CN110251692B - 一种诊疗一体化纳米材料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诊疗一体化纳米材料及其制备方法和应用。所述制备方法包括：在水中加入多巴、丝胶蛋白和KMnO₄，反应聚合形成所述的纳米材料。本发明通过两种氧化反应自组装形成高效的纳米造影剂，具有弛豫效率高、生物相容性好等优点；本发明制备的纳米材料在近红外区域的光热转化效率较高，可作为光热治疗剂应用于光热治疗中，同时可通过磁共振技术监测肿瘤组织的位置、大小及光热治疗剂在其中的富集情况，用于评价治疗效果。

Description

一种诊疗一体化纳米材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及磁共振成像介导的光热治疗诊疗一体化领域，特别是涉及一种诊疗一体化纳米材料及其制备方法与应用。

背景技术

光热治疗(PTT)是一种新型的肿瘤治疗方式，利用光热治疗剂吸收近红外光，将光能转化为热能，使肿瘤组织部位温度升高，从而诱导细胞凋亡，达到抑瘤目的。光热治疗剂是具有较高光热转换效率的材料，金纳米颗粒、碳纳米材料、硫化铜纳米颗粒以及一些有机纳米颗粒都可作为光热治疗剂用于肿瘤光热治疗。为避免组织中的血液、水分和蛋白质等的影响，降低组织穿透性，减少对正常组织的损伤，光热治疗剂的理想光吸收范围应在近红外光区域(650-950nm)。光热治疗需要整个肿瘤组织有效地暴露在光照下，但无法确定肿瘤组织的位置、大小及光热治疗剂在其中的富集情况及检测治疗效果，从而使PTT的应用受到限制。成像技术可以提供肿瘤组织的位置、大小等可用信息，确定光热治疗剂在肿瘤组织的富集情况，评价治疗效果。因此，将光热治疗和成像技术有机结合在一起有益于肿瘤的治疗。

在现有的成像技术中，磁共振成像(MRI)具有高分辨率、无电离辐射、非侵入性等优点，广泛应用于临床成像诊断中，使用造影剂(Contrast agents，CAs)可进一步增强信号对比度和提高软组织图像的分辨率，极大地扩展了MRI的应用，使可视化获得肿瘤信息成为可能。造影剂一般为顺磁性钆或锰造影剂。钆造影剂如二乙三胺五乙酸钆(Gd-DTPA)，锰造影剂如锰(Ⅱ)-N,N-乙二胺吡哆-N,N-双乙酸盐-5,5-双磷酸(MnDPDP)，都是小分子造影剂，易经肾脏代谢后迅速排除，在体内留存时间很短。小分子钆造影剂大多弛豫率较低、对比度低、具有肾纤维化等毒副作用，而由于锰的内源性，锰造影剂具有较高的生物相容性。所以，进一步开发高弛豫率、高对比度、高生物安全性且能在血液中相对长时间内保持稳定浓度的纳米大分子锰造影剂具有很好的临床医用前景。

因此，开发一种既可以用作光热治疗剂又可以用作造影剂的新型材料，即满足上述的光热治疗及成像诊疗一体化的目的，是本领域技术人员需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种诊疗一体化纳米材料的制备方法，该制备方法制备的纳米材料具有较高的弛豫率、较高的光热转化效率，可以将其应用于光热治疗和磁共振成像，以实现肿瘤的诊疗一体化。

一种肿瘤诊疗一体化用纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

在水中加入多巴、丝胶蛋白和KMnO₄，反应聚合形成所述诊疗一体化纳米材料。

所述多巴、丝胶蛋白、KMnO₄的投料质量比为10/3～20/3∶10/3～20/3∶1。当多巴、丝胶蛋白与KMnO₄的质量比为5∶5∶1时，所获纳米材料的粒径最好。

反应体系中多巴的添加量为每105mL水中加入100～200mg。

反应体系中丝胶蛋白的添加量为每105mL水中加入100～200mg。

反应体系中KMnO₄的添加量为每105mL水中加入20～30mg。

所述的制备方法，先将多巴和丝胶蛋白溶解在部分水中制成混合溶液，然后将KMnO₄溶解在剩余的水中制成KMnO₄溶液，将KMnO₄溶液滴加到混合溶液中进行反应。将KMnO₄溶解缓慢滴加进去，有利于形成均匀的纳米颗粒。

反应温度没有特殊要求，一般在室温下进行即可，比如，室温20～24℃。

所述的制备方法，反应时间为1～4h。反应结束后，用透析膜截留所述纳米材料，再用超滤管离心浓缩得到相应浓度的纳米材料。

本发明的制备方法中，多巴和丝胶蛋白与KMnO₄之间发生氧化还原反应。KMnO₄能同时氧化多巴和丝胶蛋白，其中多巴被氧化成活性更高的醌，聚合形成醌类聚合物；KMnO₄还原形成MnO₂颗粒。在反应体系中，丝胶蛋白、醌类聚合物、MnO₂颗粒自组装形成球状纳米材料。

本发明通过简单方便的一锅法将MnO₂颗粒同时嵌在丝胶蛋白和醌类聚合物中以制备纳米锰造影剂，通过调节多巴、丝胶蛋白、KMnO₄的浓度，得到粒径范围为90～130nm的球状纳米颗粒，弛豫率可达61.94mM^-1s^-1，远高于普通钆或锰造影剂的弛豫率，具有更好的造影效果，并且可以通过纳米大分子造影剂的EPR效应富集在肿瘤组织中，提高MRI的灵敏度，提升早期癌症的诊断水平。

作为优选，所述多巴为DL-多巴，分子式：C₉H₁₁NO₄，分子量：197.19，CAS号：63-84-3，结构式如式(Ⅰ)所示：

本发明又提供了所述制备方法制备的肿瘤诊疗一体化用纳米材料。

本发明还提供了所述的诊疗一体化纳米材料在制备磁共振成像造影剂和/或光热治疗剂中的应用。本发明制备的纳米材料在波长为650～950nm的近红外区域具有一定量的吸收，研究发现，将本发明的纳米材料作用到肿瘤细胞中，在近红外光照条件下，能够显著抑制肿瘤细胞的增殖，因此，可以将其作为光热治疗剂。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明通过两种氧化反应，自组装形成高效的纳米大分子造影剂，具有弛豫效率高、生物相容性好等优点；

(2)本发明制备的纳米材料在近红外区域的光热转化效率较高，可作为光热治疗剂应用于光热治疗中，同时可通过磁共振技术监测肿瘤组织的位置、大小及光热治疗剂在其中的富集情况，用于评价治疗效果。

附图说明

图1为实施例1制备纳米材料在水中的动态光散射图。

图2为实施例1制备纳米材料电镜图。

图3为实施例1制备纳米材料磁共振造影剂弛豫率与锰浓度的关系图。

图4为实施例1制备纳米材料各个浓度体外磁共振成像图，其中，从1～5各点分别为锰浓度0mM、0.025mM、0.05mM、0.075mM、0.1mM浓度下纳米材料水溶液的造影。

图5为实施例1制备纳米材料在近红外区的吸收图。

图6为在有或无近红外光照下，纳米材料对抗4T1细胞增殖效果图，其中，光照条件为1W/cm²的808nm近红外光照5min。

图7为在无激光照射情况下，实施例1制备纳米材料对抗3T3细胞、Hela细胞增殖效果图。

图8为实施例1制备纳米材料作为磁共振造影剂增强原位乳腺肿瘤磁共振成像图(A)以及信号强度定量图(B)。

图9为实施例1制备纳米材料对抗4T1乳腺癌细胞荷瘤Balb/C小鼠肿瘤的抑制实验中肿瘤生长曲线图。

图10为实施例1制备纳米材料对抗4T1乳腺癌细胞荷瘤Balb/C小鼠肿瘤的抑制实验中Balb/C小鼠体重变化曲线图。

具体实施方式

实施例1

1、纳米材料的制备

(1)在100mL去离子水中加入100mg DL-多巴和100mg丝胶蛋白，混合均匀制成混合溶液；在5mL去离子水中加入20mg KMnO₄制成KMnO₄溶液；将KMnO₄溶液缓慢滴加到混合溶液中，滴加过程大约1～2min，滴加完成后，继续反应，反应时间1～4h。

(2)透析(截留分子量Mw＝3500Da)24～48h。

(3)超滤离心浓缩，得到相应浓度的纳米材料。

2、纳米材料的性能分析

如图1所示，取200μL所述纳米材料于比色皿中，用动态光散射仪测得所述纳米材料的平均粒径是100nm，分布系数PDI为0.026。

如图2所示，取适量的所述纳米材料滴加至铜网上，风干制备成透射电镜检测样品，并用透射电镜观察到所述纳米材料的形状为球形，粒径为100nm，与动态光散射仪测得的粒径结果相符。

如图3所示，称取冷冻干燥后的所述纳米材料3.5mg，用浓硝酸加热消化完全，烘干除净浓硝酸后，定容到10mL 1％(v/v)硝酸溶液中，取100μL稀释1000倍，用电感耦合等离子体质谱测得该稀释液中锰浓度为0.015ppb，由此算得所述纳米材料的锰含量为0.015ppb×1000×10mL/3.5mg＝4％。分别配制锰浓度为0mM,0.05mM，0.1mM，0.15mM，0.20mM的所述纳米材料，用0.52T核磁共振仪测得不同锰浓度所对应的弛豫时间，1/弛豫时间(y)与锰浓度(x)成线性关系，所得函数为y＝61.94x+0.5982，斜率61.94mM^-1s^-1即为弛豫率R₁值。

如图4所示，分别配制锰浓度为0mM，0.025mM，0.05mM，0.075mM，0.1mM的所述纳米材料，用3T磁共振成像仪测得所述纳米材料的体外造影效果。由图可知，水的信号值非常弱，图像很暗淡，而纳米材料用作造影剂时的图像更亮，具有更优越的成像效率。

如图5所示，分别配制纳米颗粒浓度为0.125mg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL的所述纳米材料，各取100μL于比色皿中，用酶标仪测得所述纳米材料在200～1000nm范围内的吸收值，其中，所述纳米材料在近红外区有很强的吸收且呈浓度依耐性。

如图6所示，在96孔板中分别加入4T1细胞悬浮液，在5％CO₂浓度和95％湿度的37℃恒温培养箱中培养24小时后，按不同最终所述纳米材料浓度为0.6μg/mL，1.5μg/mL，3μg/mL，6μg/mL，12μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL分别加入所述纳米材料，药物作用24h。然后，以波长为808nm，强度为1W/cm²的激光每孔照射5min。激光照射后，继续培养24h。此后，1200rpm离心3min，吸去培养液，每孔加入100μL浓度为0.75mg/mL的MTT培养基培养3h，最后3500rpm离心5min，小心吸去培养液，每孔加入100μL DMSO，振荡5min使紫色固体全部溶解，利用酶标仪读取各个浓度下的吸光值，由吸光值算得的细胞存活率与纳米材料浓度的关系作图。由图可知，细胞存活率随纳米材料浓度的增加而降低，激光照射后，较高浓度下(≥12μg/mL)的细胞存活率迅速下降，说明该纳米材料有作为光热治疗剂的潜力。

如图7所示，在96孔板中各自分别加入Hela和3T3细胞悬浮液，在5％CO₂浓度和95％湿度的37℃恒温培养箱中培养24小时后，按不同最终所述纳米材料浓度为0.6μg/mL，1.5μg/mL，3μg/mL，6μg/mL，12μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL分别加入所述纳米材料，药物作用24h。此后，1200rpm离心3min，吸去培养液，每孔加入100μL浓度为0.75mg/mL的MTT培养基培养3h，最后3500rpm离心5min，小心吸去培养液，每孔加入100μL DMSO，振荡5min使紫色固体全部溶解，利用酶标仪读取各个浓度下的吸光值，由吸光值算得的细胞存活率与纳米材料浓度的关系作图。由图可知，两种细胞存活率在纳米材料浓度低于70μg/mL时均大于90％，说明该纳米材料对细胞的增殖能力没有显著的影响，证明纳米材料本身细胞毒性很低。

如图8所示，接种4T1肿瘤的雌性Balb/C小鼠待肿瘤长至100mm³左右时，尾静脉注射200μL锰浓度为0.04mmol/kg的所述纳米材料，用3T磁共振成像仪测得所述纳米材料的体内造影效果。(A)纳米材料作为磁共振造影剂增强原位乳腺肿瘤磁共振成像图。实验表明，与正常组织相比，肿瘤部位显示出明显的对比强度和持久的造影时间窗口。(B)信号强度定量图。实验表明，肿瘤环的信号强度在60min时到达峰值，能够为原位乳腺肿瘤提供更加清晰和准确的诊断窗口。

如图9所示，20只接种了4T1肿瘤的雌性Balb/C小鼠待肿瘤体积长至50mm³左右时，随机分为四组，分别是(1)仅注射200μL PBS组；(2)仅给药组，即仅尾静脉注射200μL锰浓度为0.04mmol/kg的所述纳米材料；(3)仅给光组，光照条件为1W/cm²的808nm激光照射5min；(4)给药+给光组，即尾静脉注射200μL锰浓度为0.04mmol/kg的所述纳米材料，同时用1W/cm²的808nm激光照射5min。对四组分别进行对应的治疗，每隔一天测量肿瘤体积与记录小鼠体重。治疗一次后，三个对照组(PBS组，给光组，给药组)的肿瘤均表现出了相同的肿瘤生长速度，说明仅是药物或者光照本身，并不能遏制肿瘤的生长。实验组(给药+给光)的肿瘤在激光照射后消失了，在接下来的17天里没有复发，说明该纳米材料可以作为光热治疗剂应用于肿瘤的光热治疗。

如图10所示，四个组的小鼠体重在治疗期间(17天)均没有显著性变化，说明纳米颗粒对小鼠并没有显著性毒性，生物安全性高。

实施例2

根据表1的反应条件制备纳米材料，工艺流程参照实施例1制得的纳米材料粒径见表1。

表1

由表1可知，当DL-多巴、丝胶蛋白与KMnO₄的质量比为5∶5∶1时，所获纳米材料的粒径最好。当KMnO₄的浓度为30mg/105mL，纳米材料的粒径分布过宽过大，过大的纳米颗粒无法经EPR效应富集在肿瘤组织附近，且容易被网状内皮系统截留，使造影和光热治疗效果下降。

Claims (7)

1.一种诊疗一体化纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在水中加入多巴、丝胶蛋白和KMnO₄，反应聚合形成所述诊疗一体化纳米材料，

所述多巴、丝胶蛋白、KMnO₄的投料质量比为10/3～20/3∶10/3～20/3∶1，

先将多巴和丝胶蛋白溶解在部分水中制成混合溶液，然后将KMnO₄溶解在剩余的水中制成KMnO₄溶液，将KMnO₄溶液滴加到混合溶液中进行反应。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反应体系中多巴的添加量为每105mL水中加入100～200mg。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反应体系中丝胶蛋白的添加量为每105mL水中加入100～200mg。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反应体系中KMnO₄的添加量为每105mL水中加入20～30mg。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反应时间为1～4h。

6.如权利要求1～5任一所述制备方法制备的诊疗一体化纳米材料。

7.如权利要求6所述的诊疗一体化纳米材料在制备磁共振成像造影剂和/或光热治疗剂中的应用。

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