ES2588755T3

ES2588755T3 - Composiciones y procedimientos para tratar infecciones por retrovirus

Info

Publication number: ES2588755T3
Application number: ES09759740.5T
Authority: ES
Inventors: Monsef Benkirane; Robinson Triboulet; Christine Chable-Bessia; Yamina Bennasser; Daniel Latreille; Oussama Meziane; Pascal Barbry; Bernard Mari; Jacques Reynes
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2008-11-26
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2016-11-04
Anticipated expiration: 2029-11-26
Also published as: WO2010060967A3; WO2010060967A2; US9439923B2; CA2744355C; EP2191834A1; US20120053223A1; EP2355832A2; JP2012509865A; EP2355832B1; CA2744355A1

Abstract

Al menos un ácido nucleico (I) que comprende o que consiste en, o (Ii) que codifica un ácido nucleico que comprende o consiste en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 1) IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1, IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 2, IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 3 e IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 4 y 2) una secuencia derivada de IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1 a 4 por sustitución, deleción o inserción de al menos un nucleótido, siempre que un ácido nucleico que consiste en la secuencia derivada de IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1 a 4 sea responsable de inducir la expresión del VIH-1 en las células latentes infectadas por VIH- 1, para su uso en el tratamiento de pacientes asintomáticos infectados por un retrovirus.

Description

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DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para tratar infecciones por retrovirus

5 [0001] La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para el tratamiento de infecciones por retrovirus, en individuos sintomáticos en los que el retrovirus está en un estado latente.

[0002] Los retrovirus, como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), son capaces de permanecer en las células infectadas en estado latente. Los mecanismos que son responsables de la latencia y la reactivación del virus

10 son poco conocidos. Parece que la replicación del virus en las células de linfocitos T CD4 + depende en parte del ciclo celular de la célula huésped. La entrada del VIH en los linfocitos CD4+ activados generalmente conduce a una infección productiva, mientras que generalmente no hay producción infecciosa después de la entrada en linfocitos CD4+ no activados.

15 [0003] Algunos pacientes referidos como controladores de élite del VIH-1 son individuos infectados que son capaces de mantener su virus a niveles indetectables durante muchos años en ausencia de tratamiento (Goudsmit et al. (2002) AIDS 16:791-793). Hoy en día esta capacidad no tiene ninguna explicación clara y muchos han expresado su preocupación con respecto a la capacidad de estas personas para gestionar el control a largo plazo de la infección.

20 [0004] Además, la latencia del VIH es un problema importante para las terapias antivirales actuales del VIH. De hecho, estas terapias no erradican la infección debido al depósito latente y resistente de los virus. Por ejemplo, la Terapia antirretroviral altamente activa (HAART, por sus siglas en inglés), en la que a los pacientes infectados del VIH-1 se les administra un cóctel de fármacos antirretrovirales, no logra erradicar definitivamente la infección del

25 VIH-1 debido a estos depósitos virales latentes refractarios del HAART (Marcello (2006) Retrovirology 3:7). En consecuencia, en estos pacientes siempre está presente el riesgo de que la infección se reactive, por ejemplo, después de una disminución de la eficacia de los fármacos administrados.

[0005] En consecuencia, es necesario erradicar completamente el depósito latente de retrovirus en estos 30 pacientes.

[0006] Una de las estrategias terapéuticas que se ha sugerido para lograr este objetivo consiste en la reactivación de los retrovirus latentes en las células infectadas, induciendo así la producción de partículas retrovirales y restaurando la sensibilidad a los medicamentos. Dicha estrategia, podría llevar a una recuperación

35 completa de los pacientes infectados.

[0007] Se conocen algunas moléculas que promueven la reactivación de los retrovirus. Se ha demostrado, por ejemplo, que la prostatina era capaz de regular la expresión del VIH en los linfocitos T CD8+ de un paciente infectado sometido a la terapia HAART. Se propuso la prostatina por ser un buen candidato para la eliminación del 40 repertorio viral persistente. Sin embargo, los resultados obtenidos con la prostratina son algo heterogéneos y siguen siendo necesarias otras moléculas (Kulkosky (2001) Blood 98:3006-3015, Korin et al. (2002) Virology 76:8118-8123).

[0008] Los microARN (miARN) son una clase recién descubierta de ARN generalmente con una longitud de 20 a 25 nucleótidos. Están involucrados en la regulación de la expresión génica a nivel pos-transcripcional 45 degradando o bloqueando la traducción del ARN mensajero específico, ARNm. La vía del miARN, desde la síntesis a la acción, ha sido bien descrita en términos de componentes de la vía, que comprenden en particular, entre otras, las proteínas conocidas como Drosha, DGCR8, Dicer, RCK/p54, LSm-1, GW182 y XRN1 (Bartel (2004) Cell 116:281-297). Recientemente se ha demostrado que los inhibidores de 2'-O-metil-oligorribonucleótido antisentido de cinco miARN, a saber, miR-28, miR-125b, miR-150, miR-223 y miR-382, podrían inducir la producción de partículas

50 infecciosas VIH-1 a partir de células CD4 + T obtenidas de individuos infectados por el VIH-1 en HAART (Huang et al. (2007) Nat. Med. 13:1241-1247). Así pues, se propone este tipo de inhibidores anti-miARN para revertir la latencia del VIH-1 in vivo. Sin embargo, se plantearon preocupaciones con respecto a la potencial toxicidad de estos inhibidores (Zhang (2008) Int J Biochem Cell).

55 [0009] En consecuencia, uno de los objetos de la presente invención es proporcionar compuestos y

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procedimientos alternativos útiles para la reactivación de depósitos retrovirales latentes en individuos infectados.

Resumen de la invención

5 [0010] En este sentido, la presente invención surge de la constatación inesperada por parte de los inventores de que al entrar en contacto las células latentes infectadas por el VIH-1 con determinados miRNA, a saber, miR-34a, miR-122, miR-206 y miR-210 (representadas respectivamente por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1 a 4), inducía la expresión del VIH-1 por parte de dichas células. También inesperadamente, los mismos inventores han encontrado que la inhibición de la expresión de los componentes de la vía de miARN, como Drosha, DGCR8, Dicer,

10 RCK/p54, LSM-1, GW182 y XRN1, inducía la expresión del VIH-1 en las células latentes infectadas.

[0011] Así pues, la presente invención se refiere a al menos un ácido nucleico

(I) que comprende o que consiste en, o

15 (Ii) que codifica un ácido nucleico que comprende o que consiste en,

una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en:

20 1) IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1, IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 2, IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 3 e IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 4 y

2) una secuencia derivada de IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1 a 4 por sustitución, deleción o inserción de al menos un nucleótido, siempre que un ácido nucleico que consiste en la secuencia derivada de IDENTIFICADOR DE 25 SECUENCIA N.º: 1 a 4 sea responsable de inducir la expresión del VIH-1 en las células latentes infectadas por VIH1,

para su uso en el tratamiento de pacientes asintomáticos infectados por un retrovirus.

30 [0012] La presente solicitud también da a conocer al menos un compuesto inhibidor de la actividad de al menos un componente de la vía de miARN para su uso en el tratamiento de infecciones por retrovirus.

[0013] La presente solicitud también describe un procedimiento para el tratamiento de infecciones por retrovirus en un individuo, comprendiendo la administración a dicho individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de al 35 menos un ácido nucleico tal y como se ha definido anteriormente o de al menos un compuesto tal y como se ha definido anteriormente.

[0014] En una realización del ácido nucleico definido anteriormente, el ácido nucleico se utiliza en combinación con al menos otro compuesto antirretroviral.

40 [0015] La presente solicitud también describe el uso in vitro de un ácido nucleico tal y como se definió anteriormente o de un compuesto inhibidor de un componente de la vía miARN seleccionado del grupo que consiste en DGCR8, RCK/p54, LSm-1, GW182 y XRN1, para la producción de partículas retrovirales a partir de células que albergan un vector retroviral.

45 [0016] La presente solicitud también describe un procedimiento in vitro para la producción de partículas retrovirales, que comprende:

-Poner en contacto células que alberguen un vector retroviral con un ácido nucleico tal y como se definió 50 anteriormente o de un compuesto inhibidor de un componente de la vía miARN seleccionado del grupo que consiste en DGCR8, RCK/p54, LSm-1, GW182 y XRN1;

-Dejar que las células expresen el vector retroviral;

55 conforme a lo cual las partículas retrovirales se producen a partir de las células.

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[0017] Preferentemente, el uso in vitro y el procedimiento in vitro definidos anteriormente no implican ninguna etapa de cultivo de las células con las células T.

5 [0018] Los inventores también han identificado 51 genes que son el objetivo de miR-34a, miR-206, miR-210 y miR122 y que inhiben la expresión de ARNip o shRNA activa la replicación viral del VIH-1.

[0019] La presente solicitud, por lo tanto, también describe un modulador de la actividad de un gen seleccionado del grupo que consiste en DGUOK, MIR16, PPP1R11, ARHGAP1, TEDDM1, QDPR, C14orf32, C1orf19, ATP1B3,

10 FLJ10241, ANP32E, TAGLN2, ARF3, PTMA, PPIB, PRCP, PTPRK, OBSL1, SLC44A1, PPIAL4, SERP1, EBPL, CBX6, ZBED3, NP, PRSS21, PPIA, C5orf13, E2F2, CACYBP, TROAP, APOBEC3A, C7orf44, ORC6L, WNT10B, VIM, CDC6, MCRS1, NAG18, PPP1CC, DULLARD, ASF1 B, PLP2, MTHFD2, PIGS, KIF2C, NRM, PEG10, C22orf9, COL4A2 y SNX26, para su uso como un medicamento, en particular, para el tratamiento de infecciones por retrovirus.

15 [0020] La presente solicitud también describe un procedimiento para el tratamiento de infecciones por retrovirus en un individuo, y comprende la administración a dicho individuo de al menos un modulador de la actividad de un gen seleccionado del grupo que consiste en DGUOK, MIR16, PPP1 R11, ARHGAP1, TEDDM1, QDPR, C14orf32, C1orf19, ATP1B3, FLJ10241, ANP32E, TAGLN2, ARF3, PTMA, PPIB, PRCP, PTPRK, OBSL1, SLC44A1, PPIAL4,

20 SERP1, EBPL, CBX6, ZBED3, NP, PRSS21, PPIA, C5orf13, E2F2, CACYBP, TROAP, APOBEC3A, C7orf44, ORC6L, WNT10B, VIM, CDC6, MCRS1, NAG18, PPP1 CC, DULLARD, ASF1 B, PLP2, MTHFD2, PIGS, KIF2C, NRM, PEG10, C22orf9, COL4A2 y SNX26.

[0021] En una descripción del modulador definido anteriormente para su uso como un medicamento o

25 procedimiento de tratamiento que implique el modulador, se emplean moduladores de la expresión de DGUOK, MIR16, PPP1 R11, ARHGAP1, TEDDM1, QDPR, C14orf32, C1orf19, ATP1B3, FLJ10241, ANP32E, TAGLN2, ARF3, PTMA, PPIB, PRCP, PTPRK, OBSL1, SLC44A1, PPIAL4, SERP1, EBPL, CBX6, ZBED3, NP, PRSS21, PPIA, C5orf13, E2F2, CACYBP, TROAP, APOBEC3A, C7orf44, ORC6L, WNT10B, VIM, CDC6, mcrs1, NAG18, PPP1 CC, DULLARD, ASF1 B, PLP2, MTHFD2, cerdos, KIF2C, MRN, PEG10, C22orf9, COL4A2 y SNX26.

30 [0022] En una descripción del modulador definido anteriormente para su uso como un medicamento o procedimiento de tratamiento que implique el modulador, el modulador se usa en combinación con al menos otro compuesto antirretroviral.

35 Descripción detallada de la invención

Ácido nucleico

[0023] Tal y como se pretende en la presente memoria, el ácido nucleico utilizado en la invención puede ser de

40 cualquier tipo y, en particular, puede ser natural o sintético, ADN o ARN, monocatenario o bicatenario. En particular, cuando el ácido nucleico es sintético puede comprender modificaciones no naturales de las bases o bonos, concretamente para aumentar la resistencia a la degradación del ácido nucleico. Cuando el ácido nucleico es ARN, las modificaciones abarcan concretamente la limitación de sus extremos o la modificación de la posición del esqueleto de ribosa 2' con el fin de reducir la reactividad del radical hidroxilo, por ejemplo, suprimiendo el radical

45 hidroxilo (para producir un 2'-desoxirribosa o un 2'-desoxirribosa-2'-fluororribosa), o sustituyendo el radical hidroxilo por un grupo alquilo, como, por ejemplo, un grupo metilo (para producir un 2'-O-metil-ribosa).

[0024] IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1, 2, 3 y 4, respectivamente, representan las secuencias de miRNAs miR-34a, miR-122, miR-206 y miR-210. Estos miARN se describen, en particular, en Griffiths-Jones (2004)

50 Nucleic Acids Res 32: D109-D111; Griffiths-Jones et al. (2008) Nucleic Acids Res 36: D154-D158; y en la base de datos disponible en miRBase http://microrna.sanger.ac.uk.

[0025] Cuando el ácido nucleico usado en la invención comprende o consiste en el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1, 2, 3 o 4, o sus secuencias derivadas, el ácido nucleico de la invención está destinado a ejercer

55 directamente su efecto sobre sus dianas celulares. En este caso, el ácido nucleico es preferentemente una molécula

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de ARN.

[0026] Cuando el ácido nucleico usado en la invención codifica un ácido nucleico que comprende o consiste en IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1, 2, 3 o 4, o sus secuencias derivadas, el ácido nucleico de la invención 5 está destinado a expresarse dentro de las células en lasque codifica el ácido nucleico, en particular, una molécula de ARN ejercerá su efecto en sus dianas celulares. En este caso, el ácido nucleico utilizado en la invención es preferentemente una molécula de ADN, y aún más preferentemente una molécula de ADN bicatenaria. Además, como será evidente para un experto en la técnica, el ácido nucleico usado de acuerdo con la invención comprenderá también preferentemente elementos genéticos que aseguren la expresión del ácido nucleico codificado, en particular

10 una secuencia promotora de la polimerasa II o III del ARN.

[0027] Los procedimientos para administrar ácidos nucleicos en células in vitro o in vivo son bien conocidos para un experto en la técnica y se describen en particular en Nguyen et al. (2008) Curr Opin Mol Ther 10: 158-67 y Dykxhoorn et al. (2006) Gene Therapy 13: 541-552, que se incluyen en este documento como referencia.

15 [0028] Preferentemente, cuando el ácido nucleico usado en la invención comprende el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1, 2, 3, o 4, o una secuencia derivada de estos, tiene menos de 1.000 nucleótidos de longitud, y preferentemente menos de 100 nucleótidos de longitud, y aún más preferentemente menos de 50 nucleótidos de longitud.

20 [0029] Preferentemente, la secuencia derivada del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1 a 4 por sustitución, deleción o inserción de al menos un nucleótido presenta al menos un 85%, o más preferentemente al menos un 90%, y aún más preferentemente al menos un 95% de identidad con la secuencia de la que se ha derivado. Según el presente documento, el porcentaje de identidad entre dos secuencias se obtiene alineando las dos secuencias a

25 fin de maximizar el número de posiciones de cada secuencia para que los nucleótidos sean idénticas y dividiendo el número de posiciones de cada secuencia por el que los nucleótidos son idénticos por el número de nucleótidos de la secuencia más larga de dichas secuencias.

[0030] Según el presente documento, las "células infectadas por VIH-1 latentes" son células en las que las

30 secuencias de VIH-1 se pueden encontrar integradas en uno de sus cromosomas y no expresan ARN o proteínas codificados por el VIH-1 . Tales células y, en particular, las células multinucleares de sangre periférica o, más concretamente, las células T e, incluso más específicamente, las células T CD4 + pueden obtenerse a partir de los pacientes asintomáticos infectados por el VIH-1, como pacientes HAART o pacientes tratados con el controlador de élite de VIH-1. Puede determinarse si las secuencias de VIH-1 se pueden encontrar integradas en uno de los

35 cromosomas de dichas células por numerosos procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica, tales como los experimentos de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) realizados con cebadores específicos de VIH-1. Puede determinarse si dichas células son latentes mediante la medición de la expresión de un ARN o proteína del VIH-1 codificados (por ejemplo, el antígeno p24), por dichas células, en particular utilizando la Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa (QRT-PCR) cuantitativa o mediante procedimientos

40 inmunológicos, tales como los Ensayos de Inmunoabsorción Ligados a Enzimas (ELISA), tal y como se describe en los Ejemplos. Las células latentes expresan esencialmente que no hay ARN ni proteínas de VIH-1-codificados, lo cual puede definirse como un nivel de expresión indetectable (por ejemplo, inferior a 40 copias de ARN de VIH-1 por ml utilizando RT-PCR cuantitativa), o puede no ser significativamente diferente del resultado de las células de control, por ejemplo las células no infectadas por VIH-1.

45 [0031] Según el presente documento, determinar si un ácido nucleico es responsable de inducir la expresión de VIH-1 en las células latentes infectadas por VIH-1 puede determinarse comparando el nivel de expresión de una proteína codificada por VIH-1, como el antígeno de p24, en células que hayan entrado en contacto con un ácido nucleico de acuerdo con la invención y en células de control idénticas que no hayan entrado en contacto con el ácido

50 nucleico de la invención. Si las células que han entrado en contacto presentan un nivel significativamente alterado de la expresión de la proteína codificada por el VIH-1 con respecto a las células de control, el ácido nucleico será responsable de inducir la expresión del VIH-1 en las células infectadas por VIH-1 latentes.

[0032] En una realización preferible de la invención, una molécula de ARN formada por el IDENTIFICADOR DE 55 SECUENCIA N.º: 1, una molécula de ARN formada por un IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 2, una molécula de ARN formada por un IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 3 y una molécula de ARN formada por un IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º : 4 se administran a un paciente que los necesita a la vez o están todos presentes en un mismo medicamento o en una composición farmacéutica.

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5 Compuesto

[0033] Según el presente documento, un "componente de la vía de miARN" se refiere a cualquiera de las proteínas celulares implicadas en la síntesis, la maduración y la acción de los microRNA (miARN): Los componentes de la vía miARN son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen en particular en Bartel (2004) Cell 116: 28110 97 y Beckham y Parker (2008) Cell Host Microbe 3: 206-12, que se incluyen en este documento como referencia. En particular, los componentes de la vía miARN se seleccionan a partir de Drosha, DGCR8 (implicadas en la maduración de los pre-miARN en su síntesis por ARN polimerasas II o III), Dicer (implicada en la maduración de los pre-miARN a miARN), RCK/p54, LSM-1, GW182 y XRN1 (implicadas en la degradación de los ARNm meta). Más preferentemente, los componentes de la vía miARN se seleccionan del grupo que consiste en DGCR8, RCK/p54,

15 LSm-1, GW182 y XRN1.

[0034] Más preferentemente, los componentes de la vía miARN se seleccionan del grupo que consiste en DGCR8, RCK/p54, LSm-1, GW182 y XRN1.

20 [0035] A título de ejemplo, Drosha está representada por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 6, DGCR8 está representada por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 8, Dicer está representada por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 10, RCK/p54 está representada por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 12, LSM-1 es representada por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 14, GW182 está representada por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 16, y XRN1 está representada por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 18.

25 [0036] Según el presente documento, el compuesto puede ser de cualquier tipo. En particular, el compuesto puede tener la capacidad de interferir directamente con la actividad de un componente de la vía miARN. El compuesto también puede interferir con la expresión del componente de la vía miARN a nivel de transcripción o de traducción. Cuando el compuesto interfiere con la expresión del componente de la vía miARN a nivel de traducción, puede

30 tratarse en particular un ácido efector nucleico dirigido a un ARNm que codifique un componente de la vía miARN o de un ácido nucleico que codifique dicho ácido nucleico efector, como, por ejemplo un vector viral. En particular, el ácido nucleico efector puede ser un oligonucleótido de ADN o ARN antisentido o un ARN interferente pequeño (ARNip).

35 [0037] El ácido nucleico efector puede comprender modificaciones no naturales de las bases o uniones, en particular para aumentar su resistencia a la degradación. Cuando el ácido nucleico es ARN, las modificaciones abarcan en particular la limitación de sus extremos o la modificación de la posición del esqueleto de ribosa 2 ' con el fin de reducir la reactividad del radical hidroxilo, por ejemplo suprimiendo el radical hidroxilo (para producir un 2'desoxirribosa o un 2'-desoxirribosa-2 'fluororribosa), o sustituyendo el radical hidroxilo con un grupo alquilo, tal como

40 un grupo metilo (para producir un 2'-o-metil-ribosa).

[0038] Preferentemente, los ácidos nucleicos efectores son de menos de 50 nucleótidos de longitud, más preferentemente de menos de 40 nucleótidos de longitud, y aún más preferentemente de menos de 30 nucleótidos de longitud. Preferentemente también, los ácidos nucleicos efectores son al menos de 10 nucleótidos de longitud,

45 más preferentemente de al menos 15 nucleótidos de longitud, y aún más preferentemente de al menos 20 nucleótidos de largo.

[0039] Los ARNip son preferentemente bicatenarios.

50 [0040] Según el presente documento, el término "ARNip" abarca "ARN de horquilla pequeña (shARN)". Los shARN se forman de una molécula de ARN monocatenaria de auto-hibridación responsable de producir un ARNip bicatenario al procesar la parte unicatenaria del shARN que une las partes hibridadas de la shARN. Como es bien sabido por un experto en la técnica, los shARN transcritos a partir de un ácido nucleico administrado a una célula diana son los precursores de elección para los ARNip en los que la producción de los ARNip va a tener lugar dentro

55 de una célula. Como resultará evidente para un experto en la técnica, la longitud preferida dada anteriormente para los ácidos nucleicos efectores se aplica a los shARN considerados hibridados en su formación y debe duplicarse si los shARN se consideran en su formación no hibridada.

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[0041] Un experto en la técnica podrá idear un ARNip diseñado para dirigirse a un ARNm específico, en el que se

5 conoce la secuencia del ARNm, ya sea parcialmente o en su totalidad y para administrar los ARNip, o a ácidos nucleicos que codifiquen los ARNip y los shARN en células in vitro o in vivo, tal y como se explica más concretamente en Dykxhoorn et al. (op. cit.) and Nguyen et al (op. cit.)

[0042] A título de ejemplo, los ARNip dirigidos a Drosha, DGCR8, Dicer, RCK/p54, LSM-1, GW182 y XRN1 están 10 representados, respectivamente, por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 19, 20, 21, 22, 23, 24 y 25.

Modulador

[0043] Según el presente documento, el modulador puede ser de cualquier tipo. Además, como será evidente para

15 un experto en la técnica, el modulador puede activar o inhibir (es decir, interferir con) la actividad de un gen seleccionado del grupo que consiste en DGUOK, MIR16, PPP1R11, ARHGAP1, TEDDM1, QDPR, C14orf32, C1orf19, ATP1B3, FLJ10241, ANP32E, TAGLN2, ARF3, PTMA, PPIB, PRCP, PTPRK, OBSL1, SLC44A1, PPIAL4, SERP1, EBPL, CBX6, ZBED3, NP, PRSS21, PPIA, C5orf13, E2F2, CACYBP, TROAP, APOBEC3A, C7orf44, ORC6L, WNT10B, VIM, CDC6, MCRS1, NAG18, PPP1 CC, DULLARD, ASF1 B, PLP2, MTHFD2, PIGS, KIF2C,

20 NRM, PEG10, C22orf9, COL4A2 y SNX26.

[0044] La ventaja es que un modulador de la inhibición de la actividad de uno de los genes anteriores sirve para activar la replicación viral de un retrovirus, permitiendo de este modo erradicar un depósito de retrovirus latente en un individuo.

25 [0045] Otra ventaja es que un modulador que active la actividad de uno de los genes anteriores sirve para inhibir la replicación viral de un retrovirus.

[0046] En particular, el modulador puede tener la capacidad de activar o inhibir directamente la actividad de los

30 genes seleccionados del grupo que consiste en DGUOK, MIR16, PPP1 R11, ARHGAP1, TEDDM1, QDPR, C14orf32, C1orf19, ATP1B3, FLJ10241, ANP32E, TAGLN2, ARF3, PTMA, PPIB, PRCP, PTPRK, OBSL1, SLC44A1, PPIAL4, SERP1, EBPL, CBX6, ZBED3, NP, PRSS21, PPIA, C5orf13, E2F2, CACYBP, TROAP, APOBEC3A, C7orf44, ORC6L, WNT10B, VIM, CDC6, MCRS1, NAG18, PPP1 CC, DULLARD, ASF1 B, PLP2, MTHFD2, PIGS, KIF2C, NRM, PEG10, C22orf9, COL4A2 y SNX26. El modulador también puede activar o inhibir la expresión de

35 estos genes a nivel de transcripción o de traducción.

[0047] Cuando el modulador interfiere con la expresión de los genes seleccionados del grupo que consiste en DGUOK, MIR16, PPP1 R11, ARHGAP1, TEDDM1, QDPR, C14orf32, C1orf19, ATP1B3, FLJ10241, ANP32E, TAGLN2, ARF3, PTMA, PPIB, PRCP, PTPRK, OBSL1, SLC44A1, PPIAL4, SERP1, EBPL, CBX6, ZBED3, NP, 40 PRSS21, PPIA, C5orf13, E2F2, CACYBP, TROAP, APOBEC3A, C7orf44, ORC6L, WNT10B, VIM, CDC6, MCRS1, NAG18, PPP1 CC, DULLARD, ASF1 B, PLP2, MTHFD2, PIGS, KIF2C, NRM, PEG10, C22orf9, COL4A2 y SNX26 a nivel de traducción, puede tratarse especialmente de un ácido nucleico efector dirigido a un ARNm que codifique uno de estos genes o puede tratarse de un ácido nucleico que codifique dicho ácido nucleico efector, como un vector viral. En particular, el ácido nucleico efector puede ser un oligonucleótido de ADN o ARN antisentido o un ARN

45 interferente pequeño (ARNip).

[0048] El ácido nucleico efector puede comprender modificaciones no naturales de las bases o uniones, en particular para aumentar su resistencia a la degradación. Cuando el ácido nucleico es ARN, las modificaciones abarcan en particular la limitación de sus extremos o la modificación de la posición del esqueleto de ribosa 2 ' con el

50 fin de reducir la reactividad del radical hidroxilo, por ejemplo suprimiendo el radical hidroxilo (para producir un 2'desoxirribosa o un 2'-desoxirribosa-2 'fluororribosa), o sustituyendo el radical hidroxilo con un grupo alquilo, tal como un grupo metilo (para producir un 2'-o-metil-ribosa).

[0049] Preferentemente, los ácidos nucleicos efectores son de menos de 50 nucleótidos de longitud, más 55 preferentemente de menos de 40 nucleótidos de longitud, y aún más preferentemente de menos de 30 nucleótidos

de longitud. Preferentemente también, los ácidos nucleicos efectores son al menos de 10 nucleótidos de longitud, más preferentemente de al menos 15 nucleótidos de longitud, y aún más preferentemente de al menos 20 nucleótidos de largo.

5 [0050] Los ARNip son preferentemente bicatenarios.

[0051] Según el presente documento, el término "ARNip" abarca "ARN de horquilla pequeña (shARN)". Los shARN se forman de una molécula de ARN monocatenaria de auto-hibridación responsable de producir un ARNip bicatenario al procesar la parte unicatenaria del shARN que une las partes hibridadas de la shARN. Como es bien

10 sabido por un experto en la técnica, los shARN transcritos a partir de un ácido nucleico administrado a una célula diana son los precursores de elección para los ARNip en los que la producción de los ARNip va a tener lugar dentro de una célula. Como resultará evidente para un experto en la técnica, la longitud preferida dada anteriormente para los ácidos nucleicos efectores se aplica a los shARN considerados hibridados en su formación y debe duplicarse si los shARN se consideran en su formación no hibridada.

15 [0052] Un experto en la técnica podrá idear un ARNip diseñado para dirigirse a un ARNm específico, en el que se conoce la secuencia del ARNm, ya sea parcialmente o en su totalidad y para administrar los ARNip, o a ácidos nucleicos que codifiquen los ARNip y los shARN en células in vitro o in vivo, tal y como se explica más concretamente en Dykxhoorn et al. (op. cit.) and Nguyen et al (op. cit.)

20 [0053] Cuando el modulador activa la actividad de los genes seleccionados del grupo que consiste en DGUOK, MIR16, PPP1 R11, ARHGAP1, TEDDM1, QDPR, C14orf32, C1orf19, ATP1B3, FLJ10241, ANP32E, TAGLN2, ARF3, PTMA, PPIB, PRCP, PTPRK, OBSL1, SLC44A1, PPIAL4, SERP1, EBPL, CBX6, ZBED3, NP, PRSS21, PPIA, C5orf13, E2F2, CACYBP, TROAP, APOBEC3A, C7orf44, ORC6L, WNT10B, VIM, CDC6, MCRS1, NAG18, PPP1

25 CC, DULLARD, ASF1 B, PLP2, MTHFD2, PIGS, KIF2C, NRM, PEG10, C22orf9, COL4A2 y SNX26 puede, en particular, tratarse de un ácido nucleico que exprese uno de estos genes, como un vector de expresión, y más concretamente un vector viral que albergue una secuencia de uno de estos genes.

[0054] Los genes anteriores son bien conocidos para un experto en la técnica y están representados por los

30 números de acceso NCBI o por los IDENTIFICADORES DE SECUENCIA N.º enumerados en la siguiente tabla. Los números de acceso NCBI y los números de IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º se refieren a las secuencias de los ARNm o a las secuencias codificantes (CDS) de los genes enumerados.

Símbolo del gen: Nombre del gen Número de acceso (NCBI) IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º:

DGUOK: desoxiguanosina cinasa NM_080916 26

MIR16: proteína que interactúa en las membranas de RGS16 AY463154 27

PPP1R11: proteína fosfatasa 1, reguladora (inhibidor) subunidad 11 NM_021959 28

ARHGAP1: Rho GTPasa de la proteína activadora 1 NM_004308 29

TEDDM1: proteína transmembrana 1, epidídimo NM_172000 30

QDPR: reductasa dihidropterina quinoide NM_000320 31

C14orf32: proteína cinasa 1 activada por mitógenos, de tipo proteína de interacción 1 NM_144578 32

C1orf19: homólogo de endonucleasa 15 de empalme de tARN de S. cerevisiae NM_052965 33

ATP1B3: polipéptido beta 3, ATPasa, transportador de Na +/K + NM_001679 34

FLJ10241: De tipo ATP5S NM_018035 35

ANP32E: fosfoproteína nuclear ácida (rica en leucina), familia 32, miembro E NM_030920 36

TAGLN2: transgelina 2 NM_003564 37

ARF3: factor de ADP-ribosilación 3 NM_001659 38

PTMA: protimosina alfa NM_002823 39

PPIB: peptidilprolil isomerasa B (ciclofilina B) NM_000942 40

PRCP: prolilcarboxipeptidasa (angiotensinasa C) NM_005040 41

imagen7

PTPRK: proteína tirosina fosfatasa, de tipo receptor, K NM_002844 42

OBSL1: tipo obscurin 1 NM_015311 43

SLC44A1: familia soluto portadora 44, miembro 1 NM_080546 44

PPIAL4: de tipo peptidilprolil isomerasa A (ciclofilina A) 4A NM_178230 45

SERP1: proteína del retículo endoplasmático asociado al estrés 1 NM_014445 46

EBPL: de tipo proteína de unión al emopamil NM_032565 47

CBX6: homóloga cromobox 6 NM_014292 48

ZBED3: dedo de zinc, que contiene tipo BED 3 NM_032367 49

NP: nucleósido fosforilasa NM_000270 50

PRSS21: proteasa, serina, 21 (testisina) NM_144956 51

PPIA: isomerasa A peptidilprolil (ciclofilina A) NM_021130 52

C5orf13: marco abierto de lectura 13 del cromosoma 5 NM_004772 53

E2F2: factor 2 de transcripción de E2F NM_004091 54

CACYBP: proteina de unión a la calcidina NM_014412 55

TROAP: proteína asociada a la trofinina (tastina) NM_005480 56

APOBEC3A: apolipoproteína B. enzima de edición de ARNm, tipo polipéptido catalítico 3A NM_145699 57

C7orf44: marco abierto de lectura 44 del cromosoma 7 NM_018224 58

ORC6L: complejo de reconocimiento de origen, tipo subunidad 6 (levadura) NM_014321 59

WNT10B: familia de integración sin alas MMTV, miembro 10B NM_003394 60

VIM: vimentina EF445046 61

CDC6: homologo de S. cerevisiae, ciclo de división celular 6 NM_001254 62

MCRS1: proteína microesférula 1 NM_006337 63

NAG18
NAG18: AF210651 64

PPP1CC: proteína fosfatasa 1, subunidad catalítica, isoforma gamma NM_002710 65

DULLARD: homólogo de Xenopus laevis dullard NM_015343 66

ASF1B: homólogo B de S. cerevisiae ASF1, función antisilenciamiento 1 NM_018154 67

PLP2: proteína proteolípida 2 (enriquecida con epitelio colónico) NM_002668 68

MTHFD2: deshidrogenasa metilenetetrahidrofolato (dependiente de NADP+) 2, ciclohidrolasa meteniltetrahidrofolato NM_006636 69

PIGS: biosíntesis de anclaje fosfatidilinositol glicano, clase S NM_033198 70

KIF2C: familia cinesinas, miembro 2C NM_006845 71

NRM: nurim (proteína de la membrana nuclear) NM_007243 72

PEG10: expresión parental 10 NM_015068 73

C22orf9: marco abierto de lectura 9 del cromosoma 22 NM_015264 74

COL4A2: colágeno tipo IV, alfa 2 NM_001846 75

SNX26: clasificación de la nexina 26 NM_052948 76

Administración

[0055] Cuando se contempla un uso terapéutico del ácido nucleico utilizado en la invención, el compuesto tal y

5 como se describe en este documento o el medicamento o la composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico de la invención, el compuesto tal y como se describe en el presente documento o el modulador tal y como se describe en el presente documento; el ácido nucleico, el compuesto y el modulador se pueden asociar a uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. En particular, se prefiere que el vehículo farmacéuticamente aceptable sea adecuado para la administración de ácido nucleico en células. Los vehículos adecuados para la

10 administración de ácido nucleico en células son bien conocidos por los expertos en la técnica y, en particular, comprenden lípidos catiónicos o péptidos, nanopartículas y liposomas, opcionalmente ligados a radicales tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, con una especificidad con respecto a un receptor específico de las células diana, en particular, las células T.

15 [0056] Se puede utilizar cualquiera de las rutas locales o sistémicas para administrar el ácido nucleico de la invención, el compuesto tal y como se describe en este documento o el modulador tal y como se describe aquí. Los ejemplos de procedimientos de administración para los ácidos nucleicos se describen en particular en Nguyen et al. (op. cit.) nad Dykxhoorn et al. (op. cit.)

imagen8

5 Compuesto antirretroviral

[0057] Preferentemente, el otro compuesto antirretroviral tal y como se definió anteriormente se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de la transcriptasa inversa y un inhibidor de proteasa, según se describe en Hammer et al. (2008) JAMA 300:555-70.

10 [0058] Los inhibidores de la transcriptasa inversa son una clase bien conocida de compuestos antirretrovirales dirigidos a la enzima que cataliza la transcripción inversa del genoma de ARN del retrovirus al ADN. Los inhibidores de la transcriptasa inversa comprenden:

15 -Los análogos de nucleósidos inhibidores de transcriptasa inversa (NRTI), tales como la zidovudina (es decir, AZT), didanosina, zalcitabina, estavudina, lamivudina, abacavir, emtricitabina y;

-Los análogos de nucleótidos inhibidores de la transcritpasa (INtTI tales como tenofovir y adefovir;

20 -Los inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (NNRTI), como efavirenz, nevirapina, delavirdina, etravirina.

[0059] Los inhibidores de proteasa son una clase bien conocida de compuestos antirretrovirales dirigidos a la enzima retroviral que cataliza la escisión de las poliproteínas expresadas por los genomas retrovirales. Los 25 inhibidores de la proteasa comprenden: saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, atazanavir, fosamprenavir, tipranavir y darunavir.

[0060] Los compuestos antirretrovirales se utilizan a menudo combinados. Por ejemplo, en el contexto de la Terapia antirretroviral altamente activa (HAART), se combinan dos o más compuestos antirretrovirales diferentes,

30 por ejemplo 2 NRTI y un inhibidor de la proteasa o 2 NRTI y un NNTI. La definición de las combinaciones adecuadas para un paciente concreto infectado por retrovirus entran dentro de las competencias habituales de un experto en la técnica.

Infección por retrovirus

35 [0061] Según el presente documento, los términos "retrovirus" o "retroviral" se refieren a los virus de la familia Retroviridae y, más concretamente, del género Lentivirus. Los retrovirus de la invención abarcan el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), en particular el VIH-1 y VIH-2, el virus de inmunodeficiencia en simios (VIS), y el virus de inmunodeficiencia felina (VIF).

40 [0062] Preferentemente, el ácido nucleico utilizado en la invención y el compuesto tal y como se describe aquí, o los medicamentos o las composiciones farmacéuticas que comprenden el ácido nucleico de la invención o el compuesto de la invención están destinados a tratar a pacientes asintomáticos infectados por un retrovirus.

45 [0063] Según el presente documento, la expresión "pacientes asintomáticos infectados por un retrovirus" se refiere a los individuos con células en las que las secuencias retrovirales pueden encontrarse integradas en uno de sus cromosomas, pero que no expresan dichas secuencias retrovirales. Identificar a estos individuos compete a un experto en la técnica e implica, concretamente, la medición de los niveles de ARN de retrovirus o antígenos (por ejemplo, el antígeno p24 del VIH-1) en sangre, suero o plasma, utilizando respectivamente técnicas inmunológicas

50 QRT-PCR, por ejemplo. En particular, los pacientes se dice que son asintomáticos si los productos de expresión de las secuencias retrovirales (es decir, ARN y proteínas) son indetectables.

[0064] Cuando los pacientes asintomáticos se infectan con el VIH-1, pueden estar bajo Terapia antirretroviral altamente activa (HAART) o a tratamiento con controladores de élite del VIH-1. 55

Producción de partículas retrovirales

[0065] Según el presente documento, una "partícula retroviral" o un "vector retroviral" se refieren a partículas o vectores derivados de virus de la familia Retroviridae y, más concretamente, de los género Lentivirus, que abarcan 5 en particular el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), concretamente el VIH-1 y VIH-2, el virus de inmunodeficiencia en simios (VIS), y el virus de inmunodeficiencia felina (VIF).

[0066] La partícula retroviral o el vector tal y como se describen en el presente documento pueden comprender y codificar, respectivamente elementos (como ácidos nucleicos y proteínas) que no son de origen retroviral. Las

10 partículas retrovirales pueden albergar proteínas de envoltura destinadas a atraer células y tejidos específicos, en particular, para administrar los transgenes. Tales partículas y vectores son bien conocidos en la técnica, según se describe en Cronin et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5:387-398 y se denominan por lo general partículas retrovirales pseudotipadas y vectores.

15 [0067] Los procedimientos para producir partículas retrovirales a partir de vectores retrovirales son bien conocidos por los expertos en la técnica y el procedimiento tal y como se describe en el presente documento puede implementarse fácilmente, en particular en vista de los siguientes ejemplos.

[0068] La ventaja es que el uso in vitro y el procedimiento in vitro anteriormente descritos pueden llevarse a cabo 20 sin el cultivo de las células con células T.

Descripción de la secuencia

[0069]

25

Descripción de la secuencia: IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º:

miR-34a: 1

miR-122: 2

miR-206: 3

miR-210: 4

Secuencia de nucleótidos Drosha: 5

Secuencia de aminoácidos Drosha: 6

Secuencia de nucleótidos DGCR8: 7

Secuencia de aminoácidos DGCR8: 8

Secuencia de nucleótidos Dicer: 9

Secuencia de aminoácidos Dicer: 10

Secuencia de nucleótidos RCK/p54: 11

Secuencia de aminoácidos RCK/p54: 12

Secuencia de nucleótidos LSm-1: 13

Secuencia de aminoácidos LSm-1: 14

Secuencia de nucleótidos GW182: 15

Secuencia de aminoácidos GW182: 16

Secuencia de nucleótidos XRN1: 17

Secuencia de aminoácidos XRN1: 18

ARNip dirigidos a Drosha: 19

ARNip dirigidos a DGCR8: 20

ARNip dirigidos a Dicer: 21

ARNip dirigidos a RCK/p54: 22

ARNip dirigidos a LSm-1: 23

ARNip dirigidos a GW182: 24

ARNip dirigidos a XRN1: 25

DGUOK: 26

MIR16: 27

PPP1R11: 28

ARHGAP1: 29

TEDDM1: 30

QDPR: 31

C14orf32: 32

C1orf19: 33

ATP1B3: 34

FLJ10241: 35

ANP32E: 36

TAGLN2: 37

ARF3: 38

PTMA: 39

PPIB: 40

PRCP: 41

PTPRK: 42

OBSL1: 43

SLC44A1: 44

PPIAL4: 45

SERP1: 46

EBPL: 47

CBX6: 48

ZBED3: 49

NP: 50

PRSS21: 51

PPIA: 52

C5orf13: 53

E2F2: 54

CACYBP: 55

TROAP: 56

APOBEC3A: 57

C7orf44: 58

ORC6L: 59

WNT10B: 60

VIM: 61

CDC6: 62

MCRS1: 63

NAG18: 64

PPP1CC: 65

DULLARD: 66

ASF1B: 67

PLP2: 68

MTHFD2: 69

PIGS: 70

KIF2C: 71

NRM: 72

PEG10: 73

C22orf9: 74

COL4A2: 75

SNX26: 76

Breve descripción de los dibujos

imagen9

[0070]

La figura 1 representa el efecto de la caída de RCK/p54, LSM-1, GW182, XRN1, DGCR8, Drosha o proteína de 5 control CDK9 mediante transfección con ARNip específico (eje horizontal), en la producción de virus (eje vertical), en comparación con la producción de virus después de la transfección con ARNip revuelto (sc).

La figura 2 muestra la producción de virus estimada en base a la cantidad de antígeno p24 (ejes verticales) presente en CMSP aisladas de un donante sano en contacto con CMSP aisladas de pacientes HAART tratados con 10 VIH-1 de tres pacientes (1, 2, 3) transfectadas con ARNip revuelto (sc) o con Drosha, DGCR8 o ARNip específico RCK/p54 (eje horizontal).

La figura 3 muestra los efectos de diferentes miARN o de miARN de control (ctrl) (ejes horizontales) en la actividad de LTR (ejes verticales), en células HeLa que contienen un constructo integrado LTR-luciferasa con un vector vacío 15 (barras blancas) o con una Tat que expresa un vector (barras rayadas).

La figura 4 muestra la producción de VIH (eje vertical) en células HeLa transfectadas con ARNip para diferentes miARN, con ARNip revuelto (sc), o con ARNip específico DGCR8 (eje horizontal) e infectadas con VIH-1 que alberga el gen de la luciferasa.

20 La figura 5 muestra la reactivación del VIH (eje vertical), en CMSP aisladas de un primer paciente tratado con controlador de élite de VIH-1 con viremia indetectable, después de la transfección miARN de control (diamantes) o con una mezcla de miARN: miR-34a, miR-206, miR-122 y miR-210 (cuadrados) en función del tiempo (en días, ejes horizontales).

25 La figura 6 muestra la reactivación del VIH (ejes verticales), en CMSP aisladas de un segundo paciente tratado con controlador de élite de VIH-1 con viremia indetectable, después de la transfección con miARN de control (diamantes)

o con una mezcla de miARN: miR-34a, miR-206, miR 122 y miR-210 (cuadrados) en función del tiempo (en días), ejes horizontales.

30 La figura 7 muestra la reactivación del VIH (ejes verticales), en CMSP aisladas de un tercer paciente tratado con controlador de élite de VIH-1 con viremia indetectable, después de la transfección con miARN de control (diamantes)

o con una mezcla de miARN: miR-34a, miR-206, miR 122 y miR-210 (cuadrados) en función del tiempo (en días, ejes horizontales).

35 La figura 8 muestra la reactivación del VIH (ejes verticales), en CMSP aisladas de un cuarto paciente tratado con controlador de élite de VIH-1 con viremia indetectable, después de la transfección con miARN de control (diamantes)

40 La figura 9 muestra la reactivación del VIH (ejes verticales), en CMSP aisladas de un quinto paciente tratado con controlador de élite de VIH-1 con viremia indetectable, después de la transfección con miARN de control (diamantes)

45 La figura 10 muestra la reactivación del VIH (eje vertical), en CMSP aisladas de un primer paciente infectado tratado con HAART con viremia indetectable, después de la transfección miARN de control (diamantes) o con una mezcla de miARN: miR-34a, miR-206, miR-122 y miR-210 (cuadrados) en función del tiempo (en días, ejes horizontales).

50 La figura 11 muestra la reactivación del VIH (eje vertical), en CMSP aisladas de un segundo paciente infectado tratado con HAART con viremia indetectable, después de la transfección miARN de control (diamantes) o con una mezcla de miARN: miR-34a, miR-206, miR-122 y miR-210 (cuadrados) en función del tiempo (en días, ejes horizontales).

55 La figura 12 muestra la reactivación del VIH (eje vertical), en CMSP aisladas de un tercer paciente infectado tratado con HAART con viremia indetectable, después de la transfección miARN de control (diamantes) o con una mezcla de miARN: miR-34a, miR-206, miR-122 y miR-210 (cuadrados) en función del tiempo (en días, ejes horizontales).

imagen10

La figura 13 muestra la reactivación del VIH (eje vertical), en CMSP aisladas de un cuarto paciente infectado tratado 5 con HAART con viremia indetectable, después de la transfección miARN de control (diamantes) o con una mezcla de miARN: miR-34a, miR-206, miR-122 y miR-210 (cuadrados) en función del tiempo (en días, ejes horizontales).

La figura 14 muestra la expresión de miR-210 por RT-PCR (ejes verticales), en CMSP aisladas de controladores de élite de VIH-1 (cuadrados), de pacientes no tratados infectados con VIH-1 (triángulos) y de pacientes infectados con

10 VIH-1 tratados con HAART (triángulos boca abajo).

La figura 15 muestra la expresión de miR-34a por RT-PCR (ejes verticales), en CMSP aisladas del controlador de élite de VIH-1 (cuadrados), de pacientes no tratados infectados con VIH-1 (triángulos) y de pacientes infectados con VIH-1 tratados con HAART (triángulos boca abajo).

15 La figura 16 muestra la expresión de miR-206 por RT-PCR (ejes verticales), en CMSP aisladas de controladores de élite de VIH-1 (cuadrados), de pacientes no tratados infectados con VIH-1 (triángulos) y de pacientes infectados con VIH-1 tratados con HAART (triángulos boca abajo).

20 La figura 17 muestra la expresión de miR-122 por RT-PCR (ejes verticales), en CMSP aisladas de controladores de élite de VIH-1 (cuadrados), de pacientes no tratados infectados con VIH-1 (triángulos) y de pacientes infectados con VIH-1 tratados con HAART (triángulos boca abajo).

EJEMPLOS

25

Ejemplo 1: los efectores miARN son represores de la expresión génica del VIH-1

[0071] Para investigar si los efectores de ARNi regulan la replicación del VIH-1, se analizó la replicación del virus en las células en las que se redujo la expresión de efectores de ARNi usando ARNip específico.

30 PROCEDIMIENTOS

[0072] Se transfectaron células HeLa con ARNip tal y como se indica en Triboulet et al. (2007) Science 315 (5818):1579-82. 48 horas después de la transfección, las células se analizaron para RCK/p54, LSM-1, GW182, 35 XRN1, DGCR8, Drosha y expresión de CDK9 por Western blot, o se infectaron con una sola ronda de un virus infeccioso (VIH-1-VSV-luc) y se midieron los extractos de las células para determinar la actividad de luciferasa 48 horas después de la infección. RCK/p54 restringe la asociación del ARNm del VIH-1 con polisomas. Los extractos citoplasmáticos de células HeLa que se transfectaron con el ARNip indicado y se infectaron con VIH-1-VSVG-luc se probaron en gradiente de glicerol (7% a 47%). Se recogieron las fracciones y su contenido de ARN se monitorizó

40 mediante la medición de la absorbancia (DO) a 254 nm. Se cuantificaron el ARNm del VIH-1 y el ARNm del Hdm2 en todas las fracciones por Q-RT-PCR utilizando oligonucleótidos específicos.

RESULTADOS

45 [0073] Se transfectaron células HeLa con ARNip específico para RCK/p54, LSm-1, GW182 XRN1 o DGCR8. Como controles, se transfectaron las células HeLa con ARNip revuelto (SCR) o CDK9 ARNip específico. El bloqueo de RCK/p54, LSM-1, GW182 y XRN1 mejoró la replicación del virus hasta en 10 veces (Fig. 1). Como se indica anteriormente, (Triboulet et al) el bloqueo de Drosha y DGCR8 (Fig. 1), las dos subunidades del complejo microprocesador, aumentaron la producción de virus, mientras que el bloqueo de CDK9, subunidad del complejo

50 pTEFb que se sabe que es necesario para la expresión génica viral, lo redujo (Fig. 1). Curiosamente, el análisis de la distribución del ARNm citoplasmático de VIH-1 en gradiente de glicerol muestra que la reducción de RCK/p54 hizo pasar el ARNm del VIH-1 de la fracción no polisomal a polisomas, al contrario que las células de control transfectadas ARNip. La reducción de RCK/p54 no afectó a la distribución endógena del ARNm del Hdm2.

55 [0074] Estos experimentos muestran que GW182, RCK/p54, LSM-1 y XRN1, necesarios para el RNAi, son

represores de la expresión génica del VIH-1 al prevenir la traducción del ARNm del VIH-1.

Ejemplo 2: El ARNm del VIH-1 se asocia físicamente con Argonaute2 y co-localiza con proteína necesaria para el silenciamiento mediado por miARN

5 [0075] Se investigó la interacción física entre los efectores de ARNi y ARNm del VIH-1.

PROCEDIMIENTOS

10 [0076] Se transfectaron células HeLa con el clon molecular del VIH-1 pNL4-3, Myc-Ago2 o Myc-AgoPAZ9 según se indica. 48 horas más tarde se recogieron las células y se prepararon extractos citoplasmáticos. El ARN total se purificó a partir de una fracción de células cosechadas mientras que el resto se sometió a inmunoprecipitación usando anticuerpos anti-Myc. Después del lavado, se utilizó una fracción para analizar la cantidad de Myc-Ago2 y Myc-AgoPAZ9 inmunoprecipitada por Western blot y el resto de Myc-IP se utilizó para la extracción de ARN. Se

15 cuantificaron VIH-1 ARNm (TAR y sin corte y empalme), Hdm2 y el ARNm de GAPDH a partir de ARN total o de mRNPs Myc inmunoprecipitadas por RT-PCR utilizando oligonucleótidos específicos. El experimento también se realizó utilizando nucleótidos marcados con 32P en la reacción de PCR. Los productos de PCR se visualizaron por autorradiografía.

20 RESULTADOS

[0077] Las células HeLa se transfectaron de forma simulada o se transfectaron con combinaciones de pNL4-3, Myc-Ago2, un componente central del complejo RISC, o su ARN de unión mutante Myc-Ago2PAZ9. En primer lugar, se verificó el hecho de que Myc-Ago2 y Myc-Ago2DPAZ9 se expresaron por igual. En segundo lugar, se prepararon 25 los extractos citoplasmáticos y se utilizó una fracción para la extracción de ARN total, mientras que el resto se sometió a inmunoprecipitación usando anticuerpos anti-Myc para purificar el mRNP de Myc-Ago2 asociado. Tanto el ARN total como el Myc-Ago2 ARN asociado se sometieron a transcripción inversa y luego se sometieron a amplificación por PCR utilizando oligonucleótidos específicos para el TAR ARN del VIH-1 (una estructura de 5' asociada con todo ARNm del VIH-1) o ARNm de VIH-1 sin corte ni empalme, ARNm de Hdm2 o ARNm de GAPDH. 30 El análisis PCR del ARN total demuestra que la misma cantidad de ARNm de VIH-1, Hdm2 y GAPDH estaba presente en todas las muestras. El ARNm de VIH-1 (tanto TAR como sin corte y empalme) se asociaron con Myc-Ago2 pero no con Myc-Ago2PAZ9 mutante. El ARNm de Hdm2 estuvo ausente de los mRNP de Myc-Ago2, esto sugiere que, en estas condiciones, Hdm2 no está regulado por ARNi. Se realizó un experimento similar para analizar la asociación del ARNm con múltiples cortes y empalmes del VIH-1 con los mRNP de Myc-Ago2. Las reacciones de

35 RT-PCR se realizaron en presencia de ATP con 32P y se analizaron por autorradiografía. El ARNM de VIH-1 con múltiples cortes y empalmes se asocia con Myc-Ago2 y ligeramente con Myc-Ago2PAZ9. También se observó la colocalización de ARNm de VIH-1 y efectores de ARNi como Ago2, RCK/p54 y DCP1 dentro de los cuerpos-P por inmunofluorescencia utilizando el VIH-1 que contiene puntos de unión MS2 y constructos MS2-GFP.

40 [0078] Los inventores muestran que los ARNm del VIH-1 se asocian físicamente con Ago2, un componente central de RISC, y co-localizan con las proteínas celulares necesarias para el silenciamiento mediado por miARN como RCK/p54 y DCP1/DCP2 en cuerpos-P. El hecho de que todas las especies de ARNm de VIH-1 se asocien con el RISC sugiere que los miARN celulares van dirigidos a una secuencia común a todos estos ARNm. Huang et al. (op. cit.) Identificó 5 miARN celulares capaces de dirigirse a la secuencia de 3'UTR presente en todos los ARNm de VIH

45 1. Sin embargo, no puede descartarse el hecho de que otros miARN celulares capaces de dirigirse a las regiones fuera de la 3'UTR puedan participar.

Ejemplo 3: La acumulación de ARNm de VIH-1 en cuerpos-P limita la replicación del virus y es independiente de la represión del VIH-1 mediada por A3G

50 PROCEDIMIENTOS

[0079] Se transfectaron células HeLa con ARNip como se indica. 48 horas después de la transfección las células se analizaron para la expresión de RCK / p54 y LSM-1 por Western blot o se infectaron con la misma cantidad de 55 VIH-1. La producción de virus se monitorizó 48 horas después de la infección mediante la medición de antígeno p24 en el sobrenadante del cultivo. Para analizar la infectividad de los viriones producidos a partir de las diferentes células HeLa transfectadas con ARNip se utilizaron volúmenes iguales de sobrenadante de células HeLa CD4 + transfectadas con ARNip para volver a infectar células HeLa CD4 +. El antígeno P24 se midió en el sobrenadante de cultivo 48 horas después de la infección. La inhibición del VIH-1 mediada por efectores de ARNi y APOBEC3G 5 implica diferentes mecanismos. Se transfectaron células HeLa CD4 + con el ARNip indicado. 48 horas más tarde las células fueron analizadas para la expresión de RCK/p54 y LSM-1 o co-transfectadas con pNL4-3Dvif (que carece del gen Vif) y pCDNA o vectores de expresión de tipo salvaje APOBEC3G o APOBEC3G doble mutante que carecen tanto de deaminasa como de actividad antiviral. Se midió la producción de VIH-1 24 horas después de la transfección en el sobrenadante de cultivo mediante la cuantificación de antígeno p24. Se realizó un ensayo de

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10 infectividad utilizando la misma cantidad de antígeno p24 para infectar células HeLa CD4 +. El antígeno p24 del VIH1 se midió 24 horas después de la infección.

RESULTADOS

15 [0080] Las nuevas evidencias sugieren interacciones físicas y funcionales entre los cuerpos-P y los ciclos de vida virales. El tráfico de ARNm viral a través de cuerpos-P puede representar un conjunto de transcripciones virales translacionalmente reprimidas para un embalaje eficiente o la formación de complejos de replicación viral. De hecho, los retrotransposones de levadura Ty1 y Ty3 ARNm se asocian con cuerpos-P y esta asociación es necesaria para una retrotransposición eficiente. En caso de BMV (virus del mosaico del bromo), la formación del complejo de

20 replicación del virus se produce en cuerpos-P. Además, los cuerpos-P también pueden funcionar en las defensas del huésped contra el virus y los elementos de transposición. En efecto, los factores celulares APOBEC 3G y 3F, que son factores de restricción virales, suelen encontrarse acumulados en cuerpos-P. Se ha sugerido que la restricción de VIH-1 mediada por 3G y 3F puede implicar ARNm viral dirigido a cuerpos-P, llevando a la inhibición de su traducción.

25 [0081] En primer lugar, se preguntó si los cuerpos-P son reguladores positivos o negativos de la replicación del VIH-1. Se transfectaron células HeLa CD4 + con RCK/p54 o ARNip específico de LSM-1 o con ARNip de control. Cuarenta y ocho horas más tarde las células se infectaron con igual cantidad de VIH-1. El antígeno p24 del VIH-1 se midió en el sobrenadante de cultivo celular de 48 horas después de la infección. El bloqueo de RCK/p54 y LSM-1

30 mejora la producción de virus en comparación con la infección de las células transfectadas con ARNip de control. Para evaluar la infectividad de los virus producidos, un volumen igual de sobrenadante de las células transfectadas con Scr, RCK/p54 y ARNip de LSM-1 se utilizó para infectar células HeLa CD4 + y el p24 del sobrenadante del cultivo se midió 48 horas más tarde. La infectividad del virus se correlaciona con la cantidad de p24 producida, mostrando que los viriones producidos en células con bloqueo de RCK/p54 y LSM-1 son plenamente competentes

35 para la replicación y no tienen defectos como el empaquetamiento del ARN. Desde que se demostró que el bloqueo de RCK/p54 y LSM-1 daba lugar a la interrupción de los cuerpos-P, se llegó a la conclusión a partir de estos experimentos de que la acumulación de ARNm de VIH-1 en cuerpos-P limita la replicación del virus.

[0082] En segundo lugar, se preguntó si la restricción de VIH-1 mediada por APOBEC3G requiere efectores de

40 ARNm mediados por miARN asociados a la inhibición de la traducción y necesarios para la formación de cuerpos-P. Por lo tanto, la restricción de VIH-1 mediada por APOBEC3G en las células donde se redujo la expresión de RCK/p54 o LSM-1 se comparó con las células de control. Las células HeLa se transfectaron con ARNip de control o con ARNip específico para RCK/p54 o LSM-1. Cuarenta y ocho horas más tarde, las células se transfectaron con un clon molecular del VIH-1 que carece del gen vif (pNL4-3Dvif) ya sea solo o con el tipo salvaje A3G o A3G mutante

45 sin actividad antiviral (A3Gdm). El antígeno p24 del VIH-1 se midió en el sobrenadante del cultivo 48 horas después de la transfección. Curiosamente, el bloqueo de RCK/p54 o LSM-1 mejora la producción de VIH-1, independientemente de A3G. Del mismo modo, el A3G, al contrario que el A3Gdm, redujo la producción de virus independientemente de la expresión de RCK/p54 o LSM-1. Estos resultados sugieren que la represión del VIH-1 mediada por RCK/p54 o LSM-1 o A3G implica diferentes mecanismos. A continuación, se analizó la infectividad del

50 VIH-1 producido a partir de células transfectadas con ARNip. Una cantidad igual de p24 se utilizó para las células CD4 + HeLa infectadas y el antígeno p24 del VIH-1 se midió en el sobrenadante del cultivo 48 horas después de la infección. El Virus producido en las células transfectadas Scr ARNip en presencia de A3G muestra una menor infectividad que el producido en ausencia o en presencia de A3Gdm. Se observó una actividad de restricción del A3G en VIH-1 cuando el virus se produjo en células con bloqueo de RCK/p54 o LSM-1.

55 [0083] Este experimento muestra que la acumulación de ARNm de VIH-1 en cuerpos-P limita la replicación del virus y que la restricción del VIH-1 mediada por A3G es independiente de los efectores de ARNi RCK/p54 y LSM-1 y no precisa cuerpos-P.

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5 Ejemplo 4: Los niveles endógenos de Drosha, DGCR8 y RCK/p54 contribuyen a la latencia del VIH-1 en pacientes infectados

[0084] Tomados en conjunto, estos resultados demuestran una interacción física represiva entre efectores de ARNi y ARNm de VIH-1. Al demostrarse que los miARN celulares desempeñan un papel en la latencia del VIH-1 se

10 preguntó si RCK/p54, que se requiere para la inhibición de la traducción de ARNm mediada por miARN, contribuye al silenciamiento in vivo del VIH-1.

PROCEDIMIENTOS

15 [0085] Implicación del ARNi en la latencia del VIH-1. Se aislaron CMSP a partir de 3 pacientes sometidos a terapia HAART activa. Las CMSP aisladas se transfectaron con el ARNip indicado y, o bien se analizaron para la expresión de RCK/p54, DGCR8 y Drosha mediante Western blot 48 horas después de la transfección o bien se co-cultivaron con CMSP activadas obtenidas a partir de donantes sanos. La replicación del virus se monitorizó cada 3 a 4 días después del co-cultivo mediante la medición de antígeno p24 en el sobrenadante del cultivo. Se muestra la cantidad

20 de antígeno p24 en el día 15 después del co-cultivo. No se aisló ningún virus CMSP transfectadas Sc durante 27 días

RESULTADOS

25 [0086] Las CMSP aisladas de 3 pacientes infectados con VIH-1 tratados con HAART con viremia indetectable se transfectaron con ARNip de control o con ARNip específico para Drosha, DGCR8 o RCK/p54. Las células transfectadas se co-cultivaron con CMSP con PHA/IL2 activado aisladas de donantes sanos. La producción de virus se monitorizó cada 3 días midiendo el antígeno p24 en el sobrenadante del cultivo. El bloqueo de Drosha provoca la reactivación del virus en CMSP aisladas de pacientes infectados con VIH-1 tratados con HAART (Fig. 2). La

30 reactivación del VIH-1 también se ve cuando DGCR8, otro componente del complejo microprocesador, se bloqueó mediante ARNip. Curiosamente, el bloqueo de RCK/p54 provoca la reactivación del virus en las células latentes infectadas con VIH-1 de forma natural.

[0087] Estos resultados muestran que los niveles endógenos de Drosha, DGCR8 y RCK/p54 contribuyen a la 35 latencia del VIH-1 en los pacientes infectados.

Ejemplo 5: miR-34a, miR-206, miR-122 y miR-210 potencian la expresión del virus en células HeLa y en depósitos de VIH-1 silenciados y aislados de forma natural.

40 PROCEDIMIENTOS

[0088] La sobrerregulación de miARN celular de VIH-1 (Triboulet et al. (2007) Science 315 (5818):1579-82) se sobreexpresó en células HeLa que contienen un constructo indicador integrado de LTR-luciferasa. 24 horas más tarde, las células se transfectaron con el vector vacío o que expresa Tat. La actividad de la luciferasa se midió 24 45 horas después de la transfección (Fig. 3). Las células HeLa CD4 + se transfectaron con los genes miARN o ARNip con DGCR8 específico indicados. 48 horas después de la transfección, las células se infectaron con VIH-1 que expresa el gen de la luciferasa en marco nef y se midió la actividad de la luciferasa 24 horas más tarde (Fig. 4). Las CMSP se aislaron de 5 pacientes tratados con controladores de élite del VIH (Fig. 5, a la figura 9) o de 4 pacientes infectados con VIH-1 y tratados con HAART (Fig. 10 a fig. 13). Las CMSP aisladas se transfectaron con una mezcla 50 de miR-34a, miR-206, miR-210 y miR-122 (miRmix) o con miARN de control (miR-32) como se indica. Las CMSP transfectadas se co-cultivaron con CMSP activadas obtenidas a partir de donantes sanos. La replicación del virus se monitorizó cada 3 a 4 días después del co-cultivo mediante la medición de antígeno p24 en el sobrenadante del cultivo. Los ARN pequeños se purificaron a partir de CMSP aisladas de donantes sanos, pacientes infectados por VIH-1 tratados con HAART, pacientes infectados tratados con controladores de élite del VIH y pacientes infectados 55 por VIH-1 no tratados. Se cuantificaron el miR-210, miR206, miR34a, miR-125 y U6 ARNsno por QRT-PCR

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utilizando oligonucleótidos específicos. Los resultados se normalizaron a U6 ARNsno.

RESULTADOS

5 [0089] El miARN, a través de la regulación de la expresión génica, desempeña un papel importante en la modulación de casi todos los procesos celulares investigados (diferenciación celular, proliferación, apoptosis...). En particular, se descubrió que los genes miARN desempeñan un papel importante en el desarrollo del sistema inmune y en la respuesta inmune adaptativa. Es tentador plantear la hipótesis de que el VIH-1 puede utilizar miARN celulares para regular los genes importantes para su replicación. De hecho, se ha demostrado previamente que la

10 infección de VIH-1 en las células Jurkat altera el perfil de expresión de los genes miARN, dándose en algunos miARN regulación decreciente y en otros sobrerregulación (Triboulet et al. (2007) Science 315:1579-1582). Dos miRNAs (miR-17 y miR-20) del grupo-objetivo de miARN 17/92 con regulación decreciente apuntan a la histona acetiltrasferasa PCAF, que se sabe es necesaria para la activación del gen del VIH-1 mediada por Tat (Triboulet et al., op. cit.). En el presente estudio, se analizó la función del miARN sobrerregulado del VIH-1 en la replicación del

15 virus. El análisis de silico muestra que ninguno de los genes miARN con VIH-1 inducido puede apuntar a ARNm viral, lo cual sugiere que si el miARN con VIH-1 inducido desempeña un papel en la replicación del virus, este efecto será mediado al apuntar el a genes celulares represivos del VIH-1. Entre los miARN con VIH-1 inducido se hizo un cribado para aquellos capaces de modular la actividad promotora del VIH-1. Las células HeLa que contienen constructo LTR-luciferasa integrado se transfectaron con los genes miARN indicados, bien solos, para medir su

20 efecto sobre la actividad basal LTR, o cotransfectados con el plásmido de expresión de Tat para analizar su efecto sobre la transactivación mediada por Tat de la LTR. Mientras que miR-34a y miR-206 mejoraron la actividad basal de la LTR, sin efectos sobre la transactivación mediada por Tat de la LTR, miR-210 y miR-122 no tuvieron efecto alguno sobre el nivel de expresión basal, pero mejoraron la actividad transcripcional mediada por Tat hacia la LTR (Fig . 3). miR-370 no tuvo ningún efecto. En cuanto al control, miR-20a, que se dirige a PCAF, reduce la capacidad

25 de Tat para activar LTR. Este experimento sugiere que miR-34a y miR-206 se dirigen a un gen celular implicado en la represión de la actividad basal, mientras que miR-122 y miR-210 se dirigen a factores celulares que reprimen la actividad transcripcional Tat. A continuación se analizó el efecto de estos miARN en la producción de VIH-1 utilizando un único clon molecular de pNL4-3 infeccioso que expresa luciferasa inserta en marco de lectura abierto nef. Curiosamente, miR-34a, miR-206, miR-122 y miR-210 mejoran la expresión del virus en este ensayo con un

30 efecto impresionante de miR-206, que mejora la producción de virus en 54 veces (Fig. 4). miR-370 no tuvo ningún efecto significativo sobre la producción de virus en este ensayo.

[0090] En pacientes infectados con VIH-1 hay dos situaciones en las que el VIH-1 se silencia a nivel de expresión génica. En primer lugar, la terapia HAART reveló la presencia de un depósito silencioso de VIH-1 que consiste en 35 células CD4 + T de memoria que contienen provirus integrados silenciosos. En segundo lugar, se ha identificado recientemente a los individuos infectados con VIH capaces de controlar su virus a niveles indetectables durante muchos años en ausencia de tratamiento y se les denomina controladores de élite del VIH. El hecho de que miR34a, miR-206, miR-122 y miR-210 mejoren la actividad viral LTR nos lleva a preguntar si estos miARN pueden desempeñar algún papel en el silenciamiento del VIH-1 observado en los pacientes infectados. Por lo tanto, las 40 CMSP aisladas de 5 controladores de élite del VIH-1 y en 4 pacientes infectados con VIH-1 tratados con HAART con viremia indetectable se transfectaron bien con miARN de control (miR-32), bien con una mezcla de miR-34a, miR206, miR 122 y miR-210. Las CMSP transfectadas se co-cultivaron con CMSP activadas con PHA/IL2 de donantes sanos y el antígeno p24 en el sobrenadante del cultivo se midió cada 3 a 4 días. La sobreexpresión de miRmix conduce a la reactivación del virus en los CMSP de 5 de cada 5 controladores de élite monitorizados (Fig. 5, a la 45 figura 9) y en 4 de cada 4 pacientes infectados con VIH-1 tratados con terapia HAART monitorizados (Fig. 10, a la figura 13). El miR de control no tuvo efecto. Estos experimentos muestran que miR-34a, miR-206, miR-122 y miR210 son capaces de reactivar la replicación del VIH-1 en depósitos aislados naturalmente silenciosos de VIH-1. El RT-PCR cuantitativo en tiempo real se utilizó a continuación para analizar los niveles de expresión de estos miARN en CMSP de controladores de élite, en pacientes tratados con HAART y en pacientes no tratados infectados con 50 VIH-1 (Fig. 14 a la figura 17). La expresión de miR-34a, miR-206 y miR-210 es baja en las CMSP aisladas de los controladores de élite del VIH y en los pacientes infectados con VIH-1 tratados con HAART, en comparación con los pacientes infectados con VIH-1 no tratados. La expresión de miR-122 fue baja en todos los pacientes analizados. El nivel de expresión de miR-125 B, que no está regulada por el VIH-1, fue similar en todas las CMSP analizadas. Curiosamente, al igual que en los controladores de élite y los pacientes tratados con HAART, el nivel de expresión 55 de miR34a, miR-206 y miR-210 fue bajo en donantes sanos. Estos experimentos sugieren una correlación entre la

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expresión de miR34a, miR-206, miR-210 y la replicación del VIH-1.

Ejemplo 4: identificación de los genes implicados en la activación de la replicación del VIH

5 [0091] Entre 135 genes diana putativos de miR-34a, miR-206, miR-210 y miR-122, los inventores han identificado 51 genes (Tabla 1) en los que la inhibición de la expresión de ARNip o shRNA activa la replicación viral del VIH-1.

[0092] En pocas palabras, se ha generado una biblioteca ARNip dirigida específicamente a los 135 genes diana putativos de miR-34a, miR-206, miR-210 y miR-122. A cada gen se dirigió específicamente un grupo de 4 ARNip. 10 Los ARNip se obtuvieron de siGenome, Dharmacon.

[0093] Las células HeLa se transfectaron primero por piscinas ARNip con oligofectamina (Invitrogen). 48 horas más tarde, las células se infectaron con un virus VIH pseudotipado, con envoltura VSV-G y que expresa un gen indicador de luciferasa que reemplaza al gen nef (VIH-VSVG-Luc). 48 horas después de la infección, se recogieron

15 las células y se cuantificó la actividad de la luciferasa (kit de ensayo de luciferasa, Promega). La actividad de la luciferasa se normalizó con respecto a la cantidad de proteínas en el lisado celular medidas mediante ensayo de Bradford. Así se pudieron identificar 51 genes en los que la inhibición específica conduce a un aumento de la replicación viral en células HeLa por un factor 5.

20 [0094] El análisis anterior también se llevó a cabo en otros en modelos celulares in vitro más cerca de las condiciones fisiológicas de la infección:

-Células CD4 HeLa, que expresan el receptor CD4 y los correceptores CCR5 y CXCR4; se transfectaron los ARNip de acuerdo con el procedimiento anterior pero el virus infectado llevaba una envoltura de VIH (pNL4-3-Luc);

25 -Las células Jurkat T, las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de individuos no infectados y los macrófagos humanos; en estos casos, los genes se inhiben después de la transducción de shARN con expresión de partículas lentivirales (clones TRC).

Tabla 1: 30

Símbolo del gen: Número de acceso (NCBI) ID del gen

DGUOK: NM_080916 1716

MIR16: AY463154 53591

PPP1R11: NM_021959 6992

ARHGAP1: NM_004308 392

TEDDM1: NM_172000 127670

QDPR: NM_000320 5860

C14orf32: NM_144578 93487

C1orf19: NM_052965 116461

ATP1B3: NM_001679 483

FLJ10241: NM_018035 55101

ANP32E: NM_030920 81611

TAGLN2: NM_003564 8407

ARF3: NM_001659 377

PTMA: NM_002823 5757

PPIB: NM_000942 5479

PRCP: NM_005040 5547

PTPRK: NM_002844 6745

OBSL1: NM_015311 23363

SLC44A1: NM_080546 23446

PPIAL4: NM_178230 164022

SERP1: NM_014445 27230

EBPL: NM_032565 84650

CBX6: NM_014292 23466

Claims

imagen1

REIVINDICACIONES

1. Al menos un ácido nucleico

(I) que comprende o que consiste en, o

(Ii) que codifica un ácido nucleico que comprende o consiste en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

1) IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1, IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 2, IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 3 e IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 4 y

2) una secuencia derivada de IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1 a 4 por sustitución, deleción o inserción de al menos un nucleótido, siempre que un ácido nucleico que consiste en la secuencia derivada de IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1 a 4 sea responsable de inducir la expresión del VIH-1 en las células latentes infectadas por VIH1,

para su uso en el tratamiento de pacientes asintomáticos infectados por un retrovirus.
2.

El al menos un ácido nucleico para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en una molécula de ARN.
3.

El al menos un ácido nucleico para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el medicamento comprende una molécula de ARN que consiste en un IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1, una molécula de ARN que consiste en un IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 2, una molécula de ARN que consiste en un IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 3 y una molécula de ARN que consiste en un IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 4.
4.

El al menos un ácido nucleico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en combinación con al menos otro compuesto antirretroviral.
5.

El al menos un ácido nucleico para el uso de acuerdo con la reivindicación 4, donde al menos el otro compuesto antirretroviral se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de la transcriptasa inversa y un inhibidor de la proteasa.
6.

El al menos un ácido nucleico para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento de pacientes asintomáticos infectados por VIH-1.
7.

El al menos un ácido nucleico para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde los pacientes están sometidos a una terapia antirretroviral altamente activa (HAART).
8.

El al menos un ácido nucleico para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde los pacientes son controladores de élite del VIH-1.
9.

Al menos un ácido nucleico

(I) que comprende o que consiste en, o

(Ii) que codifica un ácido nucleico que comprende o consiste en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

1) IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1, IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 2, IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 3 e IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 4 y

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imagen2

2) una secuencia derivada de IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1 a 4 por sustitución, deleción o inserción de al menos un nucleótido, siempre que un ácido nucleico que consiste en la secuencia derivada de IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1 a 4 sea responsable de inducir la expresión del VIH-1 en las células latentes infectadas por VIH1,

5 en combinación con al menos otro compuesto antirretroviral para uso como un medicamento.
10. Al menos un ácido nucleico en combinación con al menos otro compuesto antirretroviral para el uso de

acuerdo con la reivindicación 9, donde el ácido nucleico consiste en una molécula de ARN. 10
11. Al menos un ácido nucleico en combinación con al menos otro compuesto antirretroviral para el uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, donde el medicamento comprende una molécula de ARN que consiste en un IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 1, una molécula de ARN que consiste en un IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 2, una molécula de ARN que consiste en un IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º: 3 y una

15 molécula de ARN que consiste en un IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º : 4.
12. Al menos un ácido nucleico en combinación con al menos otro compuesto antirretroviral para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde al menos otro compuesto antirretroviral se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de la transcriptasa inversa y un inhibición de la proteasa.

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