ES2345244T3 - Composiciones para incrementar la supervivencia de animales acuaticos expuestos a virus rna. - Google Patents
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Abstract
Uso de acivicina para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección de un animal acuático por el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV).
Description
Composiciones para incrementar la supervivencia
de animales acuáticos expuestos a virus RNA.
La presente invención está dirigida al uso de
acivicina para preparar un medicamento para el tratamiento de una
infección producida por un virus Birnaviridae en un animal
acuático, preferentemente para el tratamiento del virus de la
necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces.
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La presente invención generalmente apunta a
tratar los organismos, particularmente organismos acuáticos
susceptibles a un virus, como una infección por birnavirus
acuático, administrando compuestos que aumentan la supervivencia de
los sujetos cuando son expuestos o infectados con un virus. La
invención apunta a un método profiláctico/terapéutico para aumentar
la supervivencia de especies acuáticas, particularmente poblaciones
de los peces que pueden estar o pueden infectarse con un virus como
un birnavirus acuático y más particularmente a una composición para
la prevención y tratamiento del virus de la necrosis pancreática
infecciosa (infectious pancreatic necrosis virus) (IPNV) en peces
comprendiendo compuestos isoxazol y/o compuestos aminoglicósido. La
invención también apunta a un método profiláctico/terapéutico para
aumentar la supervivencia de especies animales, particularmente
pollos y poblaciones de cerdo que pueden estar o pueden infectarse
con un virus como un birnavirus, ortomixovirus, picornavirus y a
una composición para la prevención y tratamiento del virus de la
enfermedad infecciosa bursal (infectious bursal disease virus)
(IBDV) en pollos que comprende compuestos isoxazol y/o
compuestos
aminoglicósido.
aminoglicósido.
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Se estima que las enfermedades de los peces
cuestan veinte a treinta centavos por cada dólar gastado en la
crianza del pez en los Estados Unidos. Aunque los patógenos de peces
incluyen hongos, protozoos y los agentes bacterianos, las
enfermedades virales son la mayor preocupación de los criadores de
peces, gerentes del criadero y científicos porque son
principalmente ingobernables. Los peces son susceptibles a una
variedad de infecciones y enfermedades virales. Tales virus
incluyen IPNV, virus de la necrosis celular del pillar (PCNV), virus
de necrosis de hematopoyética infecciosa (IHNV), virus de la
septicemia hemorrágica vira1 (VHSV), virus de la necrosis
hipodermal y hematopoyética infecciosa (IHHNV), virus de la mancha
blanca de la gamba (WSV), virus del síndrome Taura (TSV),
parvovirus hepatopancreático (HPV), virus de la anemia infecciosa
del salmón (ISAV), así como otros en las familias siguientes:
Birnaviridae, Rhabdoviridae, Iridoviridae, Reoviridae,
Ortomixovirus, y Picornavirus. Por ejemplo, los
birnavirus acuáticos infectan sobre 63 organismos marinos y de agua
fresca como peces, gambas y otros crustáceos, ostras y otros
moluscos. E1 birnavirus acuático, IPNV, es el agente causal de la
enfermedad pancreática en el pez. Otras especies de
Birnaviridae son conocidas, tales como IBDV, virus de la
tellina y virus de la ostra.
IPNV e IBDV son miembros de la familia
Birnaviridae. Ellos son virus icosahédricos sin envoltura de
aproximadamente 60 nm de diámetro con un genoma que consiste en dos
segmentos de ARN de doble-hebra.
El virus infeccioso de la necrosis pancreática
(IPNV) es una enfermedad vira1 contagiosa en una variedad de
animales acuáticos. En el pez, IPNV causa morbosidad y mortalidad en
la trucha arco iris, salmón Atlántico, salmón de Pacífico, trucha
de arroyo y otros salmónidos, sobre todo en fases de pececillos y
fases juveniles. IPNV es capaz de infectar a varios hospederos
diferentes y tiene presencia mundial. Pilcher et al., Crit.
Rev. Microbiol. 7:287 (1980), contenidos que están incorporados como
referencia en su integridad. IPNV se ha aislado en una variedad de
especies animales acuáticas a lo largo del mundo, incluyendo varias
especies de truchas y especies de salmones, carpa, percha, pica,
anguilas, char, moluscos y crustáceos. Los ejemplos de especies de
peces y crustáceos/mariscos en que IPNV y virus similares a IPNV se
ha aislado se encuentran en la Tabla 1. Por ejemplo, IPNV se ha
encontrado en animales acuáticos tales como salmón Atlántico, la
trucha arco iris cultivada Oncorhynchus mykiss, lenguado
salvaje Rhombosolea tapirina, bacalao Pseudophycis
sp., pez perro Squalus megalops y brezo Genypterus
blacodes. Crane et al., Dis. Aquat. Organ. 43:1 (2000).
IPNV se ha aislado de especies salmónidos y especies
no-salmónidos de peces sin síntomas patogénicos.
El virus de la enfermedad infecciosa bursal
(1BDV) también es una enfermedad viral contagiosa en una variedad
de pájaros. IBDV afecta la bursa de Fabricius, un órgano que produce
linfocitos que ayudan a proteger los pájaros contra enfermedad y
muerte. IBDV ataca la bursa, matando las células linfoides y
suprimiendo los sistemas inmunológicos de los pájaros. Los síntomas
clínicos de IBDV incluyen diarrea, depresión de peso, palidez, y
cojera. Estos síntomas producen poblaciones aumentadas de cadáveres
de pájaros, sobre el promedio de mortalidad y conversión del
alimento y ganancia de peso pobre. IBDV causa problemas serios para
los productores de pollos comerciales a lo largo del mundo,
costando millones de dólares anualmente en pérdidas de la producción
y costos de tratamiento y sumando sobre cien millones de dólares en
pérdidas cada año a nivel mundial. IBDV es capaz rápidamente de
producir virus mutantes, llamados cepas variantes que son
resistentes a las vacunas.
\newpage
En los sobrevivientes de un IPNV epizoótico, el
virus persiste y puede causar el retraso de crecimiento severo en
el pez individual que exhibe la persistencia del virus. McKnight
et al., Br. Vet. J. 132: 76 (1976). En salmones pequeños,
IPNV produce necrosis considerable o inflamación del páncreas. La
enfermedad aguda se ha informado principalmente en un número
limitado de especies salmónidas, como la trucha y salmón. Muchas de
estas especies son de gran importancia económica. Porque la
mortalidad puede ser tan alta como 90 por ciento, la aparición de
IPNV en un criadero puede ser un desastre económico. Pilcher et
al., Crit. Rev. Microbiol. 7:287 (1 980).
La edad más susceptible para la infección de
IPNV en el pez está en el pez joven, sobre todo aquellos que tienen
dos a cuatro meses de edad, en los cuales tales infecciones resultan
en mortalidad alta. Wolf et al.. US. DEPT.INT. BUR. Sport
Fish and Wildlife Fish Disease Leaflet 1:14 (1966); Frantsi et
al., J. Wildlife Dis. 7:249 (1971). En la trucha, el IPNV ataca
normalmente peces jóvenes de aproximadamente cinco a seis semanas
después de su primer alimento. Se sabe que el IPNV afecta al pez en
su primer año en el agua salada y se extiende rápidamente en el pez
cultivado contenido en jaulas de mar. Los peces afectados son
delgados, anoréxicos y letárgicos con una tendencia a congregarse
en las esquinas de la jaula y no mantener una posición horizontal.
Ferguson et al., J. Fish Dis. 9:95 (1986). Los peces
afectados son más oscuros que lo usual, mueven los ojos ligeramente
y a menudo inflan la barriga. Al principio de una aparición, se ven
grandes números de peces lentos y oscuros contra las salidas de
agua, y se ven "peces estremeciéndose" casi en la superficie.
Los peces estremeciéndose resultan un síntoma característico de la
enfermedad, presentan una forma violenta de nadar en que los peces
ruedan girando sobre su eje mayor. Si se examina la anatomía
interior del pez afectado, una mucosidad blanca característica se
ve en el estómago. El páncreas parece ser el órgano designado como
primario para el virus. McKnight et al., Br. Vet. J. 132:76
(1976).
Después de una aparición del IPNV, el pez
sobreviviente generalmente se vuelve portador del virus. Los peces
que llevan el virus son un problema serio para la industria de la
acuicultura porque el único método actualmente disponible para
eliminar el virus en el pez del portador, es la destrucción completa
de estos peces. Varios factores parecen influir en la severidad de
la infección y el subsiguiente establecimiento del estado de
portador. Estos factores incluyen edad, especie y temperatura del
agua. Los portadores supervivientes tienen IPNV infeccioso para el
resto de su vida, lo que es perceptible en su materia fecal y
productos del sexo. Billi et al., J. Fish. Res. Bd. Can.
26:1459 (1 969); Yamamoto, Can. J. Micro. 21:1343 (1 975); y Reno
et al., J. Fish. Res. Bd. Can. 33:1451 (1978). La
persistencia del virus en el pez portador parece ser el resultado de
producción del virus en forma continuada por un número pequeño de
células infectadas en ciertos órganos. Hedrick, Ph.D. Tesis,
"Persistent Infections of Salmonid Cell Lines with Infectious
Pancreatic Necrosis Virus: A Model for the Carrier State in
Trout", Oregon State University, 1980. Para IPNV, hay por lo
menos 9 tipos de cepas de Serogrupo A y otras 4 cepas
representantes del Serotipo Al. IPNV Serotipo Al es el birnavirus
acuático predominante y el serotipo de IPNV en Estados Unidos. La
familia Birnaviridae describe y clasifica un grupo de virus,
birnavirus que llevan un genoma de ARN de
doble-hebra bisegmentado como su característica
prominente; los dos segmentos se llaman el segmento A y B. El ARN
está encerrado en una cápside icosahedral
no-envolvente, de aproximadamente 60 nm de
diámetro, que se coloca como una sola capa. Los dos representantes
principales de esta familia de virus son el virus de la necrosis
pancreática infecciosa de pez (IPNV) y el agente causal de la
enfermedad infecciosa de la bursa de pollos (IBDV). El ARN tanto de
IPNV como de IBDV está unido covalentemente a un polipéptido de
alto peso molecular, el cual tiene aproximadamente 100 kDa. El
birnavirus tienen al menos cuatro proteínas estructurales: llamadas
VP1, VP2, VP3 y VP4. La secuencia de VP1, VP2, VP3 y VP4 permitieron
la construcción del mapa genómico tanto de IPNV como de IBDV.
Ver Dobos, P., The Molecular Biology of IPNV. Ann. Rev. Fish
Disease, 5:25-54 (1995).
El genoma viral de IPNV está contenido dentro de
una cápside icosahedral no-envolvente que tiene
aproximadamente 60 nm de diámetro. El segmento más grande,
segmento "A", tiene un peso molecular de 2,5 x 10^{6} Daltons
(Da) y codifica al menos tres proteínas. Su orden en el genoma, del
N (5') terminal, es \beta(VP2) (aproximadamente 54 kDa,
proteína principal de la cápside); \gamma2 (NS) (una proteína no
estructural de aproximadamente 27,5 kDa que tiene actividad
proteolítica); y \gamma1 (VP3) (una proteína menor de cápside de
aproximadamente 31 kDa). Chang et al., Can. J. Microbiol.
24:19 (1978); Huang et al., J. Virol. 60: 1002 (1986). Estas
proteínas son codificadas en un solo ARNm dentro de la célula
infectada. Mertens et al., Nature 297:243 (1982). El segmento
A del genoma de IPNV contiene un marco de lectura abierto grande
(ORF) codificando una poliproteína de 106 kDa que tiene la
estructura:
NH2-preVP2-VP4-proteasa-VP3-COOH.
La poliproteína es cortada cotraduccionalmente por una proteasa
codificada por el virus, para generar el preVP2 (pVP2) y VP3. El
pVP2 es luego cortado durante la maduración viral para producir
VP2. El segmento de genoma A contiene un ORF pequeño adicional que
solapan el amino terminal del ORF de la poliproteína y es un marco
de lectura diferente. Este ORF pequeño codifica un polipéptido
menor de 17 kDa rico en arginina que puede detectarse en células
infectadas con IPNV. El producto del segmento del genoma B es un
polipéptido interior menor VPl. VP1 es una
ARN-polimerasa putativa dependiente de ARN
virion-asociada. VP1 está presente en los viriones
en dos formas: (1) como un polipéptido libre y (2) como una
proteína unida a genoma (VPg).
Los mapas genómicos establecidos para IBDV son
similares al mapa genómico del IPNV descrito antes, que indica que
su organización genómica es en general característica de birnavirus.
Así, los únicos rasgos de birnavirus son: (i) un segmento del
genoma A es estructuralmente y funcionalmente bicistrónico; (ii) la
producción de una poliproteína que es cortada por una proteasa
virus-codificada; y (iii) la presencia de una
proteína unida a genoma (VPg). Además, ambos segmento de genoma A y
segmento de genoma B contienen regiones no codificantes de tamaño
considerable en ambos extremos. Estas secuencias no codificantes
pueden ser importantes para el reconocimiento de la polimerasa,
iniciación de traducción y posiblemente el embalaje del genoma.
Además, el segmento A de IPNV contiene terminales repetidos
invertidos de 14 nucleótidos que son similares a aquéllos
informados para el segmento A de IBDV. Ver, Encyclop. Vir.,
Ed. R.G. Webster y A. Granosf, Academic Press (1995)
143-149.
Unos pocos compuestos antivirales utilizados
para tratamiento de virus humanos han sido probados por su habilidad
de bloquear la infección de IPNV in vitro. Ellos son:
virazole (Savan et al., J. Fish Dis. 3:437 (1980));
ribavirin, pirazofurin y EICAR
(5-etinil-1-\beta-ribofuranosilimidazol-carboxamida)
(Migus et al., J. Gen. Virol. 47:47 (1980); Jashés et
al., Antiviral Res. 29:309 (1996)). Aunque el ribavirin mostró
inhibir la replicación de IPNV in vitro, no tuvo eficacia
in vivo. Migus et al., J. Gen Virol. 47:47 (1980).
Cuando se dio EICAR a la trucha arco iris y pececillos de salmón de
Coho en el primer día después de que los pececillos se infectaron
experimentalmente con IPNV, ocurrieron menos muertes entre los
pececillos infectados. Moya et al., Antiviral Res. 48: 125
(2000).
Se establecieron ensayos in vivo para
demostrar la habilidad del compuesto candidato para inhibir la
replicación vira1 in vivo y/o mejorar la morbosidad y
mortalidad. Esto mostró que ribavirin inhibe eficazmente la
replicación de IPNV in vitro pero no in vivo. Migus
et al., supra (1980); Savan et al., J. Fish.
Dis. 3: 437 (1980). Para disminuir el predominio de la enfermedad y
aumentar los rendimientos de peces cultivados, un número
considerable de antibióticos y químicos son utilizados para tratar
el agua durante el cultivo del pez. Se listan ejemplos de tales
antibióticos y químicos en la Tabla 2.
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De otra manera que la destrucción de stocks
infectados y la desinfección de medios del criadero, no hay ningún
tratamiento actual que comprenda un compuesto isoxazol y/o un
compuesto aminoglicósido para combatir las infecciones virales en
un lugar de acuicultura que sea capaz de aumentar la supervivencia
de animales acuáticos susceptibles a la infección viral. Hay
también una necesidad por métodos y composiciones que comprendan
compuestos isoxazol y/o compuestos aminoglicósido que pueden
administrarse antes, durante y para los periodos de tiempo después
de que la especie susceptible se expone a un virus. Además, hay una
necesidad por un tratamiento para combatir un virus en un lugar de
acuicultura que emplee un compuesto isoxazol y/o un compuesto
aminoglicósido que sea estable en solución. Además, no hay
actualmente una composición de comida acuática que contenga un
compuesto isoxazol que sea capaz de aumentar la supervivencia de
animales acuáticos susceptible a una infección viral antes, durante
y para los periodos de tiempo después de que la especie susceptible
se expone al virus. De acuerdo con esto, hay una necesidad por un
método para aumentar la supervivencia de animales acuáticos
expuestos a o infectados con un virus dónde el método incluya
administración de un compuesto isoxazol y/o un compuesto
aminoglicósido. Hay una necesidad por un método de administración de
un compuesto isoxazol y/o un compuesto aminoglicósido a los
animales, incluyendo los animales acuáticos, susceptibles a una
infección viral, para aumentar su supervivencia cuando sea expuesto
a o infectado con un virus.
De otra manera que la destrucción de stocks
infectados y la desinfección de medios del criadero, no hay ningún
tratamiento actual para combatir IPNV en acuicultura que sea capaz
de aumentar la supervivencia de animales acuáticos susceptibles a
la infección con IPNV. Tampoco, hay ningún tratamiento actual para
combatir IBDV de manera que sea capaz de aumentar la supervivencia
de animales susceptibles a la infección con IBDV. Hay también una
necesidad por métodos y composiciones que pueden administrarse
antes, durante y para los periodos de tiempo después de que la
especie susceptible se expone a IPNV o IBDV. Además, no hay un
tratamiento para combatir IPNV en un lugar de acuicultura que
emplee un compuesto que sea estable en solución, particularmente un
compuesto isoxazol. Además, no hay actualmente una composición de
comida acuática que contenga un compuesto que sea capaz de aumentar
la supervivencia de animales acuáticos susceptibles a una infección
con IPNV antes, durante y para los periodos de tiempo después de
que la especie susceptible se expone a IPNV. Además, no hay
actualmente una composición de comida acuática que contenga un
compuesto que sea capaz de aumentar la supervivencia de animales
acuáticos susceptibles a una infección con IBDV antes, durante y
para los periodos de tiempo después de que la especie susceptible
se expone a IBDV. De acuerdo con esto, hay una gran necesidad por un
método para aumentar la supervivencia de animales, incluyendo
animales acuáticos expuestos a o infectados con IPNV e IBDV, además
de la necesidad por tales métodos. Por esto hay una necesidad por un
método de administración de un compuesto para animales acuáticos
susceptibles a una infección por IPNV que aumentaría su
supervivencia cuando sea expuesto a o infectado con IPNV. Además,
hay una necesidad por un método de administración de un compuesto a
los animales susceptibles a infección por IBDV que aumentaría su
supervivencia cuando es expuesto a o infectado con IBDV.
Es por consiguiente un objetivo de la presente
invención proporcionar un método para aumentar la supervivencia de
un animal susceptible a la infección por, expuesto a o infectado
por, un virus seleccionado de grupo consistente de: IPNV, IBDV,
virus de la necrosis celular del pillar (PCNV), virus de la necrosis
hematopoyética infecciosa (IHNV), virus de la septicemia
hemorrágica viral (VHSV), virus de la necrosis hipodermal y
hematopoyética infecciosa (IHHNV), virus de la mancha blanca de la
gamba (WSV), virus del síndrome Taura (TSV), parvovirus
hepatopancreático (HPV), virus de la anemia infecciosa del salmón
(ISAV), virus de la tellina, virus de la ostra, virus
Birnaviridae, virus Rhabdoviridae, virus
Iridoviridae, virus Reoviridae, virus
Picornaviridae y virus Ortormixoviridae, administrando
una cantidad eficaz de un compuesto isoxazol y/o un compuesto
aminoglicósido al animal.
Es un objetivo adicional de esta invención
proporcionar un método de tratamiento para un animal acuático
susceptible a la infección de un virus seleccionado del grupo
consistente de: IPNV, virus de la necrosis celular del pillar
(PCNV), virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), virus
de la septicemia hemorrágica viral (VHSV), virus de la necrosis
hipodermal y hematopoyética infecciosa (IHHNV), virus de la mancha
blanca de la gamba (WSV), virus del síndrome Taura (TSV),
parvovirus hepatopancreático (HPV), virus de la anemia infecciosa
del salmón (ISAV), virus de la tellina, virus de la ostra, virus
Birnaviridae, virus Rhabdoviridae, virus
Iridoviridae, virus Reoviridae, virus
Picornaviridae y virus Ortomixoviridae, comprendiendo
alimentar el pez u otro animal con una comida que contiene una
cantidad eficaz de un compuesto isoxazol y/o un compuesto
aminoglicósido.
Es aún otro objetivo de la presente invención
proporcionar un método de criar peces y otros animales que comprende
la administración de una cantidad eficaz de un compuesto isoxazol
y/o un compuesto aminoglicósido.
En otro objetivo de la presente invención, el
compuesto isoxazol empleado en el método y las composiciones,
incluso las composiciones de comida, es un compuesto isoxazol que se
selecciona del grupo consistente de compuestos acivicin y análogos
de acivicin que tienen la Fórmula
en que R se selecciona del grupo
consistente de hidrógeno y alquil de 1 a 8 átomos de carbono; R1 y
R2 son diferentes y se seleccionan del grupo consistente de
hidrógeno, un compuesto de
Fórmula,
o cuando toman junto con la forma
del átomo de nitrógeno un grupo teniendo la
Fórmula
en que R3 es alquilo de 1 a 8
átomos de carbono, inclusive; y R4 se selecciona del grupo
consistente de (a) un compuesto teniendo la
Fórmula
en R5, R6, R7 y R8 se seleccionan
del grupo consistente de hidrógeno y alquil de 1 a 5 átomos de
carbono, incluyendo (b) un compuesto de
Fórmula
(c) el ortointerfenileno, y (d)
ortointerfenilenos sustituidos con la condición que otro que cuando
R1 y R2 forman un anillo con el átomo de nitrógeno uno de R1 y R2
siempre debe ser hidrógeno, preferentemente R y R1 son el hidrógeno
y R2 es el alcoxicarbonil; más preferentemente R2 es
L-butiloxicarbonil y el compuesto es ácido
3-cloro-2-[[(1,1-dimetoxi)carbonil]amino]-4,5-dihidro-5-isoxazolacético;
también preferentemente R es hidrógeno y R1 y R2 juntos con el
átomo de nitrógeno forma el grupo de
Fórmula
más preferentemente R4 es
ortointerfenileno y el compuesto es ácido
ftalil-(\alphaS,5S)-\alpha-amino-3-cloro-4,5-dihidro-5-isoxazolacético;
así como las mezclas racémicas e isómeros ópticamente activos de
compuestos que tienen la
Fórmula
\newpage
en qué R se selecciona del grupo
consistente de hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
inclusive, alquilo halogenado de 1 a 3 átomos de halógeno, y 1 a 5
átomos del carbono, inclusive, el aralquilo de 7 a 20 átomos del
carbono, inclusive; y aralquilo sustituido de 7 a 20 átomos de
carbono, inclusive. X se selecciona del grupo consistente de bromo,
cloro, flúor y yodo, -OR1, -SR1, y -NR'R'' en donde R1 se
selecciona del grupo consistente de alquilo de 1 a 12 átomos de
carbono, inclusive, aril de 6 a 20 átomos de carbono, inclusive;
aralquilo de 7 a 20 átomos de carbono; inclusive; R' y R'' son
iguales o diferentes y se seleccionan del grupo consistente de
hidrógeno y alquilo de 1 a 8 átomos de carbono; se seleccionan R14 y
R15 del grupo consistente de hidrógeno, teniendo un compuesto
la
Fórmula
Fórmula
o cuando se toman junto con el
átomo de nitrógeno o el grupo teniendo la
Fórmula
en que R6 es alquilo de 1 a 8
átomos de carbono, inclusive, alquilo halogenado de 1 a 5 átomos de
carbono, inclusive, y 1 a 3 átomos de halógeno, inclusive,
aralquilo de 7 a 20 átomos de carbono, inclusive y aralquilo
sustituido de 7 a 20 átomos de carbono, inclusive, R7 se selecciona
del grupo consistente de alquilo de 1 a 12 átomos de carbono,
inclusive, aril de 6 a 20 átomos de carbono, inclusive, aralquilo de
7 a 20 átomos de carbono, inclusive, y aralquilo sustituido de 7 a
20 átomos de carboho, inclusive; y R8 se selecciona del grupo
consistente de un compuesto teniendo la
Fórmula
en que se seleccionan R9, R10, R11
y R12 del grupo consistente de hidrógeno y alquilo de 1 a 5 átomos
de carbono, inclusive, (b) un compuesto teniendo la
Fórmula
(c) compuestos ortointerfenileno
teniendo la
Fórmula
y (d) ortointerfenileno sustituido
con la condición que cuando R, R14 y R15 son todos hidrógeno, X no
puede ser cloro y la condición adicional que cuando R14 y R15 son
hidrógeno y R8 es ortointerfenileno, R no puede ser hidrógeno o
alquilo de 1 a 8 átomos de
carbono.
En otro objetivo de la presente invención, el
compuesto isoxazol empleado en el método y las composiciones,
incluso las composiciones de comida, se selecciona del grupo
consistente de un compuesto derivado de isoxazol que tiene la
Formula
en que: R1 es alquilo, alcoxi,
hidroxi, cicloalquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxialcoxi,
alquilotioalquilo, alquilosulfinilalquilo, alquilosulfonilalquilo,
aminoalquilo, alquiloaminoalquilo. dialquiloaminoalquilo,
alcoxicarbonil, carboxi, o cianometil; Y es independientemente
alquileno de 3 a 9 átomos de carbono, R2 y R3 son hidrógeno,
alquilo, alcoxi, halo, ciano, trifluorometil y nitro; R4 es alcoxi,
hidroxi, halometil, dihalometil, trihalometil, dihaloetil,
cicloalquilo, heterociclilo, alcoxicarbonil, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, alcanocarboniloxialquilo, ciano, halo, tioalquilo,
alquilotioalquilo, alquilotio, tio,
2,2,2-trifluoro-etilo,
(4-metilfenil) sulfoniloximetil, N=Q o CON=Q, en
donde N=Q es amino, alquilamino o dialquilamino; R5 es hidrógeno o
halo o
alquilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Un objetivo adicional de las invenciones
presentes es proporcionar los métodos y composiciones, incluso las
composiciones de comida, teniendo un compuesto isoxazol seleccionado
del grupo consistente: de un compuesto derivado de isoxazol que
tiene la Fórmula
en que: Y es un puente de alquileno
de 3-9 átomos de carbono; Z es N; R es hidrógeno o
alquilo menor de 1-5 átomos de carbono, con la
condición que cuando Z es N, R es alquilo menor; R1 y R2 son
hidrógeno, halógeno, alquilo menor, alcoxi menor, nitro,
alcoxicarbonil menor o trifluorometil; y Het se selecciona de los
grupos heterocíclicos especificados,
1,3,4-oxadiazol-2-il
no sustituido y
1,2,4-oxadiazol-5-il
no
sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un método para aumentar la supervivencia de animales
acuáticos y otros susceptibles a birnavirus, expuestos y/o
infectados, administrando una cantidad eficaz de un compuesto al
animal donde el compuesto es cualquiera de los siguientes:
neomicina, paramomicina, estreptomicina, tobramicina, dibekacina,
kanamicina, amikacina, gentamicina, sisomicina, netilmicina,
lividomicina, ribocamicina, análogo adenina, y análogo guanina.
Cuando se usan neomicinas para aumentar la supervivencia de los
animales acuáticos u otros infectados por birnavirus, neomicinas se
utilizan en una manera y/o composición que logran la supervivencia
aumentada mediando su efecto en la infección del virus; por ejemplo,
inhibiendo la síntesis de ARN del virus para aumentar la
supervivencia de los animales viralmente infectados. Es por
consiguiente un objetivo de la presente invención proporcionar un
método para aumentar la supervivencia de animales y especies
acuáticas infectadas con la infección del birnavirus tratándolos con
un compuesto químico capaz de inhibir la replicación viral, como
isoxazol o neomicina.
Un objetivo adicional de la presente invención
apunta a un método para tratar un animal acuático u otro animal
susceptible a IPNV o a infección por IBDV, expuesto a y/o infectado
con IPNV o IBDV, incluso comprendiendo comer el alimento que
contiene una cantidad eficaz de un compuesto seleccionado de los
siguientes: neomicinas, paramomicina, estreptomicina, tobramicina,
dibekacina, kanamicina, amikacina, gentamicina, sisomicina,
netilmicina, lividomicina, ribocamicina, análogos de adenina, y
análogos de guanina.
En estos objetivos de la invención, la
administración puede lograrse por métodos conocidos en el arte,
incluyendo cualquiera de los métodos siguientes: introducir el
compuesto en el ambiente acuático; incluyendo el compuesto en la
comida; inyectando en el animal el compuesto disuelto en un portador
farmacéuticamente aceptable.
En otro objetivo de la presente invención, el
compuesto empleado es acivicin o un derivado del isoxazol que es un
compuesto WIN. En otra forma preferida, el compuesto isoxazol es
estable en solución y/o cuando es humedecido. Una forma adicional
de los métodos y composiciones de la presente invención utiliza el
compuesto en una cantidad eficaz que aumenta la supervivencia del
animal en aproximadamente 10% a aproximadamente 30%; preferentemente
la supervivencia aumenta de aproximadamente 10% a aproximadamente
70%. Otro objetivo de la presente invención emplea una
concentración del compuesto isoxazol o del compuesto aminoglicósido
que eficazmente inhiben la replicación viral en el animal
infectado. Las concentraciones preferidas también pueden disminuir
la carga viral/título viral del IPNV en un tejido por
aproximadamente 10 a 1000 veces o la carga puede disminuir entre
aproximadamente 10^{1} pfu/ml y 10^{3} pfu/ml. Concentraciones
preferidas que son una cantidad eficaz del compuesto isoxazol
pueden ser de aproximadamente 7,0 \mug/ml a aproximadamente 30
\mug/ml de agua en su ambiente, preferentemente de
aproximadamente 9,0 \mug/ml a aproximadamente 14,0 \mug/ml de
agua en su ambiente.
Un objetivo adicional de los métodos y
composiciones de la presente invención apunta a las aves de corral
y animales acuáticos preferidos que son peces, copepodos,
cefalópodos, crustáceos, gambas, anguilas, moluscos y ostras. Otro
objetivo de la presente invención apunta al pez a que el método
presente y las composiciones son aplicadas, aquellos listados en la
Tabla l. También, los peces pueden seleccionarse de los peces en las
familias siguientes: Anguillidae, Bothidae, Caragidae,
Cotostomidae, Chichlidae, Clupeidae, Cobitidae, Coregonidae,
Cyprinidae, Esocidae, Moronidae, Paraichthydae, Percidae,
Poecilidae, Salmonidae, Salvelinus, Sciaenidae, Thymallidae y
las especies Seriola quinqueradiata (yellowtail),
Scophthalmus maximus (rodabalo), Limanda limanda
(dab), Hippoglossus hippoglossus (halibut), Gadus
morhua (Bacalao Atlántico), Misgrunus
anguillisaudatus (loach), y Esox lucious (pike); más
preferentemente, el pez es de la faminlia Salmonidae o
Salvelinus, incluyendo la trucha arco iris, la trucha del
arroyo, salmón, Oncorhynchus tshawytscha (Chinook, Rey, o
Primavera), Oncorhynchus nerka (Blueback, Rojo, Sockeye),
Oncorhynchus kisutch (Coho, Plata), Oncorhynchus
gorbuscha (Rosa), Onchorhynchus mykiss (trucha Arco
iris), Oncorhynchus keta (Chum o Keta) y Oncorhynchus
masou (Masou, o Cereza).
Aún otro objetivo de la presente invención es
proporcionar la comida y métodos que emplean tal comida que
contiene compuesto isoxazol y/o compuesto aminoglicósido. Una de
tales composiciones preferidas es un pellet de comida el cual puede
ser un pellet húmedo.
Un objetivo adicional de la presente invención
proporciona una cantidad eficaz del compuesto isoxazol y/o
compuesto aminoglicósido para hacer más lenta o detener la
progresión de la enfermedad, como la enfermedad pancreática. En
otros objetos de las invenciones presentes, los métodos y
composiciones de comida están dirigidos a peces que pesan
aproximadamente 0,6 a aproximadamente 10 gramos, peces que pesan de
aproximadamente 10 gramos a aproximadamente 200 gramos, peces que
pesan de aproximadamente 200 gramos a aproximadamente 5000 gramos,
o más. En otros objetivos de las invenciones presentes, los métodos
y composiciones de comida se dirigen a los animales, como aves de
corral o cerdos, pesando de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 10
gramos, o pesando de aproximadamente 10 gramos a aproximadamente
200 gramos, o pesando de aproximadamente 200 gramos a
aproximadamente 5000 gramos, o más.
También es un objetivo de la presente invención
proporcionar tales métodos en que la administración o alimentación
pueden ocurrir: (i) antes de la exposición del animal a y/o
infección con el virus; (ii) durante la exposición del animal a y/o
infección con el virus; y/o (iii) después de la exposición del
animal a y/o infección con el virus; o (iv) cualquier combinación
de tal administración de tiempos de alimentación.
En otro objetivo de la presente invención, la
administración o alimentación pueden ocurrir: (i) antes de la
exposición del animal a y/o infección con un virus; (ii) durante la
exposición del animal a y/o infección con un virus; y/o (iii)
después de la exposición del animal a y/o infección con un virus. En
un objetivo adicional de la invención, la administración o
alimentación pueden ocurrir: (i) antes de la exposición del animal a
y/o infección con un virus; (ii) durante la exposición del animal a
y/o infección con un virus; y/o (iii) después de la exposición del
animal a y/o infección con un virus.
Es todavía otro objetivo de la invención
entregar comida a animales acuáticos, como la comida del pez, está
en la forma de un pellet. Preferentemente, la comida contiene un
compuesto isoxazol, preferentemente acivicin, a una concentración
de aproximadamente 1\mug a aproximadamente 100 \mug/gramo de
comida, preferentemente de aproximadamente 5 \mug a
aproximadamente 25 \mug/gramo de comida.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un método para aumentar la supervivencia de un animal
susceptible a la infección por un virus seleccionado del grupo
consistente de: virus de la enfermedad infecciosa bursal (IBDV),
virus Birnaviridae, virus Rhabdoviridae, virus
Iridoviridae, virus Reoviridae, virus
Picornaviridae, virus Ortomixoviridae, virus
Paramixovirus y virus Arterivirus comprendiendo la
administración de una cantidad eficaz de un compuesto isoxazol al
animal. En un objetivo preferido de la presente invención, el
animal es un pájaro y el virus es virus de la enfermedad infecciosa
bursal (IBDV). Es un objetivo adicional de la presente invención
proporcionar un método para tratar un animal susceptible a la
infección de IBDV administrando una cantidad eficaz de un compuesto
isoxazol en que la administración es por un método seleccionado del
grupo consistente de: (i) incluir el compuesto en la comida y (ii)
inyectar en el animal el compuesto disuelto en un portador
farmacéuticamente aceptable. Más allá, la administración es
conducida en un momento, como antes de; durante; después de; durante
y después de; antes de y durante; antes de y durante y después de;
o antes de y después de que el animal se expone a y/o infecta por el
virus.
También es un objetivo de la presente invención
proporcionar un método donde la cantidad eficaz es una concentración
que disminuye la carga viral/título viral de IBDV en un tejido del
animal; como ejemplos, la cantidad eficaz puede ser: una
concentración que disminuye la carga viral/título viral de IBDV en
un tejido del animal por sobre alrededor de 10 veces a sobre
l0^{4} veces o una cantidad que retarda o detiene la progresión de
la enfermedad de IBDV. La administración puede ocurrir después de
que se descubren las señales clínicas de IBDV, después del
descubrimiento de IBDV en el tejido del animal, y/o después del
descubrimiento de mortalidad aumentada o disminución de la
supervivencia en el animal.
Es todavía otro objetivo de la presente
invención proporcionar una composición de alimento animal que
contiene un compuesto isoxazol, como acivicin.
Otros objetivos, rasgos y ventajas de la
presente invención se aclararán en la siguiente descripción
detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción
detallada y los ejemplos específicos, indican formas preferidas de
la invención, sólo se dan como ilustración, ya que varios cambios y
modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención serán
obvias para los experimentados en el arte a partir de esta
descripción detallada.
Figura 1 es una autoradiografía que muestra el
efecto de acivicin en la síntesis del ARN genómico de IPNV.
Monocapas de células CHSE-214 se infectaron con IPNV
ya sea en ausencia de acivicin (líneas 1 y 4), o en presencia de
acivicin a 25 \mug/ml (líneas 2 y 5) o la presencia de acivicin a
70 \mug/ml (líneas 3 y 6). Simultáneamente, acivicin y 50
\muCi/ml de ácido [^{32}P]-ortofosfórico se
agregaron a las 0 horas post-infección (h.p.i.) y
las células se incubaron a 15ºC. A 24 horas
post-infección (líneas 1, 2 y 3) y 48 horas
post-infección (líneas 4, 5 y 6), las células
fueron cosechadas, se extrajo ARN de ellas y se analizó en
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) al 7% y
autoradiografía. La migración de los segmentos A y B del ARN
genómico de IPNV se indica por las flechas.
Figura 2 es un autoradiografía que muestra el
efecto de acivicin en la síntesis del polipéptido de IPNV. Monocapas
de células CHSE-214 se infectaron con IPNV ya sea
en ausencia de acivicin (líneas 1 y 9), o en presencia de acivicin
a 25 \mug/ml (líneas 4 y 10) o la presencia de acivicin a 70
\mug/ml (líneas 5 y 11). Acivicin se agregó en el momento de
infección (cero h.p.i.) y las células se incubaron a 15ºC. A las
células se les aplicó 50 \muCi/ml de
[^{35}S]-metionina seis horas
post-infección. A 24 h.p.i. (líneas 1 a 5) y a 48
h.p.i., 100 \mul de una solución de ruptura de proteína se agregó
a las monocapas celulares. Los polipéptidos de las células rotas
fueron analizados por 15% SDS-PAGE y
autoradiografía. Las muestras celulares no infectadas también
fueron incluidas en las líneas 2, 3, 6, 7 y 8. La migración de los
polipéptidos de IPNV se indica.
Las Figuras 3A y 3B son autoradiografías que
muestran el efecto de acivicin en la formación de la partícula de
IPNV.
En la Figura 3A, monocapas de células
CHSE-214 se infectaron con IPNV ya sea en ausencia
de acivicin (líneas 3 y 6), o en presencia de acivicin a 25
\mug/ml (líneas 1 y 4) o la presencia de acivicin a 70 \mug/ml
(líneas 2 y 5). Acivicin se agregó en el momento de la infección
(cero h.p.i.). Las células se incubaron a 15ºC. Doce horas
post-infección, 50 \muCi/ml de
[^{35}S]-metionina se aplicó a las células. A 24
h.p.i. (líneas 1, 2 y 3) y a 48 h.p.i.(líneas 4, 5 y 6) las
partículas fueron cosechadas, concentradas por ultracentrifugación
y parcialmente purificadas a través de una gradiente de sacarosa.
Las partículas virales se sometieron entonces a electroforesis en
geles de agarosa Tris-glicina 0,8% y
autoradiografía. La migración de las partículas de IPNV se
indica.
En la Figura 3B, se infectaron monocapas de
células de CHSE-214 con IPNV en la ausencia de
acivicin (línea 3 y 6); en presencia de 25 \mug/ml acivicin
(líneas 1 y 4); y en la presencia de 70 \mug/ml acivicin (líneas
2 y 5). Se siguieron los mismos procedimientos descritos para la
Figura 3A sólo que en el momento de infección, 50 \muCi/ml de
ácido [^{32}P]-ortofosf6rico fue agregado.
Figura 4 es un gráfico que muestra el efecto del
tratamiento del acivicin en la supervivencia de pececillos de
trucha arco iris infectadas naturalmente con IPNV. Los peces se
siguieron durante 30 días comenzando en el día uno de los
tratamientos acivicin, para detectar y documentar las muertes. Los
datos se presentan en términos de porcentaje de supervivencia:
\bullet- - -\bullet: peces
infectados naturalmente no tratados, control positivo.
\sigma- - -\sigma: pez infectado
naturalmente tratado con 9 \mug/ml de Acivicin.
Figura 5 es un gráfico que muestra el efecto de
varias concentraciones de tratamientos de acivicin en la
supervivencia de pececillos de salmón Atlántico seguido a la
infección con IPNV. En el día 0, los peces se infectan con 10^{4}
pfu/ml de IPNV. Partiendo a los nueve días
post-infección, los peces se tratan a diario por
inmersión durante 2 horas en un baño que contiene 9 \mug/ml de
acivicin. Este tratamiento diario con acivicin es continuado a
través de 21 días post-infección. Los peces se
siguieron por 36 días post-infección para documentar
las muertes, los datos los cuales se representan gráficamente en
términos de porcentaje de supervivencia. La leyenda de la Figura 5
indica:
(\ding{115} - \ding{115}) "CONTROL (-)"
= control negativo, peces no infectados;
(\blacksquare-\blacksquare)
"CONTROL (-)/A3" = control negativo, los peces no infectados
tratados con 14 \mug/ml de acivicin;
(\Delta - \Delta) "CONTROL (+)" =
control positivo, peces no tratados infectados;
(X - X) "IPNV(+)/Al" = peces infectados
tratados con 7 \mug/ml de acivicin;
(x - x) "IPNV(+)/(A2)" = peces infectados
tratados con 10,8 \mug/ml de acivicin; y
(\medbullet - \medbullet)
"IPNV(+)/(A3)" = peces infectados tratados con 14 \mug/ml de
acivicin.
Figura 6A es una fotografía de un gel de
poliacrilamida al 7% mostrando el efecto de neomicina en la síntesis
de ARN genómico de IPNV. Monocapas de células del embrión de salmón
Chinook de línea celular 214 (CHSE-2 14) se
infectaron con IPNV ya sea en ausencia de neomicina (líneas 3, 5, 7
y 9), o en presencia de neomicina a 4 \mug/ml (líneas 2, 4, 6 y
8). Neomicina se agregó a las células a 1, 3, 5 y 7 horas
post-infección (h.p.i.), (líneas 2, 4, 6 y 8)
respectivamente y las células se incubaron a 15ºC. 24 horas
post-infección las células se cosecharon, se
extrajo el ARN de estas y se analizaron en geles de poliacrilamida
al 7% electroforesis (PAGE) teñidos con nitrato de plata. La línea
1 muestra un control de ARN genómico de IPNV. Los datos muestran
que Neomicina inhibió la síntesis de ARN de IPNV.
Figura 6B es una autoradiografía que muestra el
efecto de neomicina en la síntesis del polipéptido de IPNV.
Monocapas de células CHSE-214 se infectaron con IPNV
ya sea en ausencia de neomicina (líneas 3, 5, 7 y 9), o en
presencia de neomicina a 4 \mug/ml (líneas 2, 4, 6 y 8). La
neomicina se agregó a 7, 5, 3 y 1 hora post infección (h.p.i.),
(líneas 2, 4, 6 y 8) respectivamente y las células se incubaron a
15ºC. Cuatro horas post-infección, 50 \muCi/ml de
[^{35}S]-metionina se aplicó a las células. A 24
h.p.i. 100 \mul de una solución de ruptura de proteína se agregó
a las monocapas celulares. Los polipéptidos de las células rotas
fueron analizados por 15% SDS-PAGE y
autoradiografía. Línea 1 es un control de células
CHSE-214 no infectadas. La neomicina no inhibe
síntesis de polipégtidos de IPNV.
Figura 7 es un gráfico que muestra el efecto de
varias concentraciones de tratamientos de neomicina en la
supervivencia de pececillos de salmón Atlántico seguido a la
infección con IPNV. Los pececillos de salmón pesan cerca de 0,45 a
cerca de 1,0 g. En el día 0, los peces se infectan con 10^{5}
pfu/ml de IPNV. Un día post-infección, los peces se
tratan a diario por inmersión durante 1 hora en un baño que contiene
10, 40 u 80 ppm de neomicina. Los controles de pececillos no
infectados son ya sea tratados diariamente por una hora con 0 u 80
ppm de neomicina. Este tratamiento diario en neomicina es continuado
a través de 10 días post-infección. Los peces se
siguieron por 26 días post-infección para documentar
las muertes. Los datos los cuales se representan gráficamente en
términos de porcentaje de supervivencia. El tratamiento de
pececillos de salmón infectados con IPNV a concentraciones tan
bajas como 10 ppm pueden mantener la supervivencia a niveles
equivalentes a los controles no infectados. La leyenda de la Figura
7 indica:
(\ding{115} - \ding{115}) "CONTROL (-)"
= control negativo, peces no infectados;
(\blacksquare - \blacksquare) "CONTROL
(-)/N3" = control negativo, los peces no infectados tratados con
80 ppm de neomicina 1 día post-infección;
(\Delta - \Delta) "CONTROL (+)" =
control positivo, peces no tratados infectados;
(X-X) "IPNV(+)/Nl" = peces
infectados tratados con 10 ppm de neomicina a 1 día
post-infección;
(x - x) "IPNV(+)/(N2)" = peces infectados
tratados con 40 ppm de neomicina a 1 día
post-infección; y
(\medbullet - \medbullet)
"IPNV(+)/(N3)" = peces infectados tratados con 80 ppm de
neomicina a 1 día post-infección.
Figura 8 es un gráfico que muestra el efecto de
varias concentraciones de tratamientos de neomicina en la
supervivencia de pececillos de salmón Atlántico seguido a la
infección con IPNV. Los pececillos de salmón pesan cerca de 0,45 a
cerca de 1,0 g. En el día 0, los peces se infectan con 10^{5}
pfu/ml de IPNV. Partiendo a los trece días
post-infección, después de que comenzó la
mortalidad, los peces se tratan diario por inmersión durante 1 hora
en un baño que contiene 10, 40 u 80 ppm de neomicina y es continuado
a través de 23 días post-infección. Los peces se
siguieron por 26 días post-infección para documentar
las muertes. Los datos se representan gráficamente en términos de
porcentaje de supervivencia. El tratamiento de Neomicina es capaz de
detener la mortalidad inmediatamente, evitando los aumentos de
mortalidad. La leyenda de la Figura 8 indica:
(\ding{115} - \ding{115}) "CONTROL (-)"
= control negativo, peces no infectados;
(\blacksquare - \blacksquare) "CONTROL
(-)/N3" = control negativo, los peces no infectados tratados con
80 ppm de neomicina 1 día post-infección;
(\Delta - \Delta) "CONTROL (+)" =
control positivo, peces no tratados infectados;
(X - X) "IPNV(+)/Nl" = peces infectados
tratados con 10 ppm de neomicina a 13 días
post-infección;
(x - x) "IPNV(+)/(N2)" = peces infectados
tratados con 40 ppm de neomicina a 13 días
post-infección; y
(\medbullet - \medbullet)
"IPNV(+)/(N3)" = peces infectados tratados con 80 ppm de
neomicina a 13 días post-infección.
La presente invención apunta a una gran
necesidad en acuicultura y producción animal proporcionando un
método de administrar compuestos isoxazol y/o aminoglicósido a los
animales acuáticos y otros susceptibles a la infección de un virus,
particularmente los virus de ARN, seleccionados del grupo
consistente de: IPNV, IBDV, virus de la necrosis celular del pillar
(PCNV), virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), virus
de la septicemia hemorrágica viral (VHSV), virus de la necrosis
hipodermal y hematopoyética infecciosa (IHHNV), virus de la mancha
blanca de la gamba (WSV), virus del síndrome Taura (TSV), parvovirus
hepatopancreático (HPV), virus de la anemia infecciosa del salmón
(ISAV), virus de la tellina, virus de la ostra, virus
Birnaviridae, virus Rhabdoviridae, virus
Iridoviridae, virus Reoviridae, virus
Picornaviridae y virus Ortomixoviridae, de una manera
que aumenta la supervivencia de los animales. El término
"animal(es)" incluye las especies vivientes en el reino
animal, incluyendo animales acuáticos y por consiguiente, no se
limita a los mamíferos. Los términos "administran" o
"administraron" o "la administración" indica cualquier
medio por el que el compuesto profiláctico/terapéutico se entrega
al animal para que el compuesto esté disponible para bloquear la
replicación vira1 o entrada. Tales medios de entrega incluyen, pero
no se limitan a: introducción en el ambiente acuático; inclusión en
la comida; e inyección en el animal acuático, como inyección
intraperitoneal. Los métodos de administración también incluyen:
bañando los animales acuáticos en tanques que contienen el
compuesto; e inclusión del compuesto en la comida. El método de la
invención y administración pueden realizarse antes, durante, o
después de exposición a IPNV y/o infección de IBDV. Además, el
método puede dirigirse antes, durante, y/o después de infección con
IPNV o IBDV así como antes de, durante y/o después de aparición de
enfermedad o muerte por IPNV o IBDV. Por ejemplo, la administración
puede comenzarse después de la infección cuando se observa 20% de
mortalidad.
La administración incluye aquellos protocolos
que aumentan la supervivencia de un animal acuático expuesto a
IPNV. La administración también incluye aquellos protocolos que
aumentan la supervivencia de un animal expuesto a IBDV. La
administración puede ocurrir antes, durante y/o después de la
exposición viral. Tales protocolos incluyen, pero no se limitan a
lo siguiente: (a) la inclusión del compuesto antiviral en por lo
menos un alimento diario; (b) la inclusión del compuesto antiviral
en el ambiente acuático por al menos 0,5 - 2,0 horas/día en un
periodo horario diario o cíclico que incluye, pero no se limita a:
quincenal, tri-semanal, y una-vez a
la semana/uno-semana-sin; (c)
administración antes de: la presencia de títulos virales, exposición
a IPNV, enfermedad por IPNV, y/o muertes asociadas a IPNV; (d) la
administración en la detección de: la presencia de títulos virales,
exposición a IPNV, enfermedad y/o muertes asociadas a IPNV; (e)
administración que sigue: a la presencia de títulos virales,
exposición de IPNV, enfermedad de IPNV, y/o muerte asociada a IPNV;
(f) los protocolos descritos aquí; (g) la administración diaria
para los periodos de aproximadamente 5 días a aproximadamente 30
días; y/o (h) la administración por más de una vez por día. Tales
protocolos también incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: (a)
administración antes de: la presencia de títulos virales, exposición
a IBDV, enfermedad por IBDV, y/o muertes asociadas a IBDV; (b) la
administración en la detección de: la presencia de títulos virales,
exposición a IBDV, enfermedad y/o muertes asociadas a IBDV; (c)
administración que sigue: la presencia de títulos virales,
exposición a IBDV, enfermedad de IBDV, y/o muerte asociada a IBDV;
(d) los protocolos descritos aquí; y/o (g) administración diaria
para los periodos de aproximadamente 5 días a aproximadamente 30
días.
La estabilidad del compuesto a ser usado en los
métodos y composiciones presentes, incluso las composiciones de
comida, es determinada y se considera en el método de administración
de la composición que contiene el compuesto y en el modo de
preparar la composición que contiene el compuesto. En los centros de
cultivo de peces y las granjas animales, es importante tener un
método de tratamiento que pueda usarse antes de, durante, y/o
después de infección por IPNV o IBDV, así como antes de, durante y/o
después de enfermedad por IPNV o IBDV o la aparición de la muerte.
La estabilidad en solución, las composiciones de comida secas y/o
composiciones de comida húmeda o mojada son una característica de
los compuestos preferidos empleados en el método y composiciones de
la invención.
"La cantidad terapéutica eficaz" o "la
cantidad eficaz" es esa cantidad del compuesto, como un compuesto
isoxazol o compuesto aminoglicósido que es suficiente para aumentar
la supervivencia por aproximadamente 10 a aproximadamente 70 por
ciento. Preferentemente la cantidad eficaz es la que reduce la carga
viral en el animal, o reduce a la mitad la carga viral en la
población en tratamiento. Preferentemente, la cantidad eficaz no es
tóxica a más de aproximadamente 5% a aproximadamente 10% de los
animales acuáticos u otros tratados. Aquéllos entendidos en el arte
pueden determinar las concentraciones del compuesto, como un
compuesto isoxazol o un compuesto aminoglicósido que son
terapéuticos. Tales concentraciones pueden variar con el método de
administración y el compuesto. Por ejemplo, administrar los
compuestos isoxazol o compuestos aminoglicósido bañando al pez en
el agua, las concentraciones de compuestos están en el rango de agua
de aproximadamente 1-50 \mug/ml, preferentemente
aproximadamente 2-20 \mug/ml, más preferentemente
aproximadamente 6-14 \mug/ml. La cantidad
terapéutica eficaz entregada como un componente de comida del pez es
aproximadamente 0,1-10,0 \mug compuesto
isoxazol/gramo de comida. La cantidad terapéutica eficaz entregada
por la inyección directa es calculada después de la inyección de
aproximadamente 2-20 \mug de compuesto isoxazol
por gramo de masa del pez, e identificando la dosis a que la
supervivencia a IPNV aumenta por lo menos 10% sobre los controles.
Para la guía acerca de las concentraciones iniciales a ser
probadas, el EC50 y CC50, del compuesto isoxazol específico son
determinados y la masa del animal acuático a ser tratado es
determinada. La cantidad terapéutica eficaz de neomicina para la
actividad antiviral por inmersión/bañar al pez en el agua, por
ejemplo, es de aproximadamente 5 a aproximadamente 110 ppm,
preferentemente de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 ppm. La
cantidad terapéutica eficaz de neomicina para aumentar la
supervivencia de animales acuáticos viralmente infectados es de
aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg para dosis oral,
preferentemente de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg.
La cantidad terapéutica eficaz de neomicina inyectada para aumentar
la supervivencia de animales acuáticos viralmente infectados es de
aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 6 mg/kg. Un periodo de
tratamiento preferido para inmersión es aproximadamente 3 días; un
periodo de tratamiento preferido para dosis oral es aproximadamente
5 días; un protocolo de tratamiento de inyección preferido es una
administración. Claro, pueden combinarse los métodos de aplicación;
por ejemplo, el tratamiento de inmersión puede combinarse con el
tratamiento oral de compuestos isoxazol y/o compuestos
aminoglicósidos.
aminoglicósidos.
Como es usado aquí, el término "carga
viral" significa la concentración de virus presente en un
organismo y se expresa en términos de unidades formadoras de placa.
Las unidades formadoras de placa pueden determinarse de varias
maneras. Una manera de determinar la concentración de virus es como
sigue: Una muestra de tejido es obtenida y ensayada en monocapas de
línea de células de embrión de salmón de Chinook
(CHSE-214) crecido a 18ºC en Medio Esencial Mínimo
Eagle (MEM), complementado por 5% de suero fetal de bovino (FBS) y
antibióticos para una confluencia de aproximadamente 90%. Después
de una hora, las células se recubren con 0,5% agarosa en MEM
complementado con 10% de FBS e incubado durante 3 días a 15ºC. En
varias veces, las células son fijas con formaldehído y teñidas con
una solución de cristal violeta 0,5% para detectar las células
lisadas. El número de placas formadas es contada y dividida por la
cantidad de muestra proporcionada para llegar al número unidades
formadoras de placa (pfu) por ml. La carga viral también puede ser
aproximada por la correlación con la apariencia de ciertos síntomas
en los animales acuáticos. Por ejemplo, los rangos de títulos para
un pez que tiene daño y lesiones de tejido pueden estar en el rango
de aproximadamente 10^{5} a 10^{9} pfu/ml.
La presencia, título viral y la carga viral de
un virus acuático, como IPNV, IBDV, PCNV, IHNV, VHSV, u otros virus
Birnaviridae específico, virus Rhabdoviridae, virus
Iridoviridae, virus Reoviridae, Picornaviridae
u Orthomixoviridae pueden determinarse. El virus se
identifica y/o cuantifica en muestras de tejido tomadas desde
animal acuático, u observando los varios rasgos clínicos y conductas
asociadas con el virus específico. Los métodos para medir el título
viral son conocidos en el arte y se discutieron en otra parte
aquí.
El birnavirus acuático/IPNV es clasificado y/o
identificado en base a ensayos de seroneutralización, ensayos de
cultivos celulares, ensayos de la reacción en cadena de la
polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR), análisis
de enzima de restricción y/o análisis de la secuencia. El ensayo de
RT-PCR es el método más rápido, específico y
sensible para detectar e identificar el birnavirus acuático. Hay al
menos 9 tipos de cepas del Serogrupo A y 4 otras cepas
representativas del Serotipo Al de IPNV que es el birnavirus
acuático predominante y serotipo de IPNV en los Estados Unidos. Se
usan secuencias de cebador que son muy conservadas entre el
birnavirus acuático en los ensayos de PCR para identificar todos
los serotipos reconocidos del serogrupo A del birnavirus acuático.
Los cebadores son típicamente específicos para las regiones de cDNA
codificadas por el segmento A del genoma o la región que codifica
VP2 completo del birnavirus acuático.
IBDV y sus cepas/variantes se caracterizan y/o
identifican usando inmunoensayos, como un ensayo inmunoabsorbente
unido a Enzima (ELISA) y/o un ensayo molecular como el de la
reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa
(RT-PCR) y los polimorfismos de largo de fragmentos
de restricción RT-PC (RT/PCR-RFLP).
Ver, Kreider DL, et al, Avian Dis 35:276-87
(1991); Moody, A. et al., J Virol Methods,
85:55-64 (2000); Jackwood DJ, et al., Avian
Dis 45:330-9 (2001), los contenidos del cual está
incorporado por la presente como referencia en su integridad. La
diferenciación de cepas de IBDV es importante porque las diferencias
existen en su habilidad de causar enfermedad y sus tipos
antigénicos. El ensayo molecular se usa para diferenciar los virus
en los grupos genéticamente relacionados llamados grupos
moleculares. Hay seis grupos moleculares observados para la vacuna
y cepas de laboratorio de IBDV: las cepas dentro de un grupo están
antigénicamente relacionadas.
Birnavirus acuático o título viral o la carga
viral IPNV es determinada identificando y cuantificando la presencia
de IPNV en muestras de tejido tomadas de animales acuáticos, o a
través de la observación de varios rasgos clínicos y conductas. Los
métodos para la detección de IPNV, identificación y cuantificación
(midiendo el título viral IPNV) son conocidos en el arte e incluyen
ensayos de la reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa
inversa (RT-PCR), el método se dirigió en muestras
de tejido del riñón y bazo del pez analizado de acuerdo a los
métodos conocidos en el arte. Ver, por ejemplo,
López-Lastra et al, J., Fish Dis. 17: 269
(1994), los contenidos están incorporados en la presente como
referencia en su integridad.
Semejantemente, título viral o la carga viral
IBDV es determinada identificando y cuantificando la presencia de
IBDV en muestras de tejido tomadas de pájaros, o a través de la
observación de varios rasgos clínicos y conductas. Los métodos para
la detección de IBDV, identificación y cuantificación (midiendo el
título vira1 IBDV) son conocidos en el arte e incluyen ELISA,
RT-PCR cuantitativo y ensayos
RT-PCR-RFLP descritos antes y de
acuerdo a los métodos conocidos en el arte.
Se obtienen muestras de fluido de riñón, hígado,
bazo y/o ováricas del pez. asintomático, tal como sangre de pez, en
el tiempo de desovar. Las muestras de peces clínicamente afectados,
como el alevin entero, se prueban vísceras enteras, riñón, hígado
y/o bazo para la presencia y cantidad de IPNV.
Los términos "que tratan" y
"tratamiento" como es usado aquí "administrado" como se
define aquí y también incluye eliminar o reducir los síntomas de
una enfermedad o desorden, previniendo los síntomas o desórdenes de
aumento en severidad, y previniendo el desorden en la forma que
ocurre.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Un compuesto es "estable en solución"
cuando él (a) no se descompone fácilmente o por otra parte se
modifique químicamente en solución de manera
no-funcional y/o (b) mantener su actividad cuando
está húmedo o en solución por un periodo de tiempo mayor que 1
hora, preferentemente durante 24 horas, más preferentemente por
periodos de semanas o más.
Los compuestos a ser usados de acuerdo con la
presente invención incluyen: los compuestos isoxazol y
aminoglicósidos. Muchos compuestos isoxazol están públicamente
disponibles de fuentes tales como Sigma-Aldrich,
Winthrop Esterlina, Inc., y Sanofi Winthrop, Inc. La siguiente es
una inscripción parcial de especies representativas de compuestos
isoxazol que pueden usarse en la presente invención.
El término "compuesto isoxazol" significa
un compuesto conteniendo la Fórmula
Estos compuestos son generalmente conocidos en
el arte, Por ejemplo, ver a US Pat. Nos. 4.208.510; 4.843.087;
4.942.241; 4.945.164; Re 21.578; 5.464.848; y 6.174.909, contenidos
de cada uno de los cuales es incorporado a la presente como
referencia en su integridad. Los compuestos isoxazol preferidos son
acivicin y los derivado isoxazol conocidos como los compuestos de
WIN. Uno de tales compuestos isoxazol, acivicin, es estable en
solución. Los derivados de isoxazol preferidos conocidos como los
compuestos WIN, son drogas isoxazolo-derivadas
desarrolladas por Esterlina-Winthrop, muchos de los
cuales se conocen para unir un bolsillo hidrófobo dentro de la
proteína de cápside de virión. Los miembros de la familia de los
compuestos WIN son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, ver US
Pat. Nos. 5.464.848; 5.643.929; y 4.857.539; y Vaidehi et
al., PNAS EE.UU 94:2466 (1997), los contenidos de cada uno de
los cuales está incorporado en la presente por la referencia en su
integridad. Los compuestos WIN incluyen compuestos
1,2,4-oxadiazolil-fenoxialquiloisoxazolos.
Un grupo de compuestos isoxazol preferidos, los
compuestos acivicin y análogos, son compuestos que tienen un anillo
isoxazol con R1 en la posición 1, R2 en la posición 2, y R3 en la
posición 3, en donde R1 se selecciona del grupo consistente de un
grupo consistente de cadena de alquilo recta o ramificada, alquenil
o alquinil que tienen 6 átomos de carbono, opcionalmente
sustituidos por uno o más halógenos o cicloalquilo que tienen de 3
a 6 átomos de carbono, opcionalmente llevando uno o más
sustituyentes, cicloalquenil que tienen 5 ó 6 átomos de carbono,
que lleva adicionalmente uno o más sustituyentes seleccionados de un
grupo aril o aralquilo; R2 se selecciona del grupo consistente de
nitro, ciano, halógeno, hidrógeno o alquilo recto o ramificado que
tiene 6 átomos de carbono, opcionalmente sustituido por uno o más
halógenos; R3 se selecciona del grupo consistente de un alquilo
recto o ramificado que tiene 6 átomos de carbono, opcionalmente
sustituido por uno o más halógenos.
Acivicin también se denomina ácido L (alfa S,
5S)
alfa-amino-3-cloro-4,5-dihidro-5-isoxazolacético
o ácido
(\alphaS,5S)-\alpha-amino-3-cloro-2-isoxazolin-5-acético
o AT-125. Se escriben Acivicin y sus análogos e US
Pat. Nos.
3.856.807; y 3.878.047. Los contenidos de US Pat. Nos. 3.856.807 y 3.878.047 están incorporados en la presente como referencia en su integridad.
3.856.807; y 3.878.047. Los contenidos de US Pat. Nos. 3.856.807 y 3.878.047 están incorporados en la presente como referencia en su integridad.
Se describen métodos de purificar el acivicin en
US Pat. Nos. 4.188.324; 4.225.720; y 4.232.164. Un proceso químico
por sintetizar acivicin y sus análogos, tal como los ácidos alfa
sustituidos
amino-3-sustituido-2-isoxazolin-5-acético
(ésteres) se describe en US Pat. No. 4.256.898 y RE 31.578, la
integridad de cada uno de los cuales está incorporado en la
presente por referencia. Involucra preparar el compuesto
dl-trans-3-amino-4-hidroxi-ciclopenteno
el cual se convierte por una serie de reacciones para dar derivados
de ácido tricolómico, acivicin y análogos de bromo, flúor y
iodo.
Los compuestos isoxazol preferidos usados en el
método y composiciones de la presente invención son:
\global\parskip1.000000\baselineskip
(A) Acivicin (también llamado ácido L (alfa S,
5S)
alfa-amino-3-cloro-4,5-dihidro-5-isoxazolacético;
ácido
(\alphaS,5S)-\alpha-amino-3-cloro-2-isoxazolin-5-acético; o AT-125) y sus análogos. Los compuestos acivicin y análogos empleados en el método presente y composiciones, incluso las composiciones de alimento, son mezclas racémicas e isómeros ópticamente activos de compuestos que tienen la Fórmula
(\alphaS,5S)-\alpha-amino-3-cloro-2-isoxazolin-5-acético; o AT-125) y sus análogos. Los compuestos acivicin y análogos empleados en el método presente y composiciones, incluso las composiciones de alimento, son mezclas racémicas e isómeros ópticamente activos de compuestos que tienen la Fórmula
en que R se selecciona del grupo
consistente de hidrógeno y alquil de 1 a 8 átomos de carbono; R1 y
R2 son diferentes y son seleccionados del grupo consistente de
hidrógeno, un compuesto teniendo la
Fórmula,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o cuando toman junto con el átomo
de nitrógeno la forma de un grupo teniendo la
Fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en que R3 es alquilo de 1 a 8
átomos de carbono, inclusive; y R4 se selecciona del grupo
consistente de (a) un compuesto teniendo la
Fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en R5, R6, R7 y R8 se seleccionan
del grupo consistente de hidrógeno y alquil de 1 a 5 átomos de
carbono, inclusive (b) un compuesto teniendo la
Fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(c) el ortointerfenileno, y (d)
ortointerfenilenos sustituidos con la condición que otro que cuando
R1 y R2 forman un anillo con el átomo de nitrógeno uno de R1 y R2
siempre debe ser hidrógeno, preferentemente R y R1 son hidrógeno y
R2 es el alcoxicarbonil; más preferentemente R2 es
L-butiloxicarbonil y el compuesto es ácido
3-cloro-2-[[(1,1-dimetoxi)carbonil]amino[-4,5-dihidro-5-isoxazolacético;
también preferentemente R es hidrógeno y R1 y R2 juntos con el
átomo de nitrógeno forma el grupo teniendo la
Fórmula
más preferentemente R4 es
ortointerfenileno y el compuesto es ácido
ftalil-(\alphaS,5S)-\alpha-amino-3-cloro-4,5-dihidro-5-isoxazolacético;
así como las mezclas racémicas e isómeros ópticamente activos de
compuestos que tienen la
Fórmula
en que R se selecciona del grupo
consistente de hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono,
inclusive, alquilo halogenado de 1 a 3 átomos de halógeno, y 1 a 5
átomos de carbono, inclusive, el aralquilo de 7 a 20 átomos de
carbono, inclusive; y aralquilo sustituido de 7 a 20 átomos de
carbono, inclusive. X se selecciona del grupo consistente de bromo,
cloro, flúor y yodo, -OR1, -SR1, y -NR'R'' en donde R1 se
selecciona del grupo consistente de alquilo de 1 a 12 átomos de
carbono, inclusive, aril de 6 a 20 átomos de carbono, inclusive:
aralquilo de 7 a 20 átomos de carbono; inclusive; R' y R'' son
iguales o diferentes y se seleccionan del grupo consistente de
hidrógeno y alquilo de 1 a 8 átomos de carbono; se seleccionan R14 y
R15 del grupo consistente de hidrógeno, un compuesto teniendo la
Fórmula
o cuando se toman junto con el
átomo de nitrógeno o el grupo teniendo la
Fórmula
en que R6 es alquilo de 1 a 8
átomos de carbono, inclusive, alquilo halogenado de 1 a 5 átomos de
carbono, inclusive, y 1 a 3 átomos de halógeno, inclusive,
aralquilo de 7 a 20 átomos de carbono, inclusive y aralquilo
sustituido de 7 a 20 átomos de carbono, inclusive, R7 se selecciona
del grupo consistente de alquilo de 1 a 12 átomos de carbono,
inclusive, aril de 6 a 20 átomos de carbono, inclusive, aralquilo de
7 a 20 átomos de carbono, inclusive, y aralquilo sustituido de 7 a
20 átomos de carbono, inclusive: y R8 se selecciona del grupo
consistente de un compuesto teniendo la
Fórmula
en que R9, R10, R11 y R12 se
seleccionan del grupo consistente de hidrógeno y alquilo de 1 a 5
átomos de carbono, inclusive, (b) un compuesto teniendo la Fórmula
(c) un compuesto ortointerfenileno teniendo la
Fórmula
(c) un compuesto ortointerfenileno
teniendo la
Fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
y (d) ortointerfenileno sustituido
con la condición que cuando R, R14 y R15 son todos
hidrógeno, X no puede ser cloro y la condición adicional que
cuando R14 y R15 son hidrógeno y R8 es ortointerfenileno, R no
puede ser hidrógeno o alquil de 1 a 8 átomos de carbono; (B) un
compuesto WIN de
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
en que: R1 es alquilo, alcoxi,
hidroxi, cicloalquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxialcoxi,
alquilotioalquiIo, alquilosulfinilalquilo, alquilosulfonilalquilo,
aminoalquilo, alquiloaminoalquilo, dialquiloaminoalquilo,
alcoxicarbonil, carboxi, o cianometil; Y es alquileno de 3 a 9
átomos de carbono, R2 y R3 independientemente son hidrógeno,
alquilo. alcoxi, halo, ciano, trifluorometil y nitro; R4 es alcoxi,
hidroxi, halometil, dihalometil, trihalometil, dihaloetil,
cicloalquilo, heterociclilo, alcoxicarbonil, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, alcanocarboniloxialquilo, ciano, halo, tioalquilo,
alquilotioalquilo, alquilotio, tio,
2,2,2-trifluoro-etilo,
(4-metilfenil) sulfoniloximetil, N=Q o CON=Q, en
donde N=Q es amino, alquilamino o dialquilamino; R5 es hidrógeno o
halo o alquilo; (C) compuestos WIN identificados en patente US No
4.857.539, los contenidos de los cuales son incorporados como
referencia en su totalidad, tales compuestos WIN tienen la
fórmula.
en que: Y es un puente de alquileno
de 3-9 átomos de carbono; Z es N; R es hidrógeno o
alquilo menor de 1-5 átomos de carbono, con la
condición que cuando Z es N, R es alquilo menor; R1 y R2 son
hidrógeno, halógeno, alquilo menor, alcoxi menor, nitro,
alcoxicarbonil menor o trifluorometil; y Het se selecciona de los
grupos heterocíclicos especificados,
1,3,4-oxadiazol-2-il
no sustituido y
1,2,4-oxadiazol-5-il
no sustituido. En los compuestos WIN, cuando el anillo
1,2,4-oxadiazolo se sustituye por hidroxi, amino o
alquiloamino, ellos pueden existir en las formas tautoméricas en
donde R4 es hidroxi, amino o alquilamino y T es O, NH o
N-alquil.
Los compuestos adicionales a ser usados de
acuerdo con la presente invención son los aminoglicósidos. Tales
aminoglicósidos incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente:
neomicinas (por ejemplo neomicina B), paramomicin, estreptomicina,
tobramicin (por ejemplo tobramicina o dibekacin), kanamicina, (por
ejemplo las mezclas de kanamicina A, E3 . 1 y C), amikacina,
gentamicina, (por ejemplo las mezclas de gentamicina A, C1, C2 o
C1a), sisomicina (como sisomicina o netilmicina), lividomicina y
ribocamicina.
Los compuestos adicionales a ser usados de
acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a lo
siguiente:
análogos de adenina, incluyendo
(S)-9-(2,3-dihidroxipropi1)adenina
(DHPA) y
ácido
3-adenina-9-il-2-hidroxipropanoico
(AHPA);
3'-fluoro guanosina y
9-(2-hidroxi etoximetil) guanina (aciclovir);
Pirazofurina;
extractos de planta, tales como Durvillea
antartica; y
ácido micofenólico.
Como es usado aquí, a menos que se especifique
lo contrario a lo definido, alquilo, alcano, alcoxi, cicloalquilo y
halo cada uno tiene el significado siguiente: alquilo y alcoxi
significan radicales alifáticos, incluyendo radicales ramificados,
teniendo de uno a cinco átomos de carbono. La parte alquilo de tales
radicales incluye, por ejemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo,
n-butilo, sec-butilo,
t-butilo y pentilo. "Alcano" significa un
radical alquilo alifático monovalente, incluyendo radicales
ramificados de uno a cuatro átomos de carbono Así, la parte alcano
de tales radicales incluye, por ejemplo, metilo, etilo, propil,
isopropilo, n-butil y sec-butil.
Cicloalquilo significa un radical alicíclico teniendo de tres a seis
átomos de carbono, como es ilustrado por ciclopropilo, ciclobutilo,
ciclopentilo y ciclohexilo. Heterociclilo se refiere a 5 ó 6
miembros de carbono basados en heterociclo, teniendo uno a
aproximadamente tres átomos de nitrógeno y/o un átomo de oxígeno o
átomo de azufre, con tal de que ninguno de los dos átomos de oxígeno
y/o los átomos de azufre estén adyacentes en el heterociclo. Los
ejemplos incluyen furil, tienil, piridil, oxadiazolil, tiadiazolil,
triaxinil, pirimidinil y similares.
Como es usado aquí, en hidroxialquilo y
alcoxialquilo, los grupos hidroxi y grupos alcoxi pueden ocurrir a
cualquier posición disponible del alquilo. Así hidroxialquilo y
alcoxialquilo incluyen, por ejemplo, hidroximetil,
1-hidroxietil, 2-hidroxietil,
2-hidroxipropil, 2-hidroxiisopropil,
2, 3, 4 y 5-hidroxi-pentil y
similares y los éteres del alquilo correspondientes a estos.
Como es usado aquí, en el hidroxialcoxi, el
grupo del hidroxi puede estar en cualquier posición disponible del
alcoxi distinta a la posición C-1. Así hidroxialcoxi
incluye, por ejemplo 2-hidroxietoxi,
2-hidroxipropoxi,
2-hidroxiisopropoxi, 2 y
5-hidroxipentoxi y similares.
"Alquilo-inferior"
significa metilo, etilo, propilo, buitilo, pentilo, hexilo, heptilo,
octilo y las formas isómeras de éstos.
"Alquilo halogenado de 1 a 5 átomos de
carbono, inclusive, y 1 a 3 átomos de carbono, inclusive"
significa metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y formas isómeras
de estos sustituidos por 1 a 3 átomos de halógeno.
"Arilo" quiere decir fenil y fenil
conteniendo 1 a 3 sustituyentes, el mismo o diferente y seleccionado
del grupo consistente de halógeno, alcoxi, alquilo y nitro.
"Aralquilo" quiere decir bencilo, fenetil,
fenpropil, fenbutil, fenpentil, difenilmetil, tres difeniloctil y
las formas isómeras de estos y fluorenilmetil.
"Aralquilo sustituido" significa aralquilo
en el que el anillo o anillos fenil contienen 1 a 3 sustituyentes,
el mismo o diferente y seleccionado del grupo consistente de
halógeno, alcoxi, alquilo y nitro. Por ejemplo, esto incluye
p-metoxibencil, m-metoxibencil,
p-nitrobencil, o-clorobencil,
4-propil-2-metilbencil,
2-cloro-4-metilbencil,
3,4-dietoxibencil,
3,4-dietoxibencil,
3,4,5-triclorobencil y
3,4,5-trimetilbencil.
"Ortointerfenileno sustituido" significa
alquil menor, alcoxi menor, halógeno, nitro y ortointerfenileno
ciano sustituido. Puede haber combinaciones de sustituyentes tales
como
4-propil-2-metil-,
2-cloro-4-metil-,
3,4-dietoxi-,
3-ciano-4-etoxi-fenil
y similares. El fenil sustituido se limita a un total de 10 átomos
de carbono.
"Halógeno" significa bromo, cloro, flúor y
yodo. "Halo" significa bromo, cloro, iodo o fluoro. Como es
usado aquí, el término "el animal acuático susceptible a la
infección con un virus" pretende significar cualquiera de los
virus siguientes: IPNV, virus de la necrosis celular del pillar
(PCNV), virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV),
virus de la septicemia hemorrágica vira1 (VHSV), virus de la
necrosis hipodermal y hematopoyética infecciosa (IHHNV), virus de
la mancha blanca de la gamba (WSV), virus del síndrome Taura (TSV),
parvovirus hepatopancreático (HPV), virus de la anemia infecciosa
del salmón (ISAV), virus de la tellina, virus de la ostra, virus
Birnaviridae, virus Rhabdoviridae, virus
Iridoviridae, virus Reoviridae, virus
Picornaviridae y virus Ortomixoviridae es capaz de
replicarse en y/o residir en el animal acuático de una manera que
pueda detectarse en un tejido de animal acuático. Tal infección
puede ser asintomática y puede transmitirse horizontalmente y/o
verticalmente a otros animales acuáticos.
Como es usado aquí, el término "animal
acuático susceptible a la infección de birnavirus acuático"
quiere significar que un birnavirus acuático o IPNV es capaz de
replicarse en y/o residir en el animal acuático de una manera que
puede detectarse en un tejido del animal acuático. Tal infección
puede ser asintomática y puede transmitirse horizontalmente y/o
verticalmente a otros animales acuáticos.
El término "birnavirus acuático" se quiere
que abarque cualquier birnavirus que infecta un organismo acuático.
El birnavirus acuático preferido es IPNV que se conoce por incluir
nueve serotipos por lo menos.
El término "animal acuático" incluye, pero
no se limita al pez, copepodos, cefalopodos, crustáceos incluso la
gamba, anguilas y moluscos, incluso las ostras. Los animales
acuáticos preferidos son peces que incluyen pero no se limitan a
los peces de las familias Anguillidae, Bothidae, Caragidae,
Cotostomidae, Chichlidae, Clupeidae, Cobitidae, Coregonidae,
Cyprinidae, Esocidae, Moronidae, Paraichthydae, Percidae,
Poecilidae, Salmonidae, Salvelinus, Sciaenidae, Thymallidae y
las especies Seriola quinqueradiata (yellowtail),
Scophthalmus maximus (rodabalo), Limanda limanda
(dab), Hippoglossus hippoglossus (halibut), Gadus
morhua (Bacalao Atlántico), Misgrunus anguillisaudatus
(loach), y Esox lucious (pike). Los peces más preferidos son
aquellos listados en la Tabla 1. La mayoría de los
mariscos/crustáceos preferidos también son listados en la Tabla 1.
El término "salmonídeo" es utilizado aquí para referirse a
peces de la familia Salmonidae y Salvelinus. Además
de todas las truchas, estas familias incluyen pero no se limitan a,
las siguientes especies de salmón: Oncorhynchus tshawytscha
(Chinook, Rey, o Primavera), Oncorhynchus nerka (Blueback,
Rojo, Sockeye), Oncorhynchus kisutch (Coho, Plata),
Oncorhynchus gorbuscha (Rosa), Onchorhynchus mykiss
(trucha Arco iris), Oncorhynchus keta (Chum o Keta) y
Oncorhynchus masou (Masou, o
Cereza).
Cereza).
Una comparación de la secuencia de la proteasa
viral de IPNV VP4 con VP4 del virus de la enfermedad infecciosa
bursal (IBDV), sugiere que ellos son proteasas de serina similares
que comparten las propiedades con peptidasas procarióticas y
peptidasas bacterianas. Los compuestos dentro del alcance de la
invención presente que inhiben el VP4 de IPNV también pueden ser
eficaces inhibiendo la proteasa viral VP4 de IBDV. Por consiguiente,
pueden usarse las composiciones de la invención presente para
tratar la infección de IPNV en los métodos de la invención para
aumentar la supervivencia de animales susceptibles a IBDV. La
presente invención también se dirige, por consiguiente, a los
métodos y composiciones para el tratamiento del virus de la
enfermedad infecciosa bursal (IBDV) en los pájaros, particularmente
los pollos, aumentando la supervivencia de pájaros expuestos a
IBDV.
Para la administración, la composición empleada
en el método de la invención presente puede prepararse procesando
el isoxazol o derivado de isoxazol en una forma de dosificación como
polvo, gránulo microfino, gránulo, gránulo fino, tableta, líquido,
pellet o jarabe con o sin un vehículo sólido,
semi-sólido o líquido o complementando la comida
del pez con el compuesto o la forma de dosificación. El vehículo
puede incluir pez picado crudo (por ejemplo, minced mackcrel,
sardina, sand lance, saury, Alaska Pollock, squid, etc.), el
alimento formulado (basado en harina de pescado, pastel de soja,
levadura, harina de trigo, vitaminas, etc.) y tales otros vehículos
convencionales como la lactosa, sacarosa, glucosa, almidón, talco,
arcilla ácida y así. Además, emulsificante, dispersantes, agentes
gelificantes, adhesivos, etc., puede agregarse en las proporciones
apropiadas.
Pueden administrarse tales composiciones que
contienen el compuesto para prevenir y/o tratar las infecciones del
virus en los animales acuáticos susceptibles a la infección del
virus. También pueden administrarse tales composiciones que
contienen el compuesto para la prevención y/o tratamiento de
infección de IPNV en los animales acuáticos susceptible a la
infección de IPNV. Para la profilaxis o tratamiento de IPNV en
salmón o trucha, por ejemplo, se prefiere que la modalidad del
tratamiento comprimido, aprovechándose de la estabilidad del
compuesto en la mezcla picada de pez crudo, agregando premezcla en
polvo o gránulos finos del compuesto con el vehículo a la mezcla
picada de pez crudo, o una mezcla de picado de pez crudo y el
alimento formulado y se administra la mezcla completa como tal o
premoldeada en pellets o pellets húmedos.
La dosificación y duración de la administración
de la presente composición profiláctica/terapéutica para tratar
animales acuáticos susceptibles a la infección del virus, incluso la
infección de IPNV, son dependientes del compuesto isoxazol
específico, las especies, la edad, la temperatura del agua, la
severidad de la enfermedad, etc., Para la prevención y terapia de
IPNV en salmón o yellowtail, por ejemplo, generalmente
29-50 \mug de acivicin pueden administrarse
oralmente por día por gramo de peso del cuerpo de pez.
En una forma preferida, la composición
profi1áctica/terapéutica de la invención presente contiene un
compuesto isoxazol o compuesto derivado de isoxazol que: (1)
aumenta la supervivencia del animal acuático en presencia de IPNV;
y (2) es estable en la comida del pez, tal como mezcla picada de pez
crudo. La composición administrada a peces después de ser mezclada
con una mezcla picada de pez crudo, asegura una concentración alta
de isoxazol en la sangre del pez en un periodo prolongado de
tiempo.
Aunque los inhibidores de replicación de IPNV
in vitro no pueden demostrar tener eficacia in vivo,
los ensayos in vitro pueden utilizarse para identificar
compuestos que exhiben actividad antiviral y/o menor citotoxicidad
y pueden usarse, antes de determinar la seguridad y eficacia in
vivo.
Los métodos para identificar compuestos que
bloquean la replicación viral in vitro son conocidos en el
arte. Jashes et al. Antiviral Res. 29:309 (1996). Para
determinar si un compuesto es capaz de bloquear la replicación de
IPNV in vitro, monocapas de células de embrión de salmón del
Chinook (CHSE-214) se crecen a 18ºC en un medio
esencial mínimo Eagle (MEM), suplementado por 5% de suero fetal de
bovino (FBS) y antibióticos en una confluencia de aproximadamente
90 por ciento. Las monocapas se infectaron con
50-100 unidades formadoras de placas (pfu) de una
cepa de IPNV, como la cepa VR-299a. Después de la
absorción durante una hora con agitación cada 15 minutos, una
muestra del virus se retira. Las células se recubren con 0,5%
agarosa en MEM complementado con 10% FBS y se dejó incubar durante
3 días a 15ºC. El compuesto probado se agrega a varias
concentraciones diferentes en la cubierta de agarosa. A varios
puntos de tiempo durante y después de la incubación, las células
son fijadas con formaldehído y teñidas con una solución de 0,5% de
cristal violeta para detectar las células que han sido lisadas.
Comparando el número de placas formadas en las varias
concentraciones de los compuestos ensayados, se determinan los 50%
(EC50) y 100% (EC100). Se repiten los ensayos por lo menos tres
veces para determinar la variabilidad y obtener los resultados
exactos.
Métodos generales que miden el efecto citotóxico
de un compuesto in vitro son conocidos, como aquellos
descritos por Jashes et al., supra (1996). En uno de
tales métodos, se agregan concentraciones diferentes del compuesto
a las monocapas de células CHSE-214. Se incuban las
monocapas celulares con el compuesto a 15ºC durante tres días. La
viabilidad celular es medida por exclusión celular de azul del
tripano. Es determinada la concentración citotóxica requerida para
reducir la viabilidad celular en un 50% (CC_{50}).
Los métodos para medir compuestos que bloquean
la síntesis de ADN celular in vitro son conocidos en el
arte, como aquéllos descritos en Jashes et al., supra
(1996). En tal método, se crecieron las células
CHSE-214 a aproximadamente 50% de confluencia para
asegurar que ocurra el crecimiento activo. Se agregan
concentraciones diferentes de los compuestos a las células junto
con 1,0 \muCi/ml [metilo ^{3}H] timidina (teniendo una
actividad específica de aproximadamente 67 Ci/mmol) e incubadas
durante 20 horas a 15ºC. La ^{3}H-timidina
incorporada es medida como radioactividad asociada con el material
ácido insoluble. Las concentraciones del compuesto que se requiere
para reducir la incorporación de [metilo ^{3}H] timidina en 50%
(IC_{50}) se determinan para identificar un compuesto y su
concentración que bloquea la síntesis de ADN.
Los peces se aclimataron por una semana, durante
la que se colectaron muestras de agua al azar de tiempo y muestras
de tejido y se probaron para la presencia de bacterias y virus. Las
muestras se someten a cultivo en agar de soja de triptoae (TSA),
medio de enfermedad de riñón (KDM-2), y cultivos
celulares CHSE-214 con y sin antibió-
ticos.
ticos.
Las cepas SP de IPNV se propagan en células de
embrión de salmones del Chinook (CHSE-214), y pueden
ser tituladas y almacenadas a -70ºC para el uso futuro. Acivicin
(ácido L (alfa S, 5S)
alfa-amino-3-cloro-4,5-dihidro-5-isoxazolacético)
se obtuvo de Sigma. Pueden obtenerse los peces de fuentes
innumerables. Para algunos de los ejemplos en la invención, algunos
de los peces usados se obtuvieron de la Universidad de Chile
localizada en la Isla de Chiloé.
Los pececillos del salmón Atlántico empleados en
los ejemplos tienen típicamente 90 días de edad y pesan 1 \pm 0,2
g. Los pececillos son distribuidos en grupos de 50 cada uno y
mantenidos en agua a 10 - 12ºC. Se cambia 80% del agua a diario;
cada cinco días el agua se cambia completamente. Los peces se
alimentaron dos veces diariamente con cantidades de comida que era
3% del peso del cuerpo. Los pececillos se observan y se graban
síntomas clínicos, muertes y/o características conductuales
anormales cuidadosamente.
Se exponen peces infectados experimentalmente a
un virus poniéndolos en agua a 10-12ºC que contiene
aproximadamente 10^{4} pfu/ml del virus, como la cepa Sp de IPNV,
durante 2 horas. La exposición al virus coincide típicamente con la
alimentación para facilitar la captación de IPNV. Grupos de
controles no infectados se tratan usando los mismos métodos como
aquéllos de los grupos infectados, excepto agregar al medio de
cultivo celular un virus.
Los agentes antivirales pueden administrarse
exponiendo al pez al agente antiviral por el periodo de tiempo y
protocolo especificado. Un rango de concentración de los compuestos
isoxazol administrado es 0,1 a 100 \mug/ml. Preferentemente, las
concentraciones de compuestos isoxazol son 1-20
\mug/ml cuando se usa el acivicin; más preferentemente las
concentraciones de acivicin son 9-14 \mug/ml o
mayores.
El método y la composición presente pueden ser
aplicados a animales acuáticos de todas las edades, para bajar la
mortalidad y así aumentar los rendimientos. También pueden lograrse
bajar la mortalidad y aumentar los rendimientos para peces que
permanecen como portadores virales.
Para la administración de un compuesto isoxazol,
la concentración(nes) que reduce la incorporación de
[metilo-^{3}H] timidina en 50% (IC_{50}) se usa
como una indicación inicial de la concentración o rango de dosis
para ser evaluado inicialmente antes de la identificación de la
cantidad terapéutica eficaz. Por ejemplo, menos de 25 \mug/ml de
acivicin es el IC_{50} para IPNV. El pececillo se sumerge durante
2 horas en una solución que contiene 7 \mug/ml, 10,5 \mug/ml, o
14,0 \mug/ml de acivicin. Pececillos no infectados sufren el
mismo manejo de tensión en ausencia del compuesto antiviral. Esta
administración se prueba antes, durante, y después de la exposición
y/o infección de IPNV. Por ejemplo, acivicin puede administrarse
después de la infección cuando 20% de mortalidad es observada y en
los días subsecuentes por lo menos una vez al día. En el centro de
cultivo de peces, es importante tener un método de tratamiento antes
de que puede comenzarse, durante, y/o después de la infección de
IPNV así como antes de, durante y/o después de la enfermedad de IPNV
o de la aparición de la muerte. La estabilidad del compuesto a ser
usado en los métodos presentes y las composiciones de comida son
otra característica importante que efectúa el método y modo de
preparación y administración del compuesto. Muchos de los
compuestos usados en el método presente y las composiciones son
estables en solución. Por ejemplo, el acivicin es estable en la
solución.
La detección, identificación y la cuantificación
de IPNV se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la
polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR) en las
muestras de tejido (por ejemplo, hígado y pulmón) del pez u otro
animal acuático utilizando métodos conocidos en el arte, tal como
los descritos en López-Lastra et al, J. Fish
Dis. 17: 269 (1994), incorporada aquí en su totalidad como
referencia. La primera amplificación se hace con cebadores tales
como los cebadores III y IV, que obtiene un producto de 657 bp. En
la segunda amplificación, se usan cebadores tales como I y II, qué
obtienen un producto de 228 bp. Los productos de PCR se visualizan
con tinción de plata, después de ser sometidos a electroforesis en
un gel 12% poliacrilamida (PAGE).
La administración del método y composición de la
invención presente no sólo aumenta el rendimiento del pez tratado,
sino también puede bajar los títulos virales presentes en los
animales acuáticos IPNV-infectados sobrevivientes
portadores. El método presente para el tratamiento de infecciones
IPNV en el pez puede ser un medio preferido para aumentar la
producción y rendimiento de salmón y de la trucha.
La transmisión de IPNV es horizontal y vertical.
Para criadores selectos que pueden preferir utilizar stocks libres
de virus para engendrar sus animales acuáticos (como salmón y
trucha), los compuestos preferidos a ser usados en el método y
composiciones de la invención presente son aquéllos que son capaces
de eliminar IPNV en los stocks de crías. Tal eliminación del título
de IPNV es documentada utilizando los métodos descritos aquí.
Los compuestos preferidos se eligen por su
habilidad de disminuir y/o eliminar la progenie viral infectiva y
su habilidad de inhibir la replicación viral in vivo.
También, el efecto inhibitorio del compuesto en la formación de
partículas virales es determinado. Más allá, las muestras virales
son expuestas al compuesto toda la noche y sus títulos se evalúan
después de esto. Esos compuestos que bajan el título viral por un
orden de magnitud menor indica la habilidad del compuesto de
disminuir eficazmente la descendencia viral infectiva. La habilidad
del compuesto para disminuir y/o eliminar la descendencia viral
infectiva in vivo y/o inhibir la replicación viral in
vivo es determinado por métodos conocidos en el arte que incluye
la valoración de la habilidad del compuesto de aumentar la
supervivencia de los animales antes, durante y/o después de la
exposición al virus.
Acivicin inhibe la replicación de IPNV tanto
in vivo como in vitro. Acivicin es un análogo de
glutamina y un derivado de isoxazol. El efecto de acivicin en la
síntesis macromolecular viral IPNV, como se describe aquí, muestras
que acivicin inhibe la formación de las partículas virales de IPNV,
aunque no inhibe células infectadas por IPNV de sintetizar
polipéptidos virales o ARN genómico. Además, las muestras virales
expuestas a acivicin toda la noche tienen títulos que fueron cuatro
órdenes de magnitud menores que las muestras virales no expuestas a
acivicin; indicando esto que acivicin disminuye eficazmente la
progenie infectiva viral. Los compuestos preferidos adicionales
para el uso en una forma de la invención presente son compuestos
derivados de isoxazol y denominados compuestos
WIN.
WIN.
Los siguientes ejemplos de pruebas demuestran la
eficacia de la invención, sin por esto limitarla.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se estudia el efecto de acivicin en la
viabilidad celular. No se observó ningún efecto en las células
usando concentraciones de acivicin que varía entre 0 a 100
\mug/ml. El IC_{50} se obtuvo en concentraciones que van de 25
a 70 \mug/ml, es decir, 6 a 18 veces superior que EC_{50} y 3,5
a 7 veces superior que EC100. Se examinó el efecto de acivicin en
la síntesis de ARN, síntesis de proteína y formación de partículas
IPNV.
Aunque el acivicin es al parecer un inhibidor
menos eficaz de la replicación de IPNV comparado al reovirus, estas
concentraciones del compuesto no afectan la viabilidad o la síntesis
de ADN de células CHSE-214. Acivicin tiene un
índice terapéutico bueno. Usando pruebas similares para medir el
índice terapéutico, se evalúan los compuestos isoxazol para su
habilidad de inhibir la progresión de infección de IPNV en los
animales acuáticos, particularmente peces, mientras se aumenta el
rendimiento de peces y su peso total.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El efecto de acivicin en la síntesis de ARN
genómico de IPNV fue determinado, los resultados se muestran en la
autoradiografía de la Figura 1. Ya que el ARN genómico de IPNV puede
detectarse aproximadamente 8 a 10 horas post infección, se
evaluaron las muestras a las 24 horas y 48 horas post infección.
Se infectaron 6x10^{5} células de
CHSE-214 a un m.o.i. de 50 pfu/célula. Monocapas de
células CHSE-214 se infectaron con IPNV ya sea en
ausencia de acivicin (líneas 1 y 4), o en presencia de acivicin a 25
\mug/ml (líneas 2 y 5) o la presencia de acivicin a 70 \mug/ml
(líneas 3 y 6). Simultáneamente, acivicin y 50 \muCi/ml de ácido
[^{32}P]-ortofosfórico se agregaron a las 0 horas
post-infección y las células se incubaron a 15ºC. A
24 horas post-infección (líneas 1, 2, y 3) y 48
horas post-infección (líneas 4, 5, y 6), las células
fueron cosechadas, se extrajo ARN de ellas y se analizó en
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) al 7% y
autoradiografía. La migración de los segmentos A y B del ARN
genómico de IPNV es indicado por flechas.
\newpage
Ejemplo
3
El efecto de acivicin en la síntesis de
polipéptido de IPNV fue determinado, los resultados se muestran en
la autoradiografía de la Figura 2. Monocapas de células
CHSE-214 se infectaron con IPNV ya sea en ausencia
de acivicin (líneas 1 y 9), o en presencia de acivicin a 25
\mug/ml (líneas 4 y 10) o la presencia de acivicin a 70 \mug/ml
(líneas 5 y 11). Acivicin se agregó en el momento de infección (cero
h.p.i.) y las células se incubaron a 15ºC. Seis horas
post-infección, un 50 \muCi/ml de
[^{35}S]-metionina se aplicó a las células. A 24
h.p.i. (líneas 1 a 5) y a 48 h.p.i. (líneas 6-1 l),
100 \mul de una solución de ruptura de proteína se agregó a las
monocapas celulares. Los polipéptidos de las células rotas fueron
analizados por 15% SDS-PAGE y autoradiografíadas.
Las muestras celulares no infectadas también fueron incluidas en las
líneas 2, 3, 6, 7, y 8. La migración de los polipéptidos de IPNV se
indica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El efecto de acivicin en la formación de la
partícula de IPNV fue determinado, los resultados se muestran en
las Figuras 3A y 3B. Para caracterizar adicionalmente el efecto del
compuesto de isoxazol acivicin en la formación de partículas de
IPNV, se evaluaron las partículas virales en ausencia y presencia de
acivicin. Para este propósito monocapas de células
CHSE-214 se infectaron con IPNV en presencia de
acivicin a 25 \mug/ml y 70 \mug/ml, se infectaron por 24 y 48
horas y las partículas se marcaron con
[^{35}S]-metionina y ácido
[32P]-ortofosfórico. Las partículas fueron
parcialmente purificadas y visualizadas en electroforesis en geles
de agarosa Tris-glicina (TGA). Las proteínas de
partícula viral de IPNV marcadas con
^{35}S-metionina que se obtuvieron en ausencia de
acivicin 24 ó 48 horas post infección, como es mostrado en la Figura
3A, líneas 3 y 6, respectivamente. Las líneas 1, 2 y 4, 5 muestran
el efecto que la presencia de 25 \mug/ml y 70 \mug/ml de
acivicin, respectivamente, tiene formación de la partícula de IPNV.
Las partículas del virus se obtienen a 24 ó 48 h.p.i.,
respectivamente. Los resultados similares fueron obtenidos en el
método experimental mostrado en la Figura 3B, en que el ácido
nucleico de las partículas del virus se marcó con
^{32}P-H_{2}PO_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se prueban compuestos derivados de isoxazol para
su habilidad de inhibir la entrada viral en la célula. Para
determinar si el acivicin bloquea la entrada de IPNV, se llevó a
cabo una prueba de inhibición de placa vira1 modificada. Antes del
ensayo de inhibición viral, se pre-incubaron las
muestras de IPNV toda la noche o durante 2 horas con las
concentraciones de acivicin entre 1 y 6 \mug/ml. Muestras de
control vira1 no se pre-incubaron con acivicin. Los
resultados muestran que las muestras pre-incubadas
por una noche teniendo un EC_{50} de 2,5 \mug/ml habían
disminuido a 4 \mug/ml (que corresponde a EC_{50} de muestras
sin la pre-incubación). La incubación toda la noche
del virus en acivicin aumentó la habilidad del compuesto isoxazol de
inhibir las placas virales en un 38 por ciento. El EC_{50} de las
muestras virales que se pre-incubaron durante sólo
2 horas con el acivicin no fue significativamente diferente de las
muestras virales que no se pre-incubaron con
acivicin.
Para determinar si el acivicin inhibe el
ensamble de la descendencia viral infectiva, las muestras virales
fueron tituladas en ausencia y presencia de 4 \mug/ml de acivicin.
Los métodos son iguales que la prueba de reducción de placa, sólo
que las células de la monocapa CHSE-214 se infectan
con diluciones en serie del virus desde 10^{-1} a 10^{-9}.
Muestras virales obtenidas de células infectadas con el virus en
ausencia del compuesto tenían un título que corresponde a 3,7 x
10^{8} pfu/ml mientras las muestras virales obtenidas de células
infectadas con el virus en la presencia del compuesto tenía un
título que corresponde a 4,3x10^{4} pfu/ml. En otros términos,
los títulos de una muestra viral disminuyeron cuatro órdenes de
magnitud en la presencia de acivicin. Estos resultados indican que
acivicin puede disminuir eficazmente la cantidad y/o calidad
infectiva de la descendencia viral.
Como es mostrado en la Figura 3A, monocapas de
células CHSE-214 se infectaron con IPNV ya sea en
ausencia de acivicin (líneas 3 y 6), o en presencia de acivicin a
25 \mug/ml (líneas 1 y 4) o la presencia de acivicin a 70
\mug/ml (líneas 2 y 5). Acivicin se agregó en el momento de
infección (cero h.p.i.). Las células se incubaron a 15ºC. Dos horas
post-infección, 50 \muCi/ml de
[^{35}S]-metionina se aplicó a las células. A 24
h.p.i. (líneas 1, 2 y 3) y a 48 h.p.i. (líneas 4,5 y 6) las
partículas fueron cosechadas, concentradas por ultracentrifugación
y parcialmente purificadas a través de una gradiente de sacarosa.
Las partículas virales se sometieron entonces a electroforesis en
geles de agarosa Tris-glicina 0,8% y
autoradiografiadas. La migración de las partículas de IPNV se
indica.
En la Figura 3B, se muestran resultados en los
cuales se infectaron monocapas de células de
CHSE-214 con IPNV en la ausencia de acivicin (línea
3 y 6); en presencia de 25 \mug/ml acivicin (líneas 1 y 4); y en
la presencia de 70 \mug/ml acivicin (líneas 2 y 5). Se siguieron
los mismos procedimientos descritos para la Figura 3A sólo que en
el momento de infección, 50 \muCi/ml de ácido
[^{32}P]-ortofosfórico fue agregado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Los pececillos de salmón Atlántico (teniendo un
peso promedio del cuerpo de aproximadamente 1,0 \pm 0,2 g) se
infectan con 10^{4} pfu/ml IPNV por inmersión en el día 0.
Partiendo a los nueve días
post-infección, los peces sobrevivientes son
divididos en 4 grupos de cuarenta peces cada uno y se tratan con 0,
7, 10,8 ó 14 \mug/ml de acivicin a diario por inmersión durante 2
horas en un baño que contiene 9 \mug/ml de acivicin. Un grupo
corresponde a peces no tratados y los otros tres a los tratados con
las distintas concentraciones de acivicin. Como control negativo hay
dos grupos de 40 pececillos sanos en cada uno; un grupo corresponde
a pececillos no infectados y que se les administró 14 \mug/ml de
acivicin mientras el otro grupo no fue infectado ni se le administró
el acivicin. El tratamiento diario en acivicin es continuado a
través de 21 días post-infección (día 21). Los peces
se siguieron por 36 días post-infección para
detectar y documentar la mortalidad. Los resultados de los días
10-24 se presentan gráficamente por lo que se
refiere a "% de supervivencia" en la
Figura 5.
Figura 5.
El número de muertes entre la pececillos del
salmón Atlántico infectados con IPNV empezó en el día 4
post-infección y aumentó progresivamente, mientras
alcanzó un 12% proporción de mortalidad en el día 8 y 20% en el día
9. La supervivencia mejoró cuando el tratamiento empezó el día 9
post-infección. En cada uno de los grupos tratados,
las muertes empezaron a disminuir gradualmente, y se detuvieron 10
días post-tratamiento completamente (día 19).
Después de 12 días de tratamiento con acivicin, el tratamiento se
detuvo (día 21 post-infección) que correspondió a
cuando ninguna muerte fue observada y el pez había reanudado la
actividad. Las observaciones continuaron más allá durante 15 días.
Pretenciosamente, la pececillos del salmón Atlántico
IPNV-infectado dejaron de teñir gradualmente cuando
la pececillos se trataron con acivicin.
La Figura 5 muestra las muertes que aumentaron
después de que el tratamiento del acivicin empezó en el día 9
post-infección (las muertes acumuladas se
presentaron como "% de supervivencia"). Las muertes acumuladas
entre los pececillos no tratados infectados con IPNV (control
positivo) alcanzó 30% (es decir, 70% sobrevivencia). En el grupo de
peces infectados tratados con 7,0 \mug/ml acivicin, la proporción
de mortalidad también alcanzó 30%. En el grupo de peces infectados
tratados con 10,5 \mug/ml acivicin, las muertes acumuladas
alcanzaron 8%. En el grupo de peces infectados tratados con 14
\mug/ml acivicin la mortalidad alcanzó 11%. Cinco por ciento de
mortalidad se observó en el grupo de control negativo que
corresponde a peces no infectados. Una proporción de tres por
ciento de mortalidad se observó en el grupo control negativo que
corresponde a peces no infectados tratados con 14 \mug/ml
acivicin. Las muertes entre los peces no infectados eran
probablemente debidas al manejo del pez saludable durante el
trabajo experimental, ya que ningún patógeno se encontró en el
tejido del pez de prueba y la conducta del pez era normal.
Después de que los tratamientos de acivicin
fueron terminados, no hubo ninguna muerte observada en cualquiera
de los tres grupos que se habían tratado con el compuesto antiviral,
ni en los grupos de control no infectado (días
21-36). En el grupo control no tratado infectado,
sin embargo, las muertes continuaron y alcanzaron 54%.
Los grupos tratados con 10,5 \mug/ml o 14
\mug/ml de acivicin tenían proporciones de supervivencia que
estaban igual que los controles no infectados, mostrando que el
acivicin es un inhibidor fuerte de morbosidad y mortalidad in
vivo de IPNV. Además, este compuesto antiviral no es tóxico en
peces, como es evidenciado por los peces no infectados tratados con
14 \mug/ml de acivicin que tenía una proporción de supervivencia
equivalente a los peces no infectados y no tratados. La
supervivencia más alta se observó en la concentración de antiviral
más alta, es decir, 92% y 89% de supervivencia con 10,5 \mug/ml y
14 \mug/ml de acivicin, respectivamente.
Es importante que no hubo muertes progresivas en
los peces no tratados infectados, comparado a la ausencia de
muertes adicionales en los peces infectados y tratados después de
que los tratamientos de acivicin se detuvieron. Esto indica que el
antiviral fue eficaz disminuyendo la mortalidad durante el periodo
agudo de la enfermedad así como después de que el antiviral fuera
detenido. Esta probablemente se debe a la habilidad de acivicin de
inhibir la replicación de IPNV lo que causó una marcada disminución
en la carga viral para que la pececillos se volvieran portadores
del virus asintomático. Esto se corrobora analizando las muestras
del tejido del pez en la célula cultivada y ensayada por
RT-PCR descrito aquí. En los peces infectados no
tratados, los títulos virales pueden ser sobre 10^{5} pfu/ml,
mientras que en el pez tratado los títulos virales son más
bajos.
La presencia de IPNV en el pez muerto de ambos
grupos tratados y no tratados fue verificada por la inoculación de
monocapas de células de CHSE-214 y por
RT-PCR. Se usaron estas técnicas de identificación
vira1 y cuantificación porque son actualmente las técnicas más
sensibles y fiables disponibles para permitir la detección de IPNV
en los peces portadores. Al final del experimento, 45 días
post-infección (día 45), se tomaron las muestras de
peces supervivientes para analizar si ellos eran portadores del
virus. Los resultados de RT-PCR revelaron la
presencia del virus en todos los peces infectados. Sin embargo, una
carga viral más alta se observó en los peces infectados no
tratados. Un título viral mayor que 10^{5} pfu/ml estaba presente
en los peces no tratados mientras que un título viral entre
10^{2} y 10^{4} pfu/ml estaba presente en el pez tratado.
\newpage
Birnavirus acuático/IPNV puede ser clasificado
y/o identificado basado en los ensayos de seroneutralización,
pruebas de cultivos celulares, pruebas RT-PCR,
análisis de enzima de restricción y/o análisis de la secuencia. La
prueba de RT-PCR es un método rápido, específico y
sensible para detectar, identificar y caracterizar birnavirus
acuático que puede estar presente en una muestra. Hay por lo menos 9
cepas del tipo de Serogrupo A y otras 4 cepas representantes del
Serotipo Al de IPNV que es el birnavirus acuático y serotipo de IPNV
predominante en Estados Unidos. Se usan secuencias como cebador que
son muy conservadas entre el birnavirus acuático en las pruebas de
PCR para identificar todos los serotipos de serogrupos A conocidos
del birnavirus acuático. Los cebadores de IPNV típicos son
específicos para las regiones de cDNA codificadas por el segmento
del genoma A o la región codificante VP2 completa de birnavirus
acuático.
Cuando pececillos de trucha arco iris
naturalmente infectadas de aproximadamente 0,8 g se trataron durante
12 días con 9 \mug/ml acivicin, la supervivencia obtenida fue 98%
lo que sugiere que una mejora en la supervivencia se obtiene con
concentraciones que son mayores que 7 \mug/ml, como
aproximadamente 9 \mug/ml de este agente antiviral. Con las
concentraciones más altas, la supervivencia fue igual que en los
controles saludables. Esto indica que una meseta se alcanzó en el
efecto del antiviral acivicin al usar las concentraciones sobre 9
\mug/ml. El método de la presente invención incluye la
administración de un compuesto isoxazol antes, durante, y/o después
de la exposición a IPNV. En una forma, el método de la presente
invención comienza por la administración del compuesto isoxazol
cuando la mortalidad que se observa es de aproximadamente 5% a
aproximadamente 25%, preferentemente en o antes de que la
mortalidad alcance 20%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Los compuestos siguientes se probaron para su
habilidad de inhibir la replicación de IPNV por el método descrito
anteriormente:
ácido L (alfa S,
5S)-alfa-amino-3-cloro-4,5-dihidro-5-isoxolacetico
(acivicin);
ácido
6-(4-hidroxi-6-metoxi-7-metilo-3-oxo-5-ftalanil)-4-metilo-4-hexenoico
(ácido micofenólico);
(S)-9-(2,3-dihidroxipropil)adenina
(DHPA);
ácido
3-adenina-9-il-2-hidroxipropanoico
(AHPA); y
3'-fluoro guanosina y
9-(2-hidroxi etoximetil)guanina
(aciclovir).
El efecto antiviral de estos compuestos se
evaluó por una prueba de inhibición de placa de virus que usa los
procedimientos conocidos en el arte. Jashés et al, Antiviral
Res. 29: 309 (1996). Las pruebas se repitieron tres veces por lo
menos y se hicieron por triplicado. Monocapas de línea de células de
embrión de salmón de Chinook (CHSE-214) crecido a
18ºC en Medio Esencial Mínimo Eagle (MEM), complementado por 5% de
suero fetal de bovino (FBS) y antibióticos para una confluencia de
aproximadamente 90% son infectadas con cerca de 50 - 100 unidades
formadoras de placas (pfu) de IPNVcepa VR-299.
Después de una hora de absorción con agitación cada 15 minutos, las
muestras se sacan y las células se recubren con 0,5% agarosa en MEM
complementado con 10% de FBS e incubado durante 3 días a 15ºC. Los
compuestos a ser probados fueron agregados a diferentes
concentraciones en la agarosa de cobertura. Después, las células
son fijadas con formaldehído y teñidas con una solución de cristal
violeta 0,5% para detectar las placas lisadas. Las concentraciones
de compuesto utilizadas fueron seleccionadas en base a informes
previos de estudios de otros virus. Se determinó la concentración
antiviral eficaz para inhibir la formación de placa de IPNV en 50%
(EC_{50}) y en 100% (EC_{100}).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La Tabla 3 muestra los efectos de varios agentes
antivirales en la replicación de IPNV en las células
CHSE-14.
a: concentración antiviral eficaz
requerida para inhibir formación de placa de IPNV en
50%.
b: concentración antiviral eficaz requerida
para inhibir formación de placa de IPNV en 100%.
c: concentración citotóxica requerida para
reducir la viabilidad celular en 50%.
d: concentración inhibitoria requerida para
reducir la incorporación de [metilo-^{3}H]
timidina en 50%.
N.D. =No determinada, porque a esta
concentración los compuestos afectan la monocapa celular que evita
la visualización de las placas; N.I. =No inhibitorio; N.A. =No
analizado. Ribavirina fue incluido como un compuesto de referencia;
la Tabla 3 muestra resultados similares para ribavirina como
aquéllos previamente descritos. Hudson et al., Antiviral
Res. 9: 379 (1988); Jashés et al, supra (1996).
Aciclovir, un análogo de guanosina, aunque es un
hhibidor de polimerasas virales no inhibió la replicación de IPNV
en el rango de concentración estudiado (10 - 200 \mug/ml).
Semejantemente, 3'-fluoro guanosina no inhibió la
replicación de IPNV a las concentraciones más altas que se
describieron para otros virus por otro análogo
3'-nucleósido. Van Aersehot et al., Antiviral
Res. 12: 133 (1989).
Los análogos de adenina y los inhibidores de la
enzima S-adenosil homocisteína hidrolasa, DHPA y
AHPA, inhiben la formación de placa de IPNV en 50%, con un
EC_{50} de 50 y 30 \mug/ml, respectivamente. Cuando las
concentraciones del antiviral fueron aumentadas, los monocapas
celulares fueron afectadas por lo que la visualización de la placa
no fue posible y ningún EC_{100} fue obtenido. DHPA se había
descrito como un inhibidor de la replicación de IPNV en los ensayos
en las células de RTG-2 a concentraciones de 100 a
300 \mug/ml, sin presentar citotoxicidad. No obstante, las
células de CHSE-214 resultaron ser más sensibles a
este compuesto así como a su análogo AHPA.
De estos compuestos, sólo acivicin y el ácido
mnicofenólico a las concentraciones de 7 \mug/ml y 15 \mug/ml,
respectivamente, pudo inhibir 100% (EC_{100}) la replicación de
IPNV. Se realizaron los estudios de citotoxicidad en acivicin y
ácido micofenólico. El ensayo de citotoxicidad fue realizado como se
describió anteriormente se determinó que las concentraciones
requeridas para reducir la viabilidad celular en 50% (CC_{50}) fue
mayor que 100 \mug y 50 \mug, respectivamente. El bloqueo de
síntesis de ADN celular fue moderado para acivicin y el ácido
micofenólico. Fueron determinadas las concentraciones que redujeron
la incorporación de
[metilo-^{3}Hl-timidina en 50%
(IC_{50}) fueron 25 a 70 \mug/ml y 1,8 \mug/ml,
respectivamente. La diferencia entre la concentración inhibitoria
de replicación de IPNV y la concentración que afecta la síntesis de
ADN en las células en crecimiento obtenida con el ácido micofénolico
no fue mejor que la previamente descrita para otros inhibidores de
inosina monofosfato dehidrogenasa como, ribavirin y EICAR. Sin
embargo, acivicin demostró un índice terapéutico bueno.
El ácido micofenólico inhibió la formación de
placa de IPNV en las células de CHSE-214, con un
EC_{50} de 0,5 \mug/ml. Este compuesto, como ribavirina y
EICAR, actúa inhibiendo la enzima IMP dehidrogenasa, disminuyendo
así el GTP celular que finalmente afecta la replicación viral (Neyts
et al., Antiviral Res. 30: 125 (1996); Migus et al.,
J. General Virol. 47: 47 (1980). En el tratamiento del virus de la
fiebre amarilla, este compuesto fue un agente antiviral más eficaz
que EICAR o ribavirin. Su EC_{50} era diez veces menor que el de
EICAR y 350 veces menor que el de ribavirin. No obstante, los
efectos antivirales del ácido micofenólico para IPNV no fue mayor
que para EICAR EC_{50} que es 0,01 \mug/ml y tenía el mismo EC50
que ribavirin. Jashés et al., Antiviral Res. 29:309
(1996).
Acivicin inhibió la formación de placa de IPNV
en las células de CHSE-214 con 4 \mug/ml
EC_{50}. El mecanismo de acción de acivicin puede relacionarse
como ser un análogo del glutamina. Acivicin es un derivado de
isoxazol que es capaz de actuar del mismo modo que otros derivados
actuando para inhibir la replicación de ARN viral en el virus de la
familia Picornaviridae ligándose a la proteína de la cápside
viral. Tal unión a la cápside previene la entrada viral en la
célula y desnudación del virus en la célula (Shepard et al.,
J. Virol. 67:2245 (1993)). Acivicin inhibe la replicación del
reovirus en las células de Balblc a una concentración de 0,1
\mug/ml. Keast et al., Arch. Virol. 124:235(1992).
Esta concentración de acivicin es 40 veces menor que la que inhibe
la replicación de IPNV in vitro.
Se conoce bien por aquéllos entendidos en el
arte que el nivel de pureza y la actividad de un compuesto puede
afectar la dosis requerida.
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Ejemplo
8
Los efectos de citotoxicidad en
CHSE-214 de los compuestos que inhibieron la
replicación de IPNV se estudió usando procedimientos descritos
previamente. Se determinó la concentración citotóxica requerida para
reducir la viabilidad celular en 50% (CC_{50}). Por ejemplo, en
análogos de adenina AHPA y DHPA, el CC_{50} obtenido fue 75 y 100
\mug/ml, respectivamente y la citotoxicidad fue mayor a la que se
observó en las células RTG-2. Para el ácido
micofenólico, el CC_{50} obtenido fue >50 \mug/ml y el
IC_{50} de 1,8 \mug/ml que fueron valores más altos que el
obtenido con ribavirin y EICAR para IPNV. Por consiguiente, el ácido
micofenólico no es un compuesto antiviral bueno. Ver1 Neyts et
al., Antiviral Res. 30:125 (1996). La citotoxicidad de estos
compuestos in vivo puede ser más baja que la medida por las
pruebas de incorporación de ^{3}H-timidina porque
los compuestos pueden interferir directamente con la captación de
timidina. Drach et al., Science 2 12: 549 (1981).
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Ejemplo
9
Acivicin se probó in vivo en treinta
truchas arco iris (Onchorhynchus mykiss). Treinta pececillos
naturalmente infectados de trucha arco iris (Onchorhynchus
mykiss) pesando 1,0 \pm 0,4 g se trataron durante 15 días con
9 \mug/ml de acivicin, en un baño diario de dos horas. Los peces
se siguieron durante 30 días siguientes al primer día de los
tratamientos de acivicin. Se documentaron las muertes y presentaron
referidas a por ciento de supervivencia. Se muestran resultados de
métodos que evalúan el efecto del tratamiento con acivicin en la
supervivencia de los pececillos de trucha naturalmente infectados en
el gráfico de la Figura 4. Treinta días después de la
administración de acivicin, 90% de los pececillos de trucha habían
sobrevivido, mientras que sólo 30% del grupo control no tratado
habían sobrevivido el mismo periodo de 30 días. El gráfico muestra
que en el grupo de peces tratados, todas las muertes ocurrieron por
el día 12 de los 15 días de administración del protocolo; no hubo
ninguna muerte adicional observada después del día 12 de tratamiento
de acivicin. En contraste, en el grupo de peces no tratados, las
muertes continuaron durante los primeros 25 días del periodo de
observación.
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Ejemplo
10
Los pececillos de salmón Atlántico se tratan por
un número variante de días (1 a 12 días) por un baño diario de 2
horas con acivicin (concentraciones que varían entre 7,0 y 25,0
\mug/ml) antes de infectarse experimentalmente con IPNV. Los
tratamientos de acivicin continúan después de la infección de IPNV
durante 20 días o hasta que ninguna muerte adicional sea observada.
La supervivencia y los títulos virales son determinados, como se
discutió anteriormente en el Ejemplo 5.
En un protocolo alternativo, el salmón se expone
a IPNV a través de la exposición a peces infectados con IPNV. Los
pececillos no infectados del salmón Atlántico con IPNV son divididos
en tres grupos de peces (Grupos A-D) tratados
diariamente durante 2 horas con las siguientes cuatro
concentraciones de acivicin: 7 \mug/ml (Grupo A, 11 \mug/ml
(grupo B), 15 \mug/ml (Grupo C) y 0 \mug/ml (grupo D),
respectivamente. En cada día sucesivo al día 1 del protocolo de
tratamiento de acivicin, 30 peces de cada grupo se exponen a 10
salmón Atlántico adicionales que están ya sea (1) infectados con
IPNV (7 días post infección, teniendo un título vira1 que promedia
20 pfu/ml) o (2) libres de títulos de IPNV. Por consiguiente, los
Grupos A-1, B-1, y
C-1 están tratados con acivicin e
IPNV-expuestos; los peces de D-1 son
no tratados e IPNV-expuestos; los Grupos
A-2, B-2 y C-2
están tratados con acivicin y no se expusieron a IPNV; y grupo
D-2 no se exponen a acivicin o IPNV. Empezando en
el día uno del protocolo de tratamiento de acivicin, se registran
las muertes y comparan entre los grupos. La presencia y título de
IPNV en los peces muertos son determinados por la inoculación de
monocapas de células de CHSE - 214 y por RT - PCR.
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Ejemplo
11
El compuesto activo es mezclado con jurel
desmenuzado y es administrado en una sola dosis de 50 \mug/ml por
el método de acceso libre. A 6, 9, 12, 24, 36, 48 y 72 horas
administración siguientes, se toma sangre del corazón. La
concentración del compuesto isoxazol en la sangre es entonces
determinada por métodos conocidos por los entendidos en el arte,
como HPLC. La temperatura del agua fue medida diariamente durante
horas de la mañana y se registró.
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Ejemplo
12
Un polvo es preparado mezclando 7 partes en peso
del compuesto isoxazol 2,0-5,0 g/kg con 93 partes en
peso de lactosa. Usando 100 g del polvo como una unidad de dosis
diaria, aproximadamente 20,000 peces pesando 50 g en promedio o un
total de 1 tonelada son alimentados con una mezcla de la unidad de
dosis anterior y 200 kg de pez desmenuzado durante 5 días
consecutivos. Este régimen se usa para prevenir y aumentar la
supervivencia a infección de IPNV en peces.
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Ejemplo
13
Un polvo es preparado mezclando 7 partes en peso
del acivicin con 93 partes en peso de lactosa. A aproximadamente
15.000 peces pesando 200 g en promedio o un total de 3 toneladas se
les da pellets húmedos, tales como pellets columnares preparados
con una mezcla de sardina desmenuzada con un alimento en polvo
formulado en base a comida del pez en una proporción de 6:4 y la
mezcla se forma mecánicamente en pellets, que se complementó con 300
g de acivicin en polvo durante 5 días consecutivos. Este régimen se
usa para prevenir y aumentar la supervivencia de infección de IPNV
en peces.
Pececillos de trucha arco iris (Onchorhynchus
mykiss) pesando 1 \pm 0,2 g que se han infectado naturalmente,
se les administra la comida de pez con 0; 0,5; 1,0 y 2,0 \mug/ml
de acivicin diariamente durante 15 días. Los peces se supervisan
como se describe en el Ejemplo 5 o Ejemplo 9, incluyendo tanto
supervivencia y títulos virales. La cantidad o dosis en que la
supervivencia mejora significativamente se usa entonces como la
cantidad eficaz administrada en la comida del pez.
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Ejemplo
14
Treinta pececillos de Salmón de Coho
(Onchorhynchus kisutch) IPNV-infectados
pesando aproximadamente 0,7 a aproximadamente 4,0 g se tratan un
día post infección durante 7 días con 9 \mug/ml acivicin, en un
baño diario de una hora. Los peces se siguen durante 22 días, se
determina su proporción de mortalidad después del tratamiento. La
supervivencia de los grupos de pececillos
acivicin-tratados y no tratados se compara.
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Ejemplo
15
Treinta pececillos de trucha arco iris
(Onchorhynchus mykiss) pesando 1 \pm 0,2 g que se han
infectado naturalmente son tratados por 15 días con 9 \mug/ml de
paramomicina (disponible en Sigma) diariamente por baño de dos
horas. Los peces se supervisan por 4 semanas para determinar su
proporción de mortalidad después del tratamiento. La supervivencia
de los pececillos paramomicina -tratados y no tratados se
compara.
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Ejemplo
16
Treinta pececillos de trucha arco iris
(Onchorhynchus mykiss) pesando 1 \pm 0,2 g que se han
infectado naturalmente son tratados por 15 días con 9 \mug/ml de
L-cicloserina (disponible en Sigma) diariamente por
baño de dos horas. Los peces se supervisan por 15 días más. La
supervivencia de los pececillos
L-cicloserina-tratados se documenta
y compara para determinar la efectividad y dosis del compuesto
isoxazol que aumenta la supervivencia en los animales acuáticos
tratados.
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Ejemplo
17
Treinta pececillos de trucha arco iris
(Onchorhynchus mykiss) pesando 1 \pm 0,2 g que se han
infectado naturalmente son tratados por 15 días con 9 \mug/ml
(\pm)-ácido 4-bromohomoiboténico (disponible en
Sigma) diariamente por baño de dos horas. Los peces se supervisan
por 4 semanas para determinar su proporción de mortalidad después
del tratamiento. La supervivencia de los pececillos tratados y el
grupo control no tratado se compara para determinar la efectividad
y dosis efectiva del compuesto antiviral.
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Ejemplo
18
Treinta pececillos de trucha arco iris (Salmo
nairdneri) pesando 1 \pm 0,2 g que se han infectado
naturalmente son tratados por 15 días con 9 \mug/ml isoxazolo
5-il-2'-deoxiuridina
diariamente por baño de dos horas. Los peces se supervisan por 4
semanas para determinar su proporción de mortalidad después del
tratamiento. La supervivencia de los pececillos tratados y el grupo
control no tratado se compara para determinar la efectividad y
dosis efectiva del compuesto antiviral.
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Ejemplo
19
Quinientas ostras (Crassostrea virginica)
o gambas naturalmente infectadas con un virus se tratan durante 30
días con 9 \mug/ml acivicin, en un baño diario de seis horas. El
molusco se sigue durante 1 año, para detectar una posible erupción
de mortalidad después del tratamiento. Se observa la supervivencia
final de las ostras tratadas con acivicin y ostras no tratadas. Se
observa la supervivencia de gambas tratadas con acivicin y gambas
no tratadas y se compararon para determinar la efectividad y la
cantidad eficaz del compuesto antiviral.
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Ejemplo
20
Una granja de peces Rey Salmón (Onchorhynchus
tshawytscha) monitoreando la actividad y apariencia de
pececillos, buscando pececillos que parecen oscuros, localizados
contra las salidas de agua, y/o "estremeciéndose" cerca de la
superficie. Los peces estremeciéndose se cogen y se examinan para la
mucosidad blanca, la característica del estómago por infección de
IPNV. Al detectar tales peces, todos los pececillos se tratan
durante 15 días con 9 \mug/ml acivicin, en un baño diario de dos
horas. Después del tratamiento, los peces se supervisan
estrechamente durante 2-3 semanas adicionales, para
determinar su proporción de mortalidad después del tratamiento. La
supervivencia de los pececillos tratados y no tratados se compara
para determinar la efectividad y la cantidad eficaz del compuesto
antiviral.
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Ejemplo
21
El efecto de neomicina en la síntesis de ARN
genómico de IPNV fue determinado. Los resultados se muestran en la
autoradiografía de la Figura 6A. Monocapas de células del embrión de
salmón Chinook de línea celular 214 (CHSE-214) se
infectaron con IPNV ya sea en ausencia de neomicina (líneas 3, 5, 7
y 9), o en presencia de neomicina a 4 \mug/ml (líneas 2, 4, 6 y
8). Neomicina se agregó a las células a 1, 3, 5 y 7 horas
post-infección (h.p.i.), (líneas 2, 4, 6 y 8)
respectivamente y las células se incubaron a 15ºC. 24 horas
post-infección las células se cosecharon, se
extrajo el ARN de éstas y se analizaron en geles de poliacrilamida
al 7% electroforesis (PAGE) teñidos con nitrato de plata. La línea
1 muestra un control de ARN genómico de IPNV. Los datos muestran
que Neomicina inhibió la síntesis de ARN de IPNV.
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Ejemplo
22
El efecto de neomicina en la síntesis de
polipéptido de IPNV fue determinado, los resultados se muestran en
la autoradiografía de la Figura 6B. Monocapas de células
CHSE-214 se infectaron con IPNV ya sea en ausencia
de neomicina (líneas 3, 5, 7 y 9), o en presencia de neomicina a 4
\mug/ml (líneas 2, 4, 6 y 8). La neomicina se agregó a 7, 5, 3 y
1 hora post infección (h.p.i.), (líneas 2, 4, 6 y 8) respectivamente
y las células se incubaron a 15ºC. Cuatro horas
post-infección, 50 \muCi/ml de
[^{35}S]-metionina se aplicó a las células. A 24
h.p.i. 100 \mul de una solución de ruptura de proteína se agregó a
las monocapas celulares. Los polipéptidos de las células rotas
fueron analizados por 15% SDS-PAGE y
autoradiografía. Línea 1 es un control de células
CHSE-214 no infectadas. La neornicina no inhibe
síntesis de polipéptidos.
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Ejemplo
23
Pececillos de salmón Atlántico (pesando en
promedio 0,75 \pm 0,3 g) se infectan con 10^{4} pfu/ml de IPNV
en el día 0. Un día post-infección, los peces se
tratan a diario por inmersión durante 1 hora en un baño que
contiene 10, 40 u 80 ppm de neomicina. Los controles de pececillos
no infectados son, ya sea tratados diariamente por una hora con 0 u
80 ppm de neomicina. Este tratamiento diario en neomicina es
continuado a través de 10 días post-infección. Los
peces se siguieron por 26 días post-infección para
documentar las muertes. Los datos los cuales se representan
gráficamente en términos de porcentaje de supervivencia en la Figura
7. El tratamiento de pececillos de salmón infectados con IPNV a
concentraciones tan bajas como 10 ppm pueden mantener la
supervivencia a niveles equivalentes a los controles no
infectados.
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Ejemplo
24
Los pececillos de salmón que pesan cerca de 0,45
a cerca de 1,0 g, se infectan con 10^{5} pfu/ml de IPNV en el día
0. Partiendo a los trece días post-infección,
después de que comenzó la mortalidad, los peces se tratan a diario
por inmersión durante 1 hora en un baño que contiene 10, 40 u 80 ppm
de neomicina y es continuado a través de 23 días
post-infección. Los peces se siguieron por 26 días
post-infección para documentar las muertes. Los
datos se representan gráficamente en la Figura 8 en términos de
porcentaje de supervivencia. En forma importante, los pececillos de
Salmón IPNV-infectados se dejaron de teñir
inmediatamente cuando los pececillos se trataron con neomicina.
La descripción anterior de las formas preferidas
de la invención presente se ha presentado para propósitos de
ilustración y descripción. No se piensa que es exhaustivo o
limitante para la invención las formas precisas descritas. Muchas
variaciones y modificaciones de las formas descritas aquí serán
obvias para una persona entendida en el arte. El alcance de la
invención sólo será definido por las reivindicaciones adjuntas.
Además, describiendo formas representativas de
la invención presente, la solicitud ha presentado el método como
una serie de pasos. Sin embargo, la magnitud del método no confía en
el orden particular, el método no debe limitarse a la sucesión
particular de pasos descrita. Como una persona entendida en el arte
podrá apreciar, otras sucesiones de pasos pueden posibles. Por
consiguiente, el orden particular de los pasos no debe traducirse
como limitaciones en las reivindicaciones. Además, no deben
limitarse las reivindicaciones dirigidas al método de la invención
presente a la actuación de sus pasos en el orden escrito y una
persona entendida en el arte puede apreciar prontamente que las
sucesiones pueden variarse y todavía pueden permanecer dentro del
espíritu y alcance de la invención presente.
Claims (17)
1. Uso de acivicina para la preparación de un
medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección de
un animal acuático por el virus de la necrosis pancreática
infecciosa (IPNV).
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que la administración del medicamento se efectúa en un momento
seleccionado del grupo que consiste en antes; durante; después;
durante y después; antes y durante; antes y durante y después; o
antes y después de que dicho animal acuático se exponga a y/o sea
infectado por dicho virus.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que la administración del medicamento es
mediante un método seleccionado del grupo que consiste en introducir
el compuesto en el ambiente acuático; incluir el compuesto en el
alimento; e inyectar en el animal acuático el compuesto disuelto en
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la administración inhibe la
síntesis de RNA genómico viral en dicho animal acuático.
5. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la administración disminuye la
carga viral/concentración viral del IPNV en un tejido del animal
acuático.
6. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la administración disminuye la
carga viral/concentración viral del IPNV en un tejido del animal
acuático desde 10^{5} pfu/ml hasta una carga viral/concentración
viral de 10^{1} a 10^{3} pfu/ml.
7. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la administración disminuye la
carga viral/concentración viral del IPNV en un tejido del animal
acuático en de 10 veces a 10^{4} veces.
8. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la administración disminuye la
carga viral/concentración viral del IPNV en un tejido del animal
acuático en de 10 veces a 100 veces.
9. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el medicamento se administra en
una concentración de 7,0 a 30 \mug/ml de agua en el ambiente de un
animal acuático.
10. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el medicamento se administra en
una concentración de 9,0 a aproximadamente 14 \mug/ml de agua en
el ambiente de un animal acuático.
11. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el animal acuático se selecciona
del grupo que consiste en peces, copépodos, cefalópodos, crustáceos,
camarones, anguilas y moluscos.
12. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el animal acuático es un pez
seleccionado del grupo que consiste en peces de las familias
Anguiliidae, Bothidae, Caragidae, Cotostomidae, Chichlidae,
Clupeidae, Cobitidae, Coregonidae, Cyprinidae, Esocidae, Moronidae,
Paraichthydae, Percidae, Poecilidae, Salmonidae, Salvelinus,
Sciaenidae, Thymallidae y las especies Seriola
quinqueradiata (seriola coreana), Scophthaimus maximus
(rodaballo), Limanda limanda (lenguado), Hippoglossus
hippoglossus (hipogloso), Gadus morhua (bacalao del
Atlántico), Misgrunus anguillisaudarus (locha) y Esox
lucious (lucio).
13. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el animal acuático es un pez de
la familia Salmonidae o Salvelinus seleccionado del
grupo que consiste en trucha, Oncorhynchus tshawytscha
(salmón chinook, real o del Pacífico), Oncorhynchus nerka
(salmón de lomo azul, rojo o sockeye), Oncorhynchus kisurch
(salmón coho, plateado), Oncorhynchus gorbuscha (salmón
rosado), Onchorhynchus mykiss (trucha arco iris),
Oncorhynchus keta (salmón chum o keta), Oncorhynchus
masou (salmón masou o japonés) y Salmo salar (salmón de
Atlántico).
14. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho medicamento es alimento
para peces en forma de una pella húmeda.
15. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que la administración del medicamento
frena o detiene el avance de la enfermedad pancreática.
16. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que el animal acuático se selecciona
del grupo que consiste en: salmón, trucha arco iris y trucha de
arroyo.
17. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho medicamento es para la
administración después de que se detecten los síntomas clínicos de
IPNV y/o después de la detección de IPNV en tejido de dichos
animales acuáticos y/o después de la detección de una mortalidad
incrementada o una supervivencia disminuida en dichos animales
acuáticos.
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|---|---|---|---|
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