CN116003638B

CN116003638B - 一种有效杀伤胆管型肝癌的CAR-iNKT细胞技术

Info

Publication number: CN116003638B
Application number: CN202310087774.1A
Authority: CN
Inventors: 闾军; 刘祥贺; 冯纪开
Original assignee: Beijing Gene Qiming Biology Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Gene Qiming Biology Technology Co ltd
Priority date: 2023-01-20
Filing date: 2023-01-20
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2043-01-20
Also published as: CN116003638A

Abstract

本申请提供了包含MSLN的嵌合抗原受体、转导了该嵌合抗原受体的iNKT细胞及其在制备肝癌、特别是胆管型肝癌中的用途。本申请利用iNKT细胞能归巢定居到肝脏的特性，并选择了适合的MSLN抗体序列，实现了高肿瘤杀伤效率和CAR‑iNKT细胞增殖速度；Anti‑MSLN CAR‑iNKT细胞能有效浸润到肝脏肿瘤部位，极大提高疗效，减少复发，减轻毒副作用。

Description

一种有效杀伤胆管型肝癌的CAR-iNKT细胞技术

技术领域

本申请属于癌症免疫治疗领域。具体地，本申请提供了包含MSLN的嵌合抗原受体、转导了该嵌合抗原受体的iNKT细胞及其在制备肝癌、特别是胆管型肝癌中的用途。

背景技术

胆管癌是起源于肝内或肝外胆管上皮层的一类肿瘤。胆管癌早期不容易发现，诊断后结局较差，五年生存率只有10％[4]。大约只有三分之一确诊后的胆管癌患者适合手术治疗[5]。胆管癌治疗方式包括手术切除肿瘤、肝移植、放疗、化疗、局部治疗、分子靶向治疗、免疫治疗[6]。现有治疗方式不能满足临床要求，胆管型肝癌急需更为安全有效的治疗方式。

嵌合抗原受体技术在血液肿瘤治疗中取得了显著疗效，Kymriah[7]及Yescarta[8]于2017年获得FDA批准用于B细胞急性淋巴白血病、弥漫性大B淋巴瘤的治疗。中国也于2021年6月批准了第一个用于血液肿瘤治疗的嵌合抗原受体细胞产品[9]。

Mesothelin(MSLN)是一类表达于细胞膜表面的糖基磷脂酰肌醇化蛋白，正常生理情况下表达于男性胸膜、腹膜、心包膜及鞘膜，低表达于卵巢、输卵管及睾丸的上皮层[10]。人类MSLN基因位于16号染色体，编码一个分子量约为71kDa的、由628个氨基酸组成的前体蛋白[14]。MSLN前体蛋白于Arg295处被剪接成为N-端可溶性蛋白巨核细胞增强因子(MPF)及结合于细胞膜表面的糖基磷脂酰肌醇锚着的MSLN[20]。

相比于正常情况下仅有限表达于间皮细胞，多种肿瘤中MSLN呈现过表达状态，包括恶性间皮瘤[11]、卵巢癌[12]、三阴乳腺癌[13]、前列腺癌[14]、肺癌[15]、胃癌[16]、子宫内膜癌[17]、宫颈癌[18]、胆管癌[19]等，是嵌合抗原受体技术靶向治疗的理想靶点。

不变自然杀伤T细胞(invariant natural killer T cell,iNKT)是胸腺来源T细胞中的独特亚群，具有CD1d限制性，并同时表达T细胞和自然杀伤细胞(natural killercell,NK)谱系特征的表面受体，具有T细胞和NK细胞的共同生物学特征和桥接先天免疫和过继免疫的重要作用。人类iNKT细胞中，Vα24-Jα18形成TCRα链后与Vβ11TCRβ链形成TCR[21]。

iNKT细胞在胸腺中分化为至少三个效应亚群，类似于CD4+T辅助细胞的亚群，也可类似于先天淋巴细胞(ILCs)的亚群[22-24]。功能性iNKT细胞亚群根据不同细胞表面标记和特征转录因子的表达来区分。NKT1细胞与Th1细胞和ILC1s相似，因为它们都高表达转录因子T-bet并在激活之后都分泌IFN-γ。NKT1细胞也表现出比其他iNKT细胞亚群更大的细胞毒性功能。NKT1细胞与Th1细胞或ILC1s不同之处在于除了通过TCR激活产生IFN-γ外，还能产生IL-4等因子。NKT2细胞分泌的细胞因子包括IL-4和IL-13，类似于Th2细胞。而NKT17细胞在细胞因子分泌方面类似于Th17细胞[25-27]。

不同的iNKT细胞亚群在不同的组织中富集。NKT1细胞在肝脏中高度富集，而NKT17细胞主要位于淋巴结、皮肤和肺，脾脏中也有少量的细胞[28]。NKT2细胞位于多个部位，包括肺和脾脏，但它们在肠系膜淋巴结中特别丰富[28]。在周围淋巴结中，iNKT细胞能被迅速激活，并可能在对抗致病原中发挥关键作用[29]。

NKT细胞的免疫治疗研究起步较晚，体内含量低，其特异性抗体的选择相对受限，目前仅有针对GD2,CD19,CSPG4以及BCMA设计抗体的相关研究，可供参考的特异性抗体种类少，选择和设计难度相对较高。

与本专利接近的AU2020264343A1、CN112574953A中，通过基因修饰，使T细胞表达针对MSLN抗原的嵌合性受体，其中CAR包括MSLN抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，并对携带MSLN抗原的癌细胞表现出杀伤作用。但鉴于普通T细胞无法有效浸润到实体瘤中，实体瘤的肿瘤微环境缺氧，偏酸性，对CAR-T细胞的扩增及长期存续非常不利，从而严重影响CAR-T细胞的疗效。

发明内容

针对以上问题，申请人利用iNKT细胞归巢到肝脏的特性及非特异性杀伤功能，通过基因修饰使其携带能结合MSLN抗原的嵌合抗原受体，使anti-MSLN-CAR-iNKT细胞能有效发挥特异性杀伤携带MSLN抗原的胆管癌细胞；并对不同scFv构成的CAR分子进行比较，挑选出更有利于结合癌细胞表面MSLN抗原并杀伤癌细胞的CAR分子。具体地：

在嵌合性抗原受体(CAR)分子中引入针对MSLN的特异scFv，使其能特异性结合胆管型肝癌细胞特异表达的MSLN抗原，同时在CAR分子中引入共刺激分子CD28胞内信号域及CD3ζ胞内信号域，从而可以刺激iNKT细胞增殖并分泌IFN-γ、颗粒酶等对癌细胞进行杀伤，并对不同scFv构成的CAR分子对表达MSLN抗原癌细胞的杀伤效果进行比较，从而选择出抗癌效果更好的CAR分子。

发明人经过创造性劳动，不断地进行氨基酸序列设计以及序列的排列组合和筛选，对近数十条CAR分子序列进行随机筛选试验和靶向性功能验证(例如构建病毒载体，以及进一步感染iNKT细胞，获得修饰的iNKT细胞，并检测所得修饰的iNKT细胞的体外杀伤活性等试验)，之后根据多个随机组合的结果比对，再进行序列调整，最终筛选出效果最好的序列，获得了本发明的高效价靶向人MSLN蛋白的抗人MSLN单链抗体嵌合抗原受体序列及其功能性变体。

一方面，本申请提供了一种嵌合抗原受体，其特征在于，包含依次连接的MSLN单链抗体、间隔域或铰链区、跨膜区、胞内共刺激域、信号区。

进一步地，所述嵌合抗原受体包含依次连接的CD8α信号肽、MSLN单链抗体、CD8α铰链区、CD28跨膜区、CD28共刺激区、CD3ζ信号区。

进一步地，所述MSLN单链抗体氨基酸序列选自SEQ ID NO.8、10、12。

进一步地，所述MSLN单链抗体核苷酸序列选自SEQ ID NO.9、11、13。

进一步地，所述MSLN单链抗体氨基酸序列为SEQ ID NO.8。

进一步地，所述CD8α信号肽氨基酸序列为SEQ ID NO.2、CD8α铰链区氨基酸序列为SEQ ID NO.14、CD28跨膜区氨基酸序列为SEQ ID NO.4、CD28共刺激区氨基酸序列为SEQ IDNO.6、CD3ζ信号区氨基酸序列为SEQ ID NO.16。

进一步地，所述CD8α信号肽核苷酸序列为SEQ ID NO.3、CD8α铰链区核苷酸序列为为SEQ ID NO.15、CD28跨膜区核苷酸序列为SEQ ID NO.5、CD28共刺激区核苷酸序列为SEQID NO.7、CD3ζ信号区核苷酸序列为SEQ ID NO.17。

进一步地，所述嵌合抗原受体氨基酸序列选自SEQ ID NO.18、20、22。

进一步地，所述嵌合抗原受体核苷酸序列选自SEQ ID NO.19、21、23。

另一方面，本申请提供了携带上述嵌合抗原受体的pLV300载体。

进一步地，所述pLV300载体核苷酸序列为SEQ ID NO.24。

另一方面，本申请提供了一种免疫细胞，其转导了上述嵌合抗原受体。

进一步地，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或iNKT细胞。

进一步地，所述免疫细胞为iNKT细胞。

另一方面，本申请提供了上述嵌合抗原受体、载体或免疫细胞在制备治疗癌症的药物中的应用。

另一方面，本申请提供了一种治疗癌症的方法，其特征在于，其中使用了上述嵌合抗原受体、载体或免疫细胞。

进一步地，所述癌症为MSLN过表达的癌症。

进一步地，所述癌症为肝癌。

进一步地，所述癌症为胆管型肝癌。

另一方面，本申请提供了包含上述表达载体的转导系统。

进一步地，所述转导系统为病毒转导系统和非病毒转导系统。

进一步地，所述转导系统为慢病毒转导系统。

本发明包括包含上述一种或几种元件同时用于构建表达于T细胞、NK细胞或NKT细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸表达载体。可以根据需要选用各种市售的载体，或者可以根据分子生物学领域的常规技术构建载体。在一个具体实施方案中,本发明使用的载体是一种慢病毒质粒载体pLV300。该质粒属于第四代自灭活慢病毒载体系统,该系统共有四个质粒即编码蛋白Gag/Pol的包装质粒、编码Rev蛋白的包装质粒、编码VSV-G蛋白的包膜质粒，及空载体pLV300，其可以用于重组引入目的核酸序列,即编码嵌合抗原受体蛋白的核酸序列。载体pLV300中由pGK-300启动子调控嵌合抗原受体蛋白的表达。

本发明包括包含上述载体的病毒，包括但不仅限于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒,也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其他转染T细胞、NK细胞或NKT细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。在本发明的一个实施方案中,所述病毒是包含上述pLV300-anti-GPC3 CAR重组载体的慢病毒。

本发明包括一种转基因T淋巴细胞、NK细胞或iNKT细胞,其被转导有本发明的核酸或被转导有本发明的上述包含所述含有该核酸的重组质粒,或包含该质粒的病毒系统。本领域常规的核酸转导方法,包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。近期Amaxa公司研发的nucleofector核转染仪能够直接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子(SleepingBeauty system)或PiggyBac转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提高,将nucleofector转染仪与SB睡美人转座子系统联合应用已有报道，该方法既能够具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的iNKT细胞的转导方法是基于慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高,外源基因能够稳定表达,且可以缩短体外培养iNKT淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。慢病毒转染导入的核酸通过转录、翻译表达在iNKT细胞膜表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明,本发明的表面表达嵌合抗原受体的转基因iNKT细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)。因此本发明的编码嵌合抗原受体蛋白的核酸,包含该核酸的质粒,包含该质粒的病毒和转染有上述核酸,质粒或病毒的转基因iNKT细胞、T淋巴细胞或NK细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。

本发明的核酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的编码嵌合抗原受体蛋白氨基酸序列的核酸密码子可以是简并的,即编码同一氨基酸序列的多种简并核酸序列都包含在本发明的范围之中。编码对应氨基酸的简并核酸密码子是本领域公知的。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

所述MSLN过表达的癌症，包括但不限于恶性间皮瘤、卵巢癌、三阴乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胆管癌等。

所述MSLN过表达的是指以包括但不限于分子水平、蛋白水平上的各种检测方法检测到MSLN相关核酸或蛋白含量或其他指证高于正常水平的情况。

附图说明

图1为anti-MSLN CAR结构示意图；

图2为pLV300慢病毒载体结构示意图；

图3为iNKT总细胞增殖曲线；

图4为anti-MSLN CAR-iNKT细胞培养不同时间时CD8+CAR+iNKT细胞亚群比例；

图5为anti-MSLN CAR-iNKT细胞培养不同时间时CD4+CAR+iNKT细胞亚群比例；

图6为anti-MSLN CAR-iNKT细胞培养不同时间时CD4-CD8-CAR+iNKT细胞亚群比例；

图7为不同效靶比时anti-MSLN CAR-iNKT对胆管癌细胞KMCH的杀伤效应；

图8为anti-MSLN CAR-iNKT细胞与胆管癌细胞KMCH共培养24小时后细胞培养上清中IFN-γ含量；

图9为anti-MSLN CAR-iNKT细胞与胆管癌细胞KMCH共培养24小时后细胞培养上清中IL-2含量。

具体实施方式

实施例1包含嵌合抗原受体分子的慢病毒的制备

将HEK-293T细胞传代，待细胞长至60％-70％融合后，将含有CAR分子的表达载体与包装质粒一起用pEI试剂转染至HEK-293T细胞中，转染后4小时更换新鲜培养基。转染后48-72小时收集细胞培养上清。将上清进行超速离心以浓缩包装后含有CAR分子的慢病毒。对浓缩后慢病毒进行病毒滴度测定，-80℃冻存待用。

实施例2anti-MSLN CAR分子对总iNKT细胞增殖及CAR-iNKT细胞分化的影响

以anti-iNKT mircrobeads从人外周血单个核细胞中分离出iNKT细胞后，在24孔板中按照每孔2x10⁵细胞接种，每孔加入X-VIVO完全培养基(含100IU/ml及100ng/mlα-Galcer)培养48小时后，收集各孔细胞，400xg离心5分钟，弃上清后，加入新鲜的X-VIVO完全培养基重悬后重新接种于24孔培养板中，每孔细胞分别加入含有anti-MSLN1 CAR、anti-MSLN2 CAR、anti-MSLN3 CAR的不同慢病毒进行感染。24小时后，收集各孔细胞于离心管中，400xg离心5分钟后，计数，按5x10⁵ cells/ml加入新鲜X-VIVO完全培养基进行培养，每48小时换液。分别培养至day 7、day14、day21时，取样分别计数及进行流式检测，以证明嵌合抗原受体分子的表达情况。

结果表明：不同anti-MSLN CAR分子对iNKT细胞增殖及分化有影响，anti-MSLN1CAR、anti-MSLN2 CAR转入iNKT细胞后比anti-MSLN3 CAR分子更有利于细胞生长(图3)，anti-MSLN1 CAR、anti-MSLN2 CAR转入iNKT细胞后比anti-MSLN3 CAR分子更有利于CAR-iNKT细胞向CD8+CAR+iNKT细胞分化(图4-6)。

实施例3不同anti-MSLN CAR分子对CAR-iNKT细胞杀伤肿瘤能力的影响

不同组别CAR-iNKT细胞培养至第21天时，按照效应细胞与靶细胞比例分别为1:3、1:1、3:1分别从各组中取0.33x10⁵ CAR-iNKT细胞、1x10⁵ CAR-iNKT细胞、3x10⁵CAR-iNKT细胞、与1x10⁵ KMCH细胞(KMCH为Mesothelin表达阳性的胆管癌细胞系。用荧光染料CFSE混匀孵育10分钟)共培养6小时后，取各组培养上清用酶标仪检测上清中荧光强度(CAR-iNKT细胞杀伤能力越强，KMCH细胞内释放出的CFSE越多，荧光强度越大)，计算各组CAR-iNKT细胞的杀伤效率(图7)。结果表明：三种anti-MSLN CAR-iNKT细胞均能有效杀伤KMCH细胞，但anti-MSLN1 CAR-iNKT细胞的杀伤能力最强。

实施例4不同anti-MSLN CAR-iNKT细胞与表达MSLN的KMHC细胞共孵育后分泌IFN-γ及IL-2的比较

各组CAR-iNKT细胞培养至第21天后，按效应细胞与靶细胞比例为3:1，将各组CAR-iNKT细胞(每组3x10⁵ CAR-iNKT细胞)分别与1x10⁵ KMHC细胞于0.5ml X-VIVO(不含IL-2及α-GalCer)共培养24小时后，收集细胞，400xg离心5分钟后取上清，以ELISA方法检测上清中IFN-γ及IL-2含量。结果可见anti-MSLN1 CAR-iNKT细胞分泌IFN-γ及IL-2的能力最强，这与anti-MSLN1 CAR-iNKT细胞有较强增殖能力及对肿瘤的杀伤能力一致(图8-9)。

显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

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Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含依次连接的MSLN单链抗体、间隔域或铰链区、跨膜区、胞内共刺激域、信号区；所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQID NO.18、SEQ ID NO.20或者SEQ ID NO.22。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21或者SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列编码。

3.编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列选自SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21或者SEQ ID NO.23。

4.载体，其特征在于，所述载体携带有根据权利要求3所述的核酸。

5.根据权利要求4所述的载体，所述载体为pLV300，所述载体的核苷酸序列为SEQ IDNO.24。

6.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞被转导了根据权利要求1所述的嵌合抗原受体。

7.根据权利要求6所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或iNKT细胞。

8.根据权利要求7所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞为iNKT细胞。

9.根据权利要求6-8任一项所述的免疫细胞在制备治疗胆管型肝癌的药物中的应用。