JP5971625B2 - アジュバント、及び水産用ワクチン - Google Patents
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Description
[1]1型インターフェロン又はインターフェロンγを含む、魚類の細胞内寄生病原体に対する不活化ワクチン用アジュバント。
[2]細胞内寄生病原体がバクテリアである、[1]記載のアジュバント。
[3]バクテリアがエドワジエラ・タルダである、[2]記載のアジュバント。
[4]魚類がカレイ目に属する魚である、[1]〜[3]のいずれかに記載のアジュバント。
[5]不活化した魚類の細胞内寄生病原体、またはワクチン活性を有する当該病原体の非感染性抗原、及び1型インターフェロンまたはインターフェロンγを組み合わせてなる、当該細胞内寄生病原体に対するワクチン。
[6]細胞内寄生病原体がバクテリアである、[5]記載のワクチン。
[7]バクテリアがエドワジエラ・タルダである、[6]記載のワクチン。
[8]魚類がカレイ目に属する魚である、[5]〜[7]のいずれかに記載のワクチン。
[9]油性アジュバントを実質的に含有しない、[5]〜[8]のいずれかに記載のワクチン。
[10]不活化した魚類の細胞内寄生病原体、またはワクチン活性を有する当該病原体の非感染性抗原、及び1型インターフェロン又はインターフェロンγの有効量を当該魚類に投与することを含む、当該魚類における細胞内寄生病原体感染の予防方法。
[11]細胞内寄生病原体がバクテリアである、[10]記載の方法。
[12]バクテリアがエドワジエラ・タルダである、[11]記載の方法。
[13]魚類がカレイ目に属する魚である、[10]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]油性アジュバントを実質的に投与しない、[10]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15]不活化した魚類の細胞内寄生病原体、及び1型インターフェロン又はインターフェロンγの有効量を魚に投与すること、および当該魚を飼育することを含む、当該魚の養殖方法。
[16]油性アジュバントを実質的に投与しない、[15]記載の方法。
我が国において、水産用ワクチンで使用されているアジュバントのほとんどは油性アジュバントである。油性アジュバントは界面活性剤および油脂からなり、ワクチン抗原と混合し乳化して使用される。しかし、油性アジュバントは長期間レシピエントの体内に残留することから、油性アジュバントを含有するワクチン接種後は49週間の水揚げ禁止期間を設けなければならない。これに対して、インターフェロンはタンパク質であることから、ワクチン効果の発揮に必要な免疫反応を誘導した後は、速やかに宿主の体内で代謝されると考えられる。したがって、長期間の水揚げ禁止期間が不要となる。
インターフェロンは、組換え技術を利用することで安定的にかつ大量に調製できる一方で、極めて少ない用量でアジュバント効果を発揮する。従って、インターフェロンは、一度に数万匹単位でワクチンを接種しなければならない養殖魚に適した非常に効率の良いアジュバントである。
(1) (I)と(II)とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、
(2) (I)と(II)とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の同一投与経路での同時投与、
(3) (I)と(II)とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、
(4) (I)と(II)とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の異なる投与経路での同時投与、
(5) (I)と(II)とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与(例えば、(I)→(II)の順序での投与、あるいは逆の順序での投与)
等が挙げられる。これらの投与形態全てが、本発明のワクチンに包含される。例えば、浸透法や経口法では、1型インターフェロンやインターフェロンγが十分に投与対象の魚の中に移行しない可能性も考えられるので、(I)を浸漬法又は経口法で投与し、(II)を注射法で投与する態様が考えられる。好ましくは、上記(1)〜(3)のいずれかの態様で、(I)及び(II)が注射法により投与対象へ投与される。
組換えヒラメインターフェロンの調製、およびその活性の確認
ヒラメ1型インターフェロンまたはインターフェロンγ遺伝子をほ乳類用の遺伝子発現ベクター(pSecTagベクタープラスミド)に組込み、ほ乳類細胞(HEK293)に一過的に導入した。この形質転換細胞から培地中に分泌された組換えインターフェロンを、ヒスチジンタグを利用したアフィニティー精製により濃縮・精製した。精製した組換え1型インターフェロンまたはインターフェロンγをヒラメ胚由来細胞(HINAE 細胞)またはヒラメの末梢血白血球の培地中に添加することでこれらの組換えタンパク質が活性を有するかどうかを確認した。
ヒラメ胚由来培養細胞を15% ウシ胎児血清を含むLeibovitz’s L-15培地で培養し、0〜2μg/mlとなるように組換えヒラメインターフェロンを添加した。陽性対照としてpoly I:Cを0〜2μg/ml添加する試験区も設けた。インターフェロン添加後、20時間経過した時点でtotal RNAを抽出し、目的遺伝子のmRNA蓄積量を測定した。測定は、SYBR greenを使用したインターカレーター法によるリアルタイムPCRで行った。
ヒラメ末梢血白血球を15% ウシ胎児血清を含むLeibovitz’s L-15培地で培養し、0.2μg/mlとなるように組換えヒラメインターフェロンを添加した。陽性対照としてpoly I:Cを0.2μg/ml添加する試験区も設けた。陰性対照には無刺激の末梢血白血球を用いた。インターフェロン添加後、1、3および6時間後に末梢血白血球を回収しtotal RNAを抽出した。目的遺伝子のmRNA蓄積量の測定は、SYBR greenを使用したインターカレーター法によるリアルタイムPCRで行った。3個体のヒラメより抹消血白血球を分離し別々に解析を行った。
不活化ワクチンの有効性の増強
1997年に長崎県でヒラメの病魚より分離されたエドワジエラ・タルダ NUF806株をワクチン株に使用した。本菌株を、28℃にて7.8×108colony forming unit (cfu)/mlに達するまで、ハートインフュージョン(HI)液体培地(2% NaCl含)で震盪培養した。培養後、ホルマリンを0.1%となるように添加し、4℃で48時間以上放置したものを不活化ワクチンとして使用した。ワクチン接種では、2μg/mlとなるようにPBSで希釈した各々の組換えインターフェロンを平均魚体重15gのヒラメ稚魚の腹腔内に100μl接種した(魚体重1gに対し10〜20ngの組換えインターフェロンを接種した)。次いで、時間差を設けずに上記の不活化ワクチンを100μl腹腔内に接種した。また、対照区として、リン酸緩衝液のみを接種した区画と不活化ワクチンのみを接種した区画を設けた。ワクチンを接種したヒラメ稚魚の免疫期間は3週間とし、25℃の調温海水で飼育した。
免疫有効率(relative percent survival; RPS)=(1-(ワクチン区の死亡率 / PBS区の死亡率)) ×100 (%)
Claims (10)
- 1型インターフェロン又はインターフェロンγを含む、魚類のエドワジエラ・タルダに対する不活化ワクチン用アジュバント。
- 魚類がカレイ目に属する魚である、請求項1記載のアジュバント。
- 不活化したエドワジエラ・タルダ、またはワクチン活性を有するエドワジエラ・タルダの非感染性抗原、及び1型インターフェロンまたはインターフェロンγを組み合わせてなる、魚類のエドワジエラ・タルダに対するワクチン。
- 魚類がカレイ目に属する魚である、請求項3記載のワクチン。
- 油性アジュバントを実質的に含有しない、請求項3又は4記載のワクチン。
- 不活化したエドワジエラ・タルダ、またはワクチン活性を有するエドワジエラ・タルダの非感染性抗原、及び1型インターフェロン又はインターフェロンγの有効量を魚類に投与することを含む、当該魚類におけるエドワジエラ・タルダ感染の予防方法。
- 魚類がカレイ目に属する魚である、請求項6記載の方法。
- 油性アジュバントを実質的に投与しない、請求項6又は7記載の方法。
- 不活化したエドワジエラ・タルダ、及び1型インターフェロン又はインターフェロンγの有効量を魚に投与すること、および当該魚を飼育することを含む、当該魚の養殖方法。
- 油性アジュバントを実質的に投与しない、請求項9記載の方法。
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