CN115969828A

CN115969828A - 替拉曲可在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的应用

Info

Publication number: CN115969828A
Application number: CN202211180043.3A
Authority: CN
Inventors: 任浩; 赵平; 王嘉琪; 唐海琳; 夏炳辉; 徐铮昊; 罗正汉; 戚中田
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2022-09-27
Filing date: 2022-09-27
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2042-09-27
Also published as: CN115969828B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是替拉曲可在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的应用。本发明通过体内外生物学实验，发现替拉曲可具有抗黄热病毒活性，具体表现为抑制黄热病毒在细胞内的复制；减轻小鼠感染黄热病毒的症状，提高其存活率。本发明为替拉曲可提供了新的医药用途，为黄热病毒感染提供了新的预防和治疗手段。

Description

替拉曲可在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是替拉曲可在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的应用。

背景技术

黄热病毒(Yellow fever virus，YFV)属于黄病毒科黄病毒属成员，为包膜、单股正链RNA病毒，主要经蚊虫叮咬传播引起黄热病(Yellow fever，YF)。病毒可侵犯肝、肾、脾、心、骨髓和淋巴结等组织器官，临床表现为突发高热、头痛、黄疸、肌肉疼痛、疲劳、食欲不振、恶心呕吐等。该病分布范围广，传播迅速，病死率较高，危害全球民众健康，被列为国际检疫的传染病之一。针对黄热病尚无特异性的治疗方法，主要采取对症治疗以及支持治疗，接种减毒活疫苗是目前最有效的防控措施。

替拉曲可(Tiratricol，又称替拉曲考)是甲状腺激素类似物，临床上来用来抑制垂体促甲状腺激素分泌，具有降低垂体外拟甲状腺素药效。目前未见替拉曲可用于抗黄热病毒感染治疗报道。

发明内容

本发明的目的在于提供替拉曲可的新用途。

为实现上述目的，本发明的第一方面，提供替拉曲可在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的应用；所述的替拉曲可的化学结构式如式I所示：

进一步的，所述的预防和/或治疗黄热病毒感染的药物是以替拉曲可作为唯一活性成分，或包含替拉曲可的药物组合物。

进一步的，所述的预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中，替拉曲可含量为2.5μM-10μM(1.55μg/ml-6.22μg/ml)。作为优选方案，在10μM时替拉曲可对YFV的抑制率接近100％。

进一步的，所述的预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中还包括药剂学能接受的辅料或载体。

进一步的，所述的预防和/或治疗黄热病毒感染的药物剂型为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂。

更进一步的，所述的预防和/或治疗黄热病毒感染的药物的给药途径剂包括注射给药剂型、呼吸道给药剂型、滴鼻剂、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型或腔道给药剂型。

本发明的第二方面，提供一种预防和/或治疗黄热病毒感染的药物制剂，其包含有效量的替拉曲可，以及药学上可接受的载体或辅料。

本发明优点在于：

本发明通过体内外生物学实验，发现替拉曲可具有抗YFV活性，具体表现为抑制YFV在细胞内的复制；减轻小鼠感染YFV的症状，提高其存活率。本发明为替拉曲可提供了新的医药用途，为黄热病毒感染提供了新的预防和治疗手段。

附图说明

图1.替拉曲可与DMSO对Huh7细胞活性的影响。以替拉曲可与DMSO分别处理Huh7细胞，24小时后加入CCK8试剂，检测450nm吸光值，计算不同浓度药物处理的细胞活性情况。

图2.替拉曲可与索非布韦抑制YFV感染的有效药物浓度。Huh7细胞以YFV(MOI＝1)感染，同时加入不同浓度的替拉曲可(Post-TRIAC)、索非布韦(sofosbuvir，SOFO)与DMSO溶剂，计算替拉曲可抑制YFV感染的有效药物浓度。

图3.替拉曲可、索非布韦(阳性对照抑制剂)与DMSO溶剂在细胞模型中对Huh7细胞抗YFV感染的保护作用对照图。Huh7细胞以YFV(MOI＝1)感染，同时加入不同浓度的替拉曲可、索非布韦与DMSO溶剂，或不以黄热病毒感染(未加病毒)，48小时后荧光定量PCR检测YFVRNA变化。

图4.替拉曲可与DMSO溶剂在小鼠模型中对YFV感染小鼠体重变化的影响图。将C57BL/6实验小鼠(3周龄)腹腔注射感染YFV(10⁷PFU)，分为提前给药组(Pre-TRIAC，小鼠感染前48h给药)、后给药组(Post-TRIAC，小鼠感染后0h给药)、DMSO和MOCK组。小鼠给药方式为灌胃给药(0.2mg/kg/day)，连续7天。观察药物对小鼠感染YFV的体重变化。

图5.替拉曲可与DMSO溶剂在小鼠模型中对YFV感染小鼠存活的影响图。记录上述每组小鼠死亡时间并绘制生存曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明实施例所用的替拉曲可可以通过市售方式购买获得。

实施例：

一、病毒、药物、试剂及其他材料

1.病毒：黄热病毒株(GenBank:KY587416.1)。

2.药物：替拉曲可、索非布韦(RNA酶抑制剂，文献报道能够抑制YFV，PLoSNeglTrop Dis.2019；13(1):e0007072，本实验中用作阳性对照)购于美国Selleck公司，加入DMSO将药物溶解并稀释成所需浓度。

3.人肝癌细胞系Huh7细胞，购自中国科学院上海细胞所，由中国人民解放军海军军医大学生物医学防护教研室保存。实验用C57BL/6小鼠为无特定病原体(specificpathogen free，SPF)级，购自于海军军医大学实验动物中心。

4.DMEM细胞培养液为美国Hyclone公司产品，用时添加10％胎牛血清、非必需氨基酸、氨苄青霉素和链霉素(各100U/ml)，以及细胞消化用胰蛋白酶购自美国Thermo Fisher公司。

5.细胞RNA抽提试剂TRIzol和荧光定量PCR试剂购自日本TaKaRa公司。

6.CCK8细胞活性和增殖检测试剂盒为美国Med Chem Express公司产品。

7.小鼠抗黄热病毒多克隆抗体由中国人民解放军海军军医大学生物医学防护教研室用甲醛灭活的黄热病毒免疫小鼠而制备。

8.荧光素AlexaFluor488标记的抗小鼠IgG(H+L)为美国Thermo Fisher公司产品。

9.荧光定量PCR引物：

YFV，正向引物5’-GGGGTCTAGAGGTTAGAGGAG-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物5’-GGAGGAAAAGCAGAGAACCACTC-3’(SEQ ID NO.2)；

GAPDH正向引物5’-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3’(SEQ ID NO.4)；

由北京擎科生物科技有限公司合成。

二、实验方法：

1.替拉曲可对细胞活性的影响

YFV在人体内主要感染的靶器官是肝脏，因此选择人肝癌来源的Huh7细胞作为体外细胞模型。将不同浓度(0.156、0.625、2.5、10、40、160和640μM)的替拉曲可加入96孔板细胞密度为75％的Huh-7细胞中，以DMSO作为对照。培养24h后弃上清，每孔加入含10％CCK-8试剂、2％胎牛血清的DMEM培养基孵育2h，酶标仪测定450nm波长处的光密度(OD)值，观察不同浓度药物处理的细胞活性情况。与DMSO对比，有效药物浓度的替拉曲可不影响细胞活性(图1)。

2.替拉曲可在细胞感染模型中对YFV感染的抑制作用

在96孔板中将YFV以1的MOI感染细胞密度为75％的Huh-7细胞并同时加入不同浓度(0.156、0.625、2.5、10和40μM)的替拉曲可，以索非布韦和DMSO分别做阳性和阴性对照。24小时后，进行免疫荧光检测，计数阳性克隆。根据阳性克隆数计算替拉曲可在不同浓度时对YFV的抑制率：抑制率％＝[(b-a)/b]×100(a为加药物孔的阳性克隆数；b为加相同浓度的DMSO孔的阳性克隆)。根据抑制率，利用GraphPad Prism 8软件计算各药物半数有效浓度(50％of effective concentration，EC50)。

结果表明，替拉曲可和索非布韦的EC50分别为2.07μM and 3.86μM(图2)。

3.替拉曲可、索非布韦与DMSO溶剂在细胞模型中对Huh7细胞抗YFV感染的保护作用

Huh-7细胞在24孔板中将YFV以1的MOI感染细胞密度为75％的Huh-7细胞并同时加入不同浓度的替拉曲可、索非布韦和DMSO作用37℃孵育24h。荧光定量PCR分析不同浓度药物对YFV RNA的抑制情况。

结果表明，2.5μM的替拉曲可和索非布韦对YFV的抑制率为71.58％和36.33％，10μM的替拉曲可和索非布韦对YFV的抑制率为99.50％和95.01％(图3)。

4.替拉曲可在小鼠模型中对YFV感染小鼠体重变化的影响

我们先对小鼠进行了病毒攻毒剂量的初步研究，以10⁷PFU剂量腹腔注射感染小鼠，在注射以后的第5天体重开始下降，第9天开始死亡。显示该剂量是一个相对较高的致死剂量，故小鼠实验采取该剂量。

将C57BL/6实验小鼠(3周龄)分为提前给药组(Pre-TRIAC)、后给药组(Post-TRIAC)、DMSO组和MOCK组。小鼠腹腔注射感染YFV(10⁷PFU)，给药方式为灌胃给药(0.2mg/kg/day)，连续7天。

1)提前给药组为小鼠感染前48h给药，病毒攻击当天先灌胃给药，随后腹腔注射病毒，共20只小鼠；

2)后给药组为小鼠感染同时灌胃给药，共20只小鼠；

3)DMSO组，病毒攻击24h以后灌胃药物给药，共17只小鼠；

4)MOCK空白对照组，不进行病毒攻击，也不给药，共20只小鼠。

实验小鼠每天称重，观察其临床症状(包括小鼠姿态、是否颤抖、皮毛光泽、肌肉张力、体重变化以及存活情况)，并对其进行临床评分。

结果表明，MOCK空白对照组小鼠体重持续增加；DMSO组体重记录数值从病毒攻击后的第5天开始降低，体重降低比例较大；提前给药组从病毒攻击后的第5天稍有降低随后小鼠体重持续增加；后给药组小鼠体重记录数值也是从病毒攻击后的第5天开始降低，但存活小鼠的体重在病毒攻击后第10天开始呈上升趋势(图4)。

5、替拉曲可在小鼠模型中对YFV感染小鼠存活的影响

提前给药组(Pre-TRIAC)、后给药组(Post-TRIAC)、DMSO组和MOCK组小鼠在记录体重和观察临床症状的同时，记录每组小鼠死亡时间绘制生存曲线。

结果表明，MOCK空白对照组小鼠一直存活至实验结束；DMSO组在病毒攻击后第9天后开始死亡，至20天实验结束9只死亡，8只存活；提前给药组在病毒攻击后至20天实验结束仅在第11天有一只死亡；后给药组在病毒攻击后9天后开始死亡，至20天实验结束3只死亡，17只存活(图5)。

结果提示，替拉曲可能有效保护小鼠抵抗YFV感染，降低小鼠死亡率，起到预防和治疗YFV感染的效果。

上述体外和体内实验结果均表明，替拉曲可具有显著的抗YFV感染的活性，可用于制备抗YFV感染的药物，用于YFV感染的预防和治疗。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.替拉曲可在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的应用；所述的替拉曲可的化学结构式如式I所示：

2.根据权利要求1所述的替拉曲可在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗黄热病毒感染的药物是以替拉曲可作为唯一活性成分，或包含替拉曲可的药物组合物。

3.根据权利要求2所述的替拉曲可在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中，替拉曲可含量为1.55μg/ml-6.22μg/ml。

4.根据权利要求2所述的替拉曲可在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中还包括药剂学能接受的辅料或载体。

5.根据权利要求1所述的替拉曲可在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗黄热病毒感染的药物剂型为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂。

6.根据权利要求5所述的替拉曲可在制备预防和/或治疗黄热病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗黄热病毒感染的药物的给药途径剂包括注射给药剂型、呼吸道给药剂型、滴鼻剂、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型或腔道给药剂型。

7.一种预防和/或治疗黄热病毒感染的药物制剂，其特征在于，其包含有效量的替拉曲可，以及药学上可接受的载体或辅料。