CN111973741B - pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗及制备方法和应用，涉及治疗性疫苗技术领域，本发明的发明人设计了一个纳米平台，以介孔二氧化硅纳米粒子作为载体，共载光热治疗剂多巴胺和巯基化的抗原用于光热联合免疫治疗肿瘤。通过本发明提供的制备方法，获得pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗，其抗原的包封率高达92.20％。同时，该制备方法工艺简单、操作方便，无需昂贵仪器或高端技术人员即可实现，成本较低，适合推广应用。

Description

pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性 疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及治疗性疫苗技术领域，尤其是涉及一种pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗及制备方法和应用。
背景技术
癌症由于发病率和死亡率高仍然是一个亟待解决的世界性问题。因此，发展有效的能够消除实体肿瘤和转移性肿瘤同时防止肿瘤复发的癌症疗法是当务之急。癌症免疫疗法已经彻底改变了癌症疗法，并被认为是一种有效的临床疗法，它通过激活细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，分泌IFN-γ和抑制免疫抑制调节性T细胞(Tregs)达到攻击和消除所有肿瘤细胞、产生增强的免疫记忆和防止肿瘤复发的目标。特别是，癌症疫苗已成为癌症免疫治疗的一种有希望的方法。近年来，光热疗法(PTT) 在消融局部肿瘤方面越来越受到重视，其优点是最大限度地减少对非靶目标组织的损伤和低侵入性。 PTT通过局部应用光敏剂和近红外(NIR)激光照射来诱导肿瘤的消融。然而，PTT的作用范围仅限于局部肿瘤并在边缘有残余肿瘤。此外，PTT无法到达体内的转移性肿瘤，这使得完全消除肿瘤变得困难。单次治疗后肿瘤复发和转移的发生率仍然很高。因此，旨在提高抗肿瘤疗效的协同策略得到了广泛的研究，特别是PTT与免疫治疗相结合。
目前，虽然对疫苗联合PTT治疗肿瘤的重视有所增加，但仍存在一些问题，如：1)需要多次免疫；2)即使联合抗体治疗，疗效也较差。因此急需构建一种简单的疫苗载体。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗及制备方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明提供了一种pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗的制备方法，包括将碳酸氢铵加载到介孔二氧化硅纳米粒子的孔道中，然后在所述介孔二氧化硅纳米粒子表面包被多巴胺膜，最后将巯基化的抗原与所述多巴胺膜结合，得到所述pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗。
本发明的发明人设计了一个纳米平台，以介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)作为载体，共载光热治疗剂多巴胺(PDA)和巯基化的抗原用于光热联合免疫治疗肿瘤。通过本发明提供的制备方法，获得pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗MSNs-ABC@PDA-抗原，其抗原的包封率高达92.20％。同时，该制备方法工艺简单、操作方便，无需昂贵仪器或高端技术人员即可实现，成本较低，适合推广应用。
在本发明提供的制备方法所用的原料中，介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)提供了一个具有生物相容性的多功能平台，其具有表面积大、孔径大、孔隙度高、药物包载/释放特性好、表面改性简单等优点。
多巴胺(PDA)首先对身体是安全的，具有优异的生物相容性和生物降解性。第二，PDA的制备过程很简单，在室温下于弱碱性条件下(pH 8.0～8.5)通过自发氧化和自聚合即可反应形成。第三， PDA易于修改并粘附于MSNs的表面。第四，在近红外光照射下能够表现出出色的光热转换效率。第五，PDA通过迈克尔加成反应，能够将巯基化的抗原连接到纳米粒膜上。
碳酸氢铵(ABC，NH4HCO3)可以通过热刺激和/或酸性刺激触发产生无毒的二氧化碳(CO2) 和氨(NH3)气体。材料中封装的ABC通过与树突状细胞(DCs)溶酶体和内体(pH 6.5和5.0)中的H+反应能够促进包载的抗原释放，使抗原可以从溶酶体逃逸进入细胞质中并被交叉提呈，进一步诱导机体产生强大的免疫应答。
进一步的，取介孔硅纳米粒子置于碳酸氢铵溶液中，超声得到纳米粒溶液，固液分离后收集沉淀，得到孔道中加载有碳酸氢铵的介孔二氧化硅纳米粒子；
优选地，在冰浴条件下进行超声；
优选地，得到纳米粒溶液后继续震荡孵育过夜，然后固液分离后收集沉淀；
优选地，通过离心进行固液分离。
通过对加载条件进行进一步优化，能够使得碳酸氢铵的加载效率更高，反应更完全。
进一步的，向孔道中加载有碳酸氢铵的介孔二氧化硅纳米粒子中加入盐酸多巴胺的Tris-HCl溶液，反应后固液分离收集沉淀，实现在所述介孔二氧化硅纳米粒子表面包被多巴胺膜；
优选地，在避光条件下反应；
优选地，通过离心进行固液分离。
通过引入Tris-HCl溶液能够使盐酸多巴胺在弱碱性条件下发生氧化和自聚合反应，从而实现在介孔二氧化硅纳米粒子表面包被一层PDA膜层。
进一步的，向表面包被有多巴胺膜的介孔二氧化硅纳米粒子中加入巯基化的抗原和硫醇类还原剂，反应后固液分离收集沉淀，得到所述pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗；
优选地，所述硫醇类还原剂包括TCEP；
优选地，通过离心进行固液分离。
在一些优选的实施方式中，将抗原与Traut’s试剂反应，然后经Zeba脱盐离心柱过滤，得到巯基化的抗原；
优选地，所述抗原包括蛋白抗原、多肽抗原或糖肽抗原；
可选地，所述抗原包括乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒、肿瘤相关抗原等中的一种或多种的混合物；
优选地，所述抗原包括模型抗原卵清蛋白。
卵清蛋白原料易得，通过常规市售即可购买得到，且其研发成熟度高，在体内可以引起强大的免疫效应。
具体地，pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗的制备方法包括如下步骤：
S1：称取介孔硅纳米粒子于碳酸氢铵溶液中，在冰浴条件下超声得到纳米粒溶液，继续震荡孵育过夜，然后离心收集沉淀；
S2：将S1收集的沉淀重悬后，加入盐酸多巴胺的Tris-HCl溶液，避光条件下继续反应，再次离心收集沉淀；
S3：将抗原与Traut’s试剂反应，然后经Zeba脱盐离心柱过滤，得到巯基化的抗原溶液；
S4：S2步骤中的沉淀重悬后，加入S3步骤中的巯基化抗原溶液和TCEP，避光条件下继续反应，离心收集沉淀，得到pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗。
进一步的，S1中，介孔硅纳米粒子的质量为25mg，碳酸氢铵溶液的浓度为2M，介孔硅纳米粒子的质量和碳酸氢铵溶液的体积的比值为5mg：1mL；
优选地，超声用3mm探头，功率为30％，超声时间为5min，其中每超声5s停3s；
优选地，孵育条件为4℃，时间大于10h；
优选地，离心转速为15000rpm，时间为10min；
优选地，收集沉淀后还包括用去离子水洗涤两次的步骤。
进一步的，S2中，盐酸多巴胺与介孔硅纳米粒子的质量比为1：1，Tris-HCl溶液浓度为10mM， pH为8.0～8.5，优选为8.5；
优选地，反应时间大于6h；
优选地，离心转速为15000rpm，时间为10min；
优选地，收集沉淀后还包括用去离子水洗涤两次的步骤；
进一步的，S3中，抗原溶液中抗原的浓度为1mg/mL；
优选地，反应液为5mL含5mM EDTA的PBS缓冲液，Traut’s试剂与抗原的摩尔比大于25，震荡反应时间为1h；
进一步的，S4中，巯基化抗原与TCEP的质量比为5：2；
优选地，避光条件下震荡6h以上反应；
优选地，离心转速为15000rpm，时间为10min；
优选地，收集沉淀后还包括用去离子水洗涤两次的步骤。
根据本发明的第二个方面，还提供了应用上述的制备方法制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗。
另外，本发明还提供了上述的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述抗肿瘤药物包括抗肿瘤光热-免疫疗法药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所设计的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗的制备方，可有效包载抗原，具有较高包封率，可保护游离抗原，克服其在体内不稳定和易被清除的缺点。
(2)采用本发明提供的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗，在 808nm激光照射下，可以发挥光热治疗的功能，消除大部分的原位肿瘤。该疫苗不仅可以保证抗原被有效摄取，还可以实现溶酶体逃逸，提高交叉提呈水平，有效诱导DCs活化和成熟。皮下注射该疫苗后，可有效向次级淋巴结迁移，具有强大的激活CD8+T细胞和CD4+T细胞能力，产生强有力的T细胞杀伤效应，对肿瘤有良好免疫治疗效果。最终达到光热联合免疫治疗消除所有肿瘤的目的。
(3)本发明提供的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗，可以有效积累免疫记忆细胞，防止肿瘤的复发和肺转移。
(4)本发明提供的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗，只需给药治疗一次即可达到消除所有肿瘤并预防肿瘤的复发和转移，无需添加昂贵的抗体治疗。
(5)本发明提供的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗可以长时间保存，且制备过程简单，成本较低，易于冷冻干燥保存。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)的表征图；
图2为本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)对肿瘤细胞的光热毒性、对DCs的抗原摄取、活性影响和抗原提呈结果图；
图3为BMDCs用本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)体外刺激后的活化与成熟结果图；
图4为BMDCs用本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)的Transwell评价结果图；
图5为本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)在体内的迁移结果图；
图6为小鼠经本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)治疗后的温度升高和淋巴结中DCs成熟的结果图；
图7为小鼠经本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)治疗后在体内诱导抗原特异性CTLs和Ths产生的结果图；
图8为小鼠经本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)治疗后诱导抗原特异性CTLs和Ths增殖、抗原提呈和活化的结果图；
图9小鼠经本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)治疗后诱导Tregs产生和抗原特异性CTLs与Ths分泌IFN- γ的结果图；
图10为小鼠经本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)治疗后的抗肿瘤药效及肿瘤再攻击结果图；
图11为小鼠经本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)治疗后的免疫记忆和抗肺转移结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
实施例1
本实施例提供了一种pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗，制备方法包括步骤：
S1：称取25mg介孔硅纳米粒子(MSNs)于5mL 2M的碳酸氢铵溶液中，在冰浴条件下，用 3mm探头、功率为30％的超声波细胞破碎仪超声5min(超声5s停3s)，得到纳米粒溶液，继续置于4℃震荡孵育过夜(＞10h)，然后15000rpm离心10min，并用去离子水洗涤两次，收集沉淀。
S2：上述沉淀用1mL Tris-HCl溶液(10mM，pH 8.5)重悬，然后在震荡条件下，加入4mL 含25mg盐酸多巴胺的Tris-HCl溶液(10mM，pH 8.5)，避光条件下继续震荡6h以上，再15000 rpm离心10min，并用去离子水洗涤两次，收集沉淀。
S3：将5mg OVA溶解于5mL含5mM EDTA的PBS(0.1M，pH 8.0)中，然后加入25倍摩尔过量的Traut’s试剂，在室温下震荡反应1h，反应完成后溶液经Zeba脱盐离心柱过滤，即得到巯基化的OVA溶液。
S4：S2步骤中的沉淀用1mL Tris-HCl溶液(10mM，pH 8.5)重悬，然后在震荡条件下，加入S3步骤中的巯基化OVA溶液和2mg TCEP，避光条件下继续震荡6h以上，再15000rpm离心 10min，并用去离子水洗涤两次，收集沉淀，得到pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)。
对比例1
本对比例提供了一种pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗，制备方法包括步骤：
称取25mg介孔硅纳米粒子(MSNs)加入1mL Tris-HCl溶液(10mM，pH 8.5)，然后在震荡条件下，加入4mL含25mg盐酸多巴胺的Tris-HCl溶液(10mM，pH 8.5)，避光条件下继续震荡 6h以上，再15000rpm离心10min，并用去离子水洗涤两次，收集沉淀，得到包载光敏剂的介孔硅纳米粒(MSNs@PDA)。
对比例2
本对比例提供了一种pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗，制备方法包括步骤：
S1：称取25mg介孔硅纳米粒子(MSNs)于5mL 2M的碳酸氢铵溶液中，在冰浴条件下，用 3mm探头、功率为30％的超声波细胞破碎仪超声5min(超声5s停3s)，得到纳米粒溶液，继续置于4℃震荡孵育过夜(＞10h)，然后15000rpm离心10min，并用去离子水洗涤两次，收集沉淀。
S2：上述沉淀用1mL Tris-HCl溶液(10mM，pH 8.5)重悬，然后在震荡条件下，加入4mL 含25mg盐酸多巴胺的Tris-HCl溶液(10mM，pH 8.5)，避光条件下继续震荡6h以上，再15000 rpm离心10min，并用去离子水洗涤两次，收集沉淀，得到pH响应型包载光敏剂的介孔硅纳米粒 (MSNs-ABC@PDA)。
对比例3
本对比例提供了一种pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗，制备方法包括步骤：
S1：称取25mg介孔硅纳米粒子(MSNs)加入1mL Tris-HCl溶液(10mM，pH 8.5)，然后在震荡条件下，加入4mL含25mg盐酸多巴胺的Tris-HCl溶液(10mM，pH 8.5)，避光条件下继续震荡6h以上，再15000rpm离心10min，并用去离子水洗涤两次，收集沉淀。
S2：将5mg OVA溶解于5mL含5mM EDTA的PBS(0.1M，pH 8.0)中，然后加入25倍摩尔过量的Traut’s试剂，在室温下震荡反应1h，反应完成后溶液经Zeba脱盐离心柱过滤，即得到巯基化的OVA溶液。
S3：S1步骤中的沉淀用1mL Tris-HCl溶液(10mM，pH 8.5)重悬，然后在震荡条件下，加入S2步骤中的巯基化OVA溶液和2mg TCEP，避光条件下继续震荡6h以上，再15000rpm离心 10min，并用去离子水洗涤两次，收集沉淀，得到基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs@PDA-OVA)。
为了更好的表征pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗的效果，进行如下实验：
实验例1
1、粒径和电位测定
图1中的a和b分别为MSNs，MSNs@PDA，MSNs-ABC@PDA，MSNs@PDA-OVA和 MSNs-ABC@PDA-OVA的粒径和Zeta电位图；图1中的c为PBS，游离OVA，MSNs-ABC@PDA， MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA在808nm激光(2.5W/cm2，5min)下的温度升高曲线；图1中的d、e和f分别为MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA在激光照射或者无激光照射条件下在pH分别为7.4、6.5和5.0的PBS释放液中的抗原累积释放曲线。
粒径的具体结果见图1中的a，结果表明所制备的基于介孔硅纳米粒的疫苗的平均粒径都在300 nm以下；电位测定的结果见图1中的b，结果表明所制备的基于介孔硅纳米粒的疫苗的具有稳定的负电位值。
2、本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)中模型抗原OVA的包封率
测定OVA的包载量时，需要在巯基化OVA之前，用FITC荧光标记OVA，具体步骤如下：将 10mL 1mg/mL OVA的PBS溶液(50mM，pH 8.0)与1mL 1mg/mL FITC的DMSO溶液混合反应30～60min，然后装入事先沸水处理过的透析袋(分子量8000-14000D)中透析48h以上(每4h换水一次，所有过程均需避光)，再将透析袋中溶液进行冻干，得到FITC-OVA。
其余步骤均与实施例1中相同，收集步骤S4中离心3次后的上清液，用荧光分光光度计测上清中FITC-OVA的荧光强度(激发/发射波长：495/555nm)，根据标准曲线计算介孔硅纳米粒的治疗性疫苗中OVA载药量。
OVA包封率(％)＝(加入模式抗原的总量-上清中游离模式抗原OVA的含量)/加入模式抗原的总量×100％。
结果证明，OVA的投药量是5.0mg，MSNs-ABC@PDA-OVA中OVA包封率是92.20％，表明介孔硅纳米粒的治疗性疫苗有较高的OVA包载能力。
3、本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)体外光热评估实验
研究OVA浓度为25μg/mL时，用808nm激光(2.5W/cm2，5min)照射0.5mL PBS，游离OVA，MSNs-ABC@PDA，MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA的升温情况。
图1中的c是不同样品经激光照射5min内的温度升高曲线，PDA的包载使得疫苗获得光热性能，PBS和游离OVA几乎没有温度升高情况。
4、本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)的体外OVA释放考察
与OVA的包封率测定一样，在体外OVA释放实验中也需要用FITC标记OVA。使用直接离心法评估样品的OVA体外释放。将MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA分散在分别含有5mLpH 7.4、6.5和5.0的PBS的离心管中。对于激光照射组，样品用808nm激光(2.5W/cm2)照射5min，其余操作与非激光照射组相同，每组设置三个平行样品。然后将所有组的离心管放置在恒温振荡器 (120rpm，37℃)中避光震荡，在预定的时间点(0.5、5、12、24、48、72、96和144h)，通过离心(15000rpm，10min)收集上清液，并补充相同体积的新鲜PBS。将获得的上清液在-40℃保存，用荧光分光光度计测量荧光强度，测定并绘制抗原的释放曲线。
释放结果如图1中的d，e，f所示，表明OVA从介孔硅纳米粒中的体外释放呈pH依赖性，pH 越低，OVA的累计释放率越高。在初始释放阶段，24h内OVA的释放速率较快，后续呈缓慢释放趋势。
实验例2
1、本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)对B16-OVA肿瘤细胞的光热毒性检测
将B16-OVA细胞接种到96孔板中(每孔103个细胞)培养过夜，然后吸弃培养基，分别加入 100μL PBS，游离OVA，MSNs-ABC@PDA，MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA(等效 OVA浓度为25μg/mL)的培养基继续培养。孵育2h后，细胞接受不同功率强度的808nm激光照射5min，继续孵育22h后，用PBS洗涤细胞，并加入含20μL MTS的100μL RPMI1640培养液中孵育30min。用酶标仪测定490nm处的吸光度，按照以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率＝(实验组OD值-空白组OD值)/(阴性组OD值-空白组OD值)。
图2中的a为PBS，游离OVA，MSNs-ABC@PDA，MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA 在不同功率的808nm激光照射下，B16-OVA细胞的存活情况图；图2中的b为DC2.4细胞与游离OVA，MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA共培养4h和12h后的抗原摄取图；图2中的c 为BMDCs与游离OVA，MSNs-ABC@PDA，MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA共培养 24h的流式损伤图；图2中的d为BMDCs与游离OVA，MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA 共培养24h后的抗原交叉提呈图。
细胞毒性结果见图2中的a，当没有激光照射时，疫苗对细胞基本没有杀伤作用，而随着激光照射功率的增加，疫苗对细胞的杀伤作用增强。该结果验证疫苗具有良好的生物相容性，在激光照射下会产生较强的光热毒性从而杀伤肿瘤细胞。
2、本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)的摄取评价
将DC2.4细胞(每孔5×105细胞)接种在12孔板中，孵育过夜。再加入游离OVA，MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA到细胞中，使得最终等效OVA-FITC浓度为25μg/mL，分别孵育4h和12h。然后收集细胞并用PBS洗涤两次，通过流式细胞仪定量测定DC2.4细胞摄取OVA-FITC的比例。
流式细胞术结果(图2中的b)表明，游离OVA显示低的抗原摄取效率。与游离OVA相比， MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA显示更高的递送效率。介孔硅纳米粒能显著增强抗原的摄取MSNs-ABC@PDA-OVA与MSNs@PDA-OVA相比显示出更高的细胞摄取效率，表明当包载碳酸氢铵时能更有效促进抗原的内吞。
3、本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)对BMDCs细胞的活性影响
将培养至第6天的BMDCs轻轻吹打，用DC培养基稀释至5×105细胞/mL，接种于12孔板(1 mL/孔)，孵育过夜后，加入PBS、游离OVA、MSNs-ABC@PDA、MSNs@PDA-OVA和 MSNs-ABC@PDA-OVA(最终OVA浓度为25μg/mL)。培养24h后，收集BMDCs，用PBS清洗。然后在4℃下用抗CD11c染色30min，用冷PBS洗涤两次后用100μL Annexin V结合缓冲液中重悬细胞，再加入5μL APC Annexin V和5μL 7-AAD活性染色液并在室温下避光孵育15min。最后，用流式细胞仪检测BMDCs的活性。
图2中的c的结果表明，MSNs-ABC@PDA、MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA与 PBS和游离OVA一样未对BMDCs产生毒性。
4、本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)促进BMDCs交叉提呈实验
BMDCs(每孔5×105个细胞)在12孔板中培养过夜，加入游离OVA、MSNs@PDA-OVA和MSNs-ABC@PDA-OVA(最终OVA浓度25μg/mL)孵育24h。然后收集BMDCs，用PBS冲洗两次，用抗OVA257-264(SIINFEKL)-H-2Kb在37℃孵育2h。用PBS清洗后，BMDCs在4℃下进行抗CD11c染色30min。使用流式细胞仪确定SIINFEKL的比例。
外来抗原经交叉提呈可以激活CD8+T细胞然后产生抗肿瘤免疫反应。图2中的d表明与游离 OVA相比，载OVA的介孔硅纳米粒增加了抗原交叉提呈，说明载OVA的介孔硅纳米粒优于游离 OVA，这可能归因于载OVA的介孔硅纳米粒被DCs的吞噬效率更高。
实验例3
本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗 (MSNs-ABC@PDA-OVA)对DCs的活化和成熟作用。
向培养至第6天的BMDCs中加入游离OVA、MSNs-ABC@PDA、MSNs@PDA-OVA和 MSNs-ABC@PDA-OVA(模式抗原OVA浓度为25μg/mL)，以及加同体积的PBS的对照组，继续在细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养24h后收集上层半贴壁的细胞进行表型分析。将各刺激培养组的DCs收集至1.5mL离心管中，加入PBS洗涤2次，用抗CD11c，抗CD80，抗CD40以及抗 CD86在4℃下孵育30min后，用PBS清洗2次，用0.6mLPBS重悬于流式管中过200目细胞筛，上流式细胞分析仪测定BMDCs表面共刺激因子CD80、CD40和CD86的表达水平。
图3中的a、b和c分别为PBS、游离OVA、MSNs-ABC@PDA、MSNs@PDA-OVA和 MSN-ABC@PDA-OVA与BMDCs共孵育24h后采用流式细胞术测定的BMDCs表面标记分子CD86、 CD40、CD80表达图。
CD80、CD40和CD86是评价基于DCs的免疫反应的重要指标。图3中的a、b和c显示与对照组(PBS和游离OVA)相比，MSNs-ABC@PDA显示微弱的上调。而负载抗原后，MSNs@PDA-OVA和MSN-ABC@PDA-OVA进一步提高了CD80、CD40和CD86的表达。
实验例4
本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗 (MSNs-ABC@PDA-OVA)的体外Transwell实验。
B16-OVA细胞(每孔105个细胞)在Transwell系统的上腔室中培养过夜，并加入PBS、游离 OVA、MSNs-ABC@PDA、MSNs@PDA-OVA和MSN-ABC@PDA-OVA(最终OVA浓度为25μg/mL)。孵育2h后，B16-OVA细胞用2.5W/cm2 808nm激光照射5min。然后，接种BMDCs(每孔5×105个细胞)在该系统的下腔室中并培养24h。收集并用PBS清洗BMDCs,用抗CD11c、抗CD86、抗CD40和抗CD80染色后，通过流式细胞仪检测。
图4中的a、b和c分别为Transwell实验中BMDCs采用流式细胞术测定的BMDCs表面标记分子CD86、CD40、CD80表达图。
光热治疗后的肿瘤残基可作为肿瘤相关抗原来触发免疫反应，进一步增强免疫反应，采用 Transwell系统在体外水平研究这种效应。图4中的a、b和c中PBS+激光，游离OVA+激光和 MSNs-ABC@PDA-OVA，因为温度未升高，显示比MSNs-ABC@PDA+激光，MSNs@PDA-OVA+激光和MSNs-ABC@PDA-OVA+激光组更低的BMDCs成熟水平。结果表明，用 MSNs-ABC@PDA-OVA+激光处理的B16-OVA细胞残留物可以触发有效的DCs成熟水平升高。
实验例5
本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗 (MSNs-ABC@PDA-OVA)在体内的迁移情况检测。
为了可视化疫苗在体内的迁移行为，在C57BL/6雌性小鼠(6-8周)尾根部皮下注射用Cy7标记的游离OVA，MSNs@PDA-OVA和MSN-ABC@PDA-OVA(每只小鼠25μg Cy7-OVA)。激光照射组的小鼠用808nm激光(0.25W/cm2)照射5min。使用CRI Maestro成像系统在不同的时间点(0、 5、10、24、72和120h)观察注射部位的荧光强度和淋巴结迁移。激发/发射波长设置为745/774nm，曝光时间为500ms。注射24h后，每组处死一只小鼠采集淋巴结拍摄荧光图像，然后分离的淋巴结立即在-80℃冷冻，切片后经DAPI染色通过激光共聚焦扫描显微镜观察。
图5为小鼠皮下注射Cy7标记的游离OVA，MSNs@PDA-OVA和MSN-ABC@PDA-OVA后观察注射部位的抗原储库效应和向引流淋巴结的迁移图。图5中的a为注射部位荧光成像；图5中的 b为注射部位OVA抗原的定量荧光强度分析；图5中的c为注射疫苗24h后离体淋巴结的荧光成像；图5中的d为注射疫苗24h后离体淋巴结冰冻切片的激光共聚焦显微镜照片。
疫苗从免疫部位迁移到淋巴结对免疫治疗至关重要。疫苗的活体体内迁移结果如图5中的a和 5中的b所示，游离OVA组在注射24h显示快速的荧光清除；而MSNs-ABC@PDA-OVA+激光处理组注射5h后出现在淋巴结并在72h内维持较强的荧光强度，表明MSNs-ABC@PDA-OVA+激光组的抗原通过淋巴血管逐渐从注射部位迁移到回流淋巴结，从而可有效诱导免疫反应。为了进一步分析，解剖淋巴结并用活体成像系统分析，发现MSNs-ABC@PDA-OVA+激光处理的抗原能够诱导最有效的淋巴结迁移从而产生最强的荧光信号，然而其他组处理的未成熟的DCs只显示较弱的荧光信号(图5中的c)。图5中的d的淋巴结冰冻切片图像也证明了MSNs-ABC@PDA-OVA+激光处理组表现出最强的抗原向淋巴结迁移能力。
实验例6
本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗 (MSNs-ABC@PDA-OVA)的体内抗肿瘤免疫机制研究。
肿瘤模型的建立：在6～8周龄的C57BL/6雌性小鼠的右侧靠近下肢部位皮下注射B16-OVA细胞(每只小鼠8×105个细胞)接种肿瘤。当肿瘤在第0天生长到约75mm3时，将所有小鼠随机分成六组。接下来，对小鼠进行瘤内注射PBS，游离OVA，MSNs-ABC@PDA，MSNs@PDA-OVA， MSNs-ABC@PDA-OVA(每只小鼠25μg OVA)，并用808nm激光照射(0.25W/cm2)处理5min。
PTT触发的体内抗肿瘤机制研究：在第3天，收集淋巴结，染色并使用流式细胞仪分析确定DCs 的成熟水平。同时，切除脾脏和肿瘤，研磨，过滤，与红细胞裂解缓冲液一起孵育2min，并用10 倍体积的PBS洗涤两次。得到的细胞进一步分别用以下抗体染色：1)抗CD3，抗CD4，抗CD8； 2)抗CD4，抗Foxp3；3)抗CD4，抗CD8，抗IFN-γ；4)抗CD4，抗CD8，抗Ki-67；5)抗CD8，抗SIINFEKL-H-2Kb；6)抗CD4，抗CD8，抗CD69并通过流式细胞仪分析。
图6为在小鼠右侧靠近下肢的部位皮下接种B16-OVA细胞后7天后，分别瘤内注射PBS、游离 OVA、MSN-ABC@PDA、MSN@PDA-OVA和MSN-ABC@PDA-OVA，激光组施以0.25W/cm2的808nm激光照射5min。在治疗后的第3天，处死小鼠，收集脾脏和肿瘤组织，制备成细胞悬液以检测免疫机制。图6中的a为实验方案图；图6中的b和c分别为各组经激光照射后的温度升高曲线和最高温度时的红外照片；图6中的d，e，f分别为淋巴结中DCs表达的CD86、CD40、CD80 水平。
图7中的a和b分别为治疗后第3天，小鼠脾细胞中的CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞群分布图；图7中的c和d分别为治疗后第3天，小鼠肿瘤细胞中的CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞群分布图。
图8中的a和b分别为治疗后第3天，CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖图；图8中的c为治疗后第3天，CD8+T细胞交叉提呈抗原图；图8中的d和e分别为治疗后第3天，CD4+T细胞和CD8+ T细胞活化图。
图9中的a和b分别为治疗后第3天，小鼠脾细胞和肿瘤细胞中的调节性T细胞CD4+FOXP3+细胞群分布图；图9中的c和d分别为治疗后第3天，小鼠脾细胞和肿瘤细胞中的调节性T细胞 CD4+FOXP3+比例图；图9中的e和f分别为治疗后第3天，CD4+T细胞和CD8+T细胞的IFN-γ细胞因子的分泌图。其中，(1)是PBS+激光组，(2)是游离OVA+激光组，(3)是MSN-ABC@PDA-OVA 组，(4)是MSN-ABC@PDA+激光组，(5)是MSN@PDA-OVA+激光组，(6)是MSN-ABC@PDA-OVA+ 激光组。
图6中的a为抗肿瘤免疫机制研究的示意图。疫苗在激光照射下的温度升高曲线及达到最高温度时小鼠的红外成像图如图6中的b和c所示，与对照组PBS和游离OVA相比，介孔硅纳米粒组均表现出优良的光热性能，最高温度都能达到53℃，足以抑制肿瘤的增殖并消融细胞。图6中的d， e和f为不同处理组中淋巴结中CD86、CD40和CD80的表达水平，MSNs-ABC@PDA-OVA+激光组表现出最佳效果，与体外Transwell实验的结果一致。
辅助T(Th)淋巴细胞(CD3+CD4+T细胞)在调节免疫系统中至关重要，而细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)(CD3+CD8+T细胞)可以直接杀死肿瘤细胞。通常，Th细胞和CTLs在有效触发免疫应答以实现免疫治疗中起着重要作用。如图6中的a和b所示，与PBS+激光，游离OVA+激光和 MSNs-ABC@PDA-OVA组相比，使用MSNs-ABC@PDA-OVA结合激光处理可诱导产生更多的CD4+ T细胞和CD8+T细胞。同样地，与MSNs-ABC@PDA+激光和MSNs@PDA-OVA+激光组相比，用MSNs-ABC@PDA-OVA+激光治疗组中观察到CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的比例显著增加。结果证实，纳米疫苗联合光热疗法在改善免疫反应方面具有优势。另一方面，基于 MSNs-ABC@PDA-OVA的PTT治疗，肿瘤中浸润的CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的比例明显高于其他对照组(图7中的c和d)。
为了研究Th细胞和CTLs的OVA特异性，在体外用OVA(25μg/mL)对脾细胞进行再刺激，再用Ki-67染色脾细胞后测试Th细胞和CTLs的增殖。MSNs-ABC@PDA-OVA+激光组的CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖比游离OVA+激光组的增殖约高10倍(图8中的a和b)。
通过流式细胞术定量观察OVA特异性CD8+T细胞在脾脏中的频率。MSNs-ABC@PDA-OVA+ 激光组产生了66.5％的OVA特异性CD8+T细胞，远高于PBS+激光(11.9％)，游离OVA+激光 (20.5％)，MSNs-ABC@PDA-OVA(29.4％)和MSNs-ABC@PDA+激光组(31.5％)(图8中的c)。总体而言，数据表明MSNs-ABC@PDA-OVA+激光治疗具有诱发OVA特异性CTLs、杀死B16-OVA黑色素瘤细胞的潜力。
细胞表面早期信号(如CD69)的上调是T细胞激活的标志。基于MSNs-ABC@PDA-OVA的 PTT组中CD4+和CD8+T细胞的激活率显著高于其他组(图8中的d和e)。这些结果表明基于MSNs-ABC@PDA-OVA的PTT可以显着激活CD4+和CD8+T细胞。
调节性T细胞(Tregs，CD4+Foxp3+)是CD4+辅助性T细胞的重要类型，可以抑制抗肿瘤细胞发挥免疫效力来杀死肿瘤。在对照组(PBS+激光，游离OVA+激光和MSNs-ABC@PDA-OVA)中， CD4+T细胞中Tregs的百分比远高于纳米疫苗联合光热治疗组(超过10倍)，并且大多数浸润到肿瘤中的CD4+T细胞是Tregs(图9中的a，b，c和d)。
细胞因子IFN-γ是激活先天免疫力的标志物，其分泌是引起抗肿瘤免疫力的关键机制。活化的 T细胞的关键特征是IFN-γ的分泌增加。除Tregs外的CD4+T细胞的另一种类型是效应T细胞，它能够分泌IFN-γ来刺激其他免疫相关细胞，而CD8+T细胞可以通过释放IFN-γ来攻击肿瘤。在联合治疗组(MSNs@PDA-OVA+激光和MSNs-ABC@PDA-OVA+激光)中，CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌IFN-γ的百分比显著高于其他组。
实验例7
本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗 (MSNs-ABC@PDA-OVA)的体内抗肿瘤效果和肿瘤再攻击实验。
从第0天开始，每两天测量所有小鼠的肿瘤大小和体重。肿瘤体积是根据公式计算的：肿瘤体积＝(长×宽2)/2。当长大于20mm时，小鼠被处死。第31天，肿瘤被消除的小鼠左侧靠近下肢部位用B16-OVA细胞(每只小鼠8×105个细胞)再次接种，并设8只同龄的小鼠作为对照。
图10为在小鼠右侧靠近下肢的部位皮下接种B16-OVA细胞后7天后，分别瘤内注射PBS、游离OVA、MSN-ABC@PDA、MSN@PDA-OVA和MSN-ABC@PDA-OVA，激光组施以0.25W/cm2的808nm激光照射5min。在治疗后的第31天，给治愈的小鼠在左侧靠近下肢的部位皮下接种B16-OVA细胞。图10中的a为实验方案图；图10中的b和c分别为第一次皮下接种B16-OVA细胞后26天内小鼠的肿瘤体积和体重变化曲线；图10中的d为治疗后的70天内各组小鼠的生存率曲线；图10中的e为再次接种B16-OVA细胞后，小鼠的肿瘤发生和体积变化曲线。其中，(0)是不做处理的对照组，(1)是PBS+激光组，(2)是游离OVA+激光组，(3)是MSN-ABC@PDA-OVA组，(4)是MSN-ABC@PDA+激光组，(5)是MSN@PDA-OVA+激光组，(6)是MSN-ABC@PDA-OVA+ 激光组。
图10中的a为本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗(MSNs-ABC@PDA-OVA)抗肿瘤和肿瘤再攻击实验中的方案图。如图10中的b和d 所示，仅使用MSNs-ABC@PDA-OVA治疗的小鼠的肿瘤体积与PBS+激光和游离OVA+激光小鼠的肿瘤体积相似，20天内就全部死亡，而光热治疗小鼠(MSNs-ABC@PDA+激光、MSNs@PDA-OVA+ 激光和MSNs-ABC@PDA-OVA+激光)的肿瘤体积要小得多。用MSNs@PDA-OVA+激光和 MSNs-ABC@PDA-OVA+激光治疗的未治愈小鼠在30天内死亡。在MSNs@PDA-OVA+激光组中，只有三只小鼠的肿瘤被消除。然而，6只经MSN-ABC@PDA-OVA+激光的小鼠被治愈，这些小鼠在70天内没有复发。还对所有组小鼠的重量进行了测量，不同组之间没有显著差异(图10中的c)。为了确定治愈的小鼠是否有特异性抗肿瘤免疫反应，8只未处理的同龄小鼠被设置为对照，并在第 31天接种了B16-OVA细胞。发现对照组的小鼠在接种肿瘤26天内全部死亡，MSNs@PDA-OVA+ 激光组的三只小鼠中，有两只在36天内死亡。令人印象深刻的是，MSNs-ABC@PDA-OVA+激光组的六只小鼠都没有长出肿瘤(图10中的d和e)。这些结果表明，MSNs-ABC@PDA-OVA+PTT治疗诱导抗肿瘤免疫增强，不仅根除了原发性肿瘤，而且防止了再攻击时肿瘤的发生。
实验例8
本发明实施例1制备得到的pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗 (MSNs-ABC@PDA-OVA)的体内免疫记忆效应和抗肺转移评估。
第30天，处死对照组和治愈组的小鼠，收集脾脏并制备脾细胞悬液，用25μg/mLOVA刺激培养72h后分析免疫记忆T细胞：分别用抗CD3、抗CD4、抗CD44、抗CD62L和抗CD3、抗CD8、抗CD44、抗CD62L染色，然后通过流式细胞仪进行处理分析。在抗肺转移评估中，第31天给小鼠静脉注射B16-OVA细胞(每只小鼠1×105个细胞)。20天后，处死所有的老鼠，收集肺组织观察肿瘤结节。
图11为在小鼠右侧靠近下肢的部位皮下接种B16-OVA细胞后7天后，分别瘤内注射PBS、游离OVA、MSN-ABC@PDA、MSN@PDA-OVA和MSN-ABC@PDA-OVA，激光组施以0.25W/cm2的808nm激光照射5min。在治疗后的第30天，处死治愈的小鼠，收集脾细胞进行免疫记忆评价实验。在治疗后的第31天，给治愈的小鼠静脉注射B16-OVA细胞，20天后，处死小鼠，收集肺组织，观察肿瘤结节。图11中的a为实验方案图；图11中的b和c分别为CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞中效应(CD44+CD62L-)和中央(CD44+CD62L+)记忆T细胞的流式分布图；图11中的d为肺组织上肿瘤结节的照片图。其中，(0)是不做处理的对照组，(5)是MSN@PDA-OVA+激光组，(6)是MSN-ABC@PDA-OVA+激光组。
除了激活免疫反应，免疫记忆在发挥抗肿瘤功效(如抗肿瘤转移)方面也起着重要作用。一般来说，效应记忆T细胞(TEM，CD44+CD62L-)可以诱导效应T细胞的产生，中央记忆T细胞(TCM， CD44+CD62L+)能够为身体提供持久的保护。图11中的a为体内免疫记忆效应和抗肺转移评估的方案图。使用MSNs-ABC@PDA-OVA+激光治疗的小鼠的TEM细胞和TCM细胞频率明显高于 MSNs@PDA-OVA+激光组(图11中的b和c)，这表明MSNs-ABC@PDA-OVA+激光治疗可以产生增强的免疫记忆效应。肿瘤转移是肿瘤死亡率高的主要原因。而解决肿瘤转移问题是免疫治疗的一大优势。如图11中的d所示，发现对照组产生多个明显的肿瘤肺转移，而MSNs@PDA-OVA+激光组出现很少的转移，MSNs-ABC@PDA-OVA+激光组中未发生可见转移。简言之，这些结果表明，基于MSNs-ABC@PDA-OVA联合PTT可以触发有效的免疫记忆效果，有助于防止肿瘤转移。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (1)

1.一种pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1：称取25 mg介孔硅纳米粒子于5 mL 2 M的碳酸氢铵溶液中，在冰浴条件下，用3 mm探头、功率为30%的超声波细胞破碎仪超声5 min，超声5 s停3 s，得到纳米粒溶液，继续置于4 ℃震荡孵育过夜，时间＞10h，然后15000 rpm离心10 min，并用去离子水洗涤两次，收集沉淀；
S2：上述沉淀用1 mL Tris-HCl溶液重悬，所述Tris-HCl溶液的浓度为10mM、pH为8.5，然后在震荡条件下，加入4 mL含25 mg盐酸多巴胺的Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl溶液的浓度为10mM、pH为8.5，避光条件下继续震荡6 h以上，再15000 rpm离心10 min，并用去离子水洗涤两次，收集沉淀；
S3：将5 mg OVA溶解于5 mL含5 mM EDTA的PBS中，所述PBS的浓度为0.1 M、pH为8.0，然后加入25倍摩尔过量的Traut’s试剂，在室温下震荡反应1 h，反应完成后溶液经Zeba脱盐离心柱过滤，得到巯基化的OVA溶液；
S4：S2步骤中的沉淀用1 mL Tris-HCl溶液重悬，所述Tris-HCl溶液的浓度为10mM、pH为8.5，然后在震荡条件下，加入S3步骤中的巯基化OVA溶液和2 mg TCEP，避光条件下继续震荡6 h以上，再15000 rpm离心10 min，并用去离子水洗涤两次，收集沉淀，得到pH响应型基于共包载抗原和光敏剂的介孔硅纳米粒的治疗性疫苗。
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