KR20140064847A - 백신용 분자 아쥬반트로서 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 펩타이드의 용도 - Google Patents

백신용 분자 아쥬반트로서 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 펩타이드의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 펩타이드 (PACAP)를 백신용 분자 아쥬반트로 사용하는 것에 관한 것이다. 다른 응용예들 중에서도, 상기 백신은 포유류, 조류 및 수중 생물들에 영향을 주는 바이러스, 박테리아 및 체외기생충과 같은 감염원들에 대한 보호에 사용될 수 있다. 특정 항원과 조합된 PACAP은 상기 항원에 대한 숙주 면역 반응을 증가시키는 아쥬반트로서 효과적임이 입증되었다. 이러한 유형의 반응은, PACAP를 포함하는 백신 조성물 또는 조합이 경구, 주사, 또는 수중 생물의 경우에는 침지 배쓰에 의해서 투여되는 경우에 관찰될 수 있다.

Description

백신용 분자 아쥬반트로서 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 펩타이드의 용도 {Use of the PACAP as a molecular adjuvant for vaccines}
본 발명은 의약, 분자 생물학 및 면역학 분야에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 백신 및 백신용 아쥬반트 (adjuvant)의 개발에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 면역화 방법에 사용되는, 백신용 분자 아쥬반트로서 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 펩타이드 (pituitary adenylate cyclase activating peptide, PACAP)의 용도를 개시한다.
백신 접종의 주된 목적은 병원균에 대해서 특이적이고 효과적인 면역 반응을 유도하는 것으로서, 이는 또한 감염 및/또는 질병에 대한 보호를 유발하고, 그 제거로 이어진다. 백신 제제에 소정 화합물들을 첨가함으로써 특정 항원에 대한 면역 반응이 향상될 수 있다는 개념은, 알루미늄 염이 제제에 첨가되어 "아쥬반트 (adjuvant)"로 불리운, 대략 100년 전에 밝혀진 바 있다 (G. Leroux-Roels (2010) Vaccine 28S C25-C36).
종래 백신들은 불활성 또는 독성완화 (attenuated) 병원균들, 또는 이러한 미생물로부터 유래된 독소들로 구성된다. 비록 불활성 또는 독성완화 병원균들을 사용하는 것이 높은 면역원성을 갖지만, 현재까지 이는 백신학에서 매력적이지 못한데, 이는 이러한 제제들이 높은 독성을 갖기 때문이다.
그러므로, 재조합 단백질 서브유닛들, 합성 펩타이드들 및 데옥시리보핵산 (DNA) 플라스미들에 기초하여 새로운 세대의 백신들을 개발하는 사항과 관련된 연구에 있어서 아쥬반트들에 대한 관심이 증가하고 있다. 이러한 새로운 백신 변형체들은, 비록 덜 독성을 나타내지만, 대부분의 경우, 면역자극성 아쥬반트 없이 투여되면 덜 면역원성을 갖는다. 이러한 연유로 인해서, 최근에, 더욱 안전하고, 더욱 효능 있는 아쥬반트들에 대한 필요성이 증가하였다 (Saenz et al. (2010) Vaccine 28 (47): 7556-7562).
비록 아쥬반트를 사용하는 것이 잘 알려진 사항이지만, 아쥬반트들이 작용하는 방식에 대해서는 덜 알려져 있다. 일반적으로, 아쥬반트들은 몇몇 메카니즘들을 통해서 백신들의 효능을 증가시키는 것으로 생각되며, 이러한 메카니즘들에는: 1) 수지상 세포들 (dendritic cells)에 의한 항원 가공 및 제공의 증가, 2) 병원균들과 관련된 패턴들을 인식하는 수용체들, 예를 들어 "톨 (Toll)" 수용체들에 의해서 매개되는 신호전달 경로들에 의한 "위험 (danger)" 신호의 유도, 및 3) 림프구들을 활성화하는 공-자극 신호들 (co-stimulatory signals)의 활성화가 포함된다. 이러한 메카니즘들은 시토카인 유도 및 적당한 공-자극 신호 발현의 상승-조절에 의해서 촉발된다 (Secombes (2010) Fish & Shellfish Immunology, 409-416).
몇몇 내생적 분자들 및 단백질들 (Yin and Kwang (2000) Fish & Shellfish Immunology 10, 375-378; Lingnau et al. (2007) Expert Rev Vaccines 6 (5): 741-6; Zhang et al. (2010) Vaccine 28: 5114-5127)이 아쥬반트들로서 연구된 바 있다. 또한, 특정 면역자극성 펩타이드들이 인 비보에서 아쥬반트로서 작용하여, 단백질 또는 펩타이드 항원들의 면역 반응을 자극할 수 있다는 점이 알려진 바 있다 (Saenz et al. (2010) Vaccine 28 (47): 7556-7562).
PACAP은 세크레틴/글루카곤/혈관활성 (vasoactive) 장 펩타이드 수퍼패밀리에 속한다 (Miyata et al (1989) Biochem Biophys Res Commun 164: 567-574). 이는 다관능성 신경펩타이드이며, 포유류에서 신경전달물질, 신경조절제 및 혈관확장제 분자로서, 신경영양성 및 시상하부 인자로서 중요한 역할을 담당한다 (Arimura A. (1998) Japanese Journal of Physiology 48: 301-31). 세포 분열 및 분화에서 뿐만 아니라, 세포 사멸에서도 그 역할이 알려져 있다 (Sherwood et al. (2000) Endocrine Review 21: 619-670). 이러한 펩타이드는 38 아미노산 (PACAP38) 및 27 아미노산 (PACAP27)의 두 가지 분자 형태들로 존재한다 (Miyata et al. (1990) Biochemical and Biophysical Research Communications 170:643-8). PACAP의 생물학적 활성은 세크레틴 G-단백질-결합된 수용체에 속하는 세 가지 VIP/PACAP 수용체들의 패밀리를 통해서 발현되는데: PACAP에 대해서 매우 특이적이고 PAC-1으로 명명된 타입 I 수용체; 및 혈관활성 장 펩타이드 (vasoactive intestinal peptide, VIP)에 대한 것과 동일하게 PACAP에 대해서 친화도를 나타내며, VPAC-1 및 VPAC-2로 알려진 타입 II 수용체들을 통해서 발현된다 (Vaudry et al. (2000) Pharmacol Rev 52: 269-324).
비록 포유류 면역계 세포들 중에서 PACAP 및 그 수용체들의 존재에 대해서는 오직 부분적으로만 알려져 있을 뿐이지만, PACAP은 면역계에 관련된 조직들을 포함하는 다양한 조직들에 널리 분포된다 (Gaytan et al. (1994) Cell Tissue Res 276:223-7, Abad et al. (2002) Neuroimmunomodulation 10:177-86).
PACAP은 인터루킨-6 (IL-6) 및 인터루킨-10 (IL-10)의 조절을 통해서 염증성 반응을 조절한다 (Martinez et al. (1996) J Immunol 156 (11):4128-36; Martinez et al. (1998) J Neuroimmunol 85 (2) :155-67), Martinez et al. (1998) J Leukoc Biol 63 (5) :591-601).
활성화된 대식세포들에서, PACAP은 염증촉진성 시토카인들 (pro-inflammary cytokines)의 생산을 억제하고 항염증성 시토카인들 (anti-inflammatory cytokines)의 생산을 촉진함으로써, 면역계의 항상성을 유지한다. 부가적으로, PACAP은 공-자극 분자들인 B7.2/B7.1의 발현과, 연이은 T 헬퍼 세포들 (Th)의 활성화를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 반면에, PACAP은, 활성화된 대식세포들에서, 그 PAC-1 수용체를 통해서 IL-6의 생산을 억제하고, 염증을 억제한다 (Martinez et al. (1998) J Neuroimmunol 85 (2): 155 - 67, Martinez et al. (1998) J Leukoc Biol 1998, 63 (5): 591-601). 급격한 염증 자극에 반응하여 PACAP이 IL-6 전사에 대해서 억제 활성을 나타냄으로써, 조직 보호 및 면역계 항상성에 기여한다 (Martinez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2):155-67; Martinez et al. (1998) J Leukoc Biol. 1998 May;63(5):591-601). 이와는 대조적으로, PACAP는 B7.2의 발현을 유도하고, 비-자극된 대식세포들에서 Th2로의 세포 분화를 촉진한다 (Delgado and Ganea (2001) Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 49(2):101-10). 오리의 림프 기관들에서 PACAP의 존재가 보고된 바도 있다 (Squillacioti et al. (2005) Anatomia, Histologia, Embryologia. Volume 34, Issue Supplements 1, page 49).
패혈성 쇼크, 류마티스 관절염 및 크론병과 같은 자가면역 질환들을 치료하기 위한 치료제로서, 포유류에서 PACAP를 사용하는 것이 제안된 바 있다 (Gomariz et al. (2006) Ann. NY Acad. Sci 1070: 51 - 74). 자가면역 질환들에서는, 유기체의 물질들 및 조직들에 대해서 비조절된 면역 반응이 존재하는 것으로 알려져 있다. 이러한 관점에서, PACAP은, 시토카인들 및 케모카인들 (chemokines) 그리고 그 수용체들의 적절한 균형을 통해서, 면역 세포들의 모집을 통해서, 또한 Th1 세포들의 생성 및 활성화를 조절하고 이러한 세포들이 분비하는 시토카인들을 조절함으로써, 자가면역 질환들의 동물 모델들에서 염증을 예방한다.
더 나아가, "톨" 수용체들과 같은 면역계 항상성에 관여하는 분자들이, 적응 면역 반응을 더욱 촉진하는 태생적 면역 반응의 활성화에 필수적인 것으로 알려져 있다. 그러나, 이러한 반응은 급성 및/또는 만성 염증, 자가면역, 및 암의 발병으로 이어질 수도 있다 (Gomariz et al. (2010) Current Pharmaceutical Design 16: 1063-1080). 이러한 관점에서, VIP-PACAP 시스템이 이러한 수용체들을 암호화하는 유전자들의 발현 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Gomariz et al. (2006) Ann. NY Acad. Sci 1070: 51-74). 그러므로, 양 펩타이드들 모두가 이러한 수용체들의 생산 조절 경로에서 방해를 유도할 수 있다.
PACAP은 내생적 분자인 HMGB1 (고 이동성 그룹 박스 1 (high mobility group box 1))에 의해서 매개되는 시토카인들의 순환 레벨을 감쇄시키고 (Tang et al. (2008) International Immunopharmacology 8 (12): 1646-1651), 그들의 방출을 억제한다. HMGB1 분자 및 그 유도체 펩타이드들이 아쥬반트로 기능할 수 있으며, 펩타이드 항원 및 단백질에 대해서 면역 반응을 향상시킬 수 있다고 알려져 있다 (Saenz et al. (2010) Vaccine 28 (47): 7556-7562).
어류 면역 반응의 조절에 있어서 PACAP의 기능에 대한 연구는 본 발명자들에 의해서 수행된 연구들에 한정되어 있다. 본 발명자들은 침지 배쓰 또는 주사에 의해서 투여된 재조합 클라리아스 가리에피누스 (Clarias gariepinus) PACAP이, 유충 및 어린 어류에서 성장을 촉진할 뿐만 아니라 내생적 면역 패러미터들 (리소자임, 질산 유도체 대사물들 및 항산화 방어) 및 후천성 면역 (IgM)을 자극한다는 사실을 입증한 바 있다 (Carpio et al. (2008) Fish and Shellfish Immunology 25:439-45; Lugo et al. (2010) Fish and Shellfish Immunology 29:513-520). 이러한 PACAP의 특성들은 국제특허출원 WO2007/059714, "Neuropeptidos para el cultivo de organismos acuaticos"에 서술된 바 있다.
현재, 인간 및 수의 의약 분야에서, 기존의 백신들과 개발 중인 백신들 내부로 통합될 수 있는, 안전하고, 더욱 효능 있는 아주반트들로서 사용가능한 화합물들을 확인하는데 여전히 많은 관심이 집중되고 있다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하여, 함께 투여된 항원에 대한 면역 반응을 강력하게 효능증가시킴으로써 매우 효율적인 아쥬반트가 될 수 있는 새로운 대안적인 아쥬반트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은, 다양한 면역화 전략들에 사용되는 백신들에 존재하는 항원에 대한 분자 아쥬반트로서, "뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 펩타이드 (pituitary adenylate cyclase activating peptide, PACAP)"를 사용하는 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 백신들은 PACAP를 아쥬반트로서 포함하며, 감염성 물질들에 대한 면역화를 위해서 고안된 것들이다. 이러한 감염성 물질들은, 다른 것들 중에서도, 바이러스, 박테리아 및 체외기생충 (ectoparasites)일 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 감염성 물질들은 포유류, 조류 및 어류에 영향을 미친다.
본 발명에서 "뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 펩타이드 (pituitary adenylate cyclase activating peptide, PACAP)"이라는 용어는, 이러한 분자의 임의의 변형체 (PACAP27 또는 PACAP38)를 포함하며, 그 천연 공급원으로부터 분리된 것이나, 화학적 합성에 의해서 제조된 것이나, 또는 재조합 DNA 기술에 의해서 제조된 것일 수 있으며; 그것을 펩타이드로서, 또는 핵산의 형태로서 사용하는 것을 포함한다.
본 발명에서, "분자 아쥬반트"라는 용어는 백신 항원에 대한 면역 반응을 조절하여 이를 증가시킬 수 있는 능력을 갖는 단백질 성질의 임의의 분자를 의미한다.
현재까지 PACAP를 분자 아쥬반트로서 사용한 연구는 보고된 바가 없다. 전술한 바와 같이, 이러한 펩타이드를 포유류에서 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염 및 크론병과 같은 자가면역 질환들을 치료하기 위한 치료제로서 사용한 사항이 제안된 바 있다 (Gomariz et al. (2006) Ann. NY Acad. Sci . 1070: 51-74). 이러한 관점에서, PACAP은, 시토카인들 및 케모카인들, 그리고 그 수용체들의 적절한 균형을 통해서, 면역 세포들의 모집을 통해서, 또한 Th1 세포들의 생성 및 활성화를 조절하고 이러한 세포들이 분비하는 시토카인들을 조절함으로써, 자가면역 질환들의 동물 모델들에서 염증을 예방한다. 이러한 사실들을 고려할 때, 본 발명의 일부로서 발견된 PACAP의 효과는 예기치 못한 것이며, 항원과 조합하여 이를 투여하는 경우, 자극촉진성 시토카인들 (pro-stimulatory cytokines) 및 체액성 면역 반응의 다른 요소들의 자극을 통해서, 상기 항원에 대한 면역 반응을 증가시킨다.
더 나아가, VIP-PACAP 시스템은 "톨" 수용체들을 암호화하는 유전자들의 발현 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Gomariz et al. (2006) Ann. NY Acad. Sci 1070: 51-74). 이러한 면에서, 양 펩타이드들 모두는 이러한 수용체들을 생산하는 조절 경로에서 방해 (disturbance)를 유도할 수도 있는 바, 이를 백신 아쥬반트로서 사용하는 사항은 자명한 것이 아니라 할 수 있다. 본 발명에 개시된, PACAP의 새로운 용도와 대조되는 다른 요소는, 이러한 펩타이드가 내생적 HMGB1 분자에 의해서 매개되는 시토카인들의 순환 수준을 감쇄시키고 그 방출을 저해한다는 사실이다 (Tang et al. (2008) International Immunopharmacology 8 (12 ): 1646-1651).
본 발명에서는, 최초로, PACAP와 함께 투여된 백신 항원에 대해서 특이적인 면역 반응의 증가가, 체액성 및 세포성 면역 반응 수준 모두에서 관찰된다는 점을 입증하였다.
본 발명의 또 다른 목적은 아쥬반트로서 PACAP, 적어도 하나의 백신 항원, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다. 아쥬반트로서 PACAP 및 관심 대상이 되는 적어도 하나의 항원을 포함하는 이러한 백신 조성물은, 국부적이거나 또는 전신적인 상기 항원 또는 상기 항원들에 대해서 면역 반응을 야기한다. 본 발명의 백신 또는 백신 조성물은, 예를 들어, 재조합 단백질들, 독성완화 미생물들 또는 핵산들에 기반한 것일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 전술한 백신 조성물들은 경구, 주사 또는 침지 배쓰에 의해서 투여된다.
본 발명에서, 상기 백신 조성물에서, PACAP은 화학적 합성에 의해서 얻어지거나 또는 재조합 DNA 기술에 의해서 얻어짐으로써, 그 천연 공급원으로부터 분리된 펩타이드로서 투여될 수 있다. PACAP은 또한 핵산으로서 사용될 수도 있다.
본 발명의 다양한 구현예들에서, 몇몇 항원들과 조합된 PACAP를 포함하는 백신들은 포유류, 조류 및 어류에 투여되어, 최초로 PACAP에 대한 아쥬반트 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 예기치 않게, 항원과 조합하여 신경펩타이드 PACAP를 투여하는 경우, 포유류, 조류 및 어류에서 상기 항원에 대한 특정 항체들의 수준이 증가되었다. 또한, 최초로 인 비트로에서, PACAP가 어류 백혈구들에서 인터루킨 1 베타 (IL 1β) 및 인터루킨 15 (IL15)의 전사물을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났다.
PACAP를 아쥬반트로서 포함하는 백신 조성물들 또는 조합들을 개시하는 본 발명의 다양한 구현예들에서, 다양한 항원들이 사용되며, 예를 들어 오브알부민 (ovalbumin, OVA), 돼지 열병 바이러스 (Classical Swine Fever Virus, CSFV)의 E2 당단백질, 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (HA), 칼리구스 로게르크레세이 (Caligus rogercresseyi)의 폴리펩타이드 my32, 애로모나스 히드로필리아 (Aeromonas hydrophila)의 불활성화된 세포들, 감염성 췌장 괴사 바이러스 (Infectious Pancreatic Necrosis Virus, IPNV)의 106 kDa 폴리단백질 (NH2-VP2-VP4VP3-COOH), 바이러스성 출혈 패혈증 바이러스 (Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)의 G 당단백질 및 섬모충 기생 이치하이오프티리우스 멀티필리스 (ciliate parasitic Ichthyophthirius multifiliis)가 사용된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 백신 조성물 중에서, PACAP는 배합사료 (formulated feed)로서 가해지며, 50-750 ㎍/kg 사료의 농도로 가해진다. 본 발명의 제2 구현예에서, PACAP은 주사제로 가해지며, 체중 1 그램 당 0.1-10 ㎍의 농도로 가해진다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, PACAP은 수중 생물들에 침지 배쓰 (immersion baths)로 가해지며, 물 1리터 당 50-1000 ㎍의 농도로 가해진다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 항원 및 아쥬반트 PACAP는 백신 조합의 일부로서 가해질 수 있으며, 이 경우 그 성분들은 동일한 면역화 프로토콜 동안에 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여된다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 조합은 바이러스성, 박테리아성 및 기생충성 질환들의 예방에 사용된다. 이러한 백신 조합용으로서, PACAP 및 항원, 또는 항원들은 경구, 주사 또는 침지 배쓰에 의해서 투여된다.
특정 구현예에서, PACAP는 배합사료로서 가해지며, 50-750 ㎍/kg 사료의 농도로 가해진다. 제2 구현예에서, PACAP은 주사제로 가해지며, 체중 1 그램 당 0.1-10 ㎍의 농도로 가해진다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, PACAP은 어류에 침지 배쓰로 가해지며, 물 1리터 당 50-1000 ㎍의 농도로 가해진다.
본 발명의 다른 태양은 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 항원에 대한 아쥬반트로서 PACAP를 포함하는 백신 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 아쥬반트로서의 PACAP 및 항원은 동일한 면역화 스케쥴 동안 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법에서 아쥬반트로서 사용되는 PACAP는 펩타이드로 사용되며, 이는 그 천연 공급원으로부터 얻어지거나, 화학적 합성에 의해서 얻어지거나, ㄸ또또는 재조합 DNA 기술에 의해서 얻어진다. 또한, 본 발명은 아쥬반트로서 사용되는 PACAP가 핵산의 형태로 투여되는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법에 따르면, PACAP와 함께 투여된 백신 항원에 특이적인 면역 반응의 증가는 체액성 및 세포성 특정 면역 반응에서 함께 발생된다.
본 발명의 몇몇 구현예들에 서술된 바와 같이, 관심 대상인 항원에 대한 면역 반응의 향상 또는 증가는 바이러스성, 박테리아성 및 체외기생체들을 포함하는 다양한 감염원들에 대한 높은 수준의 보호 효과로서 나타난다.
도 1은 신경펩타이드 PACAP38과 함께 투여된 OVA로 면역화된 마우스들에서 유도된 총 면역글로불린 G (IgG) (A), IgG1 (B) 및 IgG2a (C)의 역가를 나타낸 그래프이다. 각각 6 마리 동물들로 된 2개의 실험군들을 사용하였다. 음대조군 (인산 완충 식염수 (PBS)/OVA)를 0일째 및 7일째에 0.2 mL PBS 중 6 ㎍ OVA 투여량으로 복강내 접종하였다. PACAP38도 투여한 군 (PBS/OVA + 펩타이드)의 경우, 0일째 및 7일째에 0.2 mL PBS 중 6 ㎍ OVA + 0.5 ㎍ PACAP38 투여량으로 복강내 접종하였다. 다른 문자들은 유의성 있는 차이들을 나타낸다.
도 2는 E2-PACAP에 기반한 백신 조성물로 백신접종된 돼지들에서 세포 면역 반응을 분석한 그래프이다. 세포 면역 반응은 E2 (1군), E2 + PACAP (2군) 및 위약 (placebo) (3군)으로 백신접종하고 5일 경과한 날 분리된 돼지 림프구에서 측정하였다. (A) 림프증식 분석: 결과는 자극 지수 (stimulation index, SI)로 표현하였으며, 이는 자극된 배양물의 분당 카운트 (counts per minute, cpm)과, 미처리된 대조군의 cpm 사이의 비율로 정의된다. SI = 2인 림프증식 반응을 양성으로 간주하였다. (B) 실시간 PCR에 의한 IFN-γ 분비 측정. 수치들은 2-△△ Ct의 산술적 평균으로 표현하였다. (**) p <0.01.
도 3은 HA 또는 HA-PACAP로 면역화된 닭들에서 적혈구응집반응 (hemagglutination) 억제의 역가를 나타낸 도면이다. (A) 항체 역가의 산술적 평균은 적혈구응집반응 억제를 야기한 혈청의 가장 높은 희석물에 대한 역수의 log2로 표현하였다. (B) 면역화된 닭들에서의 세포 면역 반응. IFN-γ 분비는 실시간 PCR에 의해서 측정하였다. 수치들은 2-△△ Ct의 산술적 평균으로 표현하였다. (**) p <0.01.
도 4는 천연 무지개 송어의 말초혈 백혈구들 (A) 및 전신 (B)에서의 IL 1β의 전사에 대한 PACAP38의 인 비트로 효과를 실시간 PCR에 의해서 발현 분석한 그래프들이다. 10-10 M, 10-9 M 및 10-8 M의 농도에서 PACAP 투여의 효과를 치료 후 48시간 경과한 시점에서 평가하였다. 실험은 4회 반복하였다. 백혈구 배양물들은 2회 처리하였으며, PCR은 3회 수행하였다. 데이터는 내생적 신장 인자 EF1α에 관련된 IL 1β의 상대 발현 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표현하였다. (*) p<0.05). * (p<0.05)는 관심 대상이 되는 유전자의 상대 발현이 미처리된 백혈구 배양물 (음대조군)에서의 그 상대적 발현에 비해서 통계적으로 더 높다는 것을 의미한다.
도 5는 천연 무지개 송어의 말초혈 백혈구들 (A) 및 전신 (B)에서의 IL 15의 전사에 대한 PACAP38의 인 비트로 효과를 실시간 PCR에 의해서 발현 분석한 그래프들이다. 10-10 M, 10-9 M 및 10-8 M의 농도에서 PACAP 투여의 효과를 치료 후 48시간 경과한 시점에서 평가하였다. 실험은 4회 반복하였다. 백혈구 배양물들은 2회 처리하였으며, PCR은 3회 수행하였다. 데이터는 내생적 신장 인자 EF1α에 관련된 IL 15의 상대 발현 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표현하였다. (*) p<0.05
도 6은 일반 잉어에서 A. hydrophila에 대한 응집 항체 역가를 나타낸 그래프이다. Y축의 수치들은 항체 역가의 산술 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. (*) p<0.05, (**) p<0.01. 그룹 1: PBS로 주사, 그룹 2: 포르말린 비활성화된 A. hydrophila 세포들로 주사, 그룹 3: 포르말린 비활성화된 A. hydrophila 세포들 및 PACAP으로 주사 (1 ㎍/어류).
도 7은 인간 거대세포바이러스 (cytomegalovirus)의 바로 인접 상단 프로모터의 조절 하에서, 클라리아스 가리에피누스 (Clarias gariepinus) PACAP cDNA를 갖는 플라스미드 DNA (pCMV-PACAP)를 포함하는 DNA 백신 (pP-IPNV)을, 근육 내 주사에 의해서, 1 ㎍/어류의 투여량으로 함께 투여한 효과를 나타낸 그래프이다. 백신화 후 30일 경과 시점에서, 복강내 주사에 의해서 100 μL의 IPNV (어류 당 1x107 (TCID50) ml-1)로 바이러스에 어류를 노출시켰다. 감염 후 7일 경과 시점에서, 그룹 당 10 마리의 어류를 희생시킨 다음, 실시간 RT-PCR에 의해서 전신 중의 바이러스 함량을 평가하였다. 수치는 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 상단의 다른 글자들은 그룹들 사이에서 통계적으로 유의성 있는 차이들을 표시한다. 그룹 1: PBS로 주사, 그룹 2: 1 ㎍/어류의 투여량으로 pP-IPNV를 주사, 그룹 3: pP-IPNV (1 ㎍/어류) 및 pCMV-PACAP (0.5 ㎍/어류)를 함께 주사, 그룹 4: pP-IPNV (1 ㎍/어류) 및 pCMV (0.5 ㎍/어류)를 함께 주사, 그룹 5: pP-IPNV (1 ㎍/어류) 및 pCMV-PACAP (0.05 ㎍/어류)를 함께 주사, 그룹 6: pP-IPNV (1 ㎍/어류) 및 pCMV (0.05 ㎍/어류)를 함께 주사.
도 8은 VHSV의 당단백질 G (pG-VHSV) 및 펩타이드 PACAP를 암호화하는 유전자에 기반한 DNA 백신으로 무지개 송어를 근육 내 주사로 면역화한 경우 관찰되는 축적 치사율을 도시한 그래프이다. 백신화 후 4주 경과 시점에, 침지 배쓰에 의해서 어류를 바이러스에 노출시켰다 (어류 당 1x105 TCID50 mL-1). 축적 치사율은 투여 후 4주 동안 분석하였다. 그룹 1: PBS로 주사. 그룹 2: pG-VHSV (0.01 ㎍/어류)로 주사, 그룹 3: pG-VHSV (0.01 ㎍/어류) 및 PACAP (0.1 ㎍/어류), 그룹 4: pG-VHSV (0.01 ㎍/어류) 및 PACAP (0.5 ㎍/어류)로 주사.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 한다.
실시예
실시예 1. 마우스의 체액성 면역 반응에 대한 OVA 및 PACAP를 사용한 공-면역화의 효과
체중 20 g의 BALB/c 마우스 (n=12)를 각각 6 마리씩 2개의 실험군들로 분리하였다. 음대조군 (PBS/OVA)에는, 0일째 및 7일째에 PBS 0.2 mL 중의 6 ㎍ OVA의 투여량으로 복강내 주사하였다. PACAP38 (PBS/OVA + 펩타이드)로 처리된 그룹에는, 0일째 및 7일째에 PBS 0.2 mL 중의 6 ㎍ OVA + 0.5 ㎍ PACAP 투여량으로 복강내 주사하였다. 면역화 프로토콜의 15일째에, 각 어류로부터의 혈액을 채취하여 총 IgG, IgG1 및 IgG2a 역가들을 평가하였다.
도 1A, B 및 C는 PACAP38과 함께 투여된 OVA로 마우스를 면역화함으로써 유도된 총 IgG, IgG1 및 IgG2a 역가들을 각각 도시한 그래프이다. PBS/OVA+펩타이드 그룹 중 동물들이 대조군과 비교할 때 OVA에 대해서 통계적으로 월등한 특이적 총 IgG 역가를 나타내었다 (도 1A). 유사하게, OVA+PACAP로 면역화된 그룹 중에서 OVA에 대한 IgG1 및 IgG2a의 특이적 역가 역시, OVA만으로 면역화된 그룹에서 관찰되는 역가보다 현저하게 높다는 점을 관찰할 수 있었다 (도 1B 및 C).
실시예 2. E2-PACAP에 기초한 백신 조성물로 백신화된 돼지들에서 세포성 면역 반응의 평가
항원 E2는 CSFV의 주된 외피 당단백질이다. E2-PACAP에 기초한 백신 조성물로 백신화된 돼지들에서 세포성 면역 반응을 평가하기 위해서, 또한 그 반응을 E2 항원에 의해서 야기된 반응과 비교하기 위해서, 평균 체중 20 kg으로서, 혈청학적으로 CSFV에 대해서 음성인 건강한 돼지 18 마리를 선택하였는 바, 돼지들은 이러한 질병에 대한 이력이 없고 최근 3년 이내에 CSFV에 대해서 비백신화된 농장으로부터 입수하였다. 돼지들은 각각 6 마리로 이루어진 다른 그룹들에 위치시켰으며, 물과 음식은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 각각의 백신 조성물을 하기와 같이 단일 면역화로 가하였다: 25 ㎍의 재조합 E2 (그룹 1) 및 동일량의 PACAP38과 함께 공동 투여된 25 ㎍의 E2 (그룹 2). 그룹 3은 위약군 (placebo group)으로 설정하였다. 면역원들은 오일 아쥬반트의 에멀젼 중에서 제형화하였으며, 최종 부피 2 mL로 근육내 주사에 의해서 접종하였다. 동물들은 면역화 후 8일 경과 시점에 CSFV로 근육내 주사에 의해서 감염시켰다 ("마가리타" 분리 ("Margarita" isolation의 105 LD50). 임상적 징후들을 매일 분석하였으며, 혈액 시료들을 3일째 및 5일째에 채취하여, 세포 면역 반응의 지표로서 림프구 번식 및 IFN-γ의 발현을 분석하였다. 다른 그룹들과 비교할 때, E2-PACAP으로 면역화된 동물들에서 림프구 반응 증가가 검출되었으며 (도 2A), 5일째에 가장 높은 수준의 IFN-γ가 검출되었다 (도 2B). 이러한 결과들은 E2 항원과 PACAP를 공동 투여할 경우, 돼지들에서 CSFV에 대한 세포 면역 반응이 야기된다는 것을 나타낸다.
실시예 3. 닭들에서의 체액성 및 세포성 면역 반응에 대한 조류 인플루엔자 바이러스 (virus A/VietNam1203/2004)의 HA 및 PACAP 공동-면역화의 효과
면역화를 위해서 3주령의 백색 레그홈 닭들 (white leghom chickens)을 사용하였다. 각각 10 마리의 닭들로 구성된 3개의 실험군들을 사용하였다.
그룹 1: 20 ㎍의 HA로 주사
그룹 2: 20 ㎍의 HA + 0.5 ㎍의 PACAP27로 주사
그룹 3: 20 ㎍의 우 혈청 알부민으로 주사
HA는 포유류 세포들에서 재조합 발현에 의해서 얻었다. 백신들은 Montanide 888로 제형화하였으며, 피하 경로에 의해서 최종 부피 0.5 mL로 투여하였다. 동물들은 면역화 이후 28일이 경과한 시점에서 재-면역화하였다. 혈액 샘플들을 0, 14, 28, 35, 42 및 49일째에 취하여, 혈구응집반응 저해 분석 (haemagglutination inhibition assay)를 사용하여 보호 항체들의 역가를 평가하였고, 또한 백혈구들을 분리하여 백신에 의해서 야기되는 세포성 면역 반응을 인 비트로에서 평가하였다.
HA-PACAP로 면역화된 닭들은, 재-면역화 35일째부터, HA로 면역화된 그룹과 비교할 때 탁월한 항체 반응을 나타내었다 (도 3A). HA-PACAP으로 처리된 그룹은, IFN-γ의 자극으로 측정하였을 때, HA 또는 대조군으로 면역화된 그룹들에 비해서 세포 면역 반응의 증가를 나타내었다 (도 3B).
실시예 4. 천연 무지개 송어 (Oncorhynchus mykiss)의 말초혈 및 전신 백혈구에서 IL1-β 및 IL15의 발현에 대한 PACAP의 효과.
본 실시예에서는 VHSV 및 IPNV를 보유하지 않는 대략 50 g의 무지개 송어 치어 (O. mykiss)를 사용하였다. 물고기들을 (n=5) 메탄술폰산 염 (Sigma, USA)으로 마취시키고, 각 물고기의 꼬리 정맥으로부터 말초혈을 무균적으로 채혈한 다음, 전신 (head kidney)을 수집하였다.
말초혈 및 전신 백혈구를 Graham 및 Secombes (Graham and Secombes (1998) Immunology 65:293-7)에 서술된 방법에 의해서 분리하였다.
세포들을 5% FCS를 포함하는 L-15 중에 ml 당 5x106 세포들의 농도로 재현탁시키고, 웰 당 1 mL로 24-웰 플레이트 중에 분배하였다. 백혈구들을 화학적 합성에 의해서 얻어진 클라리아스 가리에피누스 (Clarias gariepinus) PACAP38로, 3가지 투여량으로 (10-10 M, 10-9 M 및 10-8 M) 중복 처리하였다. 중복 분배된 미처리 백혈구들을 음대조군으로 사용하였다.
IL 1β 및 IL 15의 수준들을 처리 48시간 경과 후 평가하였다. 이를 위해서, PACAP로 처리된 백혈구 배양물로부터 전장 RNA들을 Chomczynski 및 Sacchi (Chomczynski and Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9)에 서술된 방법에 의해서 정제하였다.
IL 1β 및 IL 15를 증폭하기 위해서 고안된 프라이머들이 cDNA와 게노믹 DNA를 구별하지 않기 때문에, 다른 조직들로부터 정제된 전장 RNA들을 DNA 뉴클레아제, 더욱 구체적으로는 RQ1 RNase-free DNase (Promega)로 처리하였다.
cDNA 합성을 위해서는 SuperScript III 역전사 효소를 사용하는 상업용 키트 (Invitrogen)를 사용하였다. 최종적으로, 정량적 PCRs (qPCRs)을 위해서는 PCR: Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)의 상업용 혼합물을 사용하였다. qPCR 결과들을 구성적 발현 (constitutive expression)의 내생적 유전자에 대해서 정규화하였는 바, 구체적으로는 신장 인자 1α (EF1α)에 대해서 3회 수행하였다. 결과들을 2-△ Ct로 표현하였으며, 여기에서 △Ct는 표적 유전자의 Ct 수치로부터 정규화된 유전자 EF1α의 Ct 수치를 뺀 나머지 값이다.
IL 1β 단백질 수준은 10-10 M의 PACAP38로 처리된 말초혈 백혈구들에서, 처리 48시간 경과 후에 증가하였다. 10-9 M의 투여량에서, 음대조군과 비교할 때, IL 1β의 전사에 대한 촉진 효과가 있었지만, 이 경우 관찰된 발현 수준은 10-10 M의 투여량으로 얻어진 수준보다 낮은 것이었다. 이러한 결과들은 저농도에서 (10-9 M 및 10-10 M) PACAP38이 IL 1β의 전사에 미치는 양의 효과를 보여주는 것이다 (도 4A). 전신 백혈구들에서, IL 1β 전사에 미치는 PACAP 38의 효과는 말초혈 백혈구들에서 얻어진 것들에 비해서 온건한 것이었는 바, 촉진 효과는 10-9 M 투여량에서만 관찰되었다 (도 4B).
또한, 말초혈 백혈구들에서 10-10 M 및 10-9 M 투여량의 PACAP38이 IL 15의 발현에 대한 촉진 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다. 가장 높은 수치는 10-10 M 투여량에서 관찰되었다 (도 5A). 전술한 IL 1β 전사 효과에 대해 서술한 바와 같이, 전신 백혈구들에서의 효과는 온건하였다. PACAP 처리된 군에서의 IL 15 발현 수준들은, 10-9 M 투여량에서, 음대조군 보다 통계적으로 더 높은 수준이었다 (도 5B).
실시예 5. 항원 my32, 및 PACAP와 공동 투여된 my32로 사전 복강내 면역화된 살모 살라 (Salmo salar)에서, 칼리구스 로게르크레세이 (Caligus rogercresseyi)를 사용한 조절 감염 테스 (controlled challenge test)
my32 단백질은 단절 BL21(DE3)-pET28a-my32 형질전환된 E. coli 세포들의 펠렛에서 재조합 형태로 수득하였다. 이러한 단백질은, 복강 투여되는 경우, S. salar에서 C. rogercresseyi로 감염 테스트를 수행하면, 제2 세대 기생충들에서 57%의 감염 억제 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다 (Carpio et al. (2011) Vaccine. 29 (15):2810-20).
이러한 단백질에 대한 PACAP의 아쥬반트 효과를 입증하기 위해서, 조절된 조건 하에서, S. salar에 대한 백신화-감염 실험을 고안하였다. 상기 실험에서는, 각 그룹 마다 25마리 동물들로 이루어진 6개의 실험 그룹들을 설정하였다 (평균 체중 80 g):
그룹 1: PBS로 복강내 주사
그룹 2: 1 ㎍/어류의 투여량으로 PACAP38로 복강내 주사
그룹 3: 3 ㎍/g 체중 (gbw)의 투여량으로 my32로 복강내 주사
그룹 4: 3 ㎍/gbw 투여량의 my32 및 1 ㎍/어류 투여량의 PACAP를 복강내 주사로 공동 투여
그룹 5: 3 ㎍/gbw 투여량의 my32를 복강내 주사하고, 250 ㎍의 PACAP/Kg의 사료로 my32로 면역화하기 1주일 전 및 1주일 후 동안 매일 배식한 어류
실험 과정 도중에, 어류들은 그 체중의 1% 비율로, PACAP를 함유하지 않는 상업적 제제로 하루에 2회 배식하였지만, 그룹 5에 대해서는, Adelmann 등 ((2008) Vaccine 26, 837-844)에 개시된 바와 같이, 면역화 1주일 전 및 1주일 후에 동일한 상업적 제제로서 PACAP를 함유한 제제로 배식하였고, 상업적 제제는 바이러스 VHSV의 독성완화 균주를 경구 투여하기 위한 것이었다.
500 임의 열량 단위 (arbitrary thermal units) 이후에, 어류들을 2주 동안 해수에 적응시켰다. 이어서, 각 탱크에 2000 ± 200 마리의 요각류유생 (copepodites)을 감염시켰다. 물고기들은 Stone 등에 의해서 제안된 온도, 염도, 및 산소 조건 하, 물 흐름이 없는 곳에서 24일 동안 보관하였다 (Dis Aquat Organ, 2000, 41: 141-149). 턴오버 (turnover) 및 여과는 수작업으로 매 48시간 마다 수행하였다. 24일째에, 물고기들을 마취시키고, 희생시켜 입체현미경 하에서 기생충의 개수를 세었다. 하기 표 1의 결과는 PACAP, my32 및 PACAP + my32로 처리된 그룹들에서 감염 수준이 감소하는 것을 보여준다. 가장 큰 감소는 그룹 4 및 5에서 관찰되었으며, 이는 항원에 대한 PACAP의 아쥬반트 효과를 보여주는 것이다.
C. rogrecresseyi로 감염시키고 24일 경과 후 기생충 마리수
실험군 기생충 마리수/어류 감염 억제도 (%)
PBS 37 ± 3a -
PACAP 29 ± 5b 22
my32 17 ± 8c 55
PACAP-IP + my32-IP 8 ± 3d 79
PACAP-oral + my32-IP 5 ± 2e 86
문자들은 통계적으로 유의미한 차이들을 나타낸다.
감염 억제 백분율은 (1-T/C)×100에 의해서 계산되었다 (T: 백신화된 그룹에서 어류 당 기생충 마리수, C: 위약 그룹에서 어류 당 기생충 마리수).
실시예 6. 일반 잉어 (Cyprinus carpio)에서 에로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila)에 대한 체액성 면역 반응에 PACAP 아쥬반트가 미치는 효과
실험은 잉어 (C. carpio) 40 ± 10 g으로 수행하였다. 수족관들은 600 L로 28 ± 2℃로 유지하였다. 각각 10마리의 잉어들로 이루어진 3개의 실험군들을 구축하였으며 이들에 대해서 하기 면역원들을 복강내 주사하였다:
그룹 1: PBS
그룹 2: 불활성화된 A. hydrophila 세포들
그룹 3: 불활성화된 A. hydrophila 세포들 + 어류 당 PACAP38 1 ㎍.
물고기들은 0일째 및 14일째에 주사하였으며, 0일째 및 21일째에 꼬리 정맥 (caudal vein)으로부터 채혈하였다. 실험 결과들은 박테리아 및 PACAP으로 면역화된 그룹이 박테리아만으로 면역화된 그룹에 비해서 응집 항체 역가가 현저하게 높은 것으로 나타났다 (도 6). 이러한 결과들은 분자 아쥬반트로서 PACAP의 효과를 보여주는 것이다. A. hydrophila 세포 제조 및 항체 역가 측정은 Yin 등 ((1996) Fish & Shellfish Immunology 6, 57-69)에 따라서 수행하였다.
실시예 7. 불활성화된 박테리아로 복강내 사전 면역화된 일반 잉어 (C. carpio) 및 불활성화된 박테리아 및 공동 투여된 PACAP로 복강내 사전 면역화된 일반 잉어 (C. carpio)를 사용한 조절 감염 테스트
실험은 일반 잉어 (C. carpio) 30 ± 5g으로 수행하였다. 수족관들은 250 L로 30 ± 2℃로 유지하였다. 각각 20마리의 잉어들로 이루어진 3개의 실험군들을 구축하였으며 이들에 대해서 하기 면역원들을 복강내 주사하였다:
그룹 1: PBS
그룹 2: A. hydrophila의 불활성화된 세포들
그룹 3: 불활성화된 A. hydrophila 세포들 + 어류 당 PACAP38 1 ㎍.
물고기들은 0일째 및 14일째에 주사하였으며, 감염은 0일째 및 21일째에 LD50 박테리아를 IP 주사함으로써 수행하였고, 치사율을 7일 동안 기록하였다. 상대 생존 백분율 (relative percent survival, RPS)은 하기와 같이 계산하였다:
RPS (%) = (대조군 치사율 % - 처리군 치사율 %) / (대조군 치사율 %) × 100
결과는 그룹 2에서 65%였으며, 그룹 3에서 95%였고, 이는 PACAP의 투여가 항원에 백신화되고 감염된 어류의 생존률을 증가시킨다는 사실을 보여준다.
실시예 8. IPNV로 실험적으로 감염된 무지개 송어 (Oncorhynchus mykiss)에서, IPNV의 106 kDa 폴리단백질 (VP2-VP4VP3-NH2-COOH)을 암호화하는 유전자에 기초한 백신과 PACAP를 공동 투여한 경우의 효과
IPNV로 실험적으로 감염된 무지개 송어에서, IPNV의 106 kDa 폴리단백질 (VP2-VP4VP3-NH2-COOH)을 암호화하는 유전자에 기초한 백신과 PACAP를 근육내 공동 투여한 경우의 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 각각 15 마리의 어류로 구성된 6개의 실험군들을 준비하였으며 (12 ± 1 g), 10-12℃에서 물에 보관하였다:
그룹 1: PBS로 주사된 어류.
그룹 2: 1 ㎍/어류의 투여량으로 DNA 백신 (pP-IPNV)으로 주사된 어류.
그룹 3: 1 ㎍/어류의 투여량으로 DNA 백신 (pP-IPNV)과, 0.5 ㎍ pCMV-PACAP/어류의 투여량으로 인간 거대세포바이러스 (cytomegalovirus)의 바로 인접 상단 프로모터의 조절 하에서, C. gariepinus PACAP의 cDNA 서열을 갖는 플라스미드 (pCMV-PACAP)를 공동 주사한 어류
그룹 4: pP-IPNV 백신 (1 ㎍/어류)과, 0.5 ㎍ pCMV/어류의 투여량으로 음대조군 플라스미드를 공동 주사한 어류
그룹 5: 1 ㎍/어류의 투여량으로 DNA 백신 (pP-IPNV)과, 0.05 ㎍ pCMV-PACAP/어류의 투여량으로 C. gariepinus PACAP의 cDNA 서열을 갖는 플라스미드 (pCMV-PACAP)를 공동 주사한 어류
그룹 6: pP-IPNV 백신 (1 ㎍/어류)과, 0.05 ㎍ pCMV/어류의 투여량으로 음대조군 플라스미드를 공동 주사한 어류.
백신화 이후 30일 경과시점에서, 어류들을 100 μL의 IPNV (어류 당 1 × 107 TCID50 mL-1)로, 복강내 주사에 의해서 바이러스에 노출시켰다.
백신화 이후 7일 경과시점에서, 그룹 당 10 마리의 어류들을 희생하여 전신 중 바이러스 함량을 분석하였다.
바이러스 함량을 결정하기 위해서, RNA를 각각의 샘플들로부터 분리하였으며, RNA 1 ㎍으로부터 RT-PCR을 수행하였다. VP1 유전자 발현의 검출은 실시간 PCR에 의해서 분석하였다. 결과들은 도 7에 도시하였다.
pP-IPNV 및 pCMV-PACAP를 공동 투여하는 경우, pP-IPNV 및 빈 벡터로 공동 주사된 경우에 비해서, 바이러스 함량이 현저하게 감소되었다. 테스트된 pCMV-PACAP 투여량들 사이에 차이점은 없었다.
실시예 9. VHSV로 실험적으로 감염된 무지개 송어 (O. mykiss)에서, VHSV의 G 당단백질을 암호화하는 유전자에 기초한 DNA 백신과 PACAP를 공동 투여한 경우의 효과
VHSV로 실험적으로 감염된 무지개 송어에서, VHSV의 G 당단백질을 암호화하는 유전자 (pG-VHSV)에 기초한 DNA 백신과 C. gariepinus PACAP를 근육내 주사에 의해서 공동 투여한 경우의 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 각각 20 마리의 어류로 구성된 4개의 실험군들을 준비하였으며 (10 ± 2 g), 10-12℃에서 물에 보관하였다:
그룹 1: PBS로 주사된 어류.
그룹 2: DNA 백신 pG-VHSV (0.01 ㎍/어류)로 주사된 어류.
그룹 3: 0.01 ㎍/어류의 투여량으로 DNA 백신 pG-VHSV와, 0.1 ㎍ PACAP/어류의 투여량으로 C. gariepinus PACAP을 공동 주사한 어류.
그룹 4: 0.01 ㎍/어류의 투여량으로 DNA 백신 pG-VHSV와, 0.5 ㎍ PACAP/어류의 투여량으로 C. gariepinus PACAP을 공동 주사한 어류.
백신화 이후 4주 경과시점에서, 어류들을 침지 배쓰에 의해서 바이러스에 노출시켰다. 감염은 VHSV 감염 투여량 (어류 당 1 × 105 TCID50 mL-1)을 함유하는 물에서 2시간 동안 수행하였다. 축적 치사율을 감염 4주 경과 후에 분석하였으며, 결과들을 도 8에 도시하였다.
펩타이드와 함께 DNA 백신을 함께 투여하는 경우에, 0.1 및 0.5 ㎍/어류의 투여량에서, DNA 백신만을 단독 투여하는 경우에 비해서, 각각 치사율이 29% 및 15%로 감소하였다.
실시예 10. 섬모 기생 백점충 (Ichthyophthirius multifiliis)의 써론트 (theronts)로 면역화된 후 PACAP의 투여가 얼룩 메기 (Ictalurus punctatus)의 생존에 미치는 영향
섬모 기생 써론트 I. multifiliis로 면역화된 후, PACAP의 투여가 얼룩 메기 (I. punctatus)의 생존에 미치는 영향을 평가하기 위해서 실험을 수행하였다. 백신화 및 감염 과정은 Wang 및 Dickerson ((2002) Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 9 (1), 176-181)에 의해서 제안된 바와 같이 수행하였다. 각각 25 마리의 어류들로 이루어진 4개의 실험군들 (12 ± 5 g)을 구축하였다:
그룹 1: PBS로 1일째 및 35일째 면역화된 어류.
그룹 2: 8000 마리의 살아있는 써론트 I. multifiliis로 1일째 면역화되고, 35일째에 10,000 마리의 살아있는 써론트 기생충으로 면역화된 어류.
그룹 3: 8000 마리의 살아있는 써론트 I. multifiliis로 1일째 면역화되고, 35일째에 10,000 마리의 살아있는 써론트 기생충으로 면역화된 어류. 또한, 본 그룹의 어류들에 대해서는 침지 배쓰에 의해서 신경펩타이드 PACAP를 물 1 L 당 100 ㎍의 투여량으로 처리하였다. 처리는, 감염 2주 전부터 격일로 1시간 동안 수행하였다 (6회의 침지 배쓰).
그룹 4: 8000 마리의 살아있는 써론트 I. multifiliis로 1일째 면역화되고, 35일째에 10,000 마리의 살아있는 써론트 기생충으로 면역화된 어류. 또한, 본 그룹의 어류들에 대해서는 PACAP 없이 1시간 동안 그룹 3에 대한 과정과 유사한 과정으로 침지 배쓰를 수행하였다.
면역화 이전에, 어류들은 포르말린으로 처리함으로써 기존재하는 체외기생충들을 제거하였다. 어류들은 23 ± 2℃, 흐르는 물 중에서 보관하였다.
84일째에, 어류들에 15,000 마리의 써론트들을 감염시켰다. 치사율 데이터는 감염 후 30일 이내에 얻었다. 결과들은 하기 표 2에 나타내었다. 하기 결과들은 PACAP로 동시에 처리된 면역화된 어류들의 생존율이 27% 증가하였음을 보여준다.
I. multifiliis의 살아있는 써론트로 면역화되고 감염된 I. punctatus의, 침지 배쓰에 의한 PACAP 처리 이후의 생존
실험군 감염 어류/생존 어류 생존률 (%)
PBS 25/0 0
살아있는 써론트 25/15 60
살아있는 써론트 + PACAP ib 25/22 87
살아있는 써론트 + ib 25/14 56
ib: 본 어류들에 대해서는 감염 2주 전부터 격일로 1시간 동안 6회 침지 배쓰를 수행하였다.

Claims (17)

  1. 백신 항원용 분자 아쥬반트로서 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 펩타이드 (pituitary adenylate cyclase activating peptide, PACAP)의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 펩타이드 또는 핵산으로서 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PACAP 펩타이드는 a) 그 천연 공급원으로부터 분리되거나, b) 화학적 합성, 또는 c) 재조합 DNA 기술에 의해서 얻어지는 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 제1항에 있어서, 상기 백신 항원은 감염원에 의해서 야기되는 질병들의 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제4항에 있어서, 상기 질병들은 포유류, 어류 또는 조류에서 발생되는 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제4항에 있어서, 상기 감염원은 바이러스, 박테리아 또는 체외기생충인 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 펩타이드 (PACAP), 적어도 하나의 백신 항원 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 감염원에 의해서 야기되는 질병들의 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 경구, 주사 또는 침지 배쓰에 의해서 투여되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 PACAP이 a) 그 천연 공급원으로부터 분리, b) 화학적 합성, 또는 c) 재조합 DNA 기술에 의해서 얻어진 펩타이드로서; 또는 핵산으로서 투여되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 조성물이 배합 사료로서 가해지는 경우에는 상기 PACAP이 50-750 ㎍/kg 사료의 농도로 사용되고, 상기 조성물이 주사제로 가해지는 경우에는 상기 PACAP이 체중 1 그램 당 0.1-10 ㎍의 농도로 사용되며, 상기 조성물이 침지 배쓰에 의해서 가해지는 경우에는 상기 PACAP이 물 1리터 당 50-1000 ㎍의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. PACAP 및 적어도 하나의 백신 항원을 포함하는 백신 조합.
  13. 제12항에 있어서, 상기 PACAP 및 상기 항원은 동일한 면역화 스케줄 동안 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 백신 조합.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조합이 배합 사료로서 가해지는 경우에는 상기 PACAP이 50-750 ㎍/kg 사료의 농도로 사용되고, 상기 조합이 주사제로 가해지는 경우에는 상기 PACAP이 체중 1 그램 당 0.1-10 ㎍의 농도로 사용되며, 상기 조합이 침지 배쓰에 의해서 가해지는 경우에는 상기 PACAP이 물 1리터 당 50-1000 ㎍의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 백신 조합.
  15. 백신 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 상기 항원에 대한 아쥬반트로서 PACAP을 포함하는 조성물의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 아쥬반트로서 상기 PACAP 및 상기 항원을 포함하는 조성물이 동일한 면역화 스케줄 동안 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 PACAP 펩타이드가 a) 그 천연 공급원으로부터의 분리, b) 화학적 합성, 또는 c) 재조합 DNA 기술에 의해서 얻어지거나; 또는 핵산으로서 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
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