IT202000007873A1 - Molecole per uso nel trattamento delle infezioni virali - Google Patents

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hydrate
inhibitor
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Luca Mazzarella
Pier Giuseppe Pelicci
Saverio Minucci
Fabio Santoro
Mauro Romanenghi
Paul Edward Massa
Duso Bruno Achutti
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St Europeo Di Oncologia S R L
Univ Degli Studi Milano
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Description

MOLECOLE PER USO NEL TRATTAMENTO DELLE INFEZIONI VIRALI
CAMPO DELLA TECNICA
La presente invenzione riguarda molecole in grado di attivare il rilevamento di RNA a doppio filamento (dsRNA) e loro combinazioni per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di infezioni virali, in particolare di infezioni da Coronavirus e metodi di screening per tali molecole.
STATO DELL?ARTE
L'attuale pandemia di Covid-19 ? indubbiamente un evento importante nella storia dell'umanit?. Il suo impatto drammatico ? favorito da diversi elementi di novit? tra cui la relativamente recente coevoluzione uomo-virus (Cui et al., 2019), l'elevato grado di connettivit? nella societ? moderna (Haw et al., 2019) e l'elevato numero di infezioni e morti, rispetto alle altre due epidemie di coronavirus di questo millennio, la sindrome respiratoria acuta grave (SARS) e la sindrome respiratoria medio-orientale (MERS) (Wang et al., 2020).
Nonostante i recenti trial con combinazioni antivirali, la mortalit? per i pazienti ospedalizzati rimane elevata, fino al 25% (Cao et al., 2020). Una strategia alternativa ? il trattamento della malattia in stadio iniziale, che potrebbe ridurre l?ospedalizzazione, alleviando cos? la pressione sui sistemi sanitari attualmente sovraccarichi, e minimizzare il rischio di diffusione virale ospedaliera, un?importante via di infezione in questa pandemia (Wang et al., 2020). A tal fine, ? necessario adottare nuovi approcci, comprese nuove modalit? di trattamento, bersagliando i processi biologici delle fasi iniziali della diffusione virale.
Meccanismi di rilevamento di RNA a doppio filamento (dsRNA) come bersagli farmacologici praticabili
Il dsRNA viene generato durante la replicazione di qualsiasi tipo di virus (virus a RNA con genoma a doppio filamento, virus a RNA, DNA a singolo filamento) in cellule di mammifero. Una volta riconosciuto dai sensori citoplasmatici, il dsRNA attiva specifici percorsi immunitari innati per limitare replicazione e diffusione virale. I sensori di dsRNA includono: i) PKR, che fosforila eIF2? portando all'inibizione della traduzione; ii) OAS, che induce la dimerizzazione della RNasiL e la degradazione non specifica di RNA, portando all'arresto trascrizionale e all'apoptosi di alcune tipologie cellulari; iii) TLR (nelle cellule immunitarie), che segnalano agli IRF e NF-?B portando all'attivazione di IFN; iv) RIG-I e MDA-5 (in cellule non immunitarie) che anche attivano IFN attraverso MAVS/IPS-1/VISA/CARDIF (Gantier & Williams, 2007). Oltre ad attivare i meccanismi di risposta precoce, il rilevamento del dsRNA ? fondamentale anche per presentare adeguatamente gli antigeni per innescare l'immunit? adattativa (Cella et al., 1999) e quindi la protezione a lungo termine.
Diverse linee di evidenza mostrano che i meccanismi di rilevamento di dsRNA svolgono un ruolo chiave nel ciclo replicativo dei Coronavirus (CoV), tra cui SARS-CoV-2, e che tutti i sensori di dsRNA (MDA5, OAS-RNASEL e PKR) sono necessari per la clearance del virus (Kindler et al 2017). I CoV producono intermedi di dsRNA durante il loro ciclo di replicazione, in organelli separati associati al RE chiamati vescicole a doppia membrana (DMV) (Knoops et al., 2008). I CoV producono pi? proteine non strutturali (ns) che proteggono attivamente i virus in replicazione dal rilevamento innato. In particolare, ? stato scoperto che tre proteine ns (ns2, ns4, ns15) inibiscono specificamente il rilevamento di dsRNA a diversi livelli. Le mutazioni inattivanti in queste proteine portano a una profonda inibizione della replicazione virale nei modelli murini di CoV e consentono un decorso clinico favorevole e l'attivazione della memoria immunologica, anche contro ceppi wild-type, nei modelli murini di CoV (Deng et al., 2017; Kindler et al., 2017). ? importante sottolineare che queste proteine ns sono conservate nel SARS-CoV-2, con omologia molto elevata tra i ceppi (Wu et al., 2020). Tutti i sistemi di rilevamento di dsRNA (MDA5, OAS-RNASEL e PKR) sembrano essere necessari per la clearance del virus (Kindler et al., 2017). I sistemi di rilevamento di dsRNA sono particolarmente attivi nelle cellule mieloidi (monociti, macrofagi e cellule dendritiche), che agiscono come prima linea di protezione. Il pretrattamento con composti simili a dsRNA (poliI-C) ha protetto i topi dalla successiva infezione sperimentale con CoV, pi? di altri agenti stimolanti l'immunit? innata come LPS o agenti cGAS-STING-attivanti (Zhao et al., 2012), supportando ulteriormente la nozione secondo cui l'attivazione precoce del rilevamento di dsRNA pu? limitare la diffusione di CoV. Le vie di rilevamento di dsRNA sono attivate anche da retrovirus endogeni (ERV), che rappresentano una frazione considerevole del genoma trascritto e potenzialmente possono generare grandi quantit? di dsRNA. Le cellule di mammifero hanno sviluppato diversi strati di controllo per mantenere i dsRNA endogeni derivati da ERV a bassi livelli. Dopo la trascrizione, il dsRNA viene modificato attraverso gli enzimi ADAR. A livello trascrizionale, gli ERV sono sottoposti a silenziamento fin dalle prime fasi dello sviluppo embrionale (Macfarlan et al., 2011) attraverso molteplici strati di regolazione epigenetica, tra cui metilazione del DNA, demetilazione dei marchi istonici attivi mediante LSD1, repressione mediata da polycomb mediante EZH2 e acetilazione istonica. Notabilmente, l'inibizione di questi meccanismi di silenziamento epigenetico mediante modulazione farmacologica o genetica induce la riespressione di ERV, innescando cos? una risposta dsRNA-simile e portando all'attivazione di OAS/RNASEL, PKR e MDA5 (Kassiotis & Stoye, 2016). Pertanto, la replicazione di CoV pu? essere inibita attivando il rilevamento di dsRNA attraverso la modulazione farmacologica di fattori epigenetici e la riespressione di ERV.
Sono disponibili numerosi farmaci che bersagliano i regolatori epigenetici (epifarmaci) in diverse fasi di sviluppo clinico. Gli inibitori della DNA metiltransferasi azacitidina e decitabina sono consolidati nel trattamento di MDS e AML nella popolazione anziana. Una formulazione orale di azacitidina ha recentemente concluso la sperimentazione di fase 3 ed ? stata presentata la relativa domanda di approvazione. Anche diversi inibitori della deacetilasi istonica (HDAC) sono stati approvati per uso in tumori ematologici maligni. Diversi inibitori di LSD1, HDAC e EZH2 sono attualmente in fase di sviluppo e hanno concluso studi di fase 1 o 2 per indicazioni oncologiche, con una recente approvazione dell'inibitore di EZH2 Tazemetostat.
Nehme et al., hanno suggerito che gli inibitori di DNMT potrebbero costituire un nuovo approccio per il trattamento di malattie associate a virus come il carcinoma epatocellulare (HCC) associato al virus dell'epatite C (HCV) (Nehme et al., 2019). Un lavoro di Chen et al., ha infatti mostrato che le DNMT sono critiche per la replicazione di HCV in cellule coltivate (Chen et al., 2013). Un altro report sostiene inoltre la potenziale azione antiretrovirale dell'azacitidina, che, somministrata per trattare la sindrome mielodisplastica in un paziente positivo per HTLV-1, ha avuto un impatto anche sulla replicazione del virus linfotropo T umano (HTLV-1) (Diamantopoulos et al., 2012). Liang et al., hanno descritto un inibitore di LSD1 in grado di reprimere la replicazione litica del virus dell'Herpes Simplex (HSV) e l'espressione genica di altri virus a DNA come il citomegalovirus (CMV) umano (Liang et al., 2013).
Pertanto, ? tuttora sentita la necessit? di un trattamento efficace per infezioni virali, in particolare infezioni da Coronavirus.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Partendo dalle seguenti ipotesi:
i) l'attivazione di meccanismi endogeni di rilevamento di dsRNA pu? inibire significativamente la replicazione di coronavirus, superando i sistemi di neutralizzazione di CoV (ns2, ns4, ns15) (Deng et al., 2017; Kindler et al., 2017; Thornbrough et al., 2016; Wu et al., 2020);
ii) l'inibizione farmacologica di LSD1 pu? sovraregolare i livelli e l'attivit? di componenti chiave del meccanismo di rilevamento di dsRNA, vale a dire MDA5 e OAS (dati presenti e referenze Banerjee et al., 2019; Sheng et al., 2018)), probabilmente a causa della riattivazione di retrovirus endogeni. Risultati simili, seppur con efficacia diversa, sono stati ottenuti con altri farmaci epigenetici come inibitori di HDAC, DNMT e EZH2 (Banerjee et al., 2019; Daskalakis et al., 2018, Thummalapalli, 2018), per i quali i farmaci attivi sono utilizzati come standard di cura per una serie di neoplasie ematologiche maligne, in particolare per i pazienti anziani (Fenaux et al., 2009);
iii) precedenti evidenze suggeriscono che le cellule mieloidi sono fondamentali nelle fasi iniziali dell'infezione da coronavirus per limitare l'estensione dell'infezione, anche se questo pu? variare a seconda del ceppo di CoV (Chu et al., 2014; Deng et al., 2017; Kindler et al., 2017). Le cellule mieloidi, in particolare i macrofagi, esprimono livelli basali di proteine OAS superiori alle cellule epiteliali a causa della segnalazione costitutiva IFN; questo ? chiave per la reattivit? precoce a CoV (Birdwell et al., 2016). Pertanto, l'effetto di inibitori di LSD1 o DNMT pu? essere massimo e biologicamente rilevante in cellule mieloidi, ma meno in cellule epiteliali,
gli inventori hanno trovato che la segnalazione di dsRNA svolge un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria innata contro i coronavirus e che pu? essere modulata per scopi terapeutici. Nello specifico, hanno trovato che la riattivazione epigenetica del rilevamento di dsRNA nelle cellule mieloidi, come mediante inibizione dell'istone demetilasi LSD1 o delle DNA metiltransferasi (DNMT), pu? inibire il ciclo replicativo del Coronavirus (CoV), specialmente nelle fasi iniziali dell'infezione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Forma pertanto un oggetto dell'invenzione una molecola in grado di attivare il rilevamento di dsRNA o relative combinazioni per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di un'infezione virale.
Preferibilmente, detta molecola bersaglia un regolatore epigenetico.
In una forma di realizzazione preferita, la molecola ? selezionata dal gruppo costituito da: inibitori di LSD1, inibitori di DNMT, inibitori di HDAC, inibitori di istone metiltransferasi (HMT) come inibitori di EZH1/2 o inibitori di PRMT, doppi inibitori di HDAC/LSD1, inibitori di BET o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni. Preferibilmente, l'inibitore di LSD1 ? selezionato dal gruppo costituito da: N-[4-[(1S,2R)-2-amminociclopropil]fenil]-4-(4-metilpiperazin-1-il)benzammide (DDP38003) e suoi stereoisomeri come N-[4-[(trans)-2-amminociclopropil]fenil]-4-(4-metilpiperazin-1-il)benzammide (DDP37368), ORY-1001 (o iadademstat), CC-90011, ORY-2001 (o vafidemstat), uno qualsiasi o pi? dei composti descritti in WO2011131576, WO2014086790, WO2015181380, WO2016034946, WO2017198780 o WO2019034774, che sono tutti qui incorporati per riferimento, GSK-2879552, IMG-7289 (o bomedemstat), INCB059872, 4SC-202 (o domatinostat), Seclidemstat, TAK-418, SYHA-1807, BEA-17, HM-97211, HM-97346, JBI-097, JBI-128, ORY-3001, RN-1, SP-2509, T-3775440, T-448, EPI-110, o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni.
Preferibilmente, l'inibitore di DNMT ? selezionato dal gruppo costituito da: 5-azacitidina (5AC, nome commerciale: Vidaza?, Azadina), 5-aza-2'-deossicitidina (5-aza-CdR; DAC; nota anche come Decitabina, nome commerciale: Dacogen?), CC-486 (Vidaza orale), 4'-tio-2'-deossicitidina (o TdCyd), 5aza-4'-tio-2'-deossicitidina (o aza-T-dCyd), Guadecitabina sodica (SGI-110), Zebularina, CP-4200, Flucitosina, Roducitabina, NSC-764276, EF-009, KM-101, NTX-301, Sinefungina, un oligonucleotide antisenso come MG-98, o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni.
Preferibilmente, l'inibitore di HDAC ? un inibitore pan-HDAC o ? selettivo per HDAC1-3 o ? selettivo per HDAC6. Preferibilmente, l'inibitore di HDAC ? selezionato dal gruppo costituito da: Vorinostat (nome commerciale: ZOLINZA?), Romidepsina (nome commerciale: Istodax?), Panobinostat (nome commerciale: FARYDAK?), Belinostat, Entinostat, Dacinostat, Domatinostat, Resminostat, Acido valproico, Valproato sodico, Quisinostat cloridrato, CUDC-101, Tefinostat, Givinostat, Mocetinostat, Chidammide, Abexinostat, Pracinostat, Tacedinalina, Acido butirrico, Pivanex, Acido 4-fenilbutirrico (o fenilbutirrato sodico), Tucidinostat (o chidammide, nome commerciale: Epidaza?), Nanatinostat, Fimepinostat, Remetinostat, Ricolinostat, Tinostamustina, Pracinostat, APH-0812, CG-745, CKD-506, CKD-581, CXD-101, FX-322, YPL-001, CFH-367C, Citarinostat, CKD-504, CUDC-908, HG-146, KA-2507, Lipocurc, MPT-0E028, NBM-BMX, OBP-801, OKI-179, RDN-929, VTR-297, REC-2282, CS-3003, ACY-1035, ACY-1071, ACY-1083, ACY-738, ACY-775, ACY-957, ADV-300, AN-446, AP-001 (o Metavert), Butirrato di arginina, BMN-290, C-1A, CG-1521, CKD-509, CKD-L, CM-414, Crocetin, CS-3158, CT-101, CX-1026, RCY-1410, SE-7552, SKLB-23bb, CY-190602, JBI-097, JBI-128, JMF-3086, KAN-0440262, KDAC-0001, Largazolo, MPT-0B291, MPT-0G211, MRx-0029, MRX-0573, MRX-1299, NHC-51, Nexturastat A, OKI-422, QTX-125, RCY-1305, SP-1161, SP-259, SRX-3636, ST-7612AA1, TJC-0545, Trichosic, YH-508, HSB-501, NBM-1001, QTX-153, RDN-1201, ROD-119, ROD-1246, ROD-1275, ROD-1702, ROD-2003, ROD-2089, ROD-702 e RTSV-5, o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni.
Preferibilmente, l'inibitore di HMT ?:
i. un inibitore di EZH1/2 selezionato dal gruppo costituito da: Tazemetostat bromidrato (nome commerciale; TAZVERIK?), Valemetostat, ZLD1039, GSK926, GSK126, PF-06821497, UNC1999, CPI-1205, MC-3629, CPI-0209, SHR-2554, CPI-169, EBI-2554, GSK-343, HM-97594, IONISEZH-22.5Rx, JQEZ-5, MS-1943, ORS-1, TBL-0404, KM-301, GSK2816126 o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o ii. un inibitore di PRMT, come un inibitore di PRMT5 o un inibitore di PRMT1, preferibilmente detto inibitore di PRMT5 ? selezionato dal gruppo costituito da: GSK3326595, JNJ-64619178, PF-06939999, PRT-543, PRT-811, JBI-778, GSK-3235025 o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni,
preferibilmente detto inibitore di PRMT1 ? GSK3368715 o un suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni,
e/o
iii. un inibitore di DOT1L, preferibilmente Pinometostat (o EPZ-5676)
o un suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o iv. APTA-16
o un suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile, e/o
v. un inibitore di istone-lisina N-metiltransferasi (EHMT2 o G9a), preferibilmente selezionato dal gruppo costituito da: BIX-01294, un analogo di BIX-01294 (o TM-2115)
o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o vi. un doppio inibitore contro G9a e DNMT, preferibilmente CM-272
o un suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o vii. un inibitore dell'interazione menin-MLL1 (o KMT2A), preferibilmente MI-3454 e/o KO-539, o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, viii. un inibitore di SETD2, preferibilmente EPZ-040414
o un suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni.
Preferibilmente, il doppio inibitore di HDAC/LSD1 ? selezionato dal gruppo costituito da: le molecole descritte in WO 2017/195216; D. Sivanandhan et al., ?Abstract 3509: Novel dual inhibitors of LSD1-HDAC for treatment of cancer?, Cancer Research, 2015, 75, 15, doi: 10.1158/1538-7445.AM2015-3509; D. Sivanandhan et al., ?Abstract 5860: Novel, first-in-class dual inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and histone deacetylatse 1 (HDAC) for treatment of cancer?, Cancer Research, 2018, 78, 13, doi: 10.1158/1538-7445.AM2018-5860; D. Sivanandhan et al., ?Abstract 1382: Novel dual inhibitors of LSD1-HDAC6/8 for treatment of cancer?, Cancer Research, 2018, 78, 13, doi: 10.1158/1538-7445.AM2018-1382; Kalin JH, Wu M, Gomez AV, et al.; ?Targeting the CoREST complex with dual histone deacetylase and demethylase inhibitors.?; Nat. Commun. 2018;9(1):53. doi:10.1038/s41467-017-02242-4, che sono tutti qui incorporati per riferimento, o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni.
Preferibilmente, l'inibitore di BET ? selezionato dal gruppo costituito da: I-BET762 (o molibresib), CPI-0610, OTX015, RVX-280 (o apabetalone), ODM-207, PLX-2853, ZEN-3694, ABBV-744, AZD-5153, BI-894999, JQ-1 BOS-475, CC-90010, CC-95775, Mivebresib, BPI23314, SYHA-1801, ARV-771, CK-103, dBET-1, GSK-3358699, MA-2014, MS-417, NEO-2734, NHWD-870, NUE-7770, OHM-581, PLX-51107, QCA-570, RVX-297, SF-2523, SF-2535, SRX-3177, SRX-3262, ZBC-260, DCBD-005, KM-601, MZ-1, SBX-1301, SRX-3225, ZL-0580, NUE-19796, NUE-20798, o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni.
? anche un oggetto della presente invenzione qualsiasi combinazione di due o pi? molecole come sopra definite. In particolare, ? un oggetto della presente invenzione una combinazione di pi? di molecola che bersaglia un regolatore epigenetico come qui definito.
Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione una combinazione per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di infezione virale, comprendente:
a) la molecola, o il suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile, o loro combinazioni come definito sopra; e
b) uno o pi? altri agenti terapeutici.
Preferibilmente, detti uno o pi? agenti terapeutici sono selezionati dal gruppo costituito da: farmaci antivirali, inibitori della citidina-deamminasi, acido retinoico, acido lipoico, agenti anticoagulanti, vitamina D, antibiotici, corticosteroidi, curcumina, procaina, idralazina, epigallocatechina gallato, RG-108, 3-nitro-2-(3-nitrofenil)flavone, disulfiram, isoossazolina. Pi? preferibilmente detti uno o pi? agenti terapeutici sono selezionati dal gruppo costituito da Interferone (in particolare interferone alfa), Ribavirina, Lopinavir/Ritonavir, clorochina, idrossiclorochina, eparina, cedazuridina.
In una forma di realizzazione preferita, detta combinazione ? una combinazione di azacitidina e cedazuridina (ad es. ASTX030) o di decitabina e cedazuridina.
Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica per uso nel trattamento e/o nella prevenzione dell'infezione virale, comprendente:
a) la molecola, o il suo sale o solvato farmaceuticamente accettabile o loro combinazioni come definito sopra o la combinazione come definita sopra; e
b) almeno un eccipiente e/o vettore farmaceuticamente accettabile.
Preferibilmente, l'infezione virale ? un'infezione del tratto respiratorio. Preferibilmente, l'infezione virale ? causata da e/o associata a virus a RNA. Preferibilmente, detti virus a RNA appartengono alla famiglia dei Coronaviridae. Pi? preferibilmente, il virus viene selezionato dal gruppo costituito da: coronavirus umano 229E; coronavirus umano OC43; coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV); coronavirus umano NL63 (HCoV-NL63, coronavirus di New Haven); coronavirus umano HKU1; coronavirus della sindrome respiratoria medio-orientale (MERS-CoV); e coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2).
Preferibilmente, l'infezione virale ? un'infezione da coronavirus selezionata dal gruppo costituito da: COVID-19, SARS, MERS, qualsiasi altra sindrome respiratoria acuta grave causata da Coronavirus, infezioni del tratto respiratorio superiore, polmonite, pneumonite, bronchite.
Un altro oggetto dell'invenzione ? un metodo in vitro o ex vivo per eseguire uno screening di un trattamento terapeutico, preferibilmente della molecola o delle sue combinazioni come definito sopra, di un'infezione virale, preferibilmente un'infezione da Coronaviridae, comprendente i seguenti passaggi:
a) trattare cellule murine L929, cellule murine LLC1, cellule murine RAW264.7, cellule umane VERO, cellule umane CALU, macrofagi primari murini, e/o macrofagi primari umani con detto trattamento terapeutico;
b) aggiungere a dette cellule un virus, preferibilmente un coronavirus, preferibilmente MHV per cellule murine, SARS-CoV per cellule umane, SARS-CoV-2 per cellule umane e/o MERS per cellule umane;
c) determinare titolo virale, RNA virale e/o proteine virali nel surnatante di dette cellule; d) confrontare con un controllo e/o riferimento appropriato,
in cui il trattamento terapeutico ? identificato quando il titolo virale, l'RNA virale e/o le proteine virali sono diminuiti o eradicati rispetto al controllo/riferimento.
Detto controllo/riferimento potrebbe essere qualsiasi controllo/riferimento adatto tra cui, ma senza limitazioni, cellule incubate con detto virus.
Preferibilmente, il titolo virale ? determinato mediante saggio di formazione di placche. Preferibilmente, l'RNA virale viene determinato mediante RT-qPCR di RNA/DNA virale.
Per "rilevamento di dsRNA" si intendono qui tutti i componenti del meccanismo cellulare responsabili del rilevamento e della reazione all'RNA a doppio filamento (si veda ad esempio Hur S, Double-Stranded RNA Sensors and Modulators in Innate Immunity, Annu Rev Immunol. apr. 201926;37:349-375).
Nel contesto della presente invenzione, il termine "molecola" pu? comprendere anche agenti biologici e sequenze oligonucleotidiche.
La molecola della presente invenzione pu? essere qualsiasi molecola comunemente indicata come regolatore epigenetico. Quindi, la molecola pu? bersagliare un regolatore epigenetico o pu? essere essa stessa un regolatore epigenetico. Quando detta molecola bersaglia un regolatore epigenetico, detto regolatore epigenetico ? preferibilmente definito come qualsiasi proteina in grado di regolare direttamente la trascrizione genica attraverso l'interazione con DNA, RNA o cromatina.
"Virus" o "virale" come qui usato comprende qualsiasi virus in grado di eseguire dsRNA o qualsiasi virus a RNA. Quindi, ? preferito che il virus non sia un virus a DNA, come l'Herpes virus.
Con "infezione da coronavirus" si intende un'infezione causata da o comunque associata alla crescita di coronavirus in un soggetto nella famiglia Coronaviridae (sottofamiglia Coronavirinae). Preferibilmente, il coronavirus ? selezionato dal gruppo costituito da:
(a) alfacoronavirus;
(b) betacoronavirus;
(c) gammacoronavirus; e
(d) deltacoronavirus.
Esempi di alfacoronavirus includono Alfacoronavirus 1, Coronavirus del pipistrello CDPHE15, Coronavirus del pipistrello HKU10, Coronavirus umano 229E, Coronavirus umano NL63, Coronavirus del pipistrello Miniopterus 1, Coronavirus del pipistrello Miniopterus HKU8, Coronavirus del visone 1, Virus della diarrea epidemica suina, Coronavirus del pipistrello Rhinolophus HKU2, e Coronavirus del pipistrello Scotophilus 512.
Esempi di betacoronavirus includono Coronavirus murino, Betacoronavirus 1, Coronavirus del riccio 1, Coronavirus umano HKU1, Coronavirus correlato alla sindrome respiratoria medioorientale, Coronavirus del pipistrello Pipistrellus HKU5, Coronavirus del pipistrello Rousettus HKU9, Coronavirus correlato alla sindrome respiratoria acuta grave, e Coronavirus del pipistrello Tylonycteris HKU4.
Esempi di gammacoronavirus includono Coronavirus aviario e Coronavirus della balena Beluga SW1.
Esempi di deltacoronavirus includono Coronavirus del bulbul HKU11, Coronavirus della gallinula comune HKU21, Coronavirus HKU15, Coronavirus della Lonchura HKU13, Coronavirus dell?airone notturno HKU19, Coronavirus del tordo HKU12, Coronavirus dell'occhio bianco HKU16 e Coronavirus della mareca HKU20.
Preferibilmente, il coronavirus ? un coronavirus umano, pi? preferibilmente ? selezionato dal gruppo costituito da:
(a) coronavirus umano 229E;
(b) coronavirus umano OC43;
(c) coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV)
(d) coronavirus umano NL63 (HCoV-NL63, coronavirus di New Haven);
(e) coronavirus umano HKU1;
(f) coronavirus della sindrome respiratoria medio-orientale (MERS-CoV);
(g) coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2).
Preferibilmente, la sequenza di nucleotidi del coronavirus e/o la sequenza di amminoacidi delle proteine del coronavirus sono come definito in: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/, ad esempio come definito in GenBank con il numero di accesso MN908947.3.
Preferibilmente, il genoma del coronavirus ? come definito in: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi?taxid=11118, e qualsiasi voce di database ivi collegata, ad esempio come definito in GenBank con il numero di accesso NC_034440.1.
Preferibilmente, la sequenza del coronavirus ? come definita nella banca dati GenBank NCBI, con il numero di accesso: FJ647223, numero di versione: FJ647223.1.
Preferibilmente, la molecola come qui definita in precedenza non ? una di quelle descritte in D. E. Gordon et al., "A SARS-CoV-2-Human Protein-Protein Interaction Map Reveals Drug Targets and Potential Drug-Repurposing" doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.22.002386, qui incorporato per riferimento.
Il termine "trattamento" comprende l'attenuazione, parziale o completa, dei sintomi dell'infezione da coronavirus (a seconda del particolare tipo di coronavirus e dello stadio dell'infezione, il sintomo pu? includere ma senza essere limitato a temperatura corporea elevata, mal di gola, naso chiuso e/o che cola, tosse, anosmia e altri deficit sensoriali, distress respiratorio associato a polmonite che pu? richiedere ventilazione artificiale e richiedere terapia intensiva). Tale trattamento pu? includere l'eradicazione, o il rallentamento della crescita del Coronavirus, e pu? includere l'eradicazione o il rallentamento della crescita di altri agenti virali o di altri agenti microbici che sono associati all'infezione da Coronavirus. Tale trattamento pu? portare alla scomparsa o al miglioramento dei sintomi associati all'infezione da Coronavirus, tra cui, ma senza limitazioni, l'effetto del trattamento ? quello di bloccare il peggioramento dei sintomi del soggetto, che richiedevano ospedalizzazione, ventilazione artificiale, e recupero in unit? di terapia intensiva.
Il termine "prevenzione" include la riduzione del rischio di infezione da coronavirus nei pazienti. Tuttavia, si apprezzer? che tale prevenzione pu? non essere assoluta, vale a dire che pu? non prevenire in tutti tali pazienti lo sviluppo di un'infezione da coronavirus, il rallentamento dell'infezione e/o l?attenuazione dei sintomi come sopra. Pertanto, i termini "prevenzione" e "profilassi" possono essere usati in modo intercambiabile.
In una forma di realizzazione, l'infezione da coronavirus ? un'infezione del tratto respiratorio superiore e/o inferiore. In alternativa, o in aggiunta, l'infezione da coronavirus pu? essere nel tratto gastrointestinale o interessare altri organi (come il sistema nervoso centrale). Alcuni coronavirus, come MERS, possono anche infettare le cellule epiteliali renali. In tutti i casi, i Coronavirus possono infettare le cellule bersaglio attraverso il legame a recettori specifici. Nel caso di alcuni Coronavirus (SARS-CoV, MERS, SARS-CoV-2) il recettore ? il recettore ACE2. Pertanto, l'infezione da coronavirus ? un'infezione di qualsiasi organo che contiene cellule che esprimono il recettore ACE2 nelle sue cellule parenchimali, o nelle cellule del tessuto connettivo (cellule vascolari, cellule fibroblastiche).
Il termine "tratto respiratorio superiore" include la bocca, il naso, il seno, l'orecchio medio, la gola, la laringe e la trachea. Il termine "tratto respiratorio inferiore" comprende i tubi bronchiali (bronchi) e i polmoni (bronchi, bronchioli e alveoli), nonch? il tessuto interstiziale dei polmoni. Per "tratto gastrointestinale" si intende il canale dalla bocca all'ano, comprendente bocca, esofago, stomaco e intestini.
In una forma di realizzazione alternativa, l'infezione da coronavirus ? un'infezione renale.
La presente invenzione comprende anche analoghi, forme tautomeriche, stereoisomeri, polimorfi, solvati, intermedi, sali, metaboliti, e profarmaci farmaceuticamente accettabili delle molecole qui descritte.
I sali delle molecole qui descritte rientrano nell'ambito della presente invenzione. Come qui usato, il termine "sale" si riferisce ad un sale acido e/o basico formato con acidi e basi inorganici e/o organici. I sali dei composti della presente invenzione possono essere formati, ad esempio, facendo reagire un composto della presente invenzione con una quantit? equivalente di un acido o di una base in un mezzo acquoso o in un mezzo come uno in cui un sale precipita.
Esempi non limitativi di tali sali includono quanto segue: ad esempio, acido acetico, acido adipico, acido benzensolfonico, acido benzoico, acido canforico, acido canforsolfonico, acido citrico, acido ciclamico, acido etan-1,2-disolfonico, acido etansolfonico, acido 2-idrossietansolfonico, acido formico, acido fumarico, acido bromico, acido cloridrico, acido solforico, acido nitrico, acido fosforico, acido malico, acido maleico, acido metansolfonico, acido naftalen-2-solfonico, acido naftalen-1,5-disolfonico, acido 1-idrossi-2-naftalenico, acido nicotinico, acido trifluoroacetico, acido ossalico, acido p-toluensolfonico, acido propionico, acido glicolico, acido succinico, acido tartarico, amminoacido (ad esempio, lisina), acido salicilico, acido 2,2-cloroacetico, acido L-aspartico, acido (+)-(1S)-canfor-10-solfonico, acido 4-acetammidobenzoico, acido caproico, acido cinnamico, acido gentisico, acido glutarico, acido malonico, acido mandelico, acido ortico, acido pamoico, acido amminosalicilico e simili possono essere usati per formare un sale di addizione acida. Quando sono presenti una pluralit? di gruppi basici, essi possono formare sali di addizione di mono- o poli-acido.
Inoltre, le molecole dell'invenzione possono essere utilizzate in forme sia non solvatate che solvatate con solventi farmaceuticamente accettabili come acqua, EtOH e simili. Preferibilmente, detto solvato ? un idrato.
Le molecole qui descritte possono contenere uno o pi? atomi di carbonio asimmetrici. I singoli stereoisomeri (enantiomeri e diastereomeri) come pure miscele degli stessi sono inclusi nell'ambito della presente invenzione.
Analogamente, resta inteso che le molecole dell'invenzione possono esistere in forme tautomeriche e anche tutte queste sono incluse nell'ambito della presente invenzione.
Nella presente invenzione sono inclusi "derivati farmaceuticamente accettabili", vale a dire sali, idrati, solvati, profarmaci, complessi, stereoisomeri o enantiomeri farmaceuticamente accettabili delle molecole della presente invenzione, che mantengono l'attivit? biologica desiderata delle molecole e mostrano minimamente o non mostrano effetti tossicologici indesiderati.
Inoltre, la presente invenzione include profarmaci dei composti della presente invenzione. Il termine "profarmaco" intende indicare un composto che viene covalentemente legato a un trasportatore (veicolo), e quando il profarmaco viene somministrato a un soggetto mammifero, un principio attivo pu? essere rilasciato. Il rilascio del principio attivo pu? avvenire in vivo. I profarmaci possono essere preparati mediante tecniche che sarebbero note agli esperti del ramo. Un gruppo funzionale appropriato in un determinato composto viene modificato mediante queste tecniche. Tale gruppo funzionale modificato rigenera il gruppo funzionale originale nella manipolazione di routine o in vivo. Esempi di profarmaci comprendono, ma senza limitazioni, esteri (ad esempio, derivati acetati, formiati e benzoati) e simili.
Un tipico dosaggio adatto delle molecole della presente invenzione richiesto per il trattamento come dose singola o dosaggio di separazione ? compreso nell?intervallo di circa 0,001 a 750 mg per kg di peso corporeo al giorno, in particolare 0,001 a 100 mg per kg di peso corporeo al giorno, preferibilmente 0,001 a 10 mg, pi? preferibilmente nell?intervallo di 0,005 a 5 mg per kg di peso corporeo. Tuttavia, uno specifico livello di dose per un singolo paziente pu? variare a seconda del particolare composto da usare, del peso corporeo, del sesso e della dieta del paziente, del tempo di somministrazione di un farmaco, del metodo di somministrazione, del tasso di escrezione, della miscela di farmaci, della condizione e dell'et? del paziente, e simili.
La composizione farmaceutica come descritta sopra pu? inoltre comprendere un vettore farmaceuticamente accettabile. Ad esempio, detto vettore pu? essere inerte e pu? essere selezionato tra, ma senza limitazioni, riempitivi come zucchero inclusi lattosio, destrosio, saccarosio, sorbitolo, mannitolo, xilitolo, eritritolo e maltitolo; amido inclusi amido di mais, amido di frumento, amido di riso e amido di patate; famiglia della cellulosa incluse cellulosa, metilcellulosa, sodio carbossimetil cellulosa e idrossipropil metilcellulosa; gelatina, polivinilpirrolidone e simili. Inoltre, in alcuni casi, ? possibile aggiungere un disintegrante come polivinilpirrolidone reticolato, agar, acido alginico o alginato di sodio, ma il disintegrante non ? limitato ad essi.
Per esempio, la composizione farmaceutica pu? inoltre includere, ma senza limitazioni, un agente anti-coesivo, un lubrificante, un agente umettante, un aroma, un emulsionante e un conservante. Inoltre, i composti o le composizioni farmaceutiche secondo la presente invenzione possono essere somministrati per qualsiasi via come desiderato. I composti o le composizioni farmaceutiche possono essere somministrati per via orale o parenterale, ed esempi della via di somministrazione parenterale comprendono, ma senza limitazioni, varie vie quali transdermica, nasale, iniezione peritoneale, muscolare, sottocutanea, endovenosa e simili. Nello specifico, la via di somministrazione dei composti o delle composizioni farmaceutiche della presente invenzione ? preferibilmente iniezione e somministrazione orale.
Le preparazioni iniettabili, ad esempio, una sospensione acquosa od oleaginosa (oleosa) sterilizzata iniettabile, possono essere preparate usando agenti disperdenti, agenti umettanti o agenti sospendenti adatti secondo la tecnica nota. Solventi che possono essere usati a questo scopo includono acqua, soluzione di Ringer e soluzione isotonica di NaCl, e come solvente o mezzo di sospensione vengono convenzionalmente usati anche oli fissi sterilizzati. A questo scopo, ? possibile usare qualsiasi olio fisso non irritante, inclusi mono- o di-gliceridi, e in preparazioni iniettabili ? anche possibile usare acidi grassi come acido oleico.
Le forme di dosaggio solide per la somministrazione orale comprendono capsule, compresse, pillole, polveri e granuli, e le capsule e le compresse sono particolarmente utili.
Le compresse e le pillole vengono preferibilmente preparate con rivestimento enterico. Le forme di dosaggio solide possono essere preparate miscelando una molecola secondo la presente invenzione con un vettore come uno o pi? diluenti inerti inclusi saccarosio, lattosio, amido, ecc.; lubrificanti come stearato di magnesio; disintegranti, leganti e simili.
In una forma di realizzazione della presente invenzione, le molecole di cui sopra o relativi sali farmaceuticamente accettabili, o le composizioni farmaceutiche comprendenti le stesse, possono essere somministrate in combinazione tra loro, per ottenere una migliore efficacia antivirale e/o una ridotta tossicit?.
In una forma di realizzazione della presente invenzione, le molecole di cui sopra o loro sali farmaceuticamente accettabili, o le composizioni farmaceutiche comprendenti le stesse, possono essere somministrate in combinazione con uno o pi? agenti aggiuntivi per ottenere esposizioni terapeutiche e attivit? biologica, come un inibitore della citidina-deamminasi.
In una forma di realizzazione della presente invenzione, le molecole di cui sopra o relativi sali farmaceuticamente accettabili, o le composizioni farmaceutiche comprendenti le stesse, possono essere somministrate in combinazione con uno o pi? agenti aggiuntivi aventi efficacia antivirale per prevenire e trattare malattie infettive virali.
Ad esempio, le composizioni farmaceutiche possono essere somministrate in combinazione con uno o pi? farmaci antivirali quali, interferone, ribavirina o lopinavir/ritonavir, clorochina, idrossiclorochina.
In una forma di realizzazione della presente invenzione, le molecole di cui sopra o loro sali farmaceuticamente accettabili, o le composizioni farmaceutiche comprendenti le stesse, possono essere somministrate in combinazione con uno o pi? agenti aggiuntivi che possono (somministrati in combinazione) migliorare l'efficacia e/o ridurre la tossicit?, ad esempio acido retinoico, acido lipoico, eparina, agenti anti-coagulanti, vitamina D, antibiotici, corticosteroidi.
In una forma di realizzazione, la combinazione pu? essere somministrata simultaneamente, separatamente o sequenzialmente (in qualsiasi ordine).
L'invenzione verr? illustrata mediante esempi non limitativi in riferimento alle figure seguenti.
Fig. 1: Effetto in vivo del trattamento di cellule di leucemia mieloide ematopoietica usando l'inibitore di LSD1 38003 (3 giorni) sulla segnalazione di interferone (A), sull'espressione di famiglie di ERV murini (C) e sul sensore di dsRNA OAS1 (RNAseq) (B).
Fig. 2: Effetto di pretrattamento di: Interferone-alfa (IFN), clorochina (CQ), inibitore di LSD1 (DDP38003), azacitidina (AZA) sul titolo virale o sulla vitalit? cellulare delle cellule bersaglio murine indicate in caso di infezione da MHV.
Fig. 3: Parte superiore: Screenshot del browser del genoma UCSC che mostra i dati da un esperimento diretto RNA-Seq Nanopore di cellule Vero infettate con BetaCoV/Corea/KCDC03/2020. Traccia superiore (verde): RNA subgenomici (sgRNA) assemblati con Pinfish. Tutti gli RNA assemblati mappano sul filamento del genoma virale. Seconda traccia (rossa): letture in sequenza che mappano sull'intermedio di replicazione del filamento ?. Terza traccia (nero) e inserto in alto a destra: posizione delle basi modificate identificate dall'analisi Nanocompore delle letture di CoV-2 (rispetto al controllo IVT).
Parte inferiore: Rilevamento di k-meri modificati nei trascritti virali. I grafici a dispersione mostrano il valore assoluto del rapporto dispari di regressione logistica Nanocompore (asse x) tracciato rispetto al suo valore p (-log 10, asse y). Ogni punto rappresenta un k-mero specifico. Il numero tra parentesi indica le coordinate genomiche della posizione del k-mero.
ESEMPI
Esempio 1
Materiali e metodi
Modello murino di leucemia.
Leucemie promielocitiche acute (APL) murine sono state generate in topi geneticamente ingegnerizzati per esprimere il trascritto di fusione PML/RARa umano (Westervelt et al, Highpenetrance mouse model of acute promyelocytic leukemia with very low levels of PML-RARalpha expression, Blood. 1? settembre 2003;102(5):1857-65). Le cellule sono state ottenute da milze leucemiche o midolli ossei e propagate mediante iniezione endovenosa in topi C57/Bl6 wild-type riceventi. Per gli esperimenti descritti, cellule di 3? passaggio (P3) (10<6>/ topo) sono state iniettate per via endovenosa in topi esprimenti CD45.1.
L'inibitore di LSD1 DDP 37368 ? stato somministrato mediante sonda orale a 45 mg/kg 3 settimane dopo l'iniezione di cellule leucemiche, per 3 giorni consecutivi una volta al giorno. I topi sono stati sacrificati 4 giorni dopo l'inizio del trattamento e le cellule leucemiche per RNAseq sono state ordinate mediante citometria a flusso dopo colorazione per il marcatore donatore CD45.1.
Il sequenziamento dell'RNA ? stato condotto su RNA purificato usando tamponi contenenti guanidinio tiocianato. Le librerie sono state preparate usando il kit di preparazione di librerie di RNA totale Illumina Truseq dopo la deplezione di RNA ribosomiale usando il kit Illumina Ribozero. Il sequenziamento ? stato condotto su uno strumento Illumina Hiseq 2000 per una media di 35 milioni di letture per campione. I file di sequenziamento risultanti sono stati elaborati con filtraggio fastq per letture di bassa qualit?, allineamento TopHat, annotazione e conteggi grezzi per gene tramite conteggi htseqcounts, quantificazione RPKM o RSEM, analisi di espressione differenziale usando DESeq2 e analisi di arricchimento del set genico (GSEA usando l'algoritmo GSEA.
Linee cellulari. I fibroblasti L929 e RAW264.7 sono stati acquistati da ATCC (rispettivamente ATCC? CCL-1? e ATCC? TIB-71?). Macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) sono stati derivati da topi C57/Bl6 come in Weischenfeldt J, Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications, CSH Protoc. 1? dic. 2008;2008.
RISULTATI
Gli inibitori di LSD1 inducono una marcata sovraregolazione di ERV ed espressione di OAS1.
Gli inventori hanno studiato a fondo l'effetto di inibitori di LSD1 su modelli di leucemia promielocitica acuta (APL) (Fioravanti et al., 2020). Le cellule APL condividono diverse caratteristiche delle normali cellule presentanti l'antigene (APC) e possono essere differenziate in cellule con caratteristiche delle cellule dendritiche (H.-Y. Park et al., 2004). Gli inventori hanno studiato i cambiamenti trascrittomici indotti dopo 3 giorni di trattamento con l'inibitore di LSD1 DDP 37368 mediante sonda gastrica. L'analisi di arricchimento del set genico ha mostrato una notevole sovraregolazione delle vie correlate all'interferone con il trattamento con LSD1 (figura 1A). In particolare, i geni chiave per il rilevamento di dsRNA (OAS1 e MDA5, figura 1B) erano tra i pi? sovraregolati; importante ? il fatto che gli inventori non hanno osservato la sovraregolazione di IL6 o altre citochine infiammatorie. Poich? ? stato recentemente suggerito che LSD1 moduli indirettamente le risposte interferone attraverso la regolazione di ERV, gli inventori hanno utilizzato un approccio bioinformatico recentemente sviluppato per quantificare le famiglie di ERV nei dati di RNAseq. Infatti, l'inibizione di LSD1 ha determinato una significativa sovraregolazione degli ERV e di altri elementi ripetuti (figura 1C).
Effetto dei farmaci epigenetici sulla replicazione del coronavirus in vitro.
Gli inventori hanno usato il virus dell'epatite murina, un modello preclinico comunemente usato per studiare la biologia di Coronavirus, che mantiene un alto livello di omologia di tutti i componenti, in particolare le proteine non strutturali coinvolte nell?evasione dal rilevamento del dsRNA. Il pretrattamento dei fibroblasti L929 o delle linee cellulari macrofagiche RAW 264.7 o dei macrofagi primari derivati dal midollo osseo (BMDM) con inibitore di LSD1 (DDP) ha provocato una riduzione del titolo virale (nelle cellule L929/RAW 264.7) e la protezione dalla citotossicit? diretta (nei BMDM). L'agente demetilante del DNA Azacitidina, descritto anche come induttore di ERV e della via di rilevamento di dsRNA, ha effetti simili in cellule L929/RAW 264.7.
Esempio 2
Gli inventori effettueranno un approccio preclinico volto a individuare i composti o le combinazioni pi? efficaci. Gli inventori pianificano di dare priorit? nei loro saggi a: 1) farmaci approvati dalla FDA e dall'EMA, che possono essere posizionati e indirizzati a trial clinici e, qualora si dimostrino efficaci, immediatamente disponibili per l'uso nella popolazione di pazienti dell'attuale pandemia COVID-19; 2) farmaci che sono gi? entrati in sviluppo clinico, per i quali sono disponibili dati di sicurezza disponibili nei pazienti (Fase I-III), che possono anche essere utilizzati immediatamente nei trial clinici, accelerandone l'approvazione clinica come agenti antivirali; 3) piccole molecole in una fase avanzata di sviluppo preclinico, che potrebbero essere prontamente sviluppate e indirizzate a trial clinici; 4) piccole molecole in una fase iniziale, da sviluppare ulteriormente nella prossima generazione di farmaci epigenetici per poter affrontare le prossime pandemie.
I farmaci saranno utilizzati a concentrazioni che minimizzeranno l'attivit? citotossica, pur mantenendo la loro capacit? di attivare la risposta di rilevamento del dsRNA (dosi gi? identificate per alcuni composti: dati preliminari). Tutti gli esperimenti si basano sul trattamento con i farmaci epigenetici, ? interferone (IFN) alfa, o qualsiasi degli altri agenti elencati sopra, prima, al momento della e dopo l'infezione con Coronavirus diversi (murino/umano: si veda di seguito). L'IFN-alfa ? noto per stimolare la produzione di OAS e MDA5, anche se studi suggeriscono che il rilevamento di dsRNA indipendente da IFN ? la via pi? rilevante. Pertanto, l'aggiunta di IFN pu? avere effetti aggiuntivi.
I farmaci valutati comprenderanno: i) Azacitidina (farmaco approvato) come agente demetilante del DNA, e per il quale ? gi? stata dimostrata l'attivazione della risposta di rilevamento del dsRNA. Negli studi in vitro, sar? esplorato un intervallo tra 0,5-10 ?M; saranno testati anche altri agenti demetilanti del DNA (come decitabina, zebularina, ecc.); ii) inibitori della istone deacetilasi (HDAC), che hanno mostrato di attivare la risposta di rilevamento del dsRNA: gli inventori utilizzeranno inibitori pan-HDAC approvati (vorinostat, panobinostat, entinostat), composti selettivi per HDAC1-3 (fase clinica-preclinica iniziale) a dosi selezionate come in precedenza, composti selettivi per HDAC6; iii) inibitori di EZH1/2 (farmaco approvato: tazemetostat; GSK2816126, fase clinica), poich? hanno mostrato di avere propriet? antivirali e potenzialmente di regolare la trascrizione retrovirale endogena; iv) inibitori di LSD1, per i quali gli inventori e altri hanno mostrato l'attivazione della risposta di rilevamento di dsRNA: gli inventori testeranno farmaci in varie fasi di sviluppo clinico, e ognuno avendo completato trial di fase 1 come monoterapia (ORY-1001, GSK-2879552, IMG-7289, INCB059872, CC-90011 e ORY-2001), e DDP38003 e loro stereoisomeri (ad esempio DDP37368), un inibitore irreversibile di LSD1 proprietario (candidato preclinico); v) piccole molecole ibride di doppio inibitore di LSD1-HDAC (all'inizio della fase lead del processo di scoperta del farmaco): come approccio esplorativo, gli inventori testeranno anche l'attivit? di doppi inibitori ibridi di LSD1-HDAC, che essi hanno mostrato essere attivi su entrambi i bersagli in vitro
Modelli in vitro e in vivo.
Il modello murino di virus sar? il virus dell'epatite murina (MHV), un modello consolidato di infezione da Coronavirus di cellule murine, gi? disponibile nei nostri laboratori (ottenuto dall'Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna) e gi? utilizzato nella figura 2. MHV appartiene allo stesso gruppo di Coronaviridae della SARS-CoV-2 umana. Sono stati descritti diversi ceppi di MHV, con tropismo e virulenza differenti: gli inventori testeranno i ceppi: A59, JHM, MHV-3 e MHV-1 (ATCC VR-261), l'ultimo dei quali ha mostrato di causare una sindrome respiratoria acuta grave in topi A/J. Preferibilmente, il genoma di tali ceppi ? come definito in: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi?taxid=11118, e qualsiasi voce di database ivi collegata, ad esempio come definito in GenBank con il numero di accesso NC_034440.1.
Come cellule bersaglio, gli inventori bersaglieranno sia il compartimento mieloide che quello epiteliale, come descritto sopra. I macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) murino possono essere derivati dal midollo osseo murino in 7 giorni, e gli inventori hanno gi? mostrato che possono essere infettati in vitro da MHV (dati preliminari). Un buon surrogato ? rappresentato dalla linea di cellule macrofagiche RAW 264.7 (frequentemente usata come modello di infezione da MHV). Come modelli per l'infezione delle cellule polmonari, gli inventori utilizzeranno: i) cellule LLC1 (ATCC CRL-1642); ii) cellule LA4 (ATCC CCL-196), derivate da epiteli polmonari neoplastici da topi di ceppo A (A/He), che hanno alcune propriet? delle cellule alveolari di tipo II, presumibilmente una cellula bersaglio critica nel COVID-19. Negli esperimenti degli inventori, le cellule bersaglio saranno esposte ai diversi farmaci (? IFN-alfa) elencati sopra: negli esperimenti iniziali, gli inventori pretratteranno le cellule bersaglio con i farmaci, poich? la velocit? di replicazione virale in vitro potrebbe non consentire un approccio sperimentale in cui la situazione della malattia (virus prima-farmaco dopo) ? perfettamente imitata. Le seguenti letture saranno misurate in diversi punti temporali (8-24 ore): i) titolo virale, mediante saggio di formazione di placche, TCID50 o quantificazione mediante RT-qPCR del RNA/DNA virale; ii) produzione di IFN-beta mediante ELISA; analisi di citochine multiple mediante ELISA multiplato ad alto rendimento sulla piattaforma LUMINEX-200 PLATFORM; iii) attivit? dell'RNasi L mediante analisi di prodotti di degradazione di rRNA sul sistema automatizzato Agilent Bioanalyzer (disponibile in laboratori esterni); iv) espressione di meccanismi di rilevamento di dsRNA (MDA5, RIG-I, OAS1-3) mediante immunoblot; v) RNAseq per testare la risposta trascrizionale all'infezione in presenza di epifarmaci, e per misurare direttamente la produzione di dsRNA (dati preliminari).
I farmaci con attivit? antivirale confermata saranno: i) immediatamente presi in considerazione per studi clinici per affrontare la pandemia in corso, se gi? approvati o in fase clinica; ii) avanzati allo sviluppo preclinico, se alla fase di candidato preclinico; iii) testati in combinazione con farmaci che infine si riveleranno efficaci contro SARS-CoV-2 negli stessi saggi; iv) esaminati per il loro meccanismo d'azione; iv) avanzati a studi in vivo (si veda di seguito); v) se in fase di scoperta, passeranno alle fasi successive di scoperta del farmaco (ottimizzazione del lead). Come fonte umana del virus, gli inventori utilizzeranno il SARS-CoV (responsabile della SARS) e l'isolato italiano di SARS-CoV-2 (responsabile del COVID-19). Se disponibili, gli inventori testeranno diverse varianti genotipiche di SARS-CoV-2 che saranno isolate da pazienti affetti da COVID-19.
Saranno utilizzate le seguenti cellule epiteliali bersaglio: i) cellule epiteliali renali di scimmia Vero E6 (ATCC CRL-1586): frequentemente utilizzate come modello cellulare umano per l'infezione da SARS-CoV e SARS-CoV-2, sebbene non siano in grado di sviluppare una risposta antivirale essendo carenti di IFN. Pertanto, possono non essere in grado di rispondere a farmaci epigenetici; ii) cellule epiteliali di cancro del polmone Calu-3 (ATCC HTB-55), ampiamente utilizzate per studi virologici. Per i Coronavirus, dovrebbe essere usato un particolare clone (Calu-3 2B4 come descritto in T. Yoshikawa et al., Plos One, 2015, 5, 1, e8729, doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008729), che esprime alti livelli di ACE2 (il recettore di CoV). Per le cellule mieloidi, gli inventori testeranno: i) macrofagi derivati da monociti (MDM) o cellule dendritiche (MDDC) umani. Queste cellule possono essere derivate in 7 giorni da cellule mononucleate di sangue periferico purificato CD14+ (Rios FJ, Touyz RM, Montezano AC. Isolation and Differentiation of Human Macrophages. Methods Mol Biol. 2017;1527:311-320. doi: 10.1007/978-1-4939-6625-7_24. PMID PubMed: 28116726). Come modello cellulare di riserva, gli inventori utilizzeranno la linea cellulare THP1 (ATCC TIB-202), che ha propriet? monocitiche-macrofagiche.
Gli studi in vitro rispecchieranno gli studi murini gi? descritti, per i farmaci, la strategia di trattamento, le letture cellulari e i passaggi successivi dopo l'identificazione dei composti attivi. Non appena i test in vitro forniranno l'indicazione di un'attivit? antivirale, gli inventori valuteranno l'attivit? antivirale in vivo dei farmaci/delle combinazioni di farmaci identificati. Gli inventori utilizzeranno diversi ceppi di MHV, dando priorit? a quelli con patologia polmonare consolidata in ceppi di topo comunemente usati. Gli inventori propongono di utilizzare ceppi murini diversi come riceventi virali (vale a dire, C57BL/6J, A/J), poich? ? stato mostrato che essi reagiscono in modo diverso all'infezione da MHV, con diversa gravit? della patologia polmonare, e risposte distinte di citochine e IFN di tipo 1. Il virus verr? inoculato per via intranasale. Il trattamento con i farmaci testati sar? iniziato 24-48 ore dopo l'inoculazione del virus, quando gli inventori si aspettano di osservare i cambiamenti iniziali nei topi (potenzialmente imitando la malattia allo stadio iniziale). I topi saranno monitorati giornalmente per i sintomi della malattia, inclusi pelo arruffato, tremori e mancanza di attivit?. I topi saranno analizzati in diversi momenti della malattia per istopatologia, carica virale, produzione di citochine, risposta trascrizionale, risposta immunitaria come sopra descritto.
Trascrittomica ad alto rendimento di effetti del farmaco epigenetico su Coronavirus e sugli elementi retrovirali endogeni
Al fine di valutare l'attivazione di vie di immunit? innate e il suo effetto sulla replicazione virale, gli inventori utilizzeranno approcci genomici allo stato dell'arte inclusi il sequenziamento Illumina e Nanopore GridION. Nello specifico, gli inventori effettueranno:
i) Valutazione dell'attivazione della via di rilevamento di dsRNA. Per valutare la capacit? di ciascun epifarmaco di innescare l'attivazione della via di rilevamento del dsRNA, gli inventori eseguiranno il sequenziamento dell'RNA a lettura breve Illumina su cellule trattate e non trattate infettate con i ceppi di coronavirus in studio (nonch? cellule di controllo non infettate trattate/non trattate). L'espressione e l'attivazione dei componenti chiave della via (MDA5, RIG-I, OAS1-3) saranno misurate anche mediante qPCR e Western Blot. Inoltre, per ottenere letture funzionali dell'attivazione della via del dsRNA gli inventori misureranno la produzione di IFNb mediante attivazione ELISA e RNASEL mediante saggi di degradazione di rRNA (bioanalizzatore Agilent).
ii) Caratterizzazione della risposta trascrizionale dell'ospite all'infezione e sua modulazione mediante epifarmaci. Profilando il trascrittoma di cellule infette/non infette, gli inventori saranno in grado di valutare l'effetto dell'infezione virale sull'attivazione delle vie di risposta immunitaria innata dell'ospite. Confrontando i cambiamenti trascrizionali indotti dall'infezione tra cellule trattate e non trattate, gli inventori determineranno il ruolo di epifarmaci nella modulazione della risposta immunitaria innata dell'ospite. Questo sar? ottenuto attraverso la combinazione di RNA-Seq sui filamenti a lettura breve Illumina e RNA-Seq diretto Nanopore, che fornir? un quadro accurato e quantitativo dei cambiamenti indotti dal farmaco a livello genico e di isoforme. In particolare, gli inventori studieranno l'influenza di farmaci epigenetici sulla polarizzazione M1/M2 dei macrofagi derivati da monociti (MDM) umani in termini di fenotipo, secrezione di citochine e chemochine ed espressione di molecole di superficie cellulare rilevanti per l'ingresso e la replicazione di SARS-CoV-2, in particolare ACE-2, TMPRSS2, furina, tra gli altri; l'influenza di farmaci epigenetici su polarizzazione M1/M2 di MDM umani in termini di capacit? di replicazione in MDM umani polarizzati M1/M2 e non polarizzati; l'influenza di farmaci epigenetici su polarizzazione M1/M2 di macrofagi derivati da monociti (MDM) umani in termini di potenziale influenza sulla capacit? infettiva di SARS-CoV-2.
iii) Quantificazione dell'induzione di retroelementi endogeni con il trattamento con epifarmaci. Le pipeline analitiche stabilite dagli inventori basate su dati RNA-Seq sui filamenti a lettura breve consentiranno loro di rilevare e quantificare l'espressione di retroelementi endogeni come LINE ed ERV durante il trattamento con epifarmaco (rispetto a cellule di controllo non trattate). Per superare le limitazioni delle tecnologie di lettura breve durante la quantificazione di elementi ripetitivi, gli inventori integreranno i dati di Illumina con i dati di RNA-Seq diretto di Nanopore, che possono rilevare RNA nativi a lunghezza intera. La combinazione di queste tecnologie consentir? agli inventori di ottenere stime accurate dell'espressione del retroelemento e di dedurre la presenza di dsRNA endogeno.
iv) Valutazione di effetti di epifarmaci sulla trascrizione e replicazione virale. Profilando le cellule trattate e non trattate mediante sequenziamento di RNA diretto Nanopore, gli inventori saranno in grado di quantificare la produzione di 1) RNA virale a senso genomico a lunghezza intera (gRNA), 2) RNA virali sub-genomici (sgRNA) e 3) RNA intermedi di replicazione a filamento negativo. Questi dati forniranno informazioni importanti sull'effetto dell'attivazione indotta dal trattamento della via di rilevamento di dsRNA sulla trascrizione e replicazione virale.
Screening ad alto rendimento di fattori epigenetici e farmaci epigenetici per identificare nuovi bersagli epigenetici per affrontare l'infezione da Coronavirus
Gli inventori esploreranno sistematicamente la possibilit? di identificare ulteriori fattori epigenetici/farmaci epigenetici in grado di interferire con la replicazione di Coronavirus negli screening genetici e farmacologici. Gli inventori hanno: i) librerie murine/umane codificate a barre sottoposte a pooling, basate su shRNA, che bersagliano circa 250 fattori associati alla cromatina (enzimi che modificano la cromatina, proteine che legano la cromatina) per eseguire screening genetici. Essi pianificano di espandere la libreria a 1.000 fattori (per includere ulteriori fattori epigenetici e la maggior parte dei fattori di trascrizione), e di progettare librerie CRISPR di sgRNA aggiuntive per gli stessi fattori. Come backup per le librerie sottoposte a pooling, genereranno inoltre librerie in array, per screening ad alto contenuto; ii) diverse raccolte di piccole molecole: una libreria simil-farmaco di 240.000 piccole molecole per screening ad alto rendimento progettata da un team di chimici medicinali, che pu? essere suddivisa in sottolibrerie rappresentative pi? piccole di 30.000 composti; librerie di piccole molecole focalizzate (che bersagliano enzimi che modificano la cromatina, o domini che legano la cromatina come inibitori di BET, con elevata potenza e buona-alta selettivit? nei saggi cellulari: circa 300 composti, che gli inventori mirano ad espandere fino a 1.000 piccole molecole gi? identificate che bersagliano l'epigenoma) per eseguire trattamenti farmacologici a medio rendimento.
Per gli screening genetici, gli inventori utilizzeranno inizialmente approcci basati non sul virus, sulla base del fatto che il trattamento con l'analogo sintetico di dsRNA poli(I:C ) attiva il meccanismo di rilevamento di dsRNA, portando alla morte cellulare. Gli inventori infetteranno quindi le cellule murine/umane con la libreria testata, e assegneranno punteggi di sopravvivenza. Per gli screening basati su virus, gli inventori infetteranno cellule murine/umane (descritte sopra) con la libreria testata, e quindi infetteranno le cellule con il virus desiderato. Per gli screening con la forma umana del virus (da eseguire in un ambiente BSL3), gli inventori daranno priorit? alle librerie sottoposte a pooling per ridurre al minimo la manipolazione dei campioni. Le letture cellulari saranno: i) vitalit?; ii) misurazione della carica virale; iii) produzione di citochine; iv) espressione di gene/i bersaglio. Gli inventori tenteranno anche di generare forme ricombinanti di Coronavirus, esprimenti reporter fluorescenti (come fusione in-frame alle proteine della replicasi virale, testata per alcuni ceppi MHV), per studi di replicazione virale ad alto contenuto. Gli inventori hanno gi? esperienza nell'esecuzione di questi saggi in formato ad alto rendimento. Nel caso di librerie in array, gli inventori identificheranno immediatamente gli hit, mentre per le librerie sottoposte a pooling (codificate a barre) ci? sar? ottenuto mediante identificazione basata su NGS dei geni bersagliati. Saranno condotti studi di controllo accurati per escludere l'interferenza del meccanismo di bersagliamento cellulare shRNA/sgRNA con la risposta cellulare all'infezione da Coronavirus.
Per gli screening farmacologici, le librerie di cellule in array saranno esposte a farmaci/virus, essenzialmente come descritto nei test farmacologici di cui sopra. Le letture cellulari saranno come per gli screening genetici in array. Gli hit identificati saranno confermati, convalidati per mirare al loro presunto hit ed escludere gli effetti fuori bersaglio, e quindi canalizzati agli studi preclinici e meccanicistici sopra descritti. Le piccole molecole, che necessitano di ulteriore ottimizzazione, saranno avanzate alle attivit? standard di scoperta di farmaci per l'ottimizzazione del lead.

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Molecola in grado di attivare il rilevamento di dsRNA o relative combinazioni per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di un'infezione virale.
  2. 2. Molecola o relative combinazioni per uso secondo la rivendicazione 1, in cui detta molecola bersaglia un regolatore epigenetico.
  3. 3. Molecola o relative combinazioni per uso secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la molecola ? selezionata dal gruppo costituito da: inibitori di LSD1, inibitori di DNMT, inibitori di HDAC, inibitori di istone metiltransferasi (HMT) come inibitori di EZH1/2 o inibitori di PRMT, doppi inibitori di HDAC/LSD1, inibitori di BET o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni.
  4. 4. Molecola per uso secondo la rivendicazione 3, in cui: - l'inibitore di LSD1 ? selezionato dal gruppo costituito da: N-[4-[(1S,2R)-2-amminociclopropil]fenil]-4-(4-metilpiperazin-1-il)benzammide (DDP38003) e suoi stereoisomeri come N-[4-[(trans)-2-amminociclopropil]fenil]-4-(4-metilpiperazin-1-il)benzammide (DDP37368), ORY-1001 (o iadademstat), CC-90011, ORY-2001 (o vafidemstat), uno qualsiasi o pi? dei composti descritti in WO2011131576, WO2014086790, WO2015181380, WO2016034946, WO2017198780 o WO2019034774, che sono tutti qui incorporati per riferimento, GSK-2879552, IMG-7289 (o bomedemstat), INCB059872, 4SC-202 (o domatinostat), Seclidemstat, TAK-418, SYHA-1807, BEA-17, HM-97211, HM-97346, JBI-097, JBI-128, ORY-3001, RN-1, SP-2509, T-3775440, T-448, EPI-110, o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o - l'inibitore di DNMT ? selezionato dal gruppo costituito da: 5-azacitidina, 5-aza-2'-deossicitidina, CC-486, 4'-tio-2'-deossicitidina, 5aza-4'-tio-2'-deossicitidina, Guadecitabina sodica (SGI-110), Zebularina, CP-4200, Flucitosina, Roducitabina, NSC-764276, EF-009, KM-101, NTX-301, Sinefungina, un oligonucleotide antisenso come MG-98, o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o - l'inibitore di HDAC ? selezionato dal gruppo costituito da: Vorinostat, Romidepsina, Panobinostat, Belinostat, Entinostat, Dacinostat, Domatinostat, Resminostat, Acido valproico, Valproato sodico, Quisinostat cloridrato, CUDC-101, Tefinostat, Givinostat, Mocetinostat, Chidammide, Abexinostat, Pracinostat, Tacedinalina, Acido butirrico, Pivanex, Acido 4-fenilbutirrico o fenilbutirrato sodico, Tucidinostat, Nanatinostat, Fimepinostat, Remetinostat, Ricolinostat, Tinostamustina, Pracinostat, APH-0812, CG-745, CKD-506, CKD-581, CXD-101, FX-322, YPL-001, CFH-367C, Citarinostat, CKD-504, CUDC-908, HG-146, KA-2507, Lipocurc, MPT-0E028, NBM-BMX, OBP-801, OKI-179, RDN-929, VTR-297, REC-2282, CS-3003, ACY-1035, ACY-1071, ACY-1083, ACY-738, ACY-775, ACY-957, ADV-300, AN-446, AP-001, Butirrato di arginina, BMN-290, C-1A, CG-1521, CKD-509, CKD-L, CM-414, Crocetin, CS-3158, CT-101, CX-1026, RCY-1410, SE-7552, SKLB-23bb, CY-190602, JBI-097, JBI-128, JMF-3086, KAN-0440262, KDAC-0001, Largazolo, MPT-0B291, MPT-0G211, MRx-0029, MRX-0573, MRX-1299, NHC-51, Nexturastat A, OKI-422, QTX-125, RCY-1305, SP-1161, SP-259, SRX-3636, ST-7612AA1, TJC-0545, Trichosic, YH-508, HSB-501, NBM-1001, QTX-153, RDN-1201, ROD-119, ROD-1246, ROD-1275, ROD-1702, ROD-2003, ROD-2089, ROD-702 e RTSV-5 o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o - l'inibitore di HMT ?: i. un inibitore di EZH1/2 selezionato dal gruppo costituito da: Tazemetostat bromidrato, Valemetostat, ZLD1039, GSK926, GSK126, PF-06821497, UNC1999, CPI-1205, MC-3629, CPI-0209, SHR-2554, CPI-169, EBI-2554, GSK-343, HM-97594, IONISEZH-22.5Rx, JQEZ-5, MS-1943, ORS-1, TBL-0404, KM-301, GSK2816126 o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o ii. un inibitore di PRMT, come un inibitore di PRMT5 o un inibitore di PRMT1, preferibilmente detto inibitore di PRMT5 ? selezionato dal gruppo costituito da: GSK3326595, JNJ-64619178, PF-06939999, PRT-543, PRT-811, JBI-778, GSK-3235025 o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, preferibilmente detto inibitore di PRMT1 ? GSK3368715 o un suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o iii. un inibitore di DOT1L, preferibilmente Pinometostat (o EPZ-5676) o un suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o iv. APTA-16 o un suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile, e/o v. un inibitore di istone-lisina N-metiltransferasi (EHMT2 o G9a), preferibilmente selezionato dal gruppo costituito da: BIX-01294, un analogo di BIX-01294 (o TM-2115) o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o vi. un doppio inibitore contro G9a e DNMT, preferibilmente CM-272 o un suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o vii. un inibitore dell'interazione menin-MLL1 (o KMT2A), preferibilmente MI-3454 e/o KO-539, o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, viii. un inibitore di SETD2, preferibilmente EPZ-040414 o un suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o - il doppio inibitore di HDAC/LSD1 ? selezionato dal gruppo costituito da: le molecole descritte in WO 2017/195216; D. Sivanandhan et al., ?Abstract 3509: Novel dual inhibitors of LSD1-HDAC for treatment of cancer?, Cancer Research, 2015, 75, 15, doi: 10.1158/1538-7445.AM2015-3509; D. Sivanandhan et al., ?Abstract 5860: Novel, first-in-class dual inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and histone deacetylatse 1 (HDAC) for treatment of cancer?, Cancer Research, 2018, 78, 13, doi: 10.1158/1538-7445.AM2018-5860; D. Sivanandhan et al., ?Abstract 1382: Novel dual inhibitors of LSD1-HDAC6/8 for treatment of cancer?, Cancer Research, 2018, 78, 13, doi: 10.1158/1538-7445.AM2018-1382; Kalin JH, Wu M, Gomez AV, et al.; ?Targeting the CoREST complex with dual histone deacetylase and demethylase inhibitors.?; Nat. Commun. 2018;9(1):53. doi:10.1038/s41467-017-02242-4, che sono tutti qui incorporati per riferimento o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni, e/o - l'inibitore di BET ? selezionato dal gruppo costituito da: I-BET762 (o molibresib), CPI-0610, OTX015, RVX-280 (o apabetalone), ODM-207, PLX-2853, ZEN-3694, ABBV-744, AZD-5153, BI-894999, JQ-1 BOS-475, CC-90010, CC-95775, Mivebresib, BPI-23314, SYHA-1801, ARV-771, CK-103, dBET-1, GSK-3358699, MA-2014, MS-417, NEO-2734, NHWD-870, NUE-7770, OHM-581, PLX-51107, QCA-570, RVX-297, SF-2523, SF-2535, SRX-3177, SRX-3262, ZBC-260, DCBD-005, KM-601, MZ-1, SBX-1301, SRX-3225, ZL-0580, NUE-19796, NUE-20798, o un loro sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile e/o loro combinazioni.
  5. 5. Combinazione per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di infezione virale, comprendente a) la molecola, o il suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile, o loro combinazioni come rivendicato in una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4; e b) uno o pi? altri agenti terapeutici, preferibilmente selezionati dal gruppo costituito da: farmaci antivirali, inibitori della citidina-deamminasi, acido retinoico, acido lipoico, agenti anticoagulanti, vitamina D, antibiotici, corticosteroidi, curcumina, procaina, idralazina, epigallocatechina gallato, RG-108, 3-nitro-2-(3-nitrofenil)flavone, disulfiram, isoossazolina, pi? preferibilmente selezionati dal gruppo costituito da Interferone, Ribavirina, Lopinavir/Ritonavir, clorochina, idrossiclorochina, eparina, cedazuridina, preferibilmente detta combinazione ? una combinazione di azacitidina e cedazuridina o di decitabina e cedazuridina.
  6. 6. Composizione farmaceutica per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di infezione virale, comprendente: a) la molecola, o il suo sale o solvato farmaceuticamente accettabile o loro combinazioni come definito in qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4 o la combinazione come definita nella rivendicazione 5; e b) almeno un eccipiente e/o vettore farmaceuticamente accettabile.
  7. 7. Molecola, o suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile o loro combinazioni per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 o combinazione per uso secondo la rivendicazione 5 o composizione farmaceutica per uso secondo la rivendicazione 6, in cui l'infezione virale ? un'infezione del tratto respiratorio.
  8. 8. Molecola, o suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile o loro combinazioni per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 o combinazione per uso secondo la rivendicazione 5 o composizione farmaceutica per uso secondo la rivendicazione 6, in cui l'infezione virale ? causata da e/o associata a virus a RNA, preferibilmente Coronaviridae.
  9. 9. Molecola, o suo sale, idrato o solvato farmaceuticamente accettabile o loro combinazioni per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 o composizione farmaceutica per uso secondo la rivendicazione 6 o combinazione per uso secondo la rivendicazione 5 in cui l'infezione virale ? un'infezione da coronavirus, preferibilmente selezionata dal gruppo costituito da: COVID-19, SARS, MERS, qualsiasi altra sindrome respiratoria acuta grave causata da Coronavirus, infezioni del tratto respiratorio superiore, polmonite, pneumonite, bronchite.
  10. 10. Metodo in vitro o ex vivo per eseguire uno screening di un trattamento terapeutico, preferibilmente della molecola o delle sue combinazioni come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, di un'infezione virale, preferibilmente un'infezione da Coronaviridae, comprendente i seguenti passaggi: a) trattare cellule murine L929, cellule murine LLC1, cellule murine RAW264.7, cellule umane VERO, cellule umane CALU, macrofagi primari murini, e/o macrofagi primari umani con detto trattamento terapeutico; b) aggiungere a dette cellule un virus, preferibilmente un coronavirus, preferibilmente MHV per cellule murine, SARS-CoV per cellule umane, SARS-CoV-2 per cellule umane e/o MERS per cellule umane; c) determinare titolo virale, RNA virale e/o proteine virali nel surnatante di dette cellule; d) confrontare con un controllo e/o riferimento appropriato, in cui il trattamento terapeutico ? identificato quando il titolo virale, l'RNA virale e/o le proteine virali sono diminuiti o eradicati rispetto al controllo/riferimento.
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