WO2022101538A1 - Ifit5 para su uso como agente antiviral - Google Patents

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WO2022101538A1
WO2022101538A1 PCT/ES2021/070821 ES2021070821W WO2022101538A1 WO 2022101538 A1 WO2022101538 A1 WO 2022101538A1 ES 2021070821 W ES2021070821 W ES 2021070821W WO 2022101538 A1 WO2022101538 A1 WO 2022101538A1
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WO
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protein
nucleic acid
ifit5
use according
rbcs
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Application number
PCT/ES2021/070821
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English (en)
French (fr)
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María del Mar ORTEGA-VILLAIZAN ROMO
Verónica CHICO GRAS
María Elizabhet SALVADOR MIRA
Original Assignee
Universidad Miguel Hernandez De Elche
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Filing date
Publication date
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1706—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Definitions

  • IFIT5 for use as an antiviral agent
  • the present invention relates to a protein with antiviral activity, the IFIT5 protein, particularly for the treatment of viral diseases in aquatic animals.
  • the invention belongs to the technical field of aquaculture.
  • the immune system of fish is not as well studied.
  • One of the main differences between the immune system of fish and mammals is the erythrocytes (in English Red Blood Cells or RBCs).
  • the nuclear RBCs characteristic of fish, birds, amphibians and reptiles, in addition to performing the function of gas exchange, have been described as having an important role in different biological processes, including the immune response.
  • nuclear RBCs are capable of inducing an immune response against different pathogens, including viral infections (Nombela I. and Ortega-Villaizan MDM., PLoS Pathog. 2018;14(4):e1006910) .
  • VHSV viral hemorrhagic septicemia virus
  • IPNV infectious pancreatic necrosis virus
  • IFN 1 interferon type 1
  • the present invention relates to a protein with antiviral activity, the IFIT5 protein from erythrocytes (hereinafter the "RBCs") of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) for use as a drug, particularly for the treatment of viral diseases in aquatic animals.
  • said protein has antiviral activity against viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV).
  • the inventors performed immunoprecipitation assays on RBC samples exposed to VHSV. Among all the proteins identified, they chose the protein induced by interferon with 5 tetratricopeptide repeats (IFIT5) of sequence SEQ ID NO: 2. The results showed that there was a correlation between the decrease in VHSV replication and the increase in the expression of ifit5 (gene encoding IFIT5 protein with nucleotide sequence SEQ ID NO: 1) in RBCs of rainbow trout exposed to VHSV ( Figure 1).
  • ifit5 silencing by small interfering ribonucleic acid showed an increase in VHSV replication in RBCs, indicating that IFIT5 was involved in the antiviral activity of rainbow trout RBCs against VHSV ( Figure 2).
  • the inventors carried out transfection assays with a plasmid encoding the IfitS gene in the epithelioma papulosum cyprini cell line from Pimephales promelas (EPC), to evaluate the antiviral activity conferred by the overexpression of IFIT5 against VHSV.
  • EPC Pimephales promelas
  • the protein of the invention refers to a protein, hereinafter the "protein of the invention", comprising an amino acid sequence that has an identity of at least 70%, 75%, 80% , 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO: 2, for use as a medicine, hereinafter "the first use of the invention” .
  • the drug is an antiviral agent.
  • the sequence SEQ ID NO: 2 corresponds to the IFIT5 protein, a protein that belongs to the family of proteins induced by type I interferon (IFIT) and that, in the present invention, has been shown to participate in innate antiviral immunity in aquatic animals. .
  • protein refers to a molecule formed by the linking, in a defined order, of alpha-amino acids via a peptide bond. It will be understood that the terms “peptide bond”, “peptide”, “polypeptide” and protein are known to those skilled in the art.
  • the protein of the invention can be obtained by techniques widely known in the state of the art, such as chemical synthesis, genetic recombination or expression of the polynucleotide that encodes the polypeptide of the invention.
  • the protein of the invention comprises an amino acid sequence that has an identity of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO: 2.
  • identity or “sequence identity” is understood as the degree of similarity between two nucleotide or amino acid sequences obtained by aligning the two sequences.
  • the degree of identity between two amino acid sequences can be determined by conventional methods, for example, by means of standard sequence alignment algorithms known in the state of the art , such as BLAST BLAST programs, eg, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, are in the public domain at The National Center for Biotechnology Information (NCBI) website.
  • BLAST BLAST programs eg, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN
  • the protein of the invention comprises an identity of at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the protein of the invention comprises 100% sequence identity, or consists of, the sequence SEQ ID NO: 2 for use as a medicament.
  • sequence SEQ ID NO: 1 that codes for the protein of the invention (the protein IFIT5 with sequence SEQ ID NO: 2), can also be used as a medicine.
  • nucleic acid of the invention comprising a nucleotide sequence that has an identity of at least 70%, 75%, 80% , 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO: 1, for use as a medicine.
  • identity has already been described hereinabove, and applies equally to this inventive aspect.
  • the nucleic acid of the invention comprises an identity of at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid of the invention comprises 100% sequence identity, or consists of, the sequence SEQ ID NO: 1 for use as a drug.
  • the nucleic acid of the invention for its use as a medicine can be included in an expression vector or plasmid.
  • another aspect of the present invention refers to a vector or plasmid, hereinafter the "vector or plasmid of the invention” comprising a nucleotide sequence that has an identity of at least 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO: 1, for use as a medicine.
  • expression vector or "expression plasmid”, used interchangeably throughout this document, refers to a DNA fragment that has the ability to replicate in a given host and can serve as a vehicle to carry out the transcription of a sequence of interest that has been inserted into it
  • the expression vector or plasmid can also be incorporated into a cosmid, bacteriophage, a viral vector, without excluding other types of vectors that correspond to the definition of vector.
  • the vector or plasmid comprises a sequence consisting of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid of the invention may be operatively linked to a plasmid expression control sequence of the invention.
  • operably linked refers to a control sequence, eg, a promoter or operator, that is appropriately placed in a relative position to a coding sequence such that the control sequence directs the production of a polypeptide encoded by the coding sequence.
  • An expression vector or plasmid in the context of the present invention may be any suitable vector or plasmid, including chromosomal, non-chromosomal and synthetic nucleic acid vectors (a nucleic acid sequence comprising a suitable set of expression control elements) .
  • suitable vector or plasmid including chromosomal, non-chromosomal and synthetic nucleic acid vectors (a nucleic acid sequence comprising a suitable set of expression control elements) .
  • examples of such vectors include SV40 derivatives, bacterial plasmids, phage DNA, baculovirus, yeast plasmids, vectors derived from combinations of phage plasmids and DNA, and viral nucleic acid (RNA or DNA) vectors.
  • the plasmid vector is selected from the list consisting of: pmTFP1, pCMV1.4, pcDNA, pAE6.
  • the plasmid vector is the pmTFP1 vector with sequence SEQ ID NO: 3.
  • the plasmid vector comprises the sequence SEQ ID NO: 4.
  • Expression vectors or plasmids may comprise expression control sequences designed to control and direct the transcription of genes of interest and the subsequent expression of proteins in various cellular systems or sites of interest. Plasmids combine an expressible nucleotide sequence or gene of interest with expression control sequences (ie, expression cassettes) comprising desirable elements such as, for example, promoters, enhancers, selectable markers, operators, etc.
  • both the protein, the nucleic acid and the vector or plasmid of the invention can be used as a medicine.
  • drug as used in this description means any substance used for the prevention, diagnosis, alleviation, treatment or cure of disease in animals or which may be administered to the animal for the purpose to restore, correct or modify its physiological functions by exerting a pharmacological, immunological or metabolic action.
  • the medicament comprises the protein, nucleic acid or plasmid of the invention or alternatively a composition comprising at least the protein, nucleic acid or plasmid of the present invention.
  • the composition or medicine to which the present invention refers is preferably for veterinary use.
  • the terms "drug", “pharmaceutical composition” or “veterinary composition” are used synonymously.
  • the protein of the invention is formulated in a medicine or in a pharmaceutical or veterinary composition, in the therapeutically effective amount.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of the protein, nucleic acid or plasmid of the invention, as described in previous paragraphs, capable of producing a beneficial effect in the animal, that is , particularly treating or preventing disorders caused by infections viral. Said amount will be determined by the characteristics of the compounds, the route, form and frequency of their administration, and other factors, including the age, condition of the animal, as well as the severity of the alteration or disorder.
  • the protein, nucleic acid or plasmid of the invention is formulated in a veterinary composition, in a therapeutically effective amount, preferably together with at least one pharmaceutically acceptable carrier or excipient and/or other active agent (eg, adjuvants).
  • a pharmaceutically acceptable carrier or excipient and/or other active agent eg, adjuvants.
  • excipient refers to a substance that helps the absorption of the elements of the composition of the invention, stabilizes said elements and activates or helps the preparation of the composition in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it nicer.
  • the excipients could have the purpose of keeping the ingredients together, as is the case of starches, sugars or cellulose, the purpose of sweetening, the basis as a colorant, the basis of protecting the composition, such as, for example, to isolate it from air and/or moisture, the filling function of a tablet, capsule or any other form of presentation, such as, for example, is the case of dibasic broth phosphate, the disintegrating fondon to facilitate the dissolution of the components and its absorption in the intestine, without excluding other types of files not mentioned in this paragraph.
  • vehicle refers to a substance that is used in the pharmaceutical or veterinary composition to dilute the protein, nucleic acid or plasmid of the present invention comprised therein, up to a volume or weight certain.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other elements, allow a better dosage and administration or give consistency and shape to the composition.
  • the presentation form is liquid, the pharmacologically acceptable vehicle is the diluent.
  • the term "adjuvant” refers to an agent that increases the antiviral effect of the composition of the invention, when it is supplied together with it or as part of the same treatment protocol.
  • the adjuvants and carriers that can be used in the veterinary composition of the present invention are the carriers and carriers known to those skilled in the art.
  • the drug or composition will be adapted to the type of administration used, for example, the composition can be presented in the form of solutions or any other form of administration that is veterinarily permitted and in a therapeutically effective amount.
  • the composition can be administered orally, intramuscularly, intraperitoneally, branchially, nasally, bloodwise, transdermally or directly (by injection, by arterial or venous perfusion, etc.) on the surface of an organ or tissue.
  • the veterinary composition or medicament comprising the protein, nucleic acid or plasmid of the invention, as described above, is preferably for veterinary use in aquatic animals for the treatment and/or prevention of viral diseases.
  • another particular embodiment refers to the protein, nucleic acid or plasmid of the invention, or in its case to the veterinary composition or medicine described above, for use in the treatment and/or prevention of diseases caused by viruses in aquatic animals.
  • treatment refers to combating the effects caused as a consequence of a disease or pathological condition in an aquatic animal, particularly virus infection, which includes inhibiting the disease or stopping its development, alleviate the disease or cause regression of the disease or its symptoms and/or stabilize the disease.
  • prevention as understood in the present invention, consists of avoiding the appearance of damage caused by viral infection.
  • diseases caused by viruses include, but are not limited to, infectious hematopoietic necrosis, viral hemorrhagic septicemia, infectious pancreatic necrosis, infectious salmon anemia, cardiac and skeletal muscle inflammation, or other diseases caused by aquatic viruses.
  • viruses that cause disease or pathology in aquatic animals include, but are not limited to, infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV), viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV), infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) , salmonid alphavirus 2 (SAV2), aquatic orthoreovirus (PRV), infectious salmon anemia virus (ISAV), or other viruses that infect aquatic animals.
  • IHNV infectious hematopoietic necrosis virus
  • VHSV viral hemorrhagic septicemia virus
  • IPNV infectious pancreatic necrosis virus
  • SAV2 salmonid alphavirus 2
  • PRV aquatic orthoreovirus
  • ISAV infectious salmon anemia virus
  • the disease is caused by the viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) or the infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), preferably it is caused by the viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) .
  • VHSV viral hemorrhagic septicemia virus
  • IPNV infectious pancreatic necrosis virus
  • the protein, nucleic acid or plasmid of the invention or, where appropriate, the veterinary composition or medicine are used in the treatment and/or prevention of diseases caused by viruses in aquatic animals.
  • aquatic animal refers to any multicellular organism that lives in water, particularly fish.
  • the aquatic animal is an animal belonging to a species of fish farmed by aquaculture.
  • fish farmed by aquaculture include, but are not limited to, salmonids (trout, salmon, etc.), cyprinids (carp), turbot, croaker, sole, bluefin tuna, sea bream, yellowtail, eels, sea bream or sea bass,
  • the aquatic animals belong to the family of salmonids (Salmonidae) or to the family of cyprinids ( Cyprinidae).
  • the salmonids are selected from the list consisting of: rainbow trout (Oncorhynchus mykiss); king salmon (Oncorhynchus tshawytscha); coho salmon (Oncorhynchus kisutch); Atlantic salmon (Salmo salar); common trout (Salmo trutta); grayling (Thymallus thymallus); coregons (Coregonus spp.); keta (Oncorhynchus keta); sockeye salmon (Oncorhynchus nerká); lake trout (Salvelinus namaycush); brook trout (Salvelinus fontinalis); and Arctic char (Salvelinus alpines).
  • the salmonid is the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).
  • the cyprinids are selected from the list consisting of: common breams (Abramis); bleaks (Alburnus); jarabugo (Anaecypris); Aztec minnow (Azteculá); common catfish (Barbus); white bream (Blicca); stone chipper (Campostoma); common carp (Cyprinus) and minnow (Pimephales).
  • the minnow is selected from the list consisting of: Pimephales notatus, Pimephales promelas, Pimephales tenellus and Pimephales vigilaa, more preferably it is Pimephales promelas.
  • Another aspect of the present invention refers to a method of treatment and/or prevention of diseases caused by a virus in aquatic animals, hereinafter the "method of the invention", which comprises the administration of a therapeutically effective amount of a protein comprising a sequence that has an identity of at least 70%, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% with SEQ ID NO: 2, or a nucleic acid that comprises a sequence that has an identity of at least 70%, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% with SEQ ID NO: 1 or a plasmid comprising said nucleic acid , or in its case a veterinary composition that comprises a therapeutically effective amount of a protein that comprises a sequence that presents an identity of at least 70%, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% with SEQ ID NO:2, or of a nucleic acid comprising a sequence that has an identity of at least 70%, 75, 80, 85
  • treatment means treatment, prevention, “aquatic animal” and “therapeutically effective amount” have been described hereinabove, and apply equally to this inventive aspect, as well as its particular embodiments (alone or in combination).
  • the disease caused by viruses is caused by the viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV).
  • VHSV viral hemorrhagic septicemia virus
  • the aquatic animals belong to the family of salmonids (Salmonidaé) or to the family of cyprinids (Cyprinidaé).
  • the salmonids are selected from the list consisting of: rainbow trout (Oncorhynchos mykiss); king salmon (Oncorhynchos tshawytscha); coho salmon (Oncorhynchos kisutch); Atlantic salmon (Salmo salar); common trout (Salmo trotta); grayling (Thymallos thymallos); coregons (Coregonus spp.); keta (Oncorhynchos Reta); sockeye salmon (Oncorhynchos nerka); lake trout (Salvelinus namaycosh); brook trout (Salvelinus fontinalis) and Arctic char (Salvelinus alp
  • the cyprinids are selected from the list consisting of: common breams (Abramis); bleaks (Albornos); jarabugo (Anaecypris); Aztec minnow (Aztecula); common barbels (Barbels); white bream (Biloca); stone chipper (Campostoma); common carp (Cyprinos) and minnow (Pimephales).
  • the minnow is selected from the list consisting of: Pimephales notatos, Pimephales promelas, Pimephales tenellus and Pimephales vigilax, more preferably it is Pimephales promelas.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of a protein comprising a sequence that has an identity of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% or 100% with SEQ ID NO: 2, or in its case a veterinary composition comprising a therapeutically effective amount of a protein comprising a sequence that has an identity of at least 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO: 2, for the preparation of a medicine, preferably for the treatment and/or prevention of diseases caused by viruses in aquatic animals.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of a nucleic acid comprising a sequence that has an identity of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO: 1 or, where appropriate, a veterinary composition comprising a therapeutically effective amount of a nucleic acid comprising a sequence that has an identity of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO:1, for the preparation of a drug, preferably for the treatment and/or prevention of diseases caused by viruses in aquatic animals.
  • nucleic acid described in the previous paragraph may be included in an expression vector or plasmid. Therefore, another aspect of the present invention relates to the use of a plasmid or vector comprising a sequence that has an identity of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% , 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO:1.
  • a particular embodiment of the present invention refers to the use of a plasmid or vector comprising the sequence consisting of SEQ ID NO:1.
  • Another particular embodiment refers to the use of the plasmid or vector comprising the sequence SEQ ID NO: 4
  • FIG. 1 Temporal tracking of the ifit5 gene in VHSV-exposed rainbow trout RBCs.
  • B IFIT5 protein expression in RBCs exposed to VHSV MO1 1, at 6 and 24 hpe, analyzed by flow cytometry. The graph shows the mean fluorescence intensity (MFI).
  • FIG. 1 Analysis of ifit5 gene silencing in RBCs electroporated with siRNA.
  • A RBCs were incubated with silFIT5 sequences for 72 hours and gene expression was assessed by semi-quantitative RT-PCR. SiGFP was used as negative control and gapdh gene as endogenous control. "C” shows electroporated RBCs without siRNA.
  • B Analysis of IFIT5 silencing at the protein level by Westemblot. The endogenous protein control was ⁇ -actin.
  • Figure 4 Graphic representation of the cloned pmTFP1 plasmid vector with the ifit5 gene of rainbow trout.
  • RBCs were obtained from peripheral blood of rainbow trout slaughtered by overexposure to tricaine (tricaine methanesulfonate) (Sigma-Aldrich) at a concentration of 0.3 g/L. Subsequently, peripheral blood samples were taken from the caudal vein using syringes (NIPRO, Bridgewater, NJ). Blood samples were deposited in a 2 mL eppendorf in RPMI-1640 medium (Dutch modification) (Gibco, Thermo Fischer Scientific Inc., Carlsbad, CA), supplemented with 10% gamma-irradiated fetal bovine serum (FBS).
  • tricaine tricaine methanesulfonate
  • FBS gamma-irradiated fetal bovine serum
  • RBCs were then purified by two consecutive Ficoll density gradient centrifugations (7206 g, Ficoll 1.007; Sigma-Aldrich).
  • the purified RBCs were cultured in the medium indicated above in 25 mL bottles at 14°C for 24 hours before experimentation.
  • the VHSV 07.71 strain used in the experiments was purchased from the ATCC (ATCC VR-1388) and cultured on EPC cells at 14°C as described in Basurco B., et al, 1998, Bulletin European Association Fish Pathologists; 9:p92-5.
  • Ficoll-purified RBCs (1x10 6 cells/well) were incubated with VHSV at multiplicity of infection (MOI) 1 in RPMI 2% FBS and MEM 2% FBS. , respectively, at 14°C. After 3 hours the RBCs were removed from the virus medium and fresh medium was added in order to remove non-adherent virus. Subsequently, the cells were stored in an appropriate buffer for RNA extraction at different times after exposure to the virus (3, 6, 24 and 72 hours). The expression levels of the N-VHSV and ifit5 genes were analyzed by real-time quantitative PCR (RT-qPCR) using specific primers from Table 1.
  • RT-qPCR real-time quantitative PCR
  • RNA extraction For RNA extraction, the E.Z.N.A. RNA (Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA) following the manufacturer's instructions. Subsequently, a DNAse treatment was performed in order to eliminate residual genomic DNA using the TURBO DNAse kit (Ambion, Thermo Fischer Scientific Inc.) following the instructions described by the manufacturer. RNA was quantified with the NanoDrop spectrophotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE).
  • cDNA complementary DNA
  • M-MLV reverse transcriptase Invitrogen & Thermo Fischer Scientific Inc.
  • the RT-PCR reaction first involves the incubation of the RNA in the presence of 10 mM dNTPs and Random hexamers (50-250 ng) or Oligodt (in the case of gene silencing) as primers.
  • thermocycler GeneAmp PCR System 2700, Applied Biosystems
  • the samples were placed in the thermocycler (GeneAmp PCR System 2700, Applied Biosystems) for 5 minutes at 65°C. After the cycle, the samples were left on ice for 1 minute. Next, a second stage took place in which the reagents First Strand Buffer RT 5x (Invitrogen & Thermo Fischer Scientific Inc.), DTT (Invitrogen), HP-RNAse Inhibitor (Invitrogen) and MMLV-RT (200 U) were added. (Invitrogen) to each sample.
  • the samples were re-introduced into the thermocycler to carry out cDNA synthesis following 1 cycle comprised of three steps: 25°C for 10 minutes, 37°C for 50 minutes and 70°C for 15 minutes. Finally, the cDNA samples were stored at -20°C until later use.
  • RT-qPCR quantitative PCR technique
  • the expression levels of the genes of interest could be determined using the QUANTSTUDIO 3 system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc.). Reactions were performed in a total volume of 20 ⁇ L using 12 ng of cDNA, 900 nM of each primer, 200 nM of probe (Table 1), 10 ⁇ L of TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific Inc.), or 10 ⁇ L of SYBR Green PCR (Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific Inc.) if no probe will be used.
  • PCR conditions were 1 cycle of 2 min at 50°C and 10 min at 95°C, followed by 40 cycles at 95°C for 15 seconds and 60°C for 1 min.
  • Gene expression was analyzed by the 2-ACt or 2-AACt method where the 18S rRNA gene (Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific Inc.) or the ef1 ⁇ gene was used as endogenous control.
  • thermocycler GeneAmp PCR System 2700, Applied Biosystems
  • the amplification reactions were performed in a volume of 25 ⁇ L using the corresponding primers for each assay, specified in Table 2.
  • the PCR reaction comprised 0.5 ⁇ L of dNTPs (10 mM), 5 ⁇ L of GoTaq buffer polymerase (5x) (Promega Biotech), 0.125 ⁇ L GoTaq DNA polymerase (Promega Biotech), 2 ⁇ L MgCl2 (25mM), 0.5 ⁇ L each primer (20 pM), 2.5 ⁇ L cDNA, and the rest of H2O.
  • the conditions used were 1 cycle of 94°C for 5 minutes followed by 30 cycles of amplification at 94°C for 1 minute, specific melting temperature for each gene for 1 min and 72°C for 90 seconds. Finally, 1 cycle of extension at 72°C for 7 min was added.
  • PCR products were visualized on a 1.2% agarose gel (Pronadisa, LaboratoriosConda S.A., Madrid, Spain) stained with a GeIRed nucleic acid dye (Biotium, Inc. Fremont CA, USA) using a transilluminator. Gelprinter Plus (Iberlab, S. L. Cartagena, Spain).
  • siRNA sequences in the case of IFIT5 called silFIT5, they were designed and synthesized by Sigma-Aldrich.
  • RBCs were transfected with siRNAs by electroporation using the Neon transfection system (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Inc.) with a mixture of 3 silFIT5 sequences, indicated in Table 3.
  • RBCs were used 187 pmol of each siRNA per 5x105 cells resuspended in Buffer T (Neon Transfection System Kit, Life Technologies).
  • Buffer T Naon Transfection System Kit, Life Technologies
  • siGFP Sigma-Aldrich
  • IFIT5 silencing in RBCs was also determined by Western blot, using an anti-lFIT5 antibody at a dilution of 1/500.
  • the anti- ⁇ -actin antibody Sigma-Aldrich
  • Peroxidase-labeled goat versus mouse secondary antibody was used for anti-lFIT5, while a goat versus mouse secondary antibody was used for anti- ⁇ -actin. rabbit, also labeled with peroxidase.
  • an infection assay was performed where the RBCs transfected after 72 hours post-transfection (hpt) with silFIT5, were exposed to VHSV at MOI 1. After 3 hours, the RBCs were washed with fresh culture medium and incubated for 24 hours at 14°C. The cells were resuspended and stored in an appropriate buffer for RNA extraction with the ultimate goal of analyzing virus replication by measuring VHSV-N gene transcripts by RT-qPCR, as explained in sections 1.5 and 1.6.
  • the Westem-blot technique was used. To do this, a total of 6x10 6 RBCs distributed in 12 wells were transfected, with a ratio of 5x10 5 cells/well, with 187 pmol/well of silFIT5 or 187 pmol/well of siGFP and the cells were incubated for 72 hours at 14°C
  • the transfected samples were collected and washed three times with phosphate buffered saline (PBS) and then resuspended in 50 ⁇ L of PBS together with a cocktail of protease inhibitors (Sigma-Aldrich). Cells were then lysed by 3 freeze (-80°C)/thaw cycles followed by the use of micropistils (Sigma-Aldrich). The supernatants were clarified by centrifugation at 13,500 revolutions per minute (rpm), 5 minutes. Next, 40 ⁇ L of each sample was loaded with reducing loading buffer on 12% SDS-polyacrylamide gels under reducing conditions.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Electrophoresis was performed at 100V for 60 minutes.
  • the proteins in the gel were transferred to a nitrocellulose membrane (BioRad, Madrid, Spain) in a transfer buffer (2.5 mM Tris, 9 mM glycine and 20% methanol) for 120 minutes at 100V.
  • Membranes were later blocked with blocking buffer (8% milk powder and 1% Tween-20 in PBS) and incubated with the primary anti-lFIT5 antibody diluted 1/500 overnight at 4 °C Anti- ⁇ -actin antibody (Sigma-Aldrich) at 1/100 was used as endogenous control.
  • RBCs were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich) and 0.008% glutaraldehyde (Sigma-Aldrich) in culture medium for 1 hour. Cells were then permeabilized with 0.05% saponin (Sigma-Aldrich) diluted in PBS for 15 minutes. After permeabilization, the primary anti-IFIT5 antibody was diluted in the permeabilization buffer to 1/300, respectively, and incubated with the RBCs for 1 hour at room temperature. As a secondary antibody, fluorescein isothiadanate-conjugated goat anti-mouse IgG (GAM-FITC) was used at a 1/200 dilution. The incubation with the secondary antibody was 30 minutes. After incubation with the primary and secondary antibodies, the RBCs were washed with permeabilization buffer.
  • PFA paraformaldehyde
  • glutaraldehyde Sigma-Aldrich
  • the mRNA-derived cDNA sequence encoding IFIT5 protein (SEQ ID NO: 1) was synthesized by ShineGene (ShineGene Molecular Biotech Inc., Shanghai, China) and subcloned into the plasmid vector pmTFP1 (Aliele Biotechnology, ABP-FP- TCNCS) (SEQ ID NO: 3), which encodes fluorescent protein 1 (mTFP1). construction obtained (SEQ ID NO: 4), pmTFP1 -IFIT5 ( Figure 4), was used in the in vitro transfection experiments. The empty pmTFP1 plasmid was used as a control.
  • the Escherichia coli strain XL1-blue was transformed with the plasmid constructions by heat shock. Briefly, 100 ⁇ L of the bacterial solution were taken together with 2 ⁇ L of the pmTFP1-IFIT5 plasmid solution. Then, they were incubated on ice for 30 minutes and then heated at 42°C for 45 seconds. The samples were again placed on ice for 5 min. Next, 1 mL of LB (Luria-Bertani) medium (Sigma-Aldrich) was added and incubated in an orbital shaker at 250 rpm for 1 hour at 37°C.
  • LB Lia-Bertani
  • Plasmids were finally purified using the QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN Inc.). The DNA concentration was quantified with the NanoDrop spectrophotometer (Nanodrop Technologies Inc.). Analysis of DNA bands corresponding to the theoretical size of the plasmid was visualized on 0.8% agarose gels.
  • an infection assay with VHSV of the EPC cell line was performed.
  • 2 pg of the pmTFP1-IFIT5 plasmid and 0.25 pg of the control plasmid (pmTFP1) were used per 9x10 4 cells resuspended in Jampon R and the cells were incubated at 14°C for 2 days in RPMI 10% FBS. Subsequently, the transfected cells were infected with VHSV at MO1 10 2 .
  • Graphpad Prism 6 (www.graphpad.com) (Graphpad Software Inc., San Diego, CA) was used for graphing and statistical calculations. The statistical tests and the associated P values are indicated in the description of the figures in each trial.
  • Flow cytometry data were processed and analyzed using Flowing software 2.5.1 (www.flowingsoftware.com/).
  • the ImageLab v6.0.1 program (BioRad) was used to obtain the images from the Western blot.
  • a temporal follow-up was performed to determine the expression of the IFIT5 gene and protein in the RBCs at different times after exposure to VHSV by means of RT-qPCR and flow cytometry, respectively.
  • ifit5 gene transcripts began to increase at 3 hours post-exposure (hpe) in RBCs and these increases correlated with the time point of greatest replication of the VHSV-N gene. From 6 hpe, the levels of virus replication decrease, which coincided with the maximum level of expression of transcripts and IFIT5 protein (figures 1 A, B and C). After this time, both IFIT5 transcript and protein levels decreased ( Figures 1A and B), reaching baseline levels of ifit5 expression at 72 hpe ( Figure 1A).
  • Figure 1C shows the results of immunofluorescence of IFIT5 protein in RBCs exposed to VHSV at 6 hpe, as well as in unexposed RBCs, used as control. This assay allowed qualitative analysis of protein expression showing a higher expression of IFIT5 in RBCs exposed to VHSV compared to control RBCs. However, high basal expression was also observed in control cells.
  • ifit5 gene expression was analyzed in RBCs from rainbow trout individuals challenged with VHSV.
  • the results obtained showed that the RBCs from individuals of rainbow trout challenged with VHSV they significantly overexpressed the ifit5 gene with respect to the RBCs of control individuals (unchallenged) (FIG. 1D).
  • the challenged samples presented levels of expression of ifit526 times higher than the control samples.

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Abstract

La presente invención se refiere a la proteína IFIT5 para su uso como medicamento, particularmente para el tratamiento de enfermedades víricas en animales acuáticos, particularmente contra el virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV).

Description

DESCRIPCIÓN
IFIT5 para su uso como agente antiviral
La presente invención se refiere a una proteína con actividad antiviral, la proteína IFIT5, particularmente para el tratamiento de enfermedades víricas en animales acuáticos. La invención pertenece al campo técnico de la acuicultura.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En las últimas décadas la acuicultura parece ser la única alternativa real para el abastecimiento de pescado mundial. Su producción ha alcanzado los 110 millones de toneladas, dando lugar a una producción de pescado mundial procedente de la acuicultura del 54.5 % respecto del total, siendo este un 9% superior al de la pesca extractiva, según el informe de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) del 2017.
Sin embargo, uno de los aspectos más importantes que tiene que solventar esta industria es la protección de las poblaciones de peces cultivados frente a enfermedades causadas por bacterias y virus (Crane M, Hyatt A. Viruses. 2011;3(11):2025-46), ya que las pérdidas que se generan dan lugar a una disminución en la tasa de producción y rentabilidad económica (6 mil millones de dólares en pérdidas al año en todo el mundo) (Stentiford GD, et al., 2017, PLoSPathog, 13(2):e1006160). Es por ello que la búsqueda de compuestos antivirales eficaces frente a estos patógenos está siendo muy explorada en la actualidad.
Además, a diferencia de los mamíferos, el sistema inmune de los peces no está tan bien estudiado. Una de las principales diferencias entre el sistema inmune de los peces y de los mamíferos son los eritrocitos (en inglés Red Blood Cells o RBCs). Los RBCs nuclearios, característicos de peces, aves, anfibios y reptiles, además de desempeñar la función de intercambio de gases, se ha descrito que tienen un papel importante en diferentes procesos biológicos, incluyendo la respuesta inmune. En relación al sistema inmune se ha visto que los RBCs nuclearios son capaces de inducir una respuesta inmune frente a distintos patógenos incluyendo las infecciones víricas (Nombela I. and Ortega-Villaizan MDM., PLoS Pathog. 2018;14(4):e1006910). En estudios previos se ha observado que los RBCs de trucha arcoíris expuestos a virus, como el virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV) y virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), aumentaban los niveles expresión de algunas proteínas que participan en la respuesta inmune antiviral, como por ejemplo interferón tipo 1 (IFN 1 ) y estos aumentos se acompañaban de una reducción de los niveles de replicación vírica dentro de los RBCs (Nombela /., et al, 2017, F1000Res;6:1958).
Sin embargo, se hace necesario determinar que proteínas están involucradas en la actividad antiviral y desarrollar estrategias antivirales en la acuicultura.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una proteína con actividad antiviral, la proteína IFIT5 procedente de los eritrocitos (de aquí en adelante los “RBCs”) de la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) para su uso como medicamento, particularmente para el tratamiento de enfermedades víricas en animales acuáticos. Particularmente, dicha proteína tiene actividad antiviral frente al virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV).
Los inventores realizaron ensayos de inmunoprecipitación en muestras de RBCs expuestas a VHSV. De entre todas las proteínas identificadas, eligieron la proteína inducida por interferón con 5 repeticiones tetratricopeptídicas ( IFIT5) de secuencia SEQ ID NO: 2. Los resultados mostraron que existía una correlación entre la disminución de la replicación de VHSV y el aumento de la expresión de ifit5 (gen que codifica la proteína IFIT5 con secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1) en los RBCs de trucha arcoíris expuestos a VHSV (Figura 1). Posteriormente, el silenciamiento de ifit5 mediante ácido ribonucleico pequeño de interferencia (siRNA) mostró un aumento en la replicación de VHSV en los RBCs, indicando que IFIT5 estaba implicada en la actividad antiviral de los RBCs de trucha arcoíris frente a VHSV (Figura 2).
Finalmente, los inventores realizaron ensayos de transfección con un plásmido que codifica el gen IfitS en la línea celular epithelioma papulosum cyprini procedente de Pimephales promelas (EPC), para evaluar la actividad antiviral conferida por la sobreexpresión de IFIT5 frente a VHSV. Los resultados obtenidos mostraron una disminución de la replicación del virus en las células EPC transfectadas con el plásmido que contiene la secuencia del gen ifit5 (Figura 3). Estos resultados demuestran el uso de IFIT5 como agente terapéutico frente a las infecciones víricas en animales acuáticos.
Por tanto, en un primer aspecto de la invención se refiere a una proteína, de aquí en adelante el “proteína de la invención", que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la SEQ ID NO: 2, para su uso como medicamento, de aquí en adelante “el primer uso de la invención". En una realización particular el medicamento es un agente antiviral.
La secuencia SEQ ID NO: 2 corresponde a la proteína IFIT5, proteína que pertenece a la familia de proteínas inducidas por interferón tipo I (IFIT) y que, en la presente invención, se ha demostrado que participa en la inmunidad innata antiviral en animales acuáticos.
El término “proteína”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula formada por la unión, en un orden definido, de alfa-aminoácidos mediante un enlace peptídico. Se entenderá que los términos "enlace peptídico", "péptido", "polipéptido" y proteína son conocidos por los expertos en la materia. La proteína de la invención puede obtenerse por técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica, tales como síntesis química, recombinación genética o expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención.
La proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la SEQ ID NO: 2. En la presente invención, se entiende por “identidad” o “identidad de secuencia" al grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos obtenido mediante el alineamiento de las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST. Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, son de dominio público en la página web de The National Center for Biotechonology Information (NCBI). En una realización particular del primer uso de la invención, la proteína de la invención comprende una identidad de, al menos, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con la secuencia SEQ ID NO: 2. En otra realización todavía más particular, la proteína de la invención comprende una identidad de secuencia del 100%, o consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 2 para su uso como medicamento.
Como entiende el experto en la materia, todas las proteínas que presentan una identidad de, al menos, un 70% con la secuencia SEQ ID NO: 2 y que presentan la misma función que la proteína SEQ ID NO: 2, es decir, tienen actividad antiviral, son variantes funcionalmente equivalentes. Ensayos para identificar péptidos o proteínas funcionalmente equivalentes a la proteína de la invención son conocidas por el experto en la materia. Además, como entiende el experto en la materia, fragmentos de la proteína de la invención pueden conservar su función y por tanto usarse como medicamento.
Como entiende un experto en la materia, el gen ifít5 (secuencia SEQ ID NO: 1) que codifica para la proteína de la invención (la proteína IFIT5 de secuencia SEQ ID NO: 2), también puede usarse como medicamento.
Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a un ácido nucleico, de aquí en adelante el “ácido nucleico de la invención”, que comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la SEQ ID NO: 1, para su uso como medicamento. El término “identidad” ya ha sido descrito anteriormente en el presente documento, y aplica de igual modo a este aspecto inventivo.
En una realización particular, el ácido nucleico de la invención comprende una identidad de, al menos, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con la secuencia SEQ ID NO: 1.
En otra realización todavía más particular, el ácido nucleico de la invención comprende una identidad de secuencia del 100%, o consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 1 para su uso como medicamento. Como entiende un experto en la materia, el ácido nucleico de la invención para su uso como medicamento, puede estar comprendido en un vector o plásmido de expresión. Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector o plásmido, de aquí en adelante el “vector o plásmido de la invención" que comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la SEQ ID NO: 1, para su uso como medicamento.
El término “vector de expresión” o “plásmido de expresión", utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un determinado huésped y puede servir de vehículo para llevar a cabo la transcripción de una secuencia de interés que haya sido insertada en el mismo. El vector o plásmido de expresión puede incorporarse también en un cósmido, bacteriófago, un vector viral, sin excluir otro tipo de vectores que se corresponda con la definición realizada del vector.
En una realización particular de la presente invención, el vector o plásmido comprende una secuencia que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1.
Opcionalmente, el ácido nucleico de la invención puede estar unido de forma operativa a una secuencia de control de expresión en plásmido de la invención. A efectos de la presente invención, el término "unido de forma operativa", tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de control, por ejemplo, un promotor u operador, que se coloca de manera adecuada en una posición relativa a una secuencia de codificación de tal manera que la secuencia de control dirija la producción de un polipéptido codificado por la secuencia codificante.
Un vector o plásmido de expresión en el contexto de la presente invención puede ser cualquier vector o plásmido adecuado, incluyendo vectores de ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos y sintéticos (una secuencia de ácidos nucleicos que comprende un conjunto adecuado de elementos de control de expresión). Los ejemplos de dichos vectores incluyen derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos y vectores de ácidos nucleicos virales (ARN o ADN). En una realización particular, el vector plasmídico se selecciona de la lista que consiste en: pmTFP1, pCMV1.4, pcDNA, pAE6. En otra realización más particular el vector plasmídico es el vector pmTFP1 con secuencia SEQ ID NO: 3.
En otra realización particular, el vector plasmídico comprende la secuencia SEQ ID NO: 4.
Los vectores o plásmidos de expresión pueden comprender secuencias de control de expresión, diseñadas para controlar y dirigir la transcripción de genes de interés y la expresión posterior de proteínas en varios sistemas celulares o sitios de interés. Los plásmidos combinan una secuencia de nucleótidos o gen de interés expresable con secuencias de control de la expresión (es decir, casetes de expresión) que comprenden elementos deseables tales como, por ejemplo, promotores, potenciadores, marcadores seleccionares, operadores, etc.
Como entiende el experto en la materia, tanto la proteína, el ácido nucleico como el vector o plásmido de la invención, se puede usar como medicamento.
El término "medicamento", tal y como se usa en esta descripción, hace referencia a cualquier sustancia usada para la prevención, el diagnóstico, el alivio, el tratamiento o la curación de enfermedades en los animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica. En el contexto de la presente invención el medicamento comprende la proteína, el ácido nucleico o el plásmido de la invención o alterativamente a una composición que comprenda al menos, la proteína el ácido nucleico o el plásmido de la presente invención. La composición o medicamento al que se refiere la presente invención es preferiblemente de uso veterinario. A efectos de la presente invención, los términos “medicamento”, “composición farmaceútica” o “composición veterinaria", se emplean como sinónimos.
La proteína de la invención se formula en un medicamento o en una composición farmaceútica o veterinaria, en la cantidad terapéuticamente efectiva. En la presente invención la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la proteína, el ácido nucleico o el plásmido de la invención, según se ha descrito en párrafos anteriores, capaz de producir un efecto beneficioso en el animal, esto es, particularmente tratando o previniendo trastornos provocados por las infecciones virales. Dicha cantidad vendrá determinada por las características propias de los compuestos, la ruta, forma y frecuencia de administración de los mismos, y otros factores, incluyendo la edad, estado del animal, así como la severidad de la alteración o trastorno.
La proteína, el ácido nucleico o el plásmido de la invención se formulan en una composición veterinaria, en una cantidad terapéuticamente efectiva, preferiblemente junto con al menos un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptable y/u otro agente activo (por ejemplo, adyuvantes).
El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos y activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la fondón de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la fondón de endulzar, la fondón como colorante, la fondón de protecdón de la composidón, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la fundón de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentadón, como por ejemplo, es el caso del fosfato de caldo dibásico, la fondón desintegradora para facilitar la disoludón de los componentes y su absordón en el intestino, sin exduir otro tipo de exdpientes no mendonados en este párrafo.
El término “vehículo”, al igual que el excipiente, hace referencia a una sustancia que se emplea en la composición farmacéutica o veterinaria para diluir la proteína, el ácido nucleico o el plásmido de la presente invención comprendido en ella, hasta un volumen o peso determinado. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente.
En esta memoria, el término “adyuvante” se refiere a un agente que aumenta el efecto antiviral de la composición de la invención, cuando es suministrado de forma conjunta a éste o bien formando parte de un mismo protocolo de tratamiento. Los adyuvantes y vehículos que pueden ser utilizados en la composición veterinaria de la presente invención son los vehículos y adyuvante conocidos por los expertos en la materia. Como entiende un experto en la materia, el medicamento o composición se adaptará al tipo de administración utilizada, por ejemplo, la composición se puede presentar en forma de soluciones o cualquier otra forma de administración veterinariamente permitida y en una cantidad terapéuticamente efectiva. Así, la composición se puede administrar de forma oral, intramuscular, intraperitoneal, branquial, nasal, sanguínea, transdérmica o de forma directa (por inyección, por perfusión arterial o venosa, etc.) en la superficie de un órgano o tejido.
La composición veterinaria o medicamento que comprende la proteína, el ácido nucleico o el plásmido de la invención, tal como se ha descrito anteriormente, es preferiblemente de uso veterinario en animales acuáticos para el tratamiento y/o prevención de enfermedades víricas.
Por ello, otra realización particular se refiere a la proteína, el ácido nucleico o el plásmido de la invención, o en su caso a la composición veterinaria o medicamento anteriormente descrito, para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por virus en animales acuáticos.
El término "tratamiento", tal como se entiende en la presente invención, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de una enfermedad o condición patológica en un animal acuático, particularmente en la infección por virus, que incluye inhibir la enfermedad o detener su desarrollo, aliviar la enfermedad o causar la regresión de la enfermedad o su sintomatología y/o estabilizar la enfermedad. El término "prevención", tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de daños cuya causa sea la infección vírica.
Ejemplos de enfermedades causadas por virus incluyen, sin limitar a, la necrosis hematopoyética infecciosa, la septicemia hemorrágica vírica, la necrosis pancreática infecciosa, la anemia infecciosa del Salmón, la inflamación del músculo esquelético y cardiaco u otras enfermedades causadas por virus acuáticos.
Ejemplos de virus que causan enfermedades o patologías en los animales acuáticos incluyen, sin limitar a, el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), el virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV), el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), el alfavirus de salmónidos 2 (SAV2), el ortoreovirus acuático (PRV), el virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV), u otros virus que infecten a animales acuáticos.
En otra realización particular de la presente invención, la enfermedad es causada por el virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV) o el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), preferiblemente es causada por el virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV).
Tal como se ha descrito en párrafos anteriores, la proteína, el ácido nucleico o el plásmido de la invención o en su caso a la composición veterinaria o medicamento se usan en el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por virus en animales acuáticos.
El término “animal acuático” tal como se usa en la presente invención, se refiere a cualquier organismo multicelular que vive en el agua, particularmente se refiere a los peces. Preferiblemente, el animal acuático es un animal perteneciente a una especie de pez cultivada mediante acuicultura. Ejemplos de peces cultivados mediante acuicultura incluyen, sin limitar a, salmónidos (truchas, salmones, etc.), ciprínidos (carpas), rodaballos, corvina, lenguado, atún rojo, besugo, serióla, anguilas, doradas o lubinas,
En otra realización particular del uso de la proteína, el ácido nucleico o el plásmido de la invención o en su caso de la composición veterinaria o medicamento, los animales acuáticos pertenecen a la familia de los salmónidos (Salmonidaé) o a la familia de los ciprínidos (Cyprinidae).
En otra realización más particular, los salmónidos se seleccionan de la lista que consiste en: trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss); salmón real (Oncorhynchus tshawytscha); salmón coho (Oncorhynchus kisutch); salmón del Atlántico (Salmo salar); trucha común (Salmo truttá); tímalo (Thymallus thymallus); coregones (Coregonus spp.); keta (Oncorhynchus keta); salmón rojo (Oncorhynchus nerká); trucha lacustre (Salvelinus namaycush); trucha de arroyo (Salvelinus fontinalis); y trucha alpina (Salvelinus alpines).
En otra realización aún más particular, el salmónido es la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss). En otra realización más particular, los ciprínidos se seleccionan de la lista que consiste en: bremas comunes (Abramis); alburnos (Alburnus); jarabugo (Anaecypris); carpita azteca (Azteculá); barbos comunes (Barbus); brema blanca (Blicca); rodapiedras (Campostoma); carpas comunes (Cyprinus) y carpita (Pimephales).
En otra realización aún más particular, la carpita (Pimephales) se selecciona de la lista que consiste en: Pimephales notatus, Pimephales promelas, Pimephales tenellus y Pimephales vigilaa, más preferiblemente es Pimephales promelas.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por un virus en animales acuáticos, de aquí en adelante el “método de la invención", que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína que comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos un 70%, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% con la SEQ ID NO:2, o de un ácido nucleico que comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos un 70%, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% con la SEQ ID NO: 1 o de un plásmido que comprende dicho ácido nucleico, o en su caso una composición veterinaria que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína que comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos un 70%, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% con la SEQ ID NO:2, o de un ácido nucleico que comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos un 70%, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% con la SEQ ID NO: 1 o de un plásmido que comprende dicho ácido nucleico.
Los términos “tratamiento", “prevención”, “animal acuático” y “cantidad terapéuticamente efectiva” han sido descritos anteriormente en el presente documento, y aplican de igual a este aspecto inventivo, así como sus realizaciones particulares (solas o en combinación).
En una realización particular del método de la invención, la enfermedad causada por virus es causada por el virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV).
En otra realización particular del método de la invención, los animales acuáticos pertenecen a la familia de los salmónidos (Salmonidaé) o a la familia de los ciprínidos (Cyprinidaé). En otra realización más particular del método de la invención, los salmónidos se seleccionan de la lista que consiste en: trucha arcoíris (Oncorhynchos mykiss); salmón real (Oncorhynchos tshawytschá); salmón coho (Oncorhynchos kisutch); salmón del Atlántico (Salmo salar); trucha común (Salmo trotta); tímalo (Thymallos thymallos); coregones (Coregonus spp.); keta (Oncorhynchos Reta); salmón rojo (Oncorhynchos nerka); trucha lacustre (Salvelinus namaycosh); trucha de arroyo (Salvelinus fontinalis) y trucha alpina (Salvelinus alpines); preferiblemente el salmónido es la trucha arcoíris (Oncorhynchos mykiss).
En otra realización más particular del método de la invención, los ciprínidos se seleccionan de la lista que consiste en: bremas comunes (Abramis); alburnos (Albornos); jarabugo (Anaecypris); carpita azteca (Aztecula); barbos comunes (Barbos); brema blanca (Biloca); rodapiedras (Campostoma); carpas comunes (Cyprinos) y carpita (Pimephales).
En otra realización aún más particular del método de la invención, la carpita (Pimephales) se selecciona de la lista que consiste en: Pimephales notatos, Pimephales promelas, Pimephales tenellus y Pimephales vigilax, más preferiblemente es Pimephales promelas.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una proteína que comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la SEQ ID NO: 2, o en su caso una composición veterinaria que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína que comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la SEQ ID NO: 2, para la elaboración de un medicamento, preferiblemente para el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por virus en animales acuáticos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un ácido nucleico que comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la SEQ ID NO: 1 o en su caso una composición veterinaria que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un ácido nucleico que comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la SEQ ID NO:1, para la elaboración de un medicamento, preferiblemente para el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por virus en animales acuáticos.
Como entiende un experto en la materia, el ácido nucleico descrito en el párrafo anterior, puede estar comprendido en un vector o plásmido de expresión. Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un plásmido o vector que comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la SEQ ID NO:1.
La proteina, el ácido nucleico y el vector de la invención, así como la composición de la invención, así como los términos “tratamiento”, “prevención”, “animal acuático”, “cantidad terapéuticamente efectiva" y “animales acuáticos", han sido descritos anteriormente en el presente documento, y aplican de igual a este aspecto inventivo, así como sus realizaciones particulares (solas o en combinación).
Una realización particular de la presente invención se refiere al uso de un plásmido o vector que comprende la secuencia que consiste en SEQ ID NO:1.
Otra realización particular, se refiere al uso del plásmido o vector que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Seguimiento temporal del gen ifit5 en los RBCs de trucha arcoíris expuestos a VHSV. (A) La expresión génica se normalizó utilizando el gen ef1α y se relativizó respecto a las células control (células no expuestas a VHSV o no infectadas). Los datos representan la media ± la desviación estándar (DE), n=7 (RBCs). El test de comparación múltiple de Tukey se realizó para el análisis estadístico entre todos los puntos temporales. *, ** y **** indican los p-valores< 0,05, <0,01 y <0,0001, respectivamente, para N-VHSV. (B) Expresión de la proteína IFIT5 en RBCs expuestos a VHSV MO1 1, a 6 y 24 hpe, analizada mediante citometría de flujo. La gráfica muestra la intensidad media de la fluorescencia (MFI). Los datos representan la media ± DE, n=4. Para el análisis estadístico se empleó el test de Kruskal-Wallis, con el test de Dunn de múltiples comparaciones (*: p-valor<0,05). (C) Inmunofluorescencia de IFIT5 en los RBCs expuestos a VHSV MO1 1, a 6 horas post-exposición (6 hpe). Las imágenes se tomaron con un aumento de 60X. Como control se utilizaron RBCs no expuestos al virus. (D) Expresión génica de ifit5 RBCs procedentes de truchas arcoíris desafiados con VHSV (o no desafiados, como control) a 2 dias post-desafío (dpd). Como control endógeno se usó el gen ef1α y los datos representan la media ± DE, n=6. Se aplicó el test de Mann- Whitney para el análisis estadístico (**: p-valor<0,01).
Figura 2. Análisis del silenciamiento génico de ifit5 en RBCs electroporados con siARN. (A) Los RBCs se incubaron con las secuencias silFIT5 durante 72 horas y la expresión del gen se evaluó por RT-PCR semicuantitativa. Como control negativo se usó siGFP y como control de gen endógeno, el gen gapdh. “C” muestra los RBCs electroporados sin siARN. (B) Análisis del silenciamiento de IFIT5 a nivel de proteína mediante Westem- blot. El control de proteínas endógeno fue la α-actina. (C) Porcentaje de expresión del gen N-VHSV en RBCs expuestos a VHSV MOI 1 durante 24 horas tras el tratamiento con silFIT5. La expresión génica se evaluó mediante RT-qPCR y como control endógeno se empleó el rARN 18S. Los datos representan la media ± DE, n = 3. Para el análisis estadístico se realizó el test de Wilcoxon de prueba de rangos con signo (***, p- valor <0,001).
Figura 3. Evaluación de la replicación de VHSV en las células EPC transfectadas con 2 μg de pmTFP1-IFIT5 a 2 días post-transfecdón analizado mediante RT-qPCR. La expresión génica de N-VHSV se normalizó usando el gen endógeno ef1α y se relativizó respecto a las células control (células no infectadas). El control positivo (+) se refiere a las células infectadas, pero no transfectadas con el plásmido. pmTFP1 a 0,25 pg se usó como control de referencia de la transfección. Los datos representan la media ± la desviación estándar (DE), n=2. Para en análisis estadístico se realizó un test Kruskal- Wallis, con el test de Dunn de múltiples comparaciones (**, p-valor <0,01).
Figura 4. Representación gráfica del vector plasmídico pmTFP1 clonado con el gen ifit5 de trucha arcoíris.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
1. MATERIALES Y MÉTODOS
1.1 Animales
Los individuos de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) de aproximadamente 6-7 cm se adquirieron de una granja comercial libre de patógenos (Piszolla SL, Cimballa Fish Farm, Zaragoza, España) y se mantuvieron en las instalaciones de la Universidad Miguel Hernández de Elche (UMH) a 14°C, con un sistema recirculante de agua declorada y alimentados diariamente. Antes de la experimentación, los peces se aclimataron a las condiciones del laboratorio durante 2 semanas.
1.2 Purificación de RBCs y cultivos celulares
Los RBCs se obtuvieron a partir de sangre periférica de truchas arcoíris sacrificadas por sobreexposición a tricaína (metanosulfonato de tricaína) (Sigma-Aldrich) a una concentración de 0,3 g/L. Posteriormente, se tomaron muestras de sangre periférica de la vena caudal mediante jeringuillas (NIPRO, Bridgewater, NJ). Las muestras de sangre se depositaron en un eppendorf de 2 mL en medio RPMI-1640 (modificación Dutch) (Gibco, Thermo Fischer Scientific Inc., Carlsbad, CA), suplementario con 10% de suero fetal bovino (FBS) irradiado con rayos gamma (Cultek, Madrid, España), 1 mM de piruvato (Gibco), 2 mM de L-glutamina (Gibco), 50 pg/mL de gentamicina (Gibco) y 2 pg/mL de fungizona (Gibco), 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina (Sigma-Aldrich).
A continuación, los RBCs se purificaron mediante dos centrifugaciones de gradiente de densidad de Ficoll consecutivas (7206 g, Ficoll 1.007; Sigma-Aldrich). Los RBCs purificados se cultivaron en el medio indicado anteriormente en botes de 25 mL a 14°C durante 24 horas antes de la experimentación. La cepa VHSV 07.71 usada en los experimentos, se adquirió de la ATCC (ATCC VR-1388) y se cultivó en células de EPC a 14°C como se describe en Basurco B., etal, 1998, Bulletin European Association Fish Pathologists; 9:p92-5.
1.3 Seguimiento temporal de la expresión de ifit5 en respuesta a VHSV en RBCs de trucha areoíris
Para determinar la expresión del gen ifit5 (SEQ ID NO: 1), los RBCs purificados por Ficoll (1x106 células/pocillo) se incubaron con VHSV a una multiplicidad de infección (MOI) 1 en RPMI 2% FBS y MEM 2% FBS, respectivamente, a 14°C. Después de 3 horas a los RBCs se les retiró el medio con el virus y se añadió medio nuevo con el fin de eliminar el virus no adherente. Posteriormente, las células se almacenaron en un lampón apropiado para la extracción de ARN a diferentes tiempos después de la exposición al virus (3, 6, 24 y 72 horas). Los niveles de expresión de los genes N-VHSV e ifit5 se analizaron mediante PCR cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR) utilizando cebadores específicos de la Tabla 1.
Figure imgf000016_0001
1.4 Desafio de individuos de trucha areoíris con VHSV
Los individuos jóvenes de trucha areoíris se desafiaron mediante inyección intramuscular con 50 μL de VHSV (108 TCID50/mL) en medio RPMI 2% FBS (Sigma- Aldrich). Como control negativo se inyectaron 50 μL de RPMI 2% FBS estéril. En el transcurso del desafío, los individuos se mantuvieron a 14°C durante 2 días. Posteriormente, los RBCs extraídos se purificaron, como se ha comentado en el apartado 1.2, con el fin último de analizar la expresión génica de ifit5 por RT-qPCR.
1.5 Aislamiento de ARN, síntesis de ADN complementario y RT-PCR
Para la extracción de ARN se usó el kit E.Z.N.A. de ARN (Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se realizó un tratamiento con ADNsa con el fin de eliminar el ADN genómico residual usando el kit TURBO ADNse (Ambion, Thermo Fischer Scientific Inc.) siguiendo las instrucciones descritas por el fabricante. El ARN se cuantificó con el espectrofotómetro NanoDrop (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE).
Luego, se realizó la síntesis de ADN complementario (ADNc), usando la enzima M-MLV transcriptasa reversa (Invitrogen & Thermo Fischer Scientific Inc.). La reacción de RT- PCR abarca en primer lugar la incubación del ARN en presencia de dNTPs 10 mM y Random hexamers (50-250 ng) u Oligodt (en el caso del silenciamiento génico) como cebadores.
Las muestras se introdujeron en el termociclador (GeneAmp PCR System 2700, Applied Biosystems) durante 5 minutos a 65°C. Finalizado el ciclo, las muestras se dejaron en hielo durante 1 minuto. A continuación, tuvo lugar una segunda etapa en la cual se añadieron los reactivos First Strand Buffer RT 5x (Invitrogen & Thermo Fischer Scientific Inc.), DTT (Invitrogen), HP-ARNse Inhibitor (Invitrogen) y MMLV-RT (200 U) (Invitrogen) a cada muestra. Las muestras se volvieron a introducir en el termociclador para llevarse a cabo la síntesis de ADNc siguiendo 1 ciclo comprendido en tres pasos: 25°C durante 10 minutos, 37°C durante 50 minutos y 70°C durante 15 minutos. Finalmente, las muestras de ADNc fueron guardadas a -20°C hasta su posterior uso.
1.6 PCR cuantitativa (RT-qPCR)
Mediante la técnica de PCR cuantitativa (RT-qPCR), se pudieron determinar los niveles de expresión de los genes de interés empleando para ello el sistema QUANTSTUDIO 3 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc.). Las reacciones se realizaron en un volumen total de 20 μL en el que se utilizaron 12 ng de ADNc, 900 nM de cada cebador, 200 nM de sonda (Tabla 1),10 μL de mezcla maestra universal de PCR TaqMan (Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific Inc.) o 10 μL de PCR SYBR Green (Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific Inc.) en el caso de que no se usará sonda. Las condiciones de PCR empleadas fueron 1 ciclo de 2 min a 50°C y 10 min a 95°C, seguido por 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 min. La expresión génica se analizó mediante el método 2-ACt o 2-AACt donde se usó el gen rARN 18S (Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific Inc.) o el gen ef1α como control endógeno.
1.7 PCR semicuantitativa (RT-PCR)
Para la PCR semicuantitativa se empleó el termociclador (GeneAmp PCR System 2700, Applied Biosystems). Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen de 25 μL usando los cebadores correspondientes para cada ensayo, especificados en la Tabla 2. Para ello, la reacción de PCR comprendía 0,5 μL de dNTPs (10 mM), 5 μL de buffer GoTaq polimerasa (5x) (Promega Biotech), 0,125 μL de GoTaq ADN polimerasa (Promega Biotech), 2 μL de MgCI2 (25mM), 0,5 μL de cada cebador (20 pM), 2,5 μL de ADNc y el resto de H2O. Las condiciones empleadas fueron 1 ciclo de 94°C durante 5 minutos seguidos de 30 ciclos de amplificación a 94°C durante 1 minuto, temperatura de fusión específica para cada gen durante 1 min y 72°C durante 90 segundos. Finamente se añadió 1 ciclo de extensión a 72°C durante 7 min.
Figure imgf000018_0001
Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa (Pronadisa, LaboratoriosConda S.A., Madrid, España) al 1,2% teñido con un colorante de ácidos nucleicos GeIRed (Biotium, Inc. Fremont CA, EE.UU.) mediante un transiluminador Gelprinter Plus (Iberlab, S. L. Cartagena, España).
1.8 Ensayos de silenciamiento génico Las secuencias de ARN pequeño de interferencia o ARN de silenciamiento (siARN): en el caso de IFIT5 denominadas silFIT5, fueron diseñadas y sintetizadas por Sigma- Aldrich.
Los RBCs se transfectaron con los siARN mediante electroporación utilizando el sistema de transfección Neon (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Inc.) con una mezcla de 3 secuencias silFIT5, indicadas en la Tabla 3. Para cada reacción de electroporación, en RBCs, se usaron 187 pmol de cada siARN por 5x105 células resuspendidas en Tampón T (Neon Transfection System Kit, Life Technologies). Como control negativo, se utilizaron 187 pmol de siGFP (Sigma-Aldrich). Los RBCs se electroporaron y se incubaron a 14°C, durante 72 horas. Transcurrido este tiempo, se evaluó el silenciamiento del gen a nivel de transcripción. El silenciamiento de IFIT5 en RBCs fue analizado mediante RT-PCR semicuantitativa siguiendo el procedimiento descrito en los apartados 1.5 y 1.7.
Figure imgf000019_0001
A nivel de proteína, el silenciamiento de IFIT5 en RBCs también se determinó mediante Westem-blot, utilizando un anticuerpo anti-lFIT5 a una dilución de 1/500. Como control endógeno, se empleó el anticuerpo anti-α-actina (Sigma-Aldrich) a 1/100. El anticuerpo secundario de cabra frente a ratón marcado con peroxidasa se empleó para anti-lFIT5, mientras que para anti-α-actina se usó un anticuerpo secundario de cabra frente a conejo, también marcado con peroxidasa.
Por otra parte, se realizó un ensayo de infección donde los RBCs transfectados tras 72 horas post-transfectión (hpt) con silFIT5, fueron expuestos a VHSV a MOI 1. Después de 3 horas, los RBCs se lavaron con medio de cultivo fresco y se incubaron durante 24 horas a 14°C. Las células se resuspendieron y almacenaron en un tampón apropiado para la extraction de ARN con el fin último de analizar la replication del virus midiendo los tránscritos del gen N-VHSV mediante RT-qPCR, según se ha explicado en los apartados 1.5 y 1.6.
1.9 Westem-Blot
Con el objetivo de corroborar el silenciamiento de la proteína IFIT5 en los RBCs transfectados con silFIT5, se utilizó la técnica Westem-blot. Para ello, se transfectaron un total de 6x106 de RBCs repartidos en 12 pocilios, con una proporción de 5x105 células/pocillo, con 187 pmol/pocillo de silFIT5 o 187 pmol/pocillo de siGFP y las células se incubaron durante 72 horas a 14°C.
Seguidamente, las muestras transfectadas fueron recogidas y lavadas tres veces con lampón fosfato salino (PBS) y, seguidamente, se resuspendieron en 50 μL de PBS junto con un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma-Aldrich). A continuación, las células se lisaron mediante 3 ciclos de congelación (-80°C) /descongelación seguido del uso de micropistilos (Sigma-Aldrich). Los sobrenadantes fueron clarificados mediante centrifugación a 13.500 revoluciones por minuto (rpm), 5 minutos. A continuación, se cargaron 40 μL de cada muestra con buffer de carga reductor en geles de SDS- poliacrilamida al 12% en condiciones reductores.
La electroforesis se realizó a 100V durante 60 minutos. Para la transferencia, las proteínas en el gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (BioRad, Madrid, España) en un tampón de transferencia (Tris 2,5 mM, glicina 9 mM y metanol 20%) durante 120 minutos a 100V. Más tarde, las membranas se bloquearon con un tampón de bloqueo (8% de leche en polvo y 1% de Tween-20 en PBS) y se incubaron con el anticuerpo primario anti-lFIT5 diluido a 1/500 durante toda la noche a 4°C. Como control endógeno se usó el anticuerpo anti- α- actina (Sigma-Aldrich) a 1/100. Una vez finalizado el tiempo de incubadón con el anticuerpo primario, se realizaron 3 lavados de 10 minutos, empleando un tampón de lavado (0,5% de leche en polvo y 0,5% de Tween-20 en PBS) y las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario de cabra frente a ratón para anti-IFIT5 o de cabra frente a conejo para anti-α-actina, conjugados con peroxidasa, durante 45 minutos. Por último, se repitieron los 3 lavados de 10 minutos. La actividad de la peroxidasa se detectó usando reactivos de quimioluminiscencia ECL (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) y empleando el sistema ChemiDoc (BioRad).
1.10 Inmunofluorescencia y citometría de flujo
Los RBCs se fijaron con paraformaldehído (PFA) (Sigma-Aldrich) al 4% y glutaraldehído (Sigma-Aldrich) al 0,008 % en medio de cultivo durante 1 hora. Después, las células se permeabilizaron con saponina al 0,05% (Sigma-Aldrich) diluida en PBS durante 15 minutos. Tras la permeabilización, el anticuerpo primario anti-IFIT5 fue diluido en el lampón de permeabilización a 1/300, respectivamente y se incubaron con los RBCs durante 1 hora a temperatura ambiente. Como anticuerpo secundario, se utilizó el anticuerpo anti-lgG de ratón producido en cabra conjugado con isotiodanato de fluoresceína (GAM-FITC) a una dilución 1/200. La incubación con el anticuerpo secundario fue de 30 minutos. Posterior a la incubación con el anticuerpo primario y secundario, los RBCs se lavaron con tampón de permeabilización.
Por último, se realizó la fijación final con PFA al 1% en PBS y los RBCs fueron analizados mediante citometría de flujo usando el citómetro FACSCanto II (BD Biosciencies) y microscopía de fluorescencia mediante el sistema de imagen IN Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). Apuntar que, previo al análisis de inmunofluorescencia (IF), los RBCs se incubaron con 4’,6-diamino-2- fenilindol (DAPI) (1/300) (Sigma-Aldrich) para teñir el núcleo celular.
1.11 Plásmidos
La secuencia de ADNc derivada del ARNm que codifica la proteína IFIT5 (SEQ ID NO: 1) fue sintetizada por ShineGene (ShineGene Molecular Biotech Inc., Shanghái, China) y se subclonó en el vector plasmídico pmTFP1 (Alíele Biotechnology, ABP-FP-TCNCS) (SEQ ID NO: 3), el cual codifica la proteína fluorescente 1 (mTFP1). La construcción obtenida (SEQ ID NO: 4), pmTFP1 -IFIT5 (Figura 4), se utilizó en los experimentos in vitro de transfección. El plásmido pmTFP1 vacio se empleó como control.
Para la producción de los plásmidos se transformó la cepa XL1-blue de Escherichia coli, con las construcciones plasmídicas mediante choque térmico. Brevemente, se tomaron 100 μL de la solución bacteriana junto con 2 μL de la solución del plásmido pmTFP1 - IFIT5. Luego, se incubaron en hielo durante 30 minutos para posteriormente calentar a 42°C durante 45 segundos. Nuevamente, las muestras se volvieron a poner en hielo 5 minutos. A continuación, se añadió 1 mL de medio LB (Luria-Bertani) (Sigma-Aldrich) y se incubaron en un agitador orbital a 250 rpm durante 1 hora a 37°C.
Posteriormente, se tomaron 50 μL y se sembraron en placas de LB-agar con ampicilina (Sigma-Aldrich) donde se incubaron toda la noche. Las colonias obtenidas en las placas de agar se sembraron en 200 mL de LB suplementado con ampicilina y se incubaron en un agitador orbital a 250 rpm a 37°C durante toda la noche.
Finalmente se purificaron los plásmidos utilizando el kit QIAGEN Plasmid Midi (QIAGEN Inc.). La concentración de ADN se cuantificó con el espectrofotómetro NanoDrop (Nanodrop Technologies Inc.). El análisis de las bandas de ADN correspondientes al tamaño teórico del plásmido se visualizó en geles de agarosa al 0,8%.
1.12 Ensayo de infección con VHSV de la línea celular EPC tras la transfección con los plásmidos
Con el fin de evaluar de forma preliminar la protección conferida por la construcción plasmídica transfectada, se realizó un ensayo de infección con VHSV de la línea celular EPC. Para cada reacción de electroporation se utilizaron 2 pg del plásmido pmTFP1 - IFIT5, y 0,25 pg del plásmido control (pmTFP1) por 9x104 células resuspendidas en Jampón R y las células se incubaron a 14°C durante 2 días en RPMI 10% FBS. Posteriormente, las células transfectadas se infectaron con VHSV a MO1 102. Después de 1 hora, las células se lavaron con medio nuevo con el fin de eliminar el virus no adherente y se incubaron a 14°C durante 24 horas en RMPI 2% FBS. Los niveles de expresión de los genes N-VHSV se analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). 1.13 Programas informáticos y estadística
El programa Graphpad Prism 6 (www.graphpad.com) (Graphpad Software Inc., San Diego, CA) se utilizó para la representación gráfica y los cálculos estadísticos. Las pruebas estadísticas y los valores P asociados se indican en la descripción de las figuras en cada ensayo. Los datos de citometría de flujo se procesaron y analizaron utilizando el programa Flowing software 2.5.1 (www.flowingsoftware.com/). Para la obtención de las imágenes provenientes del Western-blot se usó el programa ImageLab v6.0.1 (BioRad).
2. RESULTADOS
2.1 Expresión de IFIT5 tras la exposición in vitro o desafío in vivo con VHSV
En primer lugar, se realizó un seguimiento temporal para determinar la expresión del gen y de la proteína IFIT5 en los RBCs a diferentes tiempos tras la exposición a VHSV mediante RT-qPCR y citometría de flujo, respectivamente. Tal y como se puede observar en la figura 1A, los tránscritos del gen ifit5 comenzaron a aumentar a las 3 horas post-exposición (hpe) en los RBCs y estos aumentos se correlacionaban con el punto temporal de mayor replicación del gen N-VHSV. A partir de las 6 hpe, los niveles de replicación del virus disminuyen, lo que coincidió con el máximo nivel de expresión de tránscritos y de proteína IFIT5 (figuras 1 A, B y C). Después de este tiempo, tanto los niveles de tránscritos como de proteína IFIT5 disminuyeron (figuras 1A y B) alcanzando los niveles básales de expresión de ifit5 a 72 hpe (figura 1A).
En la figura 1C se muestran los resultados de la inmunofluorescencia de la proteína IFIT5 en RBCs expuestos a VHSV a 6 hpe, así como en RBCs no expuestos, usados como control. Este ensayo permitió analizar cualitativamente la expresión de la proteína mostrando una mayor expresión de IFIT5 en RBCs expuestos a VHSV en comparación con los RBCs control. No obstante, también se observó una alta expresión basal en las células control.
Por otra parte, se analizó la expresión génica de ifit5 en los RBCs procedentes de individuos de trucha arcoíris desafiados con VHSV. Los resultados obtenidos mostraron que los RBCs provenientes de individuos de trucha arcoíris desafiados con VHSV sobreexpresaban significativamente el gen ifit5 respecto a los RBCs de individuos control (no desafiados) (figura 1 D). En concreto, las muestras desafiadas presentaron niveles de expresión de ifit526 veces superiores respecto a las muestras control.
2.2 El efecto del silenciamiento del gen ifit5 en los RBCs
Para evaluar el papel de IFIT5 en los mecanismos antivirales de los RBCs de trucha arcoíris, se realizaron ensayos de silenciamiento génico de ifit5 utilizando siARN. Para comprobar el silenciamiento del gen y la proteína IFIT5, se evaluó su expresión en los RBCs tratados con siARN por RT-PCR semicuantitativa (figura 2A) y por Westem-blot (figura 2B), respectivamente. Los resultados mostraron una disminución tanto a nivel de tránscritos como de proteína en las muestras tratadas con sil FIT5. Posterior al silenciamiento, se realizó un ensayo de infección de los RBCs con VHSV en los RBCs silenciados con sil FIT5 y la expresión del gen N-VHSV se evaluó mediante RT-qPCR. El resultado se representa en la figura 2C donde se observa un aumento significativo de la replicación vírica en los RBCs pretratados con las secuencias sil FIT5. Este resultado reforzaría el papel antiviral de IFIT5 en los RBCs.
2.3 Evaluación de la protección frente a VHSV tras la transfección con el plásmido pmTFP1 -IFIT5 en la línea celular EPC
Con el objetivo de evaluar si la sobreexpresión de IFIT5 a través de la transfección con el plásmido pmTFP1-IFIT5 era capaz de disminuir la infección por VHSV en las células EPC, las cuales son susceptibles a la infección por este virus, se realizó un ensayo de infección con VHSV en las células EPC transfectadas con pmTFP1 -IFIT5. Los resultados representados gráficamente en la figura 3 mostraron una disminución importante en la replication de VHSV en las células EPC transfectadas con pmTFP1 - IFIT5 tras 24 horas post-infección (hpi), por lo tanto, se corrobora así la actividad antiviral de IFIT5 frente a VHSV, observada anteriormente en los RBCs. Estos resultados abren una vía de investigación hacia la potencial aplicación terapéutica de IFIT5 frente a VHSV.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Proteína que comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos un 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% con la SEQ ID NO:2 o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína y que comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con la SEQ ID NO: 1, para su uso como medicamento.
2. Proteína para su uso según la reivindicación 1 que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 2.
3. Proteína o ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde dicha proteína o ácido nucleico están comprendidos en una composición.
4. Proteína o ácido nucleico descritos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por el virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV) en animales acuáticos.
5. Proteína o ácido nucleico para su uso según la reivindicación 4 donde los animales acuáticos pertenecen a la familia de los salmónidos (Salmonidae) o a la familia de los ciprínidos (Cyprinidae).
6. Proteína o ácido nucleico para su uso según la reivindicación 5 donde los salmónidos se seleccionan de la lista que consiste en: trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss); salmón real (Oncorhynchus tshawytscha); salmón coho (Oncorhynchus kisutch); salmón del Atlántico (Salmo salar); trucha común (Salmo trutta); tímalo (Thymallus thymallus); coregones (Coregonus spp.); keta (Oncorhynchus keta); salmón rojo (Oncorhynchus nerka); trucha lacustre (Salvelinus namaycush); trucha de arroyo (Salvelinus fontinalis) y trucha alpina (Salvelinus alpines).
7. Proteína o ácido nucleico para su uso según la reivindicación 6 donde el salmónido es la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss).
8. Proteína o ácido nucleico para su uso según la reivindicación 5 donde los ciprínidos se seleccionan de la lista que consiste en: bremas comunes (Abramis); alburnos (Alburmus); jarabugo (Anaecypris); carpita azteca (Aztecula); barbos comunes (Barbus); brema blanca (Biloca); rodapiedras (Campostoma); carpas comunes (Cyprinus) y carpita (Pimephales).
9. Proteína o ácido nucleico para su uso según la reivindicación 8 donde el ciprínido se selecciona de la lista que consiste en: Pimephales notatus, Pimephales promelas, Pimephales tenellus y Pimephales vigilax.
10. Proteína o ácido nucleico para su uso según la reivindicación 9 donde el ciprínido es Pimephales promelas.
11. Proteína o ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, donde la composición además comprende al menos un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptable y/u otro agente activo.
PCT/ES2021/070821 2020-11-13 2021-11-15 Ifit5 para su uso como agente antiviral WO2022101538A1 (es)

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