KR20200109325A - 세포 활성화 상태를 조절함으로써 생체내 면역 세포의 염증 상태의 변경 - Google Patents

세포 활성화 상태를 조절함으로써 생체내 면역 세포의 염증 상태의 변경 Download PDF

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Abstract

생체내 면역 세포의 활성화 상태를 조절하는 시스템 및 방법이 기재되어 있다. 상기 시스템 및 방법을 사용하여 암 성장 및 고도로 활성화된 살종양 대식세포로의 전이를 지지하는 면역억제 대식세포를 형질전환시킬 수 있다.

Description

세포 활성화 상태를 조절함으로써 생체내 면역 세포의 염증 상태의 변경
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2018년 1월 18일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제62/618,908호의 우선권의 이득을 주장하며, 상기 출원은 본원에 완전히 제시된 것처럼 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 카피 대신 텍스트 포맷으로 제공되고 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일명은 18-073-WO-PCT 서열 목록_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 145 KB이고, 2019년 1월 14일자로 생성되었고, EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되고 있다.
기술분야
본원 개시내용은 생체내 면역 세포의 활성화 상태를 조절하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 상기 시스템 및 방법을 사용하여 암 성장 및 고도로 활성화된 살종양 대식세포로의 전이를 지지하는 면역억제 대식세포를 형질전환시킬 수 있다.
다수의 불리한 생리학적 병태는 면역계 활성화 (예를 들어, 자가면역 장애) 또는 면역계 억제 (예를 들어, 암)와 관련된다. 예를 들어, 대식세포는 암성 조직에 많은 수로 침투하는 주요 면역 이펙터 세포이다. 그러나, 종양 미세환경 내에 대식세포는 활성화된 살종양 상태로부터 실제로 종양 성장 및 전이를 촉진시키는 면역억제 표현형으로의 전환을 진행한다. Pollard, Nat Rev Cancer 4, 71-78 (2004); Mantovani, et al., Nat Rev Clin Oncol (2017).
종양 미세환경 내 면역억제된 대식세포가 암 성장 및 전이를 촉진시킴을 이해할 때, 면역억제 종양-관련 대식세포 (TAM)를 표적화하는 치료요법을 개발하는데 많은 노력이 기울여져 왔다. TAM을 해결하기 위한 많은 노력은 TAM을 사멸시키는데 집중되어 종양 미세환경 내 면역억제를 완화시킨다. 그러나, 이러한 접근법을 사용하여, TAM은 단순히 종양 환경에서 새롭게 도착한 대식세포로 대체된다. 더욱이, 일부 TAM을 사멸시키는데 성공적인 경우라도, 지금까지 개발된 대부분의 치료제는 종양 미세환경으로 충분히 침투할 수 없었다. 일부 소분자 약물 및 항체는 일부 성공을 보여주었지만, 이들 접근법은 신체 내 모든 대식세포를 억제하여 위험한 부작용을 유도한다. Bowman & Joyce, Immunotherapy 6, 663-666 (2014). 따라서, 암에 의해 영향을 받은 모든 사람에 의해 이해되는 바와 같이, 부작용이 적은 보다 효과적인 치료 전략이 크게 요구된다.
발명의 개요
본원 개시내용은 생체내 면역 세포의 기능을 조절하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 시스템 및 방법은 종양-관련 대식세포 (TAM)의 면역억제 종양 지지 상태를 역전시키고 이들 TAM을 고도로 활성화된 종양 세포-사멸 대식세포로 전환시키기 위해 사용된다. 따라서, 본원에 개시된 시스템 및 방법은 단순히 TAM을 사멸시키는 것을 목적으로 하지 않지만 대신 이들의 활성을 종양-촉진으로부터 종양-파괴로 재지시한다. 특정 구현예에서, 상기 시스템 및 방법은 암 세포의 사멸을 유도하고/하거나 새로운 암 세포의 성장 또는 발달을 감소시키거나 예방하기 위한 치료제로서 사용된다. 본원에 개시된 데이터는 이들 시스템 및 방법이 주지의 사실로서 제어하기가 어려운 암 유형인 난소암을 완전히 박멸하고 억제할 수 있음을 보여준다.
본원에 개시된 시스템 및 방법은 종양에서 면역억제 상태를 변형시키기 위해 사용될 수 있고 이는 종양 미세환경을 재구성하기 위한 기전을 제공한다. 이들 구현예에서, 재구성된 종양 미세환경은 종양을 백신, 키메라 항원 수용체 (CAR) 치료요법 및/또는 화학치료요법과 같은 동반 치료에 보다 민감하게 만들 수 있다.
중요하게, 본원에 개시된 시스템 및 방법은 종양 미세환경에서 국소적으로 사용될 수 있어 면역계 항상성을 전반적으로 방해하는 전신 치료에 의지할 필요가 없다. 더욱이, 특정 구현예는 종양 미세환경에 성공적으로 침투시키기 위해 최적화되었다.
특정 구현예는 전사 인자와 같은 활성화 조절인자를 암호화하는 뉴클레오타이드를 전달하기 위해 입자를 사용함으로써 생체내 면역 세포의 활성화 상태를 변형시킨다. 특히 유용한 입자는 양성 코어 및 중성 또는 음전하 표면을 갖고 키나제 IΚΚβ와 조합된 전사 인자 인터페론-조절 인자 5 (IRF5)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 전달한다. <130 nm의 입자 크기는 종양 침투를 보장한다. 더욱이, 상기 입자는 TAM에 의한 입자의 보다 선택적 취득을 지시하기 위해 TAM 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 하나의 예로서, TAM은 입자의 표면 상에 만노스를 포함시킴으로써 표적화될 수 있는 세포 표면 수용체인 CD206을 발현한다.
본원에 제출된 많은 도면은 컬러로 보다 잘 이해된다. 출원인은 본래 제출된 것의 일부로서 컬러 버전의 도면을 고려하고 후기 진행 사항에서 도면의 컬러 이미지를 제공할 권리를 보존한다.
도 1a, 도 1b. 표적화된 mRNA 나노입자를 사용하여 종양 관련 대식세포 (TAM)를 살종양 세포로 유전학적으로 형질전환시키기 위한 개략도. (도 1a) 주사가능한 나노담체는 전신 독성을 유발하지 않고 치료학적 목적을 위해 TAM을 이상적으로 재프로그래밍하기 위한 새로운 방법으로서 M1-분극화 전사 인자를 암호화하는 시험관내 전사된 mRNA를 전달하기 위해 개발되었다. mRNA 나노입자의 반복적인 복막내 주입으로 난소암 환자를 치료하도록 디자인된 제1의 계획된 임상 적용이 도해된다. (도 1b) 표적화된 mRNA 나노입자를 사용하여 두개내 TAM을 살종양 대식세포로 유전학적으로 재프로그ŽN밍하기 위한 개략도.
도 2a 내지 도 2k. IRF5 및 IKKβ를 암호화하는 mRNA를 운반하는 나노입자는 전염증성 M1-형(M1-like) 표현형을 각인시킬 수 있다. (도 2a) 대식세포 분극화의 주요 조절인자를 암호화하는 mRNA로 제형화된 대식세포-표적화된 중합체 NP의 디자인. 입자는 입자를 M2-형(M2-like) 대식세포에 의해 발현된 만노스 수용체 (CD206)로 표적화하는, PGA-디-만노스의 층으로 코팅된 PbAE-mRNA 폴리플렉스 코어로 이루어진다. 또한 재프로그래밍 전사 인자를 암호화하도록 가공된 NP 중에 캡슐화된 합성 mRNA가 도시된다. (도 2b) NP (스케일 막대 200 nm)의 집단 및 단일 NP (삽화, 스케일 막대 50 nm)의 투과 전자 현미경. (도 2c) NanoSight NS300 장비를 사용하여 측정된, NP의 크기 분포. (도 2d) NP는 1시간 노출 후 골수-유래된 대식세포 (BMDM)의 고형질감염 (46%)을 입증하였다. (도 2e) 나노입자 형질감염 24시간 후에 유동 세포측정에 의해 측정된 골수 유래된 대식세포 (BMDM)로의 유전자-전달 효율. (도 2f) NP 형질감염된 및 형질감염되지 않은 대식세포 (어넥신 V 및 PI로의 염색에 의해 평가된)의 상대적 생존능. N.s.;유의적이지 않음. (도 2g) qRT-PCR에 의해 측정된 코돈-최적화된 IRF5 mRNA (청색, 좌측 Y축) 및 내인성 IRF5 mRNA (검정색, 우측 Y 축)의 발현 동력학, 각각의 시점에 대해 n=3. (도 2h) 도 2i 내지 도 2k에 사용된 BMDM에 대해 NP 형질감염 프로토콜 및 배양 조건을 도시하는 타임라인. (도 2i) 톨형 수용체 6 효능제 MPLA로 자극된 시그니처 M1 세포와 비교하여 IRF5/IKKβ NP-형질감염된 대식세포의 유전자 발현 프로필. 결과는 유전자 발현에서 배수 변화의 분포를 보여주는 볼케이노 플롯으로서 도시된다. M1 시그니처 유전자가 지적된다. IRF5/IKKβ NP-형질감염된 대식세포와 M1 시그니처 유전자 세트 간의 중첩 P 값을 GSEA에 의해 결정하였다. (도 2j) IL-4 중에서 배양되고 IRF5/IKKβ NP로 형질감염된 세포에 대한 IL-4에서 배양된 대식세포 중에서의 M1 시그니처 유전자 발현의 히트 맵. (도 2k) 지적된 유전자 및 S.E.M에 대해 평균 계수를 보여주는 박스 플롯.
도 3. 마우스 대식세포의 표현형에 대한 인터페론-조절 인자 (IRF) 패밀리 (이들의 활성화 키나제와 조합하거나 이들의 활성화 키나제 없이 전달됨)의 상이한 구성원의 효과의 시험관내 스크리닝. C57BL/6 마우스로부터의 BMDM을 M-CSF 조건화 배지 중에서 항온처리하고 (1) 대조군 GFP, (2) 뮤린 IRF5, (3) IRF5를 인산화시키는 뮤린 IRF5 및 IKKβ 키나제, (4) 뮤린 IRF8 및 IKKβ 키나제, (5) Lys-310에서 Arg (K310R)로 전환된 IRF8의 돌연변이체인 뮤린 IRF8 K310R (White et al., J Biol Chem. 2016 Jun 24), 또는 (6) 뮤린 IRF7/3 (5D)을 암호화하는 합성 mRNA를 갖는 mRNA-PBAE NP로 형질감염시켰다. 상기 융합 단백질은 IRF-7의 DNA 결합 도메인 (DBD) 및 항상성 활성 도메인 (CAD) 및 IRF3의 핵 배출 신호 (NES) 및 IRF 연합 도메인을 포함한다 (Lin et al., Molecular and Cellular Biology. 18.5, 1998). NP 형질감염 2일 후, 세포를 TAM-연합된 대식세포 마커 Egr2 및 활성화된 대식세포 마커 CD38을 위한 유동 세포측정 분석을 위해 수확하였다. 상기 시험관내 스크리닝을 기준으로, mIRF5 및 IKKβ 키나제를 암호화하는 mRNA를 동시 전달하는 NP를 본원에 기재된 나머지 시험관내 및 치료학적 생체내 실험을 위해 선택하였다.
도 4a 내지 도 4j. IRF5 및 IKKβ 유전자를 파종성 난소암을 갖는 마우스의 평균 생존 2배 초과의 대식세포로 전달하는 mRNA 나노담체의 반복적인 복막내 주사. (도 4a) 타임라인 및 투여 용법. 화살표는 복강 주사의 시간을 지적한다. (도 4b) 대조군 및 처리된 마우스에서 종양 성장의 순차적 생발광 이미지화. (도 4c) 처리된 마우스 대 대조군 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선. 통계학적 분석은 로그 순위법 (log-rank test)을 사용하여 수행하였다. (도 4d) 대조군으로서 GFP mRNA를 운반하는 D-만노스-코팅된 NP의 단일 복강 용량 48시간 후에 상이한 면역 세포 서브집단에서 생체내 형질감염 비율의 유동 세포측정 정량: 대식세포 (CD45+, CD11b+, MHCII+, CD11c-, Ly6C-/낮은, Ly6G-), 단핵구 (CD45+, CD11b+, MHCII+, CD11c-, Ly6C+, Ly6G-), 호중구 (CD45+, CD11b+, MHCII+, CD11c-, Ly6G+), CD4+ T 세포 (CD45+, TCR-β 쇄+, CD4+, CD8-), CD8+ T 세포 (CD45+, TCR-β 쇄+, CD4-, CD8+), 및 자연 살해 세포 (CD45+, TCR-β 쇄-, CD49b+)를 측정하였다. (도 4e) 파종성 ID8 난소암을 갖는 마우스의 복막에서 대식세포 표현형의 유동 세포측정 분석. 동물을 4회 용량의 IRF5/IKKβ NP 또는 PBS로 처리하였다. (도 4f) Ly6C-, F4/80+, 및 CD206+ (M2-형) 대식세포의 상대적 퍼센트 (좌측 패널) 및 절대 수 (우측 패널)를 요약하는 박스 플롯. (도 4g) Ly6C-, F4/80+, 및 CD206- (M1-형) 대식세포에 대한 상응하는 수. (도 4h) PBS 대조군 (상부 패널) 또는 IRF5/IKKβ NP-처리된 동물 (하부 패널; 스케일 막대 100 μm)로부터 단리된 난소 종양-침투된 장간막의 대표적 헤마톡실린 및 에오신-염색된 섹션. 대표적인 악성 병변의 10배 배율은 우측 (스케일 막대 50 μm) 상에 나타낸다. (도 4i) 각각의 처리 그룹으로부터 단리된 복막 대식세포에 의해 생성된 사이토킨을 측정하는 루미넥스 검정. CD11b+, F4/80+ 복막 대식세포를 형광성 활성화된 세포 분류에 의해 단리하고 생체외 배양하였다. 24시간 후, 세포 배양 상등액을 수거하였다. 병행 실험에서, FACS-분류된 CD11b+, F4/80+ 복막 대식세포를 직접 pRT-PCR로 분석하여 대식세포 표현형 (SerpinB2, Retnla, Ccl11, 및 Ccl5)의 4개의 마스터 조절인자의 발현 수준을 결정하였다. 결과는 도 4j에서 박스 플롯으로서 요약한다.
도 5a 내지 도 5f. 대식세포-프로그래밍 mRNA 나노담체는 고도로 생체적합성이고 반복적인 투여를 위해 안전하다. (도 5a) 복강 투여 후 대식세포-표적화된 IRF5/IKKβ NP의 생체내 생분포. NP-전달된 (코돈-최적화된) mRNA를 50 μg mRNA를 함유하는 입자의 단일 주사 24시간 후 qPCR에 의해 검출하였다. (도 5b) 실험 타임라인의 도식 표현. * 마지막 용량 24시간 후, 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사시켰다. 혈액을 혈청 화학 및 완전한 혈액 계수를 위해 역-궤도 출혈을 통해 헤파린 코팅된 튜브에 수거하였다. 검시를 간, 비장, 췌장, 장간막 및 대망, 위 및 방광의 조직학적 분석을 위해 수행하였다. (도 5c) 대조군 또는 NP-처리된 동물로부터 단리된 다양한 기관의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신-염색된 섹션. 스케일 막대, 100 μm. NP-처리된 동물에서 발견된 병변은 여기서 비교 병리학자에 의한 분석을 기준으로 도시되고 기재된다. 각각의 번호를 매긴 이미지를 위한 관련된 발견은 다음과 같다: [1] 여러 과립구와 혼합된 단핵 세포로 대부분 구성된 세포 침투물의 별개의 병소; 경미한 골수외 조혈. [2] 여러 국부적 광범위 영역에서, 간세포는 경미한 것 내지 중간 정도로 부어 있다. [3] 적색 펄프내에서 중간 정도의 골수성 (우세한), 적혈구 및 거핵세포 과형성. [4] 백색 펄프의 경미한 저세포상태 (hypocellularity). [5] 장간막 내에, 대식세포, 림프구, 혈장 세포 및 과립구의 중간정도의 다초점 침투물이 있다. [6] 림프구, 혈장 세포 및 과립구와 혼합된 대식세포의 경미한 침투물 내지 중간 정도의 침투물; 세엽 (acini)과 소핵 (acinar) 상실의 경미한 해리; 소핵 세포로부터 자이모겐 과립의 경미한 확산 상실. [7] 지방 조직 주변에서 대식세포와 혼합된 림프구의 밀집된 응집물. [8] 위 점막 내 주요 세포 및 체벽 세포의 경미한 다초점 공포성 변성. (도 5d) 혈청 화학 및 혈액 계수. (도 5e, 도 5f) IRF5/IKKβ NP의 단일 복강 주사 4 또는 8일 후에 혈청 IL-6 (도 5e) 및 TNF-α (도 5f) 사이토킨의 루미넥스 검정 측정.
도 6a 내지 도 6i. 정맥내 주입된 IRF5/IKKβ 나노입자는 폐에서 종양 전이를 제어할 수 있다. (도 6a) 정맥내 투여 후 대식세포-표적화된 IRF5/IKKβ NP의 생체내 생분포. 코돈-최적화된 mRNA를 50 μg mRNA를 함유하는 입자의 단일 정맥내 주사 24시간 후에 qPCR에 의해 측정하였다. (도 6b 내지 도 6h) C57BL/6 알비노 마우스에 꼬리 정맥을 통해 1×106 B16F10 반딧불이 루시퍼라제-발현 흑색종 세포를 주사하여 폐 전이를 확립하였다. 7일 후, 동물을 무작위로 IRF5/IKKβ NP 처리 그룹, 대조군 GFP NP 그룹, 또는 PBS 대조군에 할당하였다. (도 6b) 타임라인 및 투여 용법. (도 6c) 건강한 폐 (좌측 패널) 및 B16F10 종양-침투된 폐 (우측 패널)의 공초점 현미경. 침투하는 대식세포 집단은 녹색 형광을 나타낸다. (도 6d) 순차적 생발광 종양 이미지화. (도 6e) 각각의 처리 그룹에 대한 카플란-마이어 생존 곡선. ms는 메디안 생존을 지적한다. 통계학적 분석은 로그 순위법을 사용하여 수행하였고 P<0.05는 유의적인 것으로 고려되었다. (도 6f) 처리 2주 후 각각의 그룹을 대표하는 B16F10 흑색종 전이를 함유하는 폐의 대표적 사진 (상단) 및 현미경 사진. (도 6g) 폐 종양 병소의 계수. (도 6h) 각각의 처리 그룹으로부터 기관지폐포 세척에서 단핵구/대식세포 집단의 표현형 특징 분석. (도 6i) 억제 및 활성화된 대식세포의 상대적 퍼센트의 요약.
도 7a 내지 도 7f. 대식세포 재프로그래밍은 신경교종에서 방사선치료요법의 성과를 개선시킨다. (도 7a) 유도 21일 후에 대한 RCAS-PDGF-B/Nestin-Tv-a; Ink4a/Arf-/-; Pten-/- 유전자전이 마우스에서 PDGFβ-구동된 신경교종의 개시 후 T2 MRI 스캔 및 조직학적 염색. (도 7b) 신경교종 가장자리를 침투하는 CD68+ TAM의 공초점 현미경. 스케일 막대 300 μm. (도 7c) 건강한 뇌 조직 대 신경교종에서 대식세포 (F4/80+, CD11b+) 집단의 유동 세포측정 분석. (도 7d 내지 도 7e) 단독치료요법 (도 7d)으로서 또는 뇌 종양 방사선치료요법 (도 7e)과 조합된 IRF5/IKKβ 치료를 받은 확립된 신경교종을 갖는 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. 타임라인 및 투여 용법은 상부에 나타낸다. Ms, 메디안 생존. 통계학적 분석은 로그 순위법을 사용하여 수행하였고 P<0.05는 통계학적으로 유의적인 것으로 고려되었다. (도 7f) 종양 진행의 순차적 생발광 이미지화.
도 8a 내지 도 8e. 사람 IRF5/IKKβ를 암호화하는 IVT mRNA-운반 나노입자는 사람 대식세포를 효율적으로 재프로그래밍한다. (도 8a) 사람 THP-1 단핵구 세포주를 억제 M2-형 대식세포로 분화시키기 위한 타임라인 및 배양 조건. (도 8b) 24웰에서 배양되고 대조군 GFP mRNA에 대한 사람 IRF5/ IKKβ mRNA를 운반하는 지적된 농도의 NP로 형질감염된 M2-분화된 THP1-루시아 세포의 생발광 이미지화. IRF-유도된 루시아 루시퍼라제의 수준은 Quanti-Luc를 사용하여 형질감염 24시간 후에 측정하였다. (도 8c) 생발광 계수의 요약. (도 8d 내지 도 8e) M1-대식세포 마커 CD80의 IL-1β 사이토킨 분비 (도 8d)와 표면 발현 (도 8e)에서의 차이.
도 9. 실시예 1에 기재된 골수성 및 림프성 면역표현형 패널에 사용된 항체의 목록.
도 10은 본원 개시내용을 뒷받침하는 예시적인 서열 (서열번호 1-44, 110, 및 111)을 제공한다. 서열번호 1-44, 110, 및 111의 정체는 도 11에 기재되어 있다. 특히 서열번호 15에 관하여, 융합 단백질은 뮤린 IRF7의 DBD (DNA 결합 도메인) 및 CAD (항상성 활성 도메인) 및 뮤린 IRF3의 NES (핵 배출 신호) 및 IRF 연합 도메인을 포함한다. IRF 연합 도메인은 N 말단 영역에서 4개의 세린 및 1개의 트레오닌 잔기에서 Asp 돌연변이를 포함하고 이는 융합 단백질의 항상성 활성화 및 전좌를 부여한다 (Lin R et al. (1998) 상기와 같음(supra)). 특히 서열번호 17에 관하여, 뮤린 IRF8에서 SUMO (작은 유비퀴틴-형 개질제) 결합 부위는 라이신 (K) 310에 있다. SUMO 2/3의 결합은 IRF-8이 IRF8 반응성 유전자를 관여시키고 활성화시키는 것을 방지한다. K310 잔기의 돌연변이는 IRF8로의 SUMO 결합을 방지하여 IRF8 특이적 유전자 전사를 2 내지 5배 증가시킨다 (Chang T-H et al. The Journal of Immunology (2012) 189(7): 3548-3556).
도 11은 예시적인 단백질 서열 및 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 핵심 서열번호를 제공한다.
다수의 부작용 생리학적 병태는 면역계 활성화 (예를 들어, 자가면역 장애) 또는 면역계 억제 (예를 들어, 암)와 관련된다. 예를 들어, 대식세포는 암성 조직에 많은 수로 침투하는 주요 면역 이펙터 세포이다. 그러나, 면역억제 종양 환경 내에, 이들은 활성화된 살종양 상태로부터 종양 성장 및 전이를 촉진시키는 면역억제 표현형으로의 전환을 진행한다. 이들 종양-관련 면역억제된 대식세포(TAM)는 불량한 예후와 관련된다 (Komohara Y et al. (2014) Cancer science 105(1): 1-8). 이들은 혈관형성, 림프구생성 및 간질 리모델링을 유도한다. 이들은 또한 효소 플라스민, uPA, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 및 카뎁신 B의 분비를 통한 종양 침입 및 전이를 촉진시키는데 주요 역할을 수행한다 (Komohara, Y et al. (2016) Advanced drug delivery reviews 99: 180-185; Gocheva V et al. (2010) Genes Dev 24: 241-255; Wang R et al. (2011) Lung Cancer 74: 188-196). 종양 성장 및 진행을 매개하는 것뿐만 아니라 TAM은 또한 다른 면역 세포와 상호작용하고 선천성 및 후천성 항종양 면역 반응을 억제할 수 있다.
여러 소분자 약물은 세포 동원 또는 확장에 관여하는 경로를 표적화함으로써 TAM-전구체 세포의 종양으로의 국소화를 차단시키는데 집중한다 (즉, CSF-1/CSF-1R 경로 (Pyon; teck et al. Nat Med 19, 1264-1272 (2013); Tap et al. N Engl J Med 373, 428-437 (2015)) 또는 CCL2 경로 (Nywening, et al. Lancet Oncol 17, 651-662 (2016))의 억제제). 이들 접근법은 대용량의 소분자 약물에 반복적인 전신 노출을 필요로 한다. 추가로, 이들 약물의 임상 시험은 이들이 세포감퇴 치료요법과 조합되지 않은 경우 낮은 반응을 보여주었다. Nywening, et al. Lancet Oncol 17, 651-662 (2016); Butowski et al. Neuro Oncol 18, 557-564 (2016). 추가로, 이들 소분자 접근법은 활성적으로 대식세포 항-종양 활성을 촉진시키지 않는다.
리포좀과 같은 통상의 나노담체는 종양 내 대식세포를 전신적으로 파괴하기 위한 비스포스포네이트 또는 다른 항증식성 제제 (즉, 리포좀-클로드로네이트)와 제형화되었다 (Fritz et al., Front Immunol 5, 587 (2014)). 암용해 바이러스는 또한 siRNA를 전달하여 종양 내 면역-회피 경로를 사일런싱하고 TAM의 식세포 작용을 간접적으로 촉진시키기 위해 사용되어 왔다. (Chao et al., Curr Opin Immunol 24, 225-232 (2012)). 그러나, 이들 접근법을 사용하여 파괴된 대식세포는 유사하게 면역억제성이 된 새롭게 도착한 대식세포로 천연적으로 대체된다.
항체는 TAM의 기능적 활성화를 유도하기 위해 개발되었다. 이들 접근법은 종양 내 한정된 항원 유형을 표적화하기 위해 항체를 사용한다. Mantovani, et al., Nat Rev Clin Oncol (2017). 그러나 이들 항체의 성공은 이들의 낮은 종양 제공 및 이종성 분포에 의해 제한된다. Thurber et al., Adv Drug Deliv Rev 60, 1421-1434 (2008). 이들은 또한 항체에 의해 표적화된 항원이 없는 종양 회피 변이체를 다루지 않는다.
이들 기재된 접근법의 어떠한 것도 직접적으로 및 효과적으로 TAM을 본원에 개시된 바와 같이 활성화된 살종양 대식세포가 되도록 재프로그래밍하지 못한다. 본원에 개시된 시스템 및 방법은 이들이 TAM을 종양-제거 대식세포가 되도록 재프로그래밍하고 이와 동시에 종양-촉진 TAM 부담을 감소시키기 때문에 매우 혁신적이다. 현재, 이들 치료학적 목적을 위해 담당의가 TAM을 이상적으로 재프로그래밍하도록 하는 어떠한 다른 방법도 존재하지 않는다. Mantovani, et al., Nat Rev Clin Oncol (2017); Gabrilovich & Nagaraj, Nat Rev Immunol 9, 162-174 (2009). 이들 자체는 종양 치료에서 치료학적 이득을 제공할 수 있다. 종양 미세환경을 조절하거나 재구성함으로써, 본원 개시내용은 또한 종양이 백신, 면역치료요법 (예를 들어, CAR) 및/또는 화학치료요법과 같은 다른 치료 유형에 대해 보다 민감해질 수 있도록 한다.
특정 구현예는 전사 인자 (예를 들어, 인터페론 조절 인자 (IRF)) 및/또는 키나제 (예를 들어, IKKβ)와 같은 활성화 조절인자를 암호화하는 뉴클레오타이드 암호화 유전자를 갖는 세포를 제공하기 위한 입자를 사용한다. 이들 활성화 조절인자는 대식세포 분극화를 조절한다 (도 1). 대식세포 분극화는 이를 통해 대식세포의 생리학적 활성이 변화하는 고도의 동력학적 과정이다. 지적된 바와 같이, 대부분의 종양에서, TAM은 "M2" 표현형일 수 있는 면역억제된 표현형을 나타낸다. 대조적으로, 활성화된 대식세포는 종양 세포 사멸을 유도하는 "M1" 표현형을 나타낼 수 있다. 본원에 개시된 특정 구현예는 종양-촉진 TAM의 종양-사멸 대식세포로의 분극화를 역전시킨다. 상기 효과는 염증 사이토킨을 유도하고, 다른 면역 세포를 활성화시키고 종양 세포를 식세포 작용함으로써 종양 내 면역억제 환경을 개선시킨다.
"대식세포 활성화"는 (i) 불활성화된 상태로부터 활성화된 상태로; (ii) 비-활성화된 상태로부터 활성화된 상태로; (iii) 활성화된 상태로부터 보다 활성화된 상태로; 또는 (iv) 불활성화된 상태로부터 비-활성화된 상태로의 대식세포의 표현형 또는 기능을 변경하는 공정을 언급한다. 불활성화된 상태는 종양 성장 및 전이를 촉진시키는 면역억제된 표현형을 의미한다. 비-활성화된 상태는 대식세포가 종양 성장 또는 전이를 촉진시키지 않거나 종양 세포의 사멸을 촉진시키지 않음을 의미한다. 활성화된은 대식세포가 살종양 활성을 나타냄을 의미한다. 특정 구현예에서, 활성화된 상태는 하기에 보다 완전하게 기재된 바와 같이 M1 표현형을 유도한다. 특정 구현예에서, 불활성화된 상태는 또한 하기에 보다 완전하게 기재된 바와 같이 M2 표현형을 유도한다.
"대식세포 불활성화"는 (i) 활성화된 상태로부터 덜 활성화된 상태로; (ii) 활성화된 상태로부터 비-활성화된 상태로; (iii) 활성화된 상태로부터 불활성화된 상태로; 또는 (iv) 비-활성화된 상태로부터 불활성화된 상태로의 대식세포의 표현형 또는 기능을 변경하는 공정을 언급한다. 특정 구현예에서, 불활성화된 상태는 M2이다. 특정 구현예에서, 활성화된 상태는 M1이다.
특정 구현예에서, 개시된 시스템 및 방법의 하나의 이득은 치료에 의해 유도된 염증이 치료 부위에 위치한 채로 남아있기 때문에 환자가 전신 독성으로부터 벗어나도록 하는 것이다. 상기 이득을 성취하기 위해, 국소적으로 주입된 입자는 종양 환경에서 TAM을 표적화하고, (2) 대식세포 분극화를 제어하는 신호 전달 경로를 선택적으로 재프로그래밍하는 뉴클레오타이드를 전달하고, (3) 생리학적 경로에 의해 국부적으로 완전히 분해될 수 있다 (Sahin et al., Nat Rev Drug Discov 13, 759-780 (2014)).
고형 종양에서 고발현의 외인성 뉴클레오타이드를 성취하는 것은 생체내 과제이다. 본원의 개시내용 전에, 바이러스, 또는 리포좀과 같은 통상의 나노담체를 기초로 하는 뉴클레오타이드 전달 시스템은 종양 조직 내 이들의 제한된 확산에 의해 제한되었다. Jain & Stylianopoulos, Nat Rev Clin Oncol 7, 653-664 (2010). 상기 장벽을 극복하기 위해, 특정 구현예는 증진된 확산성을 가진 나노입자 (NP)를 사용하여 NP가 뉴클레오타이드를 종양 내 대집단의 TAM으로 전달하도록 한다. 특정 구현예는 중성 표면 전하를 갖는 크기가 <130 nm인 NP를 사용한다. 특정 구현예는 추가로 NP의 표면에 부착된 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 디-만노스는 NP 표면에 부착되어 TAM 세포 표면 상에서 발현된 만노스 수용체 (CD206)에 보다 선택적으로 표적화할 수 있도록 한다. 표적화될 수 있는 다른 TAM 세포 표면 수용체는 조기 성장 반응 단백질 2 (Egr2), CD163, CD23, 인터류킨 (IL)27RA, CLEC4A, CD1a, CD1b, CD93, CD226, IL13-Ra1, IL-4r, IL-1R 유형 II, 데코이 IL-1R 유형 II, IL-10r, 대식세포 스캐빈징 수용체 A 및 B, Ym-1, Ym-2, 저밀도 수용체-관련 단백질 1 (LRP1), IL-6r, CXCR1/2, 및 PD-L1을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 시스템 및 방법은 입자를, 이를 필요로 하는 대상체에 투여함을 포함한다. 입자는 대상체 내 종양에 존재하는 대식세포에 관한 것이고 대식세포에 의해 내재화되도록 디자인된다. 일단 내재화되면, 상기 입자는 추가로 IRF5 및 IKKβ를 암호화하는 서열을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 전달한다. 하나 이상의 뉴클레오타이드는 IRF5 및 IKKβ를 발현하도록 대식세포를 변형시킨다. 이론에 국한되는 것 없이, IKKβ 키나제는 인산화에 의해 IRF5 전사 인자를 활성화시킨다. 이어서, 활성화된 IRF5는 유형 I 인터페론 (IFN) 유전자, 종양 괴사 인자(TNF), IL-6, IL-12 및 IL-23을 포함하는 염증 사이토킨, 및 종양 서프레서의 발현을 유발한다. IRF5 및 IKKβ를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 내재화한 M2 대식세포에서, IRF5 작용을 통한 상기 언급된 유전자의 발현은 M2 표현형으로부터 M1 표현형으로의 대식세포의 표현형 또는 기능적 전환을 유도하여, 이는 대식세포가 종양 세포를 사멸시키거나 달리 이의 파괴를 유발하여 암을 치료할 수 있다. 특정 구현예에서, 입자는 식세포 작용에 의해 대식세포에 내재화된다. 특정 구현예에서, 입자는 리간드-매개된 세포내이입 (예를 들어, CD-206-매개된 세포내이입)에 의해 대식세포에 내재화된다. 특정 구현예에서, IRF5 및 IKKβ 유전자를 포함하는 입자의 대식세포로의 전달은 예를 들어, (1) 대식세포로의 결합, (2) 대식세포에 의한 입자의 내재화, (3) 내재화 후 세포내이입 소포체로부터 세포질 내로 회피, (4) 하나 이상의 뉴클레오타이드의 방출을 포함할 수 있고, 상기 뉴클레오타이드는 (5) 대식세포의 핵으로 수송될 수 있고 (6) IRF5 및 IKKβ를 발현하기 위해 유전자를 전달하도록 전사될 수 있다.
본원 개시내용의 양상은 이제 하기와 같이 보다 상세하게 기재된다: (1) 대식세포 및 대식세포 표현형; (2) 대식세포 분극화에 영향을 미치는 세포 경로; (3) 활성화 조절인자를 암호화하는 뉴클레오타이드; (4) 뉴클레오타이드를 전달하기 위한 입자; (5) 뉴클레오타이드를 보다 선택적으로 전달하기 위한 표적화 리간드; (6) 입자를 포함하는 약제학적 조성물; (7) 사용 방법; 및 (8) 실험 예.
(1) 대식세포 및 대식세포 표현형. "대식세포"는 골수 유래된 단핵구로부터 분화된 면역계의 백혈구를 언급한다. 대식세포는 이들의 식세포 작용 활성 및 이들의 항원 제공 능력을 특징으로 한다. 대식세포는 선천적 및 후천적 면역 반응 둘 다에서 핵심적인 역할을 한다. 표현형적으로 대식세포는 표면 마커 F4/80 (Ly71)을 발현하고 또한 CDllb (Macl), CDllc, CD14, CD40 또는 CD68과 같은 다른 표면 마커를 발현할 수 있다.
대식세포는 T 림프구를 활성화시킴으로써 선천적 및 후천적 면역력 둘 다에서 중요한 역할을 수행한다. 암에서, 대식세포는 고형 종양과 관련된 침투하는 백혈구의 주요 집단 중 하나이다 (Gordon S & Taylor PR (2005) Nature Reviews Immunology 5(12): 953-964). 이들은 주변 조직으로부터 종양 부위에 동원될 수 있거나 화학주성 분자의 분비를 통해 종양 자체에 의해 동원될 수 있다. 대식세포는 이들의 표현형에 의존하여 분극화된 방식으로 종양에 대한 면역 반응에 참여한다. "표현형"은 본원에서 이의 유전자형 및 환경의 상호작용의 결과로서 세포의 물리적 특성 또는 생화학적 특징을 언급하기 위해 사용되고 세포의 기능을 포함할 수 있다.
Th1 T 림프구를 활성화시키는 대식세포는 염증성 반응을 제공하고 흔히 M1-분극화된 또는 "전형적으로 활성화된" 표현형을 갖는 것으로서 지칭된다. 또한 "킬러 대식세포"로서 언급되는 활성화된 상태의 대식세포 (즉, M1 대식세포 또는 M1 표현형을 갖는 대식세포)는 세포 증식을 억제하고, 조직 손상을 유발하고, 병원체에 대한 내성을 매개하고 강한 살종양 활성을 소유한다. 이들 대식세포는 항원 제공 및 동시 자극에 관여하는 매개체의 발현을 증가시킬 수 있고; 호중구-표적화된 종양 퇴행을 유도하는 종양 영역으로의 호중구의 침투를 촉진시킬 수 있다. M1 표현형은 또한 관련 대조군 병태와 비교하여 증가된 항원 제공에 의해 입증될 수 있다. 특정 구현예에서, M1 표현형은 반응성 산소 종 (ROS) 및 산화질소 (NO)의 M1 대식세포 생성에 의해 입증될 수 있다. NO는 병원체, 및 종양 세포와 같은 비정상 세포로부터의 보호를 위해 통합된 항-증식 효과를 갖는다. 특정 구현예에서, M1 표현형은 IL-12와 같은 사이토킨의 생성을 통해 Th1 면역력을 유도하는 전염증성 상태에 의해 입증될 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화된 상태의 대식세포는 병원체를 식세포 작용할 수 있는 전형적으로 활성화된 대식세포이다.
기능 뿐만 아니라, M1 표현형은 또한 대식세포에 의해 발현되는 표면 마커; 분극화시 대식세포에 의해 생성되는 인자, 단백질 또는 화합물; 또는 분극화시 대식세포에 의해 유도된 유전자에 의해 입증될 수 있다. M1 분극화는 CD80, CD86, iNOS의 발현, 사이토킨 신호전달 3의 서프레서 (SOCS3), TNFα, IL-1, IL-6, IL-12, IL-23, 유형 I IFN, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8, CXCL9, 및 CXCL10에 의해 입증된 표현형을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, M1 표현형은 CD80의 발현에서의 증가를 포함한다. 특정 구현예에서, M1 표현형은 CD206-, MHCII+, CD11c-, 및 CD11b+를 포함한다.
한편, Th2 T 림프구를 활성화시키는 대식세포는 항-염증성 반응을 제공하고 흔히 "M2" 표현형을 갖는 것으로서 지칭된다. 또한 "복구 대식세포"로서 언급되는 불활성화된 상태로 있는 대식세포 (즉, M2 대식세포 또는 M2 표현형을 갖는 대식세포)는 후생동물 기생충 내포, 세포 증식, 조직 복구, 종양 진행, 항-염증 경로 및 면역억제에 관여한다. M2 표현형은 관련 대조군 병태와 비교하여 항원 제공을 감소시킬 수 있고 식세포 작용을 감소시킬 수 있다. M2 표현형은 또한, 예를 들어, 아르기나제 1 (Arg1 (아르기나제 활성은 증식 촉진 효과 및 조직 복구 반응과 관련된다)), IL-10, TGF-β , PPArγ, KLF4, CD206 (MRC1), 덱틴-1 (신호전달 비-TLR 패턴-인지 수용체), DC-SIGN (C-유형 렉틴), 스캐빈저 수용체 A, 스캐빈저 수용체 B-1, CD163 (헤모글로빈-합토글로빈 복합체에 대한 고친화성 스캐빈저 수용체), 케모킨 수용체 CCR2, CXCR1, 및 CXCR2, YM1 (키티나제 3-형 3), 및 Fizz1 중 하나 이상의 발현; 및 케모킨 CCL17, CCL22 및 CCL24의 분비에 의해 입증될 수 있다. 특정 구현예에서, 불활성화된 상태의 대식세포는 전이 및/또는 화학치료요법에 대한 내성을 촉진시킨다. 특정 구현예에서, M2 표현형은 CD206+, MHCII-, CD11c+, 및 CD11b낮은를 포함한다.
표 1은 M1 표현형을 M2 표현형(M2a, M2b, M2c 및 M2d로서 지정된 서브-표현형을 포함하는)과 구분하기 위해 사용될 수 있는 기준의 특정 조합을 제공한다.
Figure pct00001
대식세포 표현형을 평가하기 위한 검정은 M1 또는 M2 표현형에 특정된 상이한 분자 시그니처를 이용할 수 있다. M1 대식세포에 대해 통상적으로 허용되는 마커 프로필은 CD80+이고, 반면 M2-대식세포는 CD163+로서 특징 분석될 수 있다. 따라서, 유동 세포측정을 수행하여 이들 마커에 대해 평가할 수 있다. M1 유형을 향하고 M2 유형으로부터 멀어지는 대식세포의 구동은 또한 IL-12/IL-10 비율 또는 CD163-/CD163+ 대식세포 비율의 증가를 측정함으로써 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, M1 대 M2 형태는 광 현미경에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 식세포 작용 분석은 대식세포가 M1 유형 또는 M2 표현형인지를 평가하기 위해 다른 검정과 연계하여 사용될 수 있다. 상이한 대식세포 집단의 식세포 작용 검정은 세포 당 이들의 규정화된 총 표면적과 일치하는 농도에서 식세포 작용을 받을 실체를 대식세포와 항온처리함으로써 수행될 수 있다. 식세포 작용을 받을 실체는 대식세포 배양물에 첨가될 수 있다. 식세포 작용을 받을 실체는 예를 들어, 형광성 표지로 표지시킬 수 있다. 식세포 작용 지수는 대식세포 당 측정된 메디안 총 형광성 강도에 의해 결정될 수 있다. 식세포 작용은 예를 들어, 유동세포측정에 의해 정량화될 수 있다. 종양 세포 사멸 검정이 또한 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, M1 표현형은 세르핀(Serpin)B2 (우로키나제 유형 플라스미노겐 활성화인자의 억제제), CCL2 (C-C 모티프 케모킨 리간드 2), CCL11 (C-C 모티프 케모킨 리간드 11), 및 Retnla (레시스틴-형 알파; Fizz1)를 포함하는 시그니처 M2 대식세포 유전자의 감소된 발현을 포함한다. 특정 구현예에서, M1 표현형은 CCL5 (C-C 모티프 케모킨 리간드 5)를 포함하는 M1 분화 유전자의 증가된 발현을 포함한다.
유전자 발현 (예를 들어, 상기 주지된 CD80, CD86 및/또는 다른 유전자의 M1 발현)은 당업자에게 널리 공지된 검정에 의해 측정될 수 있다. 유전자 발현을 측정하기 위한 방법은 NanoString nCounter® 발현 검정 (NanoString Technologies, Inc., Seattle, WA), 노던 블롯, 도트 블롯, 마이크로어레이, 유전자 발현의 일련의 분석 (SAGE), RNA-seq, 및 정량적 RT-PCR를 포함한다. 유전자 발현 생성물, 예를 들어, 단백질 수준을 측정하기 위한 방법은 ELISA (효소 결합된 면역흡착 검정), 웨스턴 블롯, FACS, 방사선면역학적 검정 (RIA), 샌드위치 검정, 형광성 원위치 하이브리드화 (FISH), 면역조직학적 염색, 면역전기영동, 면역침전, 및 항체 또는 단백질 결합 제제와 같은 검출 시약을 사용한 면역형광을 포함한다.
(2) 대식세포 분극화에 영향을 미치는 세포 경로. 활성화된 또는 불활성화된 표현형을 향한 대식세포의 분극화는 다수의 상이한 분자 또는 환경과의 대식세포 상호작용으로부터 비롯된다. 예를 들어, M1 대식세포 분극화는 톨형 수용체 (TLR) 리간드 (예를 들어, 리포폴리사카라이드 (LPS), 무라밀 디펩타이드, 리포테이코산, 이미퀴모드 (imiquimod), CpG), IFNγ, TNFα, 및 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 포함하는 자극에 의해 유발된다. M2 분극화된 대식세포는 분극화를 개시하는 자극에 의존하여 서브세트로 나누어질 수 있다: M2a 서브타입은 IL-4, IL-13 또는 진균류 및 유충 감염에 의해 유발되고; M2b는 IL-1 수용체 리간드, 면역 복합체 및 LPS에 의해 유발되고; M2c는 IL-10, TGF-β 및 글루코코르티코이드에 의해 유발되고; M2d는 IL-6 및 아데노신에 의해 유발된다. M2 대식세포 분극화는 또한 IL-21, GM-CSF, 보체 성분 및 아폽토시스 세포에 의해 유발될 수 있다. 대식세포 분극화는 또한 저산소증과 같은 국부 미세환경 조건에 의해 조절된다.
상기 언급된 분자 및 환경은 전사 인자가 관여하는 상이한 세포내 신호전달 경로를 유발함으로써 대식세포 분극화에 영향을 미친다. M1 및 M2 분극화 둘 다에 관여하는 전사 인자는 IRF, 신호 변환인자 및 전사의 활성화인자 (STAT), SOCS3 단백질, 및 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄 인핸서 (NFκB)를 포함한다. 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK)는 또한 대식세포 기능을 M1 또는 M2 표현형 중 어느 하나를 향하도록 지시하는데 역할을 수행한다.
상기 논의된 바와 같은 IFN 및 TLR 신호전달과 같은 상기 자극에 의해 활성화되는 IRF/STAT 경로는 대식세포를 STAT1을 통해 M1 활성화 상태로 분극화시킨다. 한편, IL-4 및 IL-13과 같은 상기 자극은 대식세포가 STAT6을 통해 M2 활성화 상태를 향하도록 한다 (Sica A & Bronte V (2007) J Clin Invest 117: 1155-1166). 따라서, 이들 신호전달 이벤트는 M1 대식세포 분극화의 경우에서와 같이 염증성 면역 반응 및 살종양 활성의 촉진 또는 M2 대식세포 분극화의 경우에서와 같이 면역억제 종양촉진 반응의 촉진을 유도한다.
M1 표현형의 유도에 관여하는 일부 세포내 분자는 NOS2를 통해 NO를 유도하는 역할을 수행하는 P2Y(2)R인 G-단백질 커플링된 수용체 (Eun SY et al. (2014) Int Immunopharmacol 18: 270-276); NO를 생성하기 위해 NFκB/PI-3 키나제 경로를 활성화하는 SOCS3 (Arnold CE et al. (2014) Immunology 141: 96-110); 및 M1 마커를 촉진시키고 IL-10을 하향조절하는 성장 및 분화 인자 액티빈 A (Sierra-Filardi E et al. (2011) Blood 117: 5092-5101)를 포함한다.
M1 표현형의 유도에 관여하는 다른 세포내 분자는 IRF를 포함한다. IRF는 IFN의 바이러스-매개된 활성화 및 세포 성장의 조절, 분화, 아폽토시스 및 면역계 활성을 포함하는 다양한 역할을 갖는 전사 인자 그룹이다. IRF 계열의 구성원은 트립토판 (W) 반복체를 함유하는 보존된 N-말단 DNA-결합 도메인을 특징으로 한다.
IRF5는 나선구조-회전-나선구조 (helix-turn-helix) DNA-결합 모티프를 갖고 바이러스- 및 IFN-유도된 신호전달 경로를 매개하는 전사 인자이다. 이것은 대식세포가 염증을 촉진시키거나 억제할지를 제어하는 분자 스위치로서 작용한다. IRF5는 유형 I IFN 유전자, TNF, IL-6, IL-12 및 IL-23을 포함하는 염증성 사이토킨, 및 종양 서프레서뿐만 아니라, Th1 및 Th17 반응을 활성화시킨다. 이것은 염색체 7q32에 위치한 사람 IRF5 유전자에 의해 암호화되어 있다(OMIM ID 607218). IRF5의 여러 이소형/전사 변이체가 존재하는 것으로 인지된다. 특정 구현예에서, 사람 IRF5의 이소형은 이소형 1 (UniProt 승인번호 Q13568-1, 서열번호 1), 이소형 2 (UniProt 승인번호 Q13568-2, 서열번호 2), 이소형 3 (UniProt 승인번호 Q13568-3, 서열번호 3), 이소형 4 (UniProt 승인번호 Q13568-4, 서열번호 4), 이소형 5 (UniProt 승인번호 Q13568-5, 서열번호 5) 및 이소형 6 (UniProt 승인번호 Q13568-6, 서열번호 6)을 포함한다. 특정 구현예에서, 사람 IRF5의 이소형은 서열번호 23에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 이소형 1, 서열번호 24에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 이소형 2, 서열번호 25에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 이소형 3, 서열번호 26에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 이소형 4, 서열번호 27에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 이소형 5 및 서열번호 28에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 이소형 6을 포함한다. 특정 구현예에서, 뮤린 IRF5는 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 뮤린 IRF5는 서열번호 29에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. M1 대식세포는 IRF5를 상향조절하는 것으로 나타났다.
IRF1 및 IRF8은 또한 IFN-γ와 같은 전염증성 신호에 의한 대식세포의 활성화를 포함하는, 골수 세포의 발달 및 기능에 중요한 역할을 수행한다. Dror N et al. (2007) Mol Immunol. 44(4):338-346. 특정 구현예에서, 사람 IRF1은 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 사람 IRF1은 서열번호 30에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 뮤린 IRF1은 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 뮤린 IRF1은 서열번호 34에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 사람 IRF8은 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 사람 IRF8은 서열번호 33에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 뮤린 IRF8은 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 뮤린 IRF8은 서열번호 38에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
IRF3은 IRF1 및 IRF2의 동족체이다. 이것은 NES, DBD, C-말단 IRF 연합 도메인 및 여러 조절 인산화 부위를 포함하는 여러 기능성 도메인을 함유한다. IRF3은 세린/트레오닌 인산화시 전사 보조활성화인자인 CREB 결합 단백질과 복합체를 형성하는 불활성 세포질 형태로 발견된다. 상기 복합체는 핵으로 이동하고 IFN-α 및 -β의 전사뿐만 아니라, 다른 인터페론-유도된 유전자의 전사를 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 사람 IRF3의 이소형은 이소형 1 (UniProt 승인번호 Q14653-1), 이소형 2 (UniProt 승인번호 Q14653-2), 이소형 3 (UniProt 승인번호 Q14653-3), 이소형 4 (UniProt 승인번호 Q14653-4), 및 이소형 5 (UniProt 승인번호 Q14653-5)를 포함한다. 특정 구현예에서, 사람 IRF3 이소형 1은 서열번호 9에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 사람 IRF3 이소형 1은 서열번호 31에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 뮤린 IRF3는 서열번호 13에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 뮤린 IRF3는 서열번호 35에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
IRF7은 유형 I IFN 유전자의 전사 활성화에서 일정 역할을 수행하는 것으로 나타났다. 특정 구현예에서, 사람 IRF7의 이소형은 이소형 A (UniProt 승인번호 Q92985-1), 이소형 B (UniProt 승인번호 Q92985-2), 이소형 C (UniProt 승인번호 Q92985-3), 및 이소형 D (UniProt 승인번호 Q92985-4)를 포함한다. 특정 구현예에서, 사람 IRF7 이소형 A는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 사람 IRF7 이소형 A는 서열번호 32에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 뮤린 IRF7은 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 뮤린 IRF7은 서열번호 36에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
IRF 활성화에 기여하는 하나 이상의 IRF 돌연변이체가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어: 아미노산 잔기 S425, S427, S430, S436을 인산화 모방 잔기, 예를 들어, 아스파르트산 잔기로 치환하는 IRF5의 사람 변이체 3/변이체 4의 포스포모사체 돌연변이체 (이소형 4, 서열번호 4) (Chen W et al. (2008) Nat Struct Mol Biol. 15(11): 1213-1220); 아미노산 잔기 T10, S158, S309, S317, S451, 및/또는 S462를 인산화 모방 잔기, 예를 들어, 아스파르트산 잔기로 치환하는 IRF5의 사람 변이체 5의 포스포모사체 돌연변이체(이소형 2, 서열번호 2) (Chang Foreman H-C et al. 하기 참조(infra)); IRF5의 항상성 핵 축적을 위해 사람 IRF5 이소형 a (변이체 1, 이소형 3, 서열번호 3) 및 이소형 b(변이체 2, 이소형 1, 서열번호 1) 잔기 S156, S158 및 T160의 인산화 모방 잔기, 예를 들어, 아스파르트산 잔기로의 돌연변이 (Lin R et al. (2005) J Biol Chem 280(4): 3088-3095); 및 IRF3의 아미노산 잔기 S396을 인산화 모방 잔기, 예를 들어, 아스파르트산 잔기로 치환하는 IRF3 포스포모사체 돌연변이체 (Chen W et al. 하기 참조). 특정 구현예에서, 뮤린 IRF7/IRF3의 융합 단백질은 IRF3 연합 도메인 (서열번호 15)에서 4개의 세린 및 1개의 트레오닌 잔기에서 Asp(D) 돌연변이를 포함하고, 융합 단백질의 항상성 활성화 및 이동을 부여한다 (Lin R et al. (1998) 상기와 같음; Lin et al. (2000) Molecular and Cellular Biology 20: 6342-6353). 특정 구현예에서, IRF3 연합 도메인에서 4개의 세린 및 1개의 트레오닌 잔기에서 D 돌연변이를 포함하는 뮤린 IRF7/IRF3의 융합 단백질은 서열번호 37에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 뮤린 IRF8 돌연변이체는 아미노산 잔기 310에서 라이신 (K)의 아르기닌 (R)으로의 치환 (서열번호 17)을 포함한다. 특정 구현예에서, 아미노산 잔기 310에서 K의 R로의 치환을 포함하는 뮤린 IRF8 돌연변이체는 서열번호 39에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. K310에서 주로 IRF8에 결합된 작은 유비퀴틴-형 개질제(SUMO)는 IRF8 반응 유전자의 활성화를 억제한다. 센트린-특이적 프로테아제 1 (SENP1)은 SUMO 2/3을 표적화한다. SENP1의 활성은 IRF8 (및 다른 단백질)을 "탈수모일화 (deSUMOylate)"하고 IRF8이 M1 대식세포 분화의 리프레서로부터 활성화인자 (직접 및 트랜스활성화 활성을 통해)로 전환되도록 한다. K310 잔기의 돌연변이에 의한 IRF8로의 SUMO 결합 방지는 IRF8 특이적 유전자 전사를 2 내지 5배로 증가시킨다(참조: Chang T-H et al. (2012) 상기와 같음).
본원 개시내용의 특정 구현예는 가공된 IRF 전사 인자를 포함한다. 특정 구현예에서, 가공된 IRF 전사 인자는 기능성 자가억제 도메인이 없고 따라서 피드백 불활성화에 무감각한 IRF를 포함한다 (Thompson et al. (2018) Front Immunol 9: 2622). 예를 들어, 활성이 2 내지 3배 증가된 사람 IRF5는 사람 IRF5 단백질의 aa 489-539를 결실시킴으로써 수득될 수 있다 (Barnes et al. (2002) Mol Cell Biol 22: 5721-5740). 특정 구현예에서, M2 표현형을 촉진시키는 전사 인자인 IRF4의 자가억제 도메인은 결실되거나 돌연변이되어 자가면역 질환을 치료하는 것과 관련하여 보다 활성인 IRF4를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, IRF의 자가억제 도메인은 IRF 단백질의 카복시 말단에서 발견된다. 특정 구현예에서, 가공된 IRF 전사 인자는 하나 이상의 기능성 핵 배출 신호 (NES)가 부재여서 핵 내 IRF가 있도록 함에 따라서 전사를 증진시키는 IRF를 포함한다. 예를 들어, 사람 IRF5의 핵 축적은 2개의 류신 잔기를 알라닌으로 대체함으로써 (L157A/L159A) 사람 IRF5의 NES를 돌연변이시켜 성취될 수 있다 (Lin et al. (2000) Molecular and Cellular Biology 20: 6342-6353). 특정 구현예에서, 가공된 IRF 전사 인자는 하나 이상의 IRF의 융합, 하나 이상의 IRF의 단편의 융합, 및 돌연변이된 IRF의 융합을 포함한다.
NFκB는 또한 대식세포 M1 활성화와 관련된 핵심 전사 인자이다. NFκB는 TNFα, IL1B, 사이클로옥시게나제 2 (COX-2), IL-6, 및 IL12p40을 포함하는 다수의 염증성 유전자의 발현을 조절한다. NFκB 활성은 카파 B 키나제 (IKK) 삼량체 복합체 (2개의 키나제, IKKα, IKKβ, 및 조절 단백질, IKKγ)의 억제제의 활성화를 통해 조절된다. 상부 신호(upstream signal)가 IKK 복합체에서 수렴하는 경우, 이들은 먼저 인산화를 통해 IKKβ 키나제를 활성화시키고 활성화된 IKKβ는 추가로 카파 B(I-κB)의 억제제인 억제 분자를 인산화시킨다. 이것은 I-κB의 프로테오좀성 분해 및 NFκB/I-κB 복합체로부터 NFκB p65/p50 이종이량체의 방출을 유도한다. 이어서, NFκB p65/p50 이종이량체는 핵으로 이동하고 염증성 유전자의 프로모터에 결합한다.
IKKβ는 IRF5와 같은 다른 전사 인자 뿐만 아니라 NFκB에 대한 활성화 키나제이다. IKKβ는 유사하게 IKK-관련 키나제 TBK1 및 IKBKE뿐만 아니라 FOXO3, NCOA3, BCL10, IRS1, NEMO/IKBKG, NFκB 서브유닛 RELA 및 NFKB1을 포함하는 여러 다른 신호전달 경로 성분을 인산화시킨다. 특정 구현예에서, 사람 IKKβ의 이소형은 이소형 1 (UniProt 승인번호 O14920-1, 서열번호 18), 이소형 2 (UniProt 승인번호 014920-2, 서열번호 19), 이소형 3 (UniProt 승인번호 O14920-3, 서열번호 20) 및 이소형 4 (UniProt 승인번호 O14920-4, 서열번호 21)을 포함한다. 특정 구현예에서, 사람 IKKβ의 이소형은 서열번호 40에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 이소형 1, 서열번호 41에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 이소형 2, 서열번호 42에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 이소형 3, 및 서열번호 43에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 이소형 4를 포함한다. 특정 구현예에서, 뮤린 IKKβ는 서열번호 22에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 뮤린 IKKβ는 서열번호 44에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
본원의 개시내용은 IRF를 활성화시켜 TAM 재프로그래밍을 종양 사멸을 위한 활성화된 상태가 되도록 할 수 있는 하나 이상의 분자와 함께 IRF 전사 인자의 동시-발현을 제공한다. 특정 구현예에서, 동시-발현 전략은 다음을 포함한다: IRF5 및 IKKβ의 동시 발현; IRF5 및 TANK-결합 키나제-1 (TBK-1), TNF 수용체-연합된 인자 6 (TRAF6) 어댑터, 수용체 상호작용 단백질 2 (RIP2) 키나제 및/또는 NFκB 키나제-ε (IKKε)의 동시 발현 (Chang Foreman H-C et al. (2012) PLoS One 7(3): e33098); IRF5 및 단백질 키나제 DNA-PK의 동시 발현 (Ryzhakov G et al. (2015) J of Interferon & Cytokine Res 35(2): 71-78); IRF5 및 단백질 키나제 티로신 키나제 BCR-ABL의 동시 발현 (Massimo M et al. (2014) Carcinogenesis 35(5):1132-1143); 및 COP9 시그날로좀의 하나 이상의 성분과 함께 IRF5 또는 IRF8의 동시 발현 (Korczeniewska J et al. (2013) Mol Cell Biol 33(6):1124-1138; Cohen H et al. (2000) J Biol Chem 275(50):39081-39089).
특정 구현예에서, 본원 개시내용의 교시는 과면역 활성화에 의해 유발되는 병태 (예를 들어, 자가면역 질환)의 관리에 적용될 수 있다. 대식세포는 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 및 쇼그렌 증후군과 같은 자가면역 질환에서 주요 역할을 수행한다 (Ushio et al. World J Immunol 2017; 7(1): 1-8). 따라서, 면역억제 M2 표현형을 지지하는 세포 경로가 또한 기재된다.
M2 표현형의 유도에 연루된 활성화 조절인자는 크루펠형 (
Figure pct00002
)형 인자 4 (KLF-4)이다. KLF-4는 STAT6과 협력하여 Arg-1, CD206 (Mrc1, 만노스 수용체), Fizz1 (레시스틴-형 α) 및 퍼옥시좀 증식기-활성화된 수용체 감마(PPArγ)와 같은 M2 유전자를 유도하고, TNFα, Cox-2, CCL5 및 iNOS와 같은 M1 유전자를 억제한다. 핵 수용체, PPARγ는 산화 대사 및 M2 표현형의 활성화에 관여하는 유전자를 조절하는 것으로 나타났다 (Odegaard JI et al. (2007) Nature 447: 1116-1120).
사이토킨 IL-21은 NOS2 발현을 감소시키고 STAT3 인산화를 증가시킴으로써 M2 분극화를 매개한다 (Li SN et al. (2013) Mediators Inflamm 2013, 548073).
IRF4는 M2 표현형을 구동하기 위해 MyD88과 무관한 방식으로 TLR 신호전달을 음성으로 조절한다 (Satoh T et al. (2010) Nat Immunol 11, 936-944). 특정 구현예에서, 사람 IRF4는 UniProt 승인번호 Q15306이다. BMP-7은 또한 SMAD-PI3K-Akt-mTOR 경로의 활성화를 통해 시험관내 M2 분극화를 유도한다 (Rocher C et al. (2013) Plos One 8: e84009).
전사 인자 글루코르티코이드-유도된 류신 지퍼 (GILZ). GILZ는 다양한 세포 유형에서 글루코코르티코이드 (GC) 작용을 매개하는 덱사메타손-유도가능한 유전자이고 이것은 억제성 M2 대식세포 표현형을 유도할 수 있다. GILZ 발현은 GC에 의해 신속하고 편재적으로 유도되고 단백질 생성물은 NF-κB, Raf-1, TORC2, AP-1, Ras, 및 C/EBP와 같은 공지된 전사 인자와 상호작용하여 염증성 촉진 유전자의 발현을 억제한다. 따라서, GILZ는 GC의 치료학적 항-염증성 효과를 모사할 수 있는 반면 해로운 것을 회피한다 (Ronchetti, S. et al. Front Endocrinol (Lausanne) 2015; 6: 170). 특정 구현예에서, GILZ는 서열번호 110에 나타낸 아미노산 서열의 사람 GILZ이다. 특정 구현예에서, GILZ는 서열번호 111에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 사람 GILZ이다.
지적된 바와 같이, 저산소증은 또한 저산소증 유도가능한 인자 HIF-1α 및 HIF-2α를 통한 대식세포 분극화에 영향을 미친다. HIF-1α는 NOS2 발현을 조절하고 M1 표현형의 출현을 지지하는 반면 HIF-2α는 Arg1 발현을 조절하고 M2 표현형의 출현을 지지한다 (Takeda N et al. (2010) Genes Dev 24: 491-501).
Figure pct00003
(3) 뉴클레오타이드. 본원의 개시내용 내에서, 활성화 상태를 조절하는 뉴클레오타이드 암호화 유전자는 면역 세포에 전달된다. "유전자"는 활성화 조절인자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 상기 정의는 다양한 서열 다형태, 돌연변이, 및/또는 서열 변이체를 포함하고, 여기서, 상기 변경은 활성화 조절인자의 기능에 영향을 주지 않는다. 용어 "유전자"는 암호화 서열뿐만 아니라 프로모터, 인핸서 및 종결 영역과 같은 조절 영역을 포함할 수 있다. 상기 용어는 추가로 대체 스플라이스 부위로부터 비롯된 변이체와 함께 모든 인트론 및 mRNA 전사체로부터 스플라이싱된 다른 DNA 서열을 포함할 수 있다. 활성화 조절인자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 활성화 조절인자의 발현을 지시하는 RNA일 수 있다. 이들 뉴클레오타이드 서열은 특정 구현예에서 단백질로 해독되는 RNA 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 당업자는 티민 (T) 염기를 포함하는 DNA 서열이 T 염기가 우라실 (U) 염기로 대체된 것을 제외하고는 동일한 서열을 갖는 mRNA 서열과 동일할 수 있음을 인지할 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 전장 단백질로부터 유래된 비-전장 서열 뿐만 아니라 전장 뉴클레오타이드 서열 둘 다를 포함한다. 서열은 또한 본래의 서열 또는 특정 면역 세포에서 코돈 선호도를 제공하기 위해 도입될 수 있는 서열의 축퇴성 코돈을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 활성화 조절인자를 암호화하기 위한 유전자 서열은 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스 및 공보에서 가용하다. "암호화"는 활성화 조절인자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는, 플라스미드, 유전자, cDNA, mRNA와 같은 뉴클레오타이드의 서열의 특성을 언급한다.
특정 구현예에서, 뉴클레오타이드는 합성 mRNA를 포함한다. 특정 구현예에서, 합성 mRNA는 5'-캡핑을 사용하여 증가된 세포내 안정성을 위해 가공된다. 다수의 특유의 5'-캡 구조를 사용하여 합성 mRNA 분자의 5'-캡을 생성할 수 있다. 예를 들어, 항-역 캡 유사체(ARCA) 캡은 5'-5'-트리포스페이트 구아닌-구아닌 연결체를 함유하고 여기서, 하나의 구아닌은 3'-O-메틸 그룹 뿐만 아니라 N7 메틸 그룹을 함유한다. 합성 mRNA 분자는 또한 5'-캡 구조를 생성하는데 관여하는 효소를 사용하여 전사 후 캡핑될 수 있다. 예를 들어, 재조합 백시니아 바이러스 캡핑 효소 및 재조합 2'-O-메틸트랜스퍼라제 효소는 mRNA의 5'-최외곽 뉴클레오타이드와 구아닌 뉴클레오타이드 간의 정규 5'-5'-트리포스페이트 연결체를 생성할 수 있고, 여기서, 상기 구아닌은 N7 메틸화를 함유하고 궁극적인 5'-뉴클레오타이드는 Cap1 구조를 생성하는 2'-O-메틸을 함유한다. 이것은 보다 높은 해독-역량 및 세포 안정성 및 세포 전염증성 사이토킨의 감소된 활성화를 갖는 캡을 유도한다.
특정 구현예에서, 면역원성을 감소시키고 mRNA 안정성을 촉진시키고/시키거나 mRNA의 해독을 촉진시키기 위한 합성 mRNA의 다른 변형은 5'- 및 3'-말단 비해독 영역 (UTR), 5' UTR에서 코작 해독 개시 서열, 변형된 리보뉴클레오시드, 및/또는 폴리A 테일을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 리보뉴클레오시드는 슈도우리딘 (Ψ), 5-메틸시티딘 (5mC), N6-메틸아데노신 (m6A), 2-티오우리딘 (2sU), 5-메톡시우리딘 (5moU), 및 N-1-메틸슈도우리딘 (m1Ψ)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, UTR은 알파- 및/또는 베타-글로빈 UTR을 포함할 수 있다. 합성 mRNA를 생성하는 특정 구현예는 상응하는 DNA 플라스미드로부터 PCR 증폭에 의해 5' T100-250 오버행을 갖는 목적하는 단백질의 암호화 DNA 서열을 함유하는 DNA 주형을 생성함을 포함한다. 이어서 DNA 주형을 사용하여 시험관내 전사 반응에 의해 mRNA를 생성할 수 있다. 시험관내 전사 동안에, 5' 캡 구조 (예를 들어, ARCA), 변형된 리보뉴클레오시드, 및/또는 3' 폴리(A) 테일은 혼입될 수 있다. 다수의 시험관내 전사 시스템은 다음을 포함하는 것으로부터 시판된다: 예를 들어, MEGAscript T7 전사 키트 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), Riboprobe™ 시스템 T7 (Promega, Madison, WI), AmpliScribe™ T7 고수율 전사 키트 (Epicentre, Madison, WI), 및 HiScribe™ T7 시험관내 전사 키트 (New England Biolabs, Ipswich, MA). 특정 구현예에서, 합성 mRNA는 핵산을 합성하는 회사 (예를 들어, TriLink Biotechnologies, San Diego, CA)에 의해 합성될 수 있다.
합성 mRNA 또는 다른 뉴클레오타이드는 사이클릭으로 만들어질 수 있다. 상기 뉴클레오타이드는 환형화되거나 연결되어 폴리-A 결합 단백질과 5'-말단 결합 단백질 간의 상호작용을 돕기 위해 해독 컴피턴트 분자를 생성할 수 있다. 환형화 또는 연결의 기전은 적어도 3개의 상이한 경로를 통해 일어날 수 있다: 1) 화학적, 2) 효소적, 또는 3) 리보자임 촉매된. 새롭게 형성된 5'-/3'-연결은 분자내 또는 분자간일 수 있다.
제1 경로에서, 뉴클레오타이드의 5'-말단 및 3'-말단은 함께 밀접해지는 경우 분자의 5'-말단과 3'-말단 간에 새로운 공유 연결을 형성하는 화학적 반응성 그룹을 함유할 수 있다. 5'-말단은 NHS-에스테르 반응성 그룹을 함유할 수 있고 3'-말단은 3'-아미노-종결된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있어 유기 용매 중에서 뉴클레오타이드 분자의 3'-말단 상에 3'-아미노-종결된 뉴클레오타이드는 새로운 5'-/3'-아미드 결합을 형성하는 5'-NHS-에스테르 모이어티 상에 친핵 공격을 진행할 것이다.
제2 경로에서, T4 RNA 리가제를 사용하여 5'-인산화된 뉴클레오타이드 분자를 핵산의 3'-하이드록실 그룹에 효소적으로 연결하여 새로운 포스포로디에스테르 연결을 형성할 수 있다. 예시 반응에서, 1 μg의 핵산 분자는 제조업자의 프로토콜에 따라 1시간 동안 37℃에서 1 내지 10 유닛의 T4 RNA 리가제 (New England Biolabs, Ipswich, MA)로 항온처리될 수 있다. 연결 반응은 효소적 연결 반응을 원조하기 위해 위치주변에서 5'- 및 3'-영역 둘 다와 염기-쌍을 형성할 수 있는 스플릿 올리고뉴클레오타이드의 존재하에 일어날 수 있다.
제3 경로에서, cDNA 주형의 5'- 또는 3'-말단은 리가제 리보자임 서열을 암호화하여 시험관내 전사 동안에, 수득한 뉴클레오타이드 분자는 핵산 분자의 5'-말단을 핵산 분자의 3'-말단에 연결할 수 있는 활성 리보자임 서열을 함유할 수 있다. 리가제 리보자임은 그룹 I 인트론, 간염 델타 바이러스, 헤어핀 리보자임으로부터 유래할 수 있거나, 또는 SELEX (대수적 농축에 의한 리간드의 시스템적 진화)에 의해 선택될 수 있다. 리보자임 리가제 반응은 0 내지 37℃의 온도에서 1 내지 24시간 소요될 수 있다.
특정 구현예에서, 뉴클레오타이드는 예를 들어, 활성화 조절인자를 발현시키기 위한 서열 (예를 들어, 유전자)을 포함할 수 있는 플라스미드, cDNA 또는 mRNA를 포함한다. 적합한 플라스미드는 유전자를 림프구에 전달하기 위해 사용될 수 있는 표준 플라스미드 벡터 및 소형 환형 플라스미드를 포함한다. 뉴클레오타이드 (예를 들어, 소형 환형 플라스미드)는 변형된 세포에서 일시적 발현을 촉진시키기 위한 임의의 추가의 서열정보를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드는 일반 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 세포-특이적 프로모터 및/또는 세포질에 특이적인 프로모터와 같은 프로모터를 포함할 수 있다. 지적된 바와 같이, 프로모터 및 플라스미드(예를 들어, 소형 환형 플라스미드)는 일반적으로 당업계에 널리 공지되어 있고 통상적인 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
특정 구현예에서, IRF를 암호화하는 뉴클레오타이드는 다른 IRF를 암호화하는 하나 이상의 추가의 뉴클레오타이드와 조합하여 사용된다. 특정 구현예에서, IRF를 암호화하는 뉴클레오타이드는 다른 IRF를 암호화하는 하나 이상의 추가의 뉴클레오타이드 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드와 조합하여 사용된다. 특정 구현예에서, IRF를 암호화하는 뉴클레오타이드는 0.5:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 또는 5:1의 비율로 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드와 조합하여 사용된다. 특정 구현예에서, IRF를 암호화하는 뉴클레오타이드는 3:1의 비율로 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드와 조합하여 사용된다.
특정 구현예는 유전자 편집 시스템 내에서 뉴클레오타이드를 전달할 수 있다. 유전자 편집 시스템은 세포의 내인성 게놈의 특정 서열을 변형시키거나 이에 영향을 미친다. 유전자 편집 시스템은 표적화된 게놈 편집, 예를 들어, 유전자 파괴, 상동성 재조합에 의한 유전자 편집, 및 사람 게놈을 갖는 적당한 염색체 표적 부위에 치료학적 유전자를 삽입하기 위한 유전자 치료요법을 위해 유용하다.
특정 구현예는 유전자 편집 시스템으로서 전사 활성화인자-형 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 사용한다. TALEN은 전사 활성화인자형 이펙터 (TALE) DNA 결합 단백질 및 DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 언급한다. TALEN은 세포 내 복구 기전을 유도하는, DNA에서 이중 가닥 절단 (DSB)을 유도함으로써 유전자 및 게놈을 편집하기 위해 사용된다. 일반적으로, 2개의 TALEN은 DNA 절단 도메인이 이량체화하고 DSB를 유도하기 위해 표적 DNA 부위의 각 측면에 결합하고 이를 플랭킹해야만 한다. DSB는 외인성 이중 가닥 공여자 DNA 단편과의 비-상동성 말단-연결 (NHEJ)에 의해 또는 상동성 재조합 (HR)에 의해 세포에서 복구된다.
지적된 바와 같이, TALEN은 예를 들어, 내인성 게놈의 표적 서열에 결합하도록 가공되었고 표적 서열의 위치에서 DNA를 절단하였다. TALEN의 TALE는 크산토모나스 세균에 의해 분비된 DNA 결합 단백질이다. TALE의 DNA 결합 도메인은 고도로 보존된 33개 또는 34개의 아미노산 반복체를 포함하고 각각의 반복체의 12번째 및 13번째 위치에 상이한 잔기를 갖는다. 반복체 가변 이잔기 (Repeat Variable Diresidue) (RVD)로서 언급되는 이들 2개의 위치는 특정 뉴클레오타이드 인지와 강한 상관관계를 보여준다. 따라서, 표적화 특이성은 RVD에서 아미노산을 변화시키고 비통상적인 RVD 아미노산을 혼입함으로써 개선될 수 있다.
TALEN 융합에 사용될 수 있는 DNA 절단 도메인의 예는 야생형 및 변이체 FokI 엔도뉴클레아제이다. FokI 도메인은 표적 서열 상의 부위에 대한 독특한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 작제물을 요구하는 이량체로서 기능한다. FokI 절단 도메인은 2개의 반전된 절반 부위를 분리하는 5개 또는 6개 염기쌍 스페이서 서열 내에서 절단된다.
특정 구현예는 유전자 편집 시스템으로서 MegaTAL을 사용한다. MegaTAL은 단일쇄 희귀-절단 뉴클레아제 구조물을 갖고, 여기서, TALE는 메가뉴클레아제의 DNA 절단 도메인과 융합된다. 귀소 엔도뉴클레아제로서도 공지된 메가뉴클레아제는 동일한 도메인에서 DNA 인지 및 뉴클레아제 기능 둘 다를 갖는 단일 펩타이드 쇄이다. TALEN과 대조적으로, megaTAL은 단지 기능적 활성을 위해 단일 펩타이드 쇄의 전달을 필요로 한다.
특정 구현예는 유전자 편집 시스템으로서 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 사용한다. ZFN은 특정 위치에서 DNA에 결합하고 이를 절단하도록 가공된 부위-특이적 뉴클레아제 부류이다. ZFN은 다양한 상이한 세포에서 ZFN이 게놈 내 독특한 서열을 표적화할 수 있는 DNA 서열 내 특정 부위에서 DSB를 도입하기 위해 사용된다. 더욱이, 이중-가닥 절단에 후속적으로, 상동성 재조합 또는 비-상동성 말단 연결은 DSB를 복구함에 따라서 게놈 편집을 가능하게 하기 위해 발생한다.
ZFN은 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 합성된다. DNA-결합 도메인은 전사 인자인 3개 내지 6개의 아연 핑거 단백질을 포함한다. DNA 절단 도메인은 예를 들어, FokI 엔도뉴클레아제의 촉매 도메인을 포함한다.
가이드 RNA는 예를 들어 CRISPR-Cas 시스템과 같은 유전자-편집 시스템과 함께 사용될 수 있다. CRISPR-Cas 시스템은 CRISPR 반복체 및 CRISPR-연합 유전자 (Cas) 세트를 포함한다.
일반적으로, 전달된 뉴클레오타이드의 기능적 발현을 유도할 수 있는 임의의 시스템은 본원의 개시내용 내에서 사용될 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 바이러스 벡터를 사용하는 전달은 배제된다.
(4) 입자. 본원에 개시된 시스템 및 방법 내에서 사용되는 입자는 뉴클레오타이드를 응축시키고 효소 분해로부터 이를 보호하는 기능을 할 수 있다. 상기 목적을 위한 입자 내에서 사용하기 위해 특히 유용한 재료는 양으로 하전된 지질 및/또는 폴리(β-아미노 에스테르) (PbAE)를 포함하는 중합체를 포함한다.
양으로 하전된 지질의 예는 아미노알콜과 포스파티드산의 에스테르, 예를 들어, 디팔미토일 포스파티드산 또는 디스테아로일 포스파티드산과 하이드록시에틸렌디아민의 에스테르를 포함한다. 양으로 하전된 지질의 보다 특정 예는 3β-[N--(N',N'-디메틸아미노에틸)카바모일) 콜레스테롤 (DC-chol); N,N'-디메틸-N,N'-디옥타실 암모늄 브로마이드(DDAB); N,N'-디메틸-N,N'-디옥타실 암모늄 클로라이드 (DDAC); 1,2-디올레오일옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 클로라이드(DORI); 1,2-디올레오일옥시-3-[트리메틸암모니오]-프로판 (DOTAP); N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA); 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC); 1,2-디옥타데실옥시-3-[트리메틸암모니오]-프로판 (DSTAP); 및 예를 들어, 문헌 (Martin et al., Current Pharmaceutical Design 2005, 11, 375-394)에 기재된 양이온 지질을 포함한다.
본원의 개시내용의 입자 내에서 사용될 수 있는 양으로 하전된 중합체의 예는 폴리아민; 폴리유기 아민 (예를 들어, 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리에틸렌이민 셀룰로스); 폴리(아미도아민) (PAMAM); 폴리아미노산(예를 들어, 폴리라이신(PLL), 폴리아르기닌); 폴리사카라이드 (예를 들어, 셀룰로스, 덱스트란, DEAE 덱스트란, 전분); 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리(비닐벤질 트리알킬 암모늄), 폴리(4-비닐-N-알킬-피리디늄), 폴리(아크릴오일-트리알킬 암모늄), 및 Tat 단백질을 포함한다.
임의의 농도에서 및 임의의 비율로의 지질 및 중합체의 블렌드가 또한 사용될 수 있다. 다양한 등급을 사용한상이한 비율로의 상이한 중합체 유형의 블렌딩은 기여하는중합체 각각으로부터 비롯된 특징을 유도할 수 있다. 다양한 말단 그룹의 화학적 성질이 또한 채택될 수 있다.
본원에 개시된 특정 구현예는 또한 다공성 네트워크를 형성할 수 있는 임의의 재료로부터 작제된 다공성 입자를 사용할 수 있다. 예시적 재료는 금속, 전이 금속 및 메탈로이드를 포함한다. 예시적 금속, 전이 금속 및 메탈로이드는 리튬, 마그네슘, 아연, 알루미늄 및 실리카를 포함한다. 특정 구현예에서, 다공성 입자는 실리카를 포함한다. 메소다공성 실리카의 예외적으로 높은 표면적 (1,000 m2/g을 초과하는)은 리포좀과 같은 통상적인 DNA 운반체를 초과하는 수준에서 뉴클레오타이드 로딩을 가능하게 한다.
입자는 구형, 입방형, 피라미드형, 장방형, 원통형, 토로이드형 등을 포함하는 다양하게 상이한 형태로 형성될 수 있다. 뉴클레오타이드는 다양한 방식으로 입자의 공극에 포함될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드는 다공성 입자로 캡슐화될 수 있다. 다른 양상에서, 뉴클레오타이드는 다공성 입자의 표면 또는 이의 인접한 기저 부근과 연관 (예를 들어, 공유적으로 및/또는 비공유적으로)될 수 있다. 특정 구현예에서, 뉴클레오타이드는 예를 들어, 다공성 입자의 재료에 통합된 다공성 입자에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드는 중합체 입자의 중합체 매트릭스내에 혼입될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 입자는 코팅을 포함한다. 코팅은 캡슐화된 뉴클레오타이드를 보호하고/하거나 오프-표적 결합을 감소시키거나 방지하는 작용을 할 수 있다. 오프-표적 결합은 입자의 표면 전하를 중성 또는 음성으로 환원시킴으로써 감소되거나 방지된다. 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 개시된 바와 같이, 코팅은 중성 또는 음으로 하전된 중합체- 및/또는 리포좀-기반 코팅을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 코팅은 캡슐화된 뉴클레오타이드가 면역 세포로 방출되기 전 환경에 노출되는 것을 방지하기에 충분한 친수성 및/또는 중성으로 하전된 친수성 중합체의 조밀한 표면 코팅이다. 특정 구현예에서, 코팅은 입자 표면의 적어도 80% 또는 적어도 90%를 차지한다. 특정 구현예에서, 코팅은 폴리글루탐산(PGA)을 포함한다. 특정 구현예에서, PGA는 표적화 리간드를 입자에 부착시키기 위한 링커로서 작용할 수 있다. 특정 구현예에서, PGA는 디만노스를 입자에 부착시키기 위한 링커로서 작용할 수 있다. 특정 구현예에서, 코팅은 하이알루론산을 포함한다.
본원의 개시내용의 구현예 내에서 코팅으로서 사용될 수 있는 중성으로 하전된 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 폴리(프로필렌 글리콜); 및 폴리알킬렌 옥사이드 공중합체 (PLURONIC®, BASF Corp., Mount Olive, NJ)를 포함한다.
중성으로 하전된 중합체는 또한 양쪽성이온 중합체를 포함한다. 양쪽성이온은 양성 및 음성 전하 둘 다를 가지면서 전체로 중성 하전의 성질을 언급한다. 양쪽성이온 중합체는 세포 및 단백질 접착에 저항하는 세포막의 영역처럼 거동할 수 있다.
양쪽성이온 중합체는 양쪽성이온 그룹과 함께 펜던트 그룹 (즉, 중합체 골격으로부터의 펜던트 그룹)을 포함하는 양쪽성이온 구성 유닛을 포함한다. 예시적 양쪽성이온 펜던트 그룹은 카복시베타인 그룹 (예를 들어, -Ra-N+(Rb)(Rc)-Rd-CO2-, 여기서, Ra는 중합체 골격을 카복시베타인 그룹의 양이온 질소 중심과 공유적으로 커플링시키는 링커 그룹이고, Rb 및 Rc는 질소 치환체이고, Rd는 양이온 질소 중심을 카복시베타인 그룹의 카복시 그룹으로 공유적으로 커플링시키는 링커 그룹이다)을 포함한다.
음으로 하전된 중합체의 예는 알긴산; 카복실산 폴리사카라이드; 카복시메틸 셀룰로스; 카복시메틸 셀룰로스-시스테인; 카라기난 (예를 들어, GELCARIN® 209, GELCARIN® 379, FMC Corporation, Philadelphia, PA); 콘드로이틴 설페이트; 글리코사미노글리칸; 뮤코폴리사카라이드; 음으로 하전된 폴리사카라이드 (예를 들어, 덱스트란 설페이트); 폴리(아크릴산); 폴리(D-아스파르트산); 폴리(L-아스파르트산); 폴리(L-아스파르트산) 나트륨 염; 폴리(D-글루탐산); 폴리(L-글루탐산); 폴리(L-글루탐산) 나트륨 염; 폴리(메타크릴산); 나트륨 알기네이트 (예를 들어, PROTANAL® LF 120M, PROTANAL® LF 200M, PROTANAL® LF 200D, FMC Biopolymer Corp., Drammen, Norway); 나트륨 카복시메틸 셀룰로스(CMC); 황화된 폴리사카라이드(헤파린, 아가로펙틴); 펙틴, 겔라틴 및 하이알루론산을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 중합체는 "별 형태의 중합체"를 포함할 수 있고, 이는 2개 이상의 중합체 분기가 코어로부터 뻗어나온 분기된 중합체를 언급한다. 코어는 2개 이상의 기능성 그룹을 갖는 원자 그룹이고, 상기 기능성 그룹으로부터 분기가 중합에 의해 연장될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 나노입자는 별 형태의 중합체를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 나노입자는 별 형태의 중합체 및 코팅을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 나노입자는 별 형태의 중합체, 및 PGA를 포함하는 코팅을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 나노입자는 별 형태의 중합체, 및 하이알루론산을 포함하는 코팅을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 분기는 양쪽성이온 또는 음으로 하전된 중합체 분기이다. 별 중합체 (star polymer)의 경우, 분기 전구체는 가수분해, 자외선 조사 또는 열을 통해 양쪽성이온 또는 음으로 하전된 중합체로 전환될 수 있다. 상기 중합체는 또한 원자 전달 라디칼 중합(ATRP), 가역적 첨가-단편화 쇄 전달 중합(RAFT), 광-중합, 개환 중합(ROP), 응축, 마이클 첨가 (Michael addition), 분기 생성/증강 반응, 또는 기타 반응을 포함하는, 불포화 단량체의 중합에 효과적인 임의의 중합 방법에 의해 수득될 수 있다.
리포좀은 적어도 하나의 동심원 지질 이중층을 포함하는 미세 소포이다. 소포-형성 지질은 최종 복합체의 특정 정도의 유동성 또는 강성을 성취하기 위해 선택된다. 특정 구현예에서, 리포좀은 다공성 입자를 둘러싸는 외층인 지질 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 나노입자는 리포좀 나노입자를 포함한다.
리포좀은 중성 (콜레스테롤) 또는 양극성일 수 있고 인지질, 예를 들어, 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 포스파티딜이노시톨(PI), 및 스핑고마이엘린 (SM) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE)을 포함하는 기타 유형의 양극성 지질을 포함하고, 탄화수소 쇄 길이는 14 내지 22의 범위이고 포화되어 있거나 하나 이상의 이중 C=C 결합을 갖는다. 단독으로 또는 다른 지질 성분들과 조합하여 안정한 리포좀을 생성할 수 있는 지질의 예는 인지질, 예를 들어, 수소화된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고마이엘린, 세팔린, 카디올리핀, 포스파티드산, 세레브로 사이드, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민 (POPE) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도-메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (DOPE-mal)이다. 리포좀으로 혼입될 수 있는 추가의 비-인 함유 지질은 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 이소프로필 미리스테이트, 트리에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤 리시놀리에이트, 헥사데실 스테아레이트, 양쪽성 아크릴산 중합체, 폴리에틸옥실화된 지방산 아미드, DDAB, 디옥타데실 디메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP), DOTAP, DOTMA, DC-Chol, 포스파티드산 (PA), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일포스파티딜글리세롤, DOPG, 및 디세틸포스페이트를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 리포좀을 생성하기 위해 사용되는 지질은 콜레스테롤, 수소화된 대두 포스파티딜콜린 (HSPC) 및 유도체화된 소포-형성 지질 PEG-DSPE를 포함한다.
리포좀을 형성하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제4,229,360호; 제4,224,179호; 제4,241,046호; 제4,737,323호; 제4,078,052호; 제4,235,871호; 제4,501,728호; 및 제4,837,028호뿐만 아니라 Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980) and Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986))에 기재되어 있다.
입자의 크기는 광범위하게 다양할 수 있고 상이한 방식으로 측정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 입자의 크기는 <130 nm인 NP이다. 그러나, 본원 개시내용의 NP는 또한 500 nm 이하, 150 nm 미만, 140 nm 미만, 120 nm 미만, 110 nm 미만, 100 nm 미만, 90 nm 미만, 80 nm 미만, 70 nm 미만, 60 nm 미만, 50 nm 미만, 40 nm 미만, 30 nm 미만, 20 nm 미만 또는 10 nm 미만의 최소 치수를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 입자는 90 내지 130 nm 크기의 NP이다.
특정 구현예에서, NP는 5 nm 내지 500 nm, 10 nm 내지 100 nm, 20 nm 내지 90 nm, 30 nm 내지 80 nm, 40 nm 내지 70 nm, 및 40 nm 내지 60 nm 범위의 최소 치수를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 치수는 NP 또는 코팅된 NP의 직경이다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용의 입자의 집단은 500 nm 이하, 100 nm 미만, 90 nm 미만, 80 nm 미만, 70 nm 미만, 60 nm 미만, 50 nm 미만, 40 nm 미만, 30 nm 미만, 20 nm 미만, 또는 10 nm 미만의 평균 최소 치수를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 본원 개시내용의 조성물 중에 NP의 집단은 5 nm 내지 500 nm, 10 nm 내지 100 nm, 20 nm 내지 90 nm, 30 nm 내지 80 nm, 40 nm 내지 70 nm, 및 40 nm 내지 60 nm, 70 nm 내지 130 nm 또는 75 nm 내지 125 nm 범위의 평균 직경을 가질 수 있다. 입자의 치수는, 예를 들어, 역학적 광 산란 및/또는 전자 현미경과 같은 통상의 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하지 않지만, 특정 구현예에서, 마이크로입자가 또한 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, PbAE 중합체는 PbAE-뉴클레오타이드 폴리플렉스를 생성하기 위해 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 또는 그 이상의 비율로 뉴클레오타이드 (예를 들어, 시험관내 전사된 mRNA)와 혼합된다. 특정 구현예에서, PbAE 중합체는 PbAE-뉴클레오타이드 폴리플렉스를 생성하기 위해 60:1의 비율로 뉴클레오타이드 (예를 들어, 시험관내 전사된 mRNA)와 혼합된다. 특정 구현예에서, PbAE-뉴클레오타이드 폴리플렉스는 PGA/디-만노스와 조합되어 최종 NP를 형성할 수 있다.
(5) 표적화 리간드. 표적화 리간드는 입자의 표면 상에 사용될 수 있고 이종성 세포 집단 내 관심 대상의 면역 세포의 보다 선택적 결합을 유도할 수 있다.
특정 구현예에서, 표적화 리간드는 세포 마커 리간드, 수용체 리간드, 항체, 펩타이드, 펩타이드 압타머, 핵산, 핵산 압타머, 스피겔머 (spiegelmer) 또는 이의 조합으로부터 유래된 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 표적화 리간드와 관련하여, 결합 도메인은 또 다른 물질에 결합하여 세포내이입을 매개할 수 있는 복합체를 형성하는 임의의 물질을 포함한다.
특정 구현예에서, 결합 도메인은 항체로부터 유래된다. 항체로부터 유래된 결합 도메인은 전체 항체를 포함할 수 있거나 항체의 결합 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, 및 단일쇄 Fv 단편(scFv) 또는 면역 세포에 의해 발현되는 표적화된 모티프에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 임의의 생물학적 유효 단편을 포함할 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 이특이적 항체, 소형 바디 및 선형 항체의 전부 또는 일부를 포함한다.
사람 기원으로부터의 항체 또는 사람화된 항체는 사람에서 저하된 면역원성을 갖거나 면역성이 부재이고 비-사람 항체와 비교하여 보다 낮은 수의 비-면역원성 에피토프를 갖는다. 항체 및 이들의 단편은 일반적으로 사람 대상체에서 감소된 수준의 항원성을 갖거나 항원성이 부재이도록 선택될 것이다.
면역 세포에 의해 발현되는 모티프에 특이적으로 결합하는 항체는 모노클로날 항체를 수득하는 방법, 파지 디스플레이 방법, 사람 또는 사람화된 항체를 생성하기 위한 방법, 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 항체를 생산하도록 가공된 유전자전이 동물 또는 식물을 사용하는 방법 (참조: 예를 들어, US 6,291,161 및 US 6,291,158)을 사용하여 제조될 수 있다. 부분적으로 또는 완전히 합성된 항체의 파지 디스플레이 라이브러리는 가용하고 면역 세포 모티프에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 결합 도메인은 관심 대상의 표적에 특이적으로 결합하는 Fab 단편에 대한 Fab 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정될 수 있다 (참조: Hoet et al., Nat. Biotechnol. 23:344, 2005). 사람 항체의 파지 디스플레이 라이브러리가 또한 가용하다. 추가로, 간편한 시스템 (예를 들어, 마우스, HuMAb mouse®, TC mouse™, KM-mouse®, 라마, 닭, 래트, 햄스터, 토끼 등)에서 면역원으로서 관심 대상의 표적을 사용한 하이브리도마 개발을 위한 통상적인 전략은 결합 도메인을 개발하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 선택된 면역 세포에 의해 발현된 모티프에 특이적으로 결합하고 비특이적 성분 또는 관련 없는 표적과 교차 반응하지 않는다. 일단 동정되면, 아미노산 서열 또는 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 단리될 수 있고/있거나 결정될 수 있다.
온전한 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함할 수 있다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH 또는 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. 상기 VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역과 교차배치된 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자로의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 결합 능력을 보유하는 온전한 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. 결합 능력을 보유하는 단편의 예는 다음을 포함한다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 포함하는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab’)2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인을 포함하는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 Fv 단편, (v) VH 도메인을 포함하는 dAb 단편 (Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989)); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR).
소정의 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌 (Kabat et al. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (Kabat 번호매기기 방식); Al-Lazikani et al. (1997) J Mol Biol 273: 927-948 (Chothia 번호매기기 방식; Maccallum et al. (1996) J Mol Biol 262: 732-745 (Contact 번호매기기 방식); Martin et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 9268-9272 (AbM 번호매기기 방식); Lefranc M P et al. (2003) Dev Comp Immunol 27(1): 55-77 (IMGT 번호매기기 방식); 및 Honegger and Pluckthun (2001) J Mol Biol 309(3): 657-670 ("Aho" 번호매기기 방식))에 기재된 것들을 포함하는, 다수의 널리 공지된 임의의 방식을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 소정의 CDR 또는 FR의 경계는 동정을 위해 사용되는 방식에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 캐뱃 (Kabat) 기획은 구조적 정렬을 기준으로 하는 반면, 초티아 (Chothia) 기획은 구조적 정보를 기준으로 한다. 캐뱃 및 초티아 기획 둘 다를 위한 넘버링은 가장 공통된 항체 영역 서열 길이를 기준으로 하고 삽입은 삽입 문자, 예를 들어,"30a"에 의해 수용되고 결실은 일부 항체에서 나타난다. 2개의 기획은 상이한 위치에 특정 삽입 및 결실 ("indels")을 위치시켜 차등 넘버링을 유도한다. 접촉 기획은 복합체 결정 구조의 분석을 기준으로 하고 많은 양상에서 초티아 넘버링 기획과 유사하다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체 CDR 서열은 캐뱃 넘버링에 따른다. 특정 구현예에서, CDR 영역은 하기와 같이 캐뱃에 의해 넘버링된 바와 같은 항체 영역 내에서 발견된다: 경쇄에 대해: CDRL1은 아미노산 24 내지 34이고; CDRL2는 아미노산 50 내지 56이고; CDRL3은 아미노산 89 내지 97이고 중쇄에 대해: CDRH1은 아미노산 31 내지 35이고; CDRH2는 아미노산 50 내지 65이고; CDRH3은 아미노산 95 내지 102이다.
펩타이드 압타머는 양 말단에서 단백질 스캐폴드에 부착된 펩타이드 루프 (표적 단백질에 특이적인)를 포함한다. 상기 이중 구조적 제약은 펩타이드 압타머의 결합 친화성을 항체와 상응하는 수준으로 크게 증가시킨다. 가변 루프 길이는 전형적으로 8 내지 20개 아미노산 (예를 들어, 8 내지 12개 아미노산)이고, 스캐폴드는 안정하고 가용성이고 소형이고 비-독성인 임의의 단백질 (예를 들어, 티오레독신-A, 스테핀 A 트리플 돌연변이체, 녹색 형광 단백질, 에글린 C, 및 세포성 전사 인자 Spl)일 수 있다. 펩타이드 압타머는 효모 2개-하이브리드 시스템 (예를 들어, Gal4 효모-2개-하이브리드 시스템) 또는 LexA 상호작용 트랩 시스템과 같은 상이한 시스템을 사용하여 선택될 수 있다.
핵산 압타머는 고친화성 및 특이성으로 표적 단백질 또는 다른 분자로의 결합을 지시하는 특이적 구형 구조로 폴딩함으로써 기능하는 단일 가닥의 뉴클레오타이드 서열(DNA 또는 RNA) 리간드이고 이는 Osborne et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1:5-9, 1997; 및 Cerchia et al., FEBS Letters 528:12-16, 2002에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 압타머는 소형(15 KD; 또는 15 내지 80개 뉴클레오타이드 또는 20 내지 50개 뉴클레오타이드)이다. 압타머는 일반적으로 SELEX로 불리는 과정에 의해 1014-1015의 무작위 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 라이브러리로부터 단리된다 (참조: 예를 들어, Tuerk et al., Science, 249:505-510, 1990; Green et al., Methods Enzymology. 75-86, 1991; 및 Gold et al., Annu. Rev. Biochem., 64: 763-797, 1995). 압타머를 생성하는 추가의 방법은 예를 들어, 미국 특허 제6,344,318호; 제6,331,398호; 제6,110,900호; 제5,817,785호; 제5,756,291호; 제5,696,249호; 제5,670,637호; 제5,637,461호; 제5,595,877호; 제5,527,894호; 제5,496,938호; 제5,475,096호; 및 제5,270,16호에 기재되어 있다. 스피겔머는 적어도 1개의 β-리보스 유닛이 예를 들어, β-D-리보스, α-D-리보스, β-L-리보스로부터 선택된 β-D-데옥시리보스 또는 변형된 슈가 유닛으로 대체된 것을 제외하고는 핵산 압타머와 유사하다.
특정 구현예에서, 표적화된 세포는 TAM이다. 표적화된 세포는 또한 조절 T 세포 (TREG)를 포함할 수 있다. TREG는 T 세포의 서브집단이고, 이는 면역계를 조절하고 자가-항원에 대한 관용성을 유지하고 자가면역 질환을 폐지시킨다. TREG는 CD25, CTLA-4, GITR, GARP 및 LAP를 발현한다. 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 뉴클레오타이드의 나이브 TREG로의 선택적 전달을 성취하기 위해 CD25, CTLA-4, GITR, GARP 및/또는 LAP에 결합할 수 있다. 표적화될 수 있는 다른 세포 유형은 골수-유래된 서프레서 세포 (MDSC), 조절 수지상 세포(DCreg), 호중구, T 헬퍼 17 세포 (Th17), 조절 B 세포 (Breg), 및/또는 중간엽 기질 세포 (MSC)를 포함한다. 당업자는 본원에 개시된 바와 같이 표적화 리간드를 사용하여 이들 세포 유형을 표적화하기 위해 적당한 세포 마커를 동정할 수 있다.
M2 결합 도메인. 특정 구현예에서, Egr2는 M2 대식세포 상에 표적화된다. Egr2에 대해 시판되는 항체를 Thermo Fisher, Waltham, MA; Abcam, Cambridge, MA; Millipore Sigma, Burlington, MA; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; 및 Novus Biologicals, Littleton, CO로부터 구입할 수 있다. 항-Egr2 항체의 생성은 예를 들어, Murakami K et al. (1993) Oncogene 8(6): 1559-1566에서 논의되어 있다. 항-Egr2 항체는 다음을 포함한다: 토끼 모노클로날 항-Egr2 항체 클론 EPR4004; 마우스 모노클로날 항-Egr2 항체 클론 1G5; 마우스 모노클로날 항-Egr2 항체 클론 OTI1B12; 사람 Egr2의 AA 잔기 200 내지 300을 인지하는 토끼 폴리클로날 항-Egr2 항체; 사람 Egr2의 AA 잔기 340 내지 420을 인지하는 토끼 폴리클로날 항-Egr2 항체; 및 사람 Egr2의 AA 잔기 370 내지 420을 인지하는 토끼 폴리클로날 항-Egr2 항체. 결합 도메인은 이들 항체 및 본원에 개시된 다른 항체로부터 유래될 수 있다.
특정 구현예에서, 표적화 리간드는 SGNIFSINAIG (서열번호 45)를 포함하는 CDRH1 서열, TITLSGSTN (서열번호 46)을 포함하는 CDRH2 서열, 및 NTYSDSDVYGY (서열번호 47)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, 나노바디)을 포함한다. 이들은 CD206에 결합하는 CDR 서열을 반영한다.
특정 구현예에서, 표적화 리간드는 PGFKLDYYAIA (서열번호 48)를 포함하는 CDRH1 서열, SINSSGGST (서열번호 49)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 LRRYYGLNLDPGSYDY (서열번호 50)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, 나노바디)을 포함한다. 이들은 CD206에 결합하는 CDR 서열을 반영한다.
특정 구현예에서, 표적화 리간드는 GFPFNIYPMS (서열번호 51)를 포함하는 CDRH1 서열, YISHGGTTT (서열번호 52)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 GYARLMTDSELV (서열번호 53)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, 나노바디)을 포함한다. 이들은 CD206에 결합하는 CDR 서열을 반영한다.
CD206에 특이적인 다수의 추가의 항체는 당업자에게 공지되어 있고 서열, 에피토프 결합 및 친화성에 대해 용이하게 특징 분석될 수 있다. 예를 들어, WO 2014/140376, WO 2013/174537, 및 US 7,560,534을 참조한다. CD206에 대해 시판되는 항체를 Thermo Fisher, Waltham, MA; Proteintech, Rosemont, IL; BioLegend, San Diego, CA; R & D Systems, Minneapolis, MN; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; Novus Biologicals, Littleton, CO; 및 Bio-Rad, Hercules, CA으로부터 구입할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-CD206 항체는 래트 모노클로날 항-마우스 CD206 모노클로날 항체 클론 C068C2 (Cat # 141732, Biolegend, San Diego, CA)를 포함한다.
특정 구현예에서, 표적화 리간드는 ASQSVSHDV (서열번호 54)를 포함하는 CDRL1 서열, YTS를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QDYSSPRT (서열번호 56)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화 리간드는 GYSITSDY (서열번호 57)를 포함하는 CDRH1 서열, YSG를 포함하는 CDRH2 서열, 및 CVSGTYYFDYWG (서열번호 59)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 이들은 CD163에 결합하는 Mac2-48 항체의 CDR 서열을 반영한다.
특정 구현예에서, 표적화 리간드는 ASQSVSSDV (서열번호 60)를 포함하는 CDRL1 서열, YAS를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QDYTSPRT (서열번호 62)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화 리간드는 GYSITSDY (서열번호 63)를 포함하는 CDRH1 서열, YSG를 포함하는 CDRH2 서열, 및 CVSGTYYFDYWG (서열번호 65)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 이들은 CD163에 결합하는 Mac2-158 항체의 CDR 서열을 반영한다.
CD163에 특이적인 다수의 추가의 항체 또는 결합 도메인은 당업자에게 공지되어 있고 서열, 에피토프 결합 및 친화성에 대해 용이하게 특징 분석될 수 있다. 예를 들어, WO 2011/039510, WO 2002/032941, WO 2002/076501, 및 US 2005/0214871를 참조한다. CD163에 대해 시판되는 항체를 Thermo Fisher, Waltham, MA; Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY; BioLegend, San Diego, CA; R & D Systems, Minneapolis, MN; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; and RDI Research Diagnostics, Flanders, NJ으로부터 구입할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-CD163 항체는 다음을 포함할 수 있다: 마우스 모노클로날 항-CD163 항체 클론 3D4; 마우스 모노클로날 항-CD163 항체 클론 Ber-Mac3; 마우스 모노클로날 항-CD163 항체 클론 EDHu-1; 및 마우스 모노클로날 항-CD163 항체 클론 GHI/61.
특정 구현예에서, 표적화 리간드는 RSSKSLLYKDGKTYLN (서열번호 66)을 포함하는 CDRL1 서열, LMSTRAS (서열번호 67)를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QQLVEYPFT (서열번호 68)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화 리간드는 GYWMS (서열번호 69)를 포함하는 CDRH1 서열, EIRLKSDNYATHYAESVKG (서열번호 70)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 FID를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 이들은 CD23에 결합하는 CDR 서열을 반영한다.
CD23에 특이적인 다수의 항체 또는 결합 도메인은 당업자에게 공지되어 있고 서열, 에피토프 결합 및 친화성에 대해 용이하게 특징 분석될 수 있다. 예를 들어, US 7,008,623, US 6,011,138 A (5E8, 6G5, 2C8, B3B1 및 3G12을 포함한 항체), US 2009/0252725, Rector et al. (1985) J. Immunol. 55: 481-488; Flores-Rumeo et al. (1993) Science 241: 1038-1046; Sherr et al. (1989) J. Immunol. 142: 481-489; 및 Pene et al., (1988) PNAS 85: 6820-6824을 참조한다. CD23에 대해 시판되는 항체를 Thermo Fisher, Waltham, MA; Abcam, Cambridge, MA; Bioss Antibodies, Inc., Woburn, MA; Bio-Rad, Hercules, CA; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; 및 Boster Biological Technology, Pleasanton, CA로부터 구입할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-CD23 항체는 다음을 포함할 수 있다: 마우스 모노클로날 항-CD23 항체 클론 Tu 1; 토끼 모노클로날 항-CD23 항체 클론 SP23; 토끼 모노클로날 항-CD23 항체 클론 EPR3617; 마우스 모노클로날 항-CD23 항체 클론 5B5; 마우스 모노클로날 항-CD23 항체 클론 1B12; 마우스 모노클로날 항-CD23 항체 클론 M-L23.4; 및 마우스 모노클로날 항-CD23 항체 클론 3A2.
M1 결합 도메인. 특정 구현예에서, 표적화 리간드는 SSNIGDNY (서열번호 72)를 포함하는 CDRL1 서열, RDS를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QSYDSSLSGS (서열번호 74)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화 리간드는 GFTFDDYG (서열번호 75)를 포함하는 CDRH1 서열, ISWNGGKT (서열번호 76)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 ARGSLFHDSSGFYFGH (서열번호 77)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 이들은 CD38에 결합하는 Ab79 항체의 CDR 서열을 반영한다.
특정 구현예에서, 표적화 리간드는 NSNIGSNT (서열번호 78)를 포함하는 CDRL1 서열, SDS를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QSYDSSLSGSR (서열번호 80)을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화 리간드는 GFTFNNYG (서열번호 81)를 포함하는 CDRH1 서열, ISYDGSDK (서열번호 82)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 ARVYYYGFSGPSMDV (서열번호 83)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 이들은 CD38에 결합하는 Ab19 항체의 CDR 서열을 반영한다.
특정 구현예에서, 표적화 리간드는 RASQSVSSYLA (서열번호 84)를 포함하는 CDRL1 서열, DASNRAT (서열번호 85)를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QQRSNWPPTF (서열번호 86)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화 리간드는 SFAMS (서열번호 87)를 포함하는 CDRH1 서열, AISGSGGGTYYADSVKG (서열번호 88)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 DKILWFGEPVFDY (서열번호 89)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 이들은 US 7,829,693에 기재된 CD38에 결합하는 다라투무맙 항체의 CDR 서열을 반영한다.
CD38에 특이적인 다수의 항체는 당업자에게 공지되어 있고 서열, 에피토프 결합 및 친화성에 대해 용이하게 특징 분석될 수 있다. 예를 들어, WO 2005/103083, WO 2006/125640, WO 2007/042309, WO 2008/047242, WO 2012/092612, WO 2006/099875, WO 2011/154453, WO 2015/130728, US 7,829,693, 및 US 2016/0200828을 참조한다. CD38에 대해 시판되는 항체를 Thermo Fisher, Waltham, MA; Abcam, Cambridge, MA; and Millipore Sigma, Burlington, MA으로부터 구입할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-CD23 항체는 다음을 포함할 수 있다: 토끼 모노클로날 항-CD38 항체 클론 GAD-3; 마우스 모노클로날 항-CD38 항체 클론 HIT2; 마우스 모노클로날 항-CD38 항체 클론 AT1; 마우스 모노클로날 항-CD38 항체 클론 AT13/5; 래트 모노클로날 항-CD38 항체 클론 NIMR-5; 및 래트 모노클로날 IgG2a, κ 항-CD38 항체 클론 90/CD38 (Cat #
Figure pct00004
BD Biosciences, San Jose, CA).
특정 구현예에서, G-단백질 커플링된 수용체 18 (Gpr18)은 M1 대식세포 상에 표적화된다. Gpr18에 대해 시판되는 항체를 Assay Biotechnology Company Inc., Sunnyvale, CA; Thermo Fisher, Waltham, MA; Abcam, Cambridge, MA; GeneTex, Inc., Irvine, CA; 및 Novus Biologicals, Littleton, CO으로부터 구입할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-Gpr18 항체는 다음을 포함한다: 사람 Gpr18의 아미노산 1 내지 50의 일부를 인지하는 토끼 폴리클로날 항-Gpr18 항체; 사람 Gpr18의 아미노산 160 내지 240을 포함하는 영역을 인지하는 토끼 폴리클로날 항-Gpr18 항체; 사람 Gpr18의 아미노산 100 내지 180을 포함하는 영역을 인지하는 토끼 폴리클로날 항-Gpr18 항체; 토끼 모노클로날 항-Gpr18 항체 클론 EPR12359; 및 사람 Gpr18의 아미노산 140 내지 190을 포함하는 영역을 인지하는 토끼 폴리클로날 항-Gpr18 항체.
특정 구현예에서, 포밀 펩타이드 수용체 2 (Fpr2)는 M1 대식세포 상에 표적화된다. Fpr2에 대해 시판되는 항체를 Atlas Antibodies, Bromma, Sweden; Biorbyt, LLC, San Francisco, CA; Cloud-Clone Corp., Katy, TX; US Biological Life Sciences, Salem, MA; 및 Novus Biologicals, Littleton, CO로부터 구입할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-fpr2 항체는 다음을 포함한다: 마우스 모노클로날 항-fpr2 항체 클론 GM1D6; 마우스 모노클로날 항-fpr2 항체 클론 304405; 재조합 항-fpr2 항체 클론 REA663; 및 fpr2의 아미노산 300 내지 350을 포함하는 영역을 인지하는 토끼 폴리클로날 항-fpr2 항체.
특정 구현예에서, 표적화 리간드는 RASQSVSSYLA (서열번호 90)를 포함하는 CDRL1 서열, DASSRAT (서열번호 91)를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QLRSNWPPYT (서열번호 92)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화 리간드는 GYGMH (서열번호 93)를 포함하는 CDRH1 서열, VIWYDGSNKYYADSVKG (서열번호 94)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 DTGDRFFDY (서열번호 95)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 사람 또는 사람화된 결합 도메인 (예를 들어, scfv)을 포함한다. 이들은 CD64에 결합하는 CDR 서열을 반영한다.
CD64에 특이적인 다수의 항체는 당업자에게 공지되어 있고 서열, 에피토프 결합 및 친화성에 대해 용이하게 특징 분석될 수 있다. 예를 들어, US 7,378,504, WO 2006/131953, 및 WO 2008/074867을 참조한다. CD64에 대해 시판되는 항체를 Ancell, Bayport, MN; Thermo Fisher, Waltham, MA; Abcam, Cambridge, MA; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; 및 Novus Biologicals, Littleton, CO으로부터 구입할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-CD64 항체는 다음을 포함한다: 마우스 모노클로날 항-CD64 항체 클론 32-2; 마우스 모노클로날 항-CD64 항체 클론 UMAB74; 래트 모노클로날 항-CD64 항체 클론 290322; 마우스 모노클로날 항-CD64 항체 클론 10.1; 및 마우스 모노클로날 항-CD64 항체 클론 1D3.
특정 구현예에서, CD86은 M1 대식세포 상에 표적화된다. CD86에 특이적인 다수의 항체는 당업자에게 공지되어 있고 서열, 에피토프 결합 및 친화성에 대해 용이하게 특징 분석될 수 있다. 예를 들어, WO 2004/076488, US 8,378,082 (mAb 2D4) 및 US 6,346,248 (IG10H6D10)을 참조한다. CD86에 대한 시판되는 항체를 Thermo Fisher, Waltham, MA; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; Bio-Rad, Hercules, CA; 및 Novus Biologicals, Littleton, CO으로부터 구입할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-CD86 항체는 다음을 포함한다: 마우스 모노클로날 항-CD86 항체 클론 BU63; 사람 CD86의 Ala23 내지 His244를 포함하는 영역을 인지하는 폴리클로날 염소 항-CD86 항체; 마우스 모노클로날 항-CD86 항체 클론 IT2.2; 토끼 모노클로날 항-CD86 항체 클론 BFF-3; 및 마우스 모노클로날 항-CD86 항체 클론 C86/1146.
이에 의한 내재화를 촉진시킬 수 있고/있거나 림프구의 형질감염을 촉진시킬 수 있는 다른 제제, 예를 들어, 폴리(에틸렌이민)/DNA (PEl/DNA) 복합체가 또한 사용될 수 있다.
(6) 조성물. 본원에 기재된 입자는 대상체로의 투여를 위해 제형화된 조성물의 일부로서 제공될 수 있다. 조성물은 본원에 기재된 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
일반적으로 예시적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체는 임의의 모든 벌킹제 또는 충전제, 용매 또는 조용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 보존제, 등장성 제제, 흡수 지연제, 염, 안정화제, 완충제, 킬레이팅제 (예를 들어, EDTA), 겔, 결합제, 붕해제, 및/또는 윤활제를 포함한다.
예시적인 완충제는 시트레이트 완충제, 숙시네이트 완충제, 타르트레이트 완충제, 푸마레이트 완충제, 글루코네이트 완충제, 옥살레이트 완충제, 락테이트 완충제, 아세테이트 완충제, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및/또는 트리메틸아민 염을 포함한다.
예시적인 보존제로는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀 및 3-펜타놀을 포함한다.
예시적인 등장성 제제는 3가 이상의 당 알콜을 포함하는 다가 당 알콜, 예를 들어, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 또는 만니톨을 포함한다.
예시적인 안정화제는 유기 당, 다가 당 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 황-함유 환원제, 아미노산, 저분자량의 폴리펩타이드, 단백질, 면역글로불린, 친수성 중합체 또는 폴리사카라이드를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 복막내, 정맥내 또는 두개내 주사용으로 제형화된다. 본원에 개시된 조성물은 추가로 동맥내, 결절내, 림프구내, 종양내, 근육내, 경구 및/또는 피하 투여, 보다 특히, 동맥내, 결절내, 림프구내, 종양내, 근육내 및/또는 피하 주사에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 본원에 개시된 조성물은 주입, 관류 또는 섭식에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다.
주사를 위해, 조성물은 예를 들어, 행크스 용액, 링거 용액 또는 생리학적 식염수를 포함하는 완충액 중에서 수용액으로서 제형화될 수 있다. 수용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기 제형은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 발열원-부재 물과의 구성을 위해 동결건조 및/또는 분말 형태로 있을 수 있다.
조성물은 또한 데포 (depot) 제제로서 제형화될 수 있다. 데포 제제는 적합한 중합성 또는 소수성 재료(예를 들어, 허용되는 오일 중에 에멀젼) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
추가로, 조성물은 입자를 함유하는 고형 중합체의 반투과성 매트릭스를 사용하여 서방출 시스템으로서 제형화될 수 있다. 다양한 서방출 재료가 확립되었고 당업자에게 널리 공지되어 있다. 서방출 시스템은 이들의 화학 구조에 의존하여 100일 초과까지 몇주 동안 투여 후 입자를 방출할 수 있다.
경구 투여를 위해, 조성물은 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제 등으로 제형화될 수 있다.
암을 치료하기 위해 제형화되는 경우, 개시된 조성물은 또한 p53, RB, BRCA1, E1A, bcl-2, MDR-1, p21, p16, bax, bcl-xs, E2F, IGF-I VEGF, 안지오스타틴, 온코스타틴, 엔도스타틴, GM-CSF, IL-12, IL-2, IL-4, IL-7, IFN-γ, TNFα 및/또는 HSV-tk로부터 선택되는 하나 이상의 항암 유전자를 함유한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 조성물 제형은 유리하게 연구용, 예방용 및/또는 치료학적 치료용이든 상관 없이 투여의 이득을 능가하는 유의적으로 불리한, 알레르기 또는 다른 좋지 않은 반응을 생성하지 않는 것들을 포함하는 임의의 다른 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체 및 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 개시되어 있다. 더욱이, 제형은 생물학적 표준화의 미국 FDA청 (United States FDA Office of Biological Standards) 및/또는 다른 관련 외부 규제 기관에 의해 요구되는 바와 같이 멸균성, 발열원성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족하도록 제조될 수 있다.
특정 구현예에서, 입자는 예를 들어, 적어도 0.1% w/v 또는 w/w 입자; 적어도 1% w/v 또는 w/w 입자; 적어도 10% w/v 또는 w/w 입자; 적어도 20% w/v 또는 w/w 입자; 적어도 30% w/v 또는 w/w 입자; 적어도 40% w/v 또는 w/w 입자; 적어도 50% w/v 또는 w/w 입자; 적어도 60% w/v 또는 w/w 입자; 적어도 70% w/v 또는 w/w 입자; 적어도 80% w/v 또는 w/w 입자; 적어도 90% w/v 또는 w/w 입자; 적어도 95% w/v 또는 w/w 입자; 또는 적어도 99% w/v 또는 w/w 입자를 포함할 수 있는 조성물의 일부로서 제공된다.
사용 방법. 본원에 개시된 방법은 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자를 대식세포에 도입함으로써 불활성화된 상태로부터 활성화된 상태로 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 변경 단계는 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자로 처리된 대식세포 집단 중에서 불활성화된 상태의 대식세포 (예를 들어, M2 대식세포)의 퍼센트를 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자로 처리되지 않은 불활성화된 상태의 대식세포의 퍼센트와 비교하여 5배, 10배, 15배, 20배 이상으로 감소시킨다. 특정 구현예에서, 상기 변경 단계는 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자로 처리된 대식세포 집단 중에서 불활성화된 상태의 대식세포 (예를 들어, M2 대식세포)의 수를 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자로 처리되지 않은 불활성화된 상태의 대식세포의 수와 비교하여 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상으로 감소시킨다. 특정 구현예에서, 상기 변경 단계는 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자로 처리된 대식세포 집단 중에서 활성화된 상태의 대식세포 (예를 들어, M1 대식세포)의 퍼센트를 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자로 처리되지 않은 활성화된 상태의 대식세포의 퍼센트와 비교하여 5배, 10배, 15배, 20배 이상으로 증가시킨다. 특정 구현예에서, 상기 변경 단계는 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자로 처리된 대식세포 집단 중에서 활성화된 상태의 대식세포의 수를 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자로 처리되지 않은 활성화된 상태의 대식세포의 수와 비교하여 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상으로 증가시킨다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자를 대식세포로 도입함으로써 불활성화된 상태로부터 활성화된 상태로 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계는 고형 종양으로의 림프구 이동 및 침윤을 복구시키고; IL-1β, IL-12, IFNγ, 및/또는 TNFα를 포함하는 염증-촉진 (항-종양) 사이토킨의 방출을 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배 이상으로 증가시키고; IL-6을 포함하는, M2 대식세포 표현형과 연관된 사이토킨의 방출을 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배 이상으로 감소시킨다.
특정 구현예에서, 불활성화된 상태로부터 활성화된 상태로의 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계는 IRF5 및 IRF8을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자를 대식세포로 도입하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 불활성화된 상태로부터 활성화된 상태로 대식세포의 활성화를 변경시키는 단계는 항상성 활성 또는 이들의 야생형 대응물 IRF 보다 더 활성인 돌연변이체 IRF를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자를 대식세포로 도입하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 방법은 대상체 (사람, 척추 동물, 가축 및 연구 동물)를 본원에 개시된 조성물로 처리하는 단계를 포함한다. 대상체의 처리 단계는 치료학적 유효량을 전달하는 단계를 포함한다. 치료학적 유효량은 유효량의 예방학적 치료 및/또는 치료학적 치료를 제공할 수 있다.
"유효량"은 대상체에서 목적하는 생리학적 변화를 유도하기에 필요한 화합물의 양이다. 유효량은 흔히 연구 목적을 위해 투여된다. 본원에 개시된 유효량은 대상체에서 세포를 면역조절한다. 특정 구현예에서, 면역조절될 세포는 면역억제된 세포이다. 특정 구현예에서, 면역조절될 세포는 대식세포이다. 특정 구현예에서, 대식세포의 면역조절은 면역억제된 대식세포를 활성화된 대식세포로 전환시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 대식세포의 면역조절은 M2 대식세포를 M1 대식세포로 전환시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역조절될 세포는 MDSC, Treg, DCreg, 호중구, Th17, Breg, 및/또는 MSC를 포함하는 면역억제된 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역억제된 세포의 면역조절은 종양촉진성에서 항종양성으로 면역억제된 세포의 표현형적 및/또는 기능적 전환을 포함한다.
"예방학적 치료"는 질환 또는 병태의 징후 또는 증상을 나타내지 않거나 질환 또는 병태의 조기 징후 또는 증상만을 나타내는 대상체에게 적용되는 치료를 포함하여 치료는 추가의 질환 또는 병태를 약화시키거나, 예방하거나, 이의 발병 위험을 감소시킬 목적으로 적용된다. 따라서, 예방학적 치료는 질환 또는 장애에 대한 예방적 치료로서 기능한다. 특정 구현예에서, 예방학적 치료는 암을 갖지만 차도 중에 있는 대상체에게 본원에 개시된 조성물을 투여함을 포함하여, 치료는 재발의 발생을 감소시키거나 지연시킬 목적으로 적용된다.
"치료학적 치료"는 질환 또는 병태의 증상 또는 징후를 나타내는 대상체에게 적용되고 상기 질환 또는 병태의 징후 또는 증상을 약화시키거나 제거할 목적으로 대상체에게 적용되는 치료를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료학적 치료는 본원에 개시된 조성물을 종양 및/또는 전이를 약화시키거나 제거하기 위해 암을 갖는 대상체에게 투여함을 포함한다.
특정 구현예에서, 치료학적 유효량은 대상체에서 항암 효과를 제공한다. 암 (의학 용어: 악성 신생물)은 세포 그룹이 제어되지 않은 성장 (정상 한계치를 초과하여 분열), 침입 (인접한 조직 상으로의 침투 및 파괴) 및 때로는 전이를 나타내는 질환의 부류를 언급한다. "전이"는 이들의 본래의 증식 부위로부터 신체의 또 다른 부위로 암 세포가 퍼지는 것을 언급한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 공정이고 1차 종양으로부터 악성 세포의 탈착, 세포외 매트릭스의 침입, 체강 및 혈관으로 진입하기 위해 내피 기저 막의 침투 및 이어서 혈액에 의해 수송된 후 표적 기관의 침윤에 의존한다. 최종적으로, 표적 부위에서 새로운 종양의 성장, 즉, 2차 종양 또는 전이성 종양의 성장은 혈관형성에 의존한다. 종양 전이는 흔히 종양 세포 또는 성분이 잔류하여 전이 가능성을 나타낼 수 있기 때문에 1차 종양의 제거 후에도 일어난다.
특정 구현예에서, 치료학적 유효량은 대상체에서 항-종양 효과를 제공한다. "종양"은 비정상적 성장의 세포 (신생물 세포 또는 종양 세포로 불리우는)에 의해 형성된 팽윤 또는 병변이다. "종양 세포"는 신속하고 비제어된 세포 증식으로 분열하고 새로운 분열을 개시하는 자극이 중단된 후에도 계속 분열하는 비정상적 세포이다. 종양은 정상 조직과의 구조적 구성 및 기능적 조정의 부분적 또는 완전한 결여를 보여주고 일반적으로 양성, 전-악성 또는 악성일 수 있는 독특한 매쓰의 조직을 형성한다.
항-종양 효과는 종양 세포 수에서의 감소, 전이 수에서의 감소, 종양 용적에서의 감소, 기대 수명의 증가, 암 세포의 유도된 아폽토시스, 유도된 암 세포사, 암세포에서 유도된 화학적 또는 방사선 민감성, 암 세포 부근에서 억제된 혈관형성, 억제된 암 세포 증식, 억제된 종양 성장, 예방된 전이, 대상체에 대한 수명 연장, 감소된 암-관련 통증, 감소된 전이 수, 및/또는 치료 후 암의 감소된 재발 또는 재생에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 언급한다. 따라서, 본원에 개시된 조성물은 다양한 암을 치료하기 위해 사용될 수 있고, 전이를 예방하거나 유의적으로 지연시킬 수 있고/있거나 재발을 예방하거나 유의적으로 지연시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 나노입자 조성물로 치료받은 암을 갖는 대상체의 전체 생존은 상기 나노입자 조성물로 치료받지 않은 동일한 암을 갖는 대조군 대상체와 비교하여 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배 이상으로 개선된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 나노입자 조성물로 치료받은 암을 갖는 대상체에서 전이 수는 상기 나노입자 조성물로 치료받지 않은 동일한 암을 갖는 대조군 대상체와 비교하여 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상으로 감소된다.
특정 구현예에서, 치료학적 치료는 본원에 개시된 조성물을. 종양을 약화시키거나 제거하기 위해 암을 갖는 대상체에게 또 다른 치료요법과 조합하여 투여함을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 조성물과 조합하여 사용하기 위한 치료요법은 암 백신, CAR 면역치료요법 (예를 들어, CAR-T 면역치료요법), 화학치료요법, 방사선 치료요법, 호르몬 치료요법, 신호 전달 억제제, 유전자 발현 조절인자, 아폽토시스 유도제, 혈관형성 억제제, 및 독성 분자를 전달하는 모노클로날 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 암을 갖는 대상체로의 방사선 치료요법과 조합된 본원에 개시된 나노입자 조성물의 투여는 전체 생존을, 방사선치료요법과 조합된 나노입자 조성물이 투여되지 않은, 동일한 암을 갖는 대조군 대상체와 비교하여 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배 이상으로 개선시킨다.
본원에 개시된 시스템 및 방법으로 치료받을 수 있는 암은 난소암, 유방암, 뇌암, 흑색종, 폐 전이, 정상피종, 기형종, 신경모세포종, 신경교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 피부암, 자궁경부암, 장암, 간암, 결장암, 위암, 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 췌장암, 귀, 코 및 인후(ENT) 암, 전립선암, 자궁암, 폐암 및 이의 전이를 포함한다.
지적된 바와 같이, 본원 개시내용의 교시는 또한 자가면역 질환과 같은 병태에서 면역계를 불활성화시키기 위해 면역 세포의 활성화 상태를 조절하는 방법에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 자가면역 질환에서 활성화된 상태로부터 불활성화된 상태로의 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계는 M2 표현형을 유도하는 IRF를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자를 대식세포로 도입하는 단계를 포함한다. M2 표현형을 유도하는 IRF의 특정 구현예는 IRF3 및/또는 IRF4를 포함한다. 특정 구현예에서, 자가면역 질환에서 활성화된 상태로부터 불활성화된 상태로의 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계는 글루코코르티코이드 항-염증 효과를 매개하고 M2 표현형을 유도할 수 있는 GILZ (글루코코르티코이드-유도된 류신 지퍼) 전사 인자를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자를 대식세포로 도입하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 자가면역 질환에서 활성화된 상태로부터 불활성화된 상태로의 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계는 GILZ 및 IRF4를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자를 대식세포로 도입하는 단계를 포함한다. 예시적인 자가면역 질환은 급성 괴사 출혈 뇌병증, 알레르기성 천식, 원형 탈모증, 빈혈, 혓바늘, 관절염 (류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염을 포함), 천식, 자가면역성 갑상선염, 결막염, 크론병, 피부 홍반 낭창, 피부염(아토피성 피부염 및 습진 피부염을 포함), 당뇨병, 진성 당뇨병, 나성결절홍반, 각결막염, 다발성 경화증, 중증근무력증, 건선, 피부경화증, 쇼그렌 증후군에 부차적인 건성 각결막염을 포함하는 쇼그렌 증후군, 스티븐-존슨 증후군, 전신 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 질염 및 베게너 육아종증을 포함한다.
투여를 위해, 치료학적 유효량 (또한 본원에서 용량으로서 언급됨)은 초기에 시험관내 검정 및/또는 동물 모델 연구로부터의 결과를 토대로 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 특정 표적에 대해 세포 배양에서 결정된 바와 같은 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 성취하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 상기 정보를 사용하여 관심 대상의 대상체에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
특정 대상체에게 투여되는 실제 투여 용량은 표적, 체중, 병태의 중증도, 질환 유형, 이전의 또는 동시 치료학적 중재, 대상체의 특발증 및 투여 경로를 포함하는 물리적 및 생리학적 인자와 같은 파라미터를 고려하여 담당의, 수의사 또는 연구자에 의해 결정될 수 있다.
유용한 용량은 흔히 0.1 내지 5 μg/kg 또는 0.5 내지 1 μg/kg 범위이다. 특정 구현예에서, 용량은 1 μg/kg, 5 μg/kg, 10 μg/kg, 15 μg/kg, 20 μg/kg, 25 μg/kg, 30 μg/kg, 35 μg/kg, 40 μg/kg, 45 μg/kg, 50 μg/kg, 55 μg/kg, 60 μg/kg, 65 μg/kg, 70 μg/kg, 75 μg/kg, 80 μg/kg, 85 μg/kg, 90 μg/kg, 95 μg/kg, 100 μg/kg, 150 μg/kg, 200 μg/kg, 250 μg/kg, 350 μg/kg, 400 μg/kg, 450 μg/kg, 500 μg/kg, 550 μg/kg, 600 μg/kg, 650 μg/kg, 700 μg/kg, 750 μg/kg, 800 μg/kg, 850 μg/kg, 900 μg/kg, 950 μg/kg, 1000 μg/kg, 0.1 내지 5 mg/kg 또는 0.5 내지 1 mg/kg을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 용량은 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg 이상을 포함할 수 있다.
치료학적 유효량은 치료 용법 과정 동안에 (예를 들어, 매일, 격일, 3일 마다, 4일 마다, 5일 마다, 6일 마다, 주간, 2주 마다, 3주 마다, 매월, 2개월 마다, 3개월 마다, 4개월 마다, 5개월 마다, 6개월 마다, 7개월 마다, 8개월 마다, 9개월 마다, 10개월 마다, 11개월 마다 또는 매년 단일 또는 다중 용량을 투여함으로써 성취될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료학적 유효량은 치료 용법 과정 동안에 반복적인 용량을 투여함으로써 성취될 수 있다.
본원에 기재된 나노입자 조성물은 주사, 흡입, 주입, 관류, 세척 또는 섭식에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 정맥내, 피내, 동맥내, 뇌실질내, 비강내, 결절내, 림프관내, 복막내, 두개내, 병변내, 전립선내, 질내, 직장내, 국소, 척추강내, 종양내, 근육내, 소포내, 경구, 피하, 및/또는 설하 투여 및 보다 특히, 정맥내, 종양내, 복막내 및/또는 두개내 주사를 포함할 수 있다. 국부 투여는 본원에 개시된 치료학적 유효량의 조성물을 신체의 특정 영역, 기관 또는 공동으로 투여함을 포함한다. 예를 들어, 복막내 주사를 사용하여 난소암을 치료하기 위해 치료제를 전달할 수 있거나 두개내 주사를 사용하여 신경교종을 치료하기 위해 치료제를 전달할 수 있다. 종양 부위에서 치료제의 투여는 상기 기재된 바와 같이 표적화 리간드를 사용하여, 건강한 조직이 아닌 종양 세포 및/또는 종양 지지 세포로 치료제 (예를 들어, 나노입자 조성물)의 리간드 매개된 표적화를 포함할 수 있다. 종양 부위에서 치료제의 투여는 건강한 조직이 아닌 종양 세포 및/또는 종양 지지 세포로 치료제 (예를 들어, 나노입자 조성물)의 수동적 표적화를 포함할 수 있다. 수동적 표적화의 특정 구현예는 나노입자의 크기 범위 및 누출 혈관계 및 종양 조직의 손상된 림프구 배수를 기준으로 하여 증진된 투과성 및 체류 (EPR) 현상을 포함할 수 있다. 대조적으로 전신 투여는 신체 전반에 걸쳐 이루어지고 전형적으로 조성물 또는 치료제의 순환계로의 정맥내 주사에 의해 성취된다. 치료제의 전신 투여는 전이된 암과 같이 덜 국소적인 암의 형태에 대해 유용할 수 있다.
도 5는 상기 개시내용을 지지하는 예시적 서열 (서열번호 1-44, 110, 및 111)을 제공한다. CDR 서열은 또한 본원에 기재되어 있다. 본원의 개시내용은 이들 서열의 변이체를 포함한다. 단백질 서열의 변이체는 단백질의 기능에 악영향을 주지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환 또는 하나 이상의 비-보존성 치환을 갖는 것들을 포함할 수 있다. "보존성 치환"은 하기의 보존성 치환 그룹 중 하나에서 발견되는 치환을 포함한다: 그룹 1: 알라닌 (Ala), 글라이신 (Gly), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr); 그룹 2: 아스파르트산 (Asp), 글루탐산 (Glu); 그룹 3: 아스파라긴 (Asn), 글루타민 (Gln); 그룹 4: 아르기닌 (Arg), 라이신 (Lys), 히스티딘 (His); 그룹 5: 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 발린 (Val); 및 그룹 6: 페닐알라닌(Phe), 타이로신(Tyr), 트립토판(Trp).
추가로, 아미노산은 유사한 기능 또는 화학적 구조 또는 조성 (예를 들어, 산성, 염기성, 지방족, 방향족, 황-함유)에 의해 보존성 치환 그룹으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 지방족 부류는 치환 목적을 위해 Gly, Ala, Val, Leu, 및 Ile를 포함할 수 있다. 서로에 대해 보존성 치환으로 고려되는 아미노산을 함유하는 다른 그룹은 황-함유: Met 및 시스테인 (Cys); 산성: Asp, Glu, Asn, 및 Gln; 소형 지방족, 비극성 또는 약간의 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, 및 Gly; 극성의 음으로 하전된 잔기 및 이들의 아미드: Asp, Asn, Glu, 및 Gln; 극성의 양으로 하전된 잔기: His, Arg, 및 Lys; 대형 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val, 및 Cys; 및 대형 방향족 잔기: Phe, Tyr, 및 Trp를 포함한다. 추가의 정보는 Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company에서 발견된다.
단백질의 단편은 상응하는 단백질의 완전한 아미노산 서열 미만으로 이루어지지만 전장 단백질의 기능을 보유한다.
뉴클레오타이드 서열의 변이체는 축퇴성 코돈, 서열 다형태, 및 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 변경은 암호화된 활성화 조절인자의 기능에 영향을 미치지 않거나 실질적으로 암호화된 활성화 조절인자의 기능에 영향을 미치지 않는다.
특정 구현예에서, 서열의 변이체는 본원에 기술되거나 개시된 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
"% 서열 동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이 2개 이상의 서열 간의 관계를 언급한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 상기 서열의 스트링 간의 일치에 의해 결정된 바와 같이 서열 간의 서열 관련성 정도를 의미한다. "동일성" (흔히, "유사성"으로서 언급되는)은 Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1994); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Oxford University Press, NY (1992)에 기재된 것들을 포함하는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. % 서열 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열들 사이에서 최대 일치를 제공하도록 디자인된다. % 서열 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에 코드화되어 있다. 서열 정렬 및 % 서열 동일성 계산은 LASERGENE 생물정보 컴퓨터 스위트 (bioinformatics computing suite) (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin)의 메갈린 (Megalign) 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 또한 디폴트 파라미터 (갭 페널티=10, 갭 길이 페널티=10)와 함께 정렬의 Clustal 방법 (Higgins and Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989))을 사용하여 수행될 수 있다. 관련 프로그램은 또한 프로그램의 GCG 스위트(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin); BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin); 및 스미스-워터맨 알고리즘 (Smith-Waterman algorithm)이 혼입된 FASTA 프로그램 (Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, NY을 포함한다. 본원의 개시내용과 관련하여, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용되는 경우, 분석 결과는 참조된 프로그램의 "디폴트 값"을 기준으로 하는 것으로 이해될 것이다. "디폴트 값"은 처음 초기화되는 경우 소프트웨어와 함께 본래 로딩되는 임의의 세트의 값 또는 파리미터를 의미할 것이다.
하기 예시적 구현예 및 실시예는 본원 개시내용의 특정 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 당업자는 본원 개시 내용에 비추어, 본원에 개시된 특정 구현예에서 다수의 변화가 이루어질 수 있고, 본원 개시내용의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 인지해야 한다.
예시적 구현예.
1. 생체내 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 방법으로서, 상기 방법이
하나 이상의 인터페론 조절 인자 (IRF)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자를 투여함으로써 생체내 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계를 포함하는, 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 면역 세포가 대식세포, 조절 T 세포 (TREG), 골수-유래된 서프레서 세포 (MDSC), 조절 수지상 세포(DCreg), 호중구, T 헬퍼 17 세포 (Th17), 조절 B 세포 (Breg), 및/또는 중간엽 기질 세포 (MSC)인, 방법.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 나노입자가 양으로 하전된 코어, 폴리(β)-아미노 에스테르 코어, 별 형태의 중합체, 폴리글루탐산 코팅, 하이알루론산 코팅, 중성으로 하전된 코팅 및/또는 리포좀 나노입자를 포함하는, 방법.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 <130 nm인, 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 시험관내 전사된 mRNA를 포함하는, 방법.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 코어 내에 캡슐화되는, 방법.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 기능성 자가억제 도메인이 부재인, 방법.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 기능성 핵 배출 신호 (NES)가 부재인, 방법.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여가 국부적 투여인, 방법.
10. 구현예 9에 있어서, 상기 국부적 투여가 복막내 또는 두개내인, 방법.
11. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여가 전신 투여인, 방법.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
13. 구현예 12에 있어서, 상기 표적화 리간드가 코팅에 연결되는, 방법.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 활성화 상태가 불활성화된 상태로부터 활성화된 상태로 변경시키는, 방법.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포가 대식세포를 포함하는, 방법.
16. 구현예 15에 있어서, 상기 대식세포가 종양 내에 있는, 방법.
17. 구현예 16에 있어서, 상기 종양이 난소암 종양, 교모세포종 종양, 또는 전이 폐암 종양인, 방법.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, 및/또는 IRF7과 IRF3의 융합체로부터 선택되는, 방법.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 1 내지 17과 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 방법.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 1 내지 7로부터 선택되는 IRF5인, 방법.
21. 구현예 20에 있어서, IRF5가 서열번호 1인, 방법.
22. 구현예 20 또는 21에 있어서, IRF5가 S156D, S158D 및 T160D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 1 또는 서열번호 3인, 방법.
23. 구현예 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, IRF5가 T10D, S158D, S309D, S317D, S451D, 및 S462D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 2인, 방법.
24. 구현예 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, IRF5가 S425D, S427D, S430D, 및 S436D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 4인, 방법.
25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 8 및 12로부터 선택되는 IRF1인, 방법.
26. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 11, 16 및 17로부터 선택되는 IRF8인, 방법.
27. 구현예 26에 있어서, IRF8이 K310R 돌연변이를 갖는 서열번호 11인, 방법.
28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 N-말단 IRF7 DNA 결합 도메인 (DBD) 및 항상성 활성 도메인 (CAD) 및 C-말단 IRF3 NES (핵 배출 신호) 및 연합 도메인을 포함하는 IRF7/IRF3 융합 단백질을 포함하는, 방법.
29. 구현예 28에 있어서, 상기 IRF7/IRF3 융합 단백질이 IRF3 연합 도메인에서 인산화를 모방하는 돌연변이를 추가로 포함하는, 방법.
30. 구현예 28 또는 29에 있어서, 상기 IRF7/IRF3 융합 단백질이 서열번호 15에 제시되는, 방법.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
32. 구현예 31에 있어서, 상기 암호화된 IKKβ가 서열번호 18 내지 22와 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 방법.
33. 구현예 31 또는 32에 있어서, 상기 암호화된 IKKβ가 서열번호 18 내지 22로부터 선택되는, 방법.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 서열번호 23 내지 44로부터 선택되는 서열을 포함하는, 방법.
35. 구현예 12 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 리간드가 CD206, CD163 또는 CD23에 결합하는, 방법.
36. 구현예 12 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 리간드가 디-만노스인, 방법.
37. 구현예 31 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드가 동일한 나노입자 내에 캡슐화되는, 방법.
38. 구현예 31 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드가 상이한 나노입자 내에 캡슐화되는, 방법.
39. 구현예 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 면역 세포의 집단에서 불활성화된 상태의 면역 세포의 퍼센트를 5배, 10배, 15배, 20배 이상으로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 면역 세포의 집단에서 불활성화된 상태의 면역 세포의 수를 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상으로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
41. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 면역 세포의 집단에서 활성화된 상태의 면역 세포의 퍼센트를 5배, 10배, 15배, 20배 이상으로 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
42. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 면역 세포의 집단에서 활성화된 상태의 면역 세포의 수를 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상으로 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
43. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 활성화 상태가 활성화된 상태로부터 불활성화된 상태로 변경시키는는, 방법.
44. 구현예 1 내지 13 및 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포가 대식세포를 포함하는, 방법.
45. 구현예 1 내지 13, 43 및 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 IRF4인, 방법.
46. 구현예 1 내지 13, 및 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 글루코코르티코이드-유도된 류신 지퍼 (GILZ)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
47. 구현예 12, 및 43 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 리간드가 CD38, G-단백질 커플링된 수용체 18 (Gpr18), 포밀 펩타이드 수용체 2 (Fpr2), CD64, 또는 CD68에 결합하는, 방법.
48. 구현예 1 내지 13 및 43 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 면역 세포의 집단에서 활성화된 상태의 면역 세포의 퍼센트를 5배, 10배, 15배, 20배 이상으로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
49. 구현예 1 내지 13, 및 43 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 면역 세포의 집단에서 활성화된 상태의 면역 세포의 수를 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상으로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
50. 구현예 1 내지 13 및 43 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 면역 세포의 집단에서 불활성화된 상태의 면역 세포의 퍼센트를 5배, 10배, 15배, 20배 이상으로 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
51. 구현예 1 내지 13, 및 43 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 면역 세포의 집단에서 불활성화된 상태의 면역 세포의 수를 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상으로 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
52. 대상체 내 종양에서 종양-연합된 대식세포의 활성화 상태를 불활성화된 것으로부터 활성화된 것으로 변경시킴으로써 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
53. 구현예 52에 있어서, 상기 종양이 난소암 종양, 교모세포종 종양, 또는 전이 폐암 종양인, 방법.
54. 구현예 52 또는 53에 있어서, 상기 변경 단계가 종양-연합된 대식세포의 활성화 상태를 불활성화된 것으로부터 활성화된 것으로 변경시키는 하나 이상의 전사 인자를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 치료학적 유효량의 나노입자의 투여를 따르는, 방법.
55. 구현예 54에 있어서, 상기 나노입자가 양으로 하전된 코어, 폴리(β)-아미노 에스테르 코어, 별 형태의 중합체, 폴리글루탐산 코팅, 하이알루론산 코팅, 중성으로 하전된 코팅 및/또는 리포좀 나노입자를 포함하는, 방법.
56. 구현예 54 또는 55에 있어서, 상기 나노입자가 <130 nm인, 방법.
57. 구현예 54 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 시험관내 전사된 mRNA를 포함하는, 방법.
58. 구현예 54 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 코어 내에 캡슐화되는, 방법.
59. 구현예 54 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여가 국부적 투여인, 방법.
60. 구현예 59에 있어서, 상기 국부적 투여가 복막내 또는 두개내 투여인, 방법.
61. 구현예 54 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여가 전신 투여인, 방법.
62. 구현예 54 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 전사 인자가 하나 이상의 인터페론 조절 인자 (IRF)를 포함하는, 방법.
63. 구현예 62에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 기능성 자가억제 도메인이 부재인, 방법.
64. 구현예 62 또는 63에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 기능성 핵 배출 신호 (NES)가 부재인, 방법.
65. 구현예 62 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, 및/또는 IRF7과 IRF3의 융합체로부터 선택되는, 방법.
66. 구현예 62 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 1 내지 17과 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 방법.
67. 구현예 62 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 1 내지 7로부터 선택되는 IRF5인, 방법.
68. 구현예 67에 있어서, IRF5가 서열번호 1인, 방법.
69. 구현예 67 또는 68에 있어서, IRF5가 S156D, S158D 및 T160D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 1 또는 서열번호 3인, 방법.
70. 구현예 67 내지 69 중 어느 하나에 있어서, IRF5가 T10D, S158D, S309D, S317D, S451D, 및 S462D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 2인, 방법.
71. 구현예 67 내지 70 중 어느 하나에 있어서, IRF5가 S425D, S427D, S430D, 및 S436D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 4인, 방법.
72. 구현예 62 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 8 및 12로부터 선택되는 IRF1인, 방법.
73. 구현예 62 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 11, 16 및 17로부터 선택되는 IRF8인, 방법.
74. 구현예 73에 있어서, IRF8이 K310R 돌연변이를 갖는 서열번호 11인, 방법.
75. 구현예 62 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 N-말단 IRF7 DNA 결합 도메인 (DBD) 및 항상성 활성 도메인 (CAD) 및 C-말단 IRF3 NES (핵 배출 신호) 및 연합 도메인을 포함하는 IRF7/IRF3 융합 단백질을 포함하는, 방법.
76. 구현예 75에 있어서, 상기 IRF7/IRF3 융합 단백질이 IRF3 연합 도메인에서 인산화를 모방하는 돌연변이를 추가로 포함하는, 방법.
77. 구현예 75 또는 76에 있어서, 상기 IRF7/IRF3 융합 단백질이 서열번호 15에 제시되는, 방법.
78. 구현예 54 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
79. 구현예 78에 있어서, 상기 암호화된 IKKβ가 서열번호 18 내지 22와 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 방법.
80. 구현예 78 또는 79에 있어서, 상기 암호화된 IKKβ가 서열번호 18 내지 22로부터 선택되는, 방법.
81. 구현예 54 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 서열번호 23 내지 44로부터 선택되는 서열을 포함하는, 방법.
82. 구현예 54 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
83. 구현예 82에 있어서, 상기 표적화 리간드가 코팅에 연결되는, 방법.
84. 구현예 82 또는 83에 있어서, 상기 표적화 리간드가 CD206, CD163 또는 CD23에 결합하는, 방법.
85. 구현예 82 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 리간드가 디-만노스인, 방법.
86. 구현예 54 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드가 동일한 나노입자 내에 캡슐화되는, 방법.
87. 구현예 54 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드가 상이한 나노입자 내에 캡슐화되는, 방법.
88. 구현예 54 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 종양 내 대식세포의 집단에서 불활성화된 상태의 대식세포의 퍼센트를 5배, 10배, 15배, 20배 이상으로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
89. 구현예 54 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 종양 내 대식세포의 집단에서 불활성화된 상태의 대식세포의 수를 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상으로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
90. 구현예 54 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 종양 내 대식세포의 집단에서 활성화된 상태의 대식세포의 퍼센트를 5배, 10배, 15배, 20배 이상으로 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
91. 구현예 54 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 종양 내 대식세포의 집단에서 활성화된 상태의 대식세포의 수를 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상으로 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
92. 구현예 54 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 치료학적 유효량의 나노입자와 조합된 암 백신, 키메라 항원 수용체 (CAR) 면역치료요법, 화학치료요법, 방사선치료요법, 호르몬 치료요법, 신호 전달 억제제, 유전자 발현 조절인자, 아폽토시스 유도제, 혈관형성 억제제, 및 독성 분자를 전달하는 모노클로날 항체로부터 선택된 치료요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
93. 대상체 내 대식세포의 활성화 상태를 활성화된 것으로부터 불활성화된 것으로 변경시킴으로써 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법.
94. 구현예 93에 있어서, 상기 자가면역 질환이 급성 괴사 출혈 뇌병증, 알레르기성 천식, 원형 탈모증, 빈혈, 혓바늘, 관절염 (류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염을 포함), 천식, 자가면역성 갑상선염, 결막염, 크론병, 피부 홍반 낭창, 피부염(아토피성 피부염 및 습진 피부염을 포함), 당뇨병, 진성 당뇨병, 나성결절홍반, 각결막염, 다발성 경화증, 중증근무력증, 건선, 피부경화증, 쇼그렌 증후군에 부차적인 건성 각결막염을 포함하는 쇼그렌 증후군, 스티븐-존슨 증후군, 전신 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 질염 및 베게너 육아종증을 포함하는, 방법.
95. 구현예 93 또는 94에 있어서, 상기 변경 단계가 대식세포의 활성화 상태를 활성화된 것으로부터 불활성화된 것으로 변경시키는 하나 이상의 전사 인자를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 치료학적 유효량의 나노입자의 투여를 따르는, 방법.
96. 구현예 94에 있어서, 상기 나노입자가 양으로 하전된 코어, 폴리(β)-아미노 에스테르 코어, 별 형태의 중합체, 폴리글루탐산 코팅, 하이알루론산 코팅, 중성으로 하전된 코팅 및/또는 리포좀 나노입자를 포함하는, 방법.
97. 구현예 94 또는 95에 있어서, 상기 나노입자가 <130 nm인, 방법.
98. 구현예 95 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 시험관내 전사된 mRNA를 포함하는, 방법.
99. 구현예 95 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 코어 내에 캡슐화되는, 방법.
100. 구현예 95 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여가 국부적 투여인, 방법.
101. 구현예 100에 있어서, 상기 국부적 투여가 복막내 또는 두개내인, 방법.
102. 구현예 92 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여가 전신 투여인, 방법.
103. 구현예 95 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 전사 인자가 하나 이상의 인터페론 조절 인자 (IRF)를 포함하는, 방법.
104. 구현예 103에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 기능성 자가억제 도메인이 부재인, 방법.
105. 구현예 103 또는 104에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 기능성 핵 배출 신호 (NES)가 부재인, 방법.
106. 구현예 103 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 IRF4인, 방법.
107. 구현예 95 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 글루코코르티코이드-유도된 류신 지퍼 (GILZ)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
108. 구현예 85 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
109. 구현예 108에 있어서, 상기 표적화 리간드가 코팅에 연결되는, 방법.
110. 구현예 108 또는 109에 있어서, 상기 표적화 리간드가 CD38, G-단백질 커플링된 수용체 18 (Gpr18), 포밀 펩타이드 수용체 2 (Fpr2), CD64, 또는 CD68에 결합하는, 방법.
111. 구현예 93 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 대식세포의 집단에서 활성화된 상태의 대식세포의 퍼센트를 5배, 10배, 15배, 20배 이상으로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
112. 구현예 93 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 대식세포의 집단에서 활성화된 상태의 대식세포의 수를 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상으로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
113. 구현예 95 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 대식세포의 집단에서 불활성화된 상태의 대식세포의 퍼센트를 5배, 10배, 15배, 20배 이상으로 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
114. 구현예 95 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 대식세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계가 대식세포의 집단에서 불활성화된 상태의 대식세포의 수를 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상으로 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
115. 하나 이상의 인터페론 조절 인자 (IRF)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물.
116. 구현예 115에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
117. 구현예 115 또는 116에 있어서, 상기 나노입자가 양으로 하전된 코어, 폴리(β)-아미노 에스테르 코어, 별 형태의 중합체, 폴리글루탐산 코팅, 하이알루론산 코팅, 중성으로 하전된 코팅 및/또는 리포좀 나노입자를 포함하는, 조성물.
118. 구현예 115 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 <130 nm인, 조성물.
119. 구현예 115 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 시험관내 전사된 mRNA를 포함하는, 조성물.
120. 구현예 115 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 코어 내에 캡슐화되는, 조성물.
121. 구현예 115 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 기능성 자가억제 도메인이 부재인, 조성물.
122. 구현예 115 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 기능성 핵 배출 신호 (NES)가 부재인, 조성물.
123. 구현예 115 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, 및/또는 IRF7과 IRF3의 융합체로부터 선택되는, 조성물.
124. 구현예 115 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 1 내지 17과 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 조성물.
125. 구현예 115 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 1 내지 7로부터 선택되는 IRF5인, 조성물.
126. 구현예 125에 있어서, IRF5가 서열번호 1인, 조성물.
127. 구현예 125 또는 126에 있어서, IRF5가 S156D, S158D 및 T160D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 1 또는 서열번호 3인, 조성물.
128. 구현예 125 내지 127 중 어느 하나에 있어서, IRF5가 T10D, S158D, S309D, S317D, S451D, 및 S462D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 2인, 조성물.
129. 구현예 125 내지 128 중 어느 하나에 있어서, IRF5가 S425D, S427D, S430D, 및 S436D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 4인, 조성물.
130. 구현예 115 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 8 및 12로부터 선택되는 IRF1인, 조성물.
131. 구현예 115 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 서열번호 11, 16 및 17로부터 선택되는 IRF8인, 조성물.
132. 구현예 131에 있어서, IRF8이 K310R 돌연변이를 갖는 서열번호 11인, 조성물.
133. 구현예 115 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 N-말단 IRF7 DNA 결합 도메인 (DBD) 및 항상성 활성 도메인 (CAD) 및 C-말단 IRF3 NES (핵 배출 신호) 및 연합 도메인을 포함하는 IRF7/IRF3 융합 단백질을 포함하는, 조성물.
134. 구현예 133에 있어서, 상기 IRF7/IRF3 융합 단백질이 IRF3 연합 도메인에서 인산화를 모방하는 돌연변이를 추가로 포함하는, 조성물.
135. 구현예 133 또는 134에 있어서, 상기 IRF7/IRF3 융합 단백질이 서열번호 15에 제시되는, 조성물.
136. 구현예 115 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조성물.
137. 구현예 136에 있어서, 상기 암호화된 IKKβ가 서열번호 18 내지 22와 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 조성물.
138. 구현예 136 또는 137에 있어서, 상기 암호화된 IKKβ가 서열번호 18 내지 22로부터 선택되는, 조성물.
139. 구현예 115 내지 138 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 서열번호 23 내지 44로부터 선택되는 서열을 포함하는, 조성물.
140. 구현예 115 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오타이드가 p53, RB, BRCA1, E1A, bcl-2, MDR-1, p21, p16, bax, bcl-xs, E2F, IGF-I VEGF, 안지오스타틴, 온코스타틴, 엔도스타틴, GM-CSF, IL-12, IL-2, IL-4, IL-7, IFN-γ, TNFα 및/또는 HSV-tk로부터 선택되는 하나 이상의 항암 유전자를 함유한 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조성물.
141. 구현예 115 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF가 IRF4인, 조성물.
142. 구현예 115 내지 122, 및 141 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 글루코코르티코이드-유도된 류신 지퍼 (GILZ)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조성물.
143. 구현예 115 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자가 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 조성물.
144. 구현예 143에 있어서, 상기 표적화 리간드가 코팅에 연결되는, 조성물.
145. 구현예 143 또는 144에 있어서, 상기 표적화 리간드가 CD206, CD163, 또는 CD23에 결합하는, 조성물.
146. 구현예 145에 있어서, 상기 표적화 리간드가 디-만노스인, 조성물.
147. 구현예 143 또는 144에 있어서, 상기 표적화 리간드가 CD38, G-단백질 커플링된 수용체 18 (Gpr18), 포밀 펩타이드 수용체 2 (Fpr2), CD64, 또는 CD68에 결합하는, 조성물.
148. 구현예 115 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 IRF, IKKβ, 및/또는 GILZ를 암호화하는 뉴클레오타이드가 동일한 나노입자 내에 캡슐화되는, 조성물.
149. 구현예 115 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 IRF, IKKβ 및/또는 GILZ를 암호화하는 뉴클레오타이드가 상이한 나노입자 내에 캡슐화되는, 조성물.
실시예 1. 재료 및 방법. PbAE 합성. 중합체를 합성하기 위해 사용되는 방법은 이전에 기재되어 있다 (Mangraviti A et al. (2015) ACS Nano 9: 1236-1249). 1,4-부탄디올 디아크릴레이트는 1:1 몰비의 디아크릴레이트 대 아민 단량체로 4-아미노-1부탄올과 조합된다. 아크릴레이트-말단화된 폴리(4-아미노-1-부탄올-코-1,4-부탄디올 디아크릴레이트)를 24시간동안 교반과 함께 상기 혼합물을 90℃로 가열함으로써 형성하였다. 2.3 g의 상기 중합체를 2 mL의 테트라하이드로푸란 (THF) 중에 용해시켰다. 피페라진-캡핑된 447 중합체를 형성하기 위해, 13 mL THF 중에 786 mg의 1-(3-아미노프로필)-4-메틸피페라진을 중합체/THF 용액에 첨가하고 2시간 동안 실온(RT)에서 교반하였다. 상기 캡핑된 중합체를 5용적의 디에틸 에테르로 침전시키고, 2용적의 새로운 에테르로 세척하고 진공하에 1일동안 건조시켰다. 순수 중합체를 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 중에 100 mg/mL의 농도로 용해시키고 -20℃에서 저장하였다.
디-만노스로의 PGA 접합. α-D-만노피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노스 (디-만노스, Omicron Biochemicals Inc.)는 폴리글루탐산 (PGA)으로 접합되기 전에 글리코실아민으로 변형시켰다. 먼저, 디-만노스 (157 mg)는 10.5 mL의 포화된 수성 탄산암모늄에 용해시키고, 이어서 24시간동안 RT에서 교반시켰다. 제2 일에, 보다 고형의 탄산암모늄을 디-만토스가 반응 용액으로부터 침전될때까지 첨가하였다. 혼합물을 TLC에 의한 측정시 완료될 때까지 교반함에 이어서 동결건조시켜 과량의 탄산암모늄을 제거하였다. 휘발성 염의 완전한 제거는 상기 고형을 메탄올 중에 재용해시켜 성취하였다. 이들 과정은 PGA와의 향후 접합을 위해 아노머 탄소 상에 아민을 생성하였다.
아민화된 디-만노스를 PGA에 접합시키기 위해, 기질을 30 mg m/L로 물에 용해시킴에 이어서 10분 동안 초음파처리하였다. 물 중에 에틸-N’-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드ㆍHCl(4 mg/mL, 30당량)을 4분 동안 RT에서 혼합하면서 첨가하였다. 물 중에 N-하이드록시설포숙신이미드 (30 mg/mL, 35당량)를 1분 동안 PGA/EDC 용액으로 항온처리하였다. 포스페이트-완충 식염수 (PBS) 중에서 아민화된 디만노스를 44:1 몰 비율로 수득된 활성화된 PGA와 배합하였고 6시간 동안 RT에서 혼합하였다. 과량의 시약을 24시간 동안 물에 대하여 투석에 의해 제거하였다.
mRNA 합성. eGFP, IRF5, 및 IKK (TriLink Biotechnologies)에 대해 코돈-최적화된 mRNA를 항-역 캡 유사체 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA)로 캡핑하고, 변형된 리보뉴클레오타이드 슈도우리딘(Ψ) 및 5-메틸시티딘 (m5C)으로 완전히 치환하였다.
나노입자 제조. IRF5 및 IKKβ mRNA를 3:1 (w:w) 비율로 배합하고 25 mM 나트륨 아세테이트 (NaOAc) 완충액 (pH=5.2) 중에서 100 μg/mL로 희석하였다. DMSO 중에서 폴리(β-아미노 에스테르)-447 (PbAE-447) 중합체 (상기된 바와 같이 제조된)를 또한 NaOAc 완충액 중에서 100 μg/μL로부터 6 μg/μL로 희석하였다. 나노입자를 형성하기 위해, PbAE-447 중합체를 60:1 (w:w)의 비율로 mRNA에 첨가하고 즉각적으로 중간 속도에서 15초 동안 와동시킴에 이어서 혼합물을 5분 동안 RT에서 항온처리하여 PbAE-mRNA 폴리플렉스가 형성되도록 하였다. 다음 단계에서, NaOAc 완충액 중에 100 μg/mL의 PGA/디-만노스를 폴리플렉스 용액에 첨가하고, 중간 속도에서 15초 동안 와동시키고, 실온에서 5분 동안 항온처리하였다. 상기 공정에서, PGA/디-만노스로 PbAE-mRNA 폴리플렉스의 표면을 코팅시켜 최종 NP를 형성하였다. 장기 저장을 위해, D-수크로스 (60 mg/mL)를 냉동보호제로서 NP 용액에 첨가하였다. 나노입자를 드라이 아이스에서 순간 동결시키고, 이어서 동결건조시켰다. 건조된 NP를 사용 때까지 -20℃ 또는 -80℃에서 저장하였다. 생체내 실험을 위해, 동결건조된 NP를 1:20 (w:v) 비율로 물에서 재현탁시켰다.
나노입자 크기 분포 및 ζ-포텐셜의 특징 분석. NP의 생리화학적 성질(수력학적 반경, 다분산성, ζ- 포텐셜 및 안정성을 포함)을 25℃에서 제타팔 (Zetapals) 장비 (Brookhaven Instrument Corporation)를 사용하여 특징 분석하였다. 역학적 광 산란을 기준으로 수력학적 반경 및 다분산성을 측정하기 위해, NP를 25 mM NaOAc (pH=5.2)로 5배 희석하였다. ζ-포텐셜을 측정하기 위해, NP를 10 mM PBS (pH=7.0) 중에서 10배 희석하였다. NP의 안정성을 평가하기 위해, 새롭게 제조된 입자를 10 mM PBS 완충액 (pH=7.4) 중에서 희석하였다. NP의 수력학적 반경 및 다분산도를 5시간 동안 10분 마다 측정하였고, 이들의 크기 및 입자 농도는 Nanosite 300 장비 (Malvern)를 사용하여 입자 트래킹 분석으로부터 유래하였다. 투과 전자 현미경을 사용하여 NP를 특징 분석하기 위해, 이전에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다 (Smith TT et al. (2017) Nat Nanotechnol 12: 813-820). 새롭게 제조된 NP (0.83 μg의 mRNA를 함유하는 25 μL)를 글로 방전-처리된 200 메쉬 탄소/포름바-코팅된 구리 격자무늬 상에 침적시켰다. 30초 후, 격자무늬를 순차적으로 50% 카노브스키 고정제, 0.1 M 카코딜레이트 완충액, dH2O, 이어서 1% (w/v) 우라닐 아세테이트로 처리하였다. 샘플은 120 kV에서 작동하는 JEOL JEM-1400 투과 전자 현미경 (JEOL USA)을 사용하여 이미지화하였다.
골수 유래된 대식세포 (BMDM) 및 다른 세포주. BMDM을 제조하기 위해, 골수 선조체 세포를 확립된 프로토콜에 따라 마우스 대퇴골로부터 수거하였다 (Zhang X et al. (2008) Curr Protoc Immunol Chapter 14: Unit 14 11). 이들 세포를 0.5 - 1.0 e6/ml의 씨딩 밀도에서 완전 배지 [4.5 g/L D-글루코스, L-글루타민, 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청 (FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL, 글루타맥스 50 mL/500 mL가 보충되고 20 ng/mL M-CSF (Peprotech, cat#315-02)가 보충된 DMEM]에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2하에 7일 동안 생체외 BMDM으로 분화되도록 하였다. 이어서, 이들을 대식세포-조건화된 배지 [20 ng/mL MPLA(Sigma, cat#L6895) 또는 20 ng/mL IL4 (eBioscience, cat# 34-8041)가 보충된 대식세포 완전 배지]로 조건화하였다. BMDM을 생체외에서 7 내지 21일 사이에 사용하였다. 카테린 로비 박사 (University of Kansas Medical Center, Kansas City, KS)로부터 기증된 뮤린 난소암 세포주 ID8을 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 5 μg/mL 인슐린, 5 μg/mL 트랜스페린, 및 5 ng/mL 나트륨 셀레나이트 (모두 Sigma-Aldrich)이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 보다 공격적인 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)-발현 ID8 균주를 생성하기 위해, ID8 종양 세포를 블라스티시딘-내성 유전자와 함께 뮤린 VEGF를 암호화하는 pUNO1 플라스미드 (Invivogen)로 형질감염시켰다. 안정한 형질감염체를 수득하기 위해, 종양 세포를 3주 동안 10 μg/mL 블라스티시딘 (Invivogen)을 함유하는 완전 배지에서 배양하였다. B16F10 흑색종 세포주 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection))를 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 2 mM/L-글루타민, 1.5 g/L 중탄산나트륨, 4.5 g/L 글루코스, 10 mM HEPES, 1.0 mM 나트륨 피루베이트, 및 0.05 mM 2-머캅토에탄올을 갖는 완전 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 생체내 생발광 이미지화를 위해, ID8-VEGF 및 B16F10 세포주 둘 다는 반딧불이 루시퍼라제를 사용하여 레트로바이러스적으로 형질도입하였다. RACS-PDGFβ 또는 RCAS-cre 레트로바이러스를 갖는 DF-1 세포주를 39℃에서 5% CO2 하에 10% FBS 및 100 U/mL 페니실린이 보충된 완전 배지에서 배양하였다.
BMDM의 mRNA 형질감염. 형질감염 1일 전에, BMDM을 250,000/웰의 농도로 대식세포 완전 배지에서 24-웰 플레이트 상에 재씨딩하였다. 형질감염 전에, 완전 배지를 300 μL의 비보충된 DMEM으로 대체하였다. 이들 세포를 형질감염시키기 위해, 2 μg mRNA를 함유하는 NP를 기본 배지에 첨가하고, 37℃에서 BMDM과 동시 배양하였다. 1시간 후, NP를 함유하는 배지를 제거하고 세포를 형질감염 효율 및 세포 생존능의 평가 전에 추가로 24시간 동안 배양하였다.
대식세포 시그니처 유전자 분석을 위한 BMDM의 형질감염. BMDM을 형질감염 24시간 전에 조건화된 배지에서 24-웰 플레이트 상에 재씨딩하여 세포가 이들의 표현형으로 형질전환되도록 하였다. 이어서, M2-형 대식세포를 상기된 형질감염 프로토콜에 따라 리포터로서 25% eGFP mRNA를 함유하는 IRF5/IKKβ NP 또는 2 μg mRNA를 함유하는 eGFP NP (대조군)에 노출시켰다. 24시간 후, 고도로 형질감염된 BMDM의 상위 10% (eGFP 발현에 의한 측정시)를 형질감염 24시간 후에 분류하였고, RNA 단리 전 또 다른 48시간 동안 저용량 (10 ng/mL) IL4 배지에서 재챌린지하였다. 이들 세포로부터 추출된 RNA를 표준 M1- 또는 M2-형 대식세포로부터의 것들과 비교하여 IRF5-NP 치료와 관련된 시그니처 유전자가 동정될 수 있다.
RNA 단리 및 제조. RNA를 수거하기 위해, BMDM을 트리졸 시약 (Ambion) 중에서 용해시키고 총 RNA를 추출하고 제조업자의 지침에 따라 RNeasy® 플러스 범용 소형-키트 (QIAGEN)를 사용하여 정제하였다. 샘플 RNA는 나노드롭 마이크로용적 분광광도계 (Thermo Fisher)를 사용하여 정량화하고, 이어서 Agilent 4200 TapeStation 분석기 (Agilent)를 사용하여 FHCRC 게놈 공유된 재원에 의해 수행된 품질 관리에 적용하였다.
나노스트링 (NanoString) 기술에 의한 대식세포 시그니처 유전자 분석. 자극된 BMDM 배양으로부터의 유전자 발현 값은 19개의 상이한 경로에 존재하는 770개의 유전자를 분석하는 nCounter® 골수 선천적 면역 패널 (NanoString Technologies, Seattle, WA)을 사용하여 측정하였고 7개의 상이한 골수성 세포 유형에 걸쳐 이들을 프로세싱하였다. 샘플은 n계수기 분석 시스템 (NanoString Technologies, Seattle, WA)을 사용하여 시험하였다. 미가공 데이터를 프로세싱하여 R/바이오컨덕터 나노스트링QCPro 소프트웨어 패키지 (Nickles D, Sandmann T, Ziman R and Bourgon R (2018) NanoStringQCPro: 나노스트링 mRNA 유전자 발현 데이터를 위한 품질향상 측정치 및 데이터 프로세싱 방법. R 패키지 버전 1.10.0.)를 사용하여 품질에 대해 조사하였다. 발현 값은 하우스키핑 유전자의 기하학적 평균으로 정규화하고 nSolver 4.0 소프트웨어 (NanoString Technologies, Seattle, WA)를 사용하여 로그2-형질전환시켰다. 비율 데이터에 대한 거짓 발견율을 벤자미니-예쿠티엘리 (Benjamini- Yekutieli) 방법을 사용한 t-시험에 의해 복귀된 p-값으로부터 계산하였다.
유동 세포측정 및 세포 분류. 비장, 혈액, 복막 세척액 및 기관지폐포 세척액으로부터 수득한 세포를 도 9에 열거된 항-마우스 항체 프로브를 사용한 골수 및 림프구 면역표현형분류 패널을 갖는 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 데이터를 FACSDIVA 소프트웨어를 실행하는 BD LSRFortessa 분석기 (Beckton Dickinson)를 사용하여 수집하였다. CD11b+ 및 F4/80+ 복막 대식세포를 BD FACS ARIA II를 사용하여 분류하였다. 수집된 모든 데이터를 FlowJo 10.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
사이토킨 분석. 사이토킨 수준은 FHCRC 면역 모니터링 공유 재원 센터에서 루미넥스 200 시스템 (Luminex)을 사용하여 평가하였다. 생체외 연구를 위해, 세포 배양 상등액을 IL-6, IL-12p70, INFγ, 및 TNFα 농도의 측정을 위해 수집하였다. 생체내 연구를 위해, GM-CSF, INFγ, IL-12p70, IL-2, IL-6, 및 TNFα의 혈장 농도를 측정하였다.
qRT-PCR 분석. 유전자 발현 수준을 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 선택된 대식세포 시그니처 유전자 (세르핀B2, Retnla, Ccl5, Ccl11, 코돈-최적화된 IRF5, 내인성 IRF5, 및 하우스키핑 GAPD 유전자)를 측정하기 위해, 총 RNA는 제조업자의 지침에 따라 RNeasy 미니-컬럼 (Qiagen)을 사용하여 단리하였다. cDNA는 qScript cDNA 합성 키트 (Quanta)를 사용하여 합성하였다. 각각의 샘플에 대해, qRT-PCR은 Roche's Universal Probe Library (UPL)으로부터의 유전자-특이적 프로브 및 프로브파인더 (ProbeFinder) (Roche)에 의해 최적화된 PCR 프라이머를 사용하여 PerfeCTa qPCR SuperMix Low ROX (Quanta)를 통해 3회 수행하였다: 세르핀B2, UPL-049, F-ACTGGGGCAGTTATGACAGG (서열번호 96), R-GATGATCGGCCACAAACTG (서열번호 97); Retnla, UPL-078, F-TTGTTCCCTTCTCATCTGCAT (서열번호 98), R-CCTTGACCTTATTCTCCACGA (서열번호 99); Ccl5, UPL-105, F-CCTACTCCCACTCGGTCCT (서열번호 100), R-CTGATTTCTTGGGTTTGCTGT (서열번호 101); Ccl11, UPL-018, F-AGAGCTCCACAGCGCTTC (서열번호 102), R-CAGCACCTGGGAGGTGAA (서열번호 103); 코돈-최적화된 IRF5, UPL- 022, F-TCTTAAAGACCACATGGTAGAACAGT (서열번호 104), R-AGCTGCTGTTGGGATTGC (서열번호 105); 내인성 IRF5, UPL-011, F-GCTGTGCCCTTAACAAAAGC (서열번호 106), R-GGCTGAGGTGGCATGTCT (서열번호 107). 시그니처 유전자 mRNA 수준을 GAPD, UPL- 060, F-AGCCACATCGCTCAGACAC (서열번호 108) 및 R-GCCCAATACGACCAAATCC (서열번호 109)의 증폭을 토대로 규정화하였다. 모든 qRT-PCR 반응은 QuantStudio6 소프트웨어(Applied Biosystems)를 실행하는 Quant Studio5 RT-PCR 기계를 사용하여 수행하였다. 증폭 플롯이 역치를 넘지 않고 어떠한 Ct 값도 수득되지 않은 경우에("미결정"), 검정의 최고 사이클 수 (40 사이클)와 균등한 Ct 값은 상대적 발현 비교를 위해 사용하였다.
마우스 및 생체내 종양 모델. 뇌 종양 모델-관련 실험을 제외하고, 이들 실험에서 사용된 마우스는 Jackson Laboratory로부터 수득하였고; 다른 것들은 교배하고 FHCRC 동물 시설에 거주시켰다. 마우스 모두는 센터의 동물실험윤리위원회 (center's Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜과 관련하여 사용하였다. 난소 종양을 모델링하기 위해, 5×106 혈관 상피 성장 인자 (VEGFP)-발현 ID8 세포를 복막내로 (복강) 4- 내지 6-주령 암컷 알비노 B6 (C57BL/6J-Tyr<c-2J>) 마우스에 주사하였고, 2주 동안 확립되도록 하였다. 생존 연구를 위해, 동물은 50 μg mRNA (9주 동안 주당 2개 용량, 또는 건강 조건이 안락사 요건에 도달할 때까지)를 함유한 IRF5 NP/eGFP NP를 사용하여 복강 처리하였다. 기전 연구를 위해, 1, 2 또는 3주 동안의 치료를 사용하고, 이어서 마지막 투여 48시간 후에 안락사시켰다. 복막 세척을 수행하여 복막 세포를 수거하였다. IRF5/IKKβ NP의 효능을 현상 대식세포 표적화 치료요법과 비교하기 위해, 마우스 하나의 그룹에 주당 2회 용량으로 3주 동안 50 μg mRNA를 함유한 IRF5/IKKβ NP로 처리하였고; 2번째 그룹에는 3주 동안 매일 비히클 (폴리에틸렌 글리콜 400 중에 5% 1-메틸-2-피롤리딘온) 중에 제형화된 15 mg/kg PI3Kγ 억제제 IPI-594 (MedKoo Biosciences Inc)를 경구 위관영양법으로 처리하고; 3번째 그룹에는 3주 동안 매일 동일한 비히클 중에 제형화된 30 mg/kg CSF1R 억제제 펙시다르티닙(PLX3397, MedKoo Biosciences Inc)을 복강 주사하였다.
전이 폐암을 모델링하기 위해, F-luc가 형질도입되고 200 μL RPMI 배지 중에 현탁된 2.5×104 16F10 세포를 4- 내지 6-주령 암컷 알비노 B6 (C57BL/6J-Tyr<c- 2J>) 마우스 (Jackson Laboratories)에 주사하고, 1주 동안 확립되도록 하였다. 생존 연구를 위해, 마우스를 레트로-오비탈적으로 PBS 중에 현탁된 30 μg mRNA를 함유하는 IRF5/IKKβ 또는 eGFP NP의 존재 (또는 부재)하에 처리하였다. 마우스를 3주 동안 또는 건강 조건이 안락사 요건에 도달할 때까지 3회 용량/주로 처리하였다. 기전 연구를 위해, 마우스에 2주 동안 동일한 처리를 하였다. 기관지폐포 세척을 수행하여, 분석을 위해 폐포 세포를 수거하였다.
신경교종을 함유한 마우스는 공개된 프로토콜 (Uhrbom L et al. (2004) Nat Med 10: 1257-1260)에 따라 생성하였다. RCAS-PDGFβ 및 RCAS-cre 레트로바이러스를 생성하는 조류 DF-1 세포를 4 내지 6주령의 네스틴-tv-a/Ink4a-arf-/-; Pten-/- 마우스 (C57BL/6)의 뇌 반구 (좌표: 브레그마로부터 1 mm 미골부, 2 mm 측면, 경막 표면으로부터 2mm의 깊이) 둘 다에 두개내로 주사하였다. 종양이 2주 동안 확립되도록 하였다. 15일 째에, 마우스를 하나의 반구에 10Gy 방사선 처리하는 한편, 비조사된 반구는 납으로 보호 처리하였다. 다음 날, 마우스에 30 μg mRNA를 함유하는 IRF5/IKKβ NP (3주 동안 3회 용량/주)를 레트로-오비탈 주사하거나 PBS 대조군 그룹에 할당하였다.
생체내 생발광 이미지화. PBS (15mg/mL) 중에 D-루시페린 (Xenogen)은 반딧불이 루시퍼라제 이미지화를 위한 기질로서 사용하였다. 생발광 이미지를 Xenogen IVIS 스펙트럼 이미지화 시스템 (Xenogen)으로 수집하였다. 마우스를 이미지화 전 및 이 동안에 2% 이소플루란 (Forane, Baxter Healthcare)을 사용하여 마취시켰다. ID8-VEGF 난소 종양에 대해, 각각의 마우스에 300 μg의 D-루시페린으로 복강 주사하였고 이미지를 10분 후에 수집하였다. B16F10 폐 전이 종양의 경우, 마우스에 3 mg의 D-루시페린으로 복강 주사하였고 이미지를 15분 후에 수거하였다. 뇌 종양 모델의 경우, 마우스에 75 mg/체중kg의 D-루시페린을 레트로-오비탈로 주사하고 이미지를 4분 후에 수집하였다. 획득 시간은 10초 내지 5분 범위였다.
생분포 분석. ID8-VEGF 난소 종양 모델에서 IRF5 NP의 생분포를 결정하기 위해, 7 내지 8개 그룹에서의 마우스에 50 μg mRNA를 함유하는 NP를 복강 투여하거나 레트로-오비탈로 투여하였다. 주사 24시간 후에, 전혈을 수거하고 마우스를 CO2로 안락사시켜 기관 (간, 비장, 폐, 신장, 심장, 장, 췌장 및 횡경막)을 회수하였다. 모든 조직은 RNAlater로 안정화시키고, 이어서 드라이 아이스 상에서 동결시켰다. 각각의 기관에서 코돈-최적화된 IRF5 mRNA 수준은 RT-qPCR을 사용하여 측정하였다.
독성 분석. 반복적 주입 대식세포-표적화 NP의 포텐셜 생체내 독성을 측정하기 위해, 본원 발명자는 3주 과정 동안 50 μg mRNA를 함유하는 RF5/IKKβ 또는 eGFP NP의 6개의 순차적 용량을 마우스 (5/그룹)에 정맥내 주사하였다. 대조군은 어떠한 처리도 받지 않았다. 최종 주입 24시간 후에, 마우스를 마취시키고 혈액을 레트로-오비탈 채혈에 의해 수집하여 완전한 혈액 계수를 측정하였다. 혈액을 또한 혈청 화학물질 분석 및 사이토킨 프로필 분석 (Phoenix Central Laboratories (Mukilteo, WA)에 의해 수행된)을 위해 수집하였다. 이어서, 동물을 CO2로 안락사시켜 기관을 회수하고, 이를 탈이온수로 세척한 후 4% 파라포름알데하이드 중에 고정시켰다. 조직을 통상적으로 프로세싱하고, 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 표본은 맹검 양상으로 스미타 필라이 (Smitha Pillai) MVSc, 박사, DACVP, 부서-인준된 스태프 병리학자에 의해 해석되었다.
사이토킨 검정. 사이토킨 수준은 FHCRC 면역 모니터링 공유 재원에서 루미넥스 200 시스템 (Luminex)을 사용하여 평가하였다. 생체외 연구를 위해, 세포 배양 상등액을 IL-6, IL12p70, INFγ, 및 TNFα 농도의 측정을 위해 수집하였다. 생체내 연구를 위해, GM-CSF, INFγ, IL-12p70, IL-2, IL-6, 및 TNFα의 혈장 농도를 측정하였다.
통계학적 분석. 관찰된 차이의 통계학적 유의성은 쌍을 이루지 않은 양측 일원 분산분석 시험 (two-tailed one-way ANOVA test)을 사용하여 분석하였다. 각각의 측정을 위한 P 값은 도면 또는 도면 범례에 열거한다. 생존 데이터는 로그 순위법을 사용하여 특징 분석하였다. 모든 통계학적 분석은 그래프패드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism software) 버전 6.0 또는 R 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
결과. TAM의 IVT mRNA 형질감염을 연출하기 위해 NP를 디자인함. 표적화된 mRNA 전달 시스템이 개발되었고 이는 양이온성 폴리(β-아미노 에스테르) (PbAE) 중합체와 음이온성 mRNA 간의 정전기 상호작용을 사용함으로써 표적화된 세포에서 강한 유전자 발현을 도입할 수 있다 (도 2a). 수득한 나노담체 중에 캡슐화된 mRNA의 안정성 및 해독을 개선시키기 위해, 변형된 리보뉴클레오타이드 슈도우리딘 (Ψ) (Kariko K et al. (2008) Mol Ther 16: 1833-1840) 및 5-메틸시티딘(m5C)을 혼입하고 ARCA (항-역 캡 유사체)(Quabius ES et al. (2015) N Biotechnol 32: 229-235)로 캠핑한 메시지의 합성 버전을 사용하였다. mRNA는 PbAE 골격에서 에스테르 결합의 가수분해 절단에 의해 세포내에서 mRNA-PbAE 복합체로부터 방출된다. 효율적인 생체내 T 세포 형질감염은 이전에 상기 시스템을 사용하여 입증하였다 (Smith TT et al. (2017) Nat Nanotechnol). 나노입자를 TAM에 표적화하고 이들이 함유하는 mRNA-PbAE 복합체를 추가로 안정화시키기 위해, 디-만노스 모이어티는 링커로서 폴리글루탐산 (PGA)을 사용하여 이들의 표면 상에 가공하였다 (도 2a). NP를 단순한 2-단계 하전 구동된 자가-어셈블리 과정을 사용하여 제조하였다. 먼저, 합성 mRNA는 mRNA를 나노 크기의 복합체로 응축시키는 양으로 하전된 PBAE 중합체와 착화시켰다. 상기 단계에 이어서 PBAE-mRNA 입자의 양전하를 보호하고 대식세포 표적화를 부여하는 디-만노스로 기능성화된 PGA를 첨가하였다. 수득한 mRNA 나노담체는 99.8 ± 24.5 nm의 크기, 0.183의 다분산도, 및 중성 표면 전하(3.40 ± 2.15 mV ζ-포텐셜, 도 2b 내지 도 2c)를 가졌다. 형질감염 효율은 먼저 녹색 형광 단백질 암호화 mRNA (GFP-NP)로 제형화된 NP를 사용하여 뮤린 골수-유래된 대식세포 (BMDM)에서 시험하였다. 간략하게, 50,000 BMDM은 1시간 동안 1 μg mRNA를 함유하는 NP에 노출시키고, 이어서 다음 날 GFP 발현을 유동 세포측정하였다. 단일 NP 적용 후, 본원 발명자는 이들의 생존능을 감소시키지 않고 통상적으로 이들 1차 대식세포의 31.9% (± 8.5%)를 형질감염시켰다 (도 2e 내지 도 2f). 디-만노스를 사용한 입자의 표면 변형은 비표적화된 (그러나 PGA-코팅된) 나노담체를 사용한 형질감염 비율이 상기 고유적으로 식세포 유형에서 25% (± 2.1%)의 평균으로 하강시키기 때문에 적절하다. NP는 선택적으로 CD11b+, F4/80+ 대식세포 집단을 표적화하였고, 대식세포의 46%가 형질감염되고 고수준의 eGFP를 발현하였다 (도 2d). 상기 높은 형질감염 효율은 mRNA의 TAM으로의 표적화된 전달에서 개시된 시스템 및 방법의 효능을 입증한다. 대식세포 분극화를 유도하는 전사 인자 후보물에 대한 시험관내 스크리닝의 결과를 토대로, 2개의 mRNA를 NP에 포함시키기 위해 선택하였다: 첫번째는 대식세포의 M1 표현형으로의 분극화를 선호하는 IRF 패밀리의 주요 구성원인 IRF5를 암호화하고 2번째는 IRF5를 인산화하고 활성화시키는 키나제인 IKKβ를 암호화한다.
면역억제 대식세포의 전염증성 표현형으로의 프로그래밍. 대식세포 분극화를 유도하기 위해, 2개의 mRNA를 NP에 포함시키기 위해 선택하였다: 첫번째는 대식세포의 M1 표현형으로의 분극화를 선호하는 인터페론 조절 인자 패밀리의 주요 구성원인 IRF5를 암호화하고 (Krausgruber T et al. (2011) Nat Immunol 12: 231-238); 두번째는 IRF5를 인산화하고 활성화시키는 키나제인 IKKβ를 암호화한다 (Ren J et al. (2014) Proc Natl Acad Sci U S A 111: 17438-17443). 3 IRF5 mRNA 대 1 IKKβ mRNA의 비율을 사용하였다. NP-전달된 (및 코돈-최적화된) IRF5 mRNA에 특이적인 실시간 정량적 PCR을 사용하여, 대식세포에서 mRNA 발현은 1일째 최대여서 내인성 인자 수준과 비교하여 IRF5에서 1,500배 증가를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (도 2a). 예상된 바와 같이, 유전자 발현은 일시적이었지만 IRF5 수준은 기준선으로 복귀하기 전에 3일 (581배 증가됨) 및 5일 (87배 증가됨) 동안 강하게 상향조절된 상태로 남아있었다.
IRF5/IKKβ-암호화 NP가, M2 대식세포를 치료학적으로 요구할 수 있는 항-암 M1 표현형으로 재프로그래밍할 수 있는지를 결정하기 위해, 나노스트링 유전자 발현 분석을 사용하였다. BMDM을 먼저 인터류킨-4 (IL-4)의 존재하에 배양하여 억제성 M2 표현형을 유도하였다 (도 2h). 대조군 GFP-mRNA 나노입자 또는 IRF5/IKKβ mRNA-함유 NP를 사용한 형질감염 후, 유전자 발현 프로필을 분석하고 BMDM을 TLR4 효능제 모노포스포릴 지질 A에 노출시킴으로써 별도로 생성된 염증성 대식세포와 비교하였다. 억제성 Il-4-함유 배지에서 배양되는 경우에도, IRF5/IKKβ mRNA NP로 형질감염된 대식세포는 염증성 대식세포와 유사한 유전자 발현 프로필을 나타낸다 (도 2i). 세르핀b2 및 Ccl2 (Jablonski K et al. (2015) Plos One 10: e0145342; Varga T et al. (2016) J Immunol 196: 4771-4782)와 같은 시그니처 M2 대식세포 유전자는 강하게 하향조절된 반면, Ccl5 (Sica A et al. (2012) J Clin Invest 122: 787-795)와 같은 주요 M1 분화 유전자는 상향조절되었다 (도 2j, 도 2k). 이들 데이터는 IRF5 및 이의 키나제의 NP-매개된 발현이 억제성 대식세포를 전염증성 표현형 쪽으로 왜곡시킴을 확립한다.
실시예 2. 산재된 난소암에 대한 NP-전달된 전구-M1 유전자의 치료학적 효과. 임상적으로 관련된 생체내 시험 시스템에서 상기 치료 접근법을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스에서 말기 단계의 절제 불가능한 난소 종양을 재현하는 모델을 사용하였고; 이들 동물에 종양 성장의 일련의 생발광 이미지화를 가능하게 하기 위해 루시퍼라제로 태깅된 ID8 난소암 세포를 주사한다 (Liao JB et al. (2015) J Immunother Cancer 3: 16; Stephan SB et al. (2015) Nat Biotechnol 33: 97-101). 종양은 2주 동안 확립되도록 하였다. 상기 단계까지, 마우스는 복막 벽에 걸쳐서 및 장간막 중에 결절을 나타내었다. 동물은 9주 동안 100 μg의 mRNA/마우스/주의 복강 용량에서 PBS (대조군), GFPNP (샴), 또는 IRF5/IKKβ NP 치료제를 투여받은 3개의 그룹으로 나누었다 (도 4a). IRF5/IKKβ NP 치료받은 그룹에서, 질환은 퇴보되고 궁극적으로 동물의 40%에서 제거된 것으로 관찰되었다(대조군에서 60일에 비해 전체 142일 메디안 생존; 도 4b 내지 도 4c). IRF5/ IKKβ NP-매개된 항-종양 효과의 기본 기전을 이해하기 위해, 만노스 수용체-표적화가 얼마나 배타적으로 NP 상호작용을 식세포로 국한시키는지를 먼저 조사하였다. 디-만노스로 표적화된 NP의 제1 용량 24시간 후에 수거된 복막 세척 체액의 유동 세포측정은 대식세포 및 단핵구로의 우선적 유전자 전달 (각각 평균 37.1% 및 15.3%, 도 4d)을 밝힌 반면, 오프-표적 세포로의 형질감염은 낮거나 검출할 수 없었다. 이어서, 3주 기간 동안 (매주 2회 주사) IRF5/IKKβ 나노입자 또는 PBS로 처리 후 확립된 난소 암을 갖는 마우스의 복막에서 대식세포/단핵구 집단의 세부적인 표현형 및 기능성 분석을 수행하였다. 유동 세포측정 분석은 IRF5/IKKβ NP가 면역 억제 대식세포의 집단 (Ly6C-, F4/80+, CD206+)을 대조군에서 43% ± 15.6%에 비해 평균 2.6% ± 2.1%로 감소시킴을 밝혔다 (도 4e 내지 도 4f). 역으로, M1-형 대식세포의 분획은 0.5% ± 0.2%에서 10.2% ± 4.1%로 증가하였다 (도 4e, 도 4g). IRF5 유전자 치료요법은 또한 다른 면역 세포의 집단에 영향을 미쳤다. 특히, 염증성 단핵구 (CD11b+, Ly6C+, Ly6G-)는 보다 풍부하였다(비처리된 마우스에서 4.5% ± 1.9%와 비교하여 73.4% ± 3.6%). 모든 IRF5 NP-처리된 동물에서 하나의 흥미로운 발견은 신생물 내 또는 이의 주변에 존재하는 림프구의 다초점 밀집 클러스터였고 (도 4h), 이는 면역 자극 대식세포의 유전학적 프로그래밍이 고형 종양으로의 림프구 이동 및 침윤을 복구시킬 수 있음을 가리킨다.
복막 대식세포는 형광성-활성화된 세포 분류에 의해 단리하여 이들의 사이토킨 분비를 분석하였고 전염증성 (항-종양) 사이토킨 IL-12 (3.4배 더 높음), IFN-g (8.4배 더 높음), 및 TNF-α (1.5배 더 높음)의 방출에서 강한 증가를 검출하였고, 반면, 다르게 활성화된 (M2-유사) 대식세포를 향한 분화와 관련된 조절 사이토킨인 IL-6의 수준은 97배 감소하였다 (도 4i). 게놈 발현 프로파일링은 IRF5/IKKβ 나노입자-처리된 마우스에서 M1-형 대식세포 표현형 쪽으로의 분화를 확인시켜주었다. MPLA 또는 IL-4에서 생체외 배양된 대식세포의 유전자 발현 수준은 각각 전형적인 M1-형 또는 M2-형 대식세포에 대한 참조 값을 제공하기 위해 포함되었다 (도 4j).
생분포 및 안전성. 이어서, 단지 나노입자-전달된 (코돈-최적화된) IRF5만을 검출하도록 디자인된 RT-qPCR 검정을 사용한 복막 주사 24시간 후에 다양한 기관내 나노입자의 분포를 정량화하였다. IVT mRNA의 최고 농도는 간, 비장, 장, 췌장 및 횡경막을 포함하는, 복막 내 위치된 기관에서 발견되었다 (도 5a). 복막 외부에 위치한 기관 (심장, 폐, 신장)에서 소량의 입자-전달된 mRNA가 검출되었고, 이는 복강 주사된 나노담체의 분획이 전신 순환계에 진입함을 시사한다. 분포 데이터에 따라, 이어서, 본원 발명자는 이들 나노시약이 반복적인 투여를 위해 생물적합성이고 안전한지를 평가하였다. 마우스에 총 8회 용량의 IRF5/IKKβ NP (4주 동안 2개의 50 μg mRNA 용량/주, 도 5b)를 주사하였다. 이들은 최종 투여 24시간 후에 안락사시키고 체중을 기록하고 혈액을 혈청 화학물질 분석을 위해 레트로오비탈 채혈로 수거하고 완전한 총 부검을 수행하였다. 그룹 간의 체중에서는 어떠한 차이도 없었다. 하기의 조직들은 보드 인증 직원 병리학자에 의해 평가하였다: 간, 비장, 장간막, 췌장, 위, 신장, 심장 및 폐. 조직병리학적 평가는 모든 경우에 종양 병변 내 또는 이의 주변에서 림프구의 다초점 밀집 클러스터를 밝혔지만 신생물 세포가 존재하지 않는 조직에서 염증 또는 실제 괴사에 대한 어떠한 증거가 관찰되지 않았다 (도 5c). 또한, IRF5/IKKβ NP-처리된 마우스의 혈청 화학물질은 PBS 대조군의 것에 상응하였고, 이는 전신 독성이 나타나지 않음을 가리킨다 (도 5d). 소량의 IRF5-mRNA가 생분포 연구에서 전신적으로 검출되었기 때문에, 말초 혈액에서 염증성 사이토킨을 정량화하기 위해 병행 실험을 디자인하였다. IRF5/IKKβ NP의 일회 복강 주사 후, 적당하고 일시적인 증가가 인터류킨-6 (IL-6)의 혈청 수준에서 평균 26.8 pg/mL (도 5e)이고, 종양 괴사 인자-a (TNF-a)가 평균 94.7 pg/mL인 것으로 측정되었다 (도 5f). 이전의 보고를 토대로, 이들 수준은 병리학적 발견과 관련된 것들 보다 500배 낮았고 따라서 안전한 것으로 고려될 수 있다 (Tarrant J.M. (2010) Toxicol Sci 117: 4-16; Copeland S et al. (2005) Clin Diagn Lab Immunol 12: 60-67).
IRF5/IKKβ 나노입자의 정맥내 주입과 함께 전신 종양 전이의 제어. 복막 전반에 걸쳐 퍼진 종양 병변을 치료하기 위해 복막강 내에 직접 투여된 IRF5/IKKβ NP로 성취된 치료학적 반응을 토대로, 요구받은 다음 질의는 정맥내 주입된 mRNA 나노담체가 산재된 질환을 제어하기 위해 전신적으로 대식세포를 프로그래밍할 수 있는지였다. RT-qPCR 생분포 연구는 정맥내-주입된 나노담체가 우선적으로 이들의 mRNA 카고를 고수준으로 대식세포/식세포가 거주하는 기관, 대부분, 비장, 간 및 폐로 전달함을 밝혔다 (도 6a). 임상적으로 관련된 생체내 시험 시스템에서 항종양 반응을 측정하기 위해, IRF5/ IKKβ mRNA를 함유하는 입자를 산재된 폐 흑색종 전이를 갖는 마우스에 투여하였다 (도 6b). 최근 연구는 상기 질환에 의해 유발된 전이를 확립하는데 단핵구 및 대식세포의 기본 역할을 기재하고 (Butler KL et al. (2017) Sci Rep 7: 45593; Nielsen SR et al. (2017) Mediators Inflamm 2017: 9624760), 이것은 종양 생착이 폐에서 식세포 축적과 협력하는 것을 공초점 현미경으로 확인되었다 (도 6c). 종양 부담은 생발광 이미지화에 의해 결정되었고, 검출가능한 암을 갖는 마우스는 일치하는 수준을 갖는 그룹으로 분류하였다. 이어서, 그룹은 어떠한 치료요법을 받지 않거나 (PBS) GFP- 또는 IRF5/ IKKβ-캡슐화 나노입자의 정맥내 주사를 받은 치료 조건으로 무작위로 할당하였다. IRF/IKKβ 나노입자 치료요법만이 폐에서의 종양 부담을 실질적으로 감소시켰고; 사실, 이들은 평균 1.3배로 전체 생존을 개선시켰다 (도 6d 내지 도 6e). 병행 실험에서, 마우스는 종양 접종 22일 후에 희생시켜 폐 전이 계수와 함께 생발광 종양 신호를 입증하였고 유동 세포측정에 의해 대식세포 분극화를 평가하였다. IRF5/IKK NP-처리된 동물의 폐에서 전이의 총 수는 PBS 대조군 (평균 419±139 전이; 도 6f 내지 도 6g)과 비교하여 8.7배 감소 (평균 40±16 전이)하였다. 기관지폐포 세척 체액 세포의 유동 세포측정은 면역-억제성(CD206+, MHCII-, CD11c+, CD11b낮은) 대식세포의 활성화된 (CD206-, MHCII+, CD11c-, CD11b+) 식세포를 향한 강한 전환을 밝혔다 (도 6h내지 도 6i).
신경교종을 치료하기 위한 종양-억제 식세포의 프로그래밍. 3번째 생체내 시험 시스템을 위해, 신경교종을 조사하였고 이는 암 유형을 관리하기가 어려웠고, 여기서 M2-형 대식세포는 다수의 비-신생물 세포를 나타내고 종양 성장 및 침투를 촉진시킨다 (Hambardzumyan D et al. (2016) Nat Neurosci 19: 20-27). 현재, 상기 질환에 대한 표준 관리는 방사선치료요법이고 이는 불행하게도 증상의 일시적인 안정화 또는 감소만을 제공하고 메디안 생존을 3개월까지 연장한다 (Mann J et al. (2017) Front Neurol 8: 748). 상기 질환의 유전학적 이벤트 및 후속적 분자 진화를 재현하기 위해, PDGFβ-구동된 신경교종의 RCAS-PDGF-B/네스틴-Tv-a; Ink4a/Arf-/-; Pten-/- 유전자전이 마우스 모델(PDG 마우스 (Hambardzumyan D et al. (2009) Transl Oncol 2: 89-95; Quail DF et al. (2016) Science 352: aad3018))을 사용하였다. 뇌 조직에 RCAS-PDGFβ 또는 RCAS-cre 레트로바이러스로 형질감염된 DF-1 세포의 혼합물 (1:1 혼합물, 2 μL)을 입체적으로 주사하였다. 신경교종 선조체에서 PDGFβ 발암유전자의 과발현 및 종양 서프레서 유전자 Ink4a-arf 및 Pten의 부재는 21일 내 거의 완전한 침투와 함께 4 내지 5 mm 직경의 종양 형성 (도 7a)을 유도하였다 (이전에 확립된 바와 같이 (Hambardzumyan D et al. (2009) Transl Oncol 2: 89-95)). 면역형광성을 사용하여, 종양 침윤 (CD68+) 대식세포의 존재 (도 7b, 좌측으로부터 3번째 패널에서 지적된)는 확립된 신경교종 (좌측으로부터 2번째 패널에 나타냄)에서 확인되었다. 유동 세포측정은 F4/80+, CD11b+ 대식세포 집단이 종양 내 총 세포의 32.8%를 차지함을 밝혔고, 이는 연령-일치된 건강한 대조군 마우스 (3.7%)에서 나타낸 것 보다 9배 높다 (도 7c). 실험에서, PDG 마우스는 주요 암 유전자 프로모터에 연결된 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 발현한다. 상기 리포터로부터의 생발광은 종양 등급과 양성으로 상호관련이 있는 것으로 입증되었고 (Uhrbom L et al. (2004) Nat Med 10: 1257-1260), 따라서, 이는 치료 개시 후 4일 마다 종양 발생을 모니터링하기 위해 사용되었다. 단독치료요법으로서 IRF/IKKβ NP는 먼저 시험되었다: PDG 마우스는 IRF5/IKKβ mRNA, 또는 대조군 그룹에서 PBS가 부하된 9개 용량의 NP의 정맥내 주입을 받았다(3주 동안 3회 용량/주). IRF/IKKβ NP 처리는 종양 진행을 단지 약하게 억제하였다(처리받지 않은 대조군과 비교하여 평균적으로 단지 5일 생존 이점만을 생성한다; 도 7d). 그러나, IRF5/IKKβ NP 주사와 표준 관리로서 조합 방사선치료요법은 PBS 대조군 그룹과 비교하여 종양 성장을 실질적으로 감소시켰고 처리된 마우스의 생존을 2배 초과로 증가시켰다 (각각 52일 대 25일; 도 7e 내지 도 7f).
결론적으로, 3개의 임상전 고형 종양 모델로부터의 생체내 결과는 국부적으로 또는 전신으로 투여된 나노입자가 대식세포 분극화의 마스터 조절인자를 암호화하는 유전자를 전달하여 면역억제 대식세포를 종양-제거 표현형으로 재프로그래밍할 수 있음을 입증한다.
뮤린으로부터 사람 대식세포로의 해석. 마우스에서 획득한 데이터가 사람 질환을 치료하는 것과 관련성이 있음 확인하기 위해, 사람 IRF5 및 IKKβ (huIRF5 NP)를 암호화하는 IVT mRNA를 전달하는 NP를 조립하였다. 사람 단핵구 세포주 THP-1은 이들 나노담체를 시험하기 위해 잘-확립된 M1 및 M2 대식세포 분극화 모델로서 사용하였다 (Li C et al. (2016) Sci Rep 6: 21044; Surdziel E et al. (2017) Plos One 12: e0183679). M2-유형 대식세포는 THP-1 세포를 PMA로 처리하고 이들을 IL-4 및 IL-13으로 분극화시킴으로써 생성하였다 (도 8a). huIRF5 NP가 기능성이고 IRF 경로를 활성화시킴을 확인하기 위해, THP1-LuciaTM ISG 세포를 huIRF5/IKKβ 또는 GFP 대조군 mRNA가 부하된 나노입자로 형질감염시켰다. THP1-LuciaTM ISG 세포는 IRF-유도성 프로모터의 제어하에 형광성 Lucia 리포터를 분비한다. 이러한 혼성 프로모터는 NF-κB 또는 AP-1 경로의 활성화인자에 반응하지 않는 ISG54 소형 프로모터에 융합된 5개 IFN-자극된 반응 요소 (ISRE)를 포함한다. 결과로서, THP1-Lucia™ ISG 세포는 Lucia 루시퍼라제의 활성을 결정함으로써 IRF 경로의 모니터링을 가능하게 한다. huIRF5 NP는 M2-분극화된 THP-1 세포에서 루시퍼라제 발현을 강하게 상향조절하는 것으로 밝혀졌고, 이는 mRNA 작제물이 사람 세포에서 기능적임을 가리킨다 (도 8b 및 도 8c). IRF5 경로 활성화가 M2 분극화된 THP-1 세포가 M1-형 표현형이 되도록 재프그래밍할 수 있는지를 결정하기 위해, NP 형질감염 후 전염증성 사이토킨 IL-1β의 분비를 측정하였다. IL-1β의 생성은 형질감염되지 않은 대조군에 비해 huIRF5 NP로 형질감염된 THP-1 세포에서 유의적으로 증가하였고 (평균 21배; P<0.0001, 도 8d), 이는 M1 대식세포 세포 표면 마커 CD80의 강한 상향조절 (10.9배 증가된 MFI, P<0.0001)과 상호관련이 있다 (도 8e).
서열번호 주요
본원에 기재된 핵산 서열은 37 C.F.R. §1.822에 정의된 바와 같이 뉴클레오타이드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 나타낸다. 각각의 핵산 서열의 하나의 가닥만을 나타내지만 상보성 가닥은 이것이 적당한 구현예에 포함되는 것으로서 이해된다. 서열번호 55, 58, 61, 64, 71, 73 및 79는 상기 서열 목록에서 사용되지 않는다. 첨부된 서열 목록은 하기의 서열을 보여준다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 개시된 각각의 구현예는 이의 특정 기재된 요소, 단계, 재료 또는 성분을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나 이루어질 수 있다. 따라서, "포함한다 (include)" 또는 "포함하는 (including)"은 하기를 언급하는 것으로 해석되어야 한다: "를 포함하는, 로 이루어진, 또는 필수적으로 이루어진". 변하는 용어 "포함한다 (comprise)" 또는 "포함한다 (comprises)"는 포함하지만 이에 제한되지 않음을 의미하고, 심지어 대량으로 비특정 요소들, 단계들, 재료들 또는 성분들의 포함을 가능하게 한다. 변하는 용어 "로 이루어진"은 특정되지 않은 임의의 요소, 단계, 재료 또는 성분을 배제한다. 변하는 용어 "필수적으로 이루어진"은 구현예의 범위를 특정된 요소들, 단계들, 재료들 또는 성분들로 제한하고 상기 구현예에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다. 재료 효과는 실시예 2에 기재된 바와 같은 난소암의 마우스 모델을 치료하는 능력에 있어서 통계학적으로 유의적인 감소를 유발할 것이다.
달리 지시하지 않는 한, 본 명세서와 청구범위에 사용된 성분의 양, 분자량, 반응 조건 등과 같은 특성을 나타내는 모든 수는 모든 경우에 있어서 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 달리 지시하지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 얻고자 하는 바람직한 특성에 따라 다를 수 있는 근사치이다. 적어도, 그리고 청구항의 범위에 대한 균등론의 적용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 숫자의 수에 비추어 통상적인 반올림 기법을 적용하여 이해되어야 한다. 추가의 명료함이 요구되는 경우, "약"은 기재된 수치 또는 범위와 연계하여 사용될 때 당업자에 의해 합리적으로 이에 기인하는 의미를 갖고, 즉, 진술된 값 또는 범위 보다 어느 정도 이상 또는 어느 정도 미만, 진술된 값의 ±20%; 진술된 값의 ±19%; 진술된 값의 ±18%; 진술된 값의 ±17%; 진술된 값의 ±16%; 진술된 값의 ±15%; 진술된 값의 ±14%; 진술된 값의 ±13%; 진술된 값의 ±12%; 진술된 값의 ±11%; 진술된 값의 ±10%; 진술된 값의 ±9%; 진술된 값의 ±8%; 진술된 값의 ±7%; 진술된 값의 ±6%; 진술된 값의 ±5%; 진술된 값의 ±4%; 진술된 값의 ±3%; 진술된 값의 ±2%; 또는 진술된 값의 ±1% 범위 이내를 지칭한다.
넓은 범위의 본 발명을 기재하고 있는 수치 범위 및 파라미터가 근사치이지만, 구체적인 실시예에 기재된 수치는 가능한 정확하게 기록된다. 그러나, 임의의 수치는 이들의 각 시험 측정에서 나타나는 표준 편차로부터 필연적으로 생기는 특정 오류를 본질적으로 포함하고 있다.
본 발명을 기재하는 것과 관련하여 (특히 하기의 청구항과 관련하여) 사용되는 "a", "an", "the", 및 유사 용어는 본원에 달리 지적되지 않거나 내용에 의해 명백하게 모순되지 않는 경우 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 특정 값의 범위에 대한 언급은, 해당 범위에 속하는 각 개별 값을 개별적으로 지칭하는 것에 대하여 단지 편법을 제공하려는 것일 뿐이다. 본원에서 달리 지시하지 않는 한, 각 개별 값은 이들이 본원에서 개별적으로 언급된 것과 같이 본 명세서 내에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 지시하지 않거나 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 임의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 예 및 모든 예, 또는 예시적인 표현 (예컨대, " ~ 와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위한 것이며, 청구된 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 명세서에서 어떠한 표현도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 구성요소를 가리키는 것으로 이해되어서는 안된다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적인 구성요소 또는 구현예의 그룹화는 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다. 각 그룹의 구성원은 개별적으로, 또는 본원에 나타난 그룹의 다른 구성원 또는 다른 구성요소와의 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 그룹 중 하나 이상의 구성원들은 편의상 및/또는 특허적격성의 이유로 그룹에 포함되거나, 또는 이로부터 삭제될 수 있는 것으로 기대된다. 이러한 임의의 포함 또는 삭제가 발생하는 경우, 본 명세서는 변형된 것과 같은 그룹을 포함하는 것으로 간주되기 때문에, 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬 그룹의 서술된 내용을 만족하게 된다.
본 발명을 수행하는데 본 발명자들에게 알려진 최선의 방법을 비롯한 본 발명의 특정 구현예가 본원에 기술된다. 물론, 기술된 이들 구현예에 대한 변형은 상술한 설명을 읽어보면 당업자에게는 명백해질 것이다. 본 발명자들은 당업자들이 이러한 변형을 적절히 사용하기를 기대하며, 본 발명자들은 본 발명이 구체적으로 기술된 것과는 달리 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용되는 법에 의해 허용되는 바와 같이 여기에 첨부된 청구범위에 언급된 대상물에 대한 모든 변형과 균등물을 포함한다. 나아가, 상기 기술된 구성요소들의 모든 가능한 변형들 중의 임의의 조합은, 본원에서 달리 지시하지 않거나 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 본 발명에 포함된다.
또한, 본 명세서 전반에 걸쳐 특허, 인쇄 된 간행물, 저널 논문 및 기타 서면 텍스트 (여기서 참조 된 자료)에 대한 수많은 참조가 이루어졌다. 참조 자료 각각은 이들의 참조 교시를 위해 그 전문이 본원에 참조로 개별적으로 포함된다.
끝으로, 본원에 개시된 본 발명의 구현예는 본 발명의 원리를 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 사용될 수 있는 다른 변형들은 본 발명의 범위 이내에 속한다. 따라서, 예로서, 제한 없이, 본 발명의 대안적인 구성은 본원의 교시에 따라 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 보여지고 기술된 것과 똑같은 것으로 한정되지 않는다.
본원에 나타낸 특정 사항은 단지 본 발명의 바람직한 구현예를 예시하고 설명적 논의를 목적으로 하고 본 발명의 다양한 구현예의 원리 및 개념 양상에 대한 가장 유용하고 용이하게 이해되는 기재인 것으로 사료되는 것을 제공할 목적으로 제공된다. 이와 관련하여, 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요한 것 보다 보다 상세하게 본 발명의 구조적 세부사항을 보여주려는 시도는 없고, 도면 및/또는 실시예로 취한 기재는 여러 형태의 본 발명이 실제로 어떻게 구현될 수 있는 지를 당업자에게 자명하다.
본원의 개시내용에 사용된 정의 및 설명은 하기 실시예에서 명확하고 명백하게 변형되지 않는 한 또는 상기 의미의 적용이 임의의 구성을 무의미하게 또는 필수적으로 무의미하게 하는 경우, 임의의 향후 구성에서 제어하는 것으로 의미되고 의도된다. 용어의 구성이 무의미하거나 필수적으로 무의미하게 하는 경우에, 상기 정의는 당업자에게 공지된 사전 또는 웹스터 사전, 제3판. 예를 들어, 생화학 및 분자 생물학의 옥스포드 사전 (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)에서 취해져야만 한다.
<110> Fred Hutchinson Cancer Research Center Stephan, Matthias <120> ALTERING INFLAMMATORY STATES OF IMMUNE CELLS IN VIVO BY MODULATING CELLULAR ACTIVATION STATES <130> F053-0076PCT/18-073-WO-PCT <150> US 62/618,908 <151> 2018-01-18 <160> 111 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 498 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Gln Ser Ile Pro Val Ala Pro Thr Pro Pro Arg Arg Val Arg 1 5 10 15 Leu Lys Pro Trp Leu Val Ala Gln Val Asn Ser Cys Gln Tyr Pro Gly 20 25 30 Leu Gln Trp Val Asn Gly Glu Lys Lys Leu Phe Cys Ile Pro Trp Arg 35 40 45 His Ala Thr Arg His Gly Pro Ser Gln Asp Gly Asp Asn Thr Ile Phe 50 55 60 Lys Ala Trp Ala Lys Glu Thr Gly Lys Tyr Thr Glu Gly Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Asp Pro Ala Lys Trp Lys Ala Asn Leu Arg Cys Ala Leu Asn Lys 85 90 95 Ser Arg Asp Phe Arg Leu Ile Tyr Asp Gly Pro Arg Asp Met Pro Pro 100 105 110 Gln Pro Tyr Lys Ile Tyr Glu Val Cys Ser Asn Gly Pro Ala Pro Thr 115 120 125 Asp Ser Gln Pro Pro Glu Asp Tyr Ser Phe Gly Ala Gly Glu Glu Glu 130 135 140 Glu Glu Glu Glu Glu Leu Gln Arg Met Leu Pro Ser Leu Ser Leu Thr 145 150 155 160 Glu Asp Val Lys Trp Pro Pro Thr Leu Gln Pro Pro Thr Leu Arg Pro 165 170 175 Pro Thr Leu Gln Pro Pro Thr Leu Gln Pro Pro Val Val Leu Gly Pro 180 185 190 Pro Ala Pro Asp Pro Ser Pro Leu Ala Pro Pro Pro Gly Asn Pro Ala 195 200 205 Gly Phe Arg Glu Leu Leu Ser Glu Val Leu Glu Pro Gly Pro Leu Pro 210 215 220 Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Glu Gln Leu Leu Pro Asp Leu Leu Ile 225 230 235 240 Ser Pro His Met Leu Pro Leu Thr Asp Leu Glu Ile Lys Phe Gln Tyr 245 250 255 Arg Gly Arg Pro Pro Arg Ala Leu Thr Ile Ser Asn Pro His Gly Cys 260 265 270 Arg Leu Phe Tyr Ser Gln Leu Glu Ala Thr Gln Glu Gln Val Glu Leu 275 280 285 Phe Gly Pro Ile Ser Leu Glu Gln Val Arg Phe Pro Ser Pro Glu Asp 290 295 300 Ile Pro Ser Asp Lys Gln Arg Phe Tyr Thr Asn Gln Leu Leu Asp Val 305 310 315 320 Leu Asp Arg Gly Leu Ile Leu Gln Leu Gln Gly Gln Asp Leu Tyr Ala 325 330 335 Ile Arg Leu Cys Gln Cys Lys Val Phe Trp Ser Gly Pro Cys Ala Ser 340 345 350 Ala His Asp Ser Cys Pro Asn Pro Ile Gln Arg Glu Val Lys Thr Lys 355 360 365 Leu Phe Ser Leu Glu His Phe Leu Asn Glu Leu Ile Leu Phe Gln Lys 370 375 380 Gly Gln Thr Asn Thr Pro Pro Pro Phe Glu Ile Phe Phe Cys Phe Gly 385 390 395 400 Glu Glu Trp Pro Asp Arg Lys Pro Arg Glu Lys Lys Leu Ile Thr Val 405 410 415 Gln Val Val Pro Val Ala Ala Arg Leu Leu Leu Glu Met Phe Ser Gly 420 425 430 Glu Leu Ser Trp Ser Ala Asp Ser Ile Arg Leu Gln Ile Ser Asn Pro 435 440 445 Asp Leu Lys Asp Arg Met Val Glu Gln Phe Lys Glu Leu His His Ile 450 455 460 Trp Gln Ser Gln Gln Arg Leu Gln Pro Val Ala Gln Ala Pro Pro Gly 465 470 475 480 Ala Gly Leu Gly Val Gly Gln Gly Pro Trp Pro Met His Pro Ala Gly 485 490 495 Met Gln <210> 2 <211> 514 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asn Gln Ser Ile Pro Val Ala Pro Thr Pro Pro Arg Arg Val Arg 1 5 10 15 Leu Lys Pro Trp Leu Val Ala Gln Val Asn Ser Cys Gln Tyr Pro Gly 20 25 30 Leu Gln Trp Val Asn Gly Glu Lys Lys Leu Phe Cys Ile Pro Trp Arg 35 40 45 His Ala Thr Arg His Gly Pro Ser Gln Asp Gly Asp Asn Thr Ile Phe 50 55 60 Lys Ala Trp Ala Lys Glu Thr Gly Lys Tyr Thr Glu Gly Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Asp Pro Ala Lys Trp Lys Ala Asn Leu Arg Cys Ala Leu Asn Lys 85 90 95 Ser Arg Asp Phe Arg Leu Ile Tyr Asp Gly Pro Arg Asp Met Pro Pro 100 105 110 Gln Pro Tyr Lys Ile Tyr Glu Val Cys Ser Asn Gly Pro Ala Pro Thr 115 120 125 Asp Ser Gln Pro Pro Glu Asp Tyr Ser Phe Gly Ala Gly Glu Glu Glu 130 135 140 Glu Glu Glu Glu Glu Leu Gln Arg Met Leu Pro Ser Leu Ser Leu Thr 145 150 155 160 Asp Ala Val Gln Ser Gly Pro His Met Thr Pro Tyr Ser Leu Leu Lys 165 170 175 Glu Asp Val Lys Trp Pro Pro Thr Leu Gln Pro Pro Thr Leu Arg Pro 180 185 190 Pro Thr Leu Gln Pro Pro Thr Leu Gln Pro Pro Val Val Leu Gly Pro 195 200 205 Pro Ala Pro Asp Pro Ser Pro Leu Ala Pro Pro Pro Gly Asn Pro Ala 210 215 220 Gly Phe Arg Glu Leu Leu Ser Glu Val Leu Glu Pro Gly Pro Leu Pro 225 230 235 240 Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Glu Gln Leu Leu Pro Asp Leu Leu Ile 245 250 255 Ser Pro His Met Leu Pro Leu Thr Asp 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tccagctgag gaaagtgtgg ggccaagtct ggcacagcat ccagacgctg 1320 aaggaagact gtaaccggct gcagcaggga cagcgagcag ccatgatgag tctcctccgg 1380 aataacagct gcctctctaa gatgaagaac gccatggcct ccacggccca gcagctcaag 1440 gccaagctgg acttcttcaa aaccagcatc cagatcgacc tggagaagta taaagagcag 1500 accgagtttg ggatcacctc agataaattg ctgctggctt ggcgggagat ggagcaggct 1560 gtggagcagt gtgggcggga gaatgacgtg aagcatctag tagagcggat gatggcactg 1620 cagactgaca ttgtggacct gcagaggagc ccgatgggtc ggaagcaggg gggcaccctg 1680 gatgacctag aggaacaagc gagggagctc taccgaagac tcagggagaa gccaagagac 1740 caaaggacag aaggtgacag ccaggagatg gtacggctgc tgcttcaggc aatccaaagc 1800 tttgagaaga aagttcgggt gatttataca cagctcagta agaccgtggt ttgtaagcag 1860 aaggcactgg agttgctgcc caaggtagaa gaggtagtga gccttatgaa cgaggacgag 1920 aggaccgtgg tccggcttca ggagaagcgg cagaaggaac tctggaacct cctgaagatc 1980 gcctgtagca aagtccgagg tcccgtgagt ggaagcccag acagcatgaa tgtgtctcga 2040 ctcagtcacc ctggtcagct aatgtcccag ccttccagtg cctgtgacag cttacctgaa 2100 tcagacaaga aaagtgaaga actggtggcc gaagcccacg ccctctgctc ccggctagaa 2160 agtgcgctgc aggacactgt gaaggagcaa gacagaagct tcacggtaac cgcctgataa 2220 2220 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 that binds CD206 <400> 45 Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile Asn Ala Ile Gly 1 5 10 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 that binds CD206 <400> 46 Thr Ile Thr Leu Ser Gly Ser Thr Asn 1 5 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 that binds CD206 <400> 47 Asn Thr Tyr Ser Asp Ser Asp Val Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 that binds CD206 <400> 48 Pro Gly Phe Lys Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Ala 1 5 10 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 that binds CD206 <400> 49 Ser Ile Asn Ser Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 that binds CD206 <400> 50 Leu Arg Arg Tyr Tyr Gly Leu Asn Leu Asp Pro Gly Ser Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 that binds CD206 <400> 51 Gly Phe Pro Phe Asn Ile Tyr Pro Met Ser 1 5 10 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 that binds CD206 <400> 52 Tyr Ile Ser His Gly Gly Thr Thr Thr 1 5 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 that binds CD206 <400> 53 Gly Tyr Ala Arg Leu Met Thr Asp Ser Glu Leu Val 1 5 10 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 that binds CD163 <400> 54 Ala Ser Gln Ser Val Ser His Asp Val 1 5 <210> 55 <400> 55 000 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 that binds CD163 <400> 56 Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 that binds CD163 <400> 57 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr 1 5 <210> 58 <400> 58 000 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 that binds CD163 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Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 that bind CD23 <400> 68 Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 that bind CD23 <400> 69 Gly Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 70 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 that bind CD23 <400> 70 Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 71 <400> 71 000 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 that bind CD38 <400> 72 Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn Tyr 1 5 <210> 73 <400> 73 000 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 that bind CD38 <400> 74 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 75 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 that bind CD38 <400> 75 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly 1 5 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 that binds CD38 <400> 76 Ile Ser Trp Asn Gly Gly Lys Thr 1 5 <210> 77 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 that binds CD38 <400> 77 Ala Arg Gly Ser Leu Phe His Asp Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Gly His 1 5 10 15 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 that binds CD38 <400> 78 Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 79 <400> 79 000 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 that binds CD38 <400> 80 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 81 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 that binds CD38 <400> 81 Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Gly 1 5 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 that binds CD38 <400> 82 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys 1 5 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 that binds CD38 <400> 83 Ala Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Phe Ser Gly Pro Ser Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 that binds CD38 <400> 84 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 that binds CD38 <400> 85 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 that binds CD38 <400> 86 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 that binds CD38 <400> 87 Ser Phe Ala Met Ser 1 5 <210> 88 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 that binds CD38 <400> 88 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 that binds CD38 <400> 89 Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 that binds CD64 <400> 90 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 that binds CD64 <400> 91 Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 that binds CD64 <400> 92 Gln Leu Arg Ser Asn Trp Pro Pro Tyr Thr 1 5 10 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 that binds CD64 <400> 93 Gly Tyr Gly Met His 1 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 that binds CD64 <400> 94 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 that binds CD64 <400> 95 Asp Thr Gly Asp Arg Phe Phe Asp Tyr 1 5 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fw primer SerpinB2 <400> 96 actggggcag ttatgacagg 20 <210> 97 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv primer SerpinB2 <400> 97 gatgatcggc cacaaactg 19 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fw primer Retnla <400> 98 ttgttccctt ctcatctgca t 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv primer Retnla <400> 99 ccttgacctt attctccacg a 21 <210> 100 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fw primer Ccl5 <400> 100 cctactccca ctcggtcct 19 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv primer Ccl5 <400> 101 ctgatttctt gggtttgctg t 21 <210> 102 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fw primer Ccl11 <400> 102 agagctccac agcgcttc 18 <210> 103 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv primer Cdl11 <400> 103 cagcacctgg gaggtgaa 18 <210> 104 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fw primer Codon optimized IRF5 <400> 104 tcttaaagac cacatggtag aacagt 26 <210> 105 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv primer codon optimized IRF5 <400> 105 agctgctgtt gggattgc 18 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fw primer endogenous IRF5 <400> 106 gctgtgccct taacaaaagc 20 <210> 107 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RV primer endogenous IRF5 <400> 107 ggctgaggtg gcatgtct 18 <210> 108 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fw primer GAPD <400> 108 agccacatcg ctcagacac 19 <210> 109 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rv primer GAPD <400> 109 gcccaatacg accaaatcc 19 <210> 110 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Met Asn Thr Glu Met Tyr Gln Thr Pro Met Glu Val Ala Val Tyr Gln 1 5 10 15 Leu His Asn Phe Ser Ile Ser Phe Phe Ser Ser Leu Leu Gly Gly Asp 20 25 30 Val Val Ser Val Lys Leu Asp Asn Ser Ala Ser Gly Ala Ser Val Val 35 40 45 Ala Ile Asp Asn Lys Ile Glu Gln Ala Met Asp Leu Val Lys Asn His 50 55 60 Leu Met Tyr Ala Val Arg Glu Glu Val Glu Ile Leu Lys Glu Gln Ile 65 70 75 80 Arg Glu Leu Val Glu Lys Asn Ser Gln Leu Glu Arg Glu Asn Thr Leu 85 90 95 Leu Lys Thr Leu Ala Ser Pro Glu Gln Leu Glu Lys Phe Gln Ser Cys 100 105 110 Leu Ser Pro Glu Glu Pro Ala Pro Glu Ser Pro Gln Val Pro Glu Ala 115 120 125 Pro Gly Gly Ser Ala Val 130 <210> 111 <211> 405 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 atgaacaccg aaatgtatca gacccccatg gaggtggcgg tctaccagct gcacaatttc 60 tccatctcct tcttctcttc tctgcttgga ggggatgtgg tttccgttaa gctggacaac 120 agtgcctccg gagccagcgt ggtggccata gacaacaaga tcgaacaggc catggatctg 180 gtgaagaatc atctgatgta tgctgtgaga gaggaggtgg agatcctgaa ggagcagatc 240 cgagagctgg tggagaagaa ctcccagcta gagcgtgaga acaccctgtt gaagaccctg 300 gcaagcccag agcagctgga gaagttccag tcctgtctga gccctgaaga gccagctccc 360 gaatccccac aagtgcccga ggcccctggt ggttctgcgg tgtaa 405

Claims (131)

  1. 생체내 종양 내 대식세포의 활성화를 변경시키는 방법으로서, 상기 방법은 폴리(β)-아미노 에스테르 코어 및 (i) 하나 이상의 인터페론 조절 인자(IRF) 및 (ii) 상기 코어 내 캡슐화된 IKKβ를 암호화하는 시험관내 전사된 mRNA와 함께 폴리글루탐산 코팅을 포함하는 나노입자를 종양 부위에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 대식세포의 활성화 상태가 불활성화된 상태로부터 활성화된 상태로 변경시키는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 종양은 난소암 종양, 교모세포종 종양, 또는 전이 폐암 종양인, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 IRF5, IRF1, IRF3, IRF7 및 IRF8로부터 선택되는, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 상기 코팅에 연결된 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 표적화 리간드는 디-만노스인, 방법.
  6. 생체내 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 방법으로서, 상기 방법은 하나 이상의 인터페론 조절 인자 (IRF)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자를 투여함으로써 생체내 면역 세포의 활성화 상태를 변경시키는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 면역 세포는 대식세포, 조절 T 세포 (TREG), 골수-유래된 서프레서 세포 (MDSC), 조절 수지상 세포(DCreg), 호중구, T 헬퍼 17 세포 (Th17), 조절 B 세포 (Breg), 및/또는 중간엽 기질 세포 (MSC)인, 방법.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서, 상기 나노입자는 양으로 하전된 코어, 폴리(β)-아미노 에스테르 코어, 별 형태의 중합체, 폴리글루탐산 코팅, 하이알루론산 코팅, 중성으로 하전된 코팅 및/또는 리포좀 나노입자를 포함하는, 방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 나노입자는 <130 nm인, 방법.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 시험관내 전사된 mRNA를 포함하는, 방법.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 코어 내에 캡슐화되는, 방법.
  12. 청구항 6에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF는 기능성 자가억제 도메인이 부재인(lack), 방법.
  13. 청구항 6에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF는 기능성 핵 배출 신호 (NES)가 부재인, 방법.
  14. 청구항 6에 있어서, 상기 투여는 국부적 투여인, 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 국부적 투여는 복막내 또는 두개내인, 방법.
  16. 청구항 6에 있어서, 상기 투여는 전신 투여인, 방법.
  17. 청구항 6에 있어서, 상기 나노입자는 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 표적화 리간드는 코팅에 연결되는, 방법.
  19. 청구항 6에 있어서, 상기 활성화 상태는 불활성화된 상태로부터 활성화된 상태로 변경되는, 방법.
  20. 청구항 6에 있어서, 상기 면역 세포는 대식세포를 포함하는, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 대식세포는 종양 내에 있는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 종양은 난소암 종양, 교모세포종 종양, 또는 전이 폐암 종양인, 방법.
  23. 청구항 6에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, 및/또는 IRF7과 IRF3의 융합체로부터 선택되는, 방법.
  24. 청구항 6에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 서열번호 1 내지 17과 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 방법.
  25. 청구항 6에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 서열번호 1 내지 7로부터 선택되는 IRF5인, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, IRF5는 S156D, S158D 및 T160D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 1 또는 서열번호 3인, 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, IRF5는 T10D, S158D, S309D, S317D, S451D, 및 S462D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 2인, 방법.
  28. 청구항 25에 있어서, IRF5는 S425D, S427D, S430D, 및 S436D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 4인, 방법.
  29. 청구항 6에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 서열번호 8 및 12로부터 선택되는 IRF1인, 방법.
  30. 청구항 6에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 서열번호 11, 16 및 17로부터 선택되는 IRF8인, 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, IRF8은 K310R 돌연변이를 갖는 서열번호 11인, 방법.
  32. 청구항 6에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 N-말단 IRF7 DNA 결합 도메인 (DBD) 및 항상성 활성 도메인 (CAD) 및 C-말단 IRF3 NES (핵 배출 신호) 및 연합 도메인을 포함하는 IRF7/IRF3 융합 단백질을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 IRF7/IRF3 융합 단백질은 IRF3 연합 도메인에서 인산화를 모방하는 돌연변이를 추가로 포함하는, 방법.
  34. 청구항 32에 있어서, 상기 IRF7/IRF3 융합 단백질은 서열번호 15에 제시되는, 방법.
  35. 청구항 6에 있어서, 상기 나노입자는 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, 암호화된 IKKβ는 서열번호 18 내지 22와 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 방법.
  37. 청구항 35에 있어서, 암호화된 IKKβ는 서열번호 18 내지 22로부터 선택되는, 방법.
  38. 청구항 6에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 23 내지 44로부터 선택되는 서열을 포함하는, 방법.
  39. 청구항 17에 있어서, 상기 표적화 리간드는 CD206, CD163 또는 CD23에 결합하는, 방법.
  40. 청구항 17에 있어서, 상기 표적화 리간드는 디-만노스인, 방법.
  41. 청구항 35에 있어서, 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드는 동일한 나노입자 내에 캡슐화되는, 방법.
  42. 청구항 35에 있어서, 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드는 상이한 나노입자 내에 캡슐화되는, 방법.
  43. 청구항 6에 있어서, 상기 활성화 상태는 활성화된 상태로부터 불활성화된 상태로 변경되는, 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 면역 세포는 대식세포를 포함하는, 방법.
  45. 청구항 6에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF는 IRF4인, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 나노입자는 글루코코르티코이드-유도된 류신 지퍼 (GILZ)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
  47. 청구항 17에 있어서, 상기 표적화 리간드는 CD38, G-단백질 커플링된 수용체 18 (Gpr18), 포밀 펩타이드 수용체 2 (Fpr2), CD64, 또는 CD68에 결합하는, 방법.
  48. 대상체 내 종양에서 종양-연합된 대식세포의 활성화 상태를 불활성화된 것으로부터 활성화된 것으로 변경시킴으로써 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하여, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, 상기 종양은 난소암 종양, 교모세포종 종양, 또는 전이 폐암 종양인, 방법.
  50. 청구항 48에 있어서, 상기 변경 단계가, 종양-연합된 대식세포의 활성화 상태를 불활성화된 것으로부터 활성화된 것으로 변경시키는 하나 이상의 전사 인자를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자의 치료학적 유효량의 투여를 따르는, 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 나노입자는 양으로 하전된 코어, 폴리(β)-아미노 에스테르 코어, 별 형태의 중합체, 폴리글루탐산 코팅, 하이알루론산 코팅, 중성으로 하전된 코팅 및/또는 리포좀 나노입자를 포함하는, 방법.
  52. 청구항 50에 있어서, 상기 나노입자는 <130 nm인, 방법.
  53. 청구항 50에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 시험관내 전사된 mRNA를 포함하는, 방법.
  54. 청구항 50에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 코어 내에 캡슐화되는, 방법.
  55. 청구항 50에 있어서, 상기 투여는 국부적 투여인, 방법.
  56. 청구항 55에 있어서, 상기 국부적 투여는 복막내 또는 두개내인, 방법.
  57. 청구항 50에 있어서, 상기 투여는 전신 투여인, 방법.
  58. 청구항 50에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 전사 인자는 하나 이상의 인터페론 조절 인자 (IRF)를 포함하는, 방법.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 암호화된 하나 이상의 IRF는 기능성 자가억제 도메인이 부재인, 방법.
  60. 청구항 58에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 기능성 핵 배출 신호 (NES)가 부재인, 방법.
  61. 청구항 58에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, 및/또는 IRF7과 IRF3의 융합체로부터 선택되는, 방법.
  62. 청구항 58에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 서열번호 1 내지 17과 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 방법.
  63. 청구항 58에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 서열번호 1 내지 7로부터 선택되는 IRF5인, 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, IRF5는 서열번호 1인, 방법.
  65. 청구항 63에 있어서, IRF5는 S156D, S158D 및 T160D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 1 또는 서열번호 3인, 방법.
  66. 청구항 63에 있어서, IRF5는 T10D, S158D, S309D, S317D, S451D, 및 S462D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 2인, 방법.
  67. 청구항 63에 있어서, IRF5는 S425D, S427D, S430D, 및 S436D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 4인, 방법.
  68. 청구항 50에 있어서, 상기 나노입자는 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
  69. 청구항 68에 있어서, 암호화된 IKKβ는 서열번호 18 내지 22와 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 방법.
  70. 청구항 68에 있어서, 암호화된 IKKβ는 서열번호 18 내지 22로부터 선택되는, 방법.
  71. 청구항 50에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 23 내지 44로부터 선택되는 서열을 포함하는, 방법.
  72. 청구항 50에 있어서, 상기 나노입자는 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 표적화 리간드는 코팅에 연결되는, 방법.
  74. 청구항 72에 있어서, 상기 표적화 리간드는 CD206, CD163 또는 CD23에 결합하는, 방법.
  75. 청구항 72에 있어서, 상기 표적화 리간드는 디-만노스인, 방법.
  76. 청구항 68에 있어서, 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드는 동일한 나노입자 내에 캡슐화되는, 방법.
  77. 청구항 68에 있어서, 하나 이상의 IRF 및 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드는 상이한 나노입자 내에 캡슐화되는, 방법.
  78. 청구항 50에 있어서, 암 백신, 키메라 항원 수용체 (CAR) 면역치료요법, 화학치료요법, 방사선치료요법, 호르몬 치료요법, 신호 전달 억제제, 유전자 발현 조절인자, 아폽토시스 유도제, 혈관형성 억제제, 및 독성 분자를 전달하는 모노클로날 항체로부터 선택된 치료요법을, 치료학적 유효량의 나노입자와 조합하여 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  79. 대상체 내 대식세포의 활성화 상태를 활성화된 것으로부터 불활성화된 것으로 변경시킴으로써 자가면역 질환 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환 치료를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법.
  80. 청구항 79에 있어서, 상기 자가면역 질환은 급성 괴사 출혈 뇌병증, 알레르기성 천식, 원형 탈모증, 빈혈, 혓바늘, 관절염 (류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염을 포함), 천식, 자가면역성 갑상선염, 결막염, 크론병, 피부 홍반 낭창, 피부염(아토피성 피부염 및 습진 피부염을 포함), 당뇨병, 진성 당뇨병, 나성결절홍반, 각결막염, 다발성 경화증, 중증근무력증, 건선, 피부경화증, 쇼그렌 증후군에 부차적인 건성 각결막염을 포함하는 쇼그렌 증후군, 스티븐-존슨 증후군, 전신 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 질염 및 베게너 육아종증을 포함하는, 방법.
  81. 청구항 79에 있어서, 상기 변경 단계는 대식세포의 활성화 상태를 활성화된 것으로부터 불활성화된 것으로 변경시키는 하나 이상의 전사 인자를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자의 치료학적 유효량의 투여를 따르는, 방법.
  82. 청구항 81에 있어서, 상기 나노입자는 양으로 하전된 코어, 폴리(β)-아미노 에스테르 코어, 별 형태의 중합체, 폴리글루탐산 코팅, 하이알루론산 코팅, 중성으로 하전된 코팅 및/또는 리포좀 나노입자를 포함하는, 방법.
  83. 청구항 81에 있어서, 상기 나노입자는 <130 nm인, 방법.
  84. 청구항 81에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 시험관내 전사된 mRNA를 포함하는, 방법.
  85. 청구항 81에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 코어 내에 캡슐화되는, 방법.
  86. 청구항 81에 있어서, 상기 투여는 국부적 투여인, 방법.
  87. 청구항 86에 있어서, 상기 국부적 투여는 복막내 또는 두개내인, 방법.
  88. 청구항 81에 있어서, 상기 투여는 전신 투여인, 방법.
  89. 청구항 81에 있어서, 암호화된 하나 이상의 전사 인자는 하나 이상의 인터페론 조절 인자 (IRF)를 포함하는, 방법.
  90. 청구항 89에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 기능성 자가억제 도메인이 부재인, 방법.
  91. 청구항 89에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 기능성 핵 배출 신호 (NES)가 부재인, 방법.
  92. 청구항 89에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 IRF4인, 방법.
  93. 청구항 81에 있어서, 상기 나노입자는 글루코코르티코이드-유도된 류신 지퍼 (GILZ)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
  94. 청구항 81에 있어서, 상기 나노입자는 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
  95. 청구항 94에 있어서, 상기 표적화 리간드는 코팅에 연결되는, 방법.
  96. 청구항 94에 있어서, 상기 표적화 리간드는 CD38, G-단백질 커플링된 수용체 18 (Gpr18), 포밀 펩타이드 수용체 2 (Fpr2), CD64, 또는 CD68에 결합하는, 방법.
  97. 하나 이상의 인터페론 조절 인자 (IRF)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물.
  98. 청구항 97에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  99. 청구항 97에 있어서, 상기 나노입자는 양으로 하전된 코어, 폴리(β)-아미노 에스테르 코어, 별 형태의 중합체, 폴리글루탐산 코팅, 하이알루론산 코팅, 중성으로 하전된 코팅 및/또는 리포좀 나노입자를 포함하는, 조성물.
  100. 청구항 97에 있어서, 상기 나노입자는 <130 nm인, 조성물.
  101. 청구항 97에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 시험관내 전사된 mRNA를 포함하는, 조성물.
  102. 청구항 97에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 코어 내에 캡슐화되는, 조성물.
  103. 청구항 97에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 기능성 자가억제 도메인이 부재인, 조성물.
  104. 청구항 97에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 기능성 핵 배출 신호 (NES)가 부재인, 조성물.
  105. 청구항 97에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 IRF1, IRF3, IRF5, IRF7, IRF8, 및/또는 IRF7과 IRF3의 융합체로부터 선택되는, 조성물.
  106. 청구항 97에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 서열번호 1 내지 17과 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 조성물.
  107. 청구항 97에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 서열번호 1 내지 7로부터 선택되는 IRF5인, 조성물.
  108. 청구항 107에 있어서, IRF5는 서열번호 1인, 조성물.
  109. 청구항 107에 있어서, IRF5는 S156D, S158D 및 T160D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 1 또는 서열번호 3인, 조성물.
  110. 청구항 107에 있어서, IRF5는 T10D, S158D, S309D, S317D, S451D, 및 S462D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 2인, 조성물.
  111. 청구항 107에 있어서, IRF5는 S425D, S427D, S430D, 및 S436D로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 4인, 조성물.
  112. 청구항 97에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 서열번호 8 및 12로부터 선택되는 IRF1인, 조성물.
  113. 청구항 97에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 서열번호 11, 16 및 17로부터 선택되는 IRF8인, 조성물.
  114. 청구항 113에 있어서, IRF8은 K310R 돌연변이를 갖는 서열번호 11인, 조성물.
  115. 청구항 97에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 N-말단 IRF7 DNA 결합 도메인 (DBD) 및 항상성 활성 도메인 (CAD) 및 C-말단 IRF3 NES (핵 배출 신호) 및 연합 도메인을 포함하는 IRF7/IRF3 융합 단백질을 포함하는, 조성물.
  116. 청구항 115에 있어서, 상기 IRF7/IRF3 융합 단백질은 IRF3 연합 도메인에서 인산화를 모방하는 돌연변이를 추가로 포함하는, 조성물.
  117. 청구항 115에 있어서, 상기 IRF7/IRF3 융합 단백질은 서열번호 15에 제시되는, 조성물.
  118. 청구항 97에 있어서, 상기 나노입자는 IKKβ를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조성물.
  119. 청구항 118에 있어서, 암호화된 IKKβ는 서열번호 18 내지 22와 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 조성물.
  120. 청구항 118에 있어서, 암호화된 IKKβ는 서열번호 18 내지 22로부터 선택되는, 조성물.
  121. 청구항 97에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 23 내지 44로부터 선택되는 서열을 포함하는, 조성물.
  122. 청구항 97에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 p53, RB, BRCA1, E1A, bcl-2, MDR-1, p21, p16, bax, bcl-xs, E2F, IGF-I VEGF, 안지오스타틴, 온코스타틴, 엔도스타틴, GM-CSF, IL-12, IL-2, IL-4, IL-7, IFN-γ, TNFα 및/또는 HSV-tk로부터 선택되는 하나 이상의 항암 유전자를 함유한 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조성물.
  123. 청구항 97에 있어서, 암호화된 하나 이상의 IRF는 IRF4인, 조성물.
  124. 청구항 97에 있어서, 상기 나노입자는 글루코코르티코이드-유도된 류신 지퍼 (GILZ)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 조성물.
  125. 청구항 97에 있어서, 상기 나노입자는 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 조성물.
  126. 청구항 125에 있어서, 상기 표적화 리간드는 코팅에 연결되는, 조성물.
  127. 청구항 125에 있어서, 상기 표적화 리간드는 CD206, CD163 또는 CD23에 결합하는, 조성물.
  128. 청구항 125에 있어서, 상기 표적화 리간드는 디-만노스인, 조성물.
  129. 청구항 125에 있어서, 상기 표적화 리간드는 CD38, G-단백질 커플링된 수용체 18 (Gpr18), 포밀 펩타이드 수용체 2 (Fpr2), CD64, 또는 CD68에 결합하는, 조성물.
  130. 청구항 124에 있어서, 하나 이상의 IRF, IKKβ, 및/또는 GILZ를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드는 동일한 나노입자 내에 캡슐화되는, 조성물.
  131. 청구항 124에 있어서, 하나 이상의 IRF, IKKβ, 및/또는 GILZ를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드는 상이한 나노입자 내에 캡슐화되는, 조성물.
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