ES2871400T3 - Células inmunitarias deficientes en SUV39H1 - Google Patents

Abstract

Una célula inmunitaria diseñada genéticamente con deficiencia en Suv39hl, para su uso en terapia celular adoptiva del cáncer, en donde la expresión y/o la actividad de Suv39hl se ha bloqueado o inhibido selectivamente y en donde dicha célula inmunitaria modificada: - es un linfocito T, un linfocito citolítico natural o un progenitor de linfocitos T, y - comprende además uno o más receptores de antígenos modificados genéticamente que se unen específicamente a un antígeno diana.

Description

DESCRIPCIÓN

Células inmunitarias deficientes en SUV39H1

Sector de la técnica

La presente invención se refiere al campo de la terapia adoptiva. La presente invención proporciona células inmunitarias deficientes en Suv39h1 con una supervivencia mejorada, potencial de reconstitución y fenotipo de memoria central después de la transferencia adoptiva.

Estado de la técnica

La terapia adoptiva de linfocitos T (ATCT) que utiliza linfocitos T armados con tecnologías recombinantes del receptor de linfocitos (TCR) y el receptor de antígeno quimérico (CAR) está mostrando una actividad muy alentadora en las pruebas clínicas de fase inicial contra varias neoplasias en varias instituciones (Kershaw MH, Westwood JA, Darcy PK. Nat Rev Cancer. 2013; 13:525-541).

Un tema emergente es que el injerto eficaz y la persistencia a largo plazo de los linfocitos T terapéuticos se correlacionan con resultados terapéuticos positivos. Varios estudios preclínicos han demostrado que los linfocitos T sin exposición previa y diferenciados tempranamente poseen una capacidad mejorada para la persistencia a largo plazo (Berger C et al., J Clin Invest. 2008; 118:294-305; Hinrichs CS et al., Proc Natl Acad Sci. 2009; 106:17469-17474; Tanel A et al., Expert Rev Vaccines. 2009; 8(3):299-312) y pueden generar potentes respuestas antitumorales (Gattinoni L et al., J Clin Investig. 2005; 115:1616-1626; Lugli E et al. J Clin Invest. 2013; 123:594-599). Adicionalmente, el aumento de la persistencia de las células transferidas adoptivamente parece depender de la adquisición de poblaciones de linfocitos T de memoria central (TCM) (Powell DJ et al., Blood. 2005; 105(1):241-50; Huang J., Khong HT et al. J Immunother. 2005; 28:258-267).

La transferencia de genes estable se ha logrado de forma rutinaria en el entorno clínico, en particular mediante el uso de vectores retrovíricos gamma para transducir linfocitos T policlonales con CAR (véase, por ejemplo, Guest RD et al., Cancer Immunol Immunother. 2014;63:133-145) y TCR (véase notablemente Johnson lA et al., Blood. 2009; 114 (3): 535-46) y estas células diseñadas genéticamente no muestran indicaciones de seguridad adversas obvias en pacientes injertados con linfocitos T CAR durante más de 10 años (Scholler J et al., Sci Transl Med. 2012;4:132ra153).

Para una transducción eficaz con vectores retrovíricos o lentivíricos, los linfocitos T primarios deben proliferar activamente (Stacchini A et al., Leuk Res. 1999; 23:127-136), lo que generalmente se logra mediante la estimulación mitogénica de los linfocitos T primarios en reposo. Sin embargo, tras la activación, los linfocitos T progresan de forma lineal irreversible hacia un fenotipo efector (Te ) (Mahnke YD et al., Eur J Immunol. 2013; 43:2797-2809; Farber DL. Semin Immunol. 2009; 21:84-91). La activación mitógena para la transducción retrovírica o lentivírica, por lo tanto, promueve la diferenciación de los linfocitos T de un fenotipo sin exposición previa hacia uno de TE. En combinación con protocolos de cultivo ex vivo para expandir el número de linfocitos T transducidos a los requeridos para la aplicación clínica (alrededor de 109-1011), los linfocitos T se dirigen hacia un fenotipo más diferenciado, que es subóptimo para la persistencia sistémica.

Por lo tanto, mientras que la terapia adoptiva de linfocitos T, incluida la terapia basada en linfocitos T CAR, han conocido notables éxitos terapéuticos, especialmente en el tratamiento de ciertos cánceres hematológicos en los últimos años, la eficiencia solo se ha demostrado en una minoría de tipos de cáncer de sangre y en unos pocos tipos de tumores sólidos. Se ha planteado la hipótesis de que la baja eficacia de los tratamientos se puede deber a una supervivencia limitada de los linfocitos T después de la transferencia adoptiva.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de linfocitos T modificados o diseñados genéticamente que presenten un fenotipo de memoria central mejorado y una supervivencia mejorada después de la transferencia adoptiva. En particular, sigue existiendo la necesidad de proporcionar células inmunitarias, especialmente los linfocitos T, que se puedan usar para terapia adoptiva, que apoyan notablemente el tratamiento eficaz del cáncer y a gran escala.

Objeto de la invención

Los inventores han descubierto ahora sorprendentemente que los linfocitos T deficientes en Suv39h1 tienen un fenotipo de memoria central mejorado y una supervivencia mejorada después de la transferencia adoptiva. En particular, los inventores demostraron que los linfocitos T deficientes en Suv39h1 se acumulan y reprograman con mayor eficacia en linfocitos T de memoria central de larga duración que expresan tanto CD44 como CD62L. Por lo tanto, la presente invención se refiere a células inmunitarias modificadas o diseñadas genéticamente, notablemente linfocitos T modificados, en donde Suv39h1 está inactivo.

Dichas células inmunitarias modificadas o diseñadas genéticamente son, por lo tanto, de interés para su uso en terapia adoptiva. Por lo tanto, la presente invención se refiere más específicamente a una célula inmunitaria diseñada genéticamente o modificada, deficiente en Suv39h1, en donde la célula inmunitaria preferentemente comprende además un receptor de antígeno modificado genéticamente que se une específicamente a un antígeno diana.

Normalmente, la célula inmunitaria diseñada según la reivindicación 1 es un linfocito T o un linfocito citolítico natural (NK), notablemente un linfocito T CD4+ o CD8+. Las células preferidas se pueden seleccionar de linfocitos Tⁿ , TSC^m , TC^m o TEm y combinación de los mismos.

Normalmente, también se aísla la célula inmunitaria diseñada genéticamente de un sujeto. Preferentemente, dicho sujeto padece un cáncer o corre el riesgo de padecerlo.

El antígeno diana al que se une específicamente el receptor de antígeno diseñado genéticamente se expresa preferentemente en células cancerosas y/o es un antígeno tumoral universal.

El receptor de antígeno diseñado genéticamente puede ser un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que se une específicamente al antígeno diana. El receptor de antígeno diseñado genéticamente también puede ser un receptor de linfocitos T (TCR).

Preferentemente, la actividad y/o la expresión de Suv39h1 en dicha célula inmunitaria diseñada genéticamente se inhibe o se bloquea de manera selectiva. En una realización, dicha célula inmunitaria diseñada genéticamente expresa un ácido nucleico Suv39h1 que codifica una proteína Suv39h1 no funcional.

La presente invención también se refiere a un método para producir una célula inmunitaria diseñada genéticamente que comprende una etapa que consiste en inhibir la expresión y/o la actividad de Suv39h1 en la célula inmunitaria; y una etapa que consiste en introducir en una célula inmunitaria un receptor de antígeno diseñado genéticamente que se une específicamente a un antígeno diana.

Preferentemente, la inhibición de la actividad y/o la expresión de Suv39h1 comprende contactar o poner en contacto, la célula con al menos un agente que inhibe la expresión y/o la actividad de Suv39h1 y/o la alteración del gen Suv39h1. Dicho agente se puede seleccionar entre inhibidores de moléculas pequeñas; derivados de anticuerpos, aptámeros, moléculas de ácido nucleico que bloquean la transcripción o traducción, o agentes de edición de genes.

La presente invención también se refiere a una célula inmunitaria diseñada genéticamente tal como se describe en el presente documento, o una composición que comprende dicha célula inmunitaria diseñada genéticamente, para su uso en terapia celular adoptiva, especialmente terapia adoptiva del cáncer.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluyendo anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos funcionales (de unión a antígeno), incluyendo fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rlgG), regiones de cadena pesada variable (VH) capaces de unirse específicamente al antígeno, fragmentos de anticuerpos de cadena simple, incluyendo fragmentos variables de cadena única (scFv) y anticuerpos de dominio único (por ejemplo, sdAb, sdFv, nanocuerpo). El término abarca formas de inmunoglobulinas modificadas genéticamente y/o de otro modo, tales como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, multiespecíficos, por ejemplo, biespecífico, anticuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "anticuerpo" abarca fragmentos de anticuerpos funcionales del mismo. El término también incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, incluyendo anticuerpos de cualquier clase o subclase, incluyendo IgG y sus subclases, IgM, IgE, IgA e IgD.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, aunque no de forma limitativa, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; regiones variables de cadena pesada (VH), moléculas de anticuerpos monocatenarios tales como scFv y anticuerpos simples de dominio único VH; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En realizaciones particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de cadena simple que comprenden una región de cadena pesada variable y/o una región de cadena ligera variable, tal como scFvs.

Los "anticuerpos de dominio único" son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de la cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano.

Tal como se usa en el presente documento, "represión" de la expresión génica se refiere a la eliminación o reducción de la expresión de uno o más productos génicos codificados por el gen sujeto en una célula, en comparación con el nivel de expresión del producto génico en ausencia de la represión. Los productos génicos ilustrativos incluyen ARNm y productos proteicos codificados por el gen. La represión en algunos casos es transitoria o reversible y en otros casos es permanente. La represión en algunos casos es de una proteína o ARNm funcional o de longitud completa, a pesar de que se puede producir un producto truncado o no funcional. En algunas realizaciones en el presente documento, la actividad o función génica, en contraposición a la expresión, se reprime. La represión génica es generalmente inducida por métodos artificiales, es decir, por adición o introducción de un compuesto, molécula, complejo, o composición, y/o por alteración del ácido nucleico del gen o asociado con él, tal como a nivel de ADN. Los métodos ilustrativos para la represión génica incluyen el silenciamiento génico, técnicas de reducción de expresión, inactivación génica y/o disrupción genética, tales como la edición de genes. Los ejemplos incluyen la tecnología antisentido, tal como el ARNi, el ARNip, el ARNhc y/o ribozimas, que generalmente son resultado de una reducción transitoria de la expresión, así como técnicas de edición de genes que dan como resultado la inactivación o interrupción de genes específicos, por ejemplo, por inducción de roturas y/o por recombinación homóloga.

Tal como se usa en el presente documento, una "alteración" de un gen se refiere a un cambio en la secuencia del gen, al nivel de ADN. Los ejemplos incluyen inserciones, mutaciones y deleciones. Las alteraciones dan como resultado típicamente la represión y/o la ausencia completa de expresión de un producto normal o de tipo silvestre codificado por el gen. Los ejemplos de tales alteraciones genéticas son las inserciones, cambios de marco y mutaciones sin sentido, deleciones, inserciones génicas e inactivaciones del gen o parte del gen, incluyendo deleciones de todo el gen. Tales alteraciones pueden tener lugar en la región codificante, por ejemplo, en uno o más exones, lo que da como resultado la incapacidad de producir un producto de longitud completa, un producto funcional o cualquier producto, tal como por inserción de un codón de terminación. Tales alteraciones también pueden tener lugar por alteraciones en el promotor o potenciador u otra región que afecte la activación de la transcripción, para evitar la transcripción del gen. Las alteraciones genéticas incluyen el direccionamiento genético, incluida la inactivación de genes dirigidos mediante recombinación homóloga.

Células de la invención

Las células de acuerdo con la invención son típicamente células eucariotas, tales como células de mamíferos (también denominadas en la presente invención células animales), por ejemplo, células humanas.

Más particularmente, las células de la invención provienen de la sangre, de la médula ósea, de la linfa o de órganos linfoides (en particular, el timo) y son células del sistema inmunitario (es decir, células inmunitarias), tales como las células de la inmunidad innata o adaptativa, por ejemplo, células mieloides o linfoides, incluyendo linfocitos, típicamente linfocitos T y/o linfocitos citolíticos naturales.

Preferentemente, según la invención, las células son, en particular, linfocitos, incluidos los linfocitos T, los linfocitos B y linfocitos citolíticos naturales (NK).

Las células de acuerdo con la invención también pueden ser progenitores de células inmunitarias, tales como progenitores linfoides y más preferentemente progenitores de linfocitos T.

Los progenitores de linfocitos T normalmente expresan un conjunto de marcadores de consenso que incluyen CD44, CD117, CD135 y Sca-1, pero véase también Petrie HT, Kincade PW. caminos, destino para los progenitores de células T. Journal of Experimental Medicine. 2005;202(1):11-13.

Las células suelen ser células primarias, tales como las aisladas directamente de un sujeto y/o aisladas de un sujeto y congeladas.

Con referencia al sujeto que se va a tratar, las células de la invención pueden ser alogénicas y/o autólogas.

En algunas realizaciones, las células incluyen uno o más subconjuntos de linfocitos T u otros tipos de células, tales como poblaciones de linfocitos T completas, células CD4+, células CD8+ y subpoblaciones de las mismas, tales como las definidas por su función, estado de activación, madurez, potencial de diferenciación, la expansión, recirculación, localización y/o capacidades de persistencia, especificidad de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presencia en un órgano o compartimento en particular, marcador o perfil de secreción de citoquinas, y/o grado de diferenciación.

Entre los subtipos y subpoblaciones de linfocitos T y/o de linfocitos T CD4+ y/o de T CD8+ están los linfocitos T sin exposición previa (Tⁿ ), los linfocitos T efectores (T^{e f f} ), los linfocitos T de memoria y los subtipos de los mismos, tales como las células madre T de memoria (TSC^m ), T de memoria central (TC^m ), T de memoria efectores (T^{e m} ), o linfocitos T efectores de memoria diferenciados terminalmente, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), linfocitos T inmaduros, linfocitos T maduros, linfocitos T colaboradores, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T invariantes asociados a mucosas (MAIT), linfocitos T reguladores (Treg) adaptativos y de origen natural, linfocitos T colaboradores, tales como linfocitos TH1, linfocitos TH2, linfocitos TH3, linfocitos t H17, linfocitos TH9, linfocitos TH22, linfocitos T colaboradores foliculares, linfocitos T alfa/beta y linfocitos T delta/gamma. Preferentemente, las células según la invención son linfocitos T^{e f f} propiedades de madre/memoria y mayor capacidad de reconstitución debido a la inhibición de Suv39h1, así como linfocitos Tⁿ , TSC^m , TC^m , linfocitos t E^m y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, una o más de las poblaciones de linfocitos T está enriquecida o agotada en, células que son positivas o expresan altos niveles de uno o más marcadores particulares, tales como marcadores de superficie, o que sean negativos o expresen niveles relativamente bajos de uno o más marcadores. En algunos casos, tales marcadores son los que están ausentes o se expresan a niveles relativamente bajos en ciertas poblaciones de linfocitos T (tales como las células sin memoria) pero están presentes o se expresan a niveles relativamente más altos en otras poblaciones determinadas de linfocitos T (tales como las células de memoria). En una realización, las células (tales como las células CD8+ o los linfocitos T, por ejemplo, células CD3+) se enriquecen (es decir, se seleccionan positivamente para) células que son positivas o que expresan altos niveles en superficie de CD117, CD135, CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127 y/o CD62L y/o células empobrecidas (por ejemplo, seleccionadas negativamente) que son positivas o expresan altos niveles en superficie de CD45RA. En algunas realizaciones, las células se enriquecen o se reducen en células positivas o que expresan altos niveles en superficie de CD122, CD95, CD25, CD27 y/o IL7-Ra (CD127). En algunos ejemplos, los linfocitos T CD8+ se enriquecen en células positivas para CD45RO (o negativas para CD45RA) y en CD62L.

Por ejemplo, de acuerdo con la invención, las células pueden incluir una población de linfocitos T CD4+ y/o una subpoblación de linfocitos T CD8+, por ejemplo, una subpoblación enriquecida en células de la memoria central (T^{c m} ). Como alternativa, las células pueden ser otros tipos de linfocitos, que incluyen linfocitos citolíticos naturales (NK), células MAIT, células linfoides innatas (ILC) y linfocitos B.

Las células y composiciones que contienen las células para el diseño genético de acuerdo con la invención se aíslan de una muestra, en particular una muestra biológica, por ejemplo, obtenida de o que proviene de un sujeto. Normalmente, el sujeto necesita una terapia celular (terapia celular adoptiva) y/o es el que recibirá la terapia celular. El sujeto es, preferentemente, un mamífero, especialmente un ser humano. En una realización de la invención, el sujeto tiene un cáncer.

Las muestras incluyen tejido, fluido y otras muestras tomadas directamente del sujeto, así como muestras resultantes de una o más etapas de procesamiento, tales como la separación, centrifugación, ingeniería genética (por ejemplo, transducción con vector vírico), el lavado y/o la incubación. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra que se procesa. Las muestras biológicas incluyen, pero sin limitación, fluidos corporales, tales como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluidas las muestras procesadas obtenidas de los mismos. Preferentemente, la muestra de la que se obtienen o aíslan las células es sangre o una muestra derivada de la sangre, o es o se obtiene de un producto de aféresis o leucocitaféresis. Las muestras ilustrativas incluyen sangre completa, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado al intestino, tejido linfoide asociado a mucosas, bazo, otros tejidos linfoides y/o células que provienen de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular (típicamente terapia celular adoptiva), muestras de fuentes autólogas y alogénicas.

En algunas realizaciones, las células se obtienen de líneas celulares, por ejemplo, líneas de linfocitos T. Las células también se pueden obtener de una fuente xenogénica, tal como un ratón, una rata, un primate no humano o un cerdo. Preferentemente, las células son células humanas.

Células deficientes en Suv39h1

Tal como se usa en el presente documento, el término "Suv39h1" o "H3K9-histona metiltransferasa Suv39h1" tiene su significado general en la técnica y se refiere a la histona metiltransferasa "supresora de variegación 3-9 homólogo 1 (Drosophila)" que trimetila específicamente el resto Lys-9 de la histona H3 usando H3-Lys-9 monometilada como sustrato (véase también Aagaard L, Laible G, Selenko P, Schmid M, Dorn R, Schotta G, Kuhfittig S, Wolf A, Lebersorger A, Singh PB, Reuter G, Jenuwein T (Junio de 1999). "Functional mammalian homologues of the Drosophila PEV-modifier Su(var)3-9 encode centromere-associated proteins which complex with the heterochromatin component M3 1". EMBO J 18 (7): 1923-38.). Dicha histona metiltransferasa también se conoce como MG44, KMT1A, SUV39H, SUV39H1, histonalisina N-metiltransferasa SUV39H1, H3-K9-HMTasa 1, OTTHUMP00000024298, Su(var)3-9 homólogo 1, lisina N-metiltransferasa 1A, histona H3-K9 metiltransferasa 1, variegación de efecto de posición 3-9 homólogo, histonalisina N-metiltransferasa o H3 lisina-9 específica 1. La metiltransferasa humana Suv39h1 tiene la referencia 043463 en UNIPROT y está codificada por el gen Suv39h1 ubicado en el cromosoma x (ID del gen: 6839 en el NCBI). El término Suv39h1 según la invención también abarca todos los ortólogos de SUV39H1 tales como SU(VAR)3-9.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "defectuoso para Suv39h1" según la presente invención se refiere a la inhibición o bloqueo de la actividad de Suv39h1 (es decir, la metilación de Lys-9 de histona H3 por la H3K9-histona metiltransferasa) en la célula de acuerdo con la invención.

"Inhibición de la actividad de Suv39h1" de acuerdo con la invención se refiere a una reducción de la actividad de Suv39h1 de al menos el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 % o el 99 % o más en comparación con la actividad o el nivel de la proteína Suv39h1 que no está inhibida. Preferentemente, la inhibición de la actividad de Suv39h1 lleva a la ausencia en la célula de una actividad detectable sustancial de Suv39h1.

La inhibición de la actividad de Suv39h1 también se puede lograr mediante la represión de la expresión del gen Suv39h1 o mediante la alteración del gen Suv39h1. De acuerdo con la invención, dicha represión reduce la expresión de Suv39h1 en la célula, en particular, la célula inmunitaria de la invención en al menos un 50, 60, 70, 80, 90 o 95 % con respecto a la misma célula producida por el método en ausencia de represión. La alteración del gen también puede llevar a una expresión reducida de la proteína Suv39h1 o a la expresión de una proteína Suv39h1 no funcional.

Por proteína Suv39h1 "no funcional" se entiende en el presente documento una proteína con una actividad reducida o una falta de actividad detectable tal como se describe anteriormente.

Por lo tanto, los inhibidores de la actividad de Suv39h1 en una célula según la invención se pueden seleccionar entre cualquier compuesto o agente natural o que no tenga la capacidad de inhibir la metilación de Lys-9 de la histona H3 por la H3K9-histona metiltransferasa, o inhibir la expresión del gen SUV39H1 de la H3K9-histona metiltransferasa.

La inhibición de Suv39h1 en la célula inmunitaria según la presente invención puede ser permanente e irreversible o transitoria o reversible. Sin embargo, preferentemente, la inhibición de Suv39h1 es permanente e irreversible. La inhibición de Suv39h1 en la célula se puede lograr antes o después de la inyección de la célula en el paciente diana tal como se describe a continuación.

Células diseñadas genéticamente según la invención

En algunas realizaciones, las células comprenden uno o más ácidos nucleicos introducidos mediante ingeniería genética que codifican uno o más receptores de antígenos.

Normalmente, los ácidos nucleicos son heterólogos, (es decir, por ejemplo, que normalmente no se encuentran en la célula que se está diseñando genéticamente y/o en el organismo del que se proviene dicha célula). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos no son de origen natural, incluyendo combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican diversos dominios de múltiples tipos de células diferentes.

Entre los receptores de antígenos de acuerdo con la invención se encuentran los receptores de linfocitos T diseñados genéticamente (TCR) y sus componentes, así como receptores de antígenos funcionales no de TCR, tales como los receptores de antígenos quiméricos (CAR).

Receptores de antígeno quiméricos (CAR)

En algunas realizaciones, los receptores de antígenos diseñados genéticamente comprenden receptores de antígenos quiméricos (CAR), incluidos los CAR activadores o estimulantes, los CAR coestimulantes (véase el documento WO2014/055668), y/o los CAR inhibidores (iCAR, véase Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (Diciembre, 2013)).

Los receptores de antígenos quiméricos (CAR), (también conocidos como inmunorreceptores quiméricos, receptores quiméricos de linfocitos T, receptores de linfocitos T artificiales) son receptores diseñados genéticamente, que injertan una especificidad arbitraria en una célula efectora inmunitaria (linfocito T). Normalmente, estos receptores se usan para injertar la especificidad de un anticuerpo monoclonal en un linfocito T, con la transferencia de su secuencia codificante facilitada por vectores retrovíricos.

Los CAR generalmente incluyen un dominio de unión de antígeno (o ligando) extracelular unido a uno o más componentes de señalización intracelular, en algunos aspectos a través de enlazadores y/o dominio(s) transmembrana. Tales moléculas típicamente imitan o se aproximan a una señal a través de un receptor de antígeno natural, una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador, y/o una señal a través de un receptor coestimulador solo.

En algunas realizaciones, el CAR se construye con una especificidad para un antígeno particular (o marcador o ligando), tal como un antígeno expresado en un tipo de célula particular al que se dirigirá la terapia adoptiva, tal como un marcador de cáncer. Por lo tanto, el CAR incluye normalmente en su porción extracelular una o más moléculas de unión a antígeno, tales como uno o más fragmentos de unión a antígeno, dominio, o porción, o uno o más dominios variables de anticuerpo, y/o moléculas de anticuerpo.

Los restos utilizados para unirse al antígeno se dividen en tres categorías generales, ya sea fragmentos de anticuerpos monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos, Fab' seleccionados de bibliotecas o ligandos naturales que se acoplan a su receptor afín (para los CAR de primera generación). Los ejemplos exitosos en cada una de estas categorías se documentan notablemente en Sadelain M, Brentjens R, Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. Cancer discovery. 2013; 3(4):388-398 (véase notablemente la tabla 1) y se incluyen en la presente solicitud. Los scFv que provienen de inmunoglobulinas murinas se utilizan comúnmente, ya que provienen fácilmente de anticuerpos monoclonales bien caracterizados.

Normalmente, el CAR incluye una porción de unión a antígeno o porciones de una molécula de anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que proviene de las cadenas pesada variable (VH) y ligera variable (VL) de un anticuerpo monoclonal (mAb).

En algunas realizaciones, el CAR comprende un dominio de cadena pesada de anticuerpo que se une específicamente al antígeno, tal como un marcador de cáncer o un antígeno de superficie celular de una célula o enfermedad a la que se dirige, tal como una célula tumoral o una célula cancerosa, tal como cualquiera de los antígenos diana descritos en el presente documento o conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, el CAR contiene un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) que reconoce específicamente un antígeno, tal como un antígeno intacto, expresado en la superficie de una célula.

En algunas realizaciones, el CAR contiene un anticuerpo similar al TCR, tal como un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) que reconoce específicamente un antígeno intracelular, tal como un antígeno asociado a un tumor, presentado en la superficie celular como un complejo MHC-péptido. En algunas realizaciones, un anticuerpo o una parte del mismo que se une a un antígeno que reconoce un complejo MHC-péptido se puede expresar en células como parte de un receptor recombinante, tal como un receptor de antígeno. Entre los receptores de antígenos se encuentran los receptores de antígenos funcionales que no son TCR, tal como los receptores de antígenos quiméricos (CAR). Generalmente, un CAR que contiene un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que presenta una especificidad similar a TCR dirigida contra complejos péptido-MHC también se puede denominar CAR similar a TCR.

En algunos aspectos, el componente de unión o reconocimiento específico de antígeno está unido a uno o más dominios de señalización transmembrana e intracelular. En algunas realizaciones, el CAR incluye un dominio transmembrana fusionado al dominio extracelular del CAR. En una realización, se usa el dominio transmembrana que se asocia de forma natural a uno de los dominios en el CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o se modifica mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de membrana de superficie o diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo de receptor.

El dominio transmembrana en algunas realizaciones proviene de una fuente natural o de una fuente sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivar de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. Las regiones transmembrana incluyen las derivadas de (es decir, comprenden al menos la región o regiones transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154). El dominio transmembrana también puede ser sintético.

En algunas realizaciones, un enlazador de oligopéptido o polipeptídico corto, por ejemplo, un enlazador de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, está presente y forma un enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplásmica del CAR.

El CAR incluye generalmente al menos un componente o componentes de señalización intracelular. Los CAR de primera generación normalmente tenían el dominio intracelular de la cadena Z de CD3, que es el principal transmisor de señales de los TCR endógenos. Los CAR de segunda generación típicamente comprenden además dominios de señalización intracelular de varios receptores de proteínas coestimulantes (por ejemplo, CD28, 41BB, ICOS) a la cola citoplasmática del CAR para proporcionar señales adicionales al linfocito T. Los estudios preclínicos indicaron que la segunda generación mejora la actividad antitumoral de los linfocitos T. Más recientemente, los CAR de tercera generación combinan múltiples dominios de señalización, tales como CD3z-CD28-41BB o CD3z-CD28-OX40, para aumentar la potencia.

Por ejemplo, el CAR puede incluir un componente intracelular del complejo TCR, tal como una cadena CD3+ de TCR que media la activación y citotoxicidad de los linfocitos T, por ejemplo, la cadena zeta de CD3. Por lo tanto, en algunos aspectos, la molécula de unión a antígeno se une a uno o más módulos de señalización celular. En algunas realizaciones, los módulos de señalización celular incluyen el dominio transmembrana de CD3, los dominios de señalización intracelular de CD3 y/u otros dominios transmembrana de CD. El CAR también puede incluir además una porción de una o más moléculas adicionales como el receptor Fc y, CD8, CD4, CD25 o CD16.

En algunas realizaciones, tras la unión del CAR, el dominio citoplásmico o el dominio de señalización intracelular del CAR activa al menos una de las funciones efectoras normales o respuestas de la correspondiente célula inmunitaria sin diseño genético (normalmente un linfocito T). Por ejemplo, el CAR puede inducir una función de un linfocito T, tal como la actividad citolítica o la actividad de los linfocitos T colaboradores, la secreción de citocinas u otros factores.

En algunas realizaciones, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplásmicas del receptor de linfocitos T (TCR) y, en algunos aspectos, también las de los correceptores que, en el contexto natural, actúan en concierto con dicho receptor para iniciar la transducción de señales después de la participación del receptor del antígeno, y/o cualquier derivado o variante de dichas moléculas, y/o cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.

La activación de los linfocitos T se describe en algunos aspectos como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmáticas primarias) y las que actúan de forma independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmicas secundarias). En algunos aspectos, el CAR incluye uno o ambos componentes de señalización.

En algunos aspectos, el CAR incluye una secuencia de señalización citoplásmica primaria que regula la activación primaria del complejo TCR ya sea de forma estimulante o de forma inhibidora. las secuencias de señalización citoplásmicas primarias que actúan de manera estimulante pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina o ITAM. Ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplásmicas primarias incluyen las derivadas de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CDS, c D22, CD79a, CD79b y CD66d. En algunas realizaciones, las moléculas de señalización citoplasmática en el CAR contienen un dominio de señalización citoplásmica, porción del mismo, o secuencia derivada de CD3 zeta.

El CAR también puede incluir un dominio de señalización y/o una porción transmembrana de un receptor coestimulador, tal como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. En algunos aspectos, el mismo CAR incluye tanto el componente activador como el coestimulador; como alternativa, el dominio de activación lo proporciona un CAR, mientras que el componente coestimulador lo proporciona otro CAR que reconoce otro antígeno.

El CAR u otro receptor de antígeno también puede ser un CAR inhibidor (por ejemplo, ICAR) e incluye componentes intracelulares que amortiguan o suprimen una respuesta, tal como una respuesta inmunitaria. Ejemplos de tales componentes de señalización intracelular son los que se encuentran en las moléculas de puntos de control inmunitario, incluyendo PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, los receptores PGE2, los receptores de adenosina EP2/4, incluido A2AR. En algunos aspectos, la célula diseñada genéticamente incluye un CAR inhibidor que incluye un dominio de señalización de dicha molécula inhibidora o derivado de ella, de modo que sirva para amortiguar la respuesta del. Estos CAR se utilizan, por ejemplo, para reducir la probabilidad de efectos colaterales cuando el antígeno es reconocido por el receptor activador, por ejemplo, CAR, también se expresa, o también se puede expresar, sobre la superficie de las células normales.

TCR

En algunas realizaciones, los receptores de antígenos diseñados genéticamente incluyen receptores de linfocitos T recombinantes (TCR) y/o TCR clonados a partir de linfocitos T de origen natural.

Un "receptor de linfocitos T" o "TCR" se refiere a una molécula que contiene cadenas a y p variables (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente) o cadenas y y 6 variables (también conocidas como TCRy y TCR5, respectivamente) y que es capaz de unirse específicamente a un péptido antigénico unido a un receptor de MHC. En algunas realizaciones, el TCR está en forma ap. Normalmente, Los TCR que existen en formas ap y y6 son generalmente estructuralmente similares, pero los linfocitos T que los expresan pueden tener distintas ubicaciones o funciones anatómicas. Un TCR se puede encontrar en la superficie de una célula o en forma soluble. Generalmente, un TCR se encuentra en la superficie de las células T (o linfocitos T) donde generalmente es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). En algunas realizaciones, un TCR también puede contener un dominio constante, un dominio transmembrana y/o una cola citoplasmática corta (véase, por ejemplo, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3a Ed., Current Biology Publications, p.4:33, 1997). Por ejemplo, en algunos aspectos, cada cadena del TCR puede poseer un dominio variable de inmunoglobulina en N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta en el extremo C-terminal. En algunas realizaciones, un TCR se asocia con proteínas invariantes del complejo CD3 implicadas en la mediación de la transducción de señales. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "TCR" abarca fragmentos de TCR funcionales del mismo. El término también incluye TCR intactos o de longitud completa, incluyendo TCR en la forma ap o y6.

Por lo tanto, para los fines del presente documento, la referencia a un TCR incluye cualquier TCR o fragmento funcional, tal como una porción de unión a antígeno de un TCR que se une a un péptido antigénico específico unido en una molécula de MHC, es decir, complejo MHC-péptido. Una "porción de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un TCR, que se puede utilizar indistintamente, se refiere a una molécula que contiene una parte de los dominios estructurales de un t Cr , pero que se une al antígeno (por ejemplo, complejo MHC-péptido) al que se une el TCR completo. En algunos casos, una porción de unión a antígeno contiene los dominios variables de un TCR, tales como la cadena a variable y la cadena p variable de un TCR, suficiente para formar un sitio de unión para unirse a un complejo MHC-péptido específico, tal como generalmente donde cada cadena contiene tres regiones determinantes de complementariedad.

En algunas realizaciones, los dominios variables de las cadenas de TCR se asocian para formar bucles o regiones determinantes de complementariedad (CDR) análogas a las inmunoglobulinas, que confieren reconocimiento de antígeno y determinan la especificidad del péptido formando el sitio de unión de la molécula de TCR y determinan la especificidad del péptido. Normalmente, como las inmunoglobulinas, las CDR están separadas por regiones marco (FR) {véase, por ejemplo, Jores et al., Pwc. Nat'lAcad. Sci. EE.UU. 87:9138, 1990; Chothia et al., EM-BO J. 7:3745, 1988; véase también Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). En algunas realizaciones, la CDR3 es la principal CDR responsable de reconocer el antígeno procesado, aunque también se ha demostrado que la CDR1 de la cadena alfa interactúa con la parte N-terminal del péptido antigénico, mientras que la CDR1 de la cadena beta interactúa con la parte C-terminal del péptido. Se cree que CDR2 reconoce la molécula del MHC. En algunas realizaciones, la región variable de la cadena p puede contener otra región de hipervariabilidad (HV4).

En algunas realizaciones, las cadenas de TCR contienen un dominio constante. Por ejemplo, como las inmunoglobulinas, la porción extracelular de las cadenas de TCR (por ejemplo, cadena a, cadena p) puede contener dos dominios de inmunoglobulina, un dominio variable (por ejemplo, Va o Vp; típicamente los aminoácidos 1 a 116 basados en la numeración de Kabat, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5a ed.) en el extremo N-terminal, y un dominio constante (por ejemplo, dominio constante de cadena a o Ca, típicamente los aminoácidos 117 a 259 basados en Kabat, dominio constante de cadena p o Cp, normalmente los aminoácidos 117 a 295 basados en Kabat) adyacentes a la membrana celular. Por ejemplo, en algunos casos, la porción extracelular del TCR formada por las dos cadenas contiene dos dominios constantes proximales a la membrana y dos dominios variables distales que contienen CDR. El dominio constante del dominio TCR contiene secuencias de conexión cortas en las que un resto de cisteína forma un enlace disulfuro, haciendo enlace entre las dos cadenas. En algunas realizaciones, un TCR puede tener un resto de cisteína adicional en cada una de las cadenas a y p de manera que el TCR contiene dos enlaces disulfuro en los dominios constantes.

En algunas realizaciones, las cadenas de TCR pueden contener un dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana está cargado positivamente. En algunos casos, las cadenas de TCR contienen una cola citoplásmica. En algunos casos, la estructura permite que el TCR se asocie con otras moléculas como CD3. Por ejemplo, un TCR que contiene dominios constantes con una región transmembrana puede anclar la proteína en la membrana celular y asociarse con subunidades invariantes del aparato o complejo de señalización de CD3.

Generalmente, CD3 es un complejo de múltiples proteínas que puede poseer tres cadenas distintas (y, 8 y £) en mamíferos y la cadena Z. Por ejemplo, en los mamíferos, el complejo puede contener una cadena CD3y, una cadena CD35, dos cadenas CD3s y un homodímero de cadenas CD3Z. Las cadenas CD3y, CD35 y CD3s son proteínas de la superficie celular muy relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas que contienen un solo dominio de inmunoglobulina. Las regiones transmembrana de las cadenas CD3y, CD35 y CD3 están cargadas negativamente, lo que es una característica que permite que estas cadenas se asocien con las cadenas receptoras de linfocitos T cargadas positivamente. Las colas intracelulares de las cadenas CD3y, CD35 y CD3s contienen cada una un único motivo conservado conocido como motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM, mientras que cada cadena CD3Z tiene tres. Generalmente, Los ITAM participan en la capacidad de señalización del complejo t Cr . Estas moléculas accesorias tienen regiones transmembrana cargadas negativamente y desempeñan un papel en la propagación de la señal del TCR al interior de la célula. Las cadenas CD3 y Z, junto con el t Cr , forman lo que se conoce como el complejo receptor de linfocitos T.

En algunas realizaciones, el TCR puede ser un heterodímero de dos cadenas a y p (u opcionalmente y y 8) o puede ser una construcción de TCR de cadena sencilla. En algunas realizaciones, el t Cr es un heterodímero que contiene dos cadenas separadas (cadenas a y p o cadenas y y 8) que están unidas, tal como por un enlace disulfuro o enlaces disulfuro.

Los receptores de antígenos ilustrativos, incluidos los CAR y los TCR recombinantes, así como métodos para diseñar e introducir los receptores en las células, incluyen los descritos, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente internacional números WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, los números de publicación de solicitud de patente de EE.UU. US2002131960, US2013287748, US20130149337,

las patentes de EE.UU. N.°: 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353 y 8.479.118, y la solicitud de patente europea número EP2537416, y/o las descritas por Sadelain et al., Cancer Discov. abril de 2013; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., octubre de 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 18 de marzo de 2012 (2): 160-75. En algunos aspectos, los receptores de antígeno diseñados genéticamente incluyen un CAR tal como se describe en la Patente de Ee .UU. N.°: 7.446.190 y los descritos en la publicación de solicitud de patente internacional N.°: WO/2014055668 A1.

Antígenos

Entre los antígenos dirigidos por los receptores de antígenos diseñados genéticamente se encuentran los expresados en el contexto de una enfermedad, afección o tipo de célula a la que se dirigirá a través de la terapia celular adoptiva.

Entre las enfermedades y afecciones se encuentran las enfermedades y trastornos proliferativos, neoplásicos y malignos, más particularmente cánceres.

El cáncer puede ser un cáncer sólido o un "tumor líquido", como los cánceres que afectan a la sangre, la médula ósea y el sistema linfoide, también conocidos como tumores de los tejidos hematopoyéticos y linfoides, que incluyen principalmente leucemia y linfoma. Los tumores líquidos incluyen, por ejemplo, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA) y leucemia linfoblástica crónica (LLC), (incluidos varios linfomas tales como el linfoma de células del manto, linfoma no Hodgkin (LNH), adenoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de laringe, cánceres de vesícula biliar y conducto biliar, cánceres de retina tales como retinoblastoma).

Los cánceres sólidos incluyen en particular los cánceres que afectan a uno de los órganos seleccionados del grupo que consiste en colon, recto, piel, endometrio, pulmón (incluido el carcinoma de pulmón no microcítico), útero, huesos (tales como osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, fibrosarcoma, tumor de células gigantes, adamantinomas y cordomas), hígado, riñón, esófago, estómago, vejiga, páncreas, cuello uterino, cerebro (tales como meningiomas, glioblastomas, astrocitomas de grado inferior, oligodendrocitomas, tumores hipofisarios, schwannomas y cánceres cerebrales metastásicos), ovario, mama, región de cabeza y cuello, testículos, próstata y la glándula tiroides.

Preferentemente, un cáncer de acuerdo con la invención es un cáncer que afecta a la sangre, la médula ósea y el sistema linfoide tal como se describió anteriormente. Normalmente, el cáncer es, o está asociado, con el mieloma múltiple.

Las enfermedades de acuerdo con la invención también comprenden enfermedades o afecciones infecciosas, tales como, pero sin limitación, infecciones de virus, retrovirus, bacterias y protozoos, inmunodeficiencia, citomegalovirus (CMV), virus Epstein Barr (EBV), adenovirus, poliomavirus BK; enfermedades o afecciones autoinmunes o inflamatorias, tales como artritis, por ejemplo, artritis reumatoide (AR), diabetes de tipo I, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad inflamatoria intestinal, soriasis, esclerodermia, enfermedad del tiroides autoinmunitaria, enfermedad de Graves, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, asma y/o enfermedades o afecciones asociadas con el trasplante.

En algunas realizaciones, el antígeno es un polipéptido. En algunas realizaciones, es un carbohidrato u otra molécula. En algunas realizaciones, el antígeno se expresa o se sobreexpresa selectivamente en las células de la enfermedad o afección, por ejemplo, el tumor o las células patógenas, en comparación con células o tejidos normales o no diana. En otras realizaciones, el antígeno se expresa en células normales y/o se expresa en células diseñadas genéticamente. En algunas de estas realizaciones, se usa un enfoque de multidireccionamiento y/o alteración de genes tal como se proporciona en el presente documento para mejorar la especificidad y/o la eficacia.

En algunas realizaciones, el antígeno es un antígeno tumoral universal. La expresión "antígeno tumoral universal" se refiere a una molécula inmunogénica, tal como una proteína, es decir, generalmente, se expresa a un nivel mayor en células tumorales que en células no tumorales y también se expresa en tumores de diferentes orígenes. En algunas realizaciones, el antígeno tumoral universal se expresa en más del 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o más de cánceres humanos. En algunas realizaciones, el antígeno tumoral universal se expresa en al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho o más tipos diferentes de tumores. En algunos casos, el antígeno tumoral universal se puede expresar en células no tumorales, tales como las células normales, pero a niveles inferiores a los que se expresa en las células tumorales. En algunos casos, el antígeno tumoral universal no se expresa en absoluto en células no tumorales, de tal manera que no se expresa en células normales. Los antígenos tumorales universales ilustrativos incluyen, por ejemplo, transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT), survivina, homólogo de ratón doble minuto 2 (MDM2), citocromo P4501B1 (CYP1B), HER2/neu, gen del tumor de Wilms 1 (WT1), livina, alfafetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), mucina 16 (MUC16), MUC1, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), p53 o ciclina (DI). Los epítopos peptídicos de antígenos tumorales, incluidos los antígenos tumorales universales, son conocidos en la técnica y, en algunos aspectos, se pueden utilizar para generar receptores de antígenos restringidos por el MHC, tales como TCR o CAR similares a Tc R (véanse, por ejemplo, la solicitud PCT publicada n.° WO2011009l73 o WO2012135854 y la solicitud estadounidense publicada n.° US20140065708).

En algunos aspectos, el antígeno se expresa en mieloma múltiple, tales como CD38, CD138 y/o CS-1. Otros antígenos ilustrativos de mieloma múltiple incluyen CD56, TIM-3, CD33, CD 123 y/o CD44. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos dirigidos contra dichos antígenos son conocidos e incluyen, por ejemplo, los descritos en la patente de EE.UU. n.° 8.153.765; 8.603477, 8.008.450; Solicitud publicada en los Estados Unidos N.° US20120189622; y las solicitudes PCT internacionales publicadas N.° WO2006099875, WO2009080829 o WO2012092612. En algunas realizaciones, tales anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, scFv) se pueden usar para generar un CAR.

En algunas realizaciones, el antígeno puede ser uno que se exprese o se regule positivamente en células cancerosas o tumorales, pero que también se puede expresar en una célula inmunitaria, tal como un linfocito T en reposo o activado. Por ejemplo, en algunos casos, la expresión de hTERT, survivina y otros antígenos tumorales universales se ha documentado que está presente en los linfocitos, incluyendo linfocitos T activados (véase, por ejemplo, Weng et al. (1996) J Exp. Med., 183:2471-2479; Hathcock et al. (1998) J Immunol, 160:5702-5706; Liu et al. (1999) Proc. Natl Acad Sci., 96:5147-5152; Turksma et al. (2013) Journal of Translational Medicine, 11: 152). Análogamente, en algunos casos, CD38 y otros antígenos tumorales también se pueden expresar en células inmunitarias, tales como linfocitos T, de tal manera que se regulan positivamente en linfocitos T activados. Por ejemplo, en algunos aspectos, CD38 es un marcador conocido de activación de linfocitos T.

En algunas realizaciones tal como se proporcionan en el presente documento, una célula inmunitaria, tal como un linfocito T, se puede diseñar genéticamente para reprimir o alterar el gen que codifica el antígeno en la célula inmunitaria de modo que el receptor de antígeno modificado genéticamente expresado no se una específicamente al antígeno en el contexto de su expresión en la propia célula inmunitaria. Por lo tanto, en algunos aspectos, esto puede evitar efectos colaterales, tales como la unión de las células inmunitarias diseñadas genéticamente a sí mismas, que puede reducir la eficacia del diseño genético en las células inmunitarias, por ejemplo, en relación con la terapia celular adoptiva.

En algunas realizaciones, como en el caso de un CAR inhibidor, la diana es un marcador no de diana, tal como un antígeno que no se expresa en la célula enferma o en la célula a la que se dirige, pero que se expresa en una célula normal o no enferma que también expresa una diana específica de la enfermedad que está dirigida por un receptor activador o estimulante en la misma célula diseñada genéticamente. Ejemplos de tales antígenos son moléculas del MHC, tales como las moléculas del MHC de clase I, por ejemplo, en relación con el tratamiento de enfermedades o afecciones en las que dichas moléculas se regulan negativamente pero permanecen expresadas en células no diana.

En algunas realizaciones, las células inmunitarias diseñadas genéticamente pueden contener un antígeno que se dirige a uno o más de otros antígenos. En algunas realizaciones, el uno o más de otros antígenos es un antígeno tumoral o un marcador de cáncer. Otro antígeno dirigido por receptores de antígeno en las células inmunitarias proporcionadas puede, en algunas realizaciones, incluir el receptor de tirosina quinasa huérfano ROR1, tEGFR, Her2, LI-CAM, CD19, Cd 20, CD22, mesotelina, CEA y el antígeno de superficie de la hepatitis B, receptor anti-folato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 o 4, FBP, receptor de aceticolina e fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión de células LI, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, ephrinB2, CD 123, CS-1, c-Met, GD-2 y MAGE A3, CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), una ciclina, tal como ciclina Al (CCNA1) y/o moléculas biotiniladas y/o moléculas expresadas por el VIH, HCV, VHB u otros patógenos.

En algunas realizaciones, el CAR se une a un antígeno específico de patógeno. En algunas realizaciones, el CAR es específico para antígenos víricos (como el VIH, HCV, HBV, etc.), antígenos bacterianos y/o antígenos parasitarios.

En algunas realizaciones, las células de la invención están diseñadas genéticamente para expresar dos o más receptores diseñados genéticamente en la célula, cada uno reconoce un antígeno diferente y típicamente cada uno incluye un componente de señalización intracelular diferente. Estas estrategias de direccionamiento múltiple se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Internacional, N.° de publicación: WO 2014055668 A1 (que describe combinaciones de CAR activadores y coestimuladores, por ejemplo, que se dirigen a dos antígenos diferentes presentes individualmente fuera de la diana, por ejemplo, células normales, pero presentes juntos solo en las células de la enfermedad o afección a tratar) y Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (diciembre de 2013) (que describe células que expresan un CAR activador e inhibidor, tales como aquellos en los que el CAR activador se une a un antígeno expresado tanto en células normales como no enfermas y en células de la enfermedad o afección a tratar, y el CAR inhibidor se une a otro antígeno expresado solo en las células normales o células que no se desea tratar).

En algunos contextos, la sobreexpresión de un factor estimulante (por ejemplo, una linfocina o una citocina) puede ser tóxica para un sujeto. Por lo tanto, en algunos contextos, las células diseñadas genéticamente incluyen segmentos de genes que hacen que las células sean susceptibles a la selección negativa in vivo, tal como tras la administración en inmunoterapia adoptiva. Por ejemplo, en algunos aspectos, las células están genéticamente diseñadas para que se puedan eliminar como resultado de un cambio en la afección in vivo del paciente al que se administran. El fenotipo seleccionable negativo puede ser resultado de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes seleccionables negativos incluyen el gen de la timidina quinasa tipo I del virus del herpes simple (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell II: 223, 1977) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la hipoxantina fosforribosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforribosiltransferasa celular (APRT), citosina desaminasa bacteriana, (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:33 (1992)).

En otras realizaciones de la invención, las células, por ejemplo, linfocitos T, no están diseñadas genéticamente para expresar receptores recombinantes, sino que incluyen receptores de antígenos de origen natural específicos para los antígenos deseados, tales como linfocitos infiltrantes de tumores y/o linfocitos T cultivados in vitro o ex vivo, por ejemplo, durante la(s) etapa(s) de incubación, para promover la expansión de células que tienen una especificidad de antígeno particular. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células se producen para la terapia celular adoptiva mediante el aislamiento de linfocitos T específicos de tumores, por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumores autólogos (TIL). El direccionamiento directo de tumores humanos utilizando linfocitos infiltrantes de tumores autólogos puede, en algunos casos, mediar en la regresión tumoral (véase Rosenberg SA, et al.(1988) N Engl J Med. 319: 1676-1680). En algunas realizaciones, los linfocitos se extraen de los tumores extirpados. En algunas realizaciones, tales linfocitos se expanden in vitro. En algunas realizaciones, tales linfocitos se cultivan con linfocinas (por ejemplo, IL-2). En algunas realizaciones, tales linfocitos median en la lisis específica de células tumorales autólogas pero no en células tumorales autólogas o autólogas normales.

Entre los ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo, los genes de introducción son los que mejoran la eficacia de la terapia, tal como promoviendo la viabilidad y/o función de las células transferidas; genes para proporcionar un marcador genético para la selección y/o evaluación de las células, tales como para evaluar la supervivencia o localización in vivo; genes para mejorar la seguridad, por ejemplo, haciendo que la célula sea susceptible a la selección negativa in vivo tal como lo describe Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); y Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); véanse también las publicaciones PCT/US91/08442 y Pc T/Us 94/05601 de Lupton et al. que describen el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales obtenidos de la fusión de un marcador seleccionable positivo dominante con un marcador seleccionable negativo. Véanse, por ejemplo, Riddell et al., patente de Estados Unidos n.° 6.040.177, en las columnas 14-17.

Método de obtención de células de acuerdo con la invención

La presente invención también se refiere a un método para producir una célula inmunitaria modificada o diseñada genéticamente, que comprende una etapa que consiste en inhibir la expresión y/o la actividad de Suv39h1 en la célula inmunitaria.

Preferentemente, el método para obtener células según la invención comprende además una etapa que consiste en introducir en dichas células inmunitarias un receptor de antígeno modificado genéticamente que se une específicamente a un antígeno diana.

La inhibición de la expresión y/o actividad de Suv39h1 y la introducción de un receptor de antígeno diseñado genéticamente que se une específicamente a un antígeno diana en la célula inmunitaria se puede llevar a cabo de forma simultánea o secuencial en cualquier orden.

Inhibición de Suv39h1

De acuerdo con la invención, la célula inmunitaria diseñada genéticamente se puede poner en contacto con al menos un agente que inhibe o bloquea la expresión y/o la actividad de Suv39h1.

Dicho agente se puede seleccionar entre inhibidores de moléculas pequeñas; derivados de anticuerpos tales como intracuerpos, nanocuerpos o aficuerpos que normalmente bloquean o inhiben la expresión o la actividad de Suv39h1; aptámeros que normalmente bloquean o inhiben la expresión o la actividad de Suv39h1; moléculas de ácido nucleico que bloquean la transcripción o la traducción, tales como moléculas antisentido complementarias a Suv39h1; agentes que interfieren con el ARN (como un ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN de horquilla pequeña (ARNhc), micro-ARN (miARN) o piwiARN (piARN); ribozimas y una combinación de los mismos.

El al menos un agente también puede ser un ácido nucleico exógeno que comprende a) un ARN guía de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR, por sus siglas en inglés), diseñado genéticamente, de origen no natural, que hibrida con la secuencia de ácido nucleico genómico de Suv39h1 y/o b) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína CRISPR (típicamente una proteína Cas9 de tipo II), en la que opcionalmente las células son transgénicas para expresar una proteína Cas9. El agente también puede ser una proteína de dedo de zinc (ZFN) o una proteína TAL.

La expresión "molécula orgánica pequeña" se refiere a una molécula de un tamaño comparable a las moléculas orgánicas generalmente utilizadas en productos farmacéuticos. El término excluye macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etc.). Las moléculas orgánicas pequeñas preferidas varían en tamaño hasta aproximadamente 5000 Da, más preferentemente hasta 2000 Da, y lo más preferentemente hasta aproximadamente 1000 Da.

En una realización particular, el inhibidor de H3K9 -histona metiltransferasa SUV39H1 es la quetocina (CAS 28097­ 03-2) tal como lo describe Greiner D, Bonaldi T, Eskeland R, Roemer E, Imhof A. "Identification of a specific inhibitor of the histone methyltransferase SU(VAR)3-9". Nat Chem Biol. Agosto de 2005;I(3): 143-5.; Weber, H. P., et al, "The molecular structure and absolute configuration of chaetocin", Acta Cryst, B28, 2945-2951 (1972); Udagawa, S., et al, "The production of chaetoglobosins, sterigmatocystin, O-methylsterigmatocystin, and chaetocin by Chaetomium spp. and related fungi", Can. J. microbiol, 25, 170-177 (1979); y Gardiner, D. M., et al, "The epipolythiodioxopiperazine (ETP) class of fungal toxins: distribution, mode of action, functions and biosynthesis", Microbiol, 151, 1021-1032 (2005). Por ejemplo, la quetocina está comercialmente disponible de Sigma Aldrich.

Un inhibidor de Suv39h1 también puede ser ETP69 (Rac-(3S,6S,7S,8aS)-6-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-2,3,7-trimetil-1,4-dioxohexahidro-6H-3,8a-epiditiopirrolo[1,2-a]pirazina-7-carbonitrilo), un análogo racémico del alcaloide epiditiodicetopiperazina quetocina A (véase WO2014066435 pero véase también Baumann M, Dieskau AP, Loertscher BM, et al. Tricyclic Analogues of Epidithiodioxopiperazine Alkaloids with Promising In Vitro and In Vivo Antitumor Activity. Chemical science (Royal Society of Chemistry: 2010). 2015;6:4451-4457, y Snigdha S, Prieto GA, Petrosyan A, et al. H3K9me3 Inhibition Improves Memory, Promotes Spine Formation, and Increases BDNF Levels in the Aged Hippocampus. The Journal of Neuroscience. 2016;36(12):3611-3622).

La actividad inhibidora de un compuesto se puede determinar usando varios métodos tal como se describe en Greiner D. Et al. Nat Chem Biol. Agosto de 2005;I(3): 143-5 o Eskeland, R. et al. Biochemistry 43, 3740-3749 (2004).

La inhibición de Suv39h1 en la célula se puede lograr antes o después de la inyección en el paciente diana. En alguna realización, se realiza la inhibición tal como se definió previamente in vivo después de la administración de la célula al sujeto. Normalmente, un inhibidor de Suv39h1 tal como se define en el presente documento se puede incluir en la composición que contiene la célula. Suv39h1 también se puede administrar por separado antes, concomitantemente o después de la administración de la(s) célula(s) al sujeto.

Normalmente, la inhibición de Suv39h1 de acuerdo con la invención se puede lograr con la incubación de una célula de acuerdo con la invención con una composición que contiene al menos un inhibidor farmacológico tal como se describió previamente. El inhibidor se incluye durante la expansión de los linfocitos T antitumorales in vitro, modificando así su reconstitución, supervivencia y eficacia terapéutica tras la transferencia adoptiva.

La inhibición de Suv39h1 en una célula según la invención se puede lograr con intracuerpos. Los intracuerpos son anticuerpos que se unen intracelularmente a su antígeno después de ser producidos en la misma célula (para una revisión, véase, por ejemplo, Marschall AL, Dübel S and Boldicke T "Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies", MAbs. 2015;7(6):1010-35. pero véase también Van Impe K, Bethuyne J, Cool S, Impens F, Ruano-Gallego D, De Wever O, Vanloo B, Van Troys M, Lambein K, Boucherie C, et al. "A nanobody targeting the F-actin capping protein CapG restrains breast cancer metastasis". Breast Cancer Res 2013; 15:R116; Hyland S, Beerli RR, Barbas Cf , Hynes NE, Wels W. "Generation and functional characterization of intracellular antibodies interacting with the kinase domain of human EGF receptor. Oncogene 2003; 22:1557-67"; Lobato MN, Rabbitts TH. "Intracellular antibodies and challenges facing their use as therapeutic agents". Trends Mol Med 2003; 9:390-6, y Donini M, Morea V, Desiderio A, Pashkoulov D, Villani ME, Tramontano A, Benvenuto E. "Engineering stable cytoplasmic intrabodies with designed specificity". J Mol Biol. 4 de julio de 2003;330(2):323-32.).

Los intracuerpos se pueden generar clonando el ADNc respectivo de un clon de hibridoma existente o más convenientemente, se pueden seleccionar nuevos scFv/Fab de técnicas de presentación in vitro, como la presentación de fagos, que proporcionan el gen necesario que codifica el anticuerpo desde el inicio y permiten un prediseño más detallado de la especificidad fina del anticuerpo. Además, se puede emplear la presentación en superficie de células bacterianas, de levadura, de mamífero y la presentación de ribosomas. Sin embargo, el sistema de presentación in vitro más comúnmente utilizado para la selección de anticuerpos específicos es la presentación en fagos. En un procedimiento llamado inmunopurificación (panning) (selección de afinidad), los fagos de anticuerpos recombinantes se seleccionan mediante incubación del repertorio de fagos de anticuerpos con el antígeno. Este proceso se repite varias veces dando lugar a repertorios de anticuerpos enriquecidos que comprenden aglutinantes de antígenos específicos para casi cualquier posible diana. Hasta la fecha, las bibliotecas de anticuerpos humanos recombinantes ensambladas in vitro ya han producido miles de nuevos fragmentos de anticuerpos recombinantes. Cabe señalar que el requisito previo para la reducción de la expresión de una proteína específica por un intracuerpo citoplasmático es que el antígeno se neutralice/inactive mediante la unión del anticuerpo. Han surgido cinco enfoques diferentes para generar anticuerpos adecuados: 1) Selección in vivo de intracuerpos funcionales en eucariotas tales como levadura y en procariotas tales como E. coli (dependiente e independiente de antígeno); 2) generación de proteínas de fusión de anticuerpos para mejorar la estabilidad citosólica; 3) uso de estructuras especiales para mejorar la estabilidad citosólica (por ejemplo, mediante injerto de CDR o introducción de CDR sintéticas en estructuras de anticuerpos estables); 4) uso de anticuerpos de dominio único para mejorar la estabilidad citosólica; y 5) selección de intracuerpos estables libres de enlaces disulfuro. Estos enfoques se detallan notablemente en Marschall, A. L et al., mAbs 2015 tal como se mencionó anteriormente.

El formato más utilizado para intracuerpos es el scFv, que consiste en el dominio de anticuerpo variable de la cadena L de mano (VH y VL) que se mantiene unido por una secuencia enlazadora corta y flexible (frecuentemente (Gly4Ser)3), para evitar la necesidad de expresión y ensamblaje separados de las 2 cadenas de anticuerpos de una molécula de IgG o Fab. Como alternativa, se ha utilizado el formato Fab que comprende adicionalmente el dominio C1 de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera. Recientemente, se ha descrito un nuevo formato posible para intracuerpos, el scFab. El formato scFab promete una subclonación más sencilla de los genes Fab disponibles en el vector de expresión intracelular, pero queda por ver si esto proporciona alguna ventaja sobre el formato scFv bien establecido. Además de scFv y Fab, se han utilizado formatos biespecíficos como intracuerpos. Un anticuerpo biespecífico Tie-2 x VEGFR-2 dirigido al RE demostró una semivida prolongada en comparación con los anticuerpos monoespecíficos homólogos. Se ha desarrollado un intracuerpo transmembrana biespecífico como un formato especial para reconocer simultáneamente epítopos intra y extracelulares del factor de crecimiento epidérmico, combinando las distintas características de los anticuerpos monoespecíficos relacionados, es decir, inhibición de la autofosforilación y unión de ligandos.

Otro formato de intracuerpo particularmente adecuado para la expresión citoplásmica son los anticuerpos de dominio único (también llamados nanocuerpos) que provienen de camellos o que consisten en un dominio VH humano o un dominio VL humano. Estos anticuerpos de dominio único a menudo tienen propiedades ventajosas, por ejemplo, alta estabilidad; buena solubilidad; facilidad de clonación y selección de bibliotecas; alto rendimiento de expresión en E. coli y levadura.

El gen de intracuerpo se puede expresar dentro de la célula diana después de la transfección con un plásmido de expresión o la transducción vírica con un virus recombinante. Normalmente, la elección tiene como objetivo proporcionar niveles óptimos de transfección y producción de intracuerpos. La transfección exitosa y la posterior producción de intracuerpos se puede analizar mediante la detección por inmunotransferencia del anticuerpo producido, pero, para la evaluación de la correcta interacción intracuerpo/antígeno, se puede utilizar la coinmunoprecipitación de extractos de células HEK 293 cotransfectadas transitoriamente con el antígeno correspondiente y los plásmidos de expresión de intracuerpos.

La inhibición de Suv39h1 en una célula según la invención también se puede efectuar con aptámeros que inhiben o bloquean la expresión o actividad de Suv39h1. Los aptámeros son una clase de molécula que representa una alternativa a los anticuerpos en términos de reconocimiento molecular. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos (ADN o ARN) u oligopéptidos con la capacidad de reconocer prácticamente cualquier clase de moléculas diana con elevada afinidad y especificidad.

Los aptámeros de oligonucleótidos se pueden aislar a través de evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial (SELEX; del inglés, Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) de una biblioteca de secuencias aleatorias, tal como se describe en Tuerk C. y Gold L., 1990. La biblioteca de secuencias aleatorias puede obtenerse mediante síntesis química combinatoria de ADN. En esta biblioteca, cada miembro es un oligómero lineal, modificado químicamente con el tiempo, de una secuencia única. Las posibles modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moléculas se han revisado en Jayasena S.D., 1999.

Los aptámeros peptídicos consisten en regiones variables de anticuerpos conformacionalmente restringidas presentadas en una plataforma proteica, tal como tiorredoxina A de E. coli que se selecciona de bibliotecas combinatorias mediante dos métodos híbridos (Colas P, Cohen B, Jessen T, Grishina I, McCoy J, Brent R. "Genetic selection of peptide aptamers that recognize and inhibit cyclin-dependent kinase 2". Nature. 11 de abril de 1996;380(6574):548-50).

La inhibición de Suv39h1 en una célula de acuerdo con la invención también se puede efectuar con moléculas de aficuerpos. Los aficuerpos son pequeñas proteínas diseñadas para unirse a una gran cantidad de proteínas o péptidos diana con alta afinidad, que imitan anticuerpos monoclonales y, por lo tanto, son miembros de la familia de miméticos de anticuerpos (véase, para revisión, Lofblom J, Feldwisch J, Tolmachev V, Carlsson J, Stahl S, Frejd FY. Affibody molecules: engineered proteins for therapeutic, diagnostic and biotechnological applications. FEBS Lett. 18 de junio de 2010;584(12):2670-80). Las moléculas de aficuerpos se basan en una variante diseñada genéticamente (el dominio Z) del dominio B en las regiones de unión a inmunoglobulinas de la proteína A estafilocócica, con enlace específico para teóricamente cualquier diana dada. Las bibliotecas de moléculas de aficuerpos se construyen generalmente mediante aleatorización combinatoria de 13 posiciones de aminoácidos en las hélices uno y dos que comprenden la superficie de unión a Fc original del dominio Z. Las bibliotecas se han presentado típicamente en fagos, seguido de bioinmunopurificación (biopanning) contra las dianas deseadas. Si la afinidad del primario aumentara, la maduración de la afinidad generalmente da como resultado aglutinantes mejorados y se puede lograr mediante reordenación de hélice o alineación de secuencia combinada con mutagénesis combinatoria dirigida. Las moléculas recientemente identificadas con su superficie de unión alterada generalmente mantienen la estructura helicoidal original, así como la alta estabilidad, aunque se han documentado excepciones únicas con propiedades interesantes. Debido a su pequeño tamaño y a sus propiedades de plegado rápido, las moléculas de aficuerpos se pueden producir mediante síntesis química de péptidos.

En otras realizaciones de la invención, La inhibición de la actividad de Suv39h1 se puede lograr mediante la represión/supresión de genes mediante la reducción de la expresión de genes utilizando ARN de interferencia (ARNi) tal como ARN de interferencia corto (ARNip) ARN de horquilla corta (ARNhc) o ribozimas. La tecnología de ARNip incluye la basada en ARNi que utiliza una molécula de a Rn bicatenario que tiene una secuencia homóloga con la secuencia de nucleótidos del ARNm que se transcribe a partir del gen, y una secuencia complementaria con la secuencia de nucleótidos. El ARNip generalmente es homólogo/complementario con una región de ARNm que se transcribe del gen, o puede ser ARNip que incluye una pluralidad de moléculas de ARN que son homólogas/complementarias con diferentes regiones.

Los oligonucleótidos antisentido, incluyendo moléculas de ARN antisentido y moléculas de ADN antisentido, actuarían para bloquear directamente la traducción de H3K9-histona metiltransferasa Suv39h1 y así prevenir la traducción de proteínas o aumentar la degradación del ARNm, reduciendo así el nivel de H3K9-histona metiltransferasa SUV39H1 y por tanto su actividad en una célula. Por ejemplo, se pueden sintetizar oligonucleótidos antisentido de al menos aproximadamente 15 bases y complementarios a regiones únicas de la secuencia de transcripción de ARNm que codifica H3K9-histona metiltransferasa SUV39H1, por ejemplo, por técnicas convencionales de fosfodiéster y administradas mediante, por ejemplo, inyección o infusión intravenosa. Los métodos para usar técnicas antisentido para inhibir específicamente la expresión génica de genes cuya secuencia es conocida son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 6.566.135; 6.566, 131; 6365354; 6410323; 6107091; 6046321; y 5.981.732).

Un "agente de ARN de interferencia" tal como se usa en el presente documento, se define como cualquier agente, que interfiere o inhibe la expresión de un gen biomarcador diana por interferencia de ARN (ARNi). Dichos agentes de ARN de interferencia incluyen, pero sin limitación, moléculas de ácido nucleico, incluidas moléculas de ARN, que son homólogas al gen diana de la invención (por ejemplo, Suv39h1), o un fragmento del mismo, ARN de interferencia corto (ARNip) y moléculas pequeñas que interfieren o inhiben la expresión del ácido nucleico diana por interferencia de ARN (ARNi).

Los ARN inhibidores pequeños (ARNip) también pueden funcionar como inhibidores de la expresión para su uso en la presente invención. La expresión del gen H3K9-histona metiltransferasa SUV39H1 se puede reducir poniendo en contacto a un sujeto o célula con un ARN bicatenario pequeño (ARNdc), o un vector o construcción que provoque la producción de un ARN bicatenario pequeño, de manera que la expresión del gen SUV39H1 de la H3K9-histona metiltransferasa se inhiba específicamente (es decir, interferencia de ARN o ARNi). Los métodos para seleccionar un vector de codificación de ARNdc o ARNdc apropiado son bien conocidos en la técnica para genes cuya secuencia es conocida (véase, por ejemplo, Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002); las Pat. de EE.UU. n.° 6.573.099 y 6.506.559; las publicaciones de patente internacionales N.° WO 01/36646, WO 99/32619 y WO 01/68836). Todos o parte de los enlaces fosfodiéster de los ARNip de la invención están ventajosamente protegidos. Esta protección se implementa generalmente por vía química usando métodos que son conocidos en la técnica. Los enlaces fosfodiéster se pueden proteger, por ejemplo, por un grupo funcional tiol o amina o por un grupo fenilo. Los extremos 5' y/o 3' de los ARNip de la invención también están protegidos ventajosamente, por ejemplo, utilizando la técnica descrita anteriormente para proteger los enlaces fosfodiéster. Ventajosamente, las secuencias de ARNip comprenden al menos doce dinucleótidos contiguos o sus derivados.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "derivados de ARNip" con respecto a las presentes secuencias de ácido nucleico se refiere a un ácido nucleico que tiene un porcentaje de identidad de al menos el 90 % con eritropoyetina o fragmento de la misma, preferentemente de al menos el 95 %, tal como ejemplo de al menos el 98 %, y más preferentemente de al menos el 98 %.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de ácido nucleico, significa el porcentaje de ácido nucleico idéntico, entre las dos secuencias a comparar, obtenido con el mejor alineamiento de dichas secuencias, siendo este porcentaje puramente estadístico y las diferencias entre estas dos secuencias se distribuyen aleatoriamente sobre las secuencias de ácidos nucleicos. Tal como se usa en el presente documento, "mejor alineación" o "alineación óptima", significa la alineación para la cual el porcentaje de identidad determinado (véase más abajo) es el más alto. La comparación de secuencias entre dos secuencias de ácidos nucleicos se realiza habitualmente comparando estas secuencias que se han alineado previamente según el mejor alineamiento; esta comparación se realiza en segmentos de comparación para identificar y comparar las regiones locales de similitud. Se puede realizar la mejor alineación de secuencias para realizar la comparación, aparte de manualmente, utilizando el algoritmo de homología global desarrollado por SMITH y WATERMAn (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), utilizando el algoritmo de homología local desarrollado por NEDd Le MAN y WUNSCH (J. Mol. Biol, vol.48, p:443, 1970), utilizando el método de similitudes desarrollado por pEARSON y LIPm A n (Proc. Natl. Acd. Sci. EE.UU., vol.85, p:2444, 1988), mediante el uso de programas informáticos que utilizan tales algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, EE.UU.), mediante el uso de los algoritmos de alineación múltiple MUSCLE (Edgar, Robert C, Nucleic Acids Research, vol. 32, p: 1792, 2004). Para obtener la mejor alineación local, preferentemente se puede utilizar el programa informático BLAST. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos se determina comparando estas dos secuencias alineadas de manera óptima, pudiendo las secuencias de ácidos nucleicos comprender adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia para conseguir el alineamiento óptimo entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre estas dos secuencias, y dividiendo este número entre el número total de posiciones comparadas, y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Los ARNhc (ARN en horquilla corta) también pueden funcionar como inhibidores de la expresión para su uso en la presente invención. Los ARNhc se componen típicamente de una hebra antisentido corta (por ejemplo, de 19-25 nucleótidos), seguido de un bucle de 5-9 nucleótidos y la hebra sentido análoga. Como alternativa, la hebra sentido puede preceder a la estructura del bucle de nucleótidos y la hebra antisentido puede seguir.

Las ribozimas también pueden funcionar como inhibidores de la expresión para su uso en la presente invención. Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica del ARN. El mecanismo de acción de las ribozimas implica la hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima con el ARN diana complementario, seguido de escisión endonucleolítica. Las moléculas de ribozima con motivo de horquilla o cabeza de martillo diseñadas genéticamente que catalizan de forma específica y eficaz la escisión endonucleolítica de las secuencias de ARNm de H3K9-histona metiltransferasa SUV39H1 son por tanto útiles dentro del alcance de la presente invención. Los sitios de escisión de ribozimas específicos dentro de cualquier posible diana de ARN se identifican inicialmente escaneando la molécula diana en busca de sitios de escisión de ribozimas, que normalmente incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificado, se pueden evaluar secuencias cortas de ARN de entre aproximadamente 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión para determinar las características estructurales previstas, tales como la estructura secundaria, que puede hacer que la secuencia de oligonucleótidos sea inadecuada.

Tanto los oligonucleótidos antisentido como las ribozimas útiles como inhibidores de la expresión se pueden preparar mediante métodos conocidos. Estos incluyen técnicas de síntesis química como, por ejemplo, por síntesis química de fosforamadita en fase sólida. Como alternativa, las moléculas de a Rn antisentido se pueden generar por transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN. Dichas secuencias de ADN se pueden incorporar a una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de la ARN polimerasa adecuados, tales como los promotores de la polimerasa T7 o SP6. Se pueden introducir diversas modificaciones de los oligonucleótidos de la invención como un medio para aumentar la estabilidad intracelular y la semivida. Las posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos a los extremos 5' y/o 3' de la molécula, o el uso de fosforotioato o 2'-0-metil en lugar de enlaces fosfodiesterasa dentro de la estructura principal de oligonucleótidos.

Los oligonucleótidos antisentido, los ARNip, los ARNhc y las ribozimas de la invención se pueden administrar in vivo solo o en asociación con un vector. En su sentido más amplio, un "vector" es cualquier vehículo capaz de facilitar la transferencia del oligonucleótido antisentido, el ARNip, el ARNhc o ácido nucleico de ribozima a las células y preferentemente a las células que expresan H3K9-histona metiltransferasa SUV39H1. Preferentemente, el vector transporta el ácido nucleico a las células con degradación reducida en relación con el grado de degradación que daría como resultado la ausencia del vector. En general, los vectores útiles en la invención incluyen, pero sin limitación, plásmidos, fagémidos, virus, otros vehículos que provienen de fuentes víricas o bacterianas que han sido manipulados por la inserción o incorporación del oligonucleótido antisentido, ARNip, ARNhc o secuencias de ácido nucleico de ribozimas. Los vectores víricos son un tipo preferido de vector e incluyen, pero sin limitación, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: retrovirus, tales como el virus de la leucemia murina de Moloney, el virus del sarcoma murino de Harvey, el virus del tumor mamario murino y el virus del sarcoma de Rous; adenovirus, virus adenoasociado; virus de tipo SV40; virus del polioma; virus de Epstein-Barr; virus del papiloma; el virus del herpes; virus vaccinia; el virus de la polio; y virus R A tal como un retrovirus. Se pueden emplear fácilmente otros vectores no nombrados pero conocidos en la técnica.

Los vectores víricos preferidos se basan en virus eucarióticos no citopáticos en los que los genes no esenciales se han reemplazado con el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus (por ejemplo, lentivirus), cuyo ciclo de vida implica la transcripción inversa de ARN vírico genómico en ADN con la posterior integración provírica en el ADN celular del hospedador. Se han aprobado retrovirus para ensayos de terapia génica en humanos. Los más útiles son los retrovirus que son deficientes en la replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Dichos vectores de expresión retrovírica genéticamente alterados tienen utilidad general para la transducción de alta eficacia de genes in vivo. Los protocolos estándar para producir retrovirus de replicación deficiente (incluidas las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, la transfección de una célula empaquetadora revestida con plásmido, la producción de retrovirus recombinantes por la línea celular empaquetadora, la recolección de partículas víricas de medios de cultivo de tejidos e infección de las células diana con partículas víricas) se proporcionan en Kriegler, 1990 y en Murry, 1991).

Los virus preferidos para ciertas aplicaciones son los adenovirus y los virus adenoasociados (AAV), que son virus de ADN de doble cadena que ya han sido aprobados para uso humano en terapia génica. En realidad, se conocen 12 serotipos diferentes de AAV (AAV1 a 12), cada uno con diferentes tropismos tisulares (Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27). Los AAV recombinantes provienen del parvovirus AAV2 dependiente (Choi, VW J Virol 2005; 79:6801-07). El virus adenoasociado de tipo 1 a 12 se puede diseñar genéticamente para que sea deficiente en la replicación y sea capaz de infectar una amplia gama de tipos de células y especies (Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27). Además tiene ventajas tales como, estabilidad al calor y al disolvente lipídico; altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes, incluidas las células hematopoyéticas; y falta de inhibición de la superinfección, lo que permite múltiples series de transducciones. Según se informa, el virus adenoasociado puede integrarse en el ADN celular humano de una manera específica de sitio, minimizando así la posibilidad de mutagénesis de inserción y la variabilidad de la expresión génica insertada característica de la infección retrovírica. Además, se han seguido infecciones por virus adenoasociados de tipo silvestre en cultivo tisular durante más de 100 pases en ausencia de presión selectiva, lo que implica que la integración genómica del virus adenoasociado es un acontecimiento relativamente estable. El virus adenoasociado también puede actuar de manera extracromosómica.

Otros vectores incluyen vectores plasmídicos. Los vectores plásmidos se han descrito ampliamente en la técnica y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989. En los últimos años, los vectores plasmídicos se han utilizado como vacunas de ADN para administrar genes codificantes de antígenos a las células in vivo. Son particularmente ventajosos para esto porque no tienen los mismos problemas de seguridad que con muchos de los vectores víricos. Estos plásmidos, sin embargo, tener un promotor compatible con la célula hospedadora, puede expresar un péptido de un gen codificado operativamente dentro del plásmido. Algunos plásmidos de uso común incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 y pBlueScript. Otros plásmidos son bien conocidos por los expertos en la materia. Adicionalmente, los plásmidos se pueden diseñar a medida utilizando enzimas de restricción y reacciones de ligación para eliminar y añadir fragmentos específicos de ADN. Los plásmidos se pueden administrar mediante una variedad de vías parenterales, mucosales y tópicas. Por ejemplo, el plásmido de ADN se puede inyectar por vía intramuscular, intradérmica, subcutánea u otras vías. También se puede administrar mediante aerosoles o gotas intranasales, supositorio rectal y por vía oral. También se puede administrar en la epidermis o una superficie mucosa usando una pistola de genes. Los plásmidos se pueden administrar en una solución acuosa, secarse sobre partículas de oro o en asociación con otro sistema de administración de ADN que incluye, entre otros, liposomas, dendrímeros, vehículos de suministro de cocleato y microencapsulación.

El oligonucleótido antisentido, ARNip, la secuencia de ácido nucleico de ARNhc o ribozima según la invención está generalmente bajo el control de una región reguladora heteróloga, por ejemplo, un promotor heterólogo. El promotor puede ser específico para células gliales de Muller, células de la microglía, células endoteliales, células de pericitos y astrocitos. Por ejemplo, es adecuada una expresión específica en células gliales de Muller a través del promotor del gen de la glutamina sintetasa. El promotor también puede ser, a modo de ejemplo, un promotor vírico, tal como el promotor de CMV o cualquier promotor sintético.

Represión génica o alteración de Suv39h1

La inhibición de Suv39h1 en una célula de acuerdo con la invención también se puede efectuar mediante la represión o alteración del gen Suv39h1, tal como por deleción, por ejemplo, la deleción de todo el gen, exón, o región, y/o sustitución con una secuencia exógena, y/o por mutación, por ejemplo, cambio de marco o mutación sin sentido, dentro del gen, típicamente dentro de un exón del gen. En algunas realizaciones, la alteración da como resultado la incorporación de un codón de parada prematuro en el gen, de manera que la proteína Suv39h1 no se expresa o no es funcional. La alteración se lleva a cabo generalmente a nivel de ADN. La alteración generalmente es permanente, irreversible o no transitorio.

En algunas realizaciones, la alteración o represión de genes se logra utilizando agentes de edición de genes, tales como una molécula dirigida al ADN, tal como una proteína de unión a ADN o un ácido nucleico de unión a ADN, o un complejo, compuesto, o composición, que contiene el mismo, que se une específicamente al gen o hibrida con él. En algunas realizaciones, la molécula dirigida al ADN comprende un dominio de unión al ADN, por ejemplo, un dominio de unión al ADN de la proteína de dedo de zinc (ZFP), un dominio de unión al ADN de una proteína similar a un activador de la transcripción (TAL) o un efector de TAL (TALE), un dominio de unión a ADN de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR), o un dominio de unión a ADN de una meganucleasa.

Los dedos de zinc, TALE y los dominios de unión al sistema CRISPR se pueden "diseñar genéticamente" para que se unan a una secuencia de nucleótidos predeterminada.

En algunas realizaciones, la molécula que se dirige al ADN, complejo o combinación contiene una molécula de unión a ADN y uno o más dominios adicionales, tal como un dominio efector para facilitar la represión o alteración del gen. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la alteración del gen se lleva a cabo mediante proteínas de fusión que comprenden proteínas de unión a ADN y un dominio regulador heterólogo o fragmento funcional del mismo.

Normalmente, el dominio adicional es un dominio nucleasa. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la alteración genética se ve facilitada por la edición de genes o genomas, utilizando proteínas diseñadas genéticamente, tales como nucleasas y complejos que contienen nucleasas o proteínas de fusión, compuestos de dominios de unión a ADN específicos de secuencia fusionados a que forman complejos con, moléculas de escisión de ADN no específicas tales como nucleasas.

Estas nucleasas quiméricas dirigidas o complejos que contienen nucleasas llevan a cabo modificaciones genéticas precisas al inducir roturas de doble hebra o roturas de una sola hebra dirigidas, estimular los mecanismos de reparación del ADN celular, incluida la unión de extremos no homólogos propensa a errores (NHEJ) y la reparación dirigida por homología (HDR). En algunas realizaciones, la nucleasa es una endonucleasa, tal como una nucleasa de dedo de zinc (ZFN), TALE nucleasa (TALEN), una endonucleasa guiada por ARN (RGEN), tal como una proteína asociada a CRISPR (Cas) o una meganucleasa. Tales sistemas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU n.° 8.697.359; Sander y Joung (2014) Nat. Biotech. 32:347-355; Hale et al. (2009) Cell 139:945-956; Karginov y Hannon (2010) Mol. Cell 37:7; la Publ. de Pat. de EE.UU. 2014/0087426 y 2012/0178169; Boch et al. (2011) Nat. Biotech. 29: 135-136; Boch et al. (2009) Science 326: 1509-1512; Moscou y Bogdanove (2009) Science 326: 1501; Weber et al. (2011) PLoS One 6:el9722; Li et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39:6315-6325; Zhang et al. (201 1) Nat. Biotech. 29: 149-153; Miller et al. (2011) Nat. Biotech. 29: 143-148; Lin et al. (2014) Nucl. Acids Res. 42:e47). Tales estrategias genéticas pueden usar sistemas de expresión constitutivos o sistemas de expresión inducibles según métodos bien conocidos en la técnica.

ZFP y ZFN; TAL, TALE y TALEN

En algunas realizaciones, la molécula dirigida al ADN incluye una proteína de unión al ADN, como una o más proteínas con dedos de zinc (ZFP) o una proteína similar a un activador de la transcripción (TAL), fusionada a una proteína efectora tal como una endonucleasa. Los ejemplos incluyen ZFN, TALE y TALEN. Véase Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221), 1-7 (2013).

En algunas realizaciones, la molécula de dirección de ADN comprende una o más proteínas con dedos de zinc (ZFP) o dominios de las mismas que se unen al ADN de una manera específica de secuencia. Una ZFP o dominio de la misma es una proteína o dominio dentro de una proteína más grande, que se une al ADN de una manera específica de secuencia a través de una o más regiones de dedos de zinc de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza mediante la coordinación de un ión de zinc. Generalmente, la especificidad de secuencia de una ZFP se puede alterar haciendo sustituciones de aminoácidos en las cuatro posiciones de la hélice (-1, 2, 3 y 6) en una hélice de reconocimiento de dedos de zinc. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la molécula que contiene ZFP o ZFP no es de origen natural, por ejemplo, está diseñada genéticamente para unirse al sitio diana elegido. Véanse, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol.

12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416.

En algunas realizaciones, la molécula dirigida al ADN es o comprende un dominio de unión a ADN con dedos de zinc fusionada a un dominio de escisión de ADN para formar una nucleasa con dedos de zinc (ZFN). En algunas realizaciones, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o semidominio de escisión) de al menos una enzima de restricción de tipo IIS y uno o más dominios de unión con dedos de zinc, que pueden estar diseñados genéticamente o no. En algunas realizaciones, el dominio de escisión es de la endonucleasa de restricción de Fok I de tipo IIS. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31.978-31.982.

En algunos aspectos, los ZFN generan eficientemente una ruptura de cadena doble (DSB, por sus siglas en inglés), por ejemplo, en un sitio predeterminado en la región codificante del gen diana (es decir, Suv39h1). Las regiones génicas diana típicas incluyen exones, regiones que codifican regiones de N-terminal, el primer exón, el segundo exón y las regiones promotoras o potenciadoras. En algunas realizaciones, la expresión transitoria de las ZFN promueve la alteración permanente y altamente eficaz del gen diana en las células diseñadas genéticamente. En particular, en algunas realizaciones, la administración de las ZFN da como resultado la alteración permanente del gen con eficacias que superan el 50 %. Muchos dedos de zinc diseñados para genes específicos están disponibles comercialmente. Por ejemplo, Sangamo Biosciences (Richmond, CA, EE. UU.) ha desarrollado una plataforma (CompoZr) para la construcción con dedos de zinc en asociación con Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Estados Unidos), permitiendo a los investigadores eludir por completo la construcción y validación de dedos de zinc, y proporciona dedos de zinc específicamente dirigidos a miles de proteínas. Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405. En algunas realizaciones, se utilizan dedos de zinc disponibles comercialmente o se diseñan a medida. (Véase, por ejemplo, los números de catálogo de Sigma-Aldrich CSTZFND, CSTZFN, CT11-1KT y PZD0020).

En algunas realizaciones, la molécula dirigida al ADN comprende un dominio de unión al ADN de una proteína similar a un activador de la transcripción (TAL) de origen natural o diseñado genéticamente (no natural), tal como en una proteína efectora de proteína similar a un activador de la transcripción (TALE). Véanse, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 20110301073. En algunas realizaciones, la molécula es una endonucleasa de unión al ADN, tal como una TALE-nucleasa (TALEN). En algunos aspectos, TALEN es una proteína de fusión que comprende un dominio de unión a ADN que proviene de una TALE y un dominio catalítico de nucleasa para escindir una secuencia diana de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el dominio de unión al ADN de TALE se ha diseñado genéticamente para unirse a una secuencia diana dentro de los genes que codifican el antígeno diana y/o la molécula inmunosupresora. Por ejemplo, en algunos aspectos, el dominio de unión al ADN de TALE puede dirigirse a CD38 y/o un receptor de adenosina, tal como A2AR.

En algunas realizaciones, la TALEN reconoce y escinde la secuencia diana en el gen. En algunos aspectos, la escisión del ADN da como resultado roturas de cadena doble. En algunos aspectos, las roturas estimulan la tasa de recombinación homóloga o unión de extremos no homólogos (NHEJ). Generalmente, la NHEJ es un proceso de reparación imperfecto que a menudo da como resultado cambios en la secuencia de ADN en el sitio de la escisión. En algunos aspectos, los mecanismos de reparación implican la reincorporación de lo que queda de los dos extremos del ADN a través de la ligadura directa (Critchlow y Jackson, Trends Biochem Sci. 1998 Oct; 23 (10): 394-8) o mediante la denominada unión de extremos mediada por microhomología. En algunas realizaciones, la reparación a través de NHEJ da como resultado pequeñas inserciones o deleciones y se puede usar para alterar y, por lo tanto, reprimir el gen. En algunas realizaciones, la modificación puede ser una sustitución, deleción o adición de al menos un nucleótido. En algunos aspectos, las células en las que se produce un evento de mutagénesis inducida por escisión, es decir, un evento de mutagénesis consecutivo a un evento de NHEJ, pueden identificarse y/o seleccionarse mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Las repeticiones de TALE se pueden ensamblar para direccionar específicamente al gen Suv39h1. (Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). Se ha construido una biblioteca de TALEN dirigida a 18.740 genes codificadores de proteínas humanas (Kim et al., Nature Biotechnology. 31, 251-258 (2013)). Las matrices TALE diseñadas a medida están disponibles comercialmente a través de Cellectis Bioresearch (París, Francia), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, EE. UU.) y Life Technologies (Grand Island, NY, EE.UU.). Específicamente, los TALEN que se dirigen a CD38 están disponibles comercialmente (consulte Gencopoeia, números de catálogo HTN222870-1, HTN222870-2 y HTN222870-3, disponible en la World Wide Web en www. genecopoeia.com/product/search/detail.php ?prt=26&c id=&key=HTN222870). Se describen moléculas ilustrativas, por ejemplo, en las publicaciones de patente de Estados Unidos N.° 2014/0120622, y 2013/0315884.

En algunas realizaciones, las TALEN se introducen como transgenes codificados por uno o más vectores plasmídicos. En algunos aspectos, el vector plasmídico puede contener un marcador de selección que permite la identificación y/o selección de células que recibieron dicho vector.

RGEN (sistemas CRISPR/Cas)

La represión génica se puede llevar a cabo utilizando uno o más ácidos nucleicos que se unen al ADN, tal como la alteración a través de una endonucleasa guiada por ARN (RGEN) u otra forma de represión por otra molécula efectora guiada por ARN. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la represión génica se puede llevar a cabo utilizando grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR) y proteínas asociadas a CRISPR. Véase Sander y Joung, Nature Biotechnology, 32(4): 347-355.

En general, "Sistema CRISPR" se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos involucrados en la expresión de o en dirigir la actividad de los genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluidas las secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR transactivadora) (por ejemplo, ARNtracr o un ARNtracr parcial activo), una secuencia de apareamiento con tracr (que abarca una "repetición directa" y una repetición directa parcial procesada por ARNtracr en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también denominada "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), y/u otras secuencias y transcritos de un locus CRISPR.

Normalmente, el sistema de nucleasa CRISPR/Cas o nucleasa CRISPR/Cas incluye una molécula de ARN no codificante, ARN (guía), cuya secuencia se une específicamente al ADN y a una proteína CRISPR, con funcionalidad nucleasa (por ejemplo, dos dominios nucleasa). Uno o más elementos de un sistema CRISPR pueden derivar de un sistema CRISPR de tipo I, tipo II o tipo III, como la nucleasa Cas. Preferentemente, la proteína CRISPR es una enzima cas tal como 9. Las enzimas Cas son bien conocidas en el campo; por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína Cas9 de S. pyogenes se puede encontrar en la base de datos SwissProt con el número de referencia Q99ZW2. En algunas realizaciones, se introducen una nucleasa Cas y ARNg en la célula. En algunas realizaciones, el sistema CRISPR induce DSB en el sitio diana, seguido de alteraciones tal como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, las variantes de Cas9, consideradas "nickasas", se pueden usar para cortar una sola hebra en el sitio diana. También se pueden usar nickasas emparejadas, por ejemplo, para mejorar la especificidad, cada uno dirigido por un par de secuencias de direccionamiento de ARNg diferentes. En todavía otras realizaciones, el Cas9 catalíticamente inactivo se puede fusionar con un dominio efector heterólogo, tal como un represor transcripcional, para afectar a la expresión génica.

En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que promueven la formación de un complejo CRISPR en el sitio de la secuencia diana. Normalmente, en el contexto de la formación de un complejo CRISPR, "secuencia diana" se refiere generalmente a una secuencia para la cual una secuencia guía se diseña para tener complementariedad, en donde la hibridación entre la secuencia diana y una secuencia guía promueve la formación de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente una completa complementariedad, siempre que haya suficiente complementariedad para provocar la hibridación y promover la formación de un complejo CRISPR. La secuencia diana puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ARN. Generalmente, una secuencia o molde que se puede usar para la recombinación en el locus diana que comprende las secuencias diana se denomina "molde de edición" o "polinucleótido de edición" o "secuencia de edición". En algunos aspectos, un polinucleótido molde exógeno se puede denominar molde de edición. En algunos aspectos, la recombinación es una recombinación homóloga.

En algunas realizaciones, uno o más vectores que dirigen la expresión de uno o más elementos del sistema CRISPR se introducen en la célula hospedadora, de manera que la expresión de los elementos del sistema CRISPR dirige la formación del complejo CRISPR en uno o más sitios diana. Por ejemplo, una enzima Cas, una secuencia guía unida a una secuencia de apareamiento con tracr y una secuencia tracr podrían unirse operativamente a elementos reguladores separados en vectores separados. Como alternativa, dos o más de los elementos expresados desde el mismo o diferentes elementos reguladores, pueden combinarse en un solo vector, con uno o más vectores adicionales que proporcionan cualquier componente del sistema CRISPR no incluido en el primer vector. En algunas realizaciones, los elementos del sistema CRISPR que se combinan en un solo vector pueden estar dispuestos en cualquier orientación adecuada. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR, la secuencia guía, secuencia de apareamiento con traer y la secuencia traer se unen operativamente a y se expresan desde el mismo promotor. En algunas realizaciones, un vector comprende un elemento regulador unido operativamente a una secuencia codificante de enzimas que codifica la enzima CRISPR, tal como una proteína Cas.

En algunas realizaciones, se administra una enzima CRISPR en combinación con (y opcionalmente complejada con) una secuencia guía a la célula. Normalmente, la tecnología CRISPR/Cas9 se puede utilizar para reducir la expresión génica de Suv39h1 en las células diseñadas genéticamente. Por ejemplo, la nucleasa Cas9 y un ARN guía específico del gen Suv39h1 se pueden introducir en las células, por ejemplo, utilizando vectores de administración lentivíricos o cualquiera de varios métodos de administración o vehículos conocidos para la transferencia a las células, tal como cualquiera de varios métodos o vehículos conocidos para administrar moléculas Cas9 y ARN guía (véase también a continuación).

Administración de ácidos nucleicos que codifican el gen que altera moléculas y complejos

En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica la molécula dirigida al ADN, complejo, o combinación, se administra o se introduce en la célula. Normalmente, se pueden utilizar métodos de transferencia de genes víricos y no víricos para introducir ácidos nucleicos que codifican componentes de un CRISPR, ZFP, ZFN, TALE y/o sistema TALEN a las células en cultivo.

En algunas realizaciones, los polipéptidos se sintetizan in situ en la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos que codifican los polipéptidos en la célula. En algunos aspectos, los polipéptidos podrían producirse fuera de la célula y a continuación introducirse en la misma.

Los métodos para introducir una construcción polinucleotídica en células animales son conocidos e incluyen, como ejemplos no limitantes, métodos de transformación estable en los que la construcción polinucleotídica se integra en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que la construcción polinucleotídica no está integrada en el genoma de la célula y métodos mediados por virus.

En algunas realizaciones, los polinucleótidos pueden introducirse en la célula mediante, por ejemplo, vectores víricos recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Los métodos de transformación transitoria incluyen microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. El ácido nucleico se administra en forma de vector de expresión. Preferentemente, el vector de expresión es un vector de expresión retrovírica, un vector de expresión adenovírica, un vector de expresión de plásmido de ADN o un vector de expresión de AAV.

Los métodos de administración no viral de ácidos nucleicos incluyen lipofección, nucleofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o lípido: conjugados de ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, y captación de ADN reforzada con un agente. La lipofección se describe en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.049.386, 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección eficiente de polinucleótidos con reconocimiento de receptor incluyen los de Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024. La administración puede ser a células (por ejemplo, administración in vitro o ex vivo) o tejidos diana (por ejemplo, administración in vivo).

Los sistemas basados en virus de ARN o ADN incluyen vectores retrovíricos, lentivíricos, adenovíricos, de virus adenoasociado y del virus del herpes simple para la transferencia génica.

Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel y Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993); Dillon. TIBTECH 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer y Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994).

Un gen indicador que incluye, entre otros, la glutatión-5-transferasa (GST), peroxidasa de rábano picante (HRP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YFP) y proteínas autofluorescentes, incluida la proteína fluorescente azul (BFP), se pueden introducir en la célula para codificar un producto génico que sirve como marcador mediante el cual medir la alteración o modificación de la expresión del producto génico.

Preparación de las células

El aislamiento de las células incluye una o más etapas de preparación y/o separación de células no basadas en afinidad de acuerdo con técnicas bien conocidas en el campo. En algunos ejemplos, las células se lavan, se centrifugan y/o se incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo, para eliminar componentes no deseados, enriquecer los componentes deseados, lisar o eliminar las células sensibles a determinados reactivos. En algunos ejemplos, las células se separan en función de una o más propiedades, tales como la densidad, propiedades adherentes, el tamaño, sensibilidad y/o resistencia a componentes particulares.

En algunas realizaciones, la preparación celular incluye etapas para la congelación, por ejemplo, criopreservar, las células, ya sea antes o después del aislamiento, incubación y/o el diseño genético. Se puede usar cualquiera de una variedad de soluciones y parámetros de congelación conocidos en algunos aspectos.

Normalmente, las células se incuban antes o en conexión con la ingeniería genética y/o la inhibición de Suv39h1.

Las etapas de incubación pueden comprender cultivo, incubación, estimulación, activación, expansión y/o propagación.

También se puede lograr la inhibición in vivo de Suv39h1 según la invención después de la inyección de las células a los pacientes diana. Normalmente, la inhibición de suv39h1 se realiza usando inhibidores farmacológicos tal como se describió previamente.

La inhibición de Suv39h1 según el método descrito anteriormente también se puede realizar durante las etapas de estimulación, activación y/o expansión. Por ejemplo, PB-MC, o linfocitos T purificados, o linfocitos citolíticos naturales (NK) purificados, o progenitores linfoides purificados, se expanden in vitro en presencia de inhibidores farmacológicos de Suv39h1 antes de la transferencia adoptiva a los pacientes. En algunas realizaciones, las composiciones o células se incuban en presencia de condiciones estimulantes o un agente estimulador. Tales condiciones incluyen las diseñadas para inducir la proliferación, la expansión, activación y/o supervivencia de células en la población, para imitar la exposición al antígeno y/o para cebar las células para el diseño genético, como por ejemplo para la introducción de un receptor de antígeno diseñado genéticamente.

Las condiciones de incubación pueden incluir uno o más de medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones y/o factores estimulantes, tales como citocinas, quimiocinas, antígenos, miembros de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para activar las células.

En algunas realizaciones, las condiciones o agentes estimuladores incluyen uno o más agentes, por ejemplo, ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo de TCR. En algunos aspectos, el agente activa o inicia la cascada de señalización intracelular de TCR/CD3 en un linfocito T. Dichos agentes pueden incluir anticuerpos, tales como los específicos para un componente de TCR y/o receptor coestimulador, por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28, por ejemplo, unido a un soporte sólido tal como una perla, y/o una o más citocinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además la etapa de añadir anticuerpo anti-CD3 y/o anti CD28 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración de al menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunas realizaciones, los agentes estimuladores incluyen 1L-2 y/o IL-15, por ejemplo, una concentración de IL-2 de al menos aproximadamente 10 unidades/ml.

En algunos aspectos, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas tales como las descritas en la patente de EE.UU. N.° 6.040.1 77 de Riddell. et al., Klebanoff et al., J Immunother. 2012; 35(9): 651-660, Terakura et al., Blood.

2012; 1:72-82, y/o Wang et al. J Immunother. 2012,35(9):689-701.

En algunas realizaciones, los linfocitos T se expanden añadiendo a la composición de inicio del cultivo células alimentadoras, tales como las células mononucleares de sangre periférica que no se dividen (PBMC), (por ejemplo, de manera que la población de células resultante contenga al menos aproximadamente 5, 10, 20 o 40 o más células alimentadoras PBMc por cada linfocito T en la población inicial que se va a expandir); e incubar el cultivo (por ejemplo, durante un tiempo suficiente para expandir el número de linfocitos T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras de PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunas realizaciones, las PBMC se irradian con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 3000 a 3600 rads para evitar la división celular. En algunos aspectos, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de la adición de las poblaciones de linfocitos T.

En algunas realizaciones, las condiciones estimulantes incluyen temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo, al menos unos 25 grados Celsius, generalmente al menos aproximadamente 30 grados, y generalmente en o aproximadamente 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además la adición de células linfoblastoides (LCL) transformadas con EBV que no se dividen como células alimentadoras. Las LCL se pueden irradiar con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 6000 a 10.000 rads. Las células alimentadoras LCL en algunos aspectos se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, tal como una proporción de células alimentadoras LCL a linfocitos T iniciales de al menos aproximadamente 10:1.

En unas realizaciones, los linfocitos T específicos de antígeno, tales como linfocitos T CD4+ y/o CD8+ específicos de antígeno, se obtienen estimulando linfocitos T sin exposición previa o específicos de antígeno con antígeno. Por ejemplo, se pueden generar líneas o clones de linfocitos T específicos de antígeno para antígenos de citomegalovirus aislando linfocitos T de sujetos infectados y estimulando las células in vitro con el mismo antígeno.

En algunos aspectos, los métodos incluyen evaluar la expresión de uno o más marcadores en la superficie de las células diseñadas genéticamente o las células que se están diseñando genéticamente. En una realización, los métodos incluyen evaluar la expresión superficial de uno o más antígenos diana (por ejemplo, antígeno reconocido por el receptor de antígeno diseñado genéticamente) que se busca que sea dirigido por la terapia celular adoptiva, por ejemplo, por métodos de detección basados en afinidad, tal como por citometría de flujo.

Vectores y métodos para diseño genético de células

En algunos aspectos, la ingeniería genética implica la introducción de un ácido nucleico que codifica el componente diseñado genéticamente u otro componente para su introducción en la célula, tal como un componente que codifica una proteína o ácido nucleico de alteración genética.

Generalmente, el diseño genético de CAR en células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T) requiere que las células se cultiven para permitir la transducción y expansión. La transducción puede utilizar una variedad de métodos, pero se requiere una transferencia génica estable para permitir la expresión sostenida de CAR en células diseñadas genéticamente en expansión clonal y persistentes.

En algunas realizaciones, la transferencia de genes se logra estimulando primero el crecimiento celular, por ejemplo, el crecimiento, la proliferación y/o la activación de linfocitos T, seguido de la transducción de las células activadas y la expansión en cultivo hasta cantidades suficientes para aplicaciones clínicas.

Diversos métodos para la introducción de componentes transgénicos, por ejemplo, receptores de antígenos, por ejemplo, CAR, son bien conocidos y se pueden usar con los métodos y composiciones proporcionados. Los métodos ilustrativos incluyen aquellos para la transferencia de ácidos nucleicos que codifican los receptores, incluso vía vírica, por ejemplo, retrovírica o lentivírica, transducción, transposones y electroporación.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células utilizando partículas de virus infecciosos recombinantes, tales como, por ejemplo, vectores obtenidos del virus del simio 40 (SV40), adenovirus, virus adenoasociado (AAV). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a los linfocitos T utilizando vectores lentivíricos recombinantes o vectores retrovíricos, tales como los vectores gammaretrovíricos (véase, por ejemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 3 de abril de 2014.; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. noviembre de 2011; 29(11): 550-557.

En algunas realizaciones, el vector retrovírico tiene una secuencia de repetición terminal larga (LTR), por ejemplo, un vector retrovírico obtenido del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), el virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), el virus de células madre embrionarias murinas (MESV), el virus de células madre murinas (MSCV), el virus formador de focos del bazo (SFFV) o el virus adenoasociado (AAV). La mayoría de los vectores retrovíricos se obtienen de retrovirus murinos. En algunas realizaciones, los retrovirus incluyen los obtenidos de cualquier fuente de células de aves o mamíferos. Los retrovirus suelen ser anfotrópicos, lo que significa que son capaces de infectar células hospedadoras de varias especies, incluyendo seres humanos. En una realización, el gen que se va a expresar sustituye el hueco retrovírico, las secuencias pol y/o env. Se han descrito varios sistemas retrovíricos ilustrativos (por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.219.740; 6207453; 5219740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102­ 109.

También se conocen métodos de transducción lentivírica. Los métodos ilustrativos se describen en, por ejemplo, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101: 1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a los linfocitos T mediante electroporación (véase, por ejemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 y Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a los linfocitos T mediante transposición (véase, por ejemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; y Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Otros métodos para introducir y expresar material genético en células inmunes incluyen la transfección con fosfato de calcio (por ejemplo, tal como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, Nueva York. N.Y.), fusión de protoplastos, transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN de fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031­ 2034 (1987)).

Otros enfoques y vectores para la transferencia de los ácidos nucleicos diseñados genéticamente que codifican los productos recombinantes son los descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional, N.° de publicación: WO2014055668 y la Patente de Estados Unidos N.° 7.446.190.

Composición de la invención

La presente invención también incluye composiciones que contienen las células descritas en el presente documento y/o producidas mediante los métodos proporcionados. Normalmente, dichas composiciones son composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración, tal como para la terapia celular adoptiva.

Una composición farmacéutica de la invención generalmente comprende al menos una célula inmunitaria diseñada genéticamente de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye solución salina, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones. En algunos aspectos, la elección del vehículo en la composición farmacéutica está determinada en parte por el CAR o TCR diseñado genéticamente en particular, por el vector, o células que expresan el CAR o TCR, así como por el método particular usado para administrar el vector o las células hospedadoras que expresan el CAR. En consecuencia, existe una variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. En algunos aspectos, se utiliza una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o las mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,0001 a aproximadamente el 2 % en peso de la composición total.

Una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista.

Métodos terapéuticos

La presente invención también se refiere a las células definidas previamente para su uso en terapia adoptiva (en particular, terapia adoptiva de linfocitos T), típicamente en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.

"Tratamiento" o "tratar" tal como se usa en el presente documento, se define como la aplicación o administración de células según la invención o de una composición que comprende las células a un paciente que lo necesita con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, paliar, mejorar o afectar a la enfermedad, como el cáncer, o cualquier síntoma de la enfermedad (por ejemplo, cáncer). En particular, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a reducir o aliviar al menos un síntoma clínico adverso asociado con la enfermedad, como el cáncer, por ejemplo, dolor, hinchazón, recuento sanguíneo bajo, etc.

Con referencia al tratamiento del cáncer, el término "tratar" también se refiere a ralentizar o revertir la progresión de la multiplicación celular descontrolada neoplásica, es decir, reducir los tumores existentes y/o detener el crecimiento del tumor. El término "tratar" también se refiere a inducir apoptosis en células cancerosas o tumorales en el sujeto.

El sujeto de la invención (es decir, un paciente) es un mamífero, típicamente un primate, tal como un ser humano. En algunas realizaciones, el primate es un mono o un simio. El sujeto puede ser hombre o mujer y puede tener cualquier edad adecuada, incluyendo bebés, juveniles, adolescentes, adultos y sujetos geriátricos. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no primate, tal como un roedor. En algunos ejemplos, el paciente o sujeto es un modelo animal validado para la enfermedad, terapia celular adoptiva y/o para evaluar resultados tóxicos tales como el síndrome de liberación de citocinas (CRS). En algunas realizaciones de la invención, dicho sujeto tiene un cáncer, está en riesgo de tener un cáncer o está en remisión de un cáncer.

El cáncer puede ser un cáncer sólido o un "tumor líquido", como los cánceres que afectan a la sangre, la médula ósea y el sistema linfoide, también conocidos como tumores de los tejidos hematopoyéticos y linfoides, que incluyen principalmente leucemia y linfoma. Los tumores líquidos incluyen, por ejemplo, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA) y leucemia linfoblástica crónica (LLC), (incluidos varios linfomas tales como el linfoma de células del manto, linfoma no Hodgkin (LNH), adenoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de laringe, cánceres de vesícula biliar y conducto biliar, cánceres de retina tales como retinoblastoma).

Los cánceres sólidos incluyen en particular los cánceres que afectan a uno de los órganos seleccionados del grupo que consiste en colon, recto, piel, endometrio, pulmón (incluido el carcinoma de pulmón no microcítico), útero, huesos (tales como osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, fibrosarcoma, tumor de células gigantes, adamantinomas y cordomas), hígado, riñón, esófago, estómago, vejiga, páncreas, cuello uterino, cerebro (tales como meningiomas, glioblastomas, astrocitomas de grado inferior, oligodendrocitomas, tumores hipofisarios, schwannomas y cánceres cerebrales metastásicos), ovario, mama, región de cabeza y cuello, testículos, próstata y la glándula tiroides.

Preferentemente, un cáncer de acuerdo con la invención es un cáncer que afecta a la sangre, la médula ósea y el sistema linfoide tal como se describió anteriormente. Por lo general, el cáncer está asociado con, mieloma múltiple.

En algunas realizaciones, el sujeto padece o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección infecciosa, tales como, pero sin limitación, infecciones de virus, retrovirus, bacterias y protozoos, inmunodeficiencia, citomegalovirus (CMV), virus Epstein Barr (EBV), adenovirus, poliomavirus BK. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria, tales como artritis, por ejemplo, artritis reumatoide (AR), diabetes de tipo I, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad inflamatoria intestinal, soriasis, esclerodermia, enfermedad del tiroides autoinmunitaria, enfermedad de Graves, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, asma y/o una enfermedad o afección asociada con el trasplante

La presente invención también se refiere a un método de tratamiento y, en particular, a una terapia celular adoptiva, preferentemente una terapia adoptiva de linfocitos T, que comprende la administración a un sujeto que lo necesite de una composición descrita previamente.

En algunas realizaciones, las células o composiciones se administran al sujeto, tal como un sujeto que tiene o está en riesgo de tener cáncer o cualquiera de las enfermedades mencionadas anteriormente. En algunos aspectos, los métodos de ese modo tratan, por ejemplo, mejoran uno o más síntomas de, la enfermedad o afección, tal como con referencia al cáncer, al disminuir la carga tumoral en un cáncer que expresa un antígeno reconocido por la célula diseñada genéticamente.

Los métodos para la administración de células para terapia celular adoptiva son conocidos y se pueden usar en relación con los métodos y composiciones proporcionados. Por ejemplo, se describen los métodos de terapia adoptiva de linfocitos T, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0170238 de Gruenberg et al; la Patente de Estados Unidos N.° 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol.

8(10):577-85). Véanse, por ejemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.

En algunas realizaciones, la terapia celular, por ejemplo, terapia celular adoptiva, por ejemplo, terapia adoptiva de linfocitos T, se realiza mediante transferencia autóloga, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir del sujeto que va a recibir la terapia celular, o de una muestra obtenida de dicho sujeto. Por lo tanto, en algunos aspectos, las células se obtienen de un sujeto, por ejemplo, paciente, que necesita un tratamiento y las células, después del aislamiento y el procesamiento se administran al mismo sujeto.

En algunas realizaciones, la terapia celular, por ejemplo, terapia celular adoptiva, por ejemplo, terapia adoptiva de linfocitos T, se lleva a cabo mediante transferencia alogénica, en la que las células se aíslan y/o preparan de otro modo a partir de un sujeto que no sea un sujeto que va a recibir o que finalmente recibe la terapia celular, por ejemplo, un primer sujeto. En dichas realizaciones, las células luego se administran a un sujeto diferente, por ejemplo, un segundo sujeto, de la misma especie. En algunas realizaciones, los sujetos primero y segundo son genéticamente idénticas. En algunas realizaciones, los sujetos primero y segundo son genéticamente similares. En algunas realizaciones, el segundo sujeto expresa la misma clase o supertipo de HLA que el primer sujeto.

La administración de al menos una célula según la invención a un sujeto que la necesite se puede combinar con uno o más agentes terapéuticos adicionales o en conexión con otra intervención terapéutica, bien de forma simultánea o secuencial en cualquier orden. En algunos contextos, las células se coadministran con otra terapia lo suficientemente cercana en el tiempo como para que las poblaciones de células mejoren el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. En algunas realizaciones, las poblaciones celulares se administran antes que uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunas realizaciones, las poblaciones celulares se administran después al uno o más agentes terapéuticos adicionales.

Con referencia al tratamiento del cáncer, un tratamiento combinado contra el cáncer puede incluir, entre otros, agentes quimioterapéuticos, hormonas, anti-angiógenos, compuestos radiomarcados, inmunoterapia, cirugía, crioterapia y/o radioterapia.

La inmunoterapia incluye, entre otros, moduladores de puntos de control inmunitarios (es decir, inhibidores y/o agonistas), anticuerpos monoclonales, vacunas contra el cáncer.

Preferentemente, la administración de células en una terapia adoptiva de linfocitos T de acuerdo con la invención se combina con la administración de moduladores de puntos de control inmunitarios. Lo más preferentemente, los moduladores del punto de control inmunitario comprenden inhibidores anti-PD-1 y/o anti-PDL-1.

La presente invención también se refiere al uso de una composición que comprende la célula inmunitaria diseñada genéticamente tal como se describe en el presente documento para la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer, una enfermedad o afección infecciosa, una enfermedad o afección autoinmune, o una enfermedad o afección inflamatoria en un sujeto.

FIGURAS

Figura 1: El número de linfocitos T CD8+ de memoria central aumenta en ratones deficientes en Suv39h1. A. Gráficos de puntos de FACS representativos de linfocitos T CD8+ esplénicos seleccionados. B. El porcentaje de linfocitos T CD8+ de memoria central se midió en diferentes compartimentos hematopoyéticos (círculos negros, Suv39h1 desactivado (KO); círculos blancos: Compañeros de camada de TS).

Figura 2: Características de las células madre y memoria en linfocitos T CD8+ con Suv39h1 desactivado, específicos de antígeno endógeno. Los linfocitos T CD8+ Kb-OVA+ deficientes en Suv39h1 tienen una firma de expresión génica de memoria y similar a una célula madre. Se muestra el análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA).

Figura 3: Mayor supervivencia y autorrenovación de linfocitos T CD8 deficientes en Suv39h1. A. Montaje experimental que muestra la transferencia de linfocitos T CD8+ congénicos CD45.2 Kb-OVA pentámeros+, aislados de ratones de TS infectados con LM-OVA, con desactivación de Suv39h1, en ratones receptores CD45.1 sin exposición previa (1: Clasificación y transferencia de subconjuntos de T CD8+ (D0); 2; análisis de autorrenovación y diferenciación (D40-44). 40 días después de la transferencia adoptiva, los ratones receptores sin exposición previa fueron expuestos con LM-OVA, y 4 días después, los linfocitos T CD8+ de pentámeros Kb-OVA+ fueron analizadas por FACS. B. Se muestran gráficos FACS representativos de linfocitos T CD8+ de donantes y receptores. C. Se midió el número total de linfocitos T CD8+ recuperados. Los resultados son datos combinados de 2 experimentos independientes.

Figura 4: Las células CD8+OT-1 deficientes en Suv39h1 controlan el crecimiento tumoral. (A) Se transfirieron células tratadas con IL-2/OVA Suv39h1-KO CD45,2 OT-1 y las células de TS de compañeros de camada se transfirieron por vía i.v. en ratones con tumor receptores después de 7 días de inoculación y se inyectaron intraperitonealmente con anticuerpo anti-PD-1 (Bio X Cell, RMP-14). Las curvas de crecimiento tumoral de las células tratadas IL-2/OVA de compañero de camada de TS (B) y Suv39h1-KO OT-1 (C) se transfirieron adoptivamente a ratones con portadores de tumor receptores.

RESULTADOS

Material y métodos:

Los ratones compañeros de camada y con desactivación de Suv39h1 se infectaron por vía i.v. con 5x103 UFC y se expusieron 40 días después con 2x106 UFC recombinante de Listeria monocytogenes que expresan OVA (LM-OVA, que proviene de la cepa de tipo silvestre 140403s). Las bacterias se cultivaron en medio TSB (BD Bioscience) hasta la fase logarítmica temprana y su crecimiento se evaluó con un fotómetro a DO600. Los linfocitos T CD8+dump'CD44alta Kb-OVA+ y los subconjuntos relacionados se clasificaron por FACS. Para cada subconjunto analizado, los presentes inventores han recolectado 3 o 4 réplicas biológicas. El ARN se extrajo usando Rneasy Micro Kit (QUIGEN) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se incluyó un tratamiento con desoxirribonucleasa en columna (QUIGEN). Para cada condición, se empleó ARN para sintetizar ADNc de acuerdo con el protocolo estándar de Affymetrix. El ADN marcado se hibridó en el Affymetrix mouse Gene 2.1 ST y se procesó en un dispositivo Affymetrix GeneTitan.

Análisis de datos de micromatriz:

Los datos de micromatrices se procesaron en R (versión 3.0.0) utilizando paquetes de Bioconductor. Se utilizaron archivos CEL de datos sin tratar y el análisis de control de calidad se realizó utilizando el paquete ArrayQualityMetrics. Los datos sin tratar fueron preprocesados utilizando el método RMA disponible en el paquete oligo. Las sondas sin anotación se eliminaron del análisis. Las pruebas de la t moderadas se realizaron utilizando el paquete limma y los pvalores se ajustaron mediante la prueba múltiple con el método de Benjamini Hochberg. Por último, los presentes inventores consideraron estadísticamente significativo si el p-valor ajustado es inferior al 5 %.

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) se realizó con genes con firmas inmunológicas (C7) y conjuntos de genes C2 (seleccionados) de la base de datos Molecular Signatures DataBase (base de datos MSigDB v5.1, http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.isp). El archivo GMT se descargó con la información del símbolo genético. El archivo GCT estaba compuesto por un total de 41345 sondas y se importó a GSEA. El GSEA se estaba ejecutando con los parámetros predeterminados, excepto el número de permutación (n = 10000). El análisis de BubbleGUM se ha realizado tal como se describió anteriormente.

El análisis del crecimiento tumoral en células CD8+ OT-1 deficientes en Suv39h1 se realizó como sigue;

El bazo total y los ganglios linfáticos de machos Suv39h1-KO CD45.2 OT-1 (específico para el péptido OVA257-264 SIINFEKL en un contexto de H2-Kb MHC clase I) y compañeros de camada de TS se cultivaron en medio completo (RPMI 1640 suplementado con FBS al 10 %, penicilina-estreptomicina y L-glutamina) durante 3 días y luego se activó con 100 Ul/ml de IL-2 y 1 ug/ml de péptido o Va 257-264 durante otros 3 días.

Para la inoculación de tumores, se inyectaron 1x106 células de linfoma EL4-OVA por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones macho CD45.1/C57BL/6 y después de 7 días, los ratones fueron inyectados por vía i.v. con 2x106 células Suv39h1-KO CD45.2 OT-1 tratadas con IL-2/OVA o células de compañero de camada de TS.

Se inyectó intraperitonealmente a los ratones anti-PD1 (Bio X Cell, RMP-14) administrado a una dosis de 7,5 mg/kg de peso corporal por dosis dos veces por semana durante 2 semanas. El crecimiento del tumor se midió usando un calibre manual.

Resultados:

1) Los resultados de los presentes inventores muestran que en la población celular obtenida de ratones con desactivación de Suv39h1, los progenitores tempranos con fenotipo "similar a células madre" se acumulan y reprograman con mayor eficacia en linfocitos T de memoria central de larga duración que expresan tanto CD44 como CD62L en comparación con la población celular obtenida de ratones de tipo silvestre. Como se ilustra en la Figura 1, la proporción y el número de linfocitos T de memoria central (que expresan tanto CD44 como CD62L) aumentan en ratones con deficiencia en Suv39h1.

2) Se utilizó el análisis transcriptómico para comprender el mecanismo de este peculiar fenotipo:

Se inmunizaron ratones de tipo silvestre y deficientes en Suv39h1 con Listeria m que expresa OVA. y los linfocitos T específicos de OVA se aislaron el día 7 después de la inmunización usando citometría de flujo de clasificación. Después del análisis de Affymetrix de las células, los presentes inventores descubrieron que los linfocitos T efectores de Suv39h1 expresan niveles más altos de ARNm que codifican proteínas relacionadas con las células madre (firma de memoria similar a las células madre T CD8+ (86 genes): Abcb1a Irf8 Rest Abcb1b Jarid2 Rif1 Alpl Kat6a Rnf138 Antxr2 Klf4 Rras Arl4c Ldha Sall4 Atr Ldhb Satb1 Baalc Ldhc Setbp1 Basp1 Ldhd Setdb1 Bcl6 Lect1 Skil Bub1 Lpin1 Smarcad1 Ccr7 Ly6a Sox2 Ccr9 Ly6e Spon1 Cd27 Map3k8 Stat3 Cxcr6 Mapk12 Tbx3 Dock9 Mcm3ap Tcf3 Dusp9 Mcoln2 Tcl1 Eomes Myc Tdgf1 Esrrb Nanog Tert Evl Ncor2 Tigit Fas Nr0b1 Tnfaip2 Fgf2 Nr1d2 Tnfrsflb Fut4 P2ry14 Traf1 Gzmk Pax6 Traf4 Hand1 Pcgf2 Trib2 Hesx1 Plekha5 Txnip ler3 Podxl Zfp42 Il2rb Pou5f1 Zfx Il7r Pou6f1 Zic3 Irf4 Prkce).

Los presentes inventores concluyeron que los linfocitos T específicos de OVA de ratones deficientes en Suv39h1 estimulados después de la infección por Listeria m. expresan una firma de ARNm similar a una "célula madre".

3) Los linfocitos T CD8+ deficientes en Suv39h1 muestran una mayor supervivencia y autorrenovación in vivo. Los linfocitos T CD8+ congénicos CD45.2 Kb-OVA pentámeros+, aislados de los ratones de TS y los que tienen desactivación de Suv39h1 infectados con LM-OVA se transfirieron a ratones receptores CD45.1 sin tratamiento previo.

40 días después de la transferencia adoptiva, los ratones receptores sin exposición previa fueron expuestos con LM-OVA, y 4 días después, los linfocitos T CD8+ de pentámeros Kb-OVA+ fueron analizadas por FACS.

Tal como se ilustra en la figura 3, el resultado muestra que las células deficientes en Suv39h1 expresan niveles aumentados de una firma "similar a una célula madre". También sobreviven mejor y repueblan de manera más eficaz a ratones de tipo silvestre después de la transferencia adoptiva.

4) Las células CD8+ OT-1 deficientes en Suv39h1 controlan el crecimiento tumoral in vivo

Las Figuras 4 B y C muestran que los ratones transferidos adoptivamente con células Suv39h1-KO OT-1 y tratados con anticuerpo monoclonal anti-PD1 controlaron el crecimiento tumoral mejor que los ratones que recibieron un tratamiento similar pero con células OT-1 de TS. Cabe destacar que, el día 30 después de la inyección del tumor, 4 de cada 5 ratones transferidos con OT-1 de TS mostraron un tumor en crecimiento, en comparación con solo 1 de cada 5 ratones inyectados con las células OT-1 con desactivación de Suv39h1.

Conclusiones

La ausencia de actividad de Suv39h1 en los linfocitos T CD8+ se asocia con una mejor eficacia antitumoral en un enfoque terapéutico adoptivo basado en la transferencia de linfocitos T.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una célula inmunitaria diseñada genéticamente con deficiencia en Suv39hl, para su uso en terapia celular adoptiva del cáncer, en donde la expresión y/o la actividad de Suv39hl se ha bloqueado o inhibido selectivamente y en donde dicha célula inmunitaria modificada:

- es un linfocito T, un linfocito citolítico natural o un progenitor de linfocitos T, y

- comprende además uno o más receptores de antígenos modificados genéticamente que se unen específicamente a un antígeno diana.

2. La célula inmunitaria diseñada genéticamente, con deficiencia para Suv39hl para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen SUV39hl ha sido reprimido o alterado.

3. La célula inmunitaria diseñada genéticamente, con deficiencia para Suv39hl para el uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la represión o alteración de genes se logra mediante el silenciamiento de genes, técnicas de reducción de expresión, inactivación, inserción y/o alteración genética, tales como la edición de genes.

4. La célula inmunitaria diseñada genéticamente, con deficiencia para Suv39hl para el uso de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde la represión o alteración del gen Suv39hl implica la deleción del gen completo, del exón, 0 de la región, el reemplazo con una secuencia exógena y/o la mutación por desplazamiento de marco o la mutación sin sentido dentro del gen.

5. La célula inmunitaria diseñada genéticamente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el linfocito T es un linfocito T CD4+, un linfocito T CD8+ o un linfocito T CD4+/CD8+.

6. La célula inmunitaria diseñada genéticamente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la célula es autóloga.

7. La célula inmunitaria diseñada genéticamente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la célula es alogénica.

8. La célula inmunitaria diseñada genéticamente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el antígeno diana se expresa en células cancerosas y/o es un antígeno tumoral universal.

9. La célula inmunitaria diseñada genéticamente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde uno o más receptores de antígenos diseñados genéticamente es un receptor de linfocitos T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que incluye una o más moléculas de unión a antígenos en su porción extracelular.

10. La célula inmunitaria diseñada genéticamente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la célula expresa además al menos un segundo receptor diseñado genéticamente que reconoce un antígeno diferente.

11. La célula inmunitaria diseñada genéticamente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que se incluye en una composición farmacéutica.

12. La célula inmunitaria diseñada genéticamente o una composición que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicha célula o composición se administra en combinación con un modulador de punto de control inmunitario.

13. La célula inmunitaria modificada o una composición que la comprende para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el modulador del punto de control inmunitario se selecciona de un anti-PD1 o un anti-PDL1.

14. Un método para producir una célula inmunitaria diseñada genéticamente tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13 que comprende la inhibición de la expresión y/o de la actividad de Suv39hl en la célula inmunitaria; y la introducción en dicha célula inmunitaria de uno o más receptores de antígenos diseñados genéticamente que se unen específicamente a un antígeno diana.