JP2023527556A

JP2023527556A - 操作されたコロナウイルススパイク（ｓ）タンパク質およびその使用方法

Info

Publication number: JP2023527556A
Application number: JP2022573585A
Authority: JP
Inventors: ジェーソンマクレラン; ジェニファーメイナード; アンドレアシャス; イリアフィンケルスタイン; モハマドジャバンマルディ; ジェフリーショーブ; ハン－チェクオ; チア－ウェイシュ; ジョリーゴールドスミス; クリスティヒョース; チン－リンシエ; パトリックバーン; ニコルジョンソン; ニアンシュアンワン; ダニエルラップ
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2023-06-29
Also published as: CN116802193A; AU2021279079A1; WO2021243122A2; WO2021243122A3; CA3180554A1; EP4157345A2; IL298131A; MX2022015040A; WO2021243122A8; US20230242594A1; BR112022023591A2; KR20230018394A

Abstract

操作されたSARS-CoV-2 Sタンパク質などの操作されたコロナウイルスSタンパク質を、本明細書において提供する。いくつかの局面において、操作されたSタンパク質は、増強された立体構造安定性および/または抗原性を示す。診断薬としての、スクリーニングプラットフォームにおける、および/またはワクチン組成物における、操作されたタンパク質の使用のための方法も提供する。

Description

関連出願の参照
本出願は、2020年5月29日付で出願された米国特許仮出願第63/032,502号の優先権の恩典を主張するものであり、この内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国立衛生研究所から授与された許可番号R01 AI127521の下で政府支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。

配列表の参照
本出願は、EFS-Webを介してASCII形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる配列表を含む。2021年5月19日に作成された該ASCIIコピーは、UTFBP1251WO_ST25.txtという名称であり、サイズが41.8キロバイトである。

1. 分野
本発明は広くは、医学、ウイルス学、免疫学およびタンパク質工学の分野に関する。より詳細には、本開示は、操作されたコロナウイルスSタンパク質、ならびに薬物デザインおよびワクチン製剤におけるその使用に関する。

2. 関連技術の説明
2019年12月に中国で始まったコロナウイルスSARS-CoV-2の感染によって引き起こされる疾患であるCOVID-19の発生は、数百万人の感染者および10万人以上の死者をもたらした。SARS-CoV-2ウイルスは、数年前に発生したSARSの原因ウイルスであるSARS-CoVと同様に、そのスパイクタンパク質を用いて、宿主細胞の受容体アンギオテンシン変換酵素2 (ACE2)に結合する。スパイク糖タンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)と全長ヒトACE2タンパク質との間の相互作用。SARS-CoV-2スパイクタンパク質の配列および構造は公知であるが(例えば、Wrapp et al. 2020を参照のこと)、薬物候補を同定するためにおよびSタンパク質に対する有効な免疫応答を刺激するために使用できる安定化されたSタンパク質の必要性が残っている。

概要
いくつかの態様において、本開示は、(a) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1208; (b) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1160; または(c) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号319～1208と少なくとも90%の同一性を有する操作されたコロナウイルスSタンパク質エクトドメインを含む、操作されたタンパク質であって、
(1) 操作されたジスルフィド結合;
(2) 空洞充填置換;
(3) 静電相互作用もしくは極性相互作用を提供する置換; および/または
(4) プロリン置換
を含む、SEQ ID NO: 1または2の配列に対する少なくとも1つの変異を含む該操作されたタンパク質を提供する。

さらなる局面において、操作タンパク質は、少なくとも1つの操作されたジスルフィド結合および少なくとも1つの空洞充填置換を含む。さらなる局面において、操作タンパク質は、少なくとも1つの操作されたジスルフィド結合および静電相互作用または極性相互作用を提供する少なくとも1つの置換を含む。さらなる局面において、操作タンパク質は、少なくとも1つの操作されたジスルフィド結合および少なくとも1つのプロリン置換を含む。さらなる局面において、操作タンパク質は、少なくとも1つの空洞充填置換および静電相互作用または極性相互作用を提供する少なくとも1つの置換を含む。さらなる局面において、操作タンパク質は、少なくとも1つの空洞充填置換および少なくとも1つのプロリン置換を含む。さらなる局面において、操作タンパク質は、静電相互作用または極性相互作用を提供する少なくとも1つの置換および少なくとも1つのプロリン置換を含む。

いくつかの態様において、本開示は、(a) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1208; (b) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1160; または(c) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号319～1208と少なくとも90%同一な配列を含む操作されたコロナウイルスSタンパク質エクトドメインを含む、操作されたタンパク質であって、SEQ ID NO: 1または2の配列に対して以下の置換: F817P、A892P、A899P、A942P、K986PおよびV987Pを含む該操作されたタンパク質を提供する。さらなる局面において、操作されたコロナウイルスSタンパク質は、(a) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1208; (b) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1160; または(c) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号319～1208と少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%または98%の同一性を有する。

さらなる態様において、本開示は、少なくとも1つの変異が以下:
(i) T724、T752、T778、T961、I1013、H1058、S735、T859、I770、A1015、L727、S1021、Q901、S875、T912、H1088、L1141、V1040、L966、A766、T778、L938、V963、V911、N1108、V705、A893、N703、A672、A694、A1080、I1132、P862、T547、N978、S758、Q762、D1118、S659、S698、R1039、V722、A930、A903、Q913、S974、D979、P728、V951、V736、L858、S884、P807、T791、A879、G799、A924、V826、A899、Q779、F817、L865、T866、A892、A899、A570、T874、S1055、V729、A1022、L894、A713、L828、L822、A1056、Q965、S1003、A972、Q992、I980、A1078、V1133、T1120、I870、T1117、D1139、T1116、Y1138、I896、G885、F1103、P1112、G889、L1034、E819、A972、I980、I1081、N1135、E819、Q1054、Q957、I1130、V1040、V1104、R1000、A944、T724、A944、S730、G769、Q895、K921、L922、A942、G946、S975、A890に対応する位置の置換; および
(ii) 位置番号829～851、675～686、673～684、1161～1208または1142～1208に対応する欠失; および
(iii) アミノ酸位置番号673～686に対しての2つのアミノ酸の置換
を含む、(a) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1208; (b) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1160; または(c) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号319～1208と少なくとも90%の同一性を有する操作されたコロナウイルスSタンパク質エクトドメインを含む、操作されたタンパク質を提供する。
さらなる局面において、操作されたコロナウイルスSタンパク質は、(a) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1208; (b) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1160; または(c) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号319～1208と少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%または98%の同一性を有する。

いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、S735CおよびT859C; I770CおよびA1015C; L727CおよびS1021C; V911CおよびN1108C; A672CおよびA694C; A1080CおよびI1132C; S659CおよびS698C; V722CおよびA930C; A903CおよびQ913C; S974CおよびD979C; P728CおよびV951C; V736CおよびL858C; S884CおよびA893C; P807CおよびS875C; T791CおよびA879C; G799CおよびA924C; A570CおよびV963C; T874CおよびS1055C; V729CおよびA1022C; L822CおよびA1056C; Q965CおよびS1003C; A972CおよびQ992C; I980CおよびQ992C; A1078CおよびV1133C; H1088CおよびT1120C; I870CおよびS1055C; T1117CおよびD1139C; T1116CおよびY1138C; I896CおよびQ901C; G885CおよびQ901C; F1103CおよびP1112C; G889CおよびL1034C; E819CおよびS1055C; A972CおよびI980C; I1081CおよびN1135C; またはE819CおよびQ1054Cに対応する位置のシステイン置換対を含む、操作されたジスルフィド結合を含む。

いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、A903CおよびQ913C; S884CおよびA893C; T791CおよびA879C; Q965CおよびS1003C; またはT1117CおよびD1139Cに対応する位置のシステイン置換対を含む、操作されたジスルフィド結合を含む。他の局面において、操作されたタンパク質は、S884CおよびA893Cに対応する位置のシステイン置換対を含む、操作されたジスルフィド結合を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、少なくとも1つのさらなる操作されたジスルフィド結合をさらに含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、T791CおよびA879C; またはG799CおよびA924Cに対応する位置のシステイン置換対を含む、操作されたジスルフィド結合をさらに含む。

他の局面において、操作されたタンパク質は、A903CおよびQ913Cに対応する位置のシステイン置換対を含む、操作されたジスルフィド結合を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、少なくとも1つのさらなる操作されたジスルフィド結合をさらに含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、Q965CおよびS1003C; S884CおよびA893C; T791CおよびA879C; またはG799CおよびA924Cに対応する位置のシステイン置換対を含む、操作されたジスルフィド結合をさらに含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、A903CおよびQ913C; ならびに/またはQ965CおよびS1003Cに対応する位置のシステイン置換対を含む、操作されたジスルフィド結合をさらに含む。

いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、T724、I1013、H1058、Q901、S875、H1088、L1141、V1040、T778、L938、V963、R1039、V826、A899、Q779、L894、V1040、V1104、R1000、A944、S730、A890、D1118またはS1003に対応する位置に空洞充填置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、T778、L938、V963またはH1088に対応する位置に空洞充填置換を含む。他の局面において、操作されたタンパク質は、T724M、I1013F、H1058W、Q901M、S875F、H1088W、L1141F、V1040F、T778L、L938F、V963L、R1039F、V826L、A899F、Q779M、L894F、H1058F、H1058Y、V1040Y、H1088Y、V1104I、R1000Y、R1000W、A944F、T724I、A944Y、S730L、A890V、D1118FまたはS1003Vから選択される空洞充填置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、T778L、L938F、V963LまたはH1088Yから選択される空洞充填置換を含む。他の局面において、操作されたタンパク質は、L938に対応する位置に空洞充填置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、L938F置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、V963に対応する位置に空洞充填置換をさらに含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、V963L置換を含む。

いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、F817P、L865P、T866P、A892P、A899P、T912P、A893P、Q895P、K921P、L922P、N978P、A942P、G946PまたはS975Pから選択されるプロリン置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、F817P、A892P、A899PまたはA942Pから選択されるプロリン置換を含む。他の局面において、操作されたタンパク質は、プロリン置換F817Pを含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、操作されたジスルフィド結合をさらに含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、S884CおよびA893C; またはT791CおよびA879Cに対応する位置のシステイン置換対を含む、操作されたジスルフィド結合をさらに含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、S884CおよびA893Cに対応する位置のシステイン置換対を含む、操作されたジスルフィド結合をさらに含む。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、V987Pおよび/またはK986Pのさらなるプロリン置換をさらに含む。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、プロリン置換A892Pを含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、A942P; A899P; および/またはF817Pのさらなるプロリン置換をさらに含む。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、A892P; A942P; A899P; および/またはF817Pから選択される少なくとも2つのプロリン置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、A892P; A942P; A899P; および/またはF817Pから選択される少なくとも3つのプロリン置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、A892P; A942P; A899P; およびF817Pのプロリン置換を含む。他の局面において、操作されたタンパク質は、プロリン置換A899PまたはT912Pを含む。他の局面において、操作されたタンパク質は、プロリン置換A892PおよびT912Pを含む。

いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、T752、T912、L966、L828、S730、T961、A766、P862、T859、Q957またはG769に対応する位置に静電相互作用置換を提供する置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、T961、L966、T859またはG769に対応する位置に静電相互作用置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、T961DまたはT961Eの静電相互作用置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、T961Dの置換を含む。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、L966DまたはL966E置換、好ましくはL966E置換をさらに含む。他の局面において、操作されたタンパク質は、T752K、T912R、L966D、L828K、L828R、S730R、T961D、A766E、P862E、T859K、Q957EまたはG769Eから選択される静電相互作用置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、T961D、L966D、T859KまたはG769Kから選択される静電相互作用置換を含む。さらなる局面において、T961D、T859KまたはG769Kから選択される静電相互作用置換。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、T778、A713またはI1130に対応する位置に静電相互作用置換または極性相互作用置換を提供する置換を含む。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、T778Q、A713SまたはI1130Yから選択される静電相互作用置換を含む。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、ある位置の静電相互作用置換を提供する置換およびF817Pを含む。

いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、L984、D985、K986、および/またはV987に対応する位置に置換をさらに含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、L984、D985、K986および/またはV987に対応する位置にグリシンまたはプロリンへの置換を含む。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、K986PおよびV987P置換を含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、A570、T572、F855および/またはN856に対応する位置に置換をさらに含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、A570、T572、F855および/またはN856に対応する位置に空洞充填置換をさらに含む。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、少なくとも1つの操作されたジスルフィド結合および少なくとも1つのプロリン置換の組み合わせを含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、少なくとも1つの空洞充填置換および少なくとも1つのプロリン置換の組み合わせを含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、少なくとも1つのプロリン置換および少なくとも1つの静電相互作用置換の組み合わせを含む。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、少なくとも1つの操作されたジスルフィド結合、少なくとも1つの空洞充填置換、少なくとも1つのプロリン置換および少なくとも1つの静電相互作用置換の組み合わせを含む。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、SEQ ID NO: 1または2の位置番号319～1208と少なくとも95%の同一性を有する。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、SEQ ID NO: 1または2の位置番号16～1208と95%の同一性を有する操作されたコロナウイルスSタンパク質エクトドメインを含む。いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、フリン切断部位を除去する変異を含む操作されたコロナウイルスSタンパク質エクトドメインを含む。さらなる局面において、操作されたタンパク質は、フリン切断部位を除去する変異が位置番号682～685のGSAS置換を含む。

本明細書において記述される置換のいずれも、以下の修飾(SEQ ID NO: 2参照): L5F、S13I、L18F、T19R、T20N、P26S、Q52R、A67V、H69del、V70del、V70I、D80A、T95I、D138Y、Y144del、Y144V、W152C、E154K、R190S、D215G、L242del、A243del、L244del、D253G、W258L、K417N、K417T、L452R、S477N、T478K、E484K、E484Q、E484K、N501Y、A570D、D614G、H655Y、Q677H、P681R、P681H、A701V、T716I、F888L、D950N、S982A、T1027I、D1118HおよびV1176Fのいずれか1つまたは複数を有するコロナウイルスSタンパク質を含むが、これらに限定されない、任意の公知のコロナウイルスSタンパク質変種へ操作されうる。そのような修飾の例示的な組み合わせは、表5に提供されている。

いくつかの局面において、操作されたタンパク質は、三量体化ドメインに融合またはコンジュゲートされている。さらなる局面において、タンパク質は三量体化ドメインに融合されている。いくつかの局面において、三量体化ドメインは、Sタンパク質エクトドメインに対してC末端に配置されている。いくつかの局面において、三量体化ドメインは、T4フィブリチン三量体化ドメインを含む。いくつかの局面において、タンパク質は膜貫通ドメインに融合またはコンジュゲートされている。いくつかの局面において、タンパク質は膜貫通ドメインに融合されている。いくつかの局面において、膜貫通ドメインは、コロナウイルススパイクタンパク質膜貫通ドメインを含む。いくつかの局面において、膜貫通ドメインは、SARS-CoVまたはSARS-CoV-2膜貫通ドメインを含む。

他の態様において、本開示は、本開示の少なくとも1つのサブユニットを含む操作されたコロナウイルス三量体を提供する。いくつかの局面において、三量体は野生型Sタンパク質サブユニットの三量体と比べて融合前の立体構造において安定化されている。いくつかの局面において、三量体はサブユニット間の少なくとも1つの操作されたジスルフィド結合を含む。さらなる局面において、サブユニット間の少なくとも1つの操作されたジスルフィド結合は、V705CおよびA983C; T547CおよびN968C; T961CおよびS758C; ならびに/またはT961CおよびQ762Cから選択される。

他の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体; および(i) 本開示の操作されたタンパク質、または(ii) 本開示の操作された三量体を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの局面において、組成物はアジュバントをさらに含む。

他の態様において、本開示は、本開示の操作されたタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。いくつかの局面において、核酸はDNA発現ベクターを含む。他の局面において、核酸はmRNAを含む。

他の態様において、本開示は、抗体に結合した本開示の操作されたタンパク質を含む組成物を提供する。

他の態様において、本開示は、対象におけるコロナウイルス感染を処置または予防する方法であって、態様の操作されたSタンパク質の治療有効量を対象に投与する段階を含む該方法を提供する。いくつかの局面において、本方法は、対象における体液性および/または細胞性免疫応答を刺激する。いくつかの局面において、本方法は、コロナウイルスに感染した対象の肺における炎症を低減させる。いくつかの局面において、対象はSARS-CoVまたはSARs-Cov-2に感染している。いくつかの局面において、対象は、SARS-CoVまたはSARs-Cov-2に感染するリスクのある、感染していない対象である。いくつかの局面において、対象は、肺炎のリスクが増加している。いくつかの局面において、本方法は、対象にさらなる抗ウイルス療法を投与する段階をさらに含む。

他の態様において、本開示は、試料または対象におけるコロナウイルス、コロナウイルスSタンパク質結合抗体および/またはコロナウイルス感染細胞を検出する方法であって、(a) 対象または対象からの試料を本開示の操作されたSタンパク質と接触させる段階; および(b) 該抗体または細胞の操作されたSタンパク質への結合を検出する段階を含む該方法を提供する。いくつかの局面において、試料は体液または生検である。いくつかの局面において、試料は血液、骨髄、喀痰、涙、唾液、粘液、血清、尿、糞便または鼻腔スワブである。いくつかの局面において、検出は免疫組織化学、フローサイトメトリー、FACS、ELISA、RIAまたはウエスタンブロットを含む。いくつかの局面において、本方法は、段階(a)および(b)を2回実施する段階、ならびに1回目と比較して検出レベルの変化を決定する段階をさらに含む。いくつかの局面において、操作されたSタンパク質は、標識をさらに含み、または表面に固定化される。さらなる局面において、標識はペプチドタグ、酵素、磁性粒子、発色団、蛍光分子、化学発光分子、または色素である。いくつかの局面において、操作されたSタンパク質は、リポソームまたはナノ粒子にコンジュゲートされる。

本明細書において記述される任意の方法または組成物は、本明細書において記述される任意の他の方法または組成物に関して実施されてもよいことが企図されている。本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例は、本発明の特定の態様を示すが、それは説明のためにのみ与えられることが理解されるべきであり、本開示の趣旨および範囲内でさまざまな変更および改良がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。

以下の図面は本明細書の一部分を形成し、本発明のある種の局面をさらに実証するために含められる。本明細書において提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することにより、本発明はより良好に理解されうる。

SARS-CoV-2スパイク安定化のための例示的な置換を示す。融合前立体構造の三量体SARS-CoV-2スパイクエクトドメイン(PDB ID: 6VSB)の側面図。S1ドメインは透明な表面として示されている。各プロトマーのS2ドメインはリボン図として示されている。各挿入図は、4種類のスパイク変種(プロリン、塩橋、ジスルフィド、空洞充填)の1つに対応する。各挿入図の側鎖は次の通りである: 左上(プロリン)、左下(ジスルフィド)、右上(塩橋)、および右下(空洞充填)。図2A～2Gは、単一置換スパイク変種の特徴付けを示す。(図2A) SARS-CoV-2 S-2Pおよび単一置換スパイク変種のSDS-PAGE。分子量標準が左側にkDa単位で示されている。(図2B～2D) タイプごとに分類された、精製スパイク変種のサイズ排除クロマトグラフィー(図2B, ジスルフィド変種; 図2C, 空洞充填および塩橋; 図2D, プロリン)。S-2Pの代表的なデータは、各グラフに黒い破線として示されている。縦点線は、S-2Pの特徴的なピーク保持体積を示す。図2Bの一番上の線は、Q965C、S1003Cである。図2Dの一番上の線はA942Pであり、図2Dの一番上の線から2番目はF817Pである。(図2E) 4つの変種の代表的な陰性染色電子顕微鏡写真。(図2F) スパイク変種の熱安定性の示差走査型蛍光分析(DSF)分析。縦点線は、S-2Pの最初の見かけの融解温度を示す。約47℃に谷がある線はA942Pである。約67℃に谷がある線はA892Pである。(図2G) 定量的生物層干渉法によって決定された、培地中の個々の変種の濃度。変種はタイプごとに分類されている。点線は、比較のために対照として用いられたS-2Pの計算濃度を示す。図2-1の説明を参照のこと。図3A～3Dは、多置換スパイク変種の特徴付けを示す。(図3A) SARS-CoV-2 コンボ変種のSDS-PAGE。分子量標準が左側にkDa単位で示されている。(図3B) S-2P、A892Pおよび4つのコンボ変種のSECトレース。縦点線は、S-2Pのピーク保持体積を示す。(図3C) コンボ変種の熱安定性のDSF分析。左の縦点線はS-2Pの最初の見かけの融解温度を示し、右の縦点線はコンボ47 (HexaPro)の最初の見かけの融解温度を示す。(図3D）精製したコンボ47の陰性染色電子顕微鏡写真。図4A～4Hは、HexaProがS-2Pと比較して増強された発現および安定性を呈することを示す。(図4A) FreeStyle 293細胞の2 L培養物からの精製後のHexaProのSECトレース。(図4B) FreeStyle 293細胞から精製されたHexaProの陰性染色電子顕微鏡写真。(図4C) ExpiCHO細胞の2 L培養物からの精製後のHexaProのSECトレース。(図4B) ExpiCHO細胞の2 L培養物から精製されたHexaProの陰性染色電子顕微鏡写真。(図4Eおよび4F) 表面プラズモン共鳴によって評価されたACE2へのS-2P (図4E)およびHexaPro(図4F)の結合。結合データは黒線として示されており、1:1結合モデルへの最良の適合は赤線として示されている。(図4Gおよび4H) 陰性染色電子顕微鏡法によるタンパク質安定性の評価。(図4G)および(図4H)の顕微鏡写真の上列はS-2Pに対応し、下列はHexaProに対応する。図4-1の説明を参照のこと。図5A～5Cは、HexaProの高解像度クライオEM構造を示す。(図5A) 三量体HexaProのEM密度マップ。(図5B) HexaPro(緑色リボン)とS-2P (白色リボン, PDB ID: 6VSB)とのアライメント。1つのRBDアップ立体構造をとる単独のプロトマーを示す。(図5C) HexaProに特有の4つのプロリン置換の拡大図。EM密度マップは透明な表面として示され、個々の原子は棒として示されている。図5Aの説明を参照のこと。図5Aの説明を参照のこと。 SECピークが左シフトした変種の陰性染色EM画像を示す。十分に折り畳まれた粒子の陰性染色EM画像を示す。図8A～8Bは、ジスルフィドおよび空洞充填の組み合わせ変種(コンボ23)の特徴付けを示す。(図8A) S-2P、コンボ23、ならびに親変種S884C/A893C (ジスルフィド結合)およびL938F (空洞充填)のSECトレース。一番上の線がコンボ23である。(図8B) S-2P、コンボ23、およびその親変種のDSF融解温度分析。左の縦破線はS-2PのTmを表し、右の縦破線はS884C/A893CのTmを表す。クライオEMデータ処理ワークフローを示す。クライオEM構造の検証を示す。cryoSPARC v2.15で生成されたFSC曲線および表示分布プロットが、2 RBDアップ(左)および1 RBDアップ(右)再構成の両方について示されている。各再構成のクライオEM密度が、局所解像度にしたがって示され、密度の中央スライスが右側に示されている。

例示的な態様の説明
本明細書において提供されるのは、操作されたコロナウイルススパイクタンパク質である。いくつかの局面において、態様のタンパク質は、膜融合前に存在する立体構造で安定化される。そのような操作されたタンパク質は、例えば、抗コロナウイルスSタンパク質特異的免疫応答を刺激するために用いることができる。さらなる局面において、操作されたSタンパク質は、試料中のSタンパク質結合抗体を検出するために用いることができる。したがって、本明細書において提供される操作されたタンパク質は、コロナウイルスに対するワクチン接種のためのより効果的な方法を可能にするだけでなく、例えば生体試料の、抗コロナウイルス抗体を検出するための新しいアッセイ方法を可能にする。

I. 定義
以上の概要および以下の詳細な説明の両方は例示的および説明的なものに過ぎず、特許請求の範囲の発明を限定するものではないことが理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は、そうでないことが具体的に記載されていない限り、複数形を包含する。本出願において、「または」の使用は、そうでないことが記載されていない限り、「および/または」を意味する。さらには、「含む(including)」の他に、「含む(includes)」および「含まれる(included)」などの他の形態の用語の使用は、限定的なものではない。また、「構成要素」または「成分」などの用語は、そうでないことが具体的に記載されていない限り、1つのユニットを含む構成要素および成分ならびに1つより多くのサブユニットを含む構成要素および成分の両方を包含する。また、「部分(portion)」という用語の使用は、部分(moiety)の一部または部分(moiety)全体を含むことができる。

本明細書において、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、そうではないことを文脈が明記していない限り、複数への言及を含む。本明細書において用いられる場合、「1つの(a)」または「1つの(an)」は、1つまたは複数を意味しうる。特許請求の範囲において用いられる場合、「含む(comprising)」という単語と併せて用いられる場合、「1つの(a)」または「1つの(an)」という単語は、1つまたは2つ以上を意味しうる。

量、時間的期間などの測定可能な値をいうときに本明細書において用いられる「約」という用語は、特定された値から±10%までのバリエーションを包含することを、意図している。別のことが示されていない限り、本明細書および特許請求の範囲において用いられる成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表す全ての数は、全ての場合に「約」という用語により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されていない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載されている数値的パラメータは、開示される主題により得ようとする所望の特性に応じて変化しうるおおよそのものである。少なくとも、そして特許請求の範囲への均等論の適用を制限しようとするものではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数に照らしておよび通常の丸めの技術を適用することにより解されるべきである。発明の広範な範囲を記載する数値範囲およびパラメータはおおよそのものであるが、特定の例に記載されている数値は可能な限り精密に報告されている。しかしながら、任意の数値は、それらの各々の試験測定に見られる標準偏差の結果として必然的にもたらされるいくらかの誤差を本質的に含有する。

本明細書において用いられる場合、指定された成分に関して「本質的に含まない」は、指定された成分のいずれも意図的に組成物に配合されていないことおよび/または夾雑物としてもしくは微量においてのみ存在することを意味するために本明細書において用いられる。組成物の任意の意図されない夾雑の結果としてもたらされる指定された成分の総量は、したがって、0.05%より十分に低い、好ましくは0.01%未満である。指定された成分のいかなる量も標準的な分析方法を用いて検出できない組成物が最も好ましい。

「抗体」という用語は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン、または標的抗原への特異的結合についてインタクトな抗体と競合できるその断片をいい、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二重特異性抗体を含む。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。インタクトな抗体は、一般に、少なくとも2つの全長重鎖および2つの全長軽鎖を含むが、いくつかの例では、重鎖のみを含むことができるラクダ科動物において天然に存在する抗体など、より少ない鎖を含むことができる。抗体は、単一の供給源のみに由来してもよいし、または「キメラ」であってもよい、すなわち、以下にさらに記述されているように、抗体の異なる部分が2つの異なる抗体に由来してもよい。抗原結合タンパク質、抗体、または結合断片は、ハイブリドーマにおいて、組換えDNA技法により、またはインタクトな抗体の酵素もしくは化学分解により製造することができる。別のことが示されていない限り、「抗体」という用語は、2つの全長重鎖および2つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変種、断片、およびムテインを含み、これらの例は以下に記述されている。さらには、明示的に除外されていない限り、抗体は、それぞれ、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体(本明細書において「抗体模倣物」といわれることがある)、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物(本明細書において「抗体コンジュゲート」といわれることがある)、およびこれらの断片を含む。いくつかの態様において、当該用語はまた、ペプチボディを包含する。

天然の抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。それぞれのそのような四量体は、典型的には、2つの同一のポリペプチド鎖の対から構成され、各対は1つの全長「軽」鎖(ある種の態様において、約25 kDa)および1つの全長「重」鎖(ある種の態様において、約50～70 kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、典型的には、約100～110個またはそれより多くのアミノ酸からなる可変領域を含み、これは典型的に抗原認識に関与する。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクタ機能に関与できる定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、典型的には、κおよびλ軽鎖として分類される。重鎖は、典型的には、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれ、IgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEとして抗体のアイソタイプを画定する。IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含むがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。IgMは、IgM1およびIgM2を含むがこれらに限定されないサブクラスを有する。IgAは同様に、IgA1およびIgA2を含むがこれらに限定されないサブクラスにさらに分割される。全長軽鎖および重鎖内で、可変領域と定常領域は、典型的には約12個またはそれより多くのアミノ酸からなる「J」領域により連結され、重鎖は、約10個のさらなるアミノ酸からなる「D」領域も含む。例えば、Fundamental Immunology, Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.(1989))を参照されたい(参照によりその全体が全ての目的のために組み入れられる)。各軽鎖/重鎖可変領域対は、典型的には、抗原結合部位を形成する。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、典型的には、重鎖におけるアミノ末端のおおよそ120～130アミノ酸および軽鎖におけるアミノ末端の約100～110アミノ酸を含む、抗体の軽鎖および/または重鎖の一部分をいう。ある種の態様において、異なる抗体の可変領域は、同じ種の抗体の間でさえもアミノ酸配列が大幅に異なる。抗体の可変領域は、典型的には、特定の抗体のその標的についての特異性を決定する。

可変領域は、典型的には、比較的保存されたフレームワーク領域(FR)が、相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる3つの超可変領域により連結された、同じ一般構造を呈する。各対の2つの鎖のCDRは、典型的には、フレームワーク領域により位置合わせされ、特定のエピトープへの結合を可能とすることができる。軽鎖および重鎖可変領域の両方は、N末端からC末端に向かって、典型的には、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4のドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割当ては、典型的には、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、Chothia＆Lesk, J. Mol. Biol, 196:901-917 (1987)またはChothia et al, Nature, 342:878-883 (1989)の定義にしたがって為される。

ある種の態様において、抗体重鎖は、抗体軽鎖の非存在下で抗原に結合する。ある種の態様において、抗体軽鎖は、抗体重鎖の非存在下で抗原に結合する。ある種の態様において、抗体の結合領域は、抗体軽鎖の非存在下で抗原に結合する。ある種の態様において、抗体の結合領域は、抗体重鎖の非存在下で抗原に結合する。ある種の態様において、個々の可変領域は、他の可変領域の非存在下で抗原に特異的に結合する。

ある種の態様において、CDRの確定的記述および抗体の結合部位を構成する残基の同定は、抗体の構造の解明および/または抗体-リガンド複合体の構造の解明により達成される。ある種の態様において、それは、当業者に公知の種々の技法のいずれか、例えばX線結晶構造解析法により達成することができる。ある種の態様において、さまざまな解析方法を用いてCDR領域を同定するかまたは概ね決定することができる。そのような方法の例としては、Kabatの定義、Chothiaの定義、AbMの定義、およびcontactの定義が挙げられるがこれらに限定されることはない。

Kabatの定義は、抗体における残基を付番するための標準であり、典型的にはCDR領域を同定するために使用される。例えば、Johnson＆Wu, Nucleic Acids Res., 28:214-8 (2000)を参照されたい。Chothiaの定義はKabatの定義と類似するが、Chothiaの定義は、ある種の構造的ループ領域の位置を考慮に入れる。例えば、Chothia et al, J. Mol. Biol, 196:901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342:877-83 (1989)を参照されたい。AbMの定義は、抗体構造をモデル化するOxford Molecular Groupにより製造された統合された一連のコンピュータプログラムを使用する。例えば、Martin et al, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989); 「AbM(商標), A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies,」Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.を参照されたい。AbMの定義は、Samudrala et al,「Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach,」in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl, 3:194-198 (1999)に記載されているように、ナレッジデータベースとアブイニシオ法との組み合わせを使用して一次配列から抗体の三次構造をモデル化する。contactの定義は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく。例えば、MacCallum et al, J. Mol. Biol, 5:732-45 (1996)を参照されたい。

慣習により、重鎖におけるCDR領域は典型的にはH1、H2、およびH3といわれ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に順次付番される。軽鎖におけるCDR領域は典型的にはL1、L2、およびL3といわれ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に順次付番される。

「軽鎖」という用語は、全長軽鎖、および結合特異性を付与するのに充分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメインVLと、定常領域ドメインCLとを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖は、κ鎖およびλ鎖を含む。

「重鎖」という用語は、全長重鎖、および結合特異性を付与するのに充分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメインVHと、3つの定常領域ドメインCH1、CH2、およびCH3とを含む。VHドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、CHドメインはカルボキシル末端にあり、CH3がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、IgG (IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4サブタイプを含む)、IgA (IgA1およびIgA2サブタイプを含む)、IgM、およびIgEを含むいずれのアイソタイプであってもよい。

二重特異性抗体または二機能性抗体は、典型的には、2つの異なる重鎖/軽鎖対および2つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の連結が挙げられるがこれらに限定されないさまざまな方法により製造されることができる。例えば、Songsivilai et al, Clin. Exp. Immunol, 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol, 148:1547-1553 (1992)を参照されたい。

「抗原」という用語は、適応免疫応答を誘導できる物質をいう。具体的には、抗原は、適応免疫応答の受容体の標的として働く物質である。典型的には、抗原は、それ自体では身体中の免疫応答を誘導できない抗原特異的受容体に結合する分子である。抗原は、通常、タンパク質および多糖であり、頻度はより低いが脂質のこともある。本明細書において用いられる場合、抗原としては、免疫原およびハプテンも挙げられる。

「Fc」領域は、抗体のCH1およびCH2ドメインを含む2つの重鎖断片を含む。2つの重鎖断片は、2つまたはそれ以上のジスルフィド結合およびCH3ドメインの疎水性相互作用により一緒に保持される。

「Fv領域」は、重鎖および軽鎖の両方の可変領域を含むが、定常領域を欠いている。

特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」または「特異的な」抗体は、あらゆる他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、その特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する抗体である。例えば、本発明のコロナウイルスSタンパク質特異的抗体はコロナウイルスSタンパク質に特異的である。いくつかの態様において、コロナウイルスSタンパク質に結合する抗体は、≦100 nM、≦10 nM、≦1 nM、≦0.1 nM、≦0.01 nM、または≦0.001 nM (例えば10^-8 M以下、例えば10^-8 M～10^-13 M、例えば10^-9 M～10^-13 M)の解離定数(Kd)を有する。

同じエピトープについて競合する抗原結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合断片)の文脈において使用される場合の「競合する」という用語は、試験されている抗原結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合断片)が共通の抗原(例えば、コロナウイルスSタンパク質またはその断片)への参照抗原結合タンパク質(例えば、リガンドまたは参照抗体)の特異的結合を防止または阻害する(例えば、低減させる)アッセイにより決定される抗原結合タンパク質間の競合を意味する。ある抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合するかどうかを決定するために多種類の競合結合アッセイを使用することができ、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ(RIA)、固相直接または間接酵素免疫測定法(EIA)、サンドイッチ競合アッセイ(例えば、Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253を参照); 固相直接ビオチン-アビジンEIA (例えば、Kirkland et al., 1986, J. Immunol.137:3614-3619を参照)固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(例えば、Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pressを参照); 1～125個の標識を使用する固相直接標識RIA (例えば、Morel et al, 1988, Molec. Immunol.25:7-15を参照); 固相直接ビオチン-アビジンEIA (例えば、Cheung, et al, 1990, Virology 176:546-552を参照); および直接標識RIA (Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol.32:77-82)がある。典型的には、そのようなアッセイは、これらの非標識試験抗原結合タンパク質と標識参照抗原結合タンパク質のいずれかを有する、固体表面または細胞に結合した精製抗原の使用を伴う。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイにより同定される抗原結合タンパク質(競合抗原結合タンパク質)としては、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質および立体障害が起こるように参照抗原結合タンパク質が結合するエピトープの充分に近位にある隣接するエピトープに結合する抗原結合タンパク質が挙げられる。競合結合を決定する方法に関する追加の詳細は、本明細書において実施例にて提供される。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、それは共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合を少なくとも40～45%、45～50%、50～55%、55～60%、60～65%、65～70%、70～75%、または75%もしくはそれ以上阻害する(例えば、低減させる)。いくつかの例では、結合は、少なくとも80～85%、85～90%、90～95%、95～97%、または97%もしくは以上阻害される。

本明細書において用いられる「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の原子またはアミノ酸の特定の群をいう。エピトープは、直鎖状エピトープまたは立体配座エピトープのいずれであってもよい。直鎖状エピトープは、抗原のアミノ酸の連続的な配列により形成され、それらの一次構造に基づいて抗体と相互作用する。他方、立体配座エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続部分から構成され、抗原の3D構造に基づいて抗体と相互作用する。一般に、エピトープは約5または6アミノ酸の長さである。2つの抗体は、抗原について競合結合を呈する場合、抗原内の同じエピトープに結合しうる。

「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換され、または形質転換されることができ、それにより関心対象の遺伝子を発現する、細胞を意味する。当該用語は、関心対象の遺伝子が存在する限り、形態または遺伝的構成がオリジナルの親細胞と同一であるか否かによらず、親細胞の子孫を含む。

「同一性」という用語は、配列をアライメントして比較することにより決定される、2つもしくはそれ以上のポリペプチド分子または2つもしくはそれ以上の核酸分子の配列間の関係性をいう。「同一性パーセント」は、比較されている分子におけるアミノ酸間またはヌクレオチド間の同一の残基のパーセントを意味し、比較されている分子のうちの最小のもののサイズに基づいて算出される。これらの算出のために、アライメント中のギャップ(それがある場合)は、好ましくは、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)により対処される。アライメントされた核酸またはポリペプチドの同一性を算出するために使用できる方法としては、Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; およびCarillo et al., 1988,SIAM J. Applied Math. 48:1073に記述されている方法が挙げられる。

同一性パーセントの算出において、比較される配列は、典型的には、配列間の最大のマッチを与えるようにアライメントされる。同一性パーセントを決定するために使用できるコンピュータプログラムの一例は、GAPを含むGCGプログラムパッケージである(Devereux et al, 1984, Nucl. Acid Res.12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)。コンピュータアルゴリズムGAPは、配列同一性パーセントを決定すべき2つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアライメントするために使用される。配列は、それらの各々のアミノ酸またはヌクレオチドの最適なマッチのためにアライメントされる(アルゴリズムにより決定される、「マッチしたスパン」)。ギャップ開始ペナルティ(平均対角の3倍として算出され、「平均対角」は使用されている比較マトリックスの対角の平均であり、「対角」は、特定の比較マトリックスにより各完璧なアミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは数である)およびギャップ伸張ペナルティ(通常、ギャップ開始ペナルティの1/10倍)の他に、比較マトリックス、例えばPAM 250またはBLOSUM 62がアルゴリズムと組み合わせて使用される。ある種の態様において、標準比較マトリックス(PAM 250比較マトリックスについてDayhoff et al, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352; BLOSUM 62比較マトリックスについてHenikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919を参照)もアルゴリズムにより使用される。

GAPプログラムを使用するポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントの決定に用いることができるパラメータの例は、Needleman et al, 1970, J. Mol. Biol.48:443-453に見出すことができる。

2つのアミノ酸配列をアライメントするためのある種のアライメントスキームは、2つの配列の短い領域のみのマッチングをもたらすことがあり、この小さいアライメントされた領域は、2つの全長配列間に有意な関係性がない場合であっても非常に高い配列同一性を有することがある。したがって、選択されたアライメント方法(GAPプログラム)は、標的ポリペプチドの少なくとも50または他の数の連続するアミノ酸にわたるアライメントをもたらすよう、そのように所望される場合に調整することができる。

「連結」という用語は、本明細書において用いられる場合、分子内相互作用、例えば、共有結合、金属結合、および/もしくはイオン結合、または分子間相互作用、例えば、水素結合もしくは非共有結合を介した会合をいう。

「機能的に連結されている」という用語は、そのように記述された成分がそれらの通常の機能を行うように構成された構成要素の並びをいう。したがって、ポリペプチドに機能的に連結された所与のシグナルペプチドは、細胞からのポリペプチドの分泌を指示する。プロモーターの場合、コーディング配列に機能的に連結されたプロモーターは、コーディング配列の発現を指示する。プロモーターまたは他の制御要素は、それらがその発現を指示するように機能する限り、コーディング配列と連続する必要はない。例えば、プロモーター配列とコーディング配列との間に介在性の、翻訳されないが転写される配列が存在してもよく、プロモーター配列はそれでもなお、コーディング配列に「機能的に連結され」ていると考えることができる。

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみをいうことが明示的に指し示されているか、または選択肢が互いに排他的である場合を除いて、「および/または」を意味するために使用され、但し、本開示は、選択肢のみおよび「および/または」をいう定義を支持する。本明細書において用いられる場合、「別の」は、少なくとも第2のもの、またはさらなるものを意味しうる。

「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、一本鎖および二本鎖の両方のヌクレオチド重合体を含む。ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオシドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態であってもよい。前記修飾としては、塩基修飾、例えばブロモウリジンおよびイノシン誘導体、リボース修飾、例えば2', 3'-ジデオキシリボース、およびヌクレオチド間連結修飾、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデートおよびホスホロアミデートが挙げられる。

「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、天然タンパク質、すなわち、天然に存在する非組換え細胞により産生されるタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を意味し、またはそれは遺伝子操作されたもしくは組換え細胞により産生され、かつ天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の1つもしくは複数のアミノ酸の欠失、付加、および/もしくは置換を有する分子を含む。該用語はまた、1つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸および重合体の化学的な類似体である、アミノ酸重合体を含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、具体的には、コロナウイルスSタンパク質結合タンパク質、抗体、または抗原結合タンパク質の1つもしくは複数のアミノ酸の欠失、付加、および/もしくは置換を有する配列を包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、全長天然タンパク質と比較してアミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、および/または内部の欠失を有するポリペプチドをいう。そのような断片はまた、天然タンパク質と比較して改変されたアミノ酸を含有することができる。ある種の態様において、断片は約5～500アミノ酸の長さである。例えば、断片は、少なくとも5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400、または450アミノ酸の長さであってもよい。有用なポリペプチド断片としては、結合ドメインなどの、抗体の免疫学的に機能的な断片が挙げられる。コロナウイルスSタンパク質結合抗体の場合、有用な断片としては、CDR領域、重鎖および/または軽鎖の可変ドメイン、2つのCDRを含む抗体鎖またはその可変領域のみの部分などが挙げられるがこれらに限定されることはない。

本発明において有用な薬学的に許容される担体は従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition(1975)には、本明細書において開示される融合タンパク質の薬学的送達のために適当な組成物および製剤が記述されている。一般に、担体の性質は、用いられる特定の投与方式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理学的に許容される液体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロースまたはグリセロールなどをビヒクルとして含む注射液を含む。固体組成物(例えば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル形態)について、従来の非毒性固体担体は、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、微量の非毒性助剤物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびpH緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。

本明細書において用いられる場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類動物)をいう。ヒトには、出生前および出生後の形態が含まれる。多くの態様において、対象は人間である。対象は患者であってもよく、患者は、疾患の診断または処置のために医療提供者に現れたヒトをいう。「対象」という用語は、「個体」または「患者」と交換可能に本明細書において用いられる。対象は、疾患または障害に罹患しているまたは感受性でありうるが、疾患または障害の症状を示していてもよいし、示していなくてもよい。

「治療有効量」または「有効投与量」という用語は、本明細書において用いられる場合、疾患または病態を処置するために有効な、薬物の投与量または濃度をいう。例えば、ウイルス感染症を処置するための本明細書において開示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用に関するものである。

本明細書において用いられる病態を「処置すること」またはその「処置」には、病態を予防もしくは軽減すること、病態の発症もしくはその発症速度を遅くすること、病態を発症するリスクを低減させること、病態に関連する症状の発症を予防するもしくは遅延させること、病態に関連する症状を低減するもしくは終了させること、病態の完全もしくは部分的な退縮をもたらすこと、病態を治癒すること、またはこれらのいくつかの組み合わせが含まれる。

本明細書において用いられる場合、「ベクター」は、宿主細胞中に導入され、それにより形質転換された宿主細胞を生じさせる核酸分子をいう。ベクターは、宿主細胞中でその複製を可能とする核酸配列、例えば複製起点を含んでもよい。ベクターはまた、当技術分野において公知の1つまたは複数の治療遺伝子および/または選択マーカー遺伝子および他の遺伝因子を含んでもよい。ベクターは、細胞に形質導入し、細胞を形質転換させまたは細胞に感染し、それにより細胞にとって天然のもの以外の核酸および/またはタンパク質を細胞に発現させることができる。ベクターは、細胞内に核酸が入ることの達成を補助する材料、例えば、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティングなどを含んでもよい。

II. コロナウイルススパイクタンパク質
SARS-CoV-2のスパイクタンパク質は、宿主細胞へのウイルス侵入に必須な役割を果たすため、中和抗体による主要な標的である。スパイクタンパク質は、N末端S1サブユニットおよびC末端S2サブユニットから構成され、受容体結合および膜融合を担っている。S1サブユニットはさらにN末端ドメイン、受容体結合ドメイン(RBD)、サブドメイン1 (SD1)およびサブドメイン2 (SD2)に分けられ、S2サブユニットはさらに融合ペプチド(FP)、ヘプタッドリピート1 (HR1)およびヘプタッドリピート2 (HR2)に分けられる。スパイクはそのRBDを通じて細胞受容体に結合し、スパイクの立体配座変化を誘発する。活性化されたスパイクは、プロテアーゼ(SARS-CoVおよびSARS-CoV-2ではTMPRSS2などの)によりS1/S2部位で切断され、S1サブユニットが放出されてS2サブユニット上のFPが露出される。HR1およびHR2は、融合後の立体配座にリフォールディングし、膜融合を促進する35。S1の機能性および免疫原性の高さから、現在までにコロナウイルスに対して特徴付けられたほとんどの中和抗体はS1サブユニットを標的としている。S2立体配座は膜融合中に非常に動的であるため、スパイクタンパク質抗原を調製すること、およびスパイクに対する有効な免疫応答を起こすこと(例えば、中和抗体を産生すること)が困難になることが大きな課題である。スパイクタンパク質安定化戦略は、スパイクタンパク質コード配列の変異により本明細書において実証されている。本明細書において分析および提供される変異は、以下の表1～3に詳述されている。変異体タンパク質を実施例において詳述されるように発現させ、産生されたタンパク質および三量体複合体の量を決定した。

（表１）スパイクタンパク質置換および変異

（表２）さらなる変異

（表３）さらなるスパイクタンパク質変異

（表４(パート１)）オリゴ

（表４(パート２)）オリゴ

（表５）SARS-CoV-2変種分類および定義

III. 薬学的製剤
本開示は、操作されたコロナウイルスＳタンパク質、操作されたコロナウイルスSタンパク質をコードする核酸分子、ならびに操作されたコロナウイルスSタンパク質を含むおよび/またはゲノム物質中に操作されたコロナウイルスSタンパク質をコードするウイルスベクターを含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、ワクチン製剤の一部など、免疫応答を刺激するために用いることができる。

操作されたコロナウイルスSタンパク質をコードする核酸分子が薬学的組成物において用いられる場合、核酸分子は、ともに共有結合的に連結されたデオキシリボヌクレオチドおよび/もしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体を含むか、またはそれらからなりうる。本明細書において記述される核酸分子は一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、少なくとも1つの異なる連結、例えば、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはO-メチルホスホロアミデート連結、ならびにペプチド核酸主鎖および連結を有しうる核酸類似体が含まれる。天然に存在するポリヌクレオチドおよび類似体の混合物を作製することができ、代替的に、異なるポリヌクレオチド類似体の混合物、ならびに天然に存在するポリヌクレオチドおよび類似体の混合物を作製してもよい。核酸分子は、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、重合体の組み立ての前または後に付与されうる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されうる。ポリヌクレオチドは、標識化成分とのコンジュゲーションによってなど、重合後にさらに修飾されうる。この用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を含む。他に指定または要求されない限り、ポリヌクレオチドという用語は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが知られているまたは予測されている2つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。核酸分子は、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびポリヌクレオチドがRNAである場合のチミンに対するウラシル(U)の4つのヌクレオチド塩基の特定の配列で構成される。したがって、「核酸配列」という用語は、核酸分子のアルファベット表記である。特に指示のない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列だけでなく、その保存的に改変された変種(例えば、縮重コドン置換)および相補的配列も暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された(または全ての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成されうる。

いくつかの態様において、本開示の核酸は、修飾された糖部分を含む1つもしくは複数の修飾されたヌクレオシドを含む。1つもしくは複数の糖修飾されたヌクレオシドを含むそのような化合物は、天然の糖部分を含むヌクレオシドのみを含むオリゴヌクレオチドと比べて、標的核酸との増大したヌクレアーゼ安定性もしくは増加した結合親和性といった、望ましい特性を有しうる。いくつかの態様において、修飾された糖部分は、置換された糖部分である。いくつかの態様において、修飾された糖部分は糖代用物である。そのような糖代用物は、置換された糖部分の置換に対応する1つもしくは複数の置換を含みうる。

いくつかの態様において、修飾された糖部分は、2'位および/もしくは5'位の置換基を含むがこれらに限定されない、1つもしくは複数の非架橋糖置換基を含む置換された糖部分である。2'位に適した糖置換基の例としては、2'-F、2'-OCH3 (「OMe」もしくは「O-メチル」)、および2'-O(CH2)2OCH3 (「MOE」)が挙げられるが、これらに限定されることはない。ある種の態様において、2'位の糖置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、O-アリル、O--C1～C10アルキル、O--C1～C10置換アルキル; OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)、およびO--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn)から選択され、各RmおよびRnは、独立して、Hまたは置換もしくは非置換C1～C10アルキルである。5'位の糖置換基の例としては、5'-メチル(RもしくはS); 5'-ビニル、および5'-メトキシが挙げられるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、置換された糖は、2つ以上の非架橋糖置換基、例えば、T-F-5'-メチル糖部分を含む(例えば、さらなる5',2'-ビス置換糖部分およびヌクレオシドの場合、PCT国際出願WO 2008/101157を参照のこと)。

2'-置換糖部分を含むヌクレオシドは2'-置換ヌクレオシドといわれる。いくつかの態様において、2'-置換ヌクレオシドは、ハロ、アリル、アミノ、アジド、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O、S、もしくはN(Rm)-アルキル; O、S、もしくはN(Rm)-アルケニル; O、SもしくはN(Rm)-アルキニル; O-アルキレニル-O-アルキル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリール、O-アラルキル、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)もしくはO--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn)から選択される2'-置換基を含み、各RmおよびRnは、独立して、H、アミノ保護基または置換もしくは非置換C1～C10アルキルである。これらの2'-置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ(NO2)、チオール、チオアルコキシ(S-アルキル)、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルから独立して選択される1つもしくは複数の置換基でさらに置換することができる。

いくつかの態様において、2'-置換ヌクレオシドは、F、NH2、N3、OCF3、O--CH3、O(CH2)3NH2、CH2-CH=CH2、O--CH2-CH=CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O--(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2、およびN-置換アセトアミド(O--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn)から選択される2'-置換基を含み、各RmおよびRnは、独立して、H、アミノ保護基または置換もしくは非置換C1～C10アルキルである。

いくつかの態様において、2'-置換ヌクレオシドは、F、OCF3, O--CH3, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(CH3)2, --O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2、およびO--CH2--C(=O)--N(H)CH3から選択される2'-置換基を含む糖部分を含む。

いくつかの態様において、2'-置換ヌクレオシドは、F、O--CH3、およびOCH2CH2OCH3から選択される2'-置換基を含む糖部分を含む。

いくつかの態様において、本開示のヌクレオシドは、1つもしくは複数の未修飾核酸塩基を含む。ある種の態様において、本開示のヌクレオシドは、1つもしくは複数の修飾核酸塩基を含む。

いくつかの態様において、修飾された核酸塩基は、本明細書において定義されるユニバーサル塩基、疎水性塩基、無差別(promiscuous)塩基、サイズ拡張塩基、およびフッ素化塩基、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびにN-2、N-6およびO-6置換プリン; 5-プロピニルシトシン; 5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルCH3)ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アザ(azo)ウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルならびに他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニン、本明細書において定義されるユニバーサル塩基、疎水性塩基、無差別塩基、サイズ拡張塩基、およびフッ素化塩基から選択される。さらに修飾された核酸塩基には、フェノキサジンシチジン([5,4-b][1,4]ベンゾオキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)などの三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン(例えば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-13][1,4]ベンゾオキサジン-2(3H)-オン)、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド[3',2':4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)などのG-クランプが含まれる。修飾された核酸塩基はまた、プリンもしくはピリミジン塩基が他の複素環で置換されたもの、例えば7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジンおよび2-ピリドンを含みうる。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J. I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859に開示されているもの; Englisch et al., 1991により開示されているもの; およびSanghvi, Y. S., 1993により開示されているものが含まれる。

上記の修飾された核酸塩基および他の修飾された核酸塩基のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許には、非限定的に、米国特許第3,687,808号; 同第4,845,205号; 同第5,130,302号; 同第5,134,066号; 同第5,175,273号; 同第5,367,066号; 同第5,432,272号; 同第5,457,187号; 同第5,459,255号; 同第5,484,908号; 同第5,502,177号; 同第5,525,711号; 同第5,552,540号; 同第5,587,469号; 同第5,594,121号; 同第5,596,091号; 同第5,614,617号; 同第5,645,985号; 同第5,681,941号; 同第5,750,692号; 同第5,763,588号; 同第5,830,653号および同第6,005,096号が含まれ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に3'末端ヌクレオチド上の糖の3'位、および5'末端ヌクレオチドの5'位で、さらなる修飾を行うこともできる。例えば、本開示のリガンド結合オリゴヌクレオチドの1つのさらなる修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布もしくは細胞取り込みを増強する1つもしくは複数のさらなる非リガンド部分もしくはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に連結することを伴う。そのような部分には、コレステロール部分(Letsinger et al., 1989)などの脂質部分、コール酸(Manoharan et al., 1994)、チオエーテル、例えば、ヘキシル-5-トリチルチオール(Manoharan et al., 1992; Manoharan et al., 1993)、チオコレステロール(Oberhauser et al., 1992)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., 1991; Kabanov et al., 1990; Svinarchuk et al., 1993)、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharan et al., 1995; Shea et al., 1990)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., 1995)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., 1995)、パルミチル部分(Mishra et al., 1995)、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分(Crooke et al., 1996)が含まれるが、これらに限定されることはない。いくつかの局面において、操作されたコロナウイルスSタンパク質をコードする核酸分子は、例えば、修飾されたmRNAなどの、修飾されたRNAである。修飾された(m)RNAは、mRNAに増加した安定性および低い免疫原性を付与し、それによって治療上重要なタンパク質の発現を促進するある種の化学修飾を企図している。例えば、N1-メチル-プソイドウリジン(N1mΨ)は、翻訳能力の点でいくつかの他のヌクレオシド修飾およびそれらの組み合わせを凌駕している。いくつかの態様において、本明細書において用いられる(m)RNA分子は、1-メチル-3'-プソイドウリジリル塩基などのプソイドウラシルでウラシルが置換されうる。いくつかの態様において、ウラシルの一部が置換されているが、他の態様において、ウラシルの全てが置換されている。(m)RNAは、5'キャップ、5'UTR要素、任意でコドン最適化された読み取り枠、3'UTR要素、ならびにポリ(A)配列および/またはポリアデニル化シグナルを含みうる。

核酸分子は、天然であろうと修飾されていようと、裸の核酸分子として、または脂質ナノ粒子などの送達ビヒクル中で送達されうる。脂質ナノ粒子は、約5:1～約1:100の脂質ナノ粒子に対する重量比で存在する1つまたは複数の核酸を含みうる。いくつかの態様において、核酸の脂質ナノ粒子に対する重量比は、約5:1、2.5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、もしくは1:100、またはその中で導出可能な任意の値である。

いくつかの態様において、本明細書において用いられる脂質ナノ粒子は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の脂質を含みうる。これらの脂質は、トリグリセリド、リン脂質、ステロイドもしくはステロール、ペグ化脂質、またはアルキルアミンなどのイオン化可能な基およびC6もしくはそれ以上のアルキル基などの1つもしくは複数の疎水性基を有する基を含みうる。

本開示のいくつかの局面において、脂質ナノ粒子は1つまたは複数のステロイドまたはステロイド誘導体と混合される。いくつかの態様において、ステロイドまたはステロイド誘導体は、任意のステロイドまたはステロイド誘導体を含む。本明細書において用いられる場合、いくつかの態様において、「ステロイド」という用語は、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、オキソ基、アシル基、または2つもしくはそれ以上の炭素原子間の二重結合を含む1つまたは複数の置換をさらに含みうる四環17炭素環構造を有する化合物のクラスである。

本開示のいくつかの局面において、脂質ナノ粒子は1つまたは複数のPEG化脂質(またはPEG脂質)と混合される。いくつかの態様において、本開示は、PEG基が結合した任意の脂質を用いることを含む。いくつかの態様において、PEG脂質は、グリセロール基に結合したPEG鎖をも含むジグリセリドである。他の態様において、PEG脂質は、PEG鎖でリンカー基に結合した1つもしくは複数のC6～C24長鎖アルキルもしくはアルケニル基またはC6～C24脂肪酸基を含む化合物である。PEG脂質のいくつかの非限定的な例としては、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、PEGセラミドコンジュゲート化PEG修飾ジアルキルアミンおよびPEG修飾1,2-ジアシルオキシプロパン-3-アミン、PEG修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールが挙げられる。いくつかの態様においては、PEG修飾ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミンまたはPEG修飾ジミリストイル-sn-グリセロール。いくつかの態様において、PEG修飾は、脂質のPEG成分の分子量によって測定される。いくつかの態様において、PEG修飾は、約100～約15,000の分子量を有する。いくつかの態様において、分子量は、約200～約500、約400～約5,000、約500～約3,000、または約1,200～約3,000である。PEG修飾の分子量は、約100、200、400、500、600、800、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,250、2,500、2,750、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、12,500～約15,000である。本開示において使用されうる脂質のいくつかの非限定的な例は、米国特許第5,820,873号、WO 2010/141069、または米国特許第8,450,298号によって教示されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。

本開示のいくつかの局面において、脂質ナノ粒子は1種類または複数種のリン脂質と混合される。いくつかの態様において、リン酸基も含む任意の脂質。いくつかの態様において、リン脂質は、1つまたは2つの長鎖C6～C24アルキル基またはアルケニル基、グリセロールまたはスフィンゴシン、1つまたは2つのリン酸基と任意で有機低分子を含有する構造である。いくつかの態様において、有機低分子は、アミノ酸、糖、またはアミノ置換されたアルコキシ基、例えば、コリンまたはエタノールアミンである。いくつかの態様において、リン脂質はホスファチジルコリンである。いくつかの態様において、リン脂質はジステアロイルホスファチジルコリンまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの態様において、他の両性イオン脂質が用いられ、ここで両性イオン脂質は、正電荷と負電荷の両方を有する脂質および脂質様分子を定義している。

本開示のいくつかの局面において、親油性成分およびカチオン性成分を含有する化合物を含有する脂質ナノ粒子であって、カチオン性成分がイオン化可能である脂質ナノ粒子が提供される。いくつかの態様において、カチオン性イオン化可能脂質は、生理学的pHでプロトン化されるが、8、9、10、11または12を超えるpHでは脱プロトン化されうる、および電荷を有しない、1つまたは複数の基を含有する。イオン化可能なカチオン基は、生理学的pHでカチオン基を形成することができる1つまたは複数のプロトン化可能なアミンを含有する場合がある。カチオン性イオン化可能脂質化合物はまた、1種類または複数種の脂質成分、例えば、C6～C24アルキルまたはアルケニル炭素基がある2つ以上の脂肪酸もさらに含んでもよい。これらの脂質基はエステル結合を介して取り付けられてもよく、硫黄原子へのマイケル(Michael)付加によりさらに付加されてもよい。いくつかの態様において、これらの化合物はデンドリマー、デンドロン、重合体、またはその組み合わせでもよい。

本開示のいくつかの局面において、親油性成分およびカチオン性成分を含有する化合物を含有する組成物であって、カチオン性成分がイオン化可能である組成物が提供される。いくつかの態様において、イオン化可能なカチオン性脂質は、電荷(pKa)を獲得することができる窒素原子を有する脂質および脂質様分子をいう。これらの脂質は、文献ではカチオン性脂質として知られている場合がある。アミノ基を有するこれらの分子は、典型的には、2～6本の疎水性鎖、多くの場合C6～C24アルキルまたはアルケニル基などのアルキルまたはアルケニルを有するが、少なくとも1つまたは6つ超(more that 6)の尾部を有しうる。

いくつかの態様において、薬学的組成物中にカプセル化された核酸分子を有する脂質ナノ粒子の量は、約0.1% w/w～約50% w/w、約0.25% w/w～約25% w/w、約0.5% w/w～約20% w/w、約1% w/w～約15% w/w、約2% w/w～約10% w/w、約2% w/w～約5% w/w、または約6% w/w～約10% w/wである。いくつかの態様において、薬学的組成物中にカプセル化された核酸分子を有する脂質ナノ粒子の量は、約0.1% w/w、0.25% w/w、0.5% w/w、1% w/w、2.5% w/w、5% w/w、7.5% w/w、10% w/w、15% w/w、20% w/w、25% w/w、30% w/w、35% w/w、40% w/w、45% w/w、50% w/w、55% w/w、60% w/w、65% w/w、70% w/w、75% w/w、80% w/w、85% w/w、90% w/w～約95% w/w、またはその中で導出可能な任意の範囲である。

いくつかの局面において、本開示は、薬学的組成物中に配合された1つまたは複数の糖を含む。いくつかの態様において、本明細書において用いられる糖はサッカライドである。これらのサッカライドは、乾燥プロセス中の不安定化から薬学的組成物を保護する凍結防止剤(lyoprotectant)として作用するように用いられうる。これらの水溶性賦形剤は、スクロース、トレハロースもしくはラクトースなどの二糖類、フルクトース、グルコース、ラフィノースを含むガラクトースなどの三糖類、スターチもしくはセルロースなどの多糖類、またはキシリトール、ソルビトールもしくはマンニトールなどの糖アルコールなどの炭水化物またはサッカライドを含む。いくつかの態様において、これらの賦形剤は室温で固体である。糖アルコールのいくつかの非限定的な例としては、エリスリトール、スレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトール、イノシトール、ボレミトール、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マルトトリトール、マルトテトライトール、またはポリグリシトールが挙げられる。

いくつかの態様において、薬学的組成物中の糖の量は、約25% w/w～約98% w/w、40% w/w～約95% w/w、50% w/w～約90% w/w、50% w/w～約70% w/w、または約80% w/w～約90% w/wである。いくつかの態様において、薬学的組成物中の糖の量は、約 10% w/w、15% w/w、20% w/w、25% w/w、30% w/w、35% w/w、40% w/w、45% w/w、50% w/w、52.5% w/w、55% w/w、57.5% w/w、60% w/w、62.5% w/w、65% w/w、67.5% w/w、70% w/w、75% w/w、80% w/w、82.5% w/w、85% w/w、87.5% w/w、90% w/w～約95% w/w、またはその中で導出可能な任意の範囲である。

いくつかの態様において、薬学的に許容される重合体は、共重合体である。薬学的に許容される重合体は、別個の異なるタイプの重合体サブユニットの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのサブユニットをさらに含みうる。これらの重合体サブユニットは、ポリオキシプロピレン、ポリオキシエチレン、または類似のサブユニットを含みうる。特に、薬学的に許容される重合体は、少なくとも1つの疎水性サブユニットおよび少なくとも1つの親水性サブユニットを含みうる。特に、共重合体は、疎水性ユニットの両側に親水性サブユニットを有しうる。共重合体は、ポリオキシエチレンである親水性サブユニットおよびポリオキシプロピレンである疎水性サブユニットを有しうる。

いくつかの態様において、発現カセットは、その後の精製および細胞/対象への送達のために、またはウイルスに基づく送達アプローチにおいて直接使用するために、操作されたコロナウイルスSタンパク質を発現させるように利用される。本明細書において提供されるのは、操作されたコロナウイルスSタンパク質をコードする1つまたは複数の核酸を含む発現ベクターである。

発現には、適切なシグナルがベクターに提供される必要があり、操作されたコロナウイルスSタンパク質の発現を細胞内で駆動する、ウイルス源および哺乳類源の両方からのエンハンサー/プロモーターなどのさまざまな調節要素が含まれる。本出願全体を通して、「発現カセット」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写および翻訳されることができる、すなわち、プロモーターの制御下にある、遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意のタイプの遺伝子コンストラクトを含むことを意味する。「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列をいう。「転写制御下」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するため、核酸に対して正確な位置および方向にあることを意味する。「発現ベクター」は、複製可能な遺伝子コンストラクトに含まれており、したがって、複製起点、転写終結シグナル、ポリA領域、選択可能マーカー、および多目的クローニング部位の1つまたは複数を含む、発現カセットを含むことを意味する。

プロモーターという用語は、RNAポリメラーゼIIのための開始部位の周辺に密集した転写制御モジュールの一群をいうために本明細書において用いられる。どのようにプロモーターが組織化されるかについての考えの大部分は、HSVチミジンキナーゼ(tk)およびSV40初期転写単位のためのものを含む、いくつかのウイルスプロモーターの分析に由来する。より最近の研究によって拡大されたこれらの研究は、プロモーターが個別の機能的モジュールから構成されることを示しており、機能的モジュールは各々、およそ7～20 bpのDNAからなり、転写活性化タンパク質または抑制タンパク質のための1つまたは複数の認識部位を含有している。

各プロモーター内の少なくとも1つのモジュールは、RNA合成のための開始部位を位置付けるように機能する。これの最もよく知られている例は、TATAボックスであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモーターおよびSV40後期遺伝子のためのプロモーターなどのTATAボックスを欠くいくつかのプロモーターにおいては、開始部位自体を覆う個別の要素が、開始の場所を固定するのを助ける。

追加のプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の30～110 bp上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが開始部位の下流にも機能的要素を含有していることが最近になって示された。要素が反転したり互いに相対的に移動したりするときにもプロモーター機能が保存されるように、プロモーター要素間の間隔は可動性であることが多い。tkプロモーターでは、プロモーター要素間の間隔を50 bp間隔にまで増加させることができ、そこからは活性が減退し始める。プロモーターに依存して、個々の要素は、協同的にまたは独立に機能して転写を活性化できるようである。

ある種の態様において、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼなどのウイルスプロモーターを、関心対象のコード配列の高レベルの発現を得るために用いることができる。発現のレベルが所与の目的に十分であるという条件で、関心対象のコード配列の発現を達成するための、当技術分野において周知である他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージのプロモーターの使用も同じく想定される。周知の特性を有するプロモーターを用いることによって、トランスフェクションまたは形質転換の後の関心対象のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを最適化することができる。さらに、特定の生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターを選択することにより、遺伝子産物の誘導性発現が可能となる。

エンハンサーは、同じDNA分子上の遠位に位置するプロモーターからの転写を増加させる遺伝要素である。エンハンサーは、プロモーターと同様に組織化される。すなわち、それらは、各々が1つまたは複数の転写タンパク質と結合する多くの個々の要素から構成される。エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な差異は、機能性である。エンハンサー領域は全体として離れて転写を刺激することができなければならない; このことは、プロモーター領域またはその成分要素には当てはまる必要がない。その一方で、プロモーターは、特定の部位において特定の方向でRNA合成の開始を指令する1つまたは複数の要素を有しなければならないが、エンハンサーはこれらの特異性を欠いている。プロモーターおよびエンハンサーは、重複しかつ連続していることが多く、極めて類似したモジュール機構を有することが多いと見られる。

以下は、発現コンストラクトにおいて関心対象の遺伝子をコードする核酸と組み合わせて使用できるプロモーター/エンハンサーおよび誘導性プロモーター/エンハンサーの一覧である。加えて、プロモーター/エンハンサーの任意の組み合わせ(真核生物プロモーターデータベース(Eukaryotic Promoter Data Base EPDB)による)を遺伝子の発現を駆動するために使用することができる。真核細胞は、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝子発現コンストラクトとして適切な細菌ポリメラーゼが提供されれば、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。

プロモーターおよび/またはエンハンサーは、例えば、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、T細胞受容体、HLA DQ aおよび/またはDQ β、β-インターフェロン、インターロイキン-2、インターロイキン-2受容体、MHCクラスII 5、MHCクラスII HLA-Dra、β-アクチン、筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)、プレアルブミン(トランスサイレチン)、エラスターゼI、メタロチオネイン(MTII)、コラゲナーゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、t-グロビン、β-グロビン、c-fos、c-HA-ras、インスリン、神経細胞接着分子(NCAM)、α1-アンチトリパイン(antitrypain)、H2B (TH2B)ヒストン、マウスおよび/またはI型コラーゲン、グルコース調節タンパク質(GRP94およびGRP78)、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイドA (SAA)、トロポニンI (TN I)、血小板由来成長因子(PDGF)、SV40、ポリオーマ、レトロウイルス、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ならびにテナガザル白血病ウイルスであってよい。

cDNAインサートが用いられる場合、典型的には、遺伝子転写物の適正なポリアデニル化を達成するため、ポリアデニル化シグナルを含めることが望ましい。ヒト成長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルなどの任意のポリアデニル化配列を用いてよい。また、ターミネーターも発現カセットの要素として想定される。これらの要素は、メッセージレベルを増強し、カセットから他の配列へのリードスルーを最小限に抑えるために役立つことができる。

発現ベクターを細胞に導入できる多数の方法が存在する。ある種の態様において、発現コンストラクトは、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する操作されたコンストラクトを含む。受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現することができるある種のウイルスは、哺乳動物細胞に外来遺伝子を移入するための魅力的な候補である。これらは、比較的低い外来DNA配列の収容量を有し、限定された宿主範囲を有する。さらに、許容細胞における発がん潜在性および細胞変性効果は、安全性の問題を提起する。これらは、8 kBまでの外来遺伝物質しか収容できないが、種々の細胞株および実験動物に容易に導入することができる。

インビボ送達のための方法の1つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を伴う。「アデノウイルス発現ベクター」は、(a) コンストラクトのパッケージングを支援すること、および(b) その中にクローニングされている操作されたコロナウイルスSタンパク質を発現することに十分な、アデノウイルス配列を含有するコンストラクトを含むことを意味する。これに関して、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。

発現ベクターは、遺伝子操作された形態のアデノウイルスを含む。36 kBの直鎖状二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスの遺伝子組織化に関する知識は、アデノウイルスDNAの大断片を7 kBまでの外来配列で置換することを可能にする。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスDNAは、潜在的な遺伝毒性なしに、エピソーム様式で複製できるため、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み込みをもたらさない。また、アデノウイルスは、構造的に安定しており、広範な増幅の後にもゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期に関わらず、事実上全ての上皮細胞に感染することができる。現在のところ、アデノウイルス感染は、ヒトにおいて急性呼吸器疾患などの軽度の疾患にのみ関連付けられているようである。

アデノウイルスは、ゲノムのサイズが中程度であり、操作が容易であり、力価が高く、標的細胞範囲が広く、感染性が高いため、遺伝子移入ベクターとして使用するのに特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシス要素である100～200塩基対逆位末端配列(ITR)を含有する。ゲノムの初期(E)領域および後期(L)領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される異なる転写単位を含有する。E1領域(E1AおよびE1B)は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。E2領域(E2AおよびE2B)の発現は、ウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与している。ウイルスキャプシドタンパク質の大半を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター(MLP)によって生じた単一の一次転写物の有意なプロセッシングの後にのみ発現される。MLP (16.8 m.u.に位置する)は、感染の後期に特に効率的であり、このプロモーターから生じたmRNAは全て、5'トリパータイトリーダー(TPL)配列を保有しており、このため翻訳のための好ましいmRNAである。あるシステムにおいて、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから生成される。2種のプロウイルスベクター間の可能性のある組換えのため、このプロセスから野生型アデノウイルスが生成されうる。それゆえ、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を調査することが重要である。

複製欠損型である現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ad5 DNA断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、E1タンパク質を構成的に発現する、293と名付けられたユニークなヘルパー細胞株に依存する。E3領域は、アデノウイルスゲノムにとって不可欠でないため、現在のアデノウイルスベクターは、293細胞の補助により、E1領域、D3領域のいずれかまたは両方に外来DNAを保持する。本来、アデノウイルスは、野生型ゲノムのおよそ105%をパッケージングすることができ、それによって、約2 kb余分のDNAを収容できる。E1領域およびE3領域において置換可能なおよそ5.5 kbのDNAと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大収容量は、7.5 kb、またはベクターの全長の約15%未満である。アデノウイルスのウイルスゲノムの80%超が、ベクター骨格に残存し、ベクター媒介性の細胞傷害の起源となる。また、E1欠失ウイルスの複製欠損は不完全である。

ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉系もしくは上皮系細胞などのヒト細胞に由来してよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容性の他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。そのような細胞は、例えば、Vero細胞または他のサル胎仔間葉系もしくは上皮系細胞を含む。上述の通り、好ましいヘルパー細胞株は、293である。

本開示のアデノウイルスは、複製欠損型であるかまたは少なくとも条件付きで複製欠損型である。アデノウイルスは、42種類の異なる公知の血清型またはサブグループA～Fのいずれかのものであってよい。サブグループCの5型アデノウイルスは、本開示において使用するための条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るために用いられうる1つの例示的な出発材料である。

他のウイルスベクターを本開示において発現コンストラクトとして用いてよい。ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを用いてよい。これらは、さまざまな哺乳動物細胞のためのいくつかの魅力的な特徴を提供する。

特定の態様において、ベクターはAAVベクターである。AAVは、ヒトおよび他のいくつかの霊長類種に感染する小型ウイルスである。AAVが、現在、疾患を引き起こすことは知られていない。このウイルスは、非常に穏やかな免疫応答を引き起こし、その明らかな病原性の欠如をさらに裏付けている。多くの場合、AAVベクターは宿主細胞のゲノムに組み込まれるが、これはある種の用途には重要でありうるが、望ましくない結果をもたらすこともありうる。AAVを用いた遺伝子治療ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染し、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外の状態で存続しうるが、ネイティブウイルスでは、ウイルスによって運ばれる遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みが起こることがある。これらの特徴により、AAVは、遺伝子治療用ウイルスベクターの作製のための、および同質遺伝子ヒト疾患モデルの作製のための非常に魅力的な候補となる。網膜の遺伝子治療にAAVを用いた最近のヒト臨床試験では、有望性が示されている。AAVはデペンドパルボウイルス属(Dependoparvovirus)に属し、そしてこれはパルボウイルス科(Parvoviridae)に属する。このウイルスは、小型(20 nm)の複製欠損の非エンベロープ型ウイルスである。

野生型AAVは、いくつかの特徴により、遺伝子治療研究者からかなりの関心を集めている。これらの中で主なものは、ウイルスの病原性の明らかな欠如である。また、非分裂細胞に感染することもあり、ヒト19番染色体の特定部位(AAVS1と指定されている)で宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれる能力を有する。この特徴により、ランダムな挿入や変異誘発の恐れを呈しかつ時にはがんの発生が続くこともあるレトロウイルスよりも、ある程度は予測可能となる。AAVゲノムは、前述の部位に最も頻繁に組み込まれ、ゲノムへのランダムな組み込みは無視できるほどの頻度で起こる。しかしながら、遺伝子治療ベクターとしてのAAVの開発では、ベクターのDNAからのrepおよびcapの除去により、この組み込み能力を排除している。遺伝子の転写を駆動するプロモーターとともに所望の遺伝子は、宿主細胞DNAポリメラーゼ複合体によって一本鎖ベクターDNAが二本鎖DNAに変換された後に、核内で鎖状体形成を補助する逆位末端配列(ITR)の間に挿入される。AAVに基づく遺伝子治療ベクターは、宿主細胞の核内にエピソーム鎖状体を形成する。非分裂細胞では、これらの鎖状体は宿主細胞の寿命の間インタクトなままである。分裂細胞では、エピソームDNAが宿主細胞DNAと一緒に複製されないため、AAV DNAは細胞分裂によって失われる。AAV DNAの宿主ゲノムへのランダムな組み込みは検出可能であるが、非常に低い頻度で起こる。また、AAVは、中和抗体の作製に限定されるようである非常に低い免疫原性を呈する一方で、それらは明確に定義された細胞毒性応答を誘発しない。この特徴は、静止細胞に感染する能力とともに、ヒト遺伝子治療用ベクターとしてアデノウイルスと比べその優位性を示すものである。

AAVゲノムは、ポジティブセンスまたはネガティブセンスの一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)で構築されており、その長さは約4.7キロベースである。ゲノムは、DNA鎖の両端にある逆位末端配列(ITR)、ならびに2つの読み取り枠(ORF): repおよびcapを含む。前者は、AAVのライフサイクルに必要なRepタンパク質をコードする4つの重複する遺伝子で構成され、後者はキャプシドタンパク質: VP1、VP2およびVP3の重複するヌクレオチド配列を含み、これらは一緒に相互作用して、正二十面体対称性のキャプシドを形成する。

逆位末端配列(ITR)配列は、各145塩基を含む。それらは、AAVゲノムの効率的な増殖に必要であることが示された、その対称性のためにそのように命名された。それらにこの特性を与えるこれらの配列の特徴は、ヘアピンを形成するその能力であり、これは、プライマーゼに依存しない第2のDNA鎖の合成を可能にする、いわゆる自己プライミングに寄与する。また、ITRは、AAV DNAの宿主細胞ゲノム(ヒトでは19番染色体)への組み込みとそこからのレスキュー、および完全に組み立てられたデオキシリボヌクレアーゼ耐性AAV粒子の生成と組み合わせたAAV DNAの効率的なキャプシド形成の両方に必要であることが示された。

遺伝子治療に関しては、ITRは治療用遺伝子の次にシスで必要とされる唯一の配列のようである: 構造(cap)およびパッケージング(rep)タンパク質はトランスで送達されうる。この仮定により、レポーター遺伝子または治療用遺伝子を含む組換えAAV (rAAV)ベクターの効率的産生のために多くの方法が確立された。しかしながら、効果的な複製およびキャプシド形成のためにシスで必要な要素はITRだけではないことも公表された。少数の研究グループにより、rep遺伝子のコード配列内にシス作用性Rep依存要素(CARE)が特定された。CAREはシスに存在する場合、複製およびキャプシド形成を増強することが示された。

いくつかの局面において、本開示は、1つまたは複数の塩を含む薬学的組成物を提供する。塩は、塩化カリウム、塩化ナトリウム、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、または一塩基性リン酸ナトリウムなどの無機カリウム塩またはナトリウム塩でありうる。薬学的組成物は、リン酸緩衝溶液を生成するように1つまたは複数のリン酸塩を含んでもよい。リン酸緩衝溶液は、約6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9もしくは8.0、またはその中で導出可能な任意の範囲のpHに溶液を緩衝するためにリン酸塩の各々を含んでもよい。

いくつかの局面において、本開示は、薬学的組成物中に配合される1つまたは複数の賦形剤を含む。「賦形剤」とは、対象へのAPIの投与もしくは送達を容易にするために用いられる、または対象における作用部位への送達のために薬学的に使用できる薬物製剤へのAPIの加工処理を容易にするために用いられる、比較的不活性な物質である薬学的に許容される担体をいう。さらに、これらの化合物は、患者に対して容易に測定または投与されうる投与量を得るために、希釈剤として用いられてもよい。賦形剤の非限定的な例としては、重合体、安定化剤、界面活性剤、表面改質剤、溶解度向上剤、緩衝液、カプセル化剤、抗酸化剤、保存剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤、および吸収増強剤が挙げられる。

特定の態様において、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトにおいて用いるために連邦もしくは州政府の規制機関により承認され、または米国薬局方もしくは他の一般に認識される薬局方に列記されることを意味する。「担体」という用語は、治療剤がそれと共に投与される希釈剤、賦形剤、またはビヒクルをいう。そのような薬学的担体は、水などの無菌の液体であってもよく、好ましくは、アジュバントを含むことができる。水は、薬学的組成物が筋肉内注射などの、注射により投与される場合の特定の担体である。食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた液体担体、特に注射溶液用の液体担体として用いることができる。他の適当な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。

所望の場合、組成物は、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出製剤などの形態をとることができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。適当な薬学的剤の例は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記述されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように適当な量の担体と共に、好ましくは精製された形態の、予防または治療有効量の抗体またはその断片を含有する。製剤は投与方式に適するべきであり、投与方式は、経口、静脈内、動脈内、頬内、鼻腔内、噴霧、気管支吸入、または機械的換気による送達でありうる。

本明細書において記述される、本開示の操作されたタンパク質または操作されたタンパク質をコードする核酸は、非経口投与のために製剤化することができ、例えば、皮内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内または腹腔内経路を介した注射のために製剤化することができる。製剤は、あるいは、粘膜に直接的に局所経路により、例えば、点鼻、吸入、またはネブライザーにより投与されてもよい。薬学的に許容される塩としては、酸の塩および無機酸、例えば塩酸もしくはリン酸、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などと形成された塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成された塩はまた、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄、および有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来してもよい。

一般に、本開示の組成物の成分は、例えば、気密密封容器、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ中に、例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として別々にまたは単位投与剤形中に一緒に混合されて供給される。組成物が注入により投与される場合、無菌の薬学的等級の水または食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配することができる。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合されうるように注射用の滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。

本開示の組成物は、中性または塩の形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、アニオン、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンと形成された塩、およびカチオン、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンと形成された塩が挙げられる。

投薬は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであることができる。初回免疫スケジュールおよび/または追加免疫スケジュールで複数回用量が用いられうる。複数回用量スケジュールでは、さまざまな用量が同じ経路または異なる経路によって与えられうる。複数回用量は、典型的には、少なくとも1週間間隔(例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など)で投与されるであろう。

本明細書において開示される組成物は、子供と大人の両方を処置するために用いられうる。したがって、ヒト対象は、1歳未満、1～5歳、5～16歳、16～55歳、55～65歳、または少なくとも65歳でありうる。

好ましい投与経路は、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、および眼球内注射を含むが、これらに限定されることはない。特に好ましい投与経路は、筋肉内注射、皮内注射および皮下注射を含む。

IV. 免疫検出法
またさらなる態様において、本開示は、コロナウイルスSタンパク質を結合し、精製し、除去し、定量化しおよびそれ以外に一般に検出するための免疫検出法に関する。そのような方法は伝統的な意味で応用することができるが、別の使用は、ウイルスストックの品質管理およびモニタリングであり、それらにおいては、抗原の量または完全性(すなわち、長期安定性)を評価するために用いることができる。あるいは、適切な/所望の反応性プロファイルについてさまざまな抗体をスクリーニングするために方法を用いてもよい。

少数を挙げると、いくつかの免疫検出法としては、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、イムノラジオメトリックアッセイ、フルオロイムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウエスタンブロットが挙げられる。特に、コロナウイルスSタンパク質の検出および定量のための競合アッセイも提供される。さまざま有用な免疫検出法の段階が、例えば、Doolittle and Ben-Zeev (1999)、Gulbis and Galand (1993)、De Jager et al. (1993)、およびNakamura et al. (1987)などの科学文献に記述されている。一般に、免疫結合法は、コロナウイルスSタンパク質を含有することが疑われる試料を得ること、および、場合により、免疫複合体の形成を可能とするために効果的な条件下で、本開示による第1の抗体と試料を接触させることを含む。

これらの方法は、コロナウイルスSタンパク質または試料からのコロナウイルスSタンパクを検出または精製する方法を含む。抗体は、好ましくは、固体支持体、例えば、カラムマトリックスの形態の固体支持体に連結され、かつ、コロナウイルスSタンパク質を含有することが疑われる試料は、固定化された抗体に適用される。望ましくない成分はカラムから洗浄されて、固定化された抗体に免疫複合体化したコロナウイルスSタンパク質発現細胞を残し、次に該複合体は、カラムから生物または抗原を除去することにより回収される。

免疫結合法はまた、試料中のコロナウイルスSタンパク質または関連成分を検出しかつその量を定量化するためならびに結合処理の間に形成された任意の免疫複合体の検出および定量化のための方法を含む。ここでは、コロナウイルスSタンパク質を含有することが疑われる試料を得、かつ試料をコロナウイルスSタンパク質またはその成分に結合する抗体と接触させた後、特定の条件下で形成された免疫複合体を検出しかつその量を定量化する。抗原検出に関して、分析される生体試料は、コロナウイルスSタンパク質を含有することが疑われる任意の試料、例えば、組織切片もしくは検体、ホモジナイズされた組織抽出物、血液および血清などの体液(例えば、鼻腔スワブ)、または糞便もしくは尿などの分泌物であってもよい。

免疫複合体(一次免疫複合体)の形成を可能とするために効果的な条件下かつそのために充分な期間にわたり選択された生体試料を抗体と接触させることは、一般に、単純に抗体組成物を試料に加え、かつ抗体が免疫複合体を形成する、すなわちコロナウイルスSタンパク質に結合するために充分な長さの期間にわたって混合物をインキュベートすることである。この時間の後、試料-抗体組成物、例えば、組織切片、ELISAプレート、ドットブロットまたはウエスタンブロットは、一般に、あらゆる非特異的に結合した抗体種を除去するために洗浄され、一次免疫複合体内に特異的に結合した抗体のみが検出されることを可能とする。

一般に、免疫複合体形成の検出は当技術分野において周知であり、多数のアプローチの適用を通じて達成されうる。これらの方法は、一般に、標識またはマーカー、例えば、放射性タグ、蛍光タグ、生物学的タグ、および酵素タグのいずれかの検出に基づく。そのような標識の使用に関する特許としては、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号および同第4,366,241号が挙げられる。当然、当技術分野において公知のように、二次結合リガンド、例えば、二次抗体および/またはビオチン/アビジンリガンド結合の構成の使用を通じて追加の利点が見出されうる。

検出において利用される抗体は、検出可能な標識にそれ自体が連結されてもよく、その場合、単純にこの標識を検出することにより、組成物中の一次免疫複合体の量を決定することが可能となる。あるいは、一次免疫複合体内に結合した第1の抗体は、該抗体に結合親和性を有する第2の結合リガンドにより検出されてもよい。これらの場合、第2の結合リガンドは、検出可能な標識に連結されてもよい。第2の結合リガンドは多くの場合、それ自体が抗体であり、その場合それは「二次」抗体と称されることがある。二次免疫複合体の形成を可能とするために効果的な条件下かつそのために充分な期間にわたり、一次免疫複合体を、標識された二次結合リガンド、または抗体と接触させる。次に、二次免疫複合体は、一般に、あらゆる非特異的に結合した標識された二次抗体またはリガンドを除去するために洗浄された後、二次免疫複合体中に残った標識が検出される。

さらなる方法は、2段階アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。上記のように、二次免疫複合体を形成するために、該抗体に結合親和性を有する抗体などの第2の結合リガンドが使用される。洗浄後、これもまた免疫複合体(三次免疫複合体)の形成を可能とするために効果的な条件下かつそのために充分な期間にわたり、第2の抗体と結合親和性を有する第3の結合リガンドまたは抗体と二次免疫複合体を接触させる。第3のリガンドまたは抗体は検出可能な標識に連結され、そのように形成される三次免疫複合体の検出を可能とする。この系は、これが所望される場合、シグナル増幅を提供しうる。

免疫検出の1つの方法では2つの異なる抗体を用いる。標的抗原を検出するために第1のビオチン化抗体が用いられ、次に複合体化したビオチンに結合したビオチンを検出するために第2の抗体が用いられる。その方法では、試験される試料は最初に、第1の段階の抗体を含有する溶液中でインキュベートされる。標的抗原が存在する場合、抗体の一部は抗原に結合してビオチン化抗体/抗原複合体を形成する。次に、ストレプトアビジン(またはアビジン)、ビオチン化DNA、および/または相補的ビオチン化DNAの連続溶液中でのインキュベーションにより抗体/抗原複合体を増幅させ、各段階では抗体/抗原複合体に追加のビオチン部位が付加される。適当なレベルの増幅が達成されるまで増幅段階を繰り返し、それが達成された時点で、ビオチンに対する第2の段階の抗体を含有する溶液中で試料がインキュベートされる。この第2の段階の抗体は、例えば、色原体基質を用いる組織酵素学により抗体/抗原複合体の存在を検出するために使用できる酵素により標識される。適当に増幅されると、巨視的に可視的なコンジュゲートを産生することができる。

免疫検出の別の公知の方法は、イムノPCR (ポリメラーゼ連鎖反応)の方法論を利用する。PCR法は、ビオチン化DNAとのインキュベーションまでCantorの方法に類似するが、複数ラウンドのストレプトアビジンおよびビオチン化DNAのインキュベーションを用いる代わりに、抗体を解放させる低pHまたは高塩の緩衝液でDNA/ビオチン/ストレプトアビジン/抗体複合体が洗浄される。次に、結果として得られる洗浄溶液を用いて、適切な対照と共に適当なプライマーを用いるPCR反応が実行される。少なくとも理論上は、単一の抗原分子を検出するために、PCRの非常に大きい増幅能力および特異性を利用することができる。

A. ELISA
最も単純かつ直接的な意味において、イムノアッセイは結合アッセイである。ある種の好ましいイムノアッセイは、当技術分野において公知のさまざまな種類の酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)およびラジオイムノアッセイ(RIA)である。組織切片を使用する免疫組織化学検出もまた特に有用である。しかしながら、検出はそのような技術に限定されないこと、およびウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、FACS分析などもまた使用されてもよいことが容易に理解されるであろう。

1つの例示的なELISAでは、本開示の抗体は、タンパク質親和性を呈する選択された表面、例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェルに固定化される。次に、コロナウイルスSタンパク質を含有することが疑われる試験組成物がウェルに加えられる。結合および非特異的に結合した免疫複合体を除去するための洗浄後に、結合した抗原を検出することができる。検出は、検出可能な標識に連結された別の抗コロナウイルスSタンパク質抗体を加えることにより達成することができる。この種類のELISAは単純な「サンドイッチELISA」である。検出はまた、第2の抗コロナウイルスSタンパク質抗体を加えた後、第2の抗体に結合親和性を有する、検出可能な標識に連結された第3の抗体を加えることにより達成されてもよい。

別の例示的なELISAでは、コロナウイルスSタンパク質(例えば、潜在的に感染した細胞)を含有することが疑われる試料をウェル表面に固定化させた後、本開示の抗コロナウイルスSタンパク質抗体と接触させる。結合および非特異的に結合した免疫複合体を除去するための洗浄の後に、結合した抗コロナウイルスSタンパク質抗体が検出される。最初の抗コロナウイルスSタンパク質抗体が検出可能な標識に連結されている場合、免疫複合体は直接的に検出されてもよい。ここでもまた、免疫複合体は、第1の抗コロナウイルスSタンパク質抗体に結合親和性を有する第2の抗体(第2の抗体は検出可能な標識に連結されている)を用いて検出されてもよい。

利用される形式にかかわらず、ELISAは、ある種の特徴、例えば、コーティング、インキュベーションおよび結合、非特異的に結合した種を除去するための洗浄、および結合した免疫複合体の検出を共通して有する。これらを以下に記述する。

抗原または抗体のいずれかでのプレートのコーティングでは、一般に、終夜または特定された時間にわたり、プレートのウェルを抗原または抗体の溶液とインキュベートする。次に、プレートのウェルを洗浄して、不完全に吸着した材料を除去する。次に、試験抗血清に関して抗原として中性である非特異的タンパク質でウェルのあらゆる残っている利用可能な表面を「コーティング」する。これらには、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼインまたは粉乳の溶液が含まれる。コーティングにより、固定化表面上の非特異的な吸着部位のブロッキングが可能となり、したがって表面上への抗血清の非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドが低減される。

ELISAにおいて、直接的な手順よりもむしろ、二次または三次検出を使用することが恐らくより慣例的である。したがって、ウェルにタンパク質または抗体を結合させ、非反応性材料でコーティングしてバックグラウンドを低減させ、洗浄して未結合の材料を除去した後、免疫複合体(抗原/抗体)形成を可能とするために効果的な条件下で、試験される生体試料を固定化表面に接触させる。次に、免疫複合体の検出は、標識された二次結合リガンドまたは抗体、および標識された三次抗体または第3の結合リガンドと組み合わせた二次結合リガンドまたは抗体を必要とする。

「免疫複合体(抗原/抗体)形成を可能とするために効果的な条件下」は、条件が、好ましくは、抗原および/または抗体を溶液、例えば、BSA、ウシガンマグロブリン(BGG)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)/Tweenで希釈することを含むことを意味する。これらの加えられる剤はまた、非特異的なバックグラウンドの低減を補助する傾向がある。

「適当な」条件はまた、インキュベーションが、効果的な結合を可能とするために充分な温度または期間行われることを意味する。インキュベーション段階は、典型的には、約1から2時間から4時間程度、好ましくは25℃～27℃程度の温度で行われ、または約4℃程度で終夜行われてもよい。

ELISAにおける全てのインキュベーション段階後、接触させた表面を洗浄して、複合体化していない材料を除去する。好ましい洗浄手順は、PBS/Tween、またはホウ酸緩衝液などの溶液での洗浄を含む。試験試料と元々結合した材料との特異的免疫複合体の形成、およびその後の洗浄後、微量の免疫複合体の存在さえも決定することができる。

検出手段を提供するために、第2または第3の抗体は、検出を可能とするための会合した標識を有する。好ましくは、これは、適切な発色基質とインキュベートすると呈色を生成する酵素である。したがって、例えば、さらなる免疫複合体形成の発生に有利に働く期間および条件下(例えば、PBS-TweenなどのPBS含有溶液中、室温で2時間のインキュベーション)でウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは水素ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体と第1および第2の免疫複合体を接触させまたはインキュベートすることが望まれる。

標識された抗体とのインキュベーション、および未結合の材料を除去するためのその後の洗浄後、例えば、発色基質、例えば、尿素、またはブロモクレゾールパープル、または2,2'-アジノ-ジ-(3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS)、または酵素標識としてペルオキシダーゼの場合はH₂O₂とのインキュベーションにより標識の量が定量化される。次に、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて、発色の程度を測定することにより定量化が達成される。

B. ウエスタンブロット
ウエスタンブロット(あるいはタンパク質イムノブロット)は、組織ホモジネートまたは抽出物の所与の試料中の特定のタンパク質を検出するために用いられる分析技法である。それは、ポリペプチドの長さにより(変性条件)またはタンパク質の3D構造(天然/非変性条件)により天然または変性タンパク質を分離するためにゲル電気泳動を用いる。次に、タンパク質を膜(典型的にニトロセルロースまたはPVDF)に転写し、標的タンパク質に特異的な抗体を用いてプロービング(検出)する。

試料は、全組織からまたは細胞培養物から採ることができる。ほとんどの場合、ブレンダーを用いて(大きい試料体積の場合)、ホモジナイザーを用いて(小さい体積)、または超音波処理により、固体組織を最初に機械的に壊す。上記の機械的方法の1つにより細胞を破砕してもよい。細胞の溶解を促しかつタンパク質を可溶化するために、組み合わせた界面活性剤、塩、および緩衝液を利用してもよい。それ自体の酵素による試料の消化を防止するために、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤が多くの場合に加えられる。組織調製は多くの場合、タンパク質の変性を回避するために低温で行われる。

ゲル電気泳動を用しいて試料のタンパク質を分離する。タンパク質の分離は、等電点(pI)、分子量、電荷、またはこれらの因子の組合せにより為されうる。分離の性質は、試料の処理およびゲルの性質に依存する。これは、タンパク質を決定するために非常に有用な方法である。単一の試料から二次元にタンパク質を広げる二次元(2-D)ゲルを用いることもできる。タンパク質は、第1の次元において等電点(中性の総電荷となるpH)にしたがって、および第2の次元において分子量にしたがって分離される。

タンパク質を抗体検出のためにアクセス可能なものとするために、それらをゲル内からニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオリド(PVDF)で作られた膜上に移動させる。膜をゲルの上に置き、積み重ねた濾紙をその上に置く。積み重ねた全体を緩衝溶液に入れると、緩衝溶液は毛管作用により紙の上方向に移動し、それと共にタンパク質を運ぶ。タンパク質を転写する別の方法はエレクトロブロッティングと呼ばれ、電流を用いてタンパク質をゲルからPVDFまたはニトロセルロース膜中に引き寄せる。タンパク質は、ゲル内での編成を維持しながらゲル内から膜上に移動する。このブロッティング処理の結果として、タンパク質は検出のために薄い表面層上に露出される(下記を参照)。非特異的タンパク質結合特性(すなわち、全てのタンパク質に等しく結合する)のために両方の種類の膜が選択される。タンパク質の結合は、疎水性相互作用の他に、膜とタンパク質との電荷相互作用に基づく。ニトロセルロース膜はPVDFよりも安価であるがはるかにもろく、プロービングの繰返しに良好に耐えることができない。ゲルから膜へのタンパク質の転写の均一性および全体的な有効性は、クマシーブリリアントブルーまたはポンソーS色素で膜を染色することによりチェックすることができる。タンパク質が転写されたら、標識された一次抗体を用いて、または未標識の一次抗体の後に一次抗体のFc領域に結合する標識されたプロテインAまたは二次標識抗体を用いる間接的検出を用いてタンパク質が検出される。

C. 免疫組織化学
本開示の抗体はまた、免疫組織化学(IHC)による研究のために調製された新鮮凍結組織ブロックおよび/またはホルマリン固定、パラフィン包埋組織ブロックのいずれとも組み合わせて使用することができる。これらの粒子検体から組織ブロックを調製する方法は、さまざまな予後因子の先行するIHC研究において用いられて成功しており、当業者に周知である(Brown et al, 1990; Abbondanzo et al, 1990; Allred et al, 1990)。

簡潔に述べれば、凍結切片は、小さいプラスチックカプセル中の50 ngの凍結「粉砕」組織を室温でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で再水和させ、遠心分離によって粒子をペレット化し、それらを粘性の包埋媒体(OCT)中に再懸濁し、カプセルを倒立させかつ/もしくは遠心分離によって再度ペレット化し、-70℃のイソペンタン中でスナップ冷却し、プラスチックカプセルを切断しかつ/もしくは凍結した円筒状の組織を取り出し、クライオスタットミクロトームチャック上に円筒状の組織を固定し、かつ/またはカプセルから25～50個の連続切片を切り出すことによって調製することができる。あるいは、凍結組織試料全体を連続切片の切り出しのために用いてもよい。

永久切片は、50 mgの試料をプラスチック微量遠心チューブ中で再水和させ、ペレット化し、10%のホルマリン中で再懸濁して4時間固定化し、洗浄/ペレット化し、温めた2.5%の寒天中に再懸濁し、ペレット化し、氷冷水で冷却して寒天を固化させ、組織/寒天ブロックをチューブから取り出し、ブロックをパラフィンで浸潤させかつ/もしくは包埋し、かつ/または最大50個の連続永久切片を切り出すことを伴う類似の方法によって調製することができる。ここでもまた、組織試料全体を置換してもよい。

D. 免疫検出キット
またさらなる態様において、本開示は、上記される免疫検出法と共に使用するための免疫検出キットに関する。抗体はコロナウイルスSタンパク質を検出するために使用することができるため、抗体をキット中に含めることができる。したがって、免疫検出キットは、適当な容器手段中に、コロナウイルスSタンパク質に結合する第1の抗体、および任意で免疫検出試薬を含む。

ある種の態様において、抗体は、固体支持体、例えば、カラムマトリックスおよび/またはマイクロタイタープレートのウェルに予め結合させてもよい。キットの免疫検出試薬は、所与の抗体に会合または連結された検出可能な標識などのさまざまな形態のいずれか1つとすることができる。二次結合リガンドに会合または連結された検出可能な標識も企図されている。例示的な二次リガンドは、第1の抗体に結合親和性を有する二次抗体である。

本発明のキットにおいて用いるためのさらなる適当な免疫検出試薬は、第1の抗体に結合親和性を有する第2の抗体と共に、第2の抗体に結合親和性を有する第3の抗体(第3の抗体は検出可能な標識に連結されている)を含む、2成分試薬を含む。上記の通り、多数の例示的な標識が当技術分野において公知であり、全てのそのような標識を本開示と関連して用いることができる。

キットは、検出アッセイのための標準曲線の作成に使用することができるように、標識化されていても未標識でもよい、コロナウイルスSタンパク質の適当に分注された組成物をさらに含んでもよい。キットは、抗体-標識コンジュゲートを、完全にコンジュゲートされた形態か、中間体の形態か、またはキットの使用者によってコンジュゲートされる別々の部分として、含有してもよい。キットの構成要素は、水性媒体中または凍結乾燥形態のいずれかにパッケージ化することができる。

キットの容器手段は、一般に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含み、その中に抗体を入れるか、または好ましくは適当に分注することができる。本開示のキットはまた、典型的には、抗体、抗原、および任意の他の試薬容器を、市販用に厳重に密閉して含有するための手段を含む。そのような容器としては、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器を挙げることができ、所望のバイアルをその中に保持する。

E. フローサイトメトリーおよびFACS
本開示の抗体はまた、フローサイトメトリーまたはFACSにおいて用いられてもよい。フローサイトメトリーは、細胞計数、細胞選別、バイオマーカー検出およびタンパク質操作を含む、多くの検出アッセイにおいて用いられるレーザーまたはインピーダンスベースの技術である。該技術では、細胞を流体のストリームに懸濁し、それらを電子的検出装置に通過させることで、1秒あたり数千までの粒子の物理的および化学的特徴の同時の多パラメータ分析が可能となる。フローサイトメトリーは、診断障害(diagnosis disorders)、殊に血液がんにおいて日常的に用いられるが、基礎研究、臨床プラクティスおよび臨床試験において多くの他の応用を有する。

蛍光活性化細胞選別(FACS)は、特殊化された種類のサイトメトリーである。それは、各細胞の特定の光散乱および蛍光特徴に基づいて、1つの時点に1つの細胞で、生物学的細胞の不均質な混合物を2つ以上の容器に選別する方法を提供する。一般に、該技術は、液体の狭い急速に流れるストリームの中心において連行された細胞懸濁液を伴う。流れは、細胞の直径に比べて細胞間の分離が大きくなるように構成される。振動機構により、細胞のストリームは個々の小滴に分断される。ストリームが小滴に分断される直前に、流れは蛍光測定ステーションを通過し、そこで各細胞の蛍光が測定される。電気的荷電リングが、ストリームが小滴に分断される正にその点に置かれる。電荷が、蛍光強度が測定される直前においてリングベース(ring based)に置かれており、小滴がストリームから壊れる(breaks form)際に反対電荷が小滴上に捕捉される。荷電した小滴は次に、静電偏向システムを通って落下し、該システムは、小滴をそれらの電荷に基づいて容器に分流させる。

フローサイトメトリーまたはFACSにおいて用いられるある種の態様において、本開示の抗体は、フルオロフォアを用いて標識され、次に目的の細胞に結合させられ、それがフローサイトメーターにおいて分析され、またはFACS機械により選別される。

V. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含めたものである。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らにより発見された技法を提示するものであり、したがってその実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることが当業者により理解されるべきである。しかしながら、開示される特定の態様において多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを当業者は本開示に照らして理解するべきである。

実施例1－SARS-CoV-2スパイクタンパク質の操作
A. 方法
融合前安定化nCoVスパイク変種のデザインスキーム
SARS-CoV-2 S-2P変種を、その後の全てのデザインの基本コンストラクトとして用いた²⁰。S-2P基本コンストラクトは哺乳類発現プラスミドpαHの中に、SARS-CoV-2 S (GenBank: MN908947)の残基番号1～1208を含み、残基番号986および987の位置で置換されたプロリン、フリン切断部位(番号残基682～685)で置換された「GSAS」、T4フィブリチンの三量体化フォールドオンモチーフ、HRV3Cプロテアーゼ認識部位、Twin-Strep-タグならびにオクタ-ヒスチジンタグを有する。このプラスミドを鋳型として用いて、SARS-CoV-2 S遺伝子内の選択の位置に所望の変異を導入した。クライオEM構造に基づいて、β炭素原子の間隔が4.6 Å未満の残基の対を、ジスルフィドデザインのために考慮した。FP、CRおよびHR1などの、融合前から融合後の移行中に劇的に移動する領域が特に標的とされた。塩橋変種では、変異残基の荷電基が4.0 Å以内であると予測される必要があった。ループ内の残基については、4.0 Åよりもわずかに長い距離が許容された。既存の内部空洞に隣接する側鎖を有するコアに面した残基を、より大きな空洞充填残基への潜在的な置換について調べた。プロリン置換をFP、CRまたはHR1においてデザインし、可動性ループまたはヘリックスのN末端のいずれかに配置した。全ての望ましい置換では、以下の回避が最大化された: 1. 隣接残基との衝突の作製、2. より大きな疎水性空洞の作製、3. 隣接残基との極性相互作用の喪失、4. 好ましくない二面角、5. 既存のN-グリコシル化部位の喪失または新規のN-グリコシル化部位の作製。組み合わせは、同じタイプのデザイン(すなわちジスルフィド/ジスルフィド)または異なるタイプのデザイン(例えばジスルフィド/プロリン)の対がスパイクの発現および安定性に相加効果をもたらしうるかどうかを試験するために選択された。ジスルフィド結合の形成に関与する隣接システインの可動性を制限しうるプロリンのような、互いに干渉する可能性があると予測される置換は、回避された。

タンパク質発現および精製
S変種をコードするプラスミドを、ポリエチレンイミンを用いてFreeStyle293F細胞(Thermo Fisher)に一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションから4日後に、培養物を採取し、遠心分離によって細胞から培地を分離した。上清を0.22μmのフィルタに通し、次いでStrepTactin樹脂(IBA)に通した。S変種を、2 mM Tris pH 8.0、200 mM NaClおよび0.02% NaN₃から構成される緩衝液中でSuperose 6 10/300カラム(GE Healthcare)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。最初の精製および特徴付けのために、単一置換変種およびコンボS変種を40 mL培養物から精製した。HexaPro変種は2 L培養物から精製した。

示差走査型蛍光分析
96ウェルqPCRプレートに、5X SYPRO Orange Protein Gel Stain (ThermoFisher)および0.25 mg/mLスパイクの終濃度で溶液を調製した。Roche LightCycler 480 IIを使い、4.4°/分の昇温速度を用い、25℃から95℃まで上昇させて連続蛍光測定(λ_ex=465 nm, λ_em=580 nm)を実施した。データを融解曲線の導関数としてプロットした。

陰性染色EM
精製した2019-nCoV S変種を、2 mM Tris pH 8.0、200 mM NaClおよび0.02% NaN₃中0.04 mg/mLの濃度に希釈した。各タンパク質を、Solarus 950血漿浄化器(Gatan)中4:1のO₂/H₂比で30秒間、血漿浄化されたCF-400-CUグリッド(Electron Microscopy Sciences)に沈着させ、メチルアミンタングステン酸(Nanoprobes)を用いて染色した。グリッドを、Ceta 16M検出器(Thermo Fisher Scientific)を備えたTalos F200C TEM顕微鏡で92,000倍(1.63 Å/pixの校正済みピクセルサイズに相当する)の倍率で画像化した。S-2PおよびHexaProを用いた安定性実験は、液体窒素による急速凍結および融解の3ラウンド後に、室温で1～2日間試料を貯蔵後に、または50℃、55℃もしくは60℃で30分間インキュベート後に、上記のように試料を画像化することによって実施された。

タンパク質発現の定量化のための生物層干渉法
FreeStyle293F細胞(Thermo Fisher)を最小培地3 mL中でトランスフェクションし、トランスフェクション4日後に採取した。遠心分離後、上清を、10 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05% Tween 20および1 mg/mLウシ血清アルブミンから構成された緩衝液で5倍希釈した。Octet RED96e (ForteBio)を用いて、抗フォールドオンIgGを抗ヒト捕捉(AHC)センサチップ(ForteBio)に固定化した。センサチップを、個々のスパイク変種を含有するウェルに浸漬した。標準曲線は、10μg/mLから0.16μg/mLの範囲の濃度の精製S-2Pの2倍連続希釈液を測定することによって決定された。データを参照減算し、IgG捕捉後のベースラインに合わせ、Octet Data Analysisソフトウェアv11.1を用いて、各関連曲線の初期勾配の線形適合に基づき定量化した。

表面プラズモン共鳴
Hisタグ付きHexaProを、Biacore X100 (GE Healthcare)と10 mM HEPES pH 8.0、150 mM NaClおよび0.05% Tween 20から構成される泳動用緩衝液とを用いて、NiNTAセンサチップ(GE Healthcare)におよそ800応答単位(RU)のレベルまで固定化した。精製hACE2の連続希釈液を250から15.6 nMの範囲の濃度で注入した。応答曲線は、Biacore X100 Evaluation Software (GE Healthcare)を用いて1:1結合モデルに適合させた。

クライオEM試料調製およびデータ収集
精製HexaProを2 mM Tris pH 8.0、200 mM NaCl、0.02% NaN₃中0.35 mg/mLの濃度に希釈し、血漿浄化したCF-400 1.2/1.3グリッドに適用した後に、Vitrobot Mark IV (ThermoFischer)中で6秒間ブロッティングし、液体エタン中にプランジ凍結した。K3直接電子検出器(Gatan)を備えたFEI Titan Krios (ThermoFischer)を用いて、単一グリッドから顕微鏡写真を収集した。データを、1.08 Å/pixの校正済みピクセルサイズに相当する倍率46,296倍で収集した。データ収集パラメータの完全な説明は、表S5において見出すことができる。

クライオEMデータ処理
動き補正、CTF推定および粒子ピッキングをWarpにおいて実施した³³。その後、粒子を2D分類、アブイニシオ3D再構成、不均質3D精密化および非一様均質精密化のためにcryoSPARC v2.15.0にインポートした³⁴。反復モデル構築および精密化を、Coot、PhenixおよびISOLDEで実施した^35～37。

B. 結果
融合前安定化SARS-CoV-2スパイクの構造に基づくデザイン
オリジナルのS-2P変種よりも良好に発現し、安定している融合前安定化SARS-CoV-2スパイクタンパク質²⁰を作製するために、SARS-CoV-2 S-2PクライオEM構造(PDB: 6VSB)を分析し、クラス I 融合タンパク質の機能と一般的なタンパク質安定性の原則に関する知識に基づいて置換をデザインした。これらの戦略には、融合前から融合後への移行中の立体構造変化を防ぐためのジスルフィド結合、電荷の不均衡を中和するための塩橋、内部空洞を満たすための疎水性残基、および融合前状態でヘリックスをキャップまたはループを安定化するためのプロリンの導入が含まれていた。100例の単一S-2P変種をクローニングし、その相対的発現量を特徴付け、十分に発現するものについては、その単分散性、熱安定性および四次構造を特徴付けた(表6)。S2サブユニットは、融合前から融合後への移行中に大規模な再折り畳みを受けることを考えて、S2の安定化に努力を集中させた。融合前の立体構造を維持しながら発現を増加させる各分類の置換が同定された(図1および2A)。全体として、変種100例中28例がS-2Pよりも良好に発現し、陰性染色EMによって評価した場合に融合前の立体構造を保持していた。

（表６）

^aサイズ排除三量体ピークの曲線下面積を用いて定量化した
^bSDS-PAGEバンド強度を用いて定量化した

単一置換スパイク変種
ジスルフィド結合の導入には2つの置換が必要とされるが、それらは、これらの目的では単一の置換と見なされる。スパイクなどのクラスI融合タンパク質を安定化するための一般的な戦略の1つは、ジスルフィド結合を介して、立体構造変化を受ける領域を、そうでない領域に共有結合的に連結することである。例えば、Q965C/S1003C置換はHR1を中央ヘリックスに連結しようと試みるが、G799C/A924CはHR1を上流ヘリックスに連結することを目的にする。これらの2つの変種は、S-2Pと比較して、それぞれ3倍および2倍、タンパク質の発現を増加させた(図2B)。しかしながら、両変種のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)トレースは、S-2Pと比較して左方向のシフトを示し、タンパク質が予想よりも大きく動いていることを示し、これは部分的に誤って折り畳まれたスパイク粒子を示す陰性染色電子顕微鏡法(nsEM)の結果とよく一致した。対照的に、S884C/A893CおよびT791C/A879C変種は、SECでS-2Pと同様の体積で溶出し、nsEMによって十分に折り畳まれた三量体粒子として現れた(図2E)。これらの変種は、同じαヘリックスを、隣接するプロトマーに対してパックする2つの異なる可動性ループに連結する(図1)。注目すべきは、S884C/A893Cは、S-2Pよりも2倍高い発現を有し、また、熱安定性を増加させた(図2F)。

選択的な空洞充填置換および塩橋の導入により、全体的な折り畳みを乱すことなくタンパク質の安定性が向上するはずである。空洞充填は、RSV FおよびHIV-1 Envの融合前立体構造の安定化に特に役立ってきた^15,22。ここで、多くの空洞充填および塩橋デザインは、S-2Pと比較してタンパク質発現を向上させることが分かった(図2G)。例えば、L938FおよびT961Dはともにタンパク質収量のおよそ2倍の増加を有し、スパイクの正しい四次構造も維持していたが(図2Cおよび2E)、示差走査型蛍光分析(DSF)によって評価した場合の両変種の熱安定性はS-2Pと同じままであった(図2F)。

プロリン置換を用いた以前の成功例から、本発明者らは、融合ペプチド(FP)、コネクタ領域(CR)およびHR1における可動性ループまたはヘリックスN末端にプロリンを置換した14例の個々の変種を試みるように動機付けされた(表1および図1G)。予想通り、複数のプロリン変種がタンパク質発現を上昇させ、熱安定性を増加させた(図2Dおよび2F)。最も成功した2つの置換F817PおよびA942Pは、S-2Pとは対照的に、それぞれ2.3倍および4倍のタンパク質収量の増加を示した。A942P置換は融解温度(Tm)をおよそ3℃だけさらに上昇させ、両変種はnsEMによって十分に折り畳まれた三量体として現れた(図2E)。

多置換スパイク変種
有益な単一置換の潜在的な相加効果または相乗効果を調べるために、最初の組み合わせ(「コンボ(Combo)」)変種は、以下の事項を考慮して作製された: 置換は空間内で互いに近接してはならず、コンストラクトあたり多くとも2つのジスルフィド結合でなくてはならない。2つのジスルフィド結合を含むコンボ変種は概して、単一ジスルフィドの変種のおよそ50%の発現レベルを有し、2つの置換が互いに干渉していることを示唆していた(表2)。1つのジスルフィド(S884C/A893C)を単一のプロリン変種(F817P)に追加しても、発現レベルは低減したが、スパイクの四次構造は十分に維持されていた(表7)。ジスルフィド結合の有益な効果は、空洞充填変種であるL938Fと組み合わせた場合に最も顕著であった。コンボ23 (S884C、A893C、L938F)は、その親変種のいずれよりも高いタンパク質収量を有したが、コンボ23のTmはS884C/A893Cと比較してさらに上昇しなかった。さらに、2つの空洞充填置換の組み合わせ(コンボ18)または1つの空洞充填置換と1つのプロリン置換の混合(コンボ20)により、L938F単独と比較して発現が増加した(表7)。

（表７）

最も顕著な結果は、複数のプロリン置換の組み合わせから得られた(図3A)。A892PおよびA942Pを含むコンボ14は、A892P単独と比較して、タンパク質収量の6.2倍の増加を有していた(図3Bおよび3C)。A899Pをコンボ14に追加すると、コンボ45はコンボ14と同じ発現レベル、しかし+1.2℃のTmを有するように見えた(図3C)。コンボ46はA892P、A899PおよびF817Pの組み合わせであり、A892Pと比較してタンパク質収量が3.4倍増加し、Tmが3.3℃上昇していた。オリジナルのS-2Pに加えて、コンボ47には4つの有益なプロリン置換が全て含まれており、タンパク質発現をS-2Pよりも9.8倍増加させるだけでなく、タンパク質を安定化させ、Tmのおよそ5℃上昇を有する。最も重要なことは、プロリン置換を有する全てのコンボ変種が、nsEMによって明らかにされたように十分に折り畳まれた三量体であったことである(図3E)。コンボ47は、計6つのプロリン置換を含み、これまでで最良のコンストラクトであるため、HexaProに改名された。

HexaPro大規模発現およびストレス試験
潜在的なワクチン抗原または診断試薬としてのHexaProの実行可能性を評価するために、FreeStyle 293 細胞での大規模生産、ExpiCHO細胞でのタンパク質発現の実現可能性、エピトープの完全性およびタンパク質の安定性を包括的に調べた。FreeStyle 293細胞2 Lからおよそ12 mg、つまり6 mg/LのHexaProが作製され、これはS-2Pよりも10倍以上の向上に相当する。大規模なHexaPro調製物のSECプロファイルは、三量体のサイズに対応する単分散ピークであった(図4A)。HexaProの四次構造も十分に維持され、nsEMに基づきS-2Pと区別がつかなかった(図4B)。従来、組換えタンパク質の工業的生産はHEK293細胞ではなくCHO細胞に依存しているため、ExpiCHO細胞でのHexaProの発現を一過性のトランスフェクションにより検討した。ExpiCHO細胞は培養液40 mLあたり1.3 mg、つまり32.5 mg/LのHexaProを産生し、タンパク質は十分に折り畳まれていた(図4Cおよび4D)。HexaProの天然受容体ヒトACE2へのHexaProの結合速度もS-2Pのそれと同等であり(図4Fおよび4E)、それぞれ13.3 nMおよび11.3 nMの親和性を有していた。重要なことに、HexaProは3サイクルの凍結融解、室温での2日のインキュベーションまたは55℃での30分のインキュベーション後も、融合前の立体構造で折り畳まれたままであった(図4Gおよび4H)。対照的に、S-2Pは3サイクルの凍結融解後に凝集の兆候を示し、50℃で30分後に折り畳み構造がほどけ始めた。まとめると、これらのデータは、HexaProが最適な特徴を保有していることを示しており、SARS-CoV-2ワクチン開発の有望な候補になりうることを示唆している。

SARS-CoV-2 S HexaProのクライオEM構造
安定化置換が意図しない立体構造変化につながらないことを確認するために、SARS-CoV-2 S HexaProのクライオEM構造が決定された。単一のグリッドから、Sの2つの異なる立体構造の高解像度3D再構成が得られた: 1つはアップ立体構造で単一のRBDを有するもの、もう1つはアップ立体構造で2つのRBDを有するものであった。この2つのRBDアップ立体構造は、SARS-CoV-2 S-2Pの以前の構造的特徴付け中には観察されなかったが、HexaProでS2の安定性が増強したため、この安定性の低い中間体を観察できたと推測したくなるが、この仮説を検証するにはさらに調査が必要である。観察された粒子のおよそ3分の1 (30.6%) は、2つのRBDアップ立体構造にあり、3.20 Åの再構成につながった。残りの粒子は1-RBDアップ立体構造で捕捉されたが、受容体がアクセスできるRBDの位置にはある程度の可動性があるため、本発明者らは、このドメインの明確な密度がない1 RBDアップ粒子のサブセットを取り除き、3.21 Åの再構成につながった85,675個の粒子の最終セットを得ることになった(図5A)。1-RBDアップHexaPro構造と、以前に決定された3.46 ÅのS-2P構造との比較を図5Bに示す。この再構成の比較的高い解像度により、本発明者らは、安定化プロリン置換を含む4つの位置全てで密度を観察することも可能になり、各置換がスパイクタンパク質に適切に導入されること、およびこれらの置換がS2サブユニットの立体構造に対していかなる有害な効果も及ぼさないことが確認された(図5C)。

C. 考察
融合前に安定化されたクラスIウイルス融合タンパク質は、概して、より強力な中和抗体を誘導し、安定化されていない対照物よりも良好なワクチン抗原として機能する^15,23。COVID-19パンデミックに対する予防的対策の緊急の必要性に対応するために、融合前に安定化されたSARS-CoV-2 S-2P構造²⁰を、発現または安定性の増大を有することを意図した100例の単一置換変種をデザインするためのガイドとして用いた。S2サブユニットは、HIV-1 gp41またはRSV Fと同様に、大規模な再折り畳みを受けて膜融合を促進することを考えて、スパイクのこの部分に特に努力を集中させた。採用された戦略の1つは、少なくとも1つのシステインが融合前と融合後の状態の間で立体構造を変化させる領域にあるジスルフィド結合の導入であった。この方法はHIV-1 Env (SOSIP)およびRSV F (DS-Cav1)の場合には成功であった^23,24が、S2に導入されたジスルフィドは一般に有害な影響を及ぼした。例えば、サブユニット間ジスルフィド(例えば、S659C/S698C)はタンパク質発現を60%だけ減少させ、Q965C/S1003C置換は部分的に誤って折り畳まれたスパイクにつながった(図2)。プロトマー間ジスルフィドは、HIV-1 Envの三量体の完全性およびRSV Fの安定性を改善することが示されている^25,26が、プロトマー間T961C/S758C置換はS-2Pと比べて発現を取り除いた。対照的に、プロトマー界面に位置する可動性ループを安定化させることが有益であることは分からなかった。S884C/A893CもT791C/A879Cもともに熱安定性および発現を増加させ、ネイティブな三量体構造をもたらした。可動性ループを比較的剛性のαヘリックスに固定することで、プロトマーの組み立てに有利に働く可能性がある。

HIV-1 gp120-gp41界面に塩橋を導入すると、タンパク質発現が増加するだけでなく、三量体特異的な抗体の結合も増強され、ネイティブな四次構造の保持が改善されたことを示唆していた²²。同様の原理に基づき、T961D置換を導入して、隣接するプロトマーからのArg765と静電的相互作用を形成させた(図1)。同様に、G769E置換はArg1014とプロトマー間の塩橋を形成するよう意図された。どちらの変種も発現を増加させ、十分に折り畳まれた三量体スパイクにも似ていた(図2)。塩橋に加えて、タンパク質が再び折り畳むことを可能にする緩く充填された疎水性コアを充填すると、RSV FおよびHIV-1 Envにおける以前の空洞充填置換によって示された^23,24,27ように、融合前の状態を安定化するのに役立ちうる。ここで、L983F置換は、HR1、FPおよびβ-ヘアピンによって部分的に形成された空洞を充填するようにデザインされた。この変種は、発現の2倍増加を有し(図2)、ジスルフィドまたはプロリン置換と組み合わせると相加効果を有するようであった。

発見された最良の単一置換変種の中には、F817PおよびA942Pがあり、これらはどちらもスパイクの質および量を大幅に向上させた(図2)。それらをA892PおよびA899P置換とさらに組み合わせることにより、これまでで最良のコンストラクトであるHexaProが作製された。これらの結果は、HIV-1 Env、RSV F、hMPV F、MERS-CoV SおよびエボラGPへのプロリン置換の以前の成功裏の適用を連想させるものである^{23,24,28～30}。さらに、融合ペプチド近傍の疎水性残基の溶媒接近性は、インフルエンザHAステムのみのデザインの懸念事項であり³¹、同様に、露出したPhe817をProに置き換えることでこの問題に対処した(図5C)。A942P置換はコネクタ領域とHRXの間の可動性ループに剛性を課し、エボラGPの安定化に役立つことが分かっているT577P置換のものと類似している²⁸。

HexaProクライオEMデータセットでは、SD1をS2に近づけ、かくしてRBDをアップ位置にさせる4つの疎水性置換を含む修飾スパイクの最近の構造が決定されるまで、SARS-CoV-2スパイクではこれまで観察されていなかった、2 RBDアップ立体構造にある粒子3分の1が観察された³²。HexaProにおけるさらに安定なS2により、本発明者らは、S1のトリガリングおよび解離の前に一時的に存在しうるこの比較的不安定な立体構造を捉えることが可能になったという仮説が立てられる。これは、安定なMERS-CoV S-2Pスパイクの構造で観察されたものと同様であり、ここでは3-RBDアップ立体構造でさえも観察することができた³⁰。HexaProスパイクは、凍結融解、室温貯蔵および熱ストレス後も融合前の状態を維持することができ、サブユニットワクチン抗原としてのHexaProスパイクの開発を可能にするはずである。さらに、組換えタンパク質の工業生産は、CHO細胞での大規模発現によって実行されることが多い。Expi-CHO細胞1 Lから十分に折り畳まれたHexaPro 32.5 mgが得られ、工業生産の実現可能性を示すものであった。HexaProスパイクは、核酸分子あたりより多くの抗原を産生することによってDNAまたはmRNAに基づくワクチンを改善し、かくして同じ用量で効力を改善するか、またはより低い用量で効力を維持することもできる。

本明細書において開示および主張される方法の全ては、本開示を考慮すれば過度の実験なく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法が好ましい態様に関して記述されたが、当業者には、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく、本明細書において記述される方法、ならびに方法の段階または段階の順序において変形が適用されうることが明らかである。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある種の薬剤が、本明細書において記述される薬剤の代わりに代用されても、同じまたは同様の結果が達成されることは明らかである。当業者には明らかなそのような同様の代用および変更は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、および概念の範囲内であると見なされる。

参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されているものに対して例示的な手順または他の詳細な補足を提供する程度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

Claims

(a) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1208;
(b) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1160; または
(c) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号319～1208
と少なくとも90%同一な配列を含む操作されたコロナウイルスSタンパク質エクトドメインを含み、
SEQ ID NO: 1または2の配列に対して以下の置換: F817P、A892P、A899P、A942P、K986PおよびV987Pを含む、
操作されたタンパク質。
(a) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1208;
(b) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1160; または
(c) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号319～1208
と少なくとも90%の同一性を有する操作されたコロナウイルスSタンパク質エクトドメインを含む、操作されたタンパク質であって、
(1) 操作されたジスルフィド結合;
(2) 空洞充填置換; および/または
(3) 静電相互作用もしくは極性相互作用を提供する置換
を含む、SEQ ID NO: 1または2の配列に対する少なくとも1つの変異
を含む、前記操作されたタンパク質。
(a) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1208;
(b) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号14～1160; または
(c) SEQ ID NO: 1もしくは2の位置番号319～1208
と少なくとも90%の同一性を有する操作されたコロナウイルスSタンパク質エクトドメインを含む、操作されたタンパク質であって、
(i) T724、T752、T778、T961、I1013、H1058、S735、T859、I770、A1015、L727、S1021、Q901、S875、T912、H1088、L1141、V1040、L966、A766、T778、L938、V963、V911、N1108、V705、A893、N703、A672、A694、A1080、I1132、P862、T859、T547、N978、T961、S758、Q762、D1118、S659、S698、R1039、V722、A930、A903、Q913、S974、D979、P728、V951、V736、L858、S884、A893、P807、S875、T791、A879、G799、A924、V826、A899、Q779、F817、L865、T866、A892、A899、T912、A570、V963; T874、S1055、V729、A1022、L894、A713、L828、H1058、L822、A1056、Q965、S1003、A972、Q992、I980、A1078、V1133、H1088、T1120、I870、S1055、T1117、D1139、T1116、Y1138、I896、G885、Q901、F1103、P1112、G889、L1034、E819、S1055、A972、I980、I1081、N1135、E819、Q1054、Q957、I1130、V1040、H1088、V1104、R1000、A944、T724、A944、S730、S730、G769、A893、Q895、K921、L922、N978、A942、G946、S975、A890、S1003に対応する位置の置換; および/または
(ii) 位置番号829～851、675～686、673～684、1161～1208もしくは1142～1208に対応する欠失; および/または
(iii) アミノ酸位置番号673～686に対しての2つのアミノ酸の置換
を含む、SEQ ID NO: 1または2の配列に対する少なくとも1つの変異
を含む、前記操作されたタンパク質。
S735CおよびT859C; I770CおよびA1015C; L727CおよびS1021C; V911CおよびN1108C; A672CおよびA694C; A1080CおよびI1132C; S659CおよびS698C; V722CおよびA930C; A903CおよびQ913C; S974CおよびD979C; P728CおよびV951C; V736CおよびL858C; S884CおよびA893C; P807CおよびS875C; T791CおよびA879C; G799CおよびA924C; A570CおよびV963C; T874CおよびS1055C; V729CおよびA1022C; L822CおよびA1056C; Q965CおよびS1003C; A972CおよびQ992C; I980CおよびQ992C; A1078CおよびV1133C; H1088CおよびT1120C; I870CおよびS1055C; T1117CおよびD1139C; T1116CおよびY1138C; I896CおよびQ901C; G885CおよびQ901C; F1103CおよびP1112C; G889CおよびL1034C; E819CおよびS1055C; A972CおよびI980C; I1081CおよびN1135C; またはE819CおよびQ1054Cに対応する位置のシステイン置換対を含む操作されたジスルフィド結合を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
A903CおよびQ913C; S884CおよびA893C; T791CおよびA879C; Q965CおよびS1003C; またはT1117CおよびD1139Cに対応する位置のシステイン置換対を含む操作されたジスルフィド結合を含む、請求項4記載の操作されたタンパク質。
S884CおよびA893Cに対応する位置のシステイン置換対を含む操作されたジスルフィド結合を含む、請求項4記載の操作されたタンパク質。
少なくとも1つのさらなる操作されたジスルフィド結合をさらに含む、請求項6記載の操作されたタンパク質。
T791CおよびA879C; またはG799CおよびA924Cに対応する位置のシステイン置換対を含む操作されたジスルフィド結合をさらに含む、請求項7記載の操作されたタンパク質。
A903CおよびQ913Cに対応する位置のシステイン置換対を含む操作されたジスルフィド結合を含む、請求項5記載の操作されたタンパク質。
少なくとも1つのさらなる操作されたジスルフィド結合をさらに含む、請求項9記載の操作されたタンパク質。
Q965CおよびS1003C; S884CおよびA893C; T791CおよびA879C; またはG799CおよびA924Cに対応する位置のシステイン置換対を含む操作されたジスルフィド結合をさらに含む、請求項10記載の操作されたタンパク質。
A903CおよびQ913C; ならびに/またはQ965CおよびS1003Cに対応する位置のシステイン置換対を含む操作されたジスルフィド結合をさらに含む、請求項11記載の操作されたタンパク質。
T724、I1013、H1058、Q901、S875、H1088、L1141、V1040、T778、L938、V963、R1039、V826、A899、Q779、L894、V1040、V1104、R1000、A944、S730、A890、D1118またはS1003に対応する位置に空洞充填置換を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
T778、L938、V963またはH1088に対応する位置に空洞充填置換を含む、請求項13記載の操作されたタンパク質。
T724M、I1013F、H1058W、Q901M、S875F、H1088W、L1141F、V1040F、T778L、L938F、V963L、R1039F、V826L、A899F、Q779M、L894F、H1058F、H1058Y、V1040Y、H1088Y、V1104I、R1000Y、R1000W、A944F、T724I、A944Y、S730L、A890V、D1118FまたはS1003Vから選択される空洞充填置換を含む、請求項13記載の操作されたタンパク質。
T778L、L938F、V963LまたはH1088Yから選択される空洞充填置換を含む、請求項15記載の操作されたタンパク質。
L938に対応する位置に空洞充填置換を含む、請求項13記載の操作されたタンパク質。
L938F置換を含む、請求項17記載の操作されたタンパク質。
V963に対応する位置に空洞充填置換をさらに含む、請求項17～18のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
V963L置換を含む、請求項19記載の操作されたタンパク質。
F817P、L865P、T866P、A892P、A899P、T912P、A893P、Q895P、K921P、L922P、N978P、A942P、G946PまたはS975Pから選択されるプロリン置換を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
F817P、A892P、A899PまたはA942Pから選択されるプロリン置換を含む、請求項21記載の操作されたタンパク質。
プロリン置換F817Pを含む、請求項21記載の操作されたタンパク質。
操作されたジスルフィド結合をさらに含む、請求項23記載の操作されたタンパク質。
S884CおよびA893C; またはT791CおよびA879Cに対応する位置のシステイン置換対を含む操作されたジスルフィド結合をさらに含む、請求項24記載の操作されたタンパク質。
S884CおよびA893Cに対応する位置のシステイン置換対を含む操作されたジスルフィド結合をさらに含む、請求項25記載の操作されたタンパク質。
V987Pおよび/またはK986Pのさらなるプロリン置換をさらに含む、請求項21記載の操作されたタンパク質。
プロリン置換A892Pを含む、請求項21記載の操作されたタンパク質。
A942P; A899P; および/またはF817Pのさらなるプロリン置換をさらに含む、請求項28記載の操作されたタンパク質。
A892P; A942P; A899P; および/またはF817Pから選択される少なくとも2つのプロリン置換を含む、請求項21記載の操作されたタンパク質。
A892P; A942P; A899P; および/またはF817Pから選択される少なくとも3つのプロリン置換を含む、請求項30記載の操作されたタンパク質。
A892P; A942P; A899P; およびF817Pのプロリン置換を含む、請求項31記載の操作されたタンパク質。
プロリン置換A899PまたはT912Pを含む、請求項28記載の操作されたタンパク質。
プロリン置換A892PおよびT912Pを含む、請求項28記載の操作されたタンパク質。
T752、T912、L966、L828、S730、T961、A766、P862、T859、Q957またはG769に対応する位置に静電相互作用置換を提供する置換を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
T961、L966、T859またはG769に対応する位置に静電相互作用置換を含む、請求項35記載の操作されたタンパク質。
T961DまたはT961Eの静電相互作用置換を含む、請求項36記載の操作されたタンパク質。
T961Dの置換を含む、請求項38記載の操作されたタンパク質。
L966E置換をさらに含む、請求項37～38のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
T752K、T912R、L828K、L828R、S730R、T961D、A766E、P862E、T859K、Q957EまたはG769Eから選択される静電相互作用置換を含む、請求項35記載の操作されたタンパク質。
T961D、L966D、T859KまたはG769Kから選択される静電相互作用置換を含む、請求項40記載の操作されたタンパク質。
T778、A713またはI1130に対応する位置に静電相互作用置換または極性相互作用置換を提供する置換を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
T778Q、A713SまたはI1130Yから選択される静電相互作用置換を含む、請求項35記載の操作されたタンパク質。
ある位置の静電相互作用置換を提供する置換およびF817Pを含む、請求項2または3記載の操作されたタンパク質。
L984、D985、K986、および/またはV987に対応する位置に置換をさらに含む、請求項1～44のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
L984、D985、K986および/またはV987に対応する位置にグリシンまたはプロリンへの置換をさらに含む、請求項44記載の操作されたタンパク質。
K986PおよびV987P置換を含む、請求項1～44のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
A570、T572、F855および/またはN856に対応する位置に置換をさらに含む、請求項1～47のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
A570、T572、F855および/またはN856に対応する位置に空洞充填置換をさらに含む、請求項48記載の操作されたタンパク質。
少なくとも1つの操作されたジスルフィド結合、少なくとも1つの空洞充填置換、少なくとも1つのプロリン置換および少なくとも1つの静電相互作用置換の組み合わせを含む、請求項1～49のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
SEQ ID NO: 1または2の位置番号319～1208と少なくとも95%の同一性を有する、請求項1～50のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
SEQ ID NO: 1または2の位置番号16～1208と95%の同一性を有する操作されたコロナウイルスSタンパク質エクトドメインを含む、請求項1～50のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
操作されたコロナウイルスSタンパク質エクトドメインが、フリン切断部位を除去する変異を含む、請求項1～52のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
フリン切断部位を除去する変異が、位置番号682～685のGSAS置換を含む、請求項53記載の操作されたタンパク質。
三量体化ドメインに融合またはコンジュゲートされている、請求項1～54のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
三量体化ドメインに融合されている、請求項55記載の操作されたタンパク質。
三量体化ドメインが、Sタンパク質エクトドメインに対してC末端に配置されている、請求項55記載の操作されたタンパク質。
三量体化ドメインが、T4フィブリチン三量体化ドメインを含む、請求項56記載の操作されたタンパク質。
膜貫通ドメインに融合またはコンジュゲートされている、請求項1～54のいずれか一項記載の操作されたタンパク質。
膜貫通ドメインに融合されている、請求項59記載の操作されたタンパク質。
膜貫通ドメインが、コロナウイルススパイクタンパク質膜貫通ドメインを含む、請求項59記載の操作されたタンパク質。
膜貫通ドメインが、SARS-CoV-2膜貫通ドメインを含む、請求項61記載の操作されたタンパク質。
請求項1～50のいずれか一項記載の少なくとも1つのサブユニットを含む、操作されたコロナウイルス三量体。
野生型Sタンパク質サブユニットの三量体と比べて融合前の立体構造において安定化されている、請求項63記載の操作された三量体。
サブユニット間の少なくとも1つの操作されたジスルフィド結合を含む、請求項63記載の操作された三量体。
サブユニット間の少なくとも1つの操作されたジスルフィド結合が、V705CおよびA983C; T547CおよびN968C; T961CおよびS758C; ならびに/またはT961CおよびQ762Cから選択される、請求項65記載の操作された三量体。
薬学的に許容される担体; および(i) 請求項1～62のいずれか一項記載の操作されたタンパク質、または(ii) 請求項63～66のいずれか一項記載の操作された三量体を含む、薬学的組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項67記載の組成物。
請求項1～62のいずれか一項記載の操作されたタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
DNA発現ベクターを含む、請求項69記載の核酸。
mRNAを含む、請求項69記載の核酸。
対象に請求項67～68のいずれか一項記載の薬学的組成物または請求項69～71のいずれか一項記載の核酸分子の有効量を投与する段階を含む、対象におけるコロナウイルス感染またはコロナウイルス感染に関連する疾患を予防する方法。
抗体に結合した請求項1～62のいずれか一項記載の操作されたタンパク質を含む、組成物。