KR101540696B1 - 바이러스 내성 넙치 육종 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이러스에 내성을 갖는 넙치 육종 방법에 관한 것으로, 본 발명의 바이러스에 내성을 갖는 넙치 육종 방법으로 생산된 넙치는 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 분석된 8개 유전좌위의 대립 유전형의 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍(base pairs)을 갖고, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)에 내성이 있으며, 빠른 성장 속도를 나타냄으로써, 질병에 강한 넙치 품종을 개발하여 양식업에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 바이러스에 내성을 갖는 넙치 육종 방법에 관한 것이다.
우리나라의 넙치 양식은 1990년대 초반부터 동해 및 남해안과 제주도 연안에서 발달하기 시작하였다. 뿐만 아니라, 고도의 양식기술이 개발되고 있으며 시설의 규모화가 진전되어 지금까지 주요 양식 산업으로 자리 잡고 있다. 이와 같은 넙치 양식 산업의 급속한 발전으로 양식넙치의 생산량은 2013년을 기준으로 약 3만 6921톤으로 총 양식어류 생산량 7만 3067통의 50.5%를 차지하고, 생산액에 있어서도 4,389억 원으로 총 양식어류 생산액 7485억원의 58%를 차지하고 있다(명정인, 2014).
그러나 최근에 이르러 잦은 질병의 발생과 이로 인한 집단 폐사, 치료를 위한 항생제의 과다한 사용 등은 그 자체 비용뿐 아니라 궁극적으로 환경 오염과 소비자들의 건강에 위해를 가할 수 있는 요소로 언급되는 등 양식 어류의 불신으로 이어져 양식 산업 경쟁력 약화의 주요 원인이 되고 있다. 이에 따라 넙치 양식의 안정적인 생산을 위한 대안으로 우수한 형질을 지닌 개체를 선발하여 이들의 교배를 거듭하는 전통적인 선발 육종 방식이 연구되고 있다. 이는 양질의 어미 확보 및 관리와 더불어 우수한 품종을 개발하여 장기적이고 체계적인 육종 연구로써 오랫동안 이에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 이를 활용하여 질병에 대한 저항성이 향상된 개체의 생산 가능성을 제시하였다(Cipriano and Heartwell, 1986; Ehlinger 1964, 1977; Embody and Hayford, 1925; Gjedrem and Aulstad, 1974; Gjedrem, 1983; Standal and Gjerde, 1987). 최근 대서양 연어(Gjedrem and Gjøen, 1995; Ødegard et al ., 2006), 무지개 송어(Henryon et al ., 2002, 2005), 잉어(Das Mahapatra et al ., 2008), 대서양 대구(Kettunen and Fjalestad, 2006)에 대한 연구는 질병 내성의 향상에 대한 실현 가능성을 한층 더 높여주었다.
넙치는 생장 속도가 매우 빠르고, 보통 육상 수조에서 양식되어지나 밀폐된 공간에서 집약적으로 양식되는 조건이 유지되면서 스트레스, 면역력 약화와 병원체 노출로 인한 대량 폐사가 발생해 오고 있다. 바이러스성 출혈성 패혈증(viral hemorrhagic septicemia: VHS)은 유럽 양식 무지개송어(Oncorhynchus mykiss)를 비롯한 담수산 연어과 어류에 감수성이 높은 것으로 알려져 왔지만 최근에는 감염 대상의 범위가 확대되어 담수 및 해수 어류의 약 50종에 질병을 유발하며(Mortensen et al., 1999; Smail, 1999), 우리나라와 일본의 넙치에서 저수온기에 발생하여 양식 산업의 경제적 손실을 일으키고 있다(Takano et al., 2000; Kim et al., 2003).
해수 어류에서의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)는 1979년 대서양 대구(Gadus morhua)에서 첫 보고된 이후(Jensen et al., 1979), 프랑스의 해수 양식 무지개송어와 광어(turbot) 등에서 질병을 야기(Dale al et., 2009; Schlotfeldt et al., 1991)하였을 뿐만 아니라, 민대구(Merlangius merlangus), 대서양 청어(Clupea harengus) 등 다양한 야생 해수어류에서 분리되어 해양 환경 중에 바이러스가 존재한다는 것이 입증되었다(Altuntas and Ogut, 2010; Mortensen et al., 1999).
VHSV는 유럽 지역뿐만 아니라 1980년대 후반부터는 북미 지역에서도 빈번히 분리되고 있고, 최근에는 우리나라와 일본 연안에서도 분리되고 있어 그 지리적 분포가 광범위한 것으로 확인되었다(Brunson et al., 1989; Kim et al., 2011; Takano et al., 2000; Nishizawa et al., 2006). 일본의 경우, 1999년 와카사만의 어류 바이러스 분포조사 중, 야생 넙치에서 처음으로 검출된 후(Takano et al., 2000), 상품 크기의 양식 넙치에서 VHSV에 의한 피해가 보고되었다(Isshiki et al., 2001). 우리나라 또한 Kim et al.(2003)이 양식 넙치에서 처음으로 보고한 이후, 다양한 해산 어류에서 분리되었으며, 양식 넙치에서 해마다 지속적인 폐사를 일으키는 병원체로 보고되고 있다(Kim et al., 2004; Kim et al., 2009).
바이러스성 출혈성 패혈증의 발병은 일교차가 큰 봄의 저수온기(10 내지 15℃)에 집중되는 경향이 있다. 변온 동물에 속하는 넙치는 생리적 적온의 범위를 가지며, 환경수온이 적은 범위보다 낮거나 높을 경우 신진 대사율의 감소, 성장 저하, 면역성 감퇴의 현상을 보이고 심한 경우에는 폐사하게 된다. 이렇듯이 수온은 수서환경에서 어류와 병원체의 성장 및 어류의 스트레스 원인 요소 중 하나로 중요하며 병원체에 의한 어루의 폐사율은 수온에 크게 의존된다고 알려져 있다. 바이러스성 출혈성 패혈증의 발병 기작에 대해서는 많이 알려져 있지 않으며 VHSV에 의해 유도되는 면역반응에 대하여 몇몇 보고가 있다(Avunje et al., 2011, 2012, 2013). 바이러스성 출혈성 패혈증은 10 내지 15℃ 범위에서 대량 폐사가 발생하지만 20℃ 이상의 수온에서는 전혀 폐사가 일어나지 않는 질병으로 수온이 질병 발생과 폐사율에 영향을 미치는 중요한 인자로 작용한다(Sano et al., 2009).
이와 같이 새롭게 확산되고 있는 VHSV의 감염을 피하기 위해 종묘 생산단계에서 바이러스 없는 종을 생산하는데 노력을 기울이고 있지만 바이러스를 완전히 차단하는 것이 현재로서는 불가능한 것으로 알려져 있다. 따라서 바이러스성 출혈성 패혈증의 발병으로 막대한 경제적 손실이 발생함에 따라 양식현장 어업인들로부터 질병에 강한 품종개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은, VHSV에 내성을 갖는 넙치를 개발하기 위해 노력하던 중, 8개 대립 유전자의 유전좌위에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 대립 유전자의 유전자형의 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍(base pair)으로 이루어진 수컷넙치와 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍으로 이루어진 암컷넙치를 교배하였을 때, L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍의 8개 대립 유전자의 유전좌위을 갖는 자손 넙치가 생산되며, 상기 자손넙치가 VHSV에 내성을 갖고, 빠른 성장 속도를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 8개 유전좌위의 유전자형에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 바이러스 내성 넙치 선발 육종 방법, 바이러스 내성 넙치 가계의 생산 방법, 및 상기 방법으로 생산된 바이러스 내성 넙치를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 바이러스 내성 넙치 선발 육종 방법을 제공한다:
1) 부모(parents)인 수컷넙치 및 암컷넙치 각각의 핵산 시료를 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 멀티플렉스(multiplex) PCR로 증폭하여 증폭된 산물을 유전자 서열분석 또는 전기영동을 통해 대립 유전자의 유전자형을 분석하여 이를 데이터베이스(data base)로 구축하는 단계로서, 여기서 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 16으로 구성되는 것을 특징으로 하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 부모인 수컷넙치와 암컷넙치를 교배하여 생산된 자손의 DNA 대립 유전자의 유전자형을 분석하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서의 부모의 대립 유전자형 데이터베이스와 단계 2)에서의 자손의 대립 유전자형을 기초로 친자확인을 수행하는 단계;
4) 상기 단계 2)에서 생산된 자손을 바이러스에 노출하여 생존율이 높은 자손을 선별하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)에서 선별된 자손의 대립 유전자형 확인을 통해 바이러스 내성 넙치 가계를 결정하는 단계.
또한, 본 발명은 부모인 수컷넙치 및 암컷넙치의 핵산 시료로부터 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 분석된 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍(base pair)으로 이루어진 수컷넙치와 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 암컷넙치를 교배하는 것을 특징으로 하는 바이러스 내성 넙치 가계의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 자손 넙치의 핵산시료로부터 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 분석된 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 바이러스 내성 넙치를 제공한다.
또한, 본 발명은 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 포함하고, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 내지 16의 염기서열로 구성된 바이러스 내성 넙치 선발용 키트(kit)를 제공한다.
아울러, 본 발명은 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머 쌍으로써,
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성된 바이러스 내성 넙치 선발용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명의 바이러스에 내성을 갖는 넙치 육종 방법으로 생산된 넙치는 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 분석된 8개 유전좌위의 대립 유전형의 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍(base pairs)을 갖고, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)에 내성이 있으며, 빠른 성장 속도를 나타냄으로써, 질병에 강한 넙치 품종을 개발하여 양식업에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV) 인위감염에 의한 넙치의 생존율을 나타내는 도이다.
도 2는 VHSV 인위감염에 대한 가계별 최종 생존율을 비교한 도이다.
도 3은 VHSV 인위감염에 대한 가계별 최종 생존율 곡선을 비교한 도이다.
도 4는 VHSV 바이러스 내성 넙치의 현장실험 및 생존율 곡선을 비교한 도이다.
도 2는 VHSV 인위감염에 대한 가계별 최종 생존율을 비교한 도이다.
도 3은 VHSV 인위감염에 대한 가계별 최종 생존율 곡선을 비교한 도이다.
도 4는 VHSV 바이러스 내성 넙치의 현장실험 및 생존율 곡선을 비교한 도이다.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
선발 육종이란, 한 개체에서 특이하거나 우수한 것을 골라서 육종시키는 것으로, 부모로부터 물려받은 표현형의 변이를 이용하는 육종 프로그램이다. 본 발명자들은 D1-0041의 8개 유전좌위의 유전자형을 갖는 암컷 넙치와 W1-0018의 8개 유전좌위의 유전자형을 갖는 수컷 넙치를 교배하여 생산된 자손 중 바이러스 내성을 갖는 넙치를 선별하여 이를 육종하고자 하였다.
또한, 유전력이란, 유전율 양적 형질이 나타내는 변이를 분산으로 표시한 분산을 유전분산과 환경분산으로 나누며, 표현형 분산에 대해 유전분산의 정도를 유전력이라고 한다.
또한, 마이크로새틀라이트(microsatellite)란, 2 내지 6개 정도의 염기서열이 반복되는 DNA군(repetitive DNA group)으로, 게놈(genome) 내에 골고루 분포하고 매우 높은 다형성을 나타내는 비암호화 DNA 서열(non-coding DNA sequence)로, 특정 유전좌위에서 반복 단위의 반복수에 따라 개체간의 다양성을 확인할 수 있다.
또한, 마이크로새틀라이트 마커란, 마이크로새틀라이트를 이용한 DNA 다형검출 마커를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 바이러스 내성 넙치 선발 육종 방법을 제공한다:
1) 부모(parents)인 수컷넙치 및 암컷넙치 각각의 핵산 시료를 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 멀티플렉스(multiplex) PCR로 증폭하여 증폭된 산물을 유전자 서열분석 또는 전기영동을 통해 대립 유전자의 유전자형을 분석하여 이를 데이터베이스(data base)로 구축하는 단계로서, 여기서 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 16으로 구성되는 것을 특징으로 하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 부모인 수컷넙치와 암컷넙치를 교배하여 생산된 자손의 DNA 대립 유전자의 유전자형을 분석하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서의 부모의 대립 유전자형 데이터베이스와 단계 2)에서의 자손의 대립 유전자형을 기초로 친자확인을 수행하는 단계;
4) 상기 단계 2)에서 생산된 자손을 바이러스에 노출하여 생존율이 높은 자손을 선별하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)에서 선별된 자손의 대립 유전자형 확인을 통해 바이러스 내성 넙치 가계를 결정하는 단계.
상기 단계 1)의 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머는 마이크로새틀라이트 DNA의 3' 및 5' 부위에 인접한 5 내지 100 bp 부위에 위치한 10 내지 50 bp의 연속된 각 염기를 포함할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 프라이머 쌍으로,
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성되는 것이 바람직하나, 상기 프라이머의 염기서열의 일부를 다른 염기로 치환, 삭제하거나 일부 염기서열의 위치와 방향이 바뀐 염기서열도 본 발명에 따른 프라이머의 범위에 속한다.
상기 단계 1)의 대립 유전자의 유전자형의 크기는 수컷넙치는 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍(base pairs)으로 이루어지고, 암컷넙치는 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍으로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 핵산 시료는 생물학적 시료로부터 분리할 수 있고, 상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 샘플, 생검 표본, 모근, 조직 배양과 같은 고형조직 샘플 또는 이로부터 유래된 세포 및 그 자손이 포함된다. 또한, 상기 샘플들은 시약처리, 가용화된 샘플 또는 배양세포, 세포 상등액 및 세포 용해물도 포함한다. 상기 서술한 생물학적 시료로부터 핵산의 분리는 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
상기 단계 1)의 대립 유전자의 유전자형 크기는 핵산 시료를 멀티플렉스 PCR 방법으로 증폭한 뒤 유전자서열분석기를 이용하여 분석하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 멀티플렉스 PCR을 위한 PCR 반응은 초기변성, 변성, 어닐링 및 신장 반응의 싸이클을 35 내지 45회 반복, 최종 신장 및 쿨링의 프로그램에 따라 이루어질 수 있고, 상기 PCR 방법에 의해 증폭된 DNA를 유전자서열분석기로 분석하여 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 대한 유전자형 크기를 결정하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 멀티플렉스 PCR 산물의 크기 결정은 통상의 방법, 즉 아가로스 겔 또는 아크릴아마이드 겔을 이용한 전기영동을 실시한 후, 전개된 DNA 단편을 형광염색 등을 통해 확인가능하고, 더욱 바람직하게는 염기서열분석장치에 대립유전자분석 모드를 이용하여 전기영동을 실시해 프라이머의 형광물질 및 PCR 산물의 크기별로 분류하는 방법을 통해 확인할 수 있다. 상기 단계에서 PCR 산물의 크기 분석은 당업계에 잘 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다.
상기 단계 2)의 자손은 동일한 환경에서 사육하는 것이 바림직하나 이에 한정하지 않는다. 일반적으로 급격한 수온의 변화와 용존산소의 변화는 어류에 스트레스로 작용하여 질병에 대한 저항성이 떨어지며 항상성 조절을 위하여 에너지를 많이 소모하게 되므로 어체가 약해지게 된다. 또한, 해수는 수온이 올라갈수록 해수 속에 녹아들어갈 수 있는 산소의 양이 적어지므로 고수온기에는 적은 양의 산소가 해수에 녹아들게 되고 생물이 소모하는 산소의 양이 증가하게 되며, 이는 양식 환경에서 발생하기 쉬운 위기 상황이 된다.
상기 단계 2)의 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)인 것이 바람직하나, 넙치가 감염될 수 있는 어떠한 바이러스라도 적용가능하다. 또한, 상기 바이러스의 노출은 101 내지 1010 particles/㎖ 농도의 바이러스에 노출시키는 것이 바람직하고, 101 particles/㎖ 농도 미만의 바이러스에 노출시키는 경우, 바이러스의 수가 적어 넙치를 감염시키기에 충분하지 않고, 1010 particles/㎖ 농도를 초과하는 바이러스에 노출시키는 경우 넙치의 수와 비교하여 바이러스가 과도하게 첨가되어 폐사되는 넙치의 수가 많아진다는 단점이 있다. 또한, 상기 바이러스에 노출되는 시간은 1 내지 5시간 동안 노출되는 것이 바람직하고, 1시간 미만으로 노출되는 경우 바이러스에 내성을 나타내는 바이러스 내성 넙치를 육종하기에 충분하지 않고, 5시간을 초과하여 노출되는 경우 바이러스 내성 넙치를 육종하는데 있어 필요이상의 시간이 소요된다는 단점이 있다.
바이러스가 어체의 몸속에 침투하여 보균상태를 유지하게 되면 일단 질병에 감염된 상태이고, 이 때, 스트레스 등의 요인으로 병에 대한 저항성이 약화되면 바이러스가 급격하게 증식하여 병리적 특이증상을 나타내게 된다. 발병을 가져오는 스트레스로 작용하는 요인은 수질악화, 영양저하, 수온 등 부적절한 환경요인, 세균 및 기생충에 의한 2차 감염 등 다양하다. 특히 사육환경의 악화와 바이러스의 발병과는 매우 밀접한 상관관계가 있는 것으로 보고되어 있는데, 이는 부적절한 사육환경이 기생충성 및 세균성 병원균의 증식을 가져와 결국 바이러스의 발병으로 이어지는 등 모든 질병의 원인이 될 수 있다. 결국 바이러스에 감염되었다고 모두 발병으로 이어지는 것은 아니며, 사육환경의 개선과 더불어 어체가 가지고 있는 방어능력에 따라 발병율이 낮아질 수 있음을 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 넙치로부터 VHSV를 분리한 뒤 이를 배양하여 성숙한 넙치 어미를 사용해 생산된 넙치 가계에 인위감염을 한 뒤, 상기 인위감염된 넙치의 지느러미로부터 DNA를 추출하여 이의 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기를 분석한 결과, 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍(base pairs)으로 이루어지고, 암컷넙치는 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 수컷 넙치를 교배하여 생산된 자손이 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 것을 확인하고, 상기 자손 넙치가 VHSV에 대한 가장 높은 내성을 나타냄을 확인하였다(표 1 참조).
또한, 상기 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 넙치 가계가 양식현장에서도 동일하게 VHSV에 대해 내성을 나타내는지 확인한 결과, VHSV 내성 넙치와 일반 대조군 넙치가 각각 79.5% 및 54.2%의 생존율을 나타낼뿐만 아니라(도 4 참조), 대조군 넙치와 비교하여 VHSV 내성 넙치가 41.1%의 빠른 성장 효과를 나타냄을 확인함으로써, 본 발명의 바이러스 내성 넙치 가계의 생산 방법이 특정 바이러스에 내성을 나타내는 바이러스 내성 넙치 선발 육종 방법에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 부모인 수컷넙치 및 암컷넙치의 핵산 시료로부터 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 분석된 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍(base pairs)으로 이루어지고, 암컷넙치는 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 암컷넙치를 교배하는 것을 특징으로 하는 바이러스 내성 넙치 가계의 생산 방법을 제공한다.
상기 핵산 시료는 생물학적 시료로부터 분리할 수 있고, 상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 샘플, 생검 표본, 모근, 조직 배양과 같은 고형조직 샘플 또는 이로부터 유래된 세포 및 그 자손이 포함된다. 또한, 상기 샘플들은 시약처리, 가용화된 샘플 또는 배양세포, 세포 상등액 및 세포 용해물도 포함한다. 상기 서술한 생물학적 시료로부터 핵산의 분리는 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
상기 대립 유전자의 유전자형 크기는 핵산 시료를 멀티플렉스 PCR 방법으로 증폭한 뒤 유전자서열분석기를 이용하여 분석하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 멀티플렉스 PCR을 위한 PCR 반응은 초기변성, 변성, 어닐링 및 신장 반응의 싸이클을 35 내지 45회 반복, 최종 신장 및 쿨링의 프로그램에 따라 이루어질 수 있고, 상기 PCR 방법에 의해 증폭된 DNA를 유전자서열분석기로 분석하여 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 대한 유전자형 크기를 결정하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 멀티플렉스 PCR 산물의 크기 결정은 통상의 방법, 즉 아가로스 겔 또는 아크릴아마이드 겔을 이용한 전기영동을 실시한 후, 전개된 DNA 단편을 형광염색 등을 통해 확인가능하고, 더욱 바람직하게는 염기서열분석장치에 대립유전자분석 모드를 이용하여 전기영동을 실시해 프라이머의 형광물질 및 PCR 산물의 크기별로 분류하는 방법을 통해 확인할 수 있다. 상기 단계에서 PCR 산물의 크기 분석은 당업계에 잘 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다.
상기 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머는 마이크로새틀라이트 DNA의 3' 및 5' 부위에 인접한 5 내지 100 bp 부위에 위치한 10 내지 50 bp의 연속된 각 염기를 포함할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 프라이머 쌍으로,
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성되는 것이 바람직하나, 상기 프라이머의 염기서열의 일부를 다른 염기로 치환, 삭제하거나 일부 염기서열의 위치와 방향이 바뀐 염기서열도 본 발명에 따른 프라이머의 범위에 속한다.
상기 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)인 것이 바람직하나, 넙치가 감염될 수 있는 어떠한 바이러스라도 적용가능하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍(base pairs)으로 이루어지고, 암컷넙치는 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 것을 확인하고, 상기 자손 넙치가 VHSV에 대한 가장 높은 내성을 나타내고(표 1 참조), 양식현장에서도 VHSV에 대해 높은 생존율을 나타내었으며(도 4 참조), 대조군 넙치와 비교하여 빠른 성장을 나타냄으로써, 상기 방법이 바이러스 내성 넙치 가계의 생산에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 자손 넙치의 핵산시료로부터 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 분석된 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 바이러스 내성 넙치를 제공한다.
상기 자손은 동일한 환경에서 사육하는 것이 바림직하나 이에 한정하지 않는다. 일반적으로 급격한 수온의 변화와 용존산소의 변화는 어류에 스트레스로 작용하여 질병에 대한 저항성이 떨어지며 항상성 조절을 위하여 에너지를 많이 소모하게 되므로 어체가 약해지게 된다. 또한, 해수는 수온이 올라갈수록 해수 속에 녹아들어갈 수 있는 산소의 양이 적어지므로 고수온기에는 적은 양의 산소가 해수에 녹아들게 되고 생물이 소모하는 산소의 양이 증가하게 되며, 이는 양식 환경에서 발생하기 쉬운 위기 상황이 된다.
상기 핵산 시료는 생물학적 시료로부터 분리할 수 있고, 상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 샘플, 생검 표본, 모근, 조직 배양과 같은 고형조직 샘플 또는 이로부터 유래된 세포 및 그 자손이 포함된다. 또한, 상기 샘플들은 시약처리, 가용화된 샘플 또는 배양세포, 세포 상등액 및 세포 용해물도 포함한다. 상기 서술한 생물학적 시료로부터 핵산의 분리는 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
상기 대립 유전자의 유전자형 크기는 핵산 시료를 멀티플렉스 PCR 방법으로 증폭한 뒤 유전자서열분석기를 이용하여 분석하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 멀티플렉스 PCR을 위한 PCR 반응은 초기변성, 변성, 어닐링 및 신장 반응의 싸이클을 35 내지 45회 반복, 최종 신장 및 쿨링의 프로그램에 따라 이루어질 수 있고, 상기 PCR 방법에 의해 증폭된 DNA를 유전자서열분석기로 분석하여 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 대한 유전자형 크기를 결정하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 멀티플렉스 PCR 산물의 크기 결정은 통상의 방법, 즉 아가로스 겔 또는 아크릴아마이드 겔을 이용한 전기영동을 실시한 후, 전개된 DNA 단편을 형광염색 등을 통해 확인가능하고, 더욱 바람직하게는 염기서열분석장치에 대립유전자분석 모드를 이용하여 전기영동을 실시해 프라이머의 형광물질 및 PCR 산물의 크기별로 분류하는 방법을 통해 확인할 수 있다. 상기 단계에서 PCR 산물의 크기 분석은 당업계에 잘 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다.
상기 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머는 마이크로새틀라이트 DNA의 3' 및 5' 부위에 인접한 5 내지 100 bp 부위에 위치한 10 내지 50 bp의 연속된 각 염기를 포함할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 프라이머 쌍으로,
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성되는 것이 바람직하나, 상기 프라이머의 염기서열의 일부를 다른 염기로 치환, 삭제하거나 일부 염기서열의 위치와 방향이 바뀐 염기서열도 본 발명에 따른 프라이머의 범위에 속한다.
상기 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)인 것이 바람직하나, 넙치가 감염될 수 있는 어떠한 바이러스라도 적용가능하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 자손 넙치가 VHSV에 대한 가장 높은 내성을 나타내고(표 1 참조), 양식현장에서도 VHSV에 대해 높은 생존율을 나타내었으며(도 4 참조), 대조군 넙치와 비교하여 빠른 성장을 나타냄으로써, 상기 넙치가 바이러스 내성 넙치로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 포함하고, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 내지 16의 염기서열로 구성된 바이러스 내성 넙치 선발용 키트(kit)를 제공한다.
아울러, 본 발명은 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머 쌍으로써,
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성된 바이러스 내성 넙치 선발용 프라이머 쌍을 제공한다.
상기 대립 유전자의 유전좌위 크기는 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍으로 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머는 마이크로새틀라이트 DNA의 3' 및 5' 부위에 인접한 5 내지 100 bp 부위에 위치한 10 내지 50 bp의 연속된 각 염기를 포함할 수 있고, 상기 서열번호 1 내지 16의 염기서열로 구성된 프라이머인 것이 바람직하나, 상기 프라이머의 염기서열의 일부를 다른 염기로 치환, 삭제하거나 일부 염기서열의 위치와 방향이 바뀐 염기서열도 본 발명에 따른 프라이머의 범위에 속한다.
상기 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)인 것이 바람직하나, 넙치가 감염될 수 있는 어떠한 바이러스라도 적용가능하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 자손 넙치가 VHSV에 대한 가장 높은 내성을 나타내고(표 1 참조), 양식현장에서도 VHSV에 대해 높은 생존율을 나타내었으며(도 4 참조), 대조군 넙치와 비교하여 빠른 성장을 나타냄으로써, 상기 대립 유전자의 유전좌위에 대한 마이크로새틀라이트 마커에 특이적인 프라이머가 바이러스 내성 넙치 선발에 사용될 수 있고, 상기 마커가 바이러스 내성 넙치 선발용 키트에 사용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(
viral
hemorrhagic
septicemia
virus,
VHSV
)의 분리
<1-1> 넙치로부터 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 분리
공지된 방법(Kim et al., 2004)을 이용하여 넙치로부터 VHSV 바이러스를 분리하였다.
구체적으로, 2001년 12월부터 2004년 3월까지 경북 동해안 지역 및 경남 남해안 일원에서 채색 흑화, 복부 팽만 및 탈장 등의 특징적인 질병 증상을 보이며 폐사하는 넙치로부터 VHSV 바이러스를 분리하였다.
(명세서의 발명의 상세한 설명은 통상의 기술자가 용이하게 따라할 수 있을 정도로 상세하게 기재되어야 합니다. 이에, 넙치로부터 VHSV 바이러스를 분리한 방법을 알려주시기 바랍니다.)
그 결과, 양식 넙치에 대한 병원성을 나타내고, 유전자형(genotype)이 미국 분리 유전자형 I(American isolate genotype 1)로 확인된 균주를 분리하였다.
<1-2> 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 배양
상기 실시예 <1-1>에서 분리된 VHSH 바이러스는 하기와 같은 방법으로 배양하였다.
구체적으로, VHSH의 배양은 병어의 조직 마쇄 여과액을 EPC(epithelial papilloma of carp) 세포주에 접종한 뒤 15℃에서 3일간 배양하여 세포 변성효과(cytopathic effect, CPE)를 확인하였다. 세포 배양액은 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1% 안티바이오틱-안티마이코틱(antibiotic-antimycotic, Gibco, 미국)을 첨가한 EMEM(Eagle's minimum essential medium)을 사용하였고, 바이러스의 계대는 낮은 감염다중도(multiplicity of infection, MOI)(< 0.01)로 수행하였고 모든 실험에는 3회 이하로 계대한 바이러스액을 사용하였다.
<
실시예
2> 넙치 가계별 내병성 변이 분석을 위한 내성 가계 선정
시험어로 사용한 넙치는 국립수산과학원 육종연구센터에서 부화시켜 생산한 넙치 종묘를 이용하였다.
구체적으로, 넙치 가계별 내병성 변이를 분석하기 위하여 바이러스성 질병 내성 실험에 필요한 넙치종묘는 성숙한 넙치 어미 478마리(암수 각 239마리)를 이용한 인공수정으로 총 177가계를 생산한 뒤, 자치어는 동일한 환경에서 사육하기 위해 각 가계당 3 ㎖ 수정란을 FRP 5톤 사육수조에 혼합하여 사육하였다. 먹이로는 부화 직후 소량의 클로렐라를 사육수에 혼합하였고, 부화 3일령부터는 로티퍼를 공급하였으며, 성장함에 따라 알테미아와 배합사료를 공급하였다. 사육수의 관리는 배합사료 공급 이전에는 지수식으로, 그 이후부터는 일부 환수와 유스식으로 관리하였다. 사육기간 동안의 수온은 17.6 내지 20.4℃, 염분은 30.7 내지 34.8 psu, DO는 6.0 내지 7.9 ㎎/ℓ 범위였다.
<
실험예
1>
VHSV
인위감염에 의한 넙치의 생존율 확인
넙치 가계별 내병성 변이를 분석하기 위하여 바이러스성 질병 내성 실험에 사용한 총 3,491 마리의 넙치를 대상으로 VHSV 인위감염에 의한 생존율을 확인하였다.
구체적으로, 넙치는 부화 후 180일령까지 사육한 넙치 종묘를 이용하였고, 인위 감염시 체장은 12.2 내지 25.0 ㎝ 범위였다. 인위감염 시험은 총 3,491 마리의 넙치 종묘를 동일 수조에서 105 particles/㎖ 농도의 시험균주로 2.5 시간동안 침지하여 실시하였다. 수온은 12 ± 0.5℃로 유지하였으며, 폐사율은 1일에 4회씩 기록하였다. 폐사어는 폐사 원인을 확인하기 위해 폐사 즉시 해부하고, 간, 신장과 비장 조직을 절취하여 공지된 방법으로 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하여 바이러스의 감염여부를 확인하였다.
그 결과, 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이 인위감염 5일 후부터 폐사가 시작되어 최종 폐사율을 97.1%, 평균 폐사 소요시간은 8.4일, 대량폐사 발생일은 7 내지 1일로 확인되었다(표 1 및 도 1).
| 폐사율(%) | 97.1(3,389/3,491) |
| 평균 폐사 소요시간(일) | 8.4 |
| 대량폐사 발생일(일)* | 7~10 |
*집단의 10% 이상 폐사
<
실험예
2>
VHSV
인위감염에 의한 넙치 가계별 내병성 변이 분석
넙치 가계별 내병성 변이를 분석하기 위하여 VHSV 인위감염 후, 수거한 폐사어와 최종 생존구 넙치의 지느러미에서 gDNA를 추출하고 친자 확인을 수행하여 가계분석을 실시하였다.
구체적으로, 친자확인의 시료는 계측형질 측정시 각 개체의 넙치 가슴지느러미 조직을 절취한 다음 공지된 폐놀 추출(phenol extraction) 방법으로 DNA를 추출하여 제조사의 사용설명서에 따라 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 반응에 사용하였다. 상기 멀티플렉스 PCR에 사용한 프라이머는 하기 표 2에 나타난 바와 같고, 정방향 프라이머에 6-FAM, VIC 또는 NED의 형광물질이 표지되도록 합성하여 사용하였으며, 하기 표 2의 프라이머로 결정되는 유전자형은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다. 유전자서열분석기(ABI 3100)를 이용하여 8개 대립 유전자의 유전좌위에 대한 각 개체의 유전자형을 결정하였으며, 친자확인은 멘델의 유전법칙에 위배되는 친어를 배제시키는 방법(exclusion method)으로 친어 및 자손의 유전자형을 분석하여 추정된 부모 조합을 교배 지침과 비교하는 방법으로 실시하였다.
그 결과, 하기 표 4에 멀티플렉스 PCR로 확인된 부모인 수컷넙치 및 암컷넙치의 대립 유전자의 유전좌위를 나타내었으며, 표 5에 상기 수컷 넙치 및 암컷 넙치를 교배하여 생산된 자손 넙치의 유전좌위를 나타내었다(표 4 및 표 5).
| 마커 | 서열번호 | 서열길이 (bp) |
서열(5'→3') | 형광표지 | 어닐링 온도 (℃) |
| L3 | 서열번호 1 | 22 | F: CACGACCTCAATCACGAATCTG | 6-FAM | 60 |
| 서열번호 2 | 22 | R: GCAGCTTTAATGCACCAGTGTC | - | ||
| L4 | 서열번호 3 | 22 | F: GATGGCAAACATACACCCACAC | 6-FAM | 60 |
| 서열번호 4 | 21 | R: GCCCCAGTACACAGGTGTTTG | - | ||
| L5 | 서열번호 5 | 21 | F: CTTCAGTCTGCTACTGAGATC | VIC | 60 |
| 서열번호 6 | 20 | R: CAAGAGTCCAGAGTGGGAAC | - | ||
| L6 | 서열번호 7 | 22 | F: ACAAACCGCTGATGTGGACATC | VIC | 60 |
| 서열번호 8 | 22 | R: AACAGGTCGACCTGAGCTGTTC | - | ||
| L8 | 서열번호 9 | 22 | F: ACATTATCCTGACAGTGCAGAG | VIC | 60 |
| 서열번호 10 | 22 | R: GGCAGAGAGAACACATTCAATC | - | ||
| L9 | 서열번호 11 | 21 | F: GCCGAGCCCGAATTAGAGAAC | NED | 60 |
| 서열번호 12 | 20 | R: GCCTTCTGGCTGCTCGACTG | - | ||
| L10 | 서열번호 13 | 22 | F: ATTCCTCCTCCAGCAGGTAAAG | NED | 60 |
| 서열번호 14 | 22 | R: ACCTAACGTCCAGATCCAGATG | - | ||
| L11 | 서열번호 15 | 22 | F: TAAGTGTTTCCTGACGGTGCTC | NED | 60 |
| 서열번호 16 | 22 | R: ACTGCCTCCATGTTTGCAAAAG | - |
| 마커 | 유전좌위 크기 | 대립 유전자 종류 |
| L3 | 217~249 bp | 217, 221, 225, 227, 231, 235,237, 249 |
| L4 | 288~326 bp | 288, 290, 292, 294, 296, 298, 302, 304, 306, 308, 310, 314, 316, 320, 324, 326 |
| L5 | 87~101 bp | 87, 89, 91, 93, 95, 97, 101 |
| L6 | 114~140 bp | 114, 118, 120, 124, 126, 130, 136, 140 |
| L8 | 234~294 bp | 234, 240, 242, 244, 246, 252, 254, 256, 258, 260, 280, 294 |
| L9 | 80~101 bp | 80, 83, 86, 92, 98, 101 |
| L10 | 152~188 bp | 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 170, 176, 182, 184, 188 |
| L11 | 206~254 bp | 206, 212, 216, 218, 220, 222, 224, 228, 234, 238, 242, 254 |
또한, 교배 그룹별, 교배 암컷별, 교배 수컷별 내성지수(resistant index), 생존율(survival rate), 생존일수(Days of survival)를 조사하였으며, 내성지수, 생존율 및 생존일수는 하기의 수학식 1 내지 3을 이용하였다. 조사형질을 대상으로 교배 그룹, 교배 암컷, 교배 수컷의 효과를 분석하기 위해 SAS 패키지(SAS Package, Ver.8.2)를 이용하여 공지된 방법으로 ANOVA-테스트(test)를 실시하였고, 평균치간의 유의성 검정은 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)을 실시하여 귀무가설을 유의수준 5%로 각각 검정하였다.
여기서, i는 인위감염 기간, Ni는 폐사된 넙치의 수, N은 전체 넙치의 수를 나타낸다.
여기서, S는 생존한 넙치의 수, N은 전체 넙치의 수를 나타낸다.
여기서, i는 넙치 각각의 인위감염 기간, Si는 인위감염 후 생존일 수, N은 전체 넙치의 수를 나타낸다.
그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이 총 3,491 마리의 시험어 중 3,438 마리(98.5%)의 친자확인이 성공하여 이들의 부모가 확인되었고, 인위감염에 사용된 넙치는 총 158 가계로 구성되어 있음을 확인하였다(표 6).
| 분석마리수 | 3,491 |
| 친자확인(%) | 3,438(98.5%) |
| 확인가계수 | 158 |
또한, 표 7에 나타난 바와 같이 가계별 생존율은 0 내지 23.3%로 다양하게 나타남에 따라 VHSV에 대한 저항성이 넙치 가계에 따라 다르다는 것을 확인하였다(표 7). 생존율이 가장 높은 넙치 가계인 07-009의 경우 다른 넙치 가계보다 월등하게 VHSV에 대하여 저항성을 가져 23.3%에 달하는 최종 생존율을 나타내었으며, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이 생존곡선에서도 다른 넙치 가계에 비해 높은 바이러스 저항성을 나타내는 것을 알 수 있다. 반면, 07-147 등과 같은 생존율이 0을 나타내는 넙치 가계의 경우 인위감염 초기부터 폐사가 심각하게 진행되어 다른 넙치 가계보다 짧은 기간에 가계 전체가 폐사하였다(도 2 및 도 3). 이는 넙치 개체의 유전형질은 부모로부터 물려받기 때문에 VHSV 질병에 대한 저항성도 부모의 질병 저항성에 따라 결정된다는 것을 알 수 있다. 생존율이 가장 높은 넙치 가계인 07-009를 질병에 강한 가계로 선발하여 넙치를 생산할 경우 바이러스에 대한 질병 저항성이 일반 넙치보다 높기 때문에 양식현장에서 생존율을 높일 수 있는 선발육종이 가능할 것을 판단된다.
| 가계번호 | 모(♀) | 부(♂) | 전체마리수 | 생존마리수 | 생존율(%) | 내성지수 |
| 07-009 | D1-0411 | W1-0018 | 43 | 10 | 23.3 | 17.5 |
| 07-033 | W1-0020 | W1-0154 | 100 | 1 | 1.0 | 8.3 |
| 07-040 | R1-0043 | W1-0421 | 57 | 2 | 3.5 | 10.1 |
| 07-102 | D1-0164 | W2-3284 | 45 | 2 | 4.4 | 9.5 |
| 07-104 | W2-4672 | W2-3735 | 48 | 4 | 8.3 | 11.1 |
| 07-142 | W3-3901 | W1-0738 | 66 | 2 | 3.0 | 8.9 |
| 07-147 | W1-0323 | D1-0636 | 41 | 0 | 0.0 | 7.8 |
| 07-149 | W2-4202 | D1-0693 | 42 | 0 | 0.0 | 9.1 |
| 07-177 | D1-0011 | W2-3871 | 44 | 0 | 0.0 | 8.4 |
| 07-181 | D1-0080 | W1-1075 | 54 | 1 | 1.9 | 9.2 |
| 07-186 | D1-0134 | D1-0649 | 46 | 0 | 0.0 | 7.7 |
| 07-187 | D1-0166 | W2-4046 | 54 | 0 | 0.0 | 7.9 |
| 07-246 | D1-0317 | W1-0401 | 41 | 0 | 0.0 | 7.8 |
| 07-255 | W2-3367 | W2-3777 | 40 | 0 | 0.0 | 7.7 |
| 07-256 | W2-4799 | D1-0516 | 40 | 0 | 0.0 | 7.7 |
| 07-260 | D1-0458 | D1-0640 | 51 | 0 | 0.0 | 8.4 |
| 07-293 | W1-8021 | W2-3900 | 87 | 12 | 13.8 | 13.9 |
| 07-304 | W1-0810 | D1-0630 | 55 | 1 | 1.8 | 9.7 |
| 07-329 | D1-0001 | W2-3424 | 42 | 0 | 0.0 | 8.5 |
| 07-367 | W2-3225 | D1-0216 | 75 | 2 | 2.7 | 8.7 |
| 07-368 | W1-0868 | D1-0329 | 47 | 0 | 0.0 | 7.6 |
| 07-373 | W1-0629 | W2-3786 | 53 | 4 | 7.5 | 11.6 |
| 07-374 | W1-0253 | W1-0491 | 58 | 0 | 0.0 | 8.3 |
| 07-385 | D1-0132 | D1-0235 | 67 | 0 | 0.0 | 8.3 |
<
실험예
3> 가계별 내병성 변이에 의한
VHSV
에 대한
유전력
분석
총 158 가계로 구성된 넙치 집단의 가계별 내병성 변이를 분석하고 이를 토대로 VHSV에 대한 넙치의 유전력을 분석하였다. 유전력이라함은 양적 형질을 나타내는 변이를 분산으로 표시한 분산을 유전분산과 환경분산으로 나누며, 표현형 분산에 대한 유전분산의 정도를 의미한다. 즉, 연속적으로 형질이 다른 개체가 태어나는 양적 형질이 그 중 어느 정도가 다음 대에 유전되는지를 나타내는 양을 말하며, 표현형 분산에 대한 유전분산의 비로 표시된다. 양적 형질에 대하여 변이가 있는 집단 중에서 선택을 하는 경우, 각 개체의 표현형이 유전적 가치 그 자체일 때에는 선택된 개체의 성질은 그대로 다음대로 유전하게 된다. 그러나 일반적으로 양적 형질은 환경의 영향을 받기 쉽고, 표현형에는 유전적 가치뿐만 아니라 그 개체에 특유한 환경에 의한 변이도 섞여 있다. 이러한 환경에 의한 변이는 선택의 다음 대에는 유전되지 않고 선택 오차로 작용하게 된다.
유전력은 다음 대에 실현되는 선택효과의 예측에 사용된다. 선택대상이 되는 원래 집단의 평균값과 선택된 무리의 평균값과의 차를 선택 차라고 하는데, 다음 대에 기대되는 개량 정도는 선택 차에 유전력을 곱한 것이다. 어떤 형질이 나타내는 변이에는 유전변이와 환경 변이가 포함된다. 이 중 유전변이가 차지하는 비율은 변이를 분산으로 나타내는 하기 수학식 4로 구할 수 있다.
여기서, h2는 유전력, VG는 유전변이에 의한 분산, VE는 환경변이에 의한 분산이다. 육종에 있어서 유전율을 형질의 선택효과를 추정하는데 유리하다.
본 발명에서 사용한 넙치 3,491 마리는 수정란 생산에서부터 동일한 수조에서 사육을 하였고, VHSV 인위감염 실험 후 친자확인으로 가계분석을 실시함에 따라 환경적 변이가 0에 가깝다고 할 수 있다. 이에 따라 158 가계로 구성된 넙치 집단을 대상으로 상가적 유전변이 및 유전력을 분석한 결과, 표 8에 나타난 바와 같이 각각 0.25 및 0.21로 나타났으며, 이는 환경적 영향을 최소화함에 따라 넙치 집단의 VHSV 바이러스에 대한 유전적 요인이 비교적 정확하게 분석되었음을 알 수 있다(표 8).
| 상기적 유전변이 | 유전력 | |
| 바이러스성 출혈성 패혈증 | 0.25 | 0.21 |
<
실험예
4>
VHSV
내성 넙치의 현장 실험을 통한 내성 확인
VHSV 인위감염 후 넙치 가계별 내병성 변이를 분석한 결과 다른 넙치 가계보다 VHSV에 대한 내성을 나타내는 가계를 상기 <실험예 2>에서 확인하였다.
이 중 07-009 넙치 가계를 선정하여 넙치 양식현장에서 VHSV에 대한 내성을 나타내는지 확인하기 위하여 인공수정으로 VHSV 내성 넙치 가계인 07-009의 종묘 생산을 실시하였다. VHSV 내성 넙치 12,000 마리와 일반 넙치 8,000 마리를 대상으로 넙치 양식현장에서 넙치 사육을 한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 현장실험 105일째 최종 생존율은 VHSV 내성 넙치와 일반 대조군 넙치가 각각 79.5% 및 54.2%로 나타났다(도 4). 특히 양식 현장에서 VHSV 질병이 발생한 시점에서 일반 대조군 넙치는 심각한 폐사율을 나타내는 반면, VHSV 내성 넙치는 대량 폐사없이 꾸준한 생존과 성장을 기록하였다. 최종 성장의 경우 VHSV 내성 넙치와 일반 대조군 넙치가 각각 150.5 g 및 106.4 g으로 조사되어 VHSV 내성 넙치가 41.1%의 빠른 성장 효과를 나타냄에 따라 질병 내성이 성장에도 직접적인 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
<110> Republic of Korea
<120> Breeding method for Olive Flounder resistant against virus
<130> 2014P-11-20
<160> 16
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L3 forward primer
<400> 1
cacgacctca atcacgaatc tg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L3 reverse primer
<400> 2
gcagctttaa tgcaccagtg tc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L4 forward primer
<400> 3
gatggcaaac atacacccac ac 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L4 reverse primer
<400> 4
gccccagtac acaggtgttt g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L5 forward primer
<400> 5
cttcagtctg ctactgagat c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L5 reverse primer
<400> 6
caagagtcca gagtgggaac 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L6 forward primer
<400> 7
acaaaccgct gatgtggaca tc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L6 reverse primer
<400> 8
aacaggtcga cctgagctgt tc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L8 forward primer
<400> 9
acattatcct gacagtgcag ag 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L8 reverse primer
<400> 10
ggcagagaga acacattcaa tc 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L9 forward primer
<400> 11
gccgagcccg aattagagaa c 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L9 reverse primer
<400> 12
gccttctggc tgctcgactg 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L10 forward primer
<400> 13
attcctcctc cagcaggtaa ag 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L10 reverse primer
<400> 14
acctaacgtc cagatccaga tg 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L11 forward primer
<400> 15
taagtgtttc ctgacggtgc tc 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L11 reverse primer
<400> 16
actgcctcca tgtttgcaaa ag 22
Claims (17)
1) 부모(parents)인 수컷넙치 및 암컷넙치 각각의 핵산 시료를 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 이용하여 멀티플렉스(multiplex) PCR로 증폭하여 증폭된 산물을 유전자 서열분석 또는 전기영동을 통해 대립 유전자의 유전자형을 분석하여 이를 데이터베이스(data base)로 구축하는 단계로서, 여기서 상기 프라이머는 하기의 서열번호 1 내지 16으로 구성되는 것을 특징으로 하는 단계:
L3에 대한 프라이머로서 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
L4에 대한 프라이머로서 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
L5에 대한 프라이머로서 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
L6에 대한 프라이머로서 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
L8에 대한 프라이머로서 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
L9에 대한 프라이머로서 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
L10에 대한 프라이머로서 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
L11에 대한 프라이머로서 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머;
2) 상기 단계 1)에서 부모인 수컷넙치와 암컷넙치를 교배하여 생산된 자손의 DNA 대립 유전자의 유전자형을 분석하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서의 부모의 대립 유전자형 데이터베이스와 단계 2)에서의 자손의 대립 유전자형을 기초로 친자확인을 수행하는 단계;
4) 상기 단계 2)에서 생산된 자손을 바이러스에 노출하여 생존율이 높은 자손을 선별하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)에서 선별된 자손의 대립 유전자형 확인을 통해 바이러스 내성 넙치 가계를 결정하는 단계를 포함하는 바이러스 내성 넙치 선발 육종 방법.
L3에 대한 프라이머로서 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
L4에 대한 프라이머로서 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
L5에 대한 프라이머로서 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
L6에 대한 프라이머로서 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
L8에 대한 프라이머로서 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
L9에 대한 프라이머로서 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
L10에 대한 프라이머로서 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
L11에 대한 프라이머로서 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머;
2) 상기 단계 1)에서 부모인 수컷넙치와 암컷넙치를 교배하여 생산된 자손의 DNA 대립 유전자의 유전자형을 분석하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서의 부모의 대립 유전자형 데이터베이스와 단계 2)에서의 자손의 대립 유전자형을 기초로 친자확인을 수행하는 단계;
4) 상기 단계 2)에서 생산된 자손을 바이러스에 노출하여 생존율이 높은 자손을 선별하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)에서 선별된 자손의 대립 유전자형 확인을 통해 바이러스 내성 넙치 가계를 결정하는 단계를 포함하는 바이러스 내성 넙치 선발 육종 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 대립 유전자의 유전자형의 크기는 수컷넙치는 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍(base pairs)으로 이루어지고, 암컷넙치는 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍으로 이루어진 것을 특징으로 하는 바이러스 내성 넙치 선발 육종 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 자손은 동일한 환경에서 사육하는 것을 특징으로 하는 바이러스 내성 넙치 선발 육종 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 4)의 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 내성 넙치 선발 육종 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 4)의 바이러스 노출은 101 내지 1010 particle/㎖ 농도의 바이러스에 노출되는 것을 특징으로 하는 바이러스 내성 넙치 선발 육종 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 4)의 바이러스 노출은 1 내지 5시간 동안 노출되는 것을 특징으로 하는 바이러스 내성 넙치 선발 육종 방법.
부모인 수컷넙치 및 암컷넙치의 핵산 시료로부터 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 하기 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 분석된 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍(base pairs)으로 이루어지고, 암컷넙치는 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 암컷넙치를 교배하는 것을 특징으로 하는 바이러스 내성 넙치 가계의 생산 방법:
L3에 대한 프라이머로서 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
L4에 대한 프라이머로서 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
L5에 대한 프라이머로서 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
L6에 대한 프라이머로서 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
L8에 대한 프라이머로서 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
L9에 대한 프라이머로서 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
L10에 대한 프라이머로서 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
L11에 대한 프라이머로서 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머.
L3에 대한 프라이머로서 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
L4에 대한 프라이머로서 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
L5에 대한 프라이머로서 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
L6에 대한 프라이머로서 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
L8에 대한 프라이머로서 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
L9에 대한 프라이머로서 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
L10에 대한 프라이머로서 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
L11에 대한 프라이머로서 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머.
삭제
제 7항에 있어서, 상기 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 내성 넙치 가계의 생산 방법.
자손 넙치의 핵산시료로부터 L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 하기 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 분석된 8개 대립 유전자의 유전좌위 크기가 L3는 217~249bp, L4는 288~326bp, L5는 87~101bp, L6는 114~140bp, L8은 234~294bp, L9는 80~101bp, L10은 152~188bp 및 L11은 206~254bp인 염기 쌍을 갖는 바이러스 내성 넙치:
L3에 대한 프라이머로서 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
L4에 대한 프라이머로서 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
L5에 대한 프라이머로서 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
L6에 대한 프라이머로서 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
L8에 대한 프라이머로서 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
L9에 대한 프라이머로서 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
L10에 대한 프라이머로서 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
L11에 대한 프라이머로서 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머.
L3에 대한 프라이머로서 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
L4에 대한 프라이머로서 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
L5에 대한 프라이머로서 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
L6에 대한 프라이머로서 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
L8에 대한 프라이머로서 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
L9에 대한 프라이머로서 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
L10에 대한 프라이머로서 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
L11에 대한 프라이머로서 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머.
삭제
제 10항에 있어서, 상기 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 내성 넙치.
L3, L4, L5, L6, L8, L9, L10 및 L11로 구성된 8개의 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커에 특이적인 프라이머를 포함하고, 상기 프라이머 쌍은 하기의 서열번호 1 내지 16의 염기서열로 구성된 바이러스 내성 넙치 선발용 키트(kit):
L3에 대한 프라이머로서 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
L4에 대한 프라이머로서 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
L5에 대한 프라이머로서 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
L6에 대한 프라이머로서 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
L8에 대한 프라이머로서 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
L9에 대한 프라이머로서 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
L10에 대한 프라이머로서 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
L11에 대한 프라이머로서 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머.
L3에 대한 프라이머로서 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머;
L4에 대한 프라이머로서 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머;
L5에 대한 프라이머로서 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머;
L6에 대한 프라이머로서 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머;
L8에 대한 프라이머로서 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머;
L9에 대한 프라이머로서 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머;
L10에 대한 프라이머로서 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머; 및
L11에 대한 프라이머로서 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머.
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제 13항에 있어서, 상기 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 내성 넙치 선발용 키트.
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100204290A1 (en) | 2001-12-07 | 2010-08-12 | Diagnotec, Laboratoria Gam Ltda. | Procedure for operating a particle filter arranged in an exhaust fume area of a brennkraftmaschine and device to execute the procedure |
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| Title |
|---|
| Mar Biotechnol, Vol.13, pp.1086-1091 (2011)* |
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