ES2711086T3 - Reactivación de la expresión génica del VIH-1 para tratar la infección persistente por VIH - Google Patents

Abstract

Una decitabina inhibidora de la metilación del ADN para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la infección por VIH en un sujeto que necesita tal tratamiento, en donde se administra una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de dicho inhibidor de la metilación del ADN a dicho sujeto y en donde una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un inhibidor de la histona desacetilasa seleccionado del grupo que comprende: hidroxamatos, péptidos cíclicos, ácidos alifáticos y benzamidas, se administra a dicho sujeto después de haber administrado dicho inhibidor de la metilación del ADN.

Description

DESCRIPCION

Reactivacion de la expresion genica del VIH-1 para tratar la infeccion persistente por VIH

Campo de la invencion

La presente invencion se encuentra en el campo de medico, mas particularmente en el campo del tratamiento de enfermedades infecciosas tales como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). La invencion proporciona un nuevo metodo para tratar infecciones (latentes) por el VIH y composiciones para su uso en ellas.

Antecedentes de la invencion

A pesar de una politerapia antirretrovmca eficaz (cART, forma siglada de combination antiretroviral therapy), la persistencia de los reservorios de VIH-1, que albergan provirus VIH-1 integrados de forma estable transcripcionalmente silenciosos pero competentes para la replicacion, desaffa seriamente la esperanza de erradicacion del VIH-1 en personas infectadas con VIH tratadas con cART. De hecho, los reservorios de VIH-1 son insensibles a la cART y pueden escapar de la respuesta inmunitaria del huesped. Por lo tanto, estos reservorios latentes son una fuente permanente para la reactivacion del virus y podnan ser responsables del restablecimiento de la carga vmca plasmatica observada despues de la interrupcion de la cART. En consecuencia, el tratamiento con cART precisa un cumplimiento terapeutico de por vida, lo que conduce a varios efectos secundarios a largo plazo y a una esperanza de vida inferior a la de los individuos no infectados. Se han propuesto varios enfoques terapeuticos dirigidos a lograr una cura esterilizante (eliminacion del VIH del cuerpo humano) o - mas probablemente - una cura funcional (control a largo plazo de la infeccion por VIH y progresion de la enfermedad en ausencia de cART). En este contexto, la reactivacion de la expresion genica del VIH-1 en celulas infectadas de forma latente junto con una cART eficaz, podna servir como una terapia adyuvante dirigida a disminuir el conjunto de reservorios persistentes.

La inhibicion transcripcional del VIH-1 es crucial para el establecimiento y mantenimiento de la latencia posintegracion. La organizacion de la cromatina y el control epigenetico del promotor del VIH-1 son elementos clave en este silenciamiento transcripcional. Por un lado, el nucleosoma represivo nuc-1, emplazado inmediatamente cadena abajo del sitio de inicio de la transcripcion, se mantiene hipoacetilado por las histonas desacetilasas (las HDAC) en condiciones latentes. El laboratorio de los inventores ha informado anteriormente que el tratamiento de lmeas celulares infectadas con VIH-1 de forma latente con inhibidores de las HDAC (HDACI) induce la transcripcion vmca y el remodelado de nuc-1. Ademas, el laboratorio de los inventores demostro que la metilacion de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9) en microgliocitos y, otros, en linfocitos T o celulas del paciente, desempena un papel importante en la represion mediada por cromatina de la expresion del VIH-1. Las histona metiltransferasas (las HMT) Suv39H1, que esta implicada principalmente en la trimetilacion de H3K9 (H3K9me3), y G9a, que es responsable de la dimetilacion de H3K9 (H3K9me2), han demostrado desempenar un papel en el silenciamiento transcripcional del VIH-1. Por otro lado, el laboratorio de los inventores y otros informaron que la metilacion del ADN es otra modificacion epigenetica implicada en la latencia posintegracion del VIH-1. La metilacion del ADN, probablemente junto con las modificaciones de histonas represivas, contribuye a "bloquear" el estado silencioso del provirus y hace diffcil su regreso a un estado activo. Estas observaciones sugieren que los inhibidores de la HDAC o la HMT, o de la metilacion del ADN, junto con una cART eficaz, constituyen buenos candidatos a farmacos anti-latencia, destinados a reducir/eliminar el conjunto de reservorios latentes hasta un nivel tolerable por el sistema inmunitario del huesped.

En este contexto, varios estudios clmicos han probado el potencial de reactivacion de un HDACI solo (acido valproico (VPA) o de vorinostat (acido hidroxamico suberoilanilida, SAHA), dos farmacos aprobados por la FDA), en cultivos celulares ex vivo aislados de sangre de pacientes VIH+. Si bien sus resultados publicados o sus resultados preliminares no publicados son alentadores, cuestionan la eficacia de estos farmacos utilizados solos para reducir el tamano de los reservorios de VIH-1 latentes. El laboratorio de los inventores ha demostrado previamente que el uso combinado de dos farmacos (un HDACI mas un inductor de NF-KappaB, prostratina) provoca una reactivacion sinergica de la produccion de VIH-1, es decir, una reactivacion mayor que la suma de las reactivaciones producidas por cada farmaco de forma individual en lmeas celulares usadas infectadas de forma latente. Ademas, la misma combinacion de farmacos reactiva la expresion del VIH-1 en cultivos de CMSP empobrecidos en CD8+ procedentes de pacientes tratados con cART en una proporcion mayor de celulas que la observada con los farmacos usados solos. Por lo tanto, han demostrado la validez del planteamiento teorico para la coadministracion de dos tipos distintos de inductores del VIH-1 terapeuticamente promisorios junto con una cART eficaz como una perspectiva terapeutica para disminuir el conjunto de reservorios de VIH-1 latentes. Sin embargo, en el 40 % de sus cultivos, no pudieron detectar ningun crecimiento vmico despues del tratamiento con prostratina y las HDACI, de forma individual o en combinacion. Esto podna ser el resultado de una represion epigenetica mas fuerte de algunos provirus integrados en celulas en reposo, que impedina una reactivacion transcripcional y expresion vmcas eficaces, destacando de este modo la importancia de encontrar nuevas estrategias combinatorias de reactivacion.

En consecuencia, la presente divulgacion utiliza el potencial de reactivacion del VIH-1 de otras dos clases de compuestos, es decir, de los inhibidores de la metilacion del ADN y los inhibidores de la histona metiltransferasa (los HMTI), solos o en combinacion con otras clases de inductores del VIH-1.

En el contexto de una combinacion que incluye un inhibidor de la metilacion del ADN, otros documentos tambien han sugerido o mencionado este tipo de uso. En Colin y Van Lint, 2009 (Retrovirology Vol. 6, diciembre de 2009, ISSN:1742-4690), se sugiere anadir inhibidores de la metilacion del ADN y las HDACI a las terapias antivmcas actuales. En la solicitud PCT WO2011/038224, se divulga una composicion que comprende un agente inductor de virus seleccionado de inhibidores de la histona desacetilasa, inhibidores de la metilacion del ADN o combinaciones de los mismos, para su uso en el tratamiento de afecciones vmcas. En la solicitud PCT WO02/085400 se divulga una composicion que comprende un inhibidor de la metilacion del ADN y un inhibidor de la histona desacetilasa para su uso en el tratamiento del cancer. Zhu Wei-Guo et al., 2000 (Proceedings Of the American Association for Cancer Research Annual Meeting, N.° 41, marzo de 2000, pagina 350) informan sobre la combinacion de 5-azacitidina con tricostatina A o depsipeptido para inducir la expresion de p16. Demonte D et al., 2004 (Biochem. Pharmacol. vol. 68, n.° 6, 15 de septiembre de 2004) informaron sobre la administracion de inhibidores de la HDAC para reactivar la expresion del VIH-1 en reservorios celulares latentes. La solicitud PCT WO2011113013 divulga metodos y composiciones para tratar afecciones vmcas que comprenden inhibidores de la HDAC.

Sin embargo, la presente divulgacion abarca la administracion de una combinacion secuencial que incluye un inhibidor de la metilacion del ADN (decitabina) y un HDACI seleccionado de hidroxamatos, peptidos dclicos, acidos alifaticos y benzamidas para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada con la infeccion por VIH, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Sumario de la invencion

La presente divulgacion utiliza el potencial de reactivacion del VIH-1 de dos clases de compuestos, es decir, inhibidores de la metilacion del ADN (5-aza-2'desoxicitidina [5-aza-CdR o decitabina]) e inhibidores de la histona metiltransferasa (quetocina y BIX-01294), solos o en combinacion con otras clases de inductores del VIH-1.

La presente divulgacion informa que un inhibidor de la metilacion del ADN o un inhibidor de la HMT, solo o en combinacion con otros inductores del VIH-1, reactiva la produccion de VIH-1 de su estado latente, y en mayor grado cuando los farmacos se usan en combinacion. En consecuencia, esto podna conducir, junto con la terapia antirretrovmca continua, a una estrategia terapeutica para disminuir el conjunto de reservorios latentes en pacientes infectados VIH+ tratados con cART.

Por un lado, los inventores han analizado el efecto reactivante de combinaciones que incluyen el inhibidor de la metilacion del ADN 5-aza-CdR, aprobado para la terapia humana del smdrome mielodisplasico, y varios HDACI que incluyen distintas familias estructurales de HDACI usadas en terapia humana (tales como VPA, butirato de sodio (NaBut) o SAHA) o en un ensayo clmico (tal como MS-275) (Figura 5). Han demostrado que tales combinaciones indujeron una reactivacion sinergica de la produccion de VIH-1 en lmeas de linfocitos T del modelo de latencia posintegracion (a nivel tanto del ARNm vmco como de protemas) y que se observaron las mejores sinergias utilizando las combinaciones 5-aza-CdR+NaBut y 5-aza-CdR+SAHA (Figura 5). Estas sinergias se debieron, al menos parcialmente, a la inclusion sinergica de celulas que no responden en la poblacion celular que expresa (Figura 5b), y estuvieron acompanados por una desmetilacion parcial de dinucleotidos CpG en el 5'LTR del VIH-1. Ademas, los datos preliminares de los inventores en cultivos de CMSP empobrecidos en c D8+ aislados de pacientes VIH+ tratados con cART con una carga vmca indetectable, han puesto en relieve que 5-aza-CdR puede aumentar el potencial de reactivacion de SAHA.

En una realizacion preferente, el inhibidor de la metilacion del ADN, tal como 5-aza-CdR, se combina con los HDACI que incluyen distintas familias estructurales de HDACI utilizadas en terapia humana, tales como VPA, butirato de sodio (NaBut) o SAHA. La combinacion con butirato de sodio es particularmente preferente debido a su menor toxicidad y mayor actividad en comparacion con SAHA.

Por otro lado, los inventores han evaluado el potencial terapeutico de los inhibidores de la HMT (quetocina y BIX-01294, dos inhibidores espedficos de Suv39H1 o de G9a, respectivamente) por su efecto sobre la reactivacion del VIH-1 de la latencia. En primer lugar, en lmeas celulares infectadas de forma latente, los inventores demostraron que el HMTI quetocina solo aumento la expresion genica y la produccion del VIH-1 (Figura 1) y que funciono de forma sinergica con la prostratina inductora de NF-kB no tumoral (Figura 2). En segundo lugar, los inventores han medido la recuperacion del VIH-1 en cultivos ex vivo de CMSP empobrecidas en CD8+ o de linfocitos T CD4+ en reposo aislados de 67 pacientes VIH+ tratados con cART con carga vmca indetectable despues del tratamiento con un HMTI solo o en combinacion con otros Inductores del VIH-1 (en ausencia de IL-2 y de estimulacion alogenica). Han demostrado, por primera vez, que la quetocina induda la recuperacion del VIH-1 en el 50 % de los cultivos de CMSP empobrecidos en CD8+ (Tabla 2a) y en el 86 % de los cultivos de linfocitos T CD4+ en reposo (Tabla 2b) aislados de pacientes VIH-1 tratados con cART, mientras que BIX-01294 reactivo la expresion de VIH-1 en el 80 % de los cultivos de linfocitos T CD4+ en reposo (Tabla 4) aislados de pacientes similares. Ademas, han demostrado que los tratamientos combinatorios que incluyen un HMTI y HDACI o SAHA, o el inductor de NF-kB no promotor de tumores prostratina tienen un mayor potencial de reactivacion que los tratamientos con estos compuestos solos (Figura 3 y 4, y Tabla 3). En conclusion, los inventores han demostrado por primera vez que los HMTI utilizados solos o en combinacion con otros inductores del VIH-1 provocan la recuperacion del VIH-1 en los linfocitos T CD4+ de memoria en reposo de pacientes tratados con cART. Estos resultados se publicaron en AIDS, en julio de 2012 (BOUCHAT et al., AIDS, 26(12), 1473-1482.PMID:22555163). Aunque la quetocina y BIX-01294 no pueden administrate de manera segura a los seres humanos, sus resultados constituyen una validez del planteamiento teorico para el uso de los HMTI en estrategias dirigidas a reducir el conjunto de reservorios latentes de VIH-1. Dado que los HMTI tambien representan compuestos prometedores en las terapias contra el cancer, se deben sintetizar pronto otros HMTI mas seguros, y deben evaluarse en cuanto a su potencial de reactivacion en individuos VIH-1 tratados con cART.

Estos resultados sugieren la administracion de inhibidores de la metilacion del ADN o de la HMT solos o en combinacion con otros inductores del VIH-1, junto con el cART continuo, como posibles estrategias terapeuticas para reactivar el VIH-1 a partir de la latencia en pacientes infectados.

La presente invencion esta definida por las reivindicaciones adjuntas. Se divulgan adicionalmente los siguientes puntos:

1. Un metodo para tratar una enfermedad o afeccion asociada con un retrovirus en un sujeto que necesita tal tratamiento, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de:

a) un inhibidor de la metilacion del ADN y

b) un inhibidor de la histona desacetilasa.

2. El metodo de acuerdo con el punto 1, en donde el inhibidor de la histona desacetilasa, se administra despues de haber administrado el inhibidor de la metilacion del ADN.

3. El metodo de acuerdo con el punto 1 o 2, en donde dicho inhibidor de la metilacion del ADN se selecciona de las dos clases de inhibidores de la metilacion del ADN (agentes de desmetilacion no nucleosfdicos y nucleosfdicos) que incluyen: 5-azacitidina (azacitidina), 5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza-CdR, decitabina), 1-p-Darabinofuranosil-5-azacitosina (fazarabina), dihidro-5-azacitidina (DHAC), 5-fluorodesoxicitidina (FdC), duplex de oligodesoxinucleotidos que contienen 2-H pirimidinona, zebularina, oligodesoxinucleotidos antisentido (los ODN), MG98, (-)-epigalocatequina-3-galato, hidralazina, procama y procainamida.

4. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en donde dicho inhibidor de la metilacion del ADN es 5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza-CdR, decitabina).

5. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en donde dicho inhibidor de la histona desacetilasa se selecciona de distintas familias de HDACI (hidroxamatos, peptidos dclicos, acidos alifaticos y benzamidas) que incluyen TSA, SAHA, MS-275, acidos aminosuberoil hidroxamicos, bishidroxamato de acido M-Carboxicinamico, LAQ-824, LBH-589, belinostat (PXD-101), Panobinostat (LBH-589), un analogo de acido cinamico hidroxamico de bishidroxamato de acido M-carboxicinamico, IF2357, hidroxamidas del acido ariloxialcanoico, depsipeptido, apicidina, grupo de moleculas peptfdicas dclicas que contienen acido hidroxamico, FK-228, f K rojo, un peptidomimetico dclico unido por una cadena alifatica a un acido hidroxamico, butirato, fenilbutirato, butirato de sodio, acido valproico, butirato de pivaloiloximetilo, 5 NOX-275 y MGCD0103.

6. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 5, en donde dicha histona desacetilasa es acido hidroxamico suberoilanilida (SAHA, Vorinostat) o butirato de sodio (NaBut).

7. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 6, en donde se utiliza la combinacion de 5-aza-2'-desoxicitidina SAHA y 5-aza-2'-desoxicitidina NaBut.

8. Un metodo para tratar una enfermedad o afeccion asociada con un retrovirus en un sujeto que necesita tal tratamiento, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un inhibidor de la histona metil-transferasa.

9. El metodo de acuerdo con el punto 8, en donde dicho inhibidor de la histona metiltransferasa se selecciona del grupo que comprende: quetocina, UNC0224, diazepinil-quinazolinamina, inhibidor de la HMTasa basado en analogo no SAM (S-adenosilmetionina), BIX-01294, b Ix -01338 (hidrato) y 2-Ciclohexil-N-(1-isopropilpiperidin-4-il)-6-metoxi-7-(3-(pirrolidin-1-il)propoxi) quinazolin-4-amina.

10. El metodo de acuerdo con el punto 8 o 9, en donde dicha histona metiltransferasa es quetocina o BIX-01294.

11. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 8 a 10, que comprende adicionalmente la administracion de: un inductor del VIH, tal como:

a) un inductor de NF-kappa-B seleccionado del grupo del grupo que comprende: PMA, prostratina, briostatina y TNF-alfa, y/o

b) un inhibidor de la histona desacetilasa seleccionado de distintas familias (hidroxamatos, peptidos dclicos, acidos alifaticos y benzamidas) que incluyen: TSA, SAHA, MS-275, acidos aminosuberoil hidroxamicos, bishidroxamato de acido M-Carboxicinamico, LAQ-824, LBH-589, belinostat (PXD-101), Panobinostat (LBH-589), un analogo de acido cinamico hidroxamico de bishidroxamato de acido M-carboxicinamico, IF2357, hidroxamidas del acido ariloxialcanoico, depsipeptido, apicidina, grupo de moleculas peptfdicas dclicas que contienen acido hidroxamico, FK-228, FK rojo, un peptidomimetico dclico unido por una cadena alifatica a un acido hidroxamico, butirato, fenilbutirato, butirato de sodio, acido valproico, butirato de pivaloiloximetilo, 5 NOX-275 y MGCD0103, y/o

c) un inhibidor de la metilacion del ADN seleccionado de dos clases (agentes de desmetilacion no nucleosfdicos y nucleosfdicos ) que incluyen: 5-azacitidina (azacitidina), 5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza-CdR, decitabina), 1-p-Darabino-furanosil-5-azacitosina (fazarabina) y dihidro-5-azacitidina (DHAC), 5-fluorodesoxicitidina (FdC), duplex de oligodesoxinucleotidos que contienen 2-H pirimidinona, zebularina, oligodesoxinucleotidos antisentido (los ODN), MG98, (-)-epigalocatequina-3-galato, hidralazina, procama y procainamida.

12. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 8 a 11, en donde se utiliza la combinacion de quetocina prostratina y quetocina SAHA.

13. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 8 a 11, en donde se utiliza la combinacion de BIX-01294 SAHA.

14. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 13, en donde dicho retrovirus se selecciona del grupo que consiste en: VIH-1, VIH-2, el VTLH -1 y el VTLH -2.

15. Una composicion o formulacion farmaceutica que comprende:

a) un inhibidor de la metilacion del ADN,

b) un inhibidor de la histona desacetilasa, y

c) uno o mas componentes adicionales, como, pero sin limitacion, uno o mas disolventes y/o uno o mas transportadores farmaceuticamente aceptables, opcionalmente para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada con un retrovirus en un sujeto que necesita tal tratamiento, dicha composicion farmaceutica.

16. La composicion farmaceutica de acuerdo con el punto 15, en donde dicho inhibidor de la metilacion del ADN se selecciona de dos clases (agentes de desmetilacion del ADN no nucleosfdicos y nucleosfdicos) que comprenden: 5-azacitidina (azacitidina), 5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza-CdR, decitabina), 1-p-Darabinofuranosil-5-azacitosina (fazarabina) y dihidro-5-azacitidina (DHAC), 5-fluorodesoxicitidina (FdC), duplex de oligodesoxinucleotidos que contienen 2-H pirimidinona, zebularina, oligodesoxinucleotidos antisentido (los ODN), MG98, (-)-epigalocatequina-3-galato, hidralazina, procama y procainamida.

17. La composicion farmaceutica de acuerdo con el punto 15, en donde dicho inhibidor de la metilacion del ADN es 5-aza-2'-desoxicitidina.

18. La composicion farmaceutica de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 15 a 17, en donde dicho inhibidor de la histona desacetilasa se selecciona de distintas familias (hidroxamatos, peptidos dclicos, acidos alifaticos y benzamidas) que incluyen: TSA, SAHA, MS-275, acidos aminosuberoil hidroxamicos, bishidroxamato de acido M-Carboxicinamico, LAQ-824, LBH-589, belinostat (PXD-101), Panobinostat (LBH-589), un analogo de acido cinamico hidroxamico de bishidroxamato de acido M-carboxicinamico, IF2357, hidroxamidas del acido ariloxialcanoico, depsipeptido, apicidina, grupo de moleculas peptfdicas dclicas que contienen acido hidroxamico, FK-228, FK rojo, un peptidomimetico dclico unido por una cadena alifatica a un acido hidroxamico, butirato, fenilbutirato, butirato de sodio, acido valproico, butirato de pivaloiloximetilo, 5 NOX-275 y MGCD0103.

19. La composicion farmaceutica de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 15 a 18, en donde dicho inhibidor de la histona desacetilasa es SAHA o NaBut.

20. La composicion farmaceutica de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 15 a 19, en donde dicho inhibidor de la metilacion del ADN es 5-aza-2'-desoxicitidina y dicho inhibidor de la histona desacetilasa es SAHA o NaBut.

21. Una composicion o formulacion farmaceutica que comprende:

a) un inhibidor de la histona metiltransferasa, y

b) uno o mas componentes adicionales, como, pero sin limitacion, uno o mas disolventes y/o uno o mas transportadores farmaceuticamente aceptables, opcionalmente para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada con un retrovirus en un sujeto que necesita tal tratamiento.

22. La composicion farmaceutica de acuerdo con el punto 21, en donde dicho inhibidor de la histona metiltransferasa se selecciona del grupo que comprende: quetocina, UNC0224, diazepinil-quinazolinamina, inhibidor de la HMTasa basado en analogo no SAM (S-adenosilmetionina), BIX-01294, BlX-01338 (hidrato) y 2-Ciclohexil-N-(1-isopropilpiperidin-4-il)-6-metoxi-7-(3-(pirrolidin-1-il)propoxi)quinazolin-4-amina.

23. La composicion farmaceutica de acuerdo con el punto 21 o 22, que comprende adicionalmente: un inductor del VIH, tal como:

a) un inductor de NF-kappa-B seleccionado del grupo del grupo que comprende: PMA, prostratina, briostatina y TNF-alfa, y/o

b) un inhibidor de la histona desacetilasa seleccionado de distintas familias (hidroxamatos, peptidos dclicos, acidos alifaticos y benzamidas) que incluyen: TSA, SAHA, MS-275, acidos aminosuberoil hidroxamicos, bishidroxamato de acido M-Carboxicinamico, LAQ-824, LBH-589, belinostat (PXD-101), Panobinostat (LBH-589), un analogo de acido cinamico hidroxamico de bishidroxamato de acido M-carboxicinamico, IF2357, hidroxamidas del acido ariloxialcanoico, depsipeptido, apicidina, grupo de moleculas peptfdicas dclicas que contienen acido hidroxamico, FK-228, FK rojo, un peptidomimetico dclico unido por una cadena alifatica a un acido hidroxamico, butirato, fenil butirato, butirato de sodio, acido valproico, butirato de pivaloiloximetilo, 5 NOX-275 y MGCD0103, y/o

c) un inhibidor de la metilacion del ADN seleccionado de dos clases (agentes de desmetilacion no nucleosfdicos y nucleosfdicos ) que comprenden: 5-azacitidina (azacitidina), 5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza-CdR, decitabina), 1-p-Darabino-furanosil-5-azacitosina (fazarabina) y dihidro-5-azacitidina (DHAC), 5-fluorodesoxicitidina (FdC), duplex de oligodesoxinucleotidos que contienen 2-H pirimidinona, zebularina, oligodesoxinucleotidos antisentido (los ODN), MG98, (-)-epigalocatequina-3-galato, hidralazina, procama y procainamida.

24. La composicion farmaceutica de acuerdo con el punto 23, que comprende la combinacion de quetocina prostratina o quetocina SAHA.

25. La composicion farmaceutica de acuerdo con el punto 23, que comprende la combinacion de BIX-01294 y SAHA.

26. Un metodo para producir las composiciones o la formulacion de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, que comprende combinar los distintos componentes en una composicion o formulacion.

27. La composicion de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 15 a 25, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada con un retrovirus, seleccionado preferentemente del grupo que consiste en: VIH-1, VIH-2, VTLH -1 y VTLH -2, preferentemente de infecciones latentes.

28. La composicion de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 15 a 25, para uso en la erradicacion de infecciones retrovmcas latentes y/o en la destruccion de reservorios retrovrncos.

29. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada con un retrovirus, seleccionado preferentemente del grupo que consiste en: VIH-1, VIH-2, VTLH -1 y VTLH -2, mas preferentemente de infecciones latentes, en donde el inhibidor de la histona desacetilasa se administra despues de dicho inhibidor de la metilacion del ADN.

Breve descripcion de las figuras

La presente invencion se ilustra mediante las siguientes figuras, que deben considerarse solo con fines ilustrativos y de ninguna manera limitan la invencion a las realizaciones divulgadas en ella:

A. Resultados para los HMTI solos o en combinacion con inductores de VIH-1

Figura 1. La quetocina induce la recuperacion del VIH-1 de una manera dependiente de la dosis, (a, b) La quetocina aumenta la actividad transcripcional del 5'LTR del VIH-1 en celulas T linfoides transfectadas. Se transfectaron de forma transitoria las lmeas celulares Jurkat o SupT1 con la construccion indicadora episomica PLTRhiv-1-Iuc. A las 24 h postransfeccion, las celulas se trataron de forma simulada o se trataron con quetocina como se indica. A las 24 h posinduccion, las celulas se lisaron y se sometieron a ensayo en cuanto a la actividad luciferasa. Las actividades de la luciferasa se normalizaron con respecto a las concentraciones de protema. El resultado obtenido con las celulas tratadas de forma simulada se establecio de forma arbitraria en un valor de 1.

(c, d) La quetocina aumenta la produccion de V IH -1 en la lmea celular infectada de forma latente J-Lat 15.4.

La lmea celular J-Lat 15.4 se trato de forma simulada o se trato con quetocina como se indica. Se midio la produccion de p24 en los sobrenadantes celulares (c) o la viabilidad celular (d). El resultado obtenido con celulas tratadas de forma simulada se establecio de forma arbitraria en un valor de 1 o del 100 %, respectivamente. Tabla 1. La quetocina induce la recuperacion del VIH-1 de una manera dependiente de la dosis en CMSP empobrecidas en CD8+ aisladas de pacientes tratados con cART infectados con VIH-1 con una carga virica indetectable. Los cultivos de CMSP empobrecidas en CD8+ se trataron de forma simulada o se trataron con quetocina (30, 60 o 90 nmol/l) o con el control positivo. Seis dfas despues del tratamiento, se determino la concentracion de ARN vmco en los sobrenadantes de cultivo (en copias/ml; 'I' indica por debajo del umbral).

Tabla 1: CMSP em obrecidas en CD8+

Figura 2: El tratamiento combinado de quetocina+prostratina aumenta de forma sinergica la transcripcion del VIH-1 en la lmea celular infectada de forma latente J-Lat 15.4.

La lmea celular J-Lat 15.4 se trato de forma simulada o se trato con quetocina, prostratina o una combinacion de ambos farmacos. Se extrajo el ARN total de estas celulas y se transcribio de forma inversa utilizando cebadores aleatorios. Despues, los cADN se usaron en una reaccion de PCR con parejas de cebadores que hibridaban con TAR, para cuantificar los transcritos iniciados o en Tat para cuantificar los transcritos extendidos. Los resultados se normalizaron usando p actina y se presentan como histogramas que indican la induccion en veces, en comparacion con las condiciones de tratamiento de forma simulada.

Tabla 2: La quetocina induce la recuperacion del VIH-1 en CMSP empobrecidas en CD8+ y en linfocitos T HLA DR- c D4+ procedentes de pacientes infectados con VHI-1 tratados con cART con carga virica indetectable. (a) Los cultivos de CMSP empobrecidos en CD8+ se trataron de forma simulada o se trataron con quetocina (90 nmol/l). Seis dfas despues del tratamiento, se determino la concentracion de ARN vmco en sobrenadantes de cultivo. El ADN total de VIH-1 se expresa como copias de ADN de VIH-1/106 celulas o como el log de copias de ADN de VIH-1/106 celulas ('/' indica condicion no analizada). (b) Se trataron cultivos de dilucion limitante de linfocitos T HLA DR‘ CD4+ de forma simulada o se trataron con quetocina (45 o 90 nmol/l). Se determino la concentracion de ARN vmco en los sobrenadantes de cultivo. El ultimo cultivo de dilucion positivo indica la presencia de al menos una celula que porta virus competente para la replicacion y sensible a la quetocina.

Tabla 2A: CMSP empobrecidas en CD8+______________________________________________________

Tabla 2B: Linfocitos T CD4+ HLA DR-

Figura 3. Los tratamientos combinatorios que incluyen quetocina inducen una mayor produccion virica en algunos cultivos ex vivo de linfocitos T CD4+ de memoria en reposo de pacientes infectados con VIH-1, tratados con cART. Los cultivos de linfocitos T CD4+ de memoria en reposo se trataron de forma simulada o se trataron como se indica. Seis dfas despues del tratamiento, se midio la concentracion de ARN vmco en los sobrenadantes de cultivo (en copias/ml). (a) La combinacion de quetocina prostratina induce la recuperacion del VIH-1 en linfocitos T CD4+de memoria en reposo de pacientes infectados con VIH-1, tratados con cART.

Los cultivos de pacientes reactivados se clasificaron en las categonas relevantes, donde la recuperacion del VIH-1 despues del tratamiento combinado presento una mayor produccion virica que despues del tratamiento individual.

(b) La combinacion de quetocina SAHA induce la recuperacion del VIH-1 en linfocitos T CD4+ de memoria en reposo de pacientes infectados con VIH-1, tratados con cART con carga virica indetectable. Los cultivos de pacientes reactivados se subdividieron en dos categonas relevantes: (b1) cultivos en los que la recuperacion del VIH-1 despues del tratamiento combinado fue mayor que despues de los tratamientos individuales, (b2) y cultivos en los que se observo una reactivacion sinergica de la produccion de ARN vmco despues de los tratamientos combinados.

Tabla 4. BIX-01294 solo induce la recuperacion del VIH-1 en linfocitos T CD4+ de memoria en reposo de pacientes infectados con VIH-1, tratados con cART con carga virica indetectable. Los cultivos de linfocitos T CD4+ de memoria en reposo se trataron de forma simulada o se trataron con BIX-01294. Seis dfas despues del tratamiento, se determino la concentracion de ARN vmco en los sobrenadantes de cultivo en copias/ml (I indica por debajo del umbral).

Tabla 4: Linfocitos T HLA DR- CD25- CD69- CD4+

Figura 4. BIX-01294 en combinacion con SAHA induce la recuperacion del VIH-1 en linfocitos T CD4+ de memoria en reposo de pacientes infectados con VIH-1, tratados con cART, con carga vinca indetectable.

Los cultivos de linfocitos T CD4+ de memoria en reposo se trataron de forma simulada o se trataron con BIX-01294 solo, con SAHA solo o con la combinacion SAHA+BIX- 01294. Seis dfas despues del tratamiento, se determino la concentracion de ARN vmco en los sobrenadantes de cultivo en copias/ml (I indica por debajo del umbral). Se muestra una categona relevante de cultivos de celulas de pacientes en los que los inventores observaron un aumento sinergico del numero de copias de ARN vmco por mililitro, despues del tratamiento combinado.

B. Resultados para los inhibidores de la metilacion del ADN en combinacion con HDACI

Figura 5. Activacion sinergica de la expresion del VIH-1 por 5-aza-CdR y HDACI en la lmea celular J-Lat 8.4.

La lmea celular J-Lat 8.4, que alberga un provirus de VIH-1 latente de longitud completa que contiene el gen que codifica la protema verde fluorescente GFP en lugar de nef, se trato de forma simulada o se trato con 5-aza-CdR durante 48 horas. Despues, se anadieron los HDACI durante 24 h. Se indican las medias y los errores tfpicos de las medias de las muestras por duplicado. Se representa un experimento representativo de tres. A. A las 72 h postratamiento con 5-aza-CdR, se midio la produccion de p24 en el sobrenadante celular. El resultado obtenido con celulas tratadas de forma simulada se establecio de forma arbitraria en un valor de 1. B. A las 72 h postratamiento con 5-aza-CdR, analisis por FACS y representacion del porcentaje de celulas GPF+ en histogramas. C. Se extrajo el ARN total de estas celulas y se transcribio de forma inversa utilizando cebadores aleatorios. Despues, los ADNc se usaron en una reaccion de PCR con parejas de cebadores que hibridaban con TAR, para cuantificar los transcritos iniciados y en el gen Tat para cuantificar los transcritos extendidos. Los resultados se normalizaron utilizando los cebadores del gen de la p-actina. Se presentan como histogramas que representan la induccion en veces en comparacion con las condiciones de tratamiento de forma simulada.

Descripcion detallada de la invencion

Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencias en singular y plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

Los terminos "que comprende", "comprende" y "compuesto de" como se usan en el presente documento son sinonimos de "que incluye", "que incluye" o "que contiene", "contiene", y son inclusivos o abiertos y no excluyen componentes, elementos o etapas de metodo adicionales no enumerados.

La enumeracion de intervalos numericos por valores extremos incluye todos los numeros y fracciones abarcados dentro de los intervalos respectivos, asf como los valores extremos enumerados.

El termino "aproximadamente", como se usa en el presente documento, se refiere a un valor medible como un parametro, una cantidad, una duracion temporal y similares, pretende abarcar variaciones de y desde el valor especificado, en particular variaciones del /-l0 % o menos, preferentemente del /-5 % o menos, mas preferentemente del /- 1 % o menos, y aun mas preferentemente del /- 0,1 % o menos de y desde el valor especificado, en la medida en que tales variaciones son apropiadas para realizar la divulgacion. Debe entenderse que el valor al que se refiere el modificador "aproximadamente" tambien se divulga de forma espedfica y preferente.

Salvo que se defina de otro modo, todos los terminos utilizados en la divulgacion, incluidos los terminos tecnicos y ciendficos, tienen el significado que el que entiende comunmente un experto en la materia a la cual pertenece la presente divulgacion. Mediante una grna adicional, se pueden incluir definiciones de terminos para apreciar mejor la ensenanza de la presente divulgacion.

Para los metodos generales relacionados con la divulgacion, se hace referencia, entre otros, a libros de texto muy conocidos, incluyendo, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed." (Sambrook et al., 1989), Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987), la serie Methods in Enzymology (Academic Press), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, ed., 1987); "Current Protocols in 10 Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3a Ed." (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 y 1995); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu ed., Academic Press 1995). Las tecnicas generales en cultivos celulares y usos de medios se describen, entre otros, en Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al. 1997. Curr Opin Biotechnol 8: 148); en Serum-free Media (K. Kitano.

1991. Biotechnology 17: 73); o en Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr Opin Biotechnol 2: 375, 1991).

El termino "retrovirus" se usa en el presente documento en su significado convencional y generalmente abarca una clase de virus en los que el material genetico es ARN monocatenario y que emplea transcriptasa inversa para transcribir el ARN vmco en ADN en un hospedador. Los retrovirus previstos en el presente documento pueden pertenecer particularmente a la familia de vmca Retroviridae, mas particularmente a la subfamilia Lentivirinae. Los retrovirus previstos en el presente documento pueden ser patogenos (es decir, provocar un fenotipo de enfermedad demostrable en un hospedador infectado) o pueden no ser patogenos (es decir, en donde la afeccion de un hospedador infectado no manifiesta un fenotipo demostrable de enfermedad). Particularmente previstos en el presente documento son los retrovirus que infectan animales, mas preferentemente retrovirus de animales de sangre caliente, incluso mas preferentemente de animales vertebrados, aun mas preferentemente de mairnferos, todavfa mas preferentemente de primates, y muy preferentemente de seres humanos. Son particularmente preferentes en el presente documento los retrovirus humanos que incluyen, pero sin limitacion, el VIH-1, VIH-2, el VTLH -1 y el VTLH -2.

La referencia a "enfermedades o afecciones asociadas con un retrovirus" abarca, generalmente, a todos y cada uno de los estados de un hospedador que son el resultado de que el hospedador se haya infectado con el retrovirus. Sin limitacion, tales estados pueden tipificarse por la presencia de material biologico vmco en el hospedador infectado, por ejemplo, la presencia de provirus en el genoma de una o mas celulas del hospedador infectado y/o la presencia de acidos nucleicos vmcos, de protemas vmcas o de pardculas vmcas en el hospedador infectado. Sin limitacion, tales estados pueden comprender fases en que el provirus esta inactivo o latente, etapas preclmicas en que el virus se produce en el hospedador infectado pero sin smtomas de enfermedad demostrables, asf como fases clmicas que implican smtomas de enfermedad demostrables, tales como, por ejemplo, el smdrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) provocado por el VIH-1 y el VIH-2, o la leucemia/linfoma de linfocitos T adultos (LLLA) o la paraparesia espastica tropical (PET) provocada por el VTLH -1.

El Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) es un Lentivirus, parte de la familia Retroviridae. Es virus de ARN monocatenario, de hebra positiva, diploide y con envoltura. Una vez que ha entrado en la celula diana, el genoma de ARN vmico del virus se transcribe de forma inversa en ADN bicatenario. Esto se hace a traves de una transcriptasa inversa codificada por el virus que se transporta junto con el genoma vmico en la pardcula del virus. Despues de eso, el ADN vmco transcrito se importa al nucleo de la celula y se integra en el ADN celular mediante una integrasa (tambien codificada por el virus). La latencia del VIH y de otros lentivirus se debe a su capacidad para integrarse en el genoma de la celula hospedadora y de permanecer allf de forma latente, es decir, sin replicacion. Debido a esto, el virus evita la deteccion por el sistema inmunitario y puede permanecer aid durante anos, dando como resultado el denominado "reservorio" de VIH en el sujeto infectado. Una vez que el virus se reactiva, el ADN vmico se transcribira, produciendo nuevos genomas de ARN y protemas vmcas que se empaquetan y liberan de la celula como nuevas pardculas de virus, las cuales pueden infectar nuevas celulas. El VIH infecta principalmente las celulas del sistema inmunitario, debilitando de este modo la respuesta inmunitaria del sujeto infectado, lo que conduce a su nombre "virus de inmunodeficiencia". Un sujeto positivo para el VIH puede desarrollar SIDA, o smdrome de inmunodeficiencia adquirida, cuando el virus tiene la capacidad de reproducirse. Esencialmente, el VIH se unira y destruira a los linfocitos T CD4+, los macrofagos y los microgliocitos. La destruccion de linfocitos T y de macrofagos hara que el sujeto sea propenso a todo tipo de infecciones que normalmente son faciles de evitar. Cuando los numeros de linfocitos T CD4+ caen por debajo del nivel de 200 celulas/pl, se pierde la inmunidad mediada por celulas, y aparecen infecciones por una diversidad de microbios oportunistas y las infecciones y tumores comunes oportunistas, la mayona de los cuales se controlan normalmente mediante una inmunidad mediada por linfocitos T CD4+ robusta, comienzan entonces a afectar al paciente. Cuando un sujeto con infeccion por VIH o con SIDA no es tratado, finalmente puede morir por infecciones que de otra manera senan faciles de curar, debido a la deficiencia del sistema inmunitario.

Debido al caracter latente del VIH, los reservorios de ADN de VIH pueden continuar existiendo durante toda la vida del sujeto infectado, sin ningun signo significativo, por ejemplo, controlado mediante un tratamiento antivmco constante. Sin embargo, detener el tratamiento a la larga dara como resultado la reactivacion del virus. Por lo tanto, el sujeto infectado nunca puede liberarse completamente de la infeccion por VIH.

Se han caracterizado dos tipos de VIH: el VIH-1 y el VIH-2. El VIH-1 es el virus que se descubrio inicialmente y es el tipo mas virulento, siendo mas infeccioso, y la causa de la mayona de las infecciones por VIH a nivel mundial. El VIH-2 es menos infeccioso e implica que menos de las personas expuestas al VIH-2 se infectaran por exposicion. El VIH-2 se restringe en gran medida a Africa occidental.

Como se usa en el presente documento, el termino "agente" se refiere en lmeas generales a cualquier sustancia qmmica (por ejemplo, inorganica u organica), bioqmmica o biologica, molecula o macromolecula (por ejemplo, macromolecula biologica), una combinacion o mezcla de las mismas, una muestra de composicion indeterminada o un extracto hecho de materiales biologicos tales como bacterias, plantas, hongos, o celulas o tejidos animales. Los "agentes" preferentes, aunque sin limitacion, incluyen acidos nucleicos, oligonucleotidos, ribozimas, polipeptidos o protemas, peptidos, peptidomimeticos, anticuerpos y fragmentos y derivados de los mismos, aptameros, sustancias qmmicas, preferentemente moleculas organicas, mas preferentemente moleculas organicas pequenas, lfpidos, hidratos de carbono, polisacaridos, etc., y cualquier combinacion de los mismos.

El termino "modular" generalmente denota una alteracion, cambio o variacion cualitativa o cuantitativa que abarca espedficamente tanto el aumento (por ejemplo, la activacion), como la disminucion (por ejemplo, la inhibicion), de lo que se esta modulando. El termino abarca cualquier grado de tal modulacion. Por ejemplo, cuando la modulacion efectua una variable determinable o medible, entonces la modulacion puede abarcar un aumento en el valor de dicha variable en al menos aproximadamente el 10 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 20 %, preferentemente en al menos aproximadamente el 30 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 40 %, mas preferentemente en al menos aproximadamente el 50 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 75 %, incluso mas preferentemente en al menos aproximadamente el l00% , por ejemplo, en al menos aproximadamente el 150%, 200 %, 250 %, 300 %, 400 % o en al menos aproximadamente el 500 %, en comparacion con una situacion de referencia sin dicha modulacion; o la modulacion puede abarcar una disminucion o reduccion en el valor de dicha variable en al menos aproximadamente el 10 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 20 %, en al menos aproximadamente el 30 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 40 %, en al menos aproximadamente el 50 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 60 %, en al menos aproximadamente el 70 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 80 %, en al menos aproximadamente el 90 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 95 %, tal como en al menos aproximadamente el 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso en el 100 %, en comparacion con una situacion de referencia sin dicha modulacion. Preferentemente, la modulacion de la actividad y/o el nivel de la diana (o dianas) prevista, es decir, los inhibidores de la metilacion del ADN y los inhibidores de las histona metiltransferasas, como se describen en el presente documento, pueden ser espedficos o selectivos, es decir, la actividad y/o el nivel de la diana (o dianas) prevista pueden modularse sin alterar sustancialmente la actividad y/o el nivel de dianas aleatorios no relacionadas.

La referencia a la "actividad" de una diana, tal como un complejo o protema, generalmente puede abarcar uno o mas aspectos de la actividad biologica de la diana, tal como, pero sin limitacion, uno o mas aspectos de su actividad bioqmmica, actividad enzimatica, actividad de senalizacion y/o actividad estructural, por ejemplo, dentro de una celula, tejido, organo o un organismo. Preferentemente, dicha actividad es una actividad de metilacion.

En una realizacion, la actividad de una diana, tal como un complejo o protema, puede modularse y, en particular, reducirse introduciendo o expresando en una celula, tejido, organo o un organismo, una variante negativa dominante de dicha diana, por ejemplo, una variante negativa dominante de uno o mas constituyentes del complejo, o una variante negativa dominante de la protema.

La referencia al "nivel" de una diana, tal como un complejo o protema, puede abarcar preferentemente la cantidad y/o la disponibilidad (por ejemplo, la disponibilidad para realizar su actividad biologica) de la diana, por ejemplo, dentro de una celula, tejido, organo o un organismo. Por ejemplo, el nivel de una diana puede modularse modulando la expresion de la diana y/o modulando la diana expresada. La modulacion de la expresion de la diana se puede lograr u observar, por ejemplo, a nivel de ARN heterogeneo nuclear (ARNhn), de ARNm precursor (pre-ARNm), de ARNm o de ADNc que codifican la diana. A modo de ejemplo y no de limitacion, la disminucion de la expresion de una diana puede lograrse mediante metodos conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, mediante transfeccion (por ejemplo, mediante electroporacion, lipofeccion, etc.) o transduciendo (por ejemplo, usando un vector vmco) una celula, tejido, organo u organismo con un agente antisentido, tales como, por ejemplo, un oligonucleotido de ADN o ARN antisentido, una construccion que codifica el agente antisentido, o un agente de interferencia de ARN, tal como ARNip o ARNhc, o una ribozima o vectores que los codifican, etc. A modo de ejemplo y no de limitacion, el aumento de la expresion de una diana puede lograrse mediante metodos conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, mediante transfeccion (por ejemplo, mediante electroporacion, lipofeccion, etc.) o transduciendo (por ejemplo, usando un vector vmco) una celula, tejido, organo u organismo con un acido nucleico recombinante que codifica dicha diana bajo el control de secuencias reguladoras que efectuan un nivel de expresion adecuado en dicha celula, tejido, organo u organismo. A modo de ejemplo y no de limitacion, el nivel de la diana se puede modular a traves de la alteracion de la formacion de la diana (tal como, por ejemplo, del plegamiento, o de interacciones que conducen a la formacion de un complejo), y/o la estabilidad (por ejemplo, la propension de los constituyentes de complejos a asociarse a un complejo o disociarse de un complejo), la degradacion o el emplazamiento celular, etc. de la diana.

La expresion "inhibidor de la metilacion del ADN" abarca cualquier compuesto o agente conocido o aun desconocido que reduce, impide o elimina la metilacion del ADN. Hay varios tipos conocidos de inhibidores de la metilacion del ADN: 1) los "inhibidores de la ADN metiltransferasa" o "DNMTi" (forma siglada de DNA methyltransferase inhibitors), que abarcan compuestos o agentes que reducen la actividad enzimatica de la metiltransferasa de cualquier manera, 2) los "agentes de desmetilacion del ADN", que eliminan los grupos metilo del ADN metilado, y 3) los "inhibidores de la metilacion del ADN", que impiden la introduccion de grupos metilo en el ADN. Los inhibidores de la metilacion del ADN se han analizado extensamente para el tratamiento del cancer y la mayona son analogos del nucleosido desoxicitidina. Se han desarrollado varias variaciones moleculares de la desoxicitidina, cada una modificada en la posicion 5 del anillo de pirimidina, segun se revisa, por ejemplo, en "DNA methyltransferase inhibitors - state of the art", por J. Goffin y E. Eisenhauer (Annals of Oncology l3 : 1699-1716, 2002). Esta caractenstica distintiva es responsable de la inhibicion de la DNMT (forma siglada de DNA methyltransferase, ADN metiltransferasa). Analogos tales como ara-C y gemcitabina, que no poseen este cambio en el anillo de pirimidina, no inhiben la metilacion. Los oligodesoxinucleotidos ejemplares son los que contienen 5-azadesoxicitidina (AzadC), por ejemplo, 5-azacitidina (azacitidina), 5-aza-2'-desoxicitidina (decitabina), 1-p-Darabinofuranosil-5-azacitosina (fazarabina) y dihidro-5-azacitidina (DHAC); los que contienen 5-fluoro desoxicitidina (FdC); o aquellos con duplex de oligodesoxinucleotidos que contienen 2-H pirimidinona, tales como zebularina. Un mecanismo alternativo para la inhibicion de la DNMT es el uso de oligodesoxinucleotidos antisentido (los ODN, forma siglada de oligodeoxynucleotides). Estos son acidos nucleicos sinteticos relativamente cortos disenados para hibridar con una secuencia de ARNm espedfica. La hibridacion puede bloquear la traduccion del ARNm y provocar la degradacion del ARNm. Dichos ODN antisentido se han dirigido contra el ARNm de la DNMT y han provocado una disminucion del ARNm y la protema DNMT. MG98, por ejemplo, es un oligodesoxinucleotido antisentido dirigido contra la region 3' no traducida del ARNm de DNMT1. Este agente ha demostrado una capacidad para inhibir la expresion de la DNMT1 sin afectar a la DNMT3. Los efectos pueden ser sinergicos en combinacion con decitabina. Como alternativa, se podnan utilizar agentes desmetilantes no nucleosidos, tales como, pero sin limitacion: (-)-epigalocatequina-3-galato, hidralazina, procama y procainamida.

La expresion "inhibidor de la histona metiltransferasa" o "HMTi" abarca cualquier compuesto o agente conocido o aun desconocido que reduce la actividad de la histona metiltransferasa de cualquier manera. Los ejemplos son: quetocina, UNC0224 de Cayman Chemical; BIX-01294 de Tocris Bioscience; diazepinil-quinazolinamina, inhibidor de la HMTasa (histona metiltransferasa) basado en analogo no SAM (S-adenosilmetionina) de EMD Millipore; BIX 01294 de Enzo Life Sciences, Inc.; BIX-01338 (hidrato) de Sigma-Aldrich; UNC0638 (hidrato) 2-Ciclohexil-N-(1-isopropilpiperidin-4-il)-6-metoxi-7-(3-(pirrolidin-1-il)propoxi)quinazolin-4-amina de Sigma-Aldrich, o cualquier otro compuesto.

La expresion "inhibidor de la histona desacetilasa" o "HDACi" abarca cualquier compuesto o agente conocido o aun desconocido que reduce la actividad de las histonas desacetilasas (las HDAC). Ejemplos son, por ejemplo, los compuestos revisados en Dokmanovic et al., 2007 (Mol Cancer Res octubre de 2007 5; 981). Los HDACi en varias familias estructurales, incluyendo los hidroxamatos, peptidos dclicos, acidos alifaticos y benzamidas. Los ejemplos preferentes son TSA, Vorinostat (SAHA), acidos aminosuberoil hidroxamicos, bishidroxamato de acido M-Carboxicinamico y los derivados que se incluyen LAQ- 824, LBH-589 y un derivado de sulfonamida, belinostat (PXD-101), Panobinostat (LBH-589; Novartis AG) un acido cinamico hidroxamico analogo del acido M-carboxicinamico bishidroxamato, IF2357 (Italfarmaco SpA) es un HDACi que contiene una fraccion de acido hidroxamico unida a un anillo aromatico, hidroxamidas del acido ariloxialcanoico; peptidos dclicos tales como el producto natural depsipeptido.(Romidepsina, FK-228,Gloucester Pharmaceutical Inc.), apicidina y el grupo de moleculas peptfdicas dclicas que contienen acido hidroxamico, FK-228 es un profarmaco de un agente activo, FK rojo, un peptidomimetico dclico unido por una cadena alifatica a un acido hidroxamico, acidos alifaticos, tales como butirato, fenilbutirato, butirato de sodio y acido valproico, AN-9 (butirato de pivaloiloximetilo de Titan Pharmaceutical, Inc.) es un profarmaco del acido butmco, 5 NOX- 275 (MS-275; Syndax Pharmaceutical Inc.) es un derivado de benzamida sintetico, MGCD0103 (Methylgene Inc. Pharmion Corp.) es la sal dibromhidrato de una 2-aminofenilbenzamida sustituida. Un ejemplo preferente es acido hidroxamico de suberoilanilida (SAHA o vorinostat).

La expresion "inductores de NF-kappa-B" abarca todos los compuestos o agentes conocidos o aun desconocidos que pueden inducir o activar la actividad de NF-kappa-B. Los ejemplos preferentes son Prostratina (12-desoxiforbol 13-acetato), forbol miristato acetato (PMA) o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa).

La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invencion de ningun modo.

Las diversas sustancias o agentes activos de la presente divulgacion, tales como los inhibidores de la histona metiltransferasa, los inhibidores de histona desacetilasa y/o los inhibidores de la metilacion del ADN, o los inductores de NF-kappa-B, entre otros complejos, protemas, acidos nucleicos, vectores, celulas y agentes, como se ensenan en el presente documento, o los derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos, pueden formularse en composiciones farmaceuticas o formulaciones con uno o mas transportadores/excipientes farmaceuticamente aceptables.

La expresion "farmaceuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, concuerda con la tecnica y significa compatible con los otros ingredientes de una composicion farmaceutica y no es nocivo para el receptor del mismo.

Como se usa en el presente documento, "transportador" o "excipiente" incluye cualquiera y todos los disolventes, diluyentes, tampones (tales como, por ejemplo, solucion salina tamponada neutra o solucion salina tamponada con fosfato), solubilizantes, coloides, medios de dispersion, vehmulos, cargas, agentes quelantes (tales como, por ejemplo, EDTA o glutation), aminoacidos (tales como, por ejemplo, glicina), protemas, disgregantes, aglutinantes, lubricantes, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, saponferos, aromatizantes, espesantes, agentes para conseguir un efecto prolongado, recubrimientos, agentes antifungicos, conservantes, antioxidantes, agentes controladores de la tonicidad, agentes retardantes de la absorcion y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce bien en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con la sustancia activa, se puede contemplar su uso en composiciones terapeuticas.

Los vehmulos ilustrativos, no limitantes, para su uso en la formulacion de composiciones farmaceuticas incluyen, por ejemplo, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, composiciones acuosas con o sin inclusion de codisolventes organicos adecuados para uso intravenoso (IV), liposomas o vesmulas que contienen tensioactivo, microesferas, microperlas o microsomas, polvos, comprimidos, capsulas, supositorios, suspensiones acuosas, aerosoles y otros trasportadores obvios para un experto en la materia.

Las composiciones pueden formularse para esencialmente cualquier via de administracion, tales como, pero sin limitacion, administracion oral (tal como, por ejemplo, ingestion o inhalacion), administracion intranasal (tal como, por ejemplo, inhalacion intranasal o aplicacion intranasal en las mucosas), administracion parenteral (tal como, por ejemplo, inyeccion o infusion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o intraesternal), administracion transdermica o transmucosal (tal como, por ejemplo, oral, sublingual, intranasal), administracion topica, rectal, vaginal o instilacion intratraqueal, y similares. De este modo, los efectos terapeuticos que se pueden obtener mediante los metodos y composiciones desvelados en el presente documento pueden ser, por ejemplo, sistemicos, locales, espedficos de tejido, etc., dependiendo de las necesidades espedficas de una aplicacion dada divulgadas en el presente documento.

Por ejemplo, para la administracion oral, las composiciones farmaceuticas pueden formularse en forma de pfldoras, comprimidos, comprimidos laqueados, comprimidos recubiertos (por ejemplo, recubiertos con azucar), granulos, capsulas duras y blandas de gelatina, soluciones acuosas, alcoholicas u oleosas, jarabes, emulsiones o suspensiones. En un ejemplo, pero sin limitacion, la preparacion de las formas farmaceuticas orales se puede lograr adecuadamente mezclando de manera uniforme y a fondo una cantidad adecuada del compuesto activo en forma de polvo, opcionalmente tambien incluyendo uno o mas transportadores solidos finamente divididos, y formulando la mezcla en una pfldora, comprimido o capsula. Los transportadores solidos ejemplares pero no limitantes incluyen fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azucares (tales como, por ejemplo, glucosa, manosa, lactosa o sacarosa), alcoholes de azucar (tales como, por ejemplo, manitol), dextrina, almidon, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusion y resinas de intercambio ionico. Los comprimidos compactados que contienen la composicion farmaceutica se pueden preparar mezclando de manera uniforme y a fondo el principio activo con un transportador solido tal como el descrito anteriormente, para proporcionar una mezcla que tenga las propiedades de compresion necesarias, y despues compactando la mezcla en una maquina adecuada para la forma y el tamano deseados. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse moldeando en una maquina adecuada, una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente lfquido inerte. Los transportadores adecuados para capsulas de gelatina blanda y supositorios son, por ejemplo, las grasas, las ceras, los polioles semisolidos y lfquidos, los aceites naturales o endurecidos, etc.

Por ejemplo, para la administracion oral o aerosol nasal o inhalacion, las composiciones farmaceuticas pueden formularse con transportadores ilustrativos, tales como, por ejemplo, en solucion con solucion salina, polietilenglicol o glicoles, DPPC, metilcelulosa, o en mezcla con agentes de dispersion en polvo, empleando adicionalmente alcohol bendlico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorcion para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarburos y/u otros agentes solubilizantes o de dispersion conocidos en la materia. Las formulaciones farmaceuticas adecuadas para la administracion en forma de aerosoles o pulverizadores son, por ejemplo, soluciones, suspensiones o emulsiones de los compuestos desvelados en el presente documento o sus sales fisiologicamente tolerables en un disolvente farmaceuticamente aceptable, tal como etanol o agua, o una mezcla de tales disolventes. Si es necesario, la formulacion tambien puede contener, ademas, otros auxiliares farmaceuticos, tales como tensioactivos, emulsionantes y estabilizantes, asf como un propulsor. De manera ilustrativa, el suministro puede ser mediante el uso de un dispositivo de suministro de unico uso, un nebulizador para nebulizacion, un inhalador de polvo activado por la respiracion, un inhalador de dosis medida por aerosol (IDM) o cualquier otro de los numerosos dispositivos de suministro nebulizadores disponibles en la tecnica. Adicionalmente, tambien se pueden utilizar tiendas de nebulizacion o la administracion directa a traves de tubos endotraqueales.

Los ejemplos de transportadores para la administracion a traves de las superficies de las mucosas dependen de la via particular, por ejemplo, oral, sublingual, intranasal, etc. Cuando se administran por via oral, los ejemplos ilustrativos incluyen manitol, almidon, lactosa, estearato de magnesio, sacarido de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares, de calidad farmaceutica, siendo preferente el manitol. Cuando se administran de forma simultanea, los ejemplos ilustrativos incluyen polietilenglicol, fosfolfpidos, glicoles y glucolfpidos, sacarosa y/o metilcelulosa, suspensiones en polvo con o sin agentes formadores de volumen tales como lactosa y conservantes tales como cloruro de benzalconio, EDTA. En una realizacion particularmente ilustrativa, el fosfolfpido 1,2 dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) se usa como un transportador acuoso isotonico a aproximadamente el 0,01-0,2% para la administracion intranasal del compuesto de la divulgacion materia objeto.

Por ejemplo, para administracion parenteral, las composiciones farmaceuticas pueden formularse de forma ventajosa como soluciones, suspensiones o emulsiones con disolventes, diluyentes, solubilizantes o emulsionantes adecuados, etc. Los disolventes adecuados son, pero sin limitacion, el agua, la solucion salina fisiologica o alcoholes, por ejemplo, etanol, propanol, glicerol, ademas tambien soluciones de azucar tales como la glucosa, azucar invertida, soluciones de sacarosa o manitol, o alternativamente mezclas de los diversos disolventes mencionados. Las soluciones o suspensiones inyectables pueden formularse de acuerdo con la tecnica conocida, utilizando diluyentes o disolventes adecuados, no toxicos parenteralmente aceptables, tales como manitol, 1,3-butanodiol, el agua, solucion de Ringer o una solucion isotonica de cloruro sodico, u otros agentes dispersantes o humectantes, y agentes de suspension, tales como aceites esteriles, blandos no volatiles, incluyendo monogliceridos o digliceridos sinteticos y acidos grasos, incluido el acido oleico. Los compuestos divulgados en el presente documento y las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos tambien pueden estar liofilizados y los liofilizados obtenidos se pueden usar, por ejemplo, para la produccion de preparaciones para inyecciones o infusiones. Por ejemplo, un ejemplo ilustrativo de un transportador para uso intravenoso incluye una mezcla de etanol USP (forma siglada de United States Pharmacopea, farmacopea de los Estados Unidos) al 10%, propilenglicol o polietilenglicol 600 USP al 40% y el resto, agua para inyeccion USP (API). Otros transportadores ilustrativos para uso intravenoso incluyen etanol USP al 10 % y API USP; trietanolamina al 0,01-0,1 % en API USP; o dipalmitoil difosfatidilcolina al 0,01-0,2 % en API USP; y escualeno al 1­ 10% o emulsion parenteral de aceite vegetal en agua. Los ejemplos ilustrativos de transportadores para uso subcutaneo o intramuscular incluyen solucion salina tamponada con fosfato (PBS), dextrosa al 5 % en API y trietanolamina al 0,01-0,1 % en dextrosa al 5 % o cloruro de sodio al 0,9 % en API USP, o una mezcla 1 a 2 o 1 a 4 de etanol USP al 10 %, propilenglicol al 40 % y el resto una solucion isotonica aceptable tal como dextrosa al 5 % o cloruro de sodio al 0,9%; o dipalmitoil difosfatidilcolina en API USP al 0,01-0,2% y escualeno del 1 al 10% o emulsiones parenterales de aceite vegetal en agua.

Cuando se prefieren formulaciones acuosas, tales pueden comprender uno o mas tensioactivos. Por ejemplo, la composicion puede estar en forma de una dispersion micelar que comprende al menos un tensioactivo adecuado, por ejemplo, un tensioactivo fosfolipfdico. Los ejemplos ilustrativos de fosfolfpidos incluyen diacil fosfatidilgliceroles, tales como dimiristoil fosfatidilglicerol (DPMG), dipalmitoil fosfatidilglicerol (DPPG), y diestearoil fosfatidilglicerol (DSPG), diacil fosfatidil colinas, tales como dimiristoil fosfatidilcolina (DPMC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) y diestearoil fosfatidilcolina (DSPC); acidos diacil fosfatfdicos, tales como acido dimiristoil fosfatfdico (DPMG), acido dipalmitoil fosfatfdico (DPPA), y acido diestearoil fosfatfdico (DSPA); y diacil fosfatidil etanolaminas tales como dimiristoil fosfatidil etanolamina (DPME), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPG), y diestearoil fosfatidil etanolamina (DSPG). Normalmente, una relacion molar de tensioactivo:sustancia activa en una formulacion acuosa sera de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 151:10, mas normalmente de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:5, sin embargo, se puede usar en una formulacion acuosa cualquier cantidad eficaz de tensioactivo para adaptarse mejor a los objetivos espedficos de interes.

Cuando se administra por via rectal en forma de supositorios, estas formulaciones se pueden preparar mezclando los compuestos divulgados en el presente documento con un excipiente no irritante adecuado, tal como manteca de cacao, esteres de glicerido sinteticos o polietilenglicoles, que son solidos a temperaturas normales, pero que se licuan y/o se disuelven en la cavidad rectal para liberar el farmaco.

Los transportadores adecuados para microcapsulas, implantes o varillas, por ejemplo, los copolfmeros de acido glicolico y acido lactico.

Un experto en la materia reconocera que la descripcion anterior es ilustrativa en lugar de exhaustiva.

De hecho, muchas tecnicas de formulacion adicionales y los excipientes y soluciones transportadoras farmaceuticamente aceptables son muy conocidos por los expertos en la materia, como lo es el desarrollo de regfmenes de dosificacion y tratamiento adecuados para utilizar las composiciones concretas descritas en el presente documento en una diversidad de regfmenes de tratamiento.

Las presentes sustancias activas se pueden usar solas o en combinacion con cualquier terapia antirretrovmca (cART) conocida en la tecnica ("terapia de combinacion"). Las terapias de combinacion como se contemplan en el presente documento pueden comprender la administracion de al menos una sustancia activa divulgada en el presente documento y al menos otro principio farmaceuticamente o biologicamente activo. Dicha sustancia activa (o sustancias activas) presente y dicho principio activo (o principios activos) farmaceuticamente o biologicamente activos pueden administrarse en la misma o en distinta formulacion farmaceutica (o formulaciones farmaceuticas), de forma simultanea o secuencial en cualquier orden. Los farmacos antirretrovmcos ejemplares en la terapia de combinacion con los cuales se pueden emplear las presentes sustancias activas incluyen, pero sin limitacion, inhibidores nucleosfdicos y nucieotfdicos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nucleosfdicos de la transcriptasa inversa, inhibidores de la proteasa, inhibidores de la integrasa, inhibidores de la entrada, inhibidores de la maduracion y un amplio espectro de inhibidores. La dosificacion o cantidad de las presentes sustancias activas utilizadas, opcionalmente en combinacion con uno o mas de otros compuestos activos a administrar, depende del caso individual y, como es habitual, debe adaptarse a las circunstancias individuales para lograr un efecto optimo. Por lo tanto, depende de la naturaleza y la gravedad del trastorno a tratar, y tambien del sexo, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, la dieta, el modo y el tiempo de administracion, y la respuesta individual del ser humano o animal a tratar, de la via de administracion, la eficacia, la estabilidad metabolica y la duracion de la accion del compuesto utilizado, de si la terapia es aguda o cronica, o profilactica, o de si se administran otros compuestos activos ademas del agente (o agentes) divulgado en el presente documento.

Sin limitacion, dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, una dosificacion diaria tfpica podna variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios dfas o un periodo mayor, dependiendo de la afeccion, se continuara el tratamiento hasta que se produzca una supresion deseada de los smtomas de enfermedad. Una dosificacion preferente de la sustancia activa divulgada en el presente documento puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de 20 de peso corporal. Por lo tanto, pueden administrarse al paciente una o mas dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinacion de las mismas). Dichas dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ejemplo, cada semana o cada dos semanas.

A menos que se indique otra cosa, "sujeto" o "paciente" se utilizan indistintamente y se refieren a animales, preferentemente animales de sangre caliente, mas preferentemente vertebrados, incluso mas preferentemente mairnferos, aun mas preferentemente primates y, en concreto, incluyen a pacientes humanos y a mairnferos y primates no humanos. Los pacientes preferentes son sujetos humanos.

Como se usa en el presente documento, una frase tal como "un sujeto que necesita tratamiento" incluye sujetos que se beneficianan del tratamiento de una afeccion dada, en particular de una infeccion retrovrnca. Dichos sujetos pueden incluir, pero sin limitacion, los que han sido diagnosticados de dicha afeccion, los propensos a contraer o desarrollar dicha afeccion y/o aquellos en quienes se debe prevenir dicha afeccion.

Los terminos "tratar" o "tratamiento" abarcan tanto el tratamiento terapeutico de una enfermedad o afeccion ya desarrollada, tal como la terapia de una infeccion retrovrnca ya desarrollada, asf como las medidas profilacticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o disminuir la posibilidades de incidencia de una afliccion no deseada, tal como para prevenir las posibilidades de contraccion y progresion de una infeccion retrovrnca. Los resultados beneficiosos o deseados pueden incluir, pero sin limitacion, el alivio de uno o mas smtomas o uno o mas marcadores biologicos, la disminucion del alcance de la enfermedad, el estado estabilizado (es decir, que no empeora) de la enfermedad, el retraso o ralentizacion de la progresion de la enfermedad, la mejora o alivio de la patologfa y similares. "Tratamiento" tambien puede significar prolongar la supervivencia en comparacion con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. En una realizacion preferente, "tratamiento" implica la erradicacion de los "reservorios" latentes de infectados con VIH, con el objetivo de liberar al paciente de la infeccion por VIH.

La expresion "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto activo o agente farmaceutico que inhibe o retrasa en un sujeto la aparicion de un trastorno, como lo busca un investigador, veterinario, medico u otro facultativo.

La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz”, como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de compuesto activo o agente farmaceutico que suscita la respuesta biologica o medica en sujeto un sistema tejido, que esta siendo buscada por un investigador, veterinario, medico u otro facultativo, que puede incluir, entre otros, el alivio de los smtomas de la enfermedad o trastorno que se esta tratando. Se conocen los metodos en la tecnica para determinar las dosis terapeutica y profilacticamente eficaces para los presentes compuestos.

Ejemplos

Metodos:

los ensayos de ELISA de p24, de RT-qPCR y de FACS se realizaron utilizando las metodologfas habituales. Las pruebas de reactivacion se llevaron a cabo en cultivos de CMSP empobrecidas en CD8+ o cultivos de HLA DR aislados de la sangre de individuos tratados con cART VIH-1+ con carga vmca indetectable (el crecimiento del VIH-1 se evaluo con el kit Roche Amplicor y Abbott HIV-1 Realtime).

Ejemplo 1: Efecto del inhibidor de la histona metiltransferasa quetocina sobre la expresion genica del VIH-1.

En este experimento, los inventores muestran que la quetocina, un inhibidor de la histona metiltransferasa, aumenta la actividad transcripcional del 5'LTR del VIH-1 en lmeas de celulas T linfoides transfectadas. Se transfectaron de forma transitoria las lmeas celulares Jurkat y SupTI con la construccion indicadora episomica de vector pLTRHiv-i-luc. A las 24 h postransfeccion, las celulas transfectadas se trataron de forma simulada o se trataron con quetocina. Las celulas se lisaron y se sometieron a ensayo en cuanto a la actividad luciferasa. Las actividades de la luciferasa se normalizaron con respecto a la concentracion de protema. El resultado obtenido con celulas tratadas de forma simulada se establecio de forma arbitraria en un valor de 1. Los resultados se representan en la Figura 1(A y B), mostrando un claro aumento de la actividad luciferasa en las celulas tratadas con quetocina frente a las celulas tratadas de forma simulada.

Ademas, los inventores analizaron el efecto de la quetocina en la lmea de celulas T linfoides J-Lat 15.4 infectadas de forma latente y demostraron que la quetocina aumenta la produccion de VIH-1. La lmea celular J-Lat 15.4 se trato de forma simulada o se trato con quetocina. Se midio la produccion de la protema p24 del VIH-1 en los sobrenadantes celulares. El resultado obtenido con celulas tratadas de forma simulada se establecio de forma arbitraria en un valor de 1. Los resultados se representan en la Figura 1(C) y muestran claramente un aumento en la formacion de p24 cuando las celulas T linfoides infectadas de forma latente se tratan con quetocina.

La Figura 2 muestra la transcripcion aumentada del VIH-1 en la lmea celular infectada de forma latente J-Lat 15.4, cuando se trata con quetocina. La lmea celular J-Lat 15.4 se trato de forma simulada o se trato con quetocina. El tratamiento con quetocina activa claramente la transcripcion de ARN del VIH-1. El ARN de VIH-1 se cuantifico de la siguiente manera: Se extrajo el ARN total de estas celulas y se transcribio de forma inversa utilizando cebadores aleatorios. Despues, los ADNc se usaron en una reaccion de PCR con parejas de cebadores que hibridaban con TAR (DIR, 5'-GTTAGACCAGATCTGAGCCT-3' e INV, 5'-GTGGGTTCCCTAGTTAGCCA-3') para cuantificar los transcritos iniciados o con Tat (DIR, 5'-ACTCGACAGAGGAGAGCAAG-3' e INV, 5'-GAGAATCTGACTGTTCTGATGA-3') para cuantificar los transcritos extendidos. Los resultados se normalizaron utilizando cebadores del gen de actina p (DIR, 5'-GTCGACAACGGCTCCGGC-3' e INV, 5'-GGTGTGGTGCCAGATTTTCT-3') y se presentan como histogramas que indican la induccion en veces en comparacion con las condiciones de tratamiento de forma simulada.

Ejemplo 2: La quetocina induce la recuperacion del VIH-1 en CMSP empobrecidas en CD8+ y en linfocitos T HLA Dr - CD4+ procedentes de individuos positivos para VHI-1 tratados con cART con carga vinca indetectable.

Se trataron cultivos que comprendfan 6,106 CMSP empobrecidas en CD8+ de forma simulada o con quetocina. Seis dfas despues del tratamiento, se determino la concentracion de ARN vmico en los sobrenadantes de cultivo mediante el metodo Amplicor (Roche Diagnostics). Los resultados se representan en la Tabla 1 y en la 2A. Se calculo el porcentaje de reactivacion en todos los pacientes reactivados. Nueve de los dieciocho cultivos de CMSP analizados reactivaron la expresion de VIH-1 en respuesta al tratamiento con quetocina, mientras que ninguno de ellos lo hizo cuando se trato de forma simulada. Posteriormente, se realizaron cultivos de dilucion limitante de linfocitos T HLA DR‘ CD4+ y estos cultivos se trataron de forma simulada o se trataron con quetocina. El ultimo cultivo de dilucion positivo indica la presencia de al menos una celula que porta virus VIH-1 competente para la replicacion. Se determino la concentracion de ARN vmico en los sobrenadantes de cultivo mediante el metodo Amplicor (Roche Diagnostics). Los valores se expresan en copias de ARN de VIH-1/ml. Los resultados muestran que la quetocina induce la recuperacion del VIH-1 (reactivacion) en 6 de 7 cultivos de pacientes (Tabla 2B). Ademas, BIX-01294 induce la recuperacion del VIH-1 en linfocitos T HLA DR‘ CD25‘ CD69‘ Cd 4+ de individuos positivos para VHI-1 tratados con ART con carga vmca indetectable. Cultivos de 2,5x105 linfocitos T HLA DR‘ CD 25‘ CD69‘ CD4+ se trataron de forma simulada o se trataron con BIX-01294. Seis dfas despues del tratamiento, se determino la concentracion de ARN vmico en los sobrenadantes de cultivo (Tabla 4).

Ejemplo 3: El tratamiento combinado de quetocina+prostratina aumenta de forma sinergica la transcripcion y la produccion de VIH-1 en las celulas infectadas de forma latente y en celulas de pacientes.

La Figura 2 muestra que el tratamiento combinado de quetocina+prostratina aumenta de forma sinergica la transcripcion del VIH-1 en la lmea celular infectada de forma latente J-Lat 15.4. La lmea celular J-Lat 15.4 se trato de forma simulada o se trato con quetocina, prostratina o una combinacion de ambos farmacos. Se extrajo el ARN total de estas celulas y se transcribio de forma inversa utilizando cebadores aleatorios. Despues, los cADN se usaron en una reaccion de PCR con parejas de cebadores que hibridaban con TAR, para cuantificar los transcritos iniciados o en Tat para cuantificar los transcritos extendidos. Los resultados se normalizaron usando p actina y se presentan como histogramas que indican la induccion en veces, en comparacion con las condiciones de tratamiento de forma simulada.

Ademas, el tratamiento combinatorio que incluyen quetocina y prostratina induce una mayor produccion vmca en algunos cultivos ex vivo de linfocitos T CD4+ de memoria en reposo de pacientes infectados con VIH-1, tratados con cART. Los cultivos de linfocitos T CD4+ de memoria en reposo se trataron de forma simulada o se trataron como se indica. Seis dfas despues del tratamiento, se midio la concentracion de ARN vmico en los sobrenadantes de cultivo (en copias/ml). Los cultivos de pacientes reactivados se clasificaron en las categonas relevantes, donde la recuperacion del VIH-1 despues del tratamiento combinado presento una mayor produccion vmca que despues del tratamiento individual (Figura 3a).

Ejemplo 4: Efecto del tratamiento combinado con el inhibidor de la metilacion del ADN 5-aza-CdR y el inhibidor de la HDAC sobre la expresion genica del VIH-1

La Figura 5 muestra que el cotratamiento con 5-aza-CdR+HDACI aumenta de forma sinergica la produccion de VIH-1 e induce la expresion de VIH-1 en una mayor proporcion de celulas que los farmacos solos en la lmea celular infectada de forma latente J-Lat 8.4. La lmea celular J- Lat alberga un provirus de VIH-1 latente de longitud completa que contiene GFP (protema verde fluorescente) en lugar de nef. La lmea celular J-Lat 8.4 se trato de forma simulada o se trato con 5-aza-CdR solo o en combinacion con los HDACI. A. Se midio la produccion de p24 en los sobrenadantes celulares. El resultado obtenido con celulas tratadas de forma simulada se establecio de forma arbitraria en un valor de 1. B. Las celulas se fijaron con paraformaldelmdo y se analizaron mediante citometna de flujo para cuantificar la proporcion de celulas que expresaban GFP. Los resultados (% de celulas GFP+) se presentan como histogramas. C. El tratamiento combinado de 5-aza-CdR+SAHA o 5-aza-CdR+NaBut induce de forma sinergica la transcripcion a partir del 5'LTR del VIH-1. La lmea celular J-Lat 8.4 se trato de forma simulada o se trato con 5-aza-CdR solo o en combinacion con SAHA o NABut. Se extrajo el ARN total de estas celulas y se transcribio de forma inversa utilizando cebadores aleatorios. Despues, los cADN se usaron en una reaccion de PCR con parejas de cebadores que hibridaban con TAR, para cuantificar los transcritos iniciados o en Tat para cuantificar los transcritos extendidos. Los resultados se normalizaron usando cebadores para el gen de p actina y se presentan como histogramas que indican la induccion en veces, en comparacion con las condiciones de tratamiento de forma simulada.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una decitabina inhibidora de la metilacion del ADN para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada con la infeccion por VIH en un sujeto que necesita tal tratamiento, en donde se administra una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de dicho inhibidor de la metilacion del ADN a dicho sujeto y en donde una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un inhibidor de la histona desacetilasa seleccionado del grupo que comprende: hidroxamatos, peptidos dclicos, acidos alifaticos y benzamidas, se administra a dicho sujeto despues de haber administrado dicho inhibidor de la metilacion del ADN.

2. Un inhibidor de la histona desacetilasa seleccionado del grupo que comprende: hidroxamatos, peptidos dclicos, acidos alifaticos y benzamidas, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada con la infeccion por VIH en un sujeto que necesita tal tratamiento, en donde se administra una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de dicho inhibidor de la histona desacetilasa a dicho sujeto despues de haber administrado una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de una decitabina inhibidora de la metilacion del ADN a dicho sujeto.

3. La decitabina inhibidora de la metilacion del ADN para su uso o el inhibidor de la histona desacetilasa para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde dicho inhibidor de la histona desacetilasa se selecciona de: TSA, SAHA, MS-275, acidos aminosuberoil hidroxamicos, bishidroxamato de acido M-Carboxicinamico, LAQ-824, LBH-589, belinostat (PXD-101), Panobinostat (LBH- 589), un analogo de acido cinamico hidroxamico de bishidroxamato de acido M-carboxicinamico, IF2357, hidroxamidas del acido ariloxialcanoico, depsipeptido, apicidina, grupo de moleculas peptfdicas dclicas que contienen acido hidroxamico, FK-228 (romidepsina), Fk rojo, un peptidomimetico dclico unido por una cadena alifatica a un acido hidroxamico, butirato, fenilbutirato, butirato de sodio (NaBut), acido valproico, butirato de pivaloiloximetilo, 5 NOX-275 y MGCD0103.

4. La decitabina inhibidora de la metilacion del ADN para su uso o el inhibidor de la histona desacetilasa para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho inhibidor de la histona desacetilasa es panobinostat, belinostat, romidepsina, acido valproico, entinostat, apicidina, SAHA o NaBut.

5. La decitabina inhibidora de la metilacion del ADN para su uso o el inhibidor de la histona desacetilasa para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha infeccion por VIH esta provocada por un retrovirus seleccionado del grupo que consiste en: el VIH-1 y el VIH-2.

6. Una composicion o formulacion farmaceutica que comprende:

a) una decitabina inhibidora de la metilacion del ADN,

b) un inhibidor de la histona desacetilasa seleccionado del grupo que comprende: hidroxamatos, peptidos dclicos, acidos alifaticos y benzamidas, y

c) uno o mas componentes adicionales, como, pero sin limitacion, uno o mas disolventes y/o uno o mas transportadores farmaceuticamente aceptables, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada con la infeccion por VIH en un sujeto que necesita tal tratamiento, en donde dicho inhibidor de la histona desacetilasa se administra despues de dicho inhibidor de la metilacion del ADN.

7. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde dicho inhibidor de la histona desacetilasa se selecciona de: TSA, SAHA, MS-275, acidos aminosuberoil hidroxamicos, bishidroxamato de acido M-Carboxicinamico, LAQ-824, LBH- 589, belinostat (PXD-101), Panobinostat (LBH-589), un analogo de acido cinamico hidroxamico de bishidroxamato de acido M-carboxicinamico, IF2357, hidroxamidas del acido ariloxialcanoico, depsipeptido, apicidina, grupo de moleculas peptfdicas dclicas que contienen acido hidroxamico, FK-228, FK rojo, un peptidomimetico dclico unido por una cadena alifatica a un acido hidroxamico, butirato, fenilbutirato, butirato de sodio (NaBut), acido valproico, butirato de pivaloiloximetilo, 5 NOX-275 y MGCD0103.

8. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, en donde dicho inhibidor de la histona desacetilasa es panobinostat, belinostat, romidepsina, acido valproico, entinostat, apicidina, SAHA o NaBut.

9. Un metodo para producir las composiciones o la formulacion para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende combinar los distintos componentes en una composicion o formulacion.