种局限性。例如，胞内Ca²⁺可能通过Ca²⁺通道排出而迅速恢复到正常水平，导致抗癌效果较差。专利 (CN115040648A)公开了一种基于硫化氢促进钙超载协同光热特异性治疗肿瘤的纳米粒，该纳米粒是以聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇作为外壳，硫化钙纳米粒和光热转换剂作为内核的核壳式纳米粒，改纳米粒通过在肿瘤微环境中分解产生硫化氢和钙离子，由硫化氢诱导钙离子的过载进而诱导肿瘤细胞凋亡，但是硫化氢气体在人体中有促氧化和DNA损伤效应，可能存在较强的副作用；而且，该纳米粒的制备方法复杂，反应条件苛刻，需要大量使用有机溶剂，降低了生物安全性和制备推广的便利性。

因此，构建一个理想的细胞内纳米Ca²⁺制剂仍然是一个严峻的挑战。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出了一种二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒及其制备方法与应用，其目的是提供一种采用生物矿化制备的二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒，其通过磷酸钙矿化过程包载铜离子形成铜磷酸钙纳米粒，然后将二硫卡钠吸附于铜磷酸钙纳米粒表面形成二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒，该纳米粒能通过释放铜离子与二硫卡钠结合形成配合物CuET，CuET 诱导内质网应激，导致大量Ca²⁺从内质网释放到细胞质中，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒，包括铜磷酸钙纳米粒和二硫卡钠，所述铜磷酸钙纳米粒由人血清蛋白调控钙离子在DMEM培养基中经生物矿化制得，所述铜磷酸钙纳米粒在生物矿化过程中包载铜离子，所述二硫卡钠吸附于所述铜磷酸钙纳米粒表面，所述二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒诱导细胞中钙离子过载。

作为优选，所述二硫卡钠-磷酸钙纳米粒呈类球形，水合粒径为200～240nm。

作为优选，所述钙离子为氯化钙，所述铜离子为氯化铜。

作为优选，所述钙离子、铜离子和二硫卡钠的摩尔比为80～100:8～5:5。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了一二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

S1、将人血清白蛋白，铜离子溶于DMEM培养基中，细胞培养箱孵育；

S2、将钙离子加入步骤S1中孵育后的溶液，细胞培养箱继续孵育，离心收集沉淀，得到铜磷酸钙纳米粒；

S3、将步骤S2得到的铜磷酸钙纳米粒复溶，加入二硫卡钠溶液混合，离心收集得到二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒。

作为优选，所述步骤S1中反应时间为1～2h。

作为优选，所述步骤S2中反应时间为18～30h。

基于一个总的发明构思，本发明化提供了一种二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒(CuCaP@DTC纳米粒)，通过将铜包载于磷酸钙纳米粒中，再将二硫卡钠(DTC)吸附在铜磷酸钙表面，CuCaP@DTC纳米粒通过响应肿瘤细胞溶酶体弱酸性微环境，纳米粒快速被降解，释放出大量Ca²⁺，降解后铜离子可与DTC结合生成配合物CuET，CuET可诱导内质网应激，导致大量Ca²⁺从内质网释放到细胞质中。这种外源Ca²⁺的大量引入和胞内Ca²⁺的大量释放可高效诱导胞内Ca²⁺过载，从而引起三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平降低、线粒体形态改变，进而诱导中肿瘤细胞凋亡。

2、本发明提供的二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒，通过响应肿瘤细胞溶酶体弱酸性微环境释放铜离子和DTC，铜离子和DTC在肿瘤细胞处结合生成配合物CuET，CuET本身能够肿瘤细胞具有一定的杀伤作用，能与诱导肿瘤细胞内Ca²⁺过载形成协同配合作用，进一步提高对于肿瘤细胞的杀伤能力；同时，铜离子和DTC通过响应肿瘤细胞微环境生成CuET，可有效避免CuET的半衰期较短的问题，提高其对于肿瘤细胞的作用，防止提前结合生成配合物CuET 而导致其作用效果差。

3、本发明通过将钙离子在DMEM培养基中生物矿化，铜离子在矿化过程中被包载在纳米粒中，DTC吸附于纳米粒表面，制备过程简易温和，反应过程简单可控，无需添加和使用有机溶剂，不会引入其他杂质；采用人血清蛋白调控钙离子在DMEM培养基中的生物矿化过程，形成的CuCaP@DTC纳米粒粒径均一，呈类球形，平均粒径240nm左右。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验例1检测获得的CuCaP@DTC纳米粒的透射电镜图，图1A为 CuCaP@DTC纳米粒的透射电镜图，图1B为铜磷酸钙纳米粒的透射电镜图；

图2为本发明实验例2检测获得的CuCaP@DTC纳米粒的粒径图；

图3为本发明实验例3检测获得的CuCaP@DTC纳米粒的紫外吸收光谱图，其中图3A为不同pH条件下CuCaP和CuCaP@DTC纳米粒的紫外光谱图，图3B为标准CuET紫外光谱图和pH5.5环境下CuCaP@DTC纳米粒的紫外光谱图；

图4为本发明实验例4检测获得的CuCaP@DTC纳米粒的体外抗肿瘤结果图，图4A为CaP纳米粒、CuCaP和CuCaP@DTC纳米粒的体外抗肿瘤结果，图4B为游离DTC和游离 CuET的体外抗肿瘤结果；

图5为本发明实验例5检测获得的CuCaP@DTC纳米粒处理细胞后，细胞内钙离子水平结果图；

图6为本发明实验例6检测获得的CuCaP@DTC纳米粒处理细胞后，细胞内ATP水平结果图；

图7为本发明实验例7检测获得的CuCaP@DTC纳米粒的体内抗肿瘤效果图；

图8为本发明实验例8检测获得的CuCaP@DTC纳米粒处理后各器官的病理切片图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1

制备CuCaP@DTC纳米粒

精密称取10mg人血清白蛋白，并吸取10μL 0.5M氯化铜，与10mL DMEM培养基混合，孵育2h，随后，加入100μL 1M氯化钙继续孵育24h，即得铜磷酸钙纳米粒。离心收集铜磷酸钙纳米粒，复溶，加入DTC溶液混合，离心去除上清，沉淀复溶，即得CuCaP@DTC 纳米粒。

对比例1

制备常规磷酸钙纳米粒(CaP)

精密称取10mg人血清白蛋白，与10mL DMEM培养基混合，孵育2h，随后，加入100 μL1M氯化钙继续孵育24h，即得CaP纳米粒。离心收集纳米粒，复溶即得。

根据实施例1和对比例1获得的纳米材料，检测CuCaP@DTC纳米粒物理化学性质和药学特性，具体包括微观形态、粒径、体外细胞毒性、调控Ca²⁺水平性能、调控ATP水平性能、体内抗肿瘤效果，其中以实施例1得到的相关材料做具体阐述。

实验例1

形态：观察CuCaP@DTC纳米粒的形态，形态的检测方法：样品滴加在覆盖碳膜的400目铜网上，置于干燥箱中，待其自然干燥后置于透射电镜Titan G2-F20下观察，其结果如图1所示，图1A为CuCaP@DTC纳米粒的透射电镜图，图1B为CuCaP纳米粒的透射电镜图，从图中可知：本发明的CuCaP@DTC纳米粒(图1A)与铜磷酸钙纳米粒(图1B)的粒子均呈类球形，粒径约100nm，而CuCaP@DTC纳米粒具有明显的壳层结构，证明CuCaP外表面有效结合了DTC。

实验例2

粒径检测：检测CuCaP@DTC纳米粒的粒径，测量方法为：取样品溶液置于MarlvenNano ZS仪器，采用动态光散射法检测粒径，测定池温度设定为25℃，每个样品平行操作3份，其结果如图2所示。从图2的结果可知：CuCaP@DTC纳米粒的水合粒径约240nm，粒径均一，分散性好。

实验例3

紫外吸收扫描：考察CuCaP@DTC的紫外吸收，测量方法为：取样品溶液稀释10倍，采用紫外-可见光吸收光谱仪扫描样品200～800nm波长范围内的紫外吸收，其结果如图3A所示；将CuCaP@DTC置于pH 5.5PBS中，再加入乙醇复溶生成的沉淀，过滤用高效液相进样(流动相：乙腈：水＝70:30；443nm；进样量：20μL)检测生成的CuET，并与CuET标准品比较峰形和出峰时间，其结果如图3B所示。从图3的结果可知：CuCaP@DTC纳米粒表面在弱酸性环境下有CuET较明显特征吸收峰，说明CuCaP@DTC纳米粒能够响应弱酸性环境释放出铜离子和钙离子，生成CuET。

实验例4

考察CuCaP@DTC纳米粒的体外抗肿瘤效果，实验步骤如下：

取胰酶消化对数生长的MDA-MB-231细胞，用含10％ FBS的DMEM培养基稀释成密度为5×10⁴个/mL的细胞悬液，以每孔100μL接种于96孔培养板中。在二氧化碳培养箱内(37℃、 5％CO₂、饱和湿度)培养12h后移弃培养液。

每孔加入100μL用培养基稀释至不同浓度的CuCaP@DTC纳米粒、CuCaP纳米粒和CaP纳米粒，以及游离DTC和CuET(浓度以CuET计，分别为18、45、90、180、450ng/mL)，同一浓度做6个复孔，孵育24h后吸弃培养液，PBS润洗3次。

每孔加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL)，孵育4h后吸弃上清。

每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振摇10min使结晶溶解完全，用酶标仪测定各孔在490nm波长处的吸光值(OD)。

其检测结果如图4所示，图4A为CuCaP@DTC纳米粒、CuCaP纳米粒和CaP纳米粒与细胞孵育24h后，用MTT法测定的细胞存活率结果；图4B为游离DTC和CuET与细胞孵育24h后，用MTT法测定的细胞存活率结果。从图4结果可以看出，CuCaP@DTC纳米粒和CuET对细胞有浓度依赖性的细胞毒性，在相同剂量下，CuCaP@DTC纳米粒的毒性强于 CuET。

实验例5

考察CuCaP@DTC纳米粒调控细胞内钙离子水平效果，实验步骤如下：

取胰酶消化对数生长的MDA-MB-231细胞，用含10％ FBS的DMEM培养基稀释成密度为2×10⁵个/mL的细胞悬液，以每孔2mL接种于6孔培养板中。在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO₂、饱和湿度)培养12h后移弃培养液。每孔加入2mL用培养基稀释至一定浓度的(浓度以CuET计，为0.5μg/mL)。孵育12h后，吸弃上清并收集细胞，加入钙离子荧光探针孵育30min，随后用流式细胞仪检测。

其检测结果如图5所示，图5为CuCaP@DTC纳米粒与MDA-MB-231细胞孵育12h后，细胞内钙离子水平测定结果。从图中可以看出， CuCaP@DTC纳米粒、CuCaP纳米粒、CaP纳米粒和CuET对均可增加细胞内钙离子水平，在相同剂量下，CuCaP@DTC纳米粒的升高钙离子水平最高。其原因主要是：CuCaP@DTC纳米粒通过响应肿瘤细胞溶酶体弱酸性微环境，纳米粒快速被降解，释放出大量Ca²⁺，降解后铜离子可与DTC结合生成配合物CuET，CuET可诱导内质网应激，导致大量Ca²⁺从内质网释放到细胞质中。这种外源Ca²⁺的大量引入和胞内Ca²⁺的大量释放可高效诱导胞内Ca²⁺过载。

实验例6

考察CuCaP@DTC纳米粒的调控细胞内ATP水平效果，实验步骤如下：

取胰酶消化对数生长的MDA-MB-231细胞，用含10％ FBS的DMEM培养基稀释成密度为2×10⁵个/mL的细胞悬液，以每孔2mL接种于6孔培养板中。在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO₂、饱和湿度)培养12h后移弃培养液。每孔加入2mL用培养基稀释至一定浓度的CuCaP@DTC纳米粒、CuCaP纳米粒和CaP纳米粒，以及游离DTC和CuET(浓度以CuET 计，为0.5μg/mL)。孵育12h后，吸弃上清并收集细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，随后离心收集上清，加入ATP检测试剂盒检测含量。

其检测结果如图6所示，图6为CuCaP@DTC纳米粒与MDA-MB-231细胞孵育12h后，细胞内ATP水平测定结果。从图中可以看出， CuCaP@DTC纳米粒、CuCaP纳米粒、CaP纳米粒和CuET对均可降低细胞内ATP水平，在相同剂量下，二硫卡钠/铜磷酸钙纳米粒的降低ATP水平最明显。这也进一步证明了实验例6 中CuCaP@DTC纳米粒能够高效诱导胞内Ca²⁺过载，胞内Ca²⁺过载进一步导致ATP水平下降。

实验例7

考察CuCaP@DTC纳米粒的体内抗肿瘤效果，实验步骤如下：

收集对数生长的MDA-MB-231细胞，以300万/只的接种数量注射于雌性裸鼠皮下，待肿瘤生长至100mm³时(肿瘤体积＝长×宽²/2)，将小鼠平均分为6组，每组6只。具体分组为 CuCaP@DTC纳米粒、CuCaP纳米粒和CaP纳米粒，以及游离DTC、CuET以及PBS(对照) 组。每三天进行尾静脉注射药物，共给药四次，给药剂量以CuET计为0.3mg/kg。每两天记录小鼠肿瘤体积，给药第16天后处死小鼠，取出肿瘤拍照。

其结果如图7所示，与对照组相比，其他五组均有一定的肿瘤抑制效果，其中CuCaP@DTC 纳米粒治疗后肿瘤体积最小抑瘤效果最佳。其原因主要是CuCaP@DTC纳米粒中的铜离子和 DTC在肿瘤细胞处结合生成配合物CuET，CuET本身能够肿瘤细胞具有一定的杀伤作用，且能与诱导肿瘤细胞内Ca²⁺过载形成协同配合作用，进一步提高对于肿瘤细胞的杀伤能力。

实验例8

考察CuCaP@DTC纳米粒的体内安全性，实验步骤如下：

收集实验例7各组小鼠的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)，用多聚甲醛固定过夜，随后进行包埋、切片、染色，最后再光学显微镜下采集图像。

其结果如图8所示，与对照组相比，其他五组的器官切片无明显病理学变化，表明CuCaP@DTC纳米粒在治疗期间内未引起明显的毒副作用，具有较高的安全性。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒，其特征在于，包括铜磷酸钙纳米粒和二硫卡钠，所述铜磷酸钙纳米粒由人血清蛋白调控钙离子在DMEM培养基中经生物矿化制得，所述铜磷酸钙纳米粒在生物矿化过程中包载铜离子，所述二硫卡钠吸附于所述铜磷酸钙纳米粒表面，所述二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒诱导细胞中钙离子过载，所述磷酸钙纳米粒的制备方法为以下步骤：

S1、将人血清白蛋白，氯化铜溶于DMEM培养基中，细胞培养箱孵育；

S2、将氯化钙加入步骤S1中孵育后的溶液，细胞培养箱继续孵育，离心收集沉淀，得到铜磷酸钙纳米粒；

S3、将步骤S2得到的铜磷酸钙纳米粒复溶，加入二硫卡钠溶液混合，离心收集得到二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒；

所述氯化钙、氯化铜和二硫卡钠的摩尔比为80~100:5~8:5。

2.根据权利要求1所述的二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒，其特征在于，所述二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒呈类球形，水合粒径为200~240nm。

3.根据权利要求1所述的二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒，其特征在于，所述步骤S1中反应时间为1~2 h。

4.根据权利要求1所述的二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒，其特征在于，所述步骤S2中反应时间为18~30 h。

5.一种如权利要求1~4任一项所述的二硫卡钠-铜磷酸钙纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。