KR20200110347A - 융합 단백질 - Google Patents

융합 단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR20200110347A
KR20200110347A KR1020207021180A KR20207021180A KR20200110347A KR 20200110347 A KR20200110347 A KR 20200110347A KR 1020207021180 A KR1020207021180 A KR 1020207021180A KR 20207021180 A KR20207021180 A KR 20207021180A KR 20200110347 A KR20200110347 A KR 20200110347A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
ser
gly
thr
lys
Prior art date
Application number
KR1020207021180A
Other languages
English (en)
Inventor
프란시스 제이 무사이
산토 카멜라 드
스티븐 리
Original Assignee
캔써 리서치 테크놀로지 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 캔써 리서치 테크놀로지 리미티드 filed Critical 캔써 리서치 테크놀로지 리미티드
Publication of KR20200110347A publication Critical patent/KR20200110347A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/53—Ligases (6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1018—Carboxy- and carbamoyl transferases (2.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/94—Pancreatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/03—Carboxy- and carbamoyltransferases (2.1.3)
    • C12Y201/03003—Ornithine carbamoyltransferase (2.1.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/04—Other carbon-nitrogen ligases (6.3.4)
    • C12Y603/04005—Argininosuccinate synthase (6.3.4.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질에 관한 것이다. 상기 도메인은 아르기니노숙시네이트 신타제(ASS-1) 효소 도메인 또는 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC) 효소 도메인과 같은 효소 도메인일 수 있다. 본 발명은 또한 상기 융합 표적-결합 단백질을 포함하는 세포(예를 들어, 상기 융합 표적-결합 단백질을 발현하는 세포), 및 상기 융합 표적-결합 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 상기 융합 표적-결합 단백질, 세포 또는 핵산을 사용하는 약학 조성물, 의학적 용도 및 치료 방법에 관한 것이다. 상기 단백질, 세포, 핵산 및 약학 조성물은 신경아세포종 또는 급성 골수성 백혈병과 같은 암의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

Description

융합 단백질
본 발명은 융합 표적-결합 단백질, 및 상기 단백질을 포함하는 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 융합 표적-결합 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 개시된 상기 융합 표적-결합 단백질, 세포 또는 핵산을 사용하는 약학 조성물, 의학적 용도 및 치료 방법에 관한 것이다.
표적-결합 능력을 갖는 융합 단백질은 다양한 치료 용도에 사용되어 왔다. 가장 특히는, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포가 암의 치료에 사용되어 왔다. 그러나, 하기에서 더 논의되는 바와 같이, 의미있는 임상 가능성을 보여줌에도 불구하고, 상기 치료들은 보편적으로 효과적이지는 않았다.
전임상 및 임상 연구에서 CAR-T 실패
급성 및 소아 암 둘 다에 대한 세포독성 화학치료에서의 발전에도 불구하고, 많은 주요 암의 아형들이 여전히 극히 불량한 예후를 가짐은 분명하다. 면역 치료는 악성 암 세포를 직접 표적화하는 것에 대안적 접근방법을 제공하며, 표준 접근방법들의 정상 세포들에 대한 독성 부작용을 배제시킨다.
키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포(CAR-T)는, 전형적으로 항체 단편(scFv)을 사용하여, 종양 세포 상의 표면 항원을 특이적으로 인식하도록 조작된 자기유래성 환자-유래된 T 세포이다. 소아 암을 성공적으로 치료하기 위해 CAR-T 세포를 이용하는 원리 증명은 항-CD19 CAR T 세포를 사용하여 신속하고 지속적인 관해를 경험한, 화학-내성인, 재발된 소아 B 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 환자들에서 확증되었다. 고형 종양들 중에서, 아동의 가장 흔한 고형암인 신경아세포종이 선택되는 모델이었으며 CAR-T 세포 치료에 대한 고형 종양의 반응에 있어 매우 정보를 제공하는 것으로 입증되었다. 전임상 연구는 디시알로강글리오시드 2(GD2) 항원을 인식하는 CAR T 세포가 신경아세포종 세포를 사멸시키는 강력한 새로운 방법을 나타낼 수 있음을 시사한다. 신경아세포종이 고형 종양에 대한 CAR-T 세포 개발을 위한 패러다임이 되고 있지만, 전임상 모델 및 초기 상 시험들에서는 단지 제한된 항종양 효능만이 나타났다. 1 세대 항-GD2 CAR T 세포는 생체내에서 지속되지 못했으며 최소의 항종양 효과를 나타내었다. 2 세대 항-GD2-CAR T 세포(CD28 또는 4-1BB 공자극 도메인 함유)는 생체내에서 개선된 지속성을 나타내어 중간정도의 종양 관해를 이끌었으나, 신경아세포종의 존재하에서는 기능적으로 고갈되어 버렸다. 인간에서, 항-GD2 CAR T 세포에 대한 연구는, 다수의 상기 세포들의 주입에도 불구하고, CAR T 세포 수가 수주 이내에 낮아지거나 검출불가능하게 되고, 활동성 질환을 갖는 환자들의 대다수가 완전 관해에 이르지 못하였다는 핵심 관찰결과를 나타내었다. 중요하게, 낮은 수준의 CAR T 세포 지속성을 나타낸 환자들이 더 오래 생존하였다. 이러한 결과들은, 남아있는 신경아세포종 종양들 상에 대형 표적 항원 부하물의 존재에도 불구하고, 국소적 및 전신적 종양 미세환경이 CAR-T 세포의 지속성을 손상시킴을 시사한다.
CAR-T 치료는 또한 시험관내, 생체내, 및 사람에서 제한된 수의 다른 고형 종양들에 대해서도 검증되었다. 각각의 경우에서, 상기 악성종양에 대한 결과들은 ALL에서 항-CD19 CAR-T 세포들에 대해 확인된 흥미로운 데이터를 반복검증하지 못했다.
급성 골수성 백혈병
급성 골수성 백혈병은 성인들에서 가장 흔한 급성 백혈병이고 아동에서 두번째로 흔한 백혈병이다. 발병률은 연령에 따라 증가하며, 고 위험성 또는 재발된 질환을 갖는 환자의 경우 예후는 조혈 줄기세포 이식에도 불구하고 성인에서 12개월 미만의 생존율 하에 극히 불량하다. 노령 환자들 또는 동반 질환을 갖는 환자들의 경우, 표준 화학치료 요법은 효능이 거의 없어서 차선의 치료로 이끌고 치유를 달성할 수 없게 만든다. 소수의 효과적인 신약들이 AML에 대해 개발되었고, 따라서 면역치료는 상이한 접근방법의 가능성을 제공한다. CD33은 거의 보편적으로 MAL 아세포 상에서 발현되며, 면역독소-기반 치료제(겜투주맙(Gemtuzumab) 오조가마이신)에 대한 효과적인 표적인 것으로 입증되었다. 항-CD33 CAR-T 세포는 시험관내에서 AML 아세포에 세포독성이며 생체내에서 백혈병 존재량을 근절시킨다. 이러한 기반에서, 항-CD33 CAR T 세포에 대한 1상 임상시험이 중국에서 개시되었다(NCT018642902 및 NCT02958397). 화학치료-난치성 AML을 갖는 1명의 환자로부터의 보고서는 골수 AML 아세포의 감소를 보여주었다. 이러한 결과들은 항-CD33 CAR T 세포가 효과적일 수 있다는 원리증명을 제공한다. 그러나, 질환은 혈액 및 골수 둘 다에 측정가능한 CAR-T 세포가 잔류함에도 불구하고 CAR 주입 9주후에 재발되었다. 상기 결과는 CAR-T 세포가 백혈병 미세환경에 의해 불활성이 되었음을 시사한다(도피 메카니즘으로서 AML 아세포 상의 CD33 손실의 증거는 없음).
중피종, 난소암 및 췌장암
성인에서 거의 보편적으로 불량한 예후를 갖는 석면 관련 종양인 중피종은 세포 표면 당단백질 메소텔린을 발현한다. 메소텔린은 또한 난소암, 폐 선암 및 췌방암과 같은 상피암에서도 발현된다. 메소텔린은 SS1P와 같은 면역독소를 사용한 수동적 면역치료에 효과적이고 선택적인 표적인 것으로 입증되어 CAR T 기술의 개발을 위해 선택되어 왔다. 뮤린 모델에서, 항-메소텔린 CAR-T 세포는 명확하고 지속적인 항-종양 활성을 나타낸다. 항-메소텔린 CAR-T 세포는 또한 상기 종양들을 가진 환자들에게도 투여되었으며, 각각의 경우에서 제한된 반응들이 검출(PR, SD)되었음에도 종양들은 진행되었다. CAR-T 세포 지속성은, 세포가 단지 초기 또는 반복 투여일들 이내에 검출불가능해지면서 극히 불량하다. CAR-T 세포가 종양 내에 위치하고 따라서 표적 항원에 매우 근접한 경우에조차, 반응들은 약하게 유지되어 T 세포의 기능을 저하시키는 강한 면역억제 미세환경을 시사한다.
교모세포종
교모세포종은 성인 및 아동 둘 다에서 가장 파괴적인 뇌종양 중 하나로, 이때 환자들은 집중적인 화학치료 및 방사선치료 기반 요법들에도 불구하고 급속한 질환 진행 및 치료 실패를 빈번히 경험한다. 교모세포종은, 면역치료에 의해 표적화될 수 있는 종양-특이적 항원을 제공하는 상피 성장 인자 수용체 - EGFRvIII의 변이체를 발현한다. EGFRvIII는 또한 진행성 대장암의 대략 1/3에서 발현될 수 있다. 항-EGFRvIII CAR-T 세포는 동소 뮤린 이종이식에서 교모세포종의 질환 억제를 나타내었다. 그러나, 모든 경우에서, 뇌를 포함한 모든 장기내 CAR-T 세포의 검출가능한 수준에도 불구하고 종양은 계속 성장하여 뮤린 치사를 야기한다. 다시, 상기 데이터는 CAR-T 세포가 종양 미세환경에 의해 불활성화됨을 시시한다. 상기 근거에 기반한 1상 시험이 현재 진행중이다(NCT02844062, NCT02664363).
아르기닌 및 면역억제 미세환경
아르기닌은 세포 생존율, 증식 및 단백질 합성을 포함한 많은 세포 과정들을 위해 건강한 조직에 필요한 준필수 아미노산이다. 전신 아르기닌 수준은 원칙적으로 식이 섭취를 통해 유지되며, 그보다 덜한 정도로 '장-신장 축'에서 전구체로부터의 합성에 의해 유지된다. 세포 수준에서, 아르기닌은 수송체의 양이온 아미노산(CAT; SLC7A) 계열을 통해 세포외액으로부터 유입되고 요소 회로에 진입한다. 염증, 임신 및 암과 같은 높은 부담의 조건에서, 아르기닌 수준은 국소 조직 미세환경에서 및 전신적으로 제한적이 될 수 있다. 일부 조직 및 세포들은 아르기니노숙시네이트 신타제(ASS1) 및 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC)의 발현을 통해, 전구체들로부터 아르기닌을 재합성함으로써 스스로를 보호할 수 있다. 상기 효소들 중 적어도 하나의 발현이 결여된 세포는 아르기닌 영양요구성으로 알려진 상태인 세포외 아르기닌의 유입에 의존성이다.
이전의 연구들은 종양 부위에서 아르기나제의 억제가 생체내에서 불량한 CAR T 세포 활성 문제를 해결하는데 유리할 수 있음을 시사하였다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 제공한다. 간결함을 위해, 본 발명의 다양한 양태들 및 실시양태들에 따른 융합 표적-결합 단백질은 본원에서 "본 발명의 단백질"로 지칭될 것이다.
두 번째 양태에서, 본 발명은 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 상기 융합 표적-결합 단백질을 발현할 수 있다.
세 번째 양태에서, 본 발명은 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 세 번째 양태에 따른 핵산은 발현되어 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 융합 표적-결합 단백질 또는 본 발명의 두 번째 양태에 따른 세포를 생성할 수 있음을 인지할 것이다.
네 번째 양태에서, 본 발명은 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 제공한다.
다섯 번째 양태에서, 본 발명은 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 상기 융합 표적-결합 단백질을 발현할 수 있다.
여섯 번째 양태에서, 본 발명은 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 여섯 번째 양태에 따른 핵산은 발현되어 본 발명의 네 번째 양태에 따른 융합 표적-결합 단백질 또는 본 발명의 다섯 번째 양태에 따른 세포를 생성할 수 있음을 인지할 것이다.
일곱 번째 양태에서, 본 발명은 본 발명의 첫 번째, 두 번째, 네 번째 또는 다섯 번째 양태에 따른 융합 표적-결합 단백질 또는 세포, 또는 본 발명의 세 번째 또는 여섯 번째 양태에 따른 핵산을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
여덟 번째 양태에서, 본 발명은, 약제로 사용하기 위한, 본 발명의 첫 번째 또는 네 번째 양태에 따른 융합 표적-결합 단백질을 제공한다.
아홉 번째 양태에서, 본 발명은, 약제로 사용하기 위한, 본 발명의 두 번째 또는 다섯 번째 양태에 따른 세포를 제공한다.
열 번째 양태에서, 본 발명은, 약제로 사용하기 위한, 본 발명의 세 번째 또는 여섯 번째 양태에 따른 핵산을 제공한다.
열한 번째 양태에서, 본 발명은, 약제로 사용하기 위한, 본 발명의 일곱 번째 양태에 따른 약학 조성물을 제공한다.
열두 번째 양태에서, 본 발명은, 대상에게 본 발명의 융합 표적-결합 단백질을 제공하는 것을 포함하는, 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에서 상기 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 융합 표적-결합 단백질은 본 발명의 첫 번째, 네 번째 또는 열한 번째 양태에 따른 것일 수 있다. 본 발명의 단백질은 본 발명의 두 번째 또는 다섯 번째 양태의 세포와 같은 본 발명의 세포의 일부로서 제공될 수 있다.
명세서의 다른 곳에서 더 논의되는 바와 같이, 본 발명의 융합 표적-결합 단백질, 세포, 핵산 및 약학 조성물은 암; 감염, 예를 들어, 바이러스 감염; 및 자가면역 질환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질병의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
도 1은 바이러스 역가를 함유하는 융합 표적-결합 단백질의 최적화를 예시한다. 패널 A는 AMPHO Phoenix 세포의 상등액중에서 72 시간에 걸쳐 증가된 레트로바이러스 입자들의 농도를 보여준다. 패널 B는 융합 표적-결합 단백질 T 세포 형질도입 효율을 tCD34의 유세포분석 검출에 의해 평가하였음을 보여준다. AMPHO 세포주 상등액을 사용하여서는 PBMC의 형질도입 효율에 차이가 보이지 않았다.
도 2는 아르기는 경로 효소가 형질도입된 Jurkat 세포에서 활성을 나타냄을 보여준다. 패널 A는 유세포분석을 이용하여 tCD34의 발현을 측정함으로써 평가시, 단백질-효소 구조물이 고도의 순도로 생성될 수 있음을 보여준다. 패널 B는 형질도입된 세포에서 ASS-1 및 OTC의 발현의 증가를 예시한다. 패널 C는 형질도입 세포에서 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인의 그 기능을 수행하는 능력을 예시한다. 패널 D는 오르니틴의 시트룰린으로의 세포 이화작용(OTC에 의한)에 대한 연구의 결과를 보여준다. OTC 효소 도메인을 함유하는 융합 표적-결합 단백질("GD2-OTC"), 또는 ASS-1 및 OTC 효소 도메인을 둘 다 함유하는 융합 표적-결합 단백질("GD2-ASS-OTC")을 발현하는 세포에 의해 생성된 시트룰린의 양을 평가하고, OTC 효소 도메인을 갖지 않는 대조군 구조물("GD2"), 또는 ASS-1 효소 도메인을 함유하는 융합 표적-결합 단백질("GD2-ASS")을 발현하는 세포와 비교하였다. 패널 E는 마우스에서 종양 미세환경에서 아르기닌 전구체 아르기니노숙시네이트의 합성을 촉진하는 도메인(ASS-1)을 포함하는 구조물로 형질도입된 융합 표적-결합 단백질 T 세포의 지속성을 보여준다. 패널 F는 OTC 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질 T 세포(GD2-OTC)가 OTC 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 갖지 않는 T 세포(GD2 단독)에 비해 상당히 증대된 지속성을 나타내었음을 보여준다.
도 3은 아르기닌 경로 효소가 인간 공여체 세포로부터의 PBMC에 형질도입될 수 있음을 예시한다. 패널 A는 유세포분석을 이용하여 tCD34의 발현을 측정함으로써, 상기 융합 표적-결합 단백질-효소 구조물이 PBMC에서 고도의 순도로 생성될 수 있음을 보여준다. 패널 B는 형질도입된 세포에서 ASS-1 및 OTC의 발현의 증가를 보여준다. 패널 C는 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 효소 도메인을 포함하는 구조물을 또한 함유하는 융합 표적-결합 단백질 T 세포에서 공동억제 수용체 LAG-3, TIM-3 및 PD-1의 발현에 차이가 없었음을 보여준다. 패널 D는, tCD34의 유세포분석에 의해 검출된 바와 같은, 7일의 증식동안 측정된, 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 구조물로 형질도입된 PBMC의 지속성을 보여준다.
도 4는 ASS-1 및 OTC 효소 도메인이 저-아르기닌 종양 조건에서 상당한 대사 및 증식 이점을 제공함을 보여준다. 패널 A는, 배양 상등액의 ELISA로 검출된, 정상 아르기닌 배지 및 75% 아르기닌 고갈 배지 조건에서 배양시 시트룰린 대사를 증대시키는, ASS-1 효소 도메인(GD2-ASS) 및 OTC 효소 도메인(GD2-OTC)을 포함하는 융합 표적-결합 단백질 T 세포를 보여준다. 패널 B는, 대조군 단백질을 발현하는 T 세포(ASS-1 또는 OTC를 갖지 않는 "GD2-BB")에 의한 용해에 대해 평가된 바와 같은, 본 발명의 융합 표적-결합 단백질을 발현하는 T 세포(ASS-1 도메인("GD2-ASS") 또는 OTC 도메인("GD2-OTC") 포함)에 의한 신경아세포종 및 골수성 백혈병 세포주의 특이적 세포 용해를 예시한다. 패널 C는 ASS-1 또는 OTC 효소 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질 T 세포가 대조군(효소를 포함하지 않는 GD2)에 비해 저-아르기닌 조건에서 증식의 상당한 증가를 나타내었음을 보여준다. 그래프에 나타낸 조건은 정상 아르기닌(RPMI+10% FCS), 신경아세포종-유래 저-아르기닌 상등액(Lan-1 TCM), 또는 75% 아르기닌 고갈 배지이다.
도 5는 변형된 융합 표적-결합 단백질 T 세포가 생체내에서 증대된 항-종양 활성을 가지며 비-GD2 융합 표적-결합 단백질 T 세포에 적용될 수 있음을 보여준다. 패널 A는 GD2+ 종양 세포가 이식되고, ASS-1 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질 T 세포(GD2-ASS) 및 함유하지 않는 융합 표적-결합 단백질 T 세포(GD2 단독)가 투여된 NOG-SCID 마우스의 상대 종양 부피를 보여준다. 상대 종양 성장률은 시간 경과에 따라 측정하였다. 패널 B는 GD2-ASS-1 및 GD2 단독 융합 표적-결합 단백질 T 세포와 함께 투여후 마우스의 생존 백분율을 보여준다. 패널 C는 50% 내지 75% AML 세포주 조건 배지(저-아르기닌) 또는 75% 아르기닌 고갈 배지에서 CD33 및 CD33-ASS-1 융합 표적-결합 단백질 T 세포의 생존율을 예시한다.
도 6은 생체내 아르기닌-고갈 조건에서 본 발명 세포의 증가된 지속성을 보여준다. 상기 지속성은 정맥내 투여된, 5x106 항-GD2 CAR-T Jurkat 세포(대조군 세포), 또는 GD2 표적 잔기 및 ASS-1 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질(GD2-ASS)을 발현하는 Jurkat 세포, 또는 GD2 표적 잔기 및 OTC 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질(GD2-OTC)을 발현하는 세포가 이식된 NOG-SCID 마우스에서 입증되었다. GD2-ASS-1 및 GD2-OTC CAR T 세포는 비변형 GD2 CAR-T 구조물을 포함하는 대조군 세포에 비해 상당히 증대된 지속성을 나타내었다.
도 7은 아르기닌 경로 효소가 다양한 표적 결합 잔기를 포함하는 인간 공여체로부터의 PBMC에 형질도입될 수 있음을 보여준다. 웨스턴 블롯(Western blot)은 대조군에 비해 본 발명의 단백질로 형질도입된 PBMC 세포에서 ASS-1 및 OTC의 발현이 증가됨을 보여준다(패널 A). 패널 B는 유세포분석에 의해 평가된 LAG-3, TIM-3 및 PD-1의 발현을 보여준다.
도 8은 상이한 효과기 대 표적 비에서 K562 백혈병 세포의 존재하에 4 시간동안 배양된, ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 및 OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 도메인을 발현하는 CAR T 세포의 세포파괴 활성을 보여준다. 본 발명의 단백질을 포함하는 세포들은 세포파괴 활성을 유지한다.
도 9는 ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 및 OTC 도메인과 함께 항-GD2, 항-CD33, 항-메소텔린, 또는 항 EGFRvIII 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 CAR T 세포가 대조군 세포에 비해 저-아르기닌 종양 조건에서 상당한 대사 및 증식 이점을 제공함을 보여준다. 동일한 결합 도메인(즉, 항-GD2, 항-CD33, 항-메소텔린 또는 항 EGFRvIII)을 공유하나 효소 도메인들은 결여된 비변형 CAR-T 세포를 본 발명의 단백질을 발현하는 대조군 CAR T 세포로 사용하였다.
도 10은 종양 조정 배지(TCM)에서 배양된, ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 및 OTC 도메인과 함께 GD2-결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 상당한 대사 및 증식 이점을 제공함을 보여준다(패널 A). 패널 B는 종양 조정 배지(TCM)에서 배양된, ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 및 OTC 도메인과 함께 CD33-결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 또한 상당한 대사 및 증식 이점을 제공함을 보여준다.
도 11은 ASS-1 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 CAR-T 세포(항-CD33-ASS-1 CAR-T 세포)가 백혈병을 가진 마우스의 골수로부터의 AML 제거율을 상당히 증대시킴을 보여준다. 상기 데이터는 NOG-SCID 마우스내에 이식된 HL-60 급성 골수성 백혈병(AML) 세포의 제거율과 관련된다.
도 12 패널 A는 GD2-결합 잔기 및 ASS-1 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포로 처리된 신경아세포종 이종이식 마우스의 비장내에서의 본 발명 세포의 증가된 지속성을 예시한다. 항원 자극에 반응하여 증식하는 본 발명 세포의 개선된 능력이 패널 B에 나타나 있다.
도 13 패널 A는 CD33-결합 잔기, 및 ASS-1 도메인, OTC 도메인; 또는 ASS-1 도메인 및 OTC 도메인 중 하나를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포로 처리된 AML 이종이식 마우스의 비장내에서의 본 발명 세포의 증가된 지속성을 예시한다. 항원 자극에 반응하여 증식하는 본 발명 세포의 개선된 능력이 패널 B에 나타나 있다.
도 14는 본 발명 세포의 성공적인 렌티바이러스 생산에 사용된, 본 발명의 핵산을 포함하는 구조물의 세부사항을 나타낸다.
본 발명은 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인(및/또는 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인)을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 발현하는 세포가 생체내에서 상당한 이점을 나타낸다는 본 발명자들의 인식을 기반으로 한다. 특히, 본 발명자들은 상기 단백질을 발현하는 세포가, 본 발명자들이 많은 선행 기술의 CAR-기반 치료법들의 실패에 기여한 것으로 생각하는 종양 미세환경과 연관된 면역억제 효과를 극복할 수 있음을 밝혀내었다.
본 발명의 단백질을 발현하는 세포들에 의해 나타난 특별한 이점들 중 하나는 종양 미세환경에서 상기 세포들의 증가된 지속성 및 증식이다. 상기 미세환경은 달리는 선행 기술의 CAR T 세포의 효과를 현저하게 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 면역억제 종양 미세환경의 조건에서 증식하는 개선된 능력을 나타낸다. CAR을 발현하는 세포의 증식은 통상적으로 아르기닌-고갈 조건에 의해 현저하게 억제된다.
상기 이점은 둘 다, 본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 수가 증가되고 상기 세포들이 종양 부위에서 오래 체류하게 되어 개선된 암세포 사멸을 가능하게 하는 개선된 치료를 가능하게 한다. 이와 관련하여, 본 발명의 단백질 및 세포에 관하여 이루어진 변형이 암세포를 사멸하는(세포독성 작용에 의해서든 아니면 특이적 세포 용해에 의해서든) 그들의 능력을 별로 손상시키지 않음을 유의하는 것은 중요하다.
따라서, 본 발명의 단백질 및 세포는 선행 기술의 CAR-기반 치료법들에 비해 개선된 치료제를 제공함을 인지할 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 다양한 양태들 및 실시양태들은 상기 개선점들로부터 비롯되거나 상기 개선점들에 기여한다.
본 발명의 이해를 위해, 이제 본 발명을 하기의 정의와 관련하여 더 기술할 것이다. 간결함을 위해, 뒤에 나오는 단락들은 본 발명의 단백질의 맥락에서 특정 실시양태들만을 언급할 수 있으나, 맥락상 달리 요구되는 경우를 제외하고, 본 발명의 단백질과 관련하여 언급된 실시양태들은 본원에 개시된 본 발명의 다른 양태들 어느 것에나 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
융합 표적-결합 단백질
융합 표적-결합 단백질은, 본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 목적하는 생물학적 성질에 목적하는 특이성이 부여될 수 있게 하는 인공 융합 단백질이다. 간결함을 위해, 상기 단백질은 또한 본 개시내용에서 "단백질" 또는 "본 발명의 단백질"로도 지칭될 것이다. 상이한 유형의 세포들, 및 본 발명의 맥락에서 이들이 각각 제공할 수 있는 목적하는 생물학적 성질들이 명세서의 다른 곳에서 더 논의된다. 전형적으로, 융합 표적-결합 단백질 및 상기 단백질을 발현하는 세포의 의학적 용도의 맥락에서, 질환과 연관된 세포(예를 들어, 암세포 또는 감염 세포)에 대해 목표가 된 세포파괴 활성은 필요한 치료 유용성을 제공한다.
본 발명의 단백질은 적어도 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인 및/또는 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함한다. 상기 용어들은 본 명세서내 다른 곳에서 정의된다. 숙련가라면 상기 단백질이 또한 다양한 다른 선택적 도메인 또는 영역들을 포함할 수 있음을 인지할 것이다.
상기 융합 표적-결합 단백질의 상이한 부분들(표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인 및/또는 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인)은 2개 이상의 상이한 "공급원"으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 상기 상이한 부분들은 2개 이상의 천연 분자, 예를 들어, 단백질로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 상이한 부분들은 상이한 기원하는 계 또는 종의 측면에서 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 특히 관심을 끄는 융합 표적-결합 단백질의 부류는 키메라 항원 수용체(CAR) 단백질이다. CAR은 결합 특이성을 제공하기 위해 항체 또는 그의 단편을 이용하고 필요한 특이적 생물 활성을 결정하기 위해 세포내 신호전달 영역을 이용한다. 다양한 상이한 세대의 CAR이 공지되어 있고, 이들 상이한 세대들은 각각, 본 개시내용의 맥락에서 달리 요구되지 않는 한, 본 발명의 융합 표적-결합 단백질의 적합한 예를 대표한다.
의혹을 피하기 위해, 본 발명의 단백질은 또한 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인 및/또는 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하도록 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 상기와 같은 실시양태에서, 표적 결합 잔기는 수용체의 TCR α 및 TCR β 쇄에 의해 제공될 수 있다. 표적 결합 잔기, 및 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인 및/또는 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인은 상이한 공급원으로부터 유래하기 때문에, 상기 변형된 TCR은 본 발명의 목적을 위해 키메라 TCR이다.
본 발명의 단백질은 전형적으로 막관통 부분, CH2CH3 스페이서 부분, CD8 힌지 부분 및 CD8a 신호전달 부분으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상을 포함하여 추가의 부분들을 더 포함한다.
본 발명의 예시적 단백질들의 아미노산 서열들은 서열번호 12 내지 23에 나타내었다. 상기 서열들 중 임의 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 분자는 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 단백질을 나타냄을 인지할 것이다. 서열번호 12 내지 23에 나타낸 임의의 단백질은 본 발명의 의학적 용도, 치료 방법 또는 약학 조성물에 사용될 수 있다.
본 발명의 예시적 단백질들의 서열들의 단편 또는 변이체
본 명세서는 다수의 예시적 단백질 및 핵산 서열을 포함한다. 융합 표적-결합 단백질 및 그를 암호화하는 핵산뿐 아니라, 상기 서열들은 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역 및 효소 도메인의 서열들을 포함한다.
맥락상 달리 요구되는 경우를 제외하고, 본 발명의 범위는 본원에 나타낸 특정한 예시적 서열들로 제한되지 않아야 함을 인지할 것이다. 특히, 전문적인 독자라면 예시적 서열들의 단편 또는 변이체도 또한 상기 예시적 서열들에 의해 제공된 필요한 활성을 제공할 수 있음을 인식할 것이다. 예시적 서열들의 상기 적합한 단편 또는 변이체들은 본 발명의 다양한 양태 및 실시양태들에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 예시적 아미노산 또는 핵산 서열에 대한 언급은, 맥락상 달리 요구되는 경우를 제외하고, 상기 예시적 서열들의 기능성 단편 또는 변이체들을 또한 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 적합한 단편은 관련된 예시적 서열의 전장의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 차지할 수 있다. 실제로, 적합한 변이체는 예시적 서열의 전장의 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 차지할 수 있다.
적합한 변이체는 관련된 예시적 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 공유할 수 있다. 실제로, 적합한 변이체는 관련된 예시적 서열과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 공유할 수 있다.
단편 또는 변이체가 "기능성"인 것은 실시예에 기술된 분석법들을 포함하여 당해 분야의 숙련가에게 공지된 분석법들을 참고로 하여 실험적으로 평가될 수 있다.
아르기닌 또는 아르기닌 전구체
본 발명은 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질에 관한 것이다.
아르기닌(흔히 "Arg" 또는 "R"로 약칭됨)은 준필수 아미노산이다. 아르기닌은 174.2 g/몰-1의 분자질량을 가지며, 2-아미노-5-구아니디노펜타노산으로도 지칭될 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 아르기닌 전구체에 대한 언급은 대사성 아르기닌이 유입되거나 이화되거나 재순환되는 일련의 화학 반응인 아르기닌 경로의 맥락에서 이해되어야 한다. 따라서, 아르기닌의 전구체는 본 발명의 목적에 있어서 직접 또는 간접적으로 아르기닌으로 전환되는 임의의 화합물을 포함하는 것으로 간주될 수 있다.
아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인
본 발명의 단백질은 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함한다. 상기 기능을 충족시키는 도메인의 능력, 즉, 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인의 능력은 임의의 적합한 수단 또는 분석법에 의해 조사할 수 있다.
숙련가라면 그 합성이 촉진될 화합물, 예를 들어, 아르기닌 또는 아르기닌 전구체와 관련하여 적합한 수단 또는 분석법이 선택될 수 있음을 인지할 것이다. 단지 예로서, 상기 필요한 합성을 촉진하는 도메인의 능력을 평가하는 적합한 분석법은 본 발명의 예시적 세포의 특성화와 관련하여 실시예에서 더 기술된다.
적합하게는, 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인은 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진할 수 있는 효소 도메인일 수 있다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 효소 도메인은 전장 효소 도메인, 또는 상기 도메인이 필요한 활성을 나타내는 한 상기 도메인의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
적합한 실시양태에서, 그 합성이 촉진되는 아르기닌 전구체는 아르기노숙시네이트이다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 합성을 촉진하는 도메인은 아르기니노숙시네이트 신타제(ASS-1) 효소 도메인; 및 아르기니노숙시네이트 신테타제(ArgG) 도메인으로부터 선택될 수 있다. 적합하게는, 상기 합성을 촉진하는 도메인은 아르기니노숙시네이트 신타제(ASS-1) 효소 도메인이다.
적합한 실시양태에서, 그 합성이 촉진되는 아르기닌 전구체는 아르기노숙시네이트이다. 아르기니노숙시네이트 리아제에 의해서와 같은 아르기니노숙시네이트의 촉매작용은 아르기닌을 생성한다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 합성을 촉진하는 도메인은 아르기니노숙시네이트 리아제(ASL) 효소 도메인; 및 아르기니노숙시네이트 리아제(ArgH) 효소 도메인으로부터 선택될 수 있다.
적합한 실시양태에서, 그 합성이 촉진되는 아르기닌 전구체는 시트룰린이다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 합성을 촉진하는 도메인은 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC) 효소 도메인; 오르니틴 디카복실라제(ODC1); 및 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ArgF) 효소 도메인으로부터 선택될 수 있다. 적합하게는, 상기 합성을 촉진하는 도메인은 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC) 효소 도메인이다.
따라서, 적합한 실시양태에서, 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인은 ASS-1 도메인; OTC 도메인; ASL 도메인; OCD1 도메인; ArgG 도메인; ArgH 도메인; 및 ArgF 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 효소 도메인을 포함한다. 상기 도메인은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인으로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 따른 단백질은 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 다수의 도메인들을 포함할 수 있다. 적합하게는, 상기 다수는 다수의 효소 도메인들을 포함할 수 있다. 상기 다수는 개별적 효소 도메인의 1개보다 많은 카피, 및/또는 여러 효소 도메인들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 단백질은 ASS-1 도메인; OTC 도메인; ASL 도메인; OCD1 도메인; ArgG 도메인; ArgH 도메인; 및 ArgF 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 효소 도메인들의 조합을 포함할 수 있다. 단지 예로서, 본 발명의 단백질은 ASS-1 도메인 및 OTC 도메인을 둘 다 포함할 수 있다.
아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 적합한 효소 도메인은 인간 효소 도메인일 수 있다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 효소 도메인은 ASS-1, OTC, ASL 또는 OCD1일 수 있다.
아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 적합한 효소 도메인은 천연 효소 도메인일 수 있다. 또는, 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 적합한 효소 도메인은 천연 도메인의 합성 활성을 재현할 수 있는 천연 효소 도메인의 단편 또는 유도체일 수 있다. 상기 단편 또는 유도체는 천연 도메인의 합성 활성의 50% 이상; 천연 도메인의 합성 활성의 60% 이상; 천연 도메인의 합성 활성의 70% 이상; 천연 도메인의 합성 활성의 80% 이상; 천연 도메인의 합성 활성의 90% 이상; 또는 천연 도메인의 합성 활성의 95% 이상인 합성 활성을 가질 수 있다. 실제로, 적합한 단편 또는 유도체는 그가 유래될 수 있는 천연 도메인보다 더 큰 합성 활성, 즉 천연 도메인의 합성 활성의 100% 이상의 합성 활성을 가질 수 있다.
본 개시내용의 목적을 위해 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 적합한 효소 도메인에 대한 추가의 세부사항은 하기에 나타낸다.
ASS-1 효소 도메인
본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ASS-1 효소 도메인의 한 예를 서열번호 1에 나타내었다.
또는, 서열번호 1에 나타낸 서열의 단편 또는 유도체를 본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ASS-1 효소 도메인으로 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질에 ASS-1 활성을 제공하는 임의의 효소 도메인을 상기와 같은 실시양태에 사용할 수 있다. ASS-1 활성은 본 개시내용의 실시예 부분에서 기술된 분석법에 의해 평가할 수 있다.
ASS-1 활성의 적합한 수준은 서열번호 1에 의해 제공된 수준과 동등할 수 있다. 또는, 더 낮거나 높은 수준의 ASS-1 활성을 제공하는 효소 도메인이 여전히 유리할 수 있다.
서열번호 1에 나타낸 ASS-1 효소 도메인의 적합한 단편은 서열번호 1에 나타낸 아미노산 잔기들 중 1개를 제외한 전부, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 잔기 중 2개를 제외한 전부, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 잔기들 중 3개를 제외한 전부, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 잔기들 중 4개를 제외한 전부, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 잔기들 중 5개를 제외한 전부, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 잔기들 중 6개를 제외한 전부, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 잔기들 중 7개를 제외한 전부, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 잔기들 중 8개를 제외한 전부, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 잔기들 중 9개를 제외한 전부, 또는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 잔기들 중 10개를 제외한 전부를 포함할 수 있다.
단지 예로서, 서열번호 1에 나타낸 서열의 적합한 변이체는 서열번호 1과 또는 상기에서 정의된 바와 같은 서열번호 1의 단편과 적어도 75% 동일성을 공유할 수 있다. 적합한 변이체는 서열번호 1 또는 그의 단편과 적어도 80% 동일성; 서열번호 1 또는 그의 단편과 적어도 85% 동일성; 서열번호 1 또는 그의 단편과 적어도 90% 동일성; 서열번호 1 또는 그의 단편과 적어도 95% 동일성; 서열번호 1 또는 그의 단편과 적어도 96% 동일성; 서열번호 1 또는 그의 단편과 적어도 97% 동일성; 서열번호 1 또는 그의 단편과 적어도 98% 동일성; 또는, 서열번호 1 또는 그의 단편과 적어도 99% 동일성을 공유할 수 있다. 본 발명의 CAR에 혼입되기에 적합하기 위해, 상기 변이체는 상기에 언급된 바와 같은 ASS-1의 합성 활성을 유지해야 한다.
적합한 ASS-1 효소 도메인은 서열번호 1의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 50%의 활성을 제공할 수 있다. 적합하게는, 상기 적합한 ASS-1 효소 도메인은 서열번호 1의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%의 활성을 제공할 수 있다. 적합하게는, 상기 효소 도메인은 서열번호 1의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 100%의 활성도 제공할 수 있다.
사실상, 적합한 ASS-1 도메인은 서열번호 1의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 110%의 활성을 제공할 수 있다. 적합하게는, 상기 적합한 ASS-1 도메인은 서열번호 1의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%의 활성을 제공할 수 있다. 적합하게는, 상기 효소 도메인은 서열번호 1의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 200%의 활성도 제공할 수 있다.
OTC 효소 도메인
본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 OTC 효소 도메인의 한 예를 서열번호 2에 나타내었다.
또는, 서열번호 2에 나타낸 서열의 단편 또는 유도체를 본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 OTC 효소 도메인으로 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질에 OTC 활성을 제공하는 임의의 효소 도메인을 상기 실시양태에 사용할 수 있다. OTC 활성은 본 개시내용의 실시예 부분에서 기술된 분석법에 의해 평가할 수 있다.
OTC 활성의 적합한 수준은 서열번호 2에 의해 제공된 수준과 동등할 수 있다. 또는, 더 낮거나 높은 수준의 OTC 활성을 제공하는 효소 도메인이 여전히 유리할 수 있다.
서열번호 2에 나타낸 OTC 효소 도메인의 적합한 단편은 서열번호 2에 나타낸 아미노산 잔기들 중 1개를 제외한 전부, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 잔기들 중 2개를 제외한 전부, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 잔기들 중 3개를 제외한 전부, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 잔기들 중 4개를 제외한 전부, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 잔기들 중 5개를 제외한 전부, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 잔기들 중 6개를 제외한 전부, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 잔기들 중 7개를 제외한 전부, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 잔기들 중 8개를 제외한 전부, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 잔기들 중 9개를 제외한 전부, 또는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 잔기들 중 10개를 제외한 전부를 포함할 수 있다.
단지 예로서, 서열번호 2에 나타낸 서열의 적합한 변이체는 서열번호 2와 또는 상기에서 정의된 바와 같은 서열번호 2의 단편과 적어도 75% 동일성을 공유할 수 있다. 적합한 변이체는 서열번호 2 또는 그의 단편과 적어도 80% 동일성; 서열번호 2 또는 그의 단편과 적어도 85% 동일성; 서열번호 2 또는 그의 단편과 적어도 90% 동일성; 서열번호 2 또는 그의 단편과 적어도 95% 동일성; 서열번호 2 또는 그의 단편과 적어도 96% 동일성; 서열번호 2 또는 그의 단편과 적어도 97% 동일성; 서열번호 2 또는 그의 단편과 적어도 98% 동일성; 또는, 서열번호 2 또는 그의 단편과 적어도 99% 동일성을 공유할 수 있다. 본 발명의 CAR에 혼입되기에 적합하기 위해, 상기 변이체는 상기에 언급된 바와 같은 OTC의 합성 활성을 유지해야 한다.
적합한 OTC 효소 도메인은 서열번호 2의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 50%의 활성을 제공할 수 있다. 적합하게는, 상기 적합한 OTC 효소 도메인은 서열번호 2의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 활성을 제공할 수 있다. 적합하게는, 상기 효소 도메인은 서열번호 2의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 100%의 활성도 제공할 수 있다.
사실상, 적합한 OTC 도메인은 서열번호 2의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 110%의 활성을 제공할 수 있다. 적합하게는, 상기 적합한 OTC 도메인은 서열번호 2의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%의 활성을 제공할 수 있다. 적합하게는, 상기 효소 도메인은 서열번호 2의 도메인에 의해 제공된 활성의 적어도 200%의 활성도 제공할 수 있다.
아르기노숙시네이트 리아제( ASL ) 효소 도메인
본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ASL 효소 도메인의 한 예는 서열번호 30에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된다.
또는, 서열번호 30에 나타낸 서열의 단편 또는 유도체를 본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ASL 효소 도메인을 암호화하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질에 ASL 활성을 제공하는 임의의 효소 도메인을 상기와 같은 실시양태에 사용할 수 있다.
ASL 활성의 적합한 수준은 서열번호 30에 의해 암호화된 단백질에 의해 제공되는 수준과 동등할 수 있다. 또는, 더 낮거나 높은 수준의 ASL 활성을 제공하는 효소 도메인이 여전히 유리할 수 있다.
오르니틴 디카복실라제 ( ODC1 ) 효소 도메인
본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ODC1 효소 도메인의 한 예는 서열번호 31에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된다.
또는, 서열번호 31에 나타낸 서열의 단편 또는 유도체를 본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ODC1 효소 도메인을 암호화하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질에 ODC1 활성을 제공하는 임의의 효소 도메인을 상기와 같은 실시양태에 사용할 수 있다.
ODC1 활성의 적합한 수준은 서열번호 31에 의해 암호화된 단백질에 의해 제공되는 수준과 동등할 수 있다. 또는, 더 낮거나 높은 수준의 ODC1 활성을 제공하는 효소 도메인이 여전히 유리할 수 있다.
아르기노숙시네이트 신테타제 ( ArgG ) 효소 도메인
본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ArgG 효소 도메인의 한 예는 서열번호 32에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된다.
또는, 서열번호 32에 나타낸 서열의 단편 또는 유도체를 본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ArgG 효소 도메인을 암호화하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질에 ArgG 활성을 제공하는 임의의 효소 도메인을 상기와 같은 실시양태에 사용할 수 있다.
ArgG 활성의 적합한 수준은 서열번호 32에 의해 암호화된 단백질에 의해 제공되는 수준과 동등할 수 있다. 또는, 더 낮거나 높은 수준의 ArgG 활성을 제공하는 효소 도메인이 여전히 유리할 수 있다.
아르기노숙시네이트 리아제( ArgH ) 효소 도메인
본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ArgH 효소 도메인의 한 예는 서열번호 33에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된다.
또는, 서열번호 33에 나타낸 서열의 단편 또는 유도체를 본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ArgH 효소 도메인을 암호화하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질에 ArgH 활성을 제공하는 임의의 효소 도메인을 상기와 같은 실시양태에 사용할 수 있다.
ArgH 활성의 적합한 수준은 서열번호 33에 의해 암호화된 단백질에 의해 제공되는 수준과 동등할 수 있다. 또는, 더 낮거나 높은 수준의 ArgH 활성을 제공하는 효소 도메인이 여전히 유리할 수 있다.
오르니틴 카바모일트랜스퍼라제 ( ArgF ) 효소 도메인
본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ArgF 효소 도메인의 한 예는 서열번호 34에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된다.
또는, 서열번호 34에 나타낸 서열의 단편 또는 유도체를 본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 ArgF 효소 도메인을 암호화하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질에 ArgF 활성을 제공하는 임의의 효소 도메인을 상기와 같은 실시양태에 사용할 수 있다.
ArgF 활성의 적합한 수준은 서열번호 34에 의해 암호화된 단백질에 의해 제공되는 수준과 동등할 수 있다. 또는, 더 낮거나 높은 수준의 ArgF 활성을 제공하는 효소 도메인이 여전히 유리할 수 있다.
트립토판 또는 트립토판 전구체
본 발명은 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
트립토판(흔히 "Trp" 또는 "W"로 약칭됨)은 비-극성 아미노산이다. 트립토판은 204.2 g/몰-1의 분자질량을 가지며, 2-아미노-3-(1H-인돌-3-일)프로파노산으로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 목적에 있어서, "트립토판 전구체"는 트립토판 생성 연쇄반응에서 트립토판보다 선행하는 임의의 화합물인 것으로 간주될 수 있다.
트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인
본 발명의 단백질은 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함한다. 상기 기능을 충족시키는 도메인의 능력, 즉, 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인의 능력은 임의의 적합한 수단 또는 분석법에 의해 조사할 수 있다.
숙련가라면 그 합성이 촉진될 화합물, 예를 들어, 트립토판 또는 트립토판 전구체와 관련하여 적합한 수단 또는 분석법이 선택될 수 있음을 인지할 것이다. 단지 예로서, 상기 필요한 합성을 촉진하는 도메인의 능력을 평가하는 적합한 분석법은 본 발명의 예시적 세포의 특성화와 관련하여 실시예에서 더 기술된다.
적합하게는, 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인은 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진할 수 있는 효소 도메인일 수 있다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 효소 도메인은 전장 효소 도메인, 또는 상기 도메인이 필요한 활성을 나타내는 한 상기 도메인의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
적합한 실시양태에서, 그 합성이 촉진되는 트립토판 전구체는 인돌글리세롤 포스페이트이다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 합성을 촉진하는 도메인은 트립토판 신테타제(TRP5) 효소 도메인일 수 있다.
적합한 실시양태에서, 트립토판의 합성이 촉진된다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 합성을 촉진하는 도메인은 인돌아민 2,3-다이옥시게나제(IDO) 효소 도메인일 수 있다.
트립토판 신테타제 ( TRP5 ) 효소 도메인
본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 TRP5 효소 도메인의 한 예는 서열번호 35에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된다.
또는, 서열번호 35에 나타낸 서열의 단편 또는 유도체를 본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 TRP5 효소 도메인을 암호화하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질에 TRP5 활성을 제공하는 임의의 효소 도메인을 상기와 같은 실시양태에 사용할 수 있다.
TRP5 활성의 적합한 수준은 서열번호 35에 의해 암호화된 단백질에 의해 제공되는 수준과 동등할 수 있다. 또는, 더 낮거나 높은 수준의 TRP5 활성을 제공하는 효소 도메인이 여전히 유리할 수 있다.
인돌아민 2,3- 다이옥시게나제 (IDO) 효소 도메인
본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 IDO 효소 도메인의 한 예는 서열번호 36에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된다.
또는, 서열번호 36에 나타낸 서열의 단편 또는 유도체를 본 발명의 단백질에 혼입되기에 적합한 IDO 효소 도메인을 암호화하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질에 IDO 활성을 제공하는 임의의 효소 도메인을 상기와 같은 실시양태에 사용할 수 있다.
IDO 활성의 적합한 수준은 서열번호 36에 의해 암호화된 단백질에 의해 제공되는 수준과 동등할 수 있다. 또는, 더 낮거나 높은 수준의 IDO 활성을 제공하는 효소 도메인이 여전히 유리할 수 있다.
표적 결합 잔기
본 발명의 단백질은 표적 결합 잔기를 포함한다. 상기 표적 결합 잔기는 단백질의 결합 특이성을 제공하고, 따라서 표적 결합 잔기에 의해 인식되는 표적 분자가 발견되는 표적 구조물, 예를 들어, 세포에 대해 본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 세포파괴 활성을 제공한다.
특히, 표적 결합 잔기는, 그 치료 유용성을 뒷받침하는 본 발명의 세포의 생물 활성(예를 들어, 세포파괴 활성, 또는 활성화에 반응한 세포 증식)의 특이성을 제공한다. 맥락상 달리 요구되는 경우를 제외하고, 본 개시내용에서 특이적 결합에 대한 언급은 결합이 일어나는 환경에서 가능한 상대물들을 식별하는 표적 결합 잔기의 능력에 대한 언급으로 이해될 수 있다. 다른 잠재적 표적이 존재하는 경우 한 특정 표적 분자와 상호작용하는 표적 결합 잔기는 그것이 상호작용하는 표적 분자에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 표적 결합 잔기와 그의 표적 분자 사이의 결합 정도를 검출하거나 측정함으로써 평가된다; 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 결합 잔기-표적 분자 복합체의 해리 정도를 검출하거나 측정함으로써 평가된다; 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 그 표적 분자와 또 다른 존재 사이의 대체 상호작용과 경쟁하는 표적 결합 잔기의 능력을 검출하거나 측정함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 다양한 농도에 걸쳐 상기 검출 또는 측정을 수행함으로써 평가된다. 적합한 실시양태에서, 특이적 결합은 동족 및 비-동족 표적들 사이의 결합 친화성의 차이를 측정함으로써 평가된다. 예를 들어, 특이적인 표적 결합 잔기는 비-동족 표적에 대한 결합 친화성보다 약 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상인 동족 표적 분자에 대한 결합 친화성을 가질 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, "특이성"은 그 표적 분자 결합 상대와 다른 잠재적 결합 상대를 식별하는 특정 표적 결합 잔기의 능력의 척도이다.
적합한 표적 결합 잔기는 임의의 목적하는 표적 분자에게로 유도될 수 있다. 표적 결합 잔기는, 본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 세포파괴 활성을 유도하는 것이 바람직한 표적에 의해, 독점적으로 또는 광범위하게 발현된 표적 분자에게로 유도될 수 있다. 예를 들어, 표적 결합 잔기는 질환과 연관된 표적 분자에게로 유도될 수 있다. 적합하게는, 표적 결합 잔기는 암, 또는 감염과 연관된 표적 분자에게로 유도될 수 있다.
적합한 실시양태에서, 표적 결합 잔기는 GD2 표적 결합 잔기; CD33 표적 결합 잔기; 메소텔린 표적 결합 잔기; 및 EGFRvIII 표적 결합 잔기로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 표적 결합 잔기의 예는 서열번호 3 내지 6에 나타내었다. 단편 또는 변이체(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 잔기만큼 예시적 서열과 상이한)를, 상기 단편 또는 변이체가 표적 분자와 결합하는 능력을 유지하는 한, 대체 표적 결합 잔기로 사용할 수 있다.
제한하지 않고, 적합한 표적 결합 잔기는 항체, 또는 그의 단편(예를 들어, scFv) 또는 유도체; TCR, 예를 들어, TCRα쇄 또는 TCR β쇄; 및 압타머로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
GD2 표적 결합 잔기
GD2 표적 결합 잔기는, 강글리오시드 GD2로도 지칭될 수 있는 디시알로강글리오시드 2(GD2)에 결합할 수 있는 잔기이다. GD2 표적 결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질은 GD2 분자를 포함하는 표적, 예를 들어, GD2를 발현하는 세포에 대해 본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 세포파괴 활성을 발휘하는 것이 바람직한 상황에서 사용하기에 적합하다.
GD2는 신경아세포종, 골육종 및 흑색종을 포함하여, 신경외배엽 기원의 암에 의해 발현된다. 그러므로, GD2 표적 결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질(예를 들어, CAR)은 임의의 상기 암, 및 특히 신경아세포종의 예방 및/또는 치료를 위한 의학적 용도에 본 발명의 단백질을 사용하는 것이 바람직한 상황에서 사용하기에 적합한 것을 인지할 것이다.
본 발명에 따른 단백질에 혼입되기에 적합한 GD2 표적 결합 잔기는 항-GD2 항체, 예를 들어, 항-GD2 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 유도체일 수 있다. 예를 들어, GD2 표적 결합 잔기는 항-GD2 scFv 항체 단편일 수 있다. 단지 예로서, scFv 항체 단편을 포함하는 적합한 GD2 표적화 도메인은 서열번호 3에 나타내었다.
서열번호 3에 나타낸 상기 scFv 항체 단편은 US 9,493,740 B2 호에 기술된 바와 같이, 14g2a scFv로도 지칭된다. 상기 단편은 US 9,777,068 B2 호에 개시된 ch14.18 항체로부터 유래되며, 다른 ch14.18 항체 단편 또는 변이체들도 본 발명의 단백질에 GD2 표적 결합 잔기로 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
또는, 적합한 GD2 표적 결합 잔기는 항-GD2 압타머; 또는 그의 단편 또는 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
적합하게는, GD2 표적 결합 잔기는 GD2에 특이적으로 결합할 수 있다.
CD33 표적 결합 잔기
CD33 표적 결합 잔기는, CD33(시글렉(Siglec)-3으로도 알려져 있음)에 결합할 수 있는 잔기이다. CD33은 막관통 단백질이다. CD33 표적 결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질은 CD33 분자를 포함하는 표적, 예를 들어, CD33을 발현하는 세포에 대해 본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 세포파괴 활성을 발휘하는 것이 바람직한 상황에서 사용하기에 적합하다.
CD33은 급성 골수성 백혈병(AML) 세포에 의해 발현된다. 그러므로, CD33 표적 결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질은 AML의 예방 및/또는 치료를 위한 의학적 용도에 본 발명의 단백질을 사용하는 것이 바람직한 상황에서 사용하기에 적합한 것을 인지할 것이다.
본 발명에 따른 단백질에 혼입되기에 적합한 CD33 표적 결합 잔기는 항-CD33 항체, 예를 들어, 항-CD33 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 유도체일 수 있다. 예를 들어, CD33 표적 결합 잔기는 항-CD33 scFv 항체 단편일 수 있다. 단지 예로서, scFv 항체 단편을 포함하는 적합한 CD33 표적화 도메인은 서열번호 4에 나타내었다.
서열번호 4에 나타낸 상기 scFv 항체 단편은 인간화 my96 클론 단일클론 항체로부터 유래된다. my96 항체에 대한 세부사항은 문헌[Leukemia. 2015 Aug;29(8):1637-1647]에 개시되어 있고, 서열번호 4의 scFv 단편에 대한 세부사항은 US20160096892A1(scFv가 서열번호 147로 개시되어 있음)에 개시되어 있다. 다른 my96 항체 단편 또는 변이체들도 본 발명의 단백질에 CD33 표적 결합 잔기로 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
또는, 적합한 CD33 표적 결합 잔기는 항-CD33 압타머; 또는 그의 단편 또는 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
적합하게는, CD33 표적 결합 잔기는 CD33에 특이적으로 결합할 수 있다.
메소텔린 표적 결합 잔기
메소텔린 표적 결합 잔기는 메소텔린에 결합할 수 있는 잔기이다. 메소텔린은 MSLN의 산물인 40 kDa 단백질이다. 메소텔린 표적 결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질은 메소텔린 분자를 포함하는 표적, 예를 들어, 메소텔린을 발현하는 세포에 대해 본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 세포파괴 활성을 발휘하는 것이 바람직한 상황에서 사용하기에 적합하다.
메소텔린은 많은 상이한 유형의 암들의 세포에 의해 발현된다. 메소텔린 발현 암으로는, 예를 들어, 난소암, 폐 선암 및 췌장암과 같은 상피암이 포함된다. 그러므로, 메소텔린 표적 결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질은 임의의 메소텔린 발현 암의 예방 및/또는 치료를 위한 의학적 용도에 본 발명의 단백질을 사용하는 것이 바람직한 상황에서 사용하기에 적합한 것을 인지할 것이다.
본 발명에 따른 단백질에 혼입되기에 적합한 메소텔린 표적 결합 잔기는 항-메소텔린 항체, 예를 들어, 항-메소텔린 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 유도체일 수 있다. 예를 들어, 메소텔린 표적 결합 잔기는 항-메소텔린 scFv 항체 단편일 수 있다. 단지 예로서, scFv 항체 단편을 포함하는 적합한 메소텔린 표적화 도메인은 서열번호 5에 나타내었다.
서열번호 5에 나타낸 상기 scFv 항체 단편은 SS1 항체로부터 유래된다. 상기 항체 및 그로부터 유도된 scFv에 대한 세부사항은 WO 2015/090230 A(뮤린 SS1 scFv의 아미노산 서열이 서열번호 279에 제공되어 있음)에 개시되어 있다. 다른 SS1 항체 단편 또는 변이체들도 본 발명의 단백질에 메소텔린 표적 결합 잔기로 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
또는, 적합한 메소텔린 표적 결합 잔기는 항-메소텔린 압타머; 또는 그의 단편 또는 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
적합하게는, GD2 표적 결합 잔기는 GD2에 특이적으로 결합할 수 있다.
EGFRvIII 표적 결합 잔기
EGFRvIII 표적 결합 잔기는 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)에 결합할 수 있는 잔기이다. EGFRvIII 표적 결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질은 EGFRvIII 분자를 포함하는 표적, 예를 들어, EGFRvIII를 발현하는 세포에 대해 본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 세포파괴 활성을 발휘하는 것이 바람직한 상황에서 사용하기에 적합하다.
EGFRvIII는 다양한 상피 기원의 암에 의해 발현된다. 그러므로, EGFRvIII 표적 결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질은 EGFR을 발현하는 암, 예를 들어, 교모세포종 및 대장암의 예방 및/또는 치료를 위한 의학적 용도에 본 발명의 단백질을 사용하는 것이 바람직한 상황에서 사용하기에 적합한 것을 인지할 것이다. 특히, EGFRvIII 표적 결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질은 교모세포종의 예방 및/또는 치료에 사용하기에 적합하다.
본 발명에 따른 단백질에 혼입되기에 적합한 EGFRvIII 표적 결합 잔기는 항-EGFRvIII 항체, 예를 들어, 항-EGFRvIII 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 유도체일 수 있다. 예를 들어, EGFRvIII 표적 결합 잔기는 항-EGFRvIII scFv 항체 단편일 수 있다. 단지 예로서, scFv 항체 단편을 포함하는 적합한 EGFRvIII 표적화 도메인은 서열번호 6에 나타내었다.
서열번호 6에 나타낸 상기 scFv 항체 단편은 WO 2012/138475 A1(여기서, 139 항체의 인간 scFv는 서열번호 5로 개시되어 있고, 상기 scFv를 포함하는 CAR 구조물은 서열번호 11로 개시되어 있다)에 개시된 139 항체로부터 유래된다. 다른 139 항체 단편 또는 변이체들도 본 발명의 단백질에 메소텔린 표적 결합 잔기로 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
대체 EGFRvIII 표적 결합 잔기가 MR1 항-EGFRvIII 항체로부터 유래될 수 있다. 상기 EGFRvIII 표적 결합 잔기의 한 예는 서열번호 41의 DAN 서열에 의해 암호화된 scFv(MR1로부터 유래)이다. 상기 대체 EGFRvIII 표적 결합 잔기는 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44에 나타낸 본 발명의 예시적 단백질들에 혼입된다. 본 발명의 상기 예시적 단백질들은 실시예에 기술된 연구들에 사용되었다.
또는, 적합한 EGFRvIII 표적 결합 잔기는 항-EGFRvIII 압타머; 또는 그의 단편 또는 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
적합하게는, EGFRvIII 표적 결합 잔기는 EGFRvIII에 특이적으로 결합할 수 있다.
세포내 신호전달 영역
본 발명의 단백질은 적어도 하나의 세포내 신호전달 영역을 포함한다. 상기 세포내 신호전달 영역은 단백질을 발현하는 세포의 다른 생물 활성을 갖는 표적 분자에 상기 표적 결합 잔기를 커플 결합시키는 역할을 한다. 특히, 적합한 세포내 신호전달 영역은 상기 표적 결합 잔기를, 세포의 세포파괴 활성의 활성화 및/또는 활성화에 반응하여 증식하는 세포 능력을 갖는 그 표적 분자에 커플 결합시킬 수 있다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 적합한 세포내 신호전달 영역은 표적 결합 잔기에 표적 분자가 결합하는 것에 반응하여 세포독성 또는 특이적 세포용해 활성을 활성화시킬 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 적합한 세포내 신호전달 영역은 표적 결합 잔기에 표적 분자가 결합하는 것에 반응하여 활성화-유도된 세포 증식을 촉진할 수 있다.
적합한 실시양태에서, 세포내 신호전달 영역은 4-1BB 신호전달 영역; OX-40 신호전달 영역; CD28 신호전달 영역; ICOS 신호전달 영역; 및 CD3ζ 신호전달 영역으로 이루어진 군에서 선택된 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 단백질은 다수의 세포내 신호전달 영역을 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 적합하게는, 상기 다수는 개별적 세포내 신호전달 영역의 하나보다 많은 카피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질은 4-1BB 신호전달 영역; OX-40 신호전달 영역; CD28 신호전달 영역; ICOS 신호전달 영역; 및 CD3ζ 신호전달 영역 중 하나 이상의 다수의 카피를 포함할 수 있다.
추가로 또는 다르게는, 본 발명의 단백질은 다수의 세포내 신호전달 영역들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 단백질은 4-1BB 신호전달 영역; OX-40 신호전달 영역; CD28 신호전달 영역; ICOS 신호전달 영역; 및 CD3ζ 신호전달 영역으로 이루어진 군에서 선택된 세포내 신호전달 영역들의 조합을 포함할 수 있다. 단지 예로서, 본 발명의 단백질은 4-1BB 신호전달 영역 및 CD3ζ 신호전달 영역을 둘 다 포함할 수 있다.
적합한 4-1BB 신호전달 영역은, 세포의 활성화, 및/또는 세포의 기능, 예를 들어, 세포에 의한 사이토카인 방출 및/또는 세포에 의한 세포독성; 및/또는 세포의 증식 및/또는 지속성 중 적어도 하나를 촉진하는 상기 신호전달 영역을 포함하는 단백질을 발현하는 세포에 충분한 공자극 신호를 제공할 수 있는 영역이다. 상기 지속성은 생체내 또는 시험관내에서의 지속성일 수 있다. 지속성은, 특히, 면역억제 종양 미세환경의 조건 또는 상기 미세환경을 모방하는 조건에서 세포의 지속성일 수 있다. 예로서, 사이토카인 방출은 IFN-감마 및/또는 TNFα 및/또는 IL2로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 사이토카인을 포함할 수 있다.
적합하게는, 4-1BB 신호전달 영역은 4-1BB의 전장 서열을 포함할 수 있다. 또는, 4-1BB 신호전달 영역은 전장 서열의 절두되고/되거나 변형된 형태를 포함할 수 있다. 단지 예로서, 적합한 4-1BB 신호전달 영역은 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열 또는 상기 서열의 일부분을 포함할 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 단백질에 혼입되기 위한 4-1BB 신호전달 영역은 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
적합한 실시양태에서, OX-40 신호전달 영역은, 세포의 활성화, 및/또는 세포의 기능, 및/또는 세포의 지속성 중 적어도 하나를 촉진하는 상기 신호전달 영역을 포함하는 단백질을 발현하는 세포에 충분한 공자극 신호를 제공할 수 있는 영역이다. 상기 지속성은 생체내 또는 시험관내에서의 지속성일 수 있다. 지속성은, 특히 면역억제 종양 미세환경의 조건 또는 상기 미세환경을 모방하는 조건에서 세포의 지속성일 수 있다.
적합하게는, OX-40 신호전달 영역은 OX-40의 전장 서열을 포함할 수 있다. 또는, OX-40 신호전달 영역은 전장 서열의 절두되고/되거나 변형된 형태를 포함할 수 있다. 단지 예로서, 적합한 OX-40 신호전달 영역은 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열 또는 상기 서열의 일부분을 포함할 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 단백질에 혼입되기 위한 4-1 OX-40 BB 신호전달 영역은 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
적합한 CD28 신호전달 영역은, 세포의 활성화, 및/또는 세포의 기능, 및/또는 세포의 지속성 중 적어도 하나를 촉진하는 상기 신호전달 영역을 포함하는 단백질을 발현하는 세포에 충분한 공자극 신호를 제공할 수 있는 영역이다. 상기 지속성은 생체내 또는 시험관내에서의 지속성일 수 있다. 지속성은, 특히 면역억제 종양 미세환경의 조건 또는 상기 미세환경을 모방하는 조건에서 세포의 지속성일 수 있다.
적합하게는, CD28 신호전달 영역은 CD28의 전장 서열을 포함할 수 있다. 또는, CD28 신호전달 영역은 전장 서열의 절두되고/되거나 변형된 형태를 포함할 수 있다. 단지 예로서, 적합한 CD28 신호전달 영역은 서열번호 9에 나타낸 아미노산 서열 또는 상기 서열의 일부분을 포함할 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 단백질에 혼입되기 위한 CD28 신호전달 영역은 서열번호 9에 나타낸 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
ICOS 신호전달 영역은, 세포의 활성화, 및/또는 세포의 기능, 예를 들어, 세포에 의한 사이토카인 방출 및/또는 세포에 의한 세포독성; 및/또는 세포의 증식 및/또는 세포의 지속성 중 적어도 하나를 촉진하는 상기 신호전달 영역을 포함하는 단백질을 발현하는 세포에 충분한 공자극 신호를 제공할 수 있는 영역이다. 상기 지속성은 생체내 또는 시험관내에서의 지속성일 수 있다. 지속성은, 특히 면역억제 종양 미세환경의 조건 또는 상기 미세환경을 모방하는 조건에서 세포의 지속성일 수 있다.
적합하게는, ICOS 신호전달 영역은 ICOS(CD278로도 알려져 있음)의 전장 서열을 포함할 수 있다. 또는, ICOS 신호전달 영역은 전장 서열의 절두되고/되거나 변형된 형태를 포함할 수 있다. 단지 예로서, 적합한 ICOS 신호전달 영역은 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열 또는 상기 서열의 일부분을 포함할 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 단백질에 혼입되기 위한 ICOS 신호전달 영역은 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. ICOS의 절두되거나 변형된 형태는 적어도 전장 ICOS 단백질의 잔기 180 내지 183에서 발견된 YMFM 모티프를 포함할 수 있다.
적합한 CD3ζ 신호전달 영역은 T 세포내에서의 기능성 반응(예를 들어, 사이토카인 방출(예, 인터페론-감마, TNFα 및/또는 IL2), 세포독성 및/또는 증식)을 활성화할 수 있는 영역이다.
적합하게는, CD3ζ 신호전달 영역은 CD3ζ의 전장 서열을 포함할 수 있다. 또는, CD3ζ 신호전달 영역은 전장 서열의 절두되고/되거나 변형된 형태를 포함할 수 있다. 단지 예로서, 적합한 CD3ζ 신호전달 영역은 서열번호 11 또는 서열번호 40에 나타낸 아미노산 서열 또는 상기 서열의 일부분을 포함할 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 단백질에 혼입되기 위한 CD3ζ 신호전달 영역은 서열번호 11 또는 서열번호 40에 나타낸 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
GD2를 표적화하는 본 발명의 단백질
GD2를 표적화하는 본 발명의 단백질은 적합한 세포내 신호전달 영역(예를 들어, 4-1BB 세포내 신호전달 영역 및 CD3ζ 세포내 신호전달 영역)과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함할 수 있다. 상기 단백질은 ASS-1 도메인; 및/또는 OTC 도메인; 및/또는 ASL 도메인; 및/또는 OCD1 도메인; 및/또는 ArgG 도메인; 및/또는 ArgH 도메인; 및/또는 ArgF 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 적합하게는, 상기 단백질은 ASS-1 도메인; 및/또는 OTC 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질이 그 치료적 유용성을 보여주는 많은 성질과 관련하여 특히 유용함을 밝혀내었다.
예를 들어, 본 발명자들은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 선행 기술에서 공지된 GD2 CAR-T 세포에 비해 필적하거나 개선된 생존율을 나타냄을 밝혀내었다.
유리하게, 본 발명자들은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 필적하는 대조군 CAR-T 세포에 비해 증가된 지속성을 나타낼 수 있음을 밝혀내었다. ASS-1 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 대조군 세포에 비해 특히 유리한 증가된 지속성을 나타낸다.
본 발명자들은 또한 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 종양 미세환경을 나타내는 조건(예를 들어, 실험적으로 아르기닌-고갈 조건)에서 대조군 CAR-T 세포에 비해 증가된 증식을 나타낼 수 있음을 밝혀내었다.
특히, OTC 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 종양 미세환경을 나타내는 조건, 예를 들어, 아르기닌-고갈 조건에서 대조군 세포에 비해 증가된 증식을 나타낼 수 있다. 놀랍게도, ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 종양 미세환경을 나타내는 조건, 예를 들어, 아르기닌-고갈 조건에서 대조군 세포에 비해 증식에 훨씬 더 큰 증가를 나타낼 수 있다.
실시예에 나타낸 바와 같이, OTC 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 아르기닌-고갈 조건과 같은 종양 미세환경의 조건에서 대조군 세포에 비해 증식에 5배 증가를 나타낼 수 있다.
훨씬 더 놀랍게, ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 아르기닌-고갈 조건과 같은 종양 미세환경의 조건에서 대조군 세포에 비해 증식에 10배 증가를 나타낼 수 있다.
본 발명자들은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 암세포와 관련하여 세포파괴 활성을 나타냄을 밝혀내었다. 단지 예로서, 본 발명자들은 ASS-1 도메인 또는 OTC 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 선행 기술에서 공지된 GD2 CAR-T 세포에 필적하는 특이적 세포파괴 활성을 나타낼 수 있음을 입증하였다.
유리하게, ASS-1 도메인 또는 OTC 도메인과 함께 GD2 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 증가된 지속성 및 증식에 더하여, 생체내 암 모델에서 수용체의 생존을 개선시키는 세포파괴 활성을 나타낼 수 있다.
상기 이점들은 본 명세서의 실시예 부분에서 더 논의된다.
GD2를 표적화하는 본 발명의 예시적 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 12 내지 14에 나타내었다. 본 발명은 상기 특정 단백질들을 포함할 뿐 아니라, 상기 예시적 단백질들의 생물 활성(특히 세포파괴 활성 및 단백질 결합에 반응하여 증식을 촉진하는 능력)을 공유하는 상기 단백질들의 변이체들을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 상기 변이체들은 서열번호 12 내지 14의 단백질들 중 임의의 단백질과 적어도 80% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 적합하게는, 상기 변이체들은 서열번호 12 내지 14의 단백질들 중 임의의 단백질과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유할 수 있다.
메소텔린을 표적화하는 본 발명의 단백질
메소텔린을 표적화하는 본 발명의 단백질은 적합한 세포내 신호전달 영역(예를 들어, 4-1BB 세포내 신호전달 영역 및 CD3ζ 세포내 신호전달 영역)과 함께, 항-메소텔린 SS1 항체로부터 유래된 메소텔린 표적화 잔기를 포함할 수 있다. 상기 단백질은 ASS-1 도메인; 및/또는 OTC 도메인; 및/또는 ASL 도메인; 및/또는 OCD1 도메인; 및/또는 ArgG 도메인; 및/또는 ArgH 도메인; 및/또는 ArgF 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 적합하게는, 상기 단백질은 ASS-1 도메인; 및/또는 OTC 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 메소텔린 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질이 그 치료적 유용성을 보여주는 많은 성질과 관련하여 특히 유용함을 밝혀내었다.
예를 들어, 본 발명자들은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 메소텔린 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 선행 기술에서 공지된 메소텔린 CAR-T 세포에 비해 필적하거나 개선된 생존율을 나타냄을 밝혀내었다.
유리하게, 본 발명자들은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 메소텔린 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 종양 미세환경을 나타내는 조건(예를 들어, 실험적으로 아르기닌-고갈 조건)에서 대조군 CAR-T 세포에 비해 증가된 증식을 나타낼 수 있음을 밝혀내었다.
OTC 도메인과 함께 메소텔린 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 종양 미세환경을 나타내는 조건, 예를 들어, 아르기닌-고갈 조건에서 대조군 세포에 비해 특히 증가된 증식을 나타낸다. 실시예에 예시된 바와 같이, 상기 증식의 특별한 증가는 OTC 도메인을 단독으로 또는 ASS-1 도메인과 함께 포함하는 본 발명의 단백질에 의해 입증된다. OTC 도메인과 함께 메소텔린 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 종양 미세환경에서 발견되는 조건들을 모방하는 조건에서 대조군 세포에 비해 증식에 약 4배 증가를 나타냄을 볼 수 있다.
실시예에 나타낸 바와 같이, ASS-1 도메인 및 OTC 도메인과 함께 메소텔린 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 아르기닌-고갈 조건과 같은 종양 미세환경의 조건에서 대조군 세포에 비해 증식에 3배보다 많은 증가를 나타낼 수 있다.
상기 이점들은 본 명세서의 실시예 부분에서 더 논의된다.
메소텔린을 표적화하는 본 발명의 예시적 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 15 내지 17에 나타내었다. 본 발명은 상기 특정 단백질들을 포함할 뿐 아니라, 상기 예시적 단백질들의 생물 활성(특히 세포파괴 활성 및 단백질 결합에 반응하여 증식을 촉진하는 능력)을 공유하는 상기 단백질들의 변이체들을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 상기 변이체들은 서열번호 15 내지 17의 단백질들 중 임의의 단백질과 적어도 80% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 적합하게는, 상기 변이체들은 서열번호 15 내지 17의 단백질들 중 임의의 단백질과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유할 수 있다.
CD33을 표적화하는 본 발명의 단백질
CD33을 표적화하는 본 발명의 단백질은 적합한 세포내 신호전달 영역(예를 들어, 4-1BB 세포내 신호전달 영역 및 CD3ζ 세포내 신호전달 영역)과 함께, 항-CD33 my96 항체로부터 유래된 CD33 표적화 잔기를 포함할 수 있다. 상기 단백질은 ASS-1 도메인; 및/또는 OTC 도메인; 및/또는 ASL 도메인; 및/또는 OCD1 도메인; 및/또는 ArgG 도메인; 및/또는 ArgH 도메인; 및/또는 ArgF 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 적합하게는, 상기 단백질은 ASS-1 도메인; 및/또는 OTC 도메인을 포함할 수 있다.
ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질은 그 치료적 유용성을 보여주는 많은 성질과 관련하여 특히 유용하다.
예를 들어, 본 발명자들은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 선행 기술에서 공지된 CD33 CAR-T 세포에 비해 필적하거나 개선된 생존율을 나타냄을 밝혀내었다.
유리하게, 본 발명자들은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 필적하는 대조군 CAR-T 세포에 비해 증가된 지속성을 나타낼 수 있음을 밝혀내었다. ASS-1 도메인과 함께 CD33 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 대조군 세포에 비해 특히 유리한 증가된 지속성을 나타낸다.
본 발명자들은 또한 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 종양 미세환경을 나타내는 조건(예를 들어, 실험적으로 아르기닌-고갈 조건)에서 대조군 CAR-T 세포에 비해 증가된 증식을 나타낼 수 있음을 밝혀내었다.
OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 종양 미세환경을 나타내는 조건, 예를 들어, 아르기닌-고갈 조건에서 대조군 세포에 비해 상당히 증가된 증식을 나타낸다. 본 발명자들은 또한 ASS-1 도메인 및 OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 종양 미세환경을 나타내는 조건에서 대조군 세포에 비해 증식에 훨씬 더 큰 증가를 나타냄을 밝혀내었다.
실시예에 나타낸 바와 같이, OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 종양 미세환경을 나타내는 조건에서 대조군 세포에 비해 증식에 5배보다 많은 증가를 나타낸다. 훨씬 더 유리하게, ASS-1 도메인 및 OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 동일한 조건하에서 대조군 세포에 비해 증식에 약 6배 증가를 나타낸다.
본 발명자들은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 암 세포와 관련하여 선행 기술에서 공지된 CD33 CAR-T 세포에 필적하는 세포파괴 활성을 나타냄을 밝혀내었다.
유리하게, ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포는 증가된 지속성 및 증식에 더하여, 생체내 암 모델에서 수용체의 생존을 개선시키는 세포파괴 활성을 나타낼 수 있다.
상기 이점들은 본 명세서의 실시예 부분에서 더 논의된다.
CD33을 표적화하는 본 발명의 예시적 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 18 내지 20에 나타내었다. 본 발명은 상기 특정 단백질들을 포함할 뿐 아니라, 상기 예시적 단백질들의 생물 활성(특히 세포파괴 활성 및 단백질 결합에 반응하여 증식을 촉진하는 능력)을 공유하는 상기 단백질들의 변이체들을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 상기 변이체들은 서열번호 18 내지 20의 단백질들 중 임의의 단백질과 적어도 80% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 적합하게는, 상기 변이체들은 서열번호 18 내지 20의 단백질들 중 임의의 단백질과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유할 수 있다.
EGFRvIII를 표적화하는 본 발명의 단백질
EGFRvIII를 표적화하는 본 발명의 단백질은 적합한 세포내 신호전달 영역(예를 들어, 4-1BB 세포내 신호전달 영역 및 CD3ζ 세포내 신호전달 영역)과 함께, 항-EGFRvIII 139 항체로부터 유래된 EGFRvIII 표적화 잔기를 포함할 수 있다. 상기 단백질은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인; 및/또는 ASL 도메인; 및/또는 OCD1 도메인; 및/또는 ArgG 도메인; 및/또는 ArgH 도메인; 및/또는 ArgF 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 상기 단백질은 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명자들의 결과는 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인과 함께 EGFRvIII 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 선행 기술에서 공지된 EGFRvIII CAR-T 세포에 비해 필적하거나 개선된 생존율을 나타냄을 입증한다.
본 발명자들은 ASS-1 도메인과 함께 EGFRvIII 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포가 종양 미세환경을 나타내는 조건(예를 들어, 실험적으로 아르기닌-고갈 조건)에서 대조군 CAR-T 세포에 비해 증가된 증식을 나타냄을 밝혀내었다. ASS-1 도메인과 함께 EGFRvIII 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 상기 세포는 상기와 같은 조건에서 대조군 세포에 비해 증식에 2배보다 많은 증가를 나타낸다.
상기 이점들은 본 명세서의 실시예 부분에서 더 논의된다.
EGFRvIII를 표적화하는 본 발명의 예시적 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 21 내지 23에 나타내었다. 본 발명은 상기 특정 단백질들을 포함할 뿐 아니라, 상기 예시적 단백질들의 생물 활성(특히 세포파괴 활성 및 단백질 결합에 반응하여 증식을 촉진하는 능력)을 공유하는 상기 단백질들의 변이체들을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 상기 변이체들은 서열번호 21 내지 23의 단백질들 중 임의의 단백질과 적어도 80% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 적합하게는, 상기 변이체들은 서열번호 21 내지 23의 단백질들 중 임의의 단백질과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유할 수 있다.
본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산
본 발명의 세 번째 양태는 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다. 상기 단백질은 본원에 기술된 본 발명의 임의의 양태 또는 실시양태에 따를 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 따른 핵산은 DNA를 포함한다. 적합한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 RNA를 포함한다. 적합한 핵산은 필수적으로 DNA로 이루어질 수 있거나, 필수적으로 RNA로 이루어질 수 있거나, DNA와 RNA의 조합을 포함할 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산의 예들은 서열번호 37 내지 39에 나타내었다. 상기 핵산 서열들은 다음과 같이 명세서에 나타낸 예시적 단백질들을 암호화하는 DNA 분자들이다:
Figure pct00001
코돈 축중은 본 발명의 해당 단일 단백질을 암호화하는 본 발명의 핵산의 서열들에 현저한 차이가 있을 수 있음을 의미함을 인지할 것이다.
단지 예로서, 본 발명의 적합한 핵산은 서열번호 37 내지 39에 나타낸 본 발명의 예시적 핵산들 중 하나와 적어도 70% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 본 발명의 적합한 핵산은 서열번호 37 내지 39에 나타낸 본 발명의 예시적 핵산들 중 하나와 적어도 75% 서열 동일성; 적어도 80% 서열 동일성; 적어도 85% 서열 동일성; 적어도 90% 서열 동일성; 적어도 95% 서열 동일성; 적어도 96% 서열 동일성; 적어도 97% 서열 동일성; 적어도 98% 서열 동일성; 또는 심지어 99% 이상의 서열 동일성을 공유할 수 있다.
메소텔린을 표적화하는 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 서열은, 표적 결합 잔기를 암호화하는 핵산 서열들 중 일부가 서열번호 28의 핵산 서열로 대체되는 것을 제외하고, 서열번호 37, 38 또는 39 중 어느 하나의 핵산 서열과 동일한 것일 수 있다.
CD33을 표적화하는 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 서열은, 표적 결합 잔기를 암호화하는 핵산 서열들 중 일부가 서열번호 27의 핵산 서열로 대체되는 것을 제외하고, 서열번호 37, 38 또는 39 중 어느 하나의 핵산 서열과 동일한 것일 수 있다.
EGFRvIII를 표적화하는 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 서열은, 표적 결합 잔기를 암호화하는 핵산 서열들 중 일부가 서열번호 29의 핵산 서열로 대체되는 것을 제외하고, 서열번호 37, 38 또는 39 중 어느 하나의 핵산 서열과 동일한 것일 수 있다.
본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산은 벡터의 형태로 제공될 수 있다. 적합하게는, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포손일 수 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 접근방법은 둘 다 본 발명의 세포 생산에 성공적으로 사용되었다.
본 발명의 세포의 성공적인 렌티바이러스 생산에 사용된 구조물들에 대한 세부사항은 도 14에 나타내었다. 상기 구조물들은 본 발명의 핵산의 추가의 예를 제공한다.
본 발명의 세포
본 발명의 두 번째 양태는 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 단백질을 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 상기 단백질을 발현할 수 있다. 상기 단백질은 본원에 기술된 본 발명의 첫 번째 양태의 임의의 실시양태에 따를 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 두 번째 양태에 따른 세포는 세포-매개 면역 반응을 발휘할 수 있는 세포일 수 있다. 적합한 세포는, 예를 들어, 세포독성 작용에 의해 또는 특이적 세포 용해를 유도함으로써 세포파괴 활성을 발휘할 수 있다. 또한, 적합한 세포는 단백질의 그 상응하는 표적 분자에 대한 결합에 반응하여 증식할 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 두 번째 양태에 따른 세포는 T 세포; 및 자연 살해(NK) 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
적합하게는, T 세포는 비-변이 자연 살해 T 세포(iNKT); 자연 살해 T 세포(NKT); 감마 델타 T 세포(gd T 세포); 알파 베타 T 세포(ab T 세포); 효과기 T 세포; 및 기억 T 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
적합하게는, T 세포는 CD4+ 림프구; 및 CD8+ 림프구로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 세포는 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상으로부터 수득될 수 있다. 상기 세포는 상기 대상으로부터의 샘플로부터 취할 수 있다.
또는, 상기 세포는 건강한 공여 대상(본 개시내용의 목적을 위해 본 발명의 단백질 또는 세포로 치료될 질환에 걸리지 않은 대상으로 간주됨)으로부터 취할 수 있다.
적합한 세포는 또한 세포주들의 세포를 포함할 수 있음을 인지할 것이다.
인간 세포의 수집, 및 본 발명의 단백질과 같은 단백질에 의한 그의 형질전환을 위한 표준 기법들은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 인간 T 세포의 레트로바이러스 형질도입, 형질도입 효율 측정, 및 자기 활성화 세포 분류에 의한 형질도입 T 세포의 분류에 바람직한 기법들은 실시예에서 더 기술된다.
본 발명 세포의 생물 활성
본 발명의 단백질을 포함하는 본 발명의 세포는 질환의 예방 및/또는 치료와 같은 용도에서 유리한 다수의 활성을 나타낸다.
상기 생물 활성들은, 본 발명의 세포로 하여금 선행 기술의 CAR-발현 세포의 경우에서보다 더 오래 그 치료 효과를 발휘하게 할 수 있는 세포파괴 활성(본 발명의 세포가 그 치료 효과를 발휘할 수 있는 수단을 나타냄) 및 증식(예를 들어, 활성화에 반응하여) 및 생체내 지속성과 같은 활성과 관련하여 더 고려될 수 있다.
상기 각각의 생물 활성들은 하기에서 더 기술한다. 본 발명의 단백질 및 세포에 의해 제공되는 이점들은 주로 상기 생물 활성들의 조합의 결과로 비롯됨을 인지할 것이다.
본 발명 세포의 생물 활성은 적합한 비교 세포를 참고로 하여 측정될 수 있다. 적합한 비교 세포의 예로는 단백질로 형질도입되지 않은 본 발명의 세포와 동일한 유형의 세포, 또는 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하지 않는 단백질로 형질도입된 본 발명의 세포와 동일한 유형의 세포가 포함된다.
본 발명 세포의 세포파괴 활성
본 발명의 목적에 있어서, 세포파괴 활성은 본 발명의 세포(예를 들어, 본 발명의 단백질을 발현하는 세포)가 다른 세포를 사멸시키는 임의의 활성을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 예로서, 다른 세포의 사멸은 본 발명 세포의 세포독성 작용에 의해, 또는 본 발명 세포에 의해 매개된 특이적 세포 용해에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 세포는 본 발명의 단백질의 표적 결합 잔기에 의해 결합된 표적 분자를 포함하는 표적 구조물에 대해 그의 세포파괴 활성을 발휘한다.
바람직하게, 본 발명 세포의 세포파괴 활성에 의해 사멸된 세포는 질환과 연관된 세포이다. 적합하게는, 질환과 연관된 세포는 암세포 또는 감염된 세포일 수 있다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 세포(본 발명의 단백질을 포함하는)가 본 발명 단백질의 표적 결합 잔기에 의해 결합된 표적 분자를 발현하는 세포에 대해 특이적으로 유도되는 세포파괴 활성을 나타냄을 입증하였다. 본 발명의 세포에 대해 관찰된 세포파괴 활성의 정도는 선행 기술에서 기술된 단백질 발현 세포의 상기 활성 정도와 대략 비슷하다. 그러나, 본 발명의 세포에 의해 나타난, 개선된 증식 및/또는 지속성과 상기 유지된 세포파괴 활성의 조합은 선행 기술의 세포에 대해 주목되지 않은 이점들을 제공한다.
숙련가라면 본 발명의 세포 또는 적합한 비교 세포의, 세포파괴 활성이든 또는 특이적 세포 용해이든 세포파괴 활성을 평가할 수 있는 많은 적합한 분석법들을 알 것이다. 단지 예로서, 적합한 분석법들이 실시예에 기술되어 있으며, 여기서 상기 분석법들은 본 발명의 예시적 세포들의 특성화에 이용된다.
전문 독자라면 실시예에 나타낸 정보를 고려하여 본 발명의 세포가 본 명세서에 기술된 방식으로 질환의 예방 및/또는 치료에 치료적으로 사용하기에 적합하게 하는 세포파괴 활성을 나타냄을 인지할 것이다.
본 발명 세포의 지속성
치료 효과를 발휘하는 세포의 생체내 및 특히 대상내에서의 지속성은 질환의 효과적인 예방 및/또는 치료를 위해 중요하다. 앞에서 언급했듯이, 신경아세포종과 같은 종양 주변의 미세환경은 CAR T 세포와 같은 치료 세포에 특히 손상을 가한다. 상기 미세환경의 효과, 및 치료 세포가 상기 환경내에서 지속하지 못하는 상태는 많은 선행 기술의 치료와 관련하여 관찰된 실패들에 상당히 기여한 것으로 생각된다.
본 발명의 단백질을 포함하는 본 발명의 세포는 종양 미세환경에서 증가된 지속성을 나타낸다. 실시예에서 입증되는 상기 증가된 생체내 지속성은 본 발명 세포의 치료 효과가 선행 기술의 세포에 비해 연장되고 따라서 그 치료적 유용성이 증가될 수 있는 메카니즘을 나타낸다.
본 발명의 세포 또는 적합한 비교 세포의 지속성은 실험적으로 많은 상이한 방법들에 의해 평가될 수 있다. 단지 예로서, 세포 지속성은 해당 기간후에 수용체내에서 생존하여 유지되는, 원래 투여된 세포의 백분율과 관련하여 정의될 수 있다. 2개 이상의 세포 집단(예를 들어, 본 발명 세포의 집단 및 적합한 비교 세포의 집단) 사이에 유용한 비교가, 경과 시간이 각각의 세포 집단에 대해 대략 동일하다면, 임의의 해당 기간후에 이루어질 수 있음을 인지할 것이다. 즉, 본 발명자들은, 예를 들어, 실시예에 나타낸 바와 같이 본 발명의 세포 5x106 세포가 이식된 NOG-SCID 마우스의 경우에서, 세포 투여 17일 후에 이루어진 비교가 상기 계산에 적절함을 밝혀내었다. 관심있는 특정 실험 모델과 관련하여 다른 시점들을 이용할 수 있으며 세포에서의 지속성을 측정하는 다른 방법들이 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있음을 인지할 것이다.
일정 기간후에 지속되는 본 발명 세포의 비율은 적합한 비교 세포의 상기 비율보다 적어도 5% 더 높을 수 있다. 실제로, 지속되는 본 발명 세포의 비율은 적합한 비교 세포의 상기 비율보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 더 높울 수 있다. 일정 기간후에 지속되는 본 발명 세포의 비율은 적합한 비교 세포의 상기 비율보다 적어도 100% 이상 더 높을 수 있다.
일정 기간후에 지속되는 본 발명 세포의 비율은 원래 투여된 본 발명 세포의 총수의 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 40% 이하, 45% 이하, 50% 이하, 55% 이하, 60% 이하, 65% 이하, 70% 이하, 75% 이하, 80% 이하, 85% 이하, 90% 이하, 95% 이하, 또는 심지어 100% 이하일 수 있다.
본 발명의 세포는 적합한 비교 세포보다 더 오랜 기간동안 수용체내에서 지속될 수 있다. 본 발명의 세포는 적합한 비교 세포보다 5%까지 더 오래 수용체에서 지속될 수 있다. 본 발명의 세포는 적합한 비교 세포보다 10%까지 더 오래, 15%까지, 20%까지, 25%까지, 30%까지, 35%까지, 40%까지, 45%까지, 50%까지, 55%까지, 60%까지, 65%까지, 70%까지, 75%까지, 80%까지, 85%까지, 90%까지, 95%까지, 또는 심지어 100%까지 더 오래 수용체에서 지속할 수 있다.
본 발명의 세포와 같은 세포의 지속성을 평가할 수 있는 또 다른 방법은 세포가 수용체에서 생존하여 유지되는 시간 길이와 관련된 것이다. 적합하게는, 본 발명의 단백질을 포함하는 본 발명의 세포는 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 15일, 적어도 20일, 적어도 25일, 적어도 30일, 적어도 35일, 적어도 40일, 적어도 45일, 적어도 50일, 적어도 55일, 적어도 60일, 적어도 65일, 적어도 70일, 적어도 75일, 적어도 80일, 적어도 85일, 적어도 90일, 적어도 95일, 또는 적어도 100일 이상동안 수용체에서 생존한 채 유지될 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 단백질을 포함하는 본 발명의 세포는 적어도 150일, 적어도 200일, 적어도 250일, 적어도 300일, 또는 적어도 350일 이상동안 수용체에서 생존한 채 유지될 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 단백질을 포함하는 본 발명의 세포는 적어도 6 개월, 적어도 9 개월, 적어도 12 개월, 적어도 15 개월, 적어도 18 개월, 적어도 21 개월, 적어도 24 개월 이상동안 수용체에서 생존한 채 유지될 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 단백질을 포함하는 본 발명의 세포는 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년, 적어도 5년, 적어도 6년, 적어도 7년, 적어도 8년, 적어도 9년, 또는 적어도 10년 이상동안 수용체에서 생존한 채 유지될 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 단백질을 포함하는 본 발명의 세포는 적어도 10년, 적어도 15년, 적어도 20년, 적어도 25년, 적어도 30년, 적어도 35년, 적어도 40년, 적어도 45년, 적어도 50년 이상동안 수용체에서 생존한 채 유지될 수 있다.
본 발명 세포의 증식
상응하는 표적 분자에 대한 단백질의 결합을 통한 본 발명 세포의 활성화는 세포 증식을 유도한다. 이에 의해 치료 활성을 발휘할 수 있는 증가된 수의 세포 생산이 가능하게 된다. 그러나, 상기 세포 증식은 통상적으로 종양 미세환경에서 억제되며, 이것은 선행 기술에서 개시된 CAR T 세포 치료의 실패에 기여하였다.
본 발명의 세포는 선행 기술의 CAR T 세포와 관련하여 관찰된 것에 비해 현저히 개선된, 아르기닌-고갈 종양 미세환경내에서의 증식 능력을 나타낸다. 세포 증식은 종양 미세환경내에서 그의 치료적 세포파괴 활성을 나타낼 수 있는 본 발명의 세포 집단의 증식을 야기하므로, 상기 세포 증식은 매우 유리하다.
본 발명의 세포와 같은 세포의 증식은 실험적으로 많은 방법으로 평가될 수 있다. 단지 예로서, 세포 증식은 종양 미세환경을 모방한 조건에서 평가될 수 있다. 상기 조건은, 예를 들어, 종양 세포로 조정함으로써 아르기닌과 관련하여 고갈된 배양 배지의 사용을 포함할 수 있다. 상기와 같은 조건에서, 본 발명의 세포는, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 5% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 10% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 15% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 20% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 25% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 30% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 35% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 40% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 45% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 50% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 55% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 60% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 65% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 70% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 75% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 80% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 85% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 90% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 95% 더 높은 증식 속도를 나타낼 수 있다. 실제로, 본 발명의 세포는 동일한 실험 조건에서 적합한 비교 세포의 증식 속도보다 적어도 100% 이상 더 높은 증식 속도를 나타낼 수 있다.
또는, 세포의 증식은, 동일한 조건하에서 존재하는 비교 세포의 수와 비교하여 투여로부터 일정 기간후에 수용체에 존재하는 세포의 수와 관련하여 평가할 수 있다. 해당 시간 후에 수용체에 존재하는 본 발명의 세포의 수는, 본 발명의 세포 및 비교 세포가 둘 다 대략 동일한 양으로 투여되는 경우, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 5% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 10% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 15% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 20% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 25% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 30% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 35% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 40% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 45% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 50% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 55% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 60% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 65% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 70% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 75% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 80% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 85% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 90% 더 높거나, 적합한 비교 세포의 수보다 적어도 95% 더 높을 수 있다.
의학적 용도 및 치료 방법
본 발명의 단백질은, 특히 상기 단백질을 발현하는 본 발명의 두 번째 양태의 세포 형태로, 의학적 용도에 적절하다, 즉, 질환의 예방 및/또는 치료에 약제로 사용하기에 적절하다. 상기 의학적 용도는 본 발명의 다섯 번째, 여섯 번째 및 일곱 번째 양태의 주제이다.
질환의 예방은 대상이 아직 질환이 발생되지는 않았지만 앞으로 질환이 발생할 위험이 있는 것으로 확인된 경우에 필요할 수 있다. 적합하게는 상기 확인은 대상 또는 그 가족의 병력, 대상 또는 그 가족의 유전자 검사 결과, 또는 알고 있는 질환 유발 요인들에 노출 위험과 같은 세부사항을 기반으로 할 수 있다. 암의 경우, 예방은 전암성 질환의 증상 또는 특징을 나타내는 대상의 경우에서 바람직할 수 있다.
질환의 치료는 일단 대상이 이미 질환이 발생된 것으로 확인되면 필요할 수 있다. 확인시에 질환의 발생 단계는 유증상 또는 무증상일 수 있다. 상기 확인은 대상의 임상 평가, 대상이 나타내는 증상, 또는 대상에 의해 제공된 샘플(예를 들어, 악성종양, 감염원 또는 다른 병리학 지표의 존재를 확인할 수 있게 하는 생검물, 혈액 샘플 등)의 분석을 기반으로 할 수 있다.
본 발명의 여덟 번째 양태는 대상에게 본 발명의 단백질을 제공하는 것을 포함하는, 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에서 상기 질환을 예방하고/하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 치료 효과량으로 제공된다. 상기 치료 효과량은 본 발명의 단백질의 단일 제공에 의해, 또는 본 발명 단백질의 다수 제공을 통해 점증적으로 달성될 수 있다.
본 발명의 단백질은 적합하게는 대상에게 직접 또는 간접적으로 제공될 수 있다. 직접적인 제공은 특히 단백질을 발현하는 세포의 형태로 상기 단백질을 대상에게 투여하는 것을 의미한다. 간접적 제공은 대상이 본 발명의 단백질을 발현하도록 유도하는 것을 의미한다. 본 발명의 단백질은 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 단백질을 암호화하는 본 발명의 세번 째 양태의 핵산을 투여함으로써 대상에게 간접적으로 제공될 수 있음을 인지할 것이다.
단백질을 포함하는 세포는 암, 자가면역 질환 및 바이러스 감염과 같은 감염에 의해 야기된 질환을 포함하는 광범위한 질환들의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 적합하게는, 상기 질환은 본 발명의 단백질, 세포, 핵산 또는 약학 조성물을 사용하는 치료 방법을 의학적으로 이용하여 예방되고/되거나 치료될 수 있다.
암의 예방 및/또는 치료
특히, 본 발명의 단백질, 세포, 핵산 또는 약학 조성물은 암의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 아르기닌-고갈 종양 미세환경에서 기능하고 지속되고 증식하는 본 발명 세포의 능력이 특히 유리한 것이 상기 용도에서이다.
본 발명의 단백질, 세포, 핵산 또는 약학 조성물을 사용하는 치료 방법을 의학적으로 이용하여 예방되고/되거나 치료될 수 있는 암의 적합한 예로는 신경아세포종; 중피종; 난소암; 유방암; 결장암; 수모세포종; 췌장암; 전립선암; 고환암; 급성 골수성 백혈병; 교모세포종; 골육종; 및 흑색종으로 이루어진 군에서 선택된 암들이 포함된다.
약학 조성물 및 제형
본 발명은 또한 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 해당 용량 또는 그의 분획으로 투여하기 위한 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을 포함하는 단위 용량 형태 조성물과 같은 약학 조성물 및 제형을 제공한다. 상기 약학 조성물 및 제형은 일반적으로 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
용어 "약학적 제형"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하는 형태이면서 제형이 투여되는 대상에게 허용되지 않게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 대상에게 무독성인, 활성 성분이외의 다른, 약학 제형내 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 담체의 선택은 부분적으로 본 발명의 특정 단백질, 세포 또는 핵산에 의해서 및/또는 투여 방법에 의해서 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형들이 존재한다. 예를 들어, 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는, 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 나트륨 벤조에이트 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 2개 이상의 보존제들의 혼합물을 사용한다. 보존제 또는 그의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 약 0.0001 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed. (1980)]에 기술되어 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에게 무독성이고, 다음을 포함하나 이로 한정되지는 않는다: 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착체(예, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG).
완충제는 본 발명 조성물의 일부 실시양태에 포함된다. 적합한 완충제로는, 예를 들어, 시트르산, 나트륨 시트레이트, 인산, 인산칼륨 및 다양한 다른 산 및 염들이 포함된다. 일부 양태에서, 2개 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 그의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 약 0.001 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여가능한 약학 조성물을 제조하는 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed.(May 1, 2005)]에 보다 상세히 기술되어 있다.
제형은 수용액을 포함할 수 있다. 제형 또는 조성물은 또한 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산으로 치료되는 특정한 적응증, 질환 또는 병태에 유용한 하나보다 많은 활성 성분, 바람직하게는 각각의 활성이 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 경우에 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산에 상보적인 활성을 갖는 활성 성분을 함유할 수 있다. 상기 활성 성분들은 적합하게는 의도한 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 다른 약학적으로 활성인 약제 또는 약물, 예를 들어, 화학치료제, 예를 들어, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 및/또는 빈크리스틴을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서 약학 조성물은 본 발명의 CAR, 세포 또는 핵산을 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기에 효과적인 양으로, 예를 들어, 치료 효과량 또는 예방 효과량으로 함유한다. 일부 실시양태에서 치료 또는 예방 효능은 치료되는 대상의 주기적 평가에 의해 모니터링된다. 목적하는 투여량은 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 단일 볼루스 투여에 의해, 상기 단백질, 세포 또는 핵산의 다중 볼루스 투여에 의해, 또는 상기 단백질, 세포 또는 핵산의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
상기 조성물은 표준 투여 기법, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 세포의 투여는 자기유래성 또는 이종유래성일 수 있다. 예를 들어, 면역응답 세포 또는 전구세포는 하나의 대상으로부터 수득되고, 동일한 대상 또는 상이한 양립가능한 대상에게 투여될 수 있다. 면역응답 세포 또는 그 자손세포로부터 수득된(예를 들어, 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 수득된) 말초혈은 카테터 투여, 전신 주입, 국소 주사, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 포함한 국소 주입을 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예를 들어, 유전자 변형된 면역응답 세포를 함유하는 약학 조성물)을 투여할 때, 상기 조성물은 일반적으로 단위 투여량의 주사가능한 형태(용액, 현탁액, 유화액)로 제형화될 것이다.
제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 구강, 설하 또는 좌약 투여용 제형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 비경구 투여된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의해 말초 전신 전달을 이용하여 대상에게 투여된다.
일부 실시양태에서 조성물은 멸균 액체 제제, 예를 들어, 일부 양태에서 선택된 pH로 완충될 수 있는, 등장성 수용액, 현탁액, 유화액, 분산액 또는 점성 조성물로 제공된다. 액체 제제는 통상적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기에 더 용이하다. 또한, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기에 다소 더 편리하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특정 조적에 더 긴 접촉 기간을 제공하도록 적절한 점도 범위내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 담체를 포함할 수 있으며, 상기 담체는, 예를 들어, 물, 식염수, 포스페이트 완충된 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
멸균 주사 용액은 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을 용매에, 예를 들어, 적합한 담체, 희석제 또는 부형제, 예를 들어, 멸균수, 생리 식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물중에 혼입시켜 제조할 수 있다. 조성물은, 투여 경로 및 목적하는 제제에 따라서, 보조 물질, 예를 들어, 습윤제, 분산제 또는 유화제(예, 메틸셀룰로스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향미제 및/또는 색소를 함유할 수 있다. 일부 양태에서 적합한 제제를 제조하기 위해 표준 교과서를 찾아볼 수 있다.
항미생물 보존제, 산화방지제, 킬레이트화제 및 완충제를 포함하여 조성물의 안정성 및 멸균성을 증대시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 솔브산에 의해 보장될 수 있다. 주사가능한 약학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 이루어질 수 있다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
용량 및 투여 요법
용량의 크기 또는 양
본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산은 1차 용량, 및 선택적으로 후속 용량들로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 1차 또는 후속 용량은 다수의 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을, 대상의 체중 킬로그램 당 상기 세포 약 105 내지 약 106의 범위로, 및/또는 대상의 체중 킬로그램 당 상기 세포 약 105 또는 약 106 이하인 상기 세포의 수로 함유한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 1차 또는 후속 용량은 대상의 체중 킬로그램당 약 1 x 105, 약 2 x 105, 약 5 x 105, 또는 약 1 x 106 미만 또는 이하의 상기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 1차 용량은 대상의 체중 킬로그램당 약 1 x 105, 약 2 x 105, 약 5 x 105, 또는 약 1 x 106, 또는 상기 값들 중 임의의 두 값 사이 범위내의 값의 상기 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 대상이 인간인 경우, 상기 1차 또는 후속 용량은 약 1 x 10 미만의 본 발명의 총 단백질, 세포 또는 핵산, 예를 들어, 약 1 x 106 내지 1 x 108 범위의 상기 세포, 예를 들어, 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 또는 1 x 108 또는 전체 상기 세포, 또는 상기 값들 중 임의의 두 값 사이 범위의 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 1차 또는 후속 용량은 대상의 m2 당 약 1 x 108 미만의 본 발명의 총 단백질, 세포 또는 핵산, 예를 들어, 대상의 m2 당 상기 세포 약 1 x 106 내지 1 x 108 범위, 예를 들어, 대상의 m2 당 상기 세포 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 또는 1 x 108, 또는 상기 값들 중 임의의 두 값 사이 범위의 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 1차 또는 후속 용량내 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수는 대상의 체중 킬로그램당 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산 약 1 x 106보다 크다, 예를 들어, 체중 킬로그램당 상기 세포 2 x 106, 3 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 또는 1 x 1010, 및/또는 대상의 m2 당 상기 세포 1 x 108, 또는 1 x 109, 1 x 1010, 또는 전체, 또는 상기 값들 중 임의의 두 값 사이의 범위이다.
일부 실시양태에서, 후속 용량으로 투여되는 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수는 본원의 임의의 실시양태에서 1차 용량으로 투여된 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수와 동일하거나 유사하다, 예를 들어, 대상의 체중 킬로그램당 상기 세포 약 1 x 105, 약 2 x 105, 약 5 x 105, 또는 약 1 x 106 미만 또는 이하이다. 일부 실시양태에서, 상기 후속 용량(들)은 대상의 체중 킬로그램 당 상기 세포 약 1 x 105, 약 2 x 105, 약 5 x 105, 또는 약 1 x 106, 또는 상기 값들 중 임의의 두값 사이 범위내의 값을 함유한다. 일부 실시양태에서, 상기 값들은 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수를 말한다. 일부 양태에서, 후속 용량은 1차 용량보다 크다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 후속 용량은 대상의 체중 킬로그램당 약 1 x 106보다 많은 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산, 예를 들어, 대상의 체중 킬로그램 당 약 3 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 또는 1 x 109의 상기 세포를 함유한다. 일부 실시양태에서, 상기 후속 용량의 양 또는 크기는 질환 존재량 또는 그의 징후, 및/또는 상기 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 경감시키기에 충분하다. 일부 실시양태에서, 2차(또는 다른 후속) 용량은 대상의 생존을 개선시키기에, 예를 들어, 적어도 6 개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 년동안 대상의 생존, 비재발 생존 또는 무사건 생존을 유도하기에 효과적인 크기이다. 일부 실시양태에서, 후속 용량에서 대상의 체중 당 투여되는 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수 및/또는 투여되는 상기 세포의 수는 1차 용량에서 투여되는 수보다 적어도 2배, 5배, 10배, 50배 또는 100배 이상 더 크다. 일부 실시양태에서, 질환 존재량, 종양 크기, 종양 부피, 종양 질량 및/또는 종양 부하량 또는 벌크는 1차 용량 또는 2차(또는 다른 후속)용량의 투여 직전에 비해 후속 용량후에 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90% 이상 감소된다.
다른 실시양태에서, 후속 용량에서 투여되는 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수는 1차 용량에서 투여되는 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수보다 낮다.
일부 실시양태에서, 추가의 용량 또는 용량들이 2차(또는 다른 후속) 용량의 투여후에 투여되도록, 다중 후속 용량들이 1차 용량후에 투여된다. 일부 양태에서, 상기 추가의 후속 용량 또는 용량들(즉, 3차, 4차, 5차 등)에서 대상에게 투여되는 세포의 수는 1차 용량, 2차 용량 및/또는 다른 후속 용량과 동일하거나 유사하다. 일부 실시양태에서, 추가의 용량 또는 용량들은 선행 용량들보다 크다.
일부 양태에서, 1차 및/또는 후속 용량의 크기는, 화학치료와 같은 선행 치료에 대한 대상의 반응, 대상에서의 질환 존재량, 예를 들어, 종양 부하량, 벌크, 크기 또는 정도, 전이의 정도 또는 유형, 단계, 및/또는 독성 결과, 예를 들어, CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성, 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응을 발생시키는 대상의 가능성 또는 발병과 같은 하나 이상의 기준에 기반하여 결정된다.
일부 양태에서, 1차 및/또는 후속 용량의 크기는 대상에서 질환 또는 병태의 존재량에 의해 결정된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 1차 용량에서 투여되는 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수는 1차 용량 투여 직전에 대상에 존재하는 종양 존재량을 기반으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 1차 및/또는 후속 용량의 크기는 질환 존재량과 반비례하여 상관된다. 일부 양태에서, 큰 질환 존재량의 맥락에서와 같이, 대상은 낮은 수의 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을 투여받는다, 예를 들어, 대상 체중 킬로그램 당 약 1 x 106 미만의 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을 투여받는다. 다른 실시양태에서, 더 낮은 질환 존재량의 맥락에서와 같이, 대상은 큰 수의 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을 투여받는다, 예를 들어, 대상 체중 킬로그램 당 약 1 x 106보다 많은 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을 투여받는다.
일부 양태에서, 후속 용량에서 투여되는 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수는 1차 용량 투여 후에 대상에 존재하는 종양 존재량을 기반으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 1차 용량이 질병 존재량을 감소시켰거나 특정 임계량 또는 임계 수준, 예를 들어, 독성 결과에 대한 위험이 증가된 수준 이하에서 그러한 경우, 후속 용량은, 예를 들어, 체중 킬로그램 당 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산 1 x 106보다 크고/크거나, 1차 용량보다 크다. 다른 양태에서, 1차 용량이 종양 존재량을 조금만 감소시켰거나 1차 용량이 종양 존재량에 검출가능한 감소를 야기하지 못한 경우, 후속 용량에서 투여된 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수는, 예를 들어, 약 1 x 106보다 낮다, 예를 들어, 1차 용량과 동일하거나 그보다 낮다.
일부 실시양태에서, 1차 용량에서 투여되는 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수는, 예를 들어, 면역 반응이 발생하기 전에 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을 투여하기 위해서와 같이 대형 단일 용량의 세포가 투여되는 방법과 같은 다른 방법들에서 투여되는 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 수보다 낮다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 더 큰 용량의 투여를 포함하는 다른 방법들에 비해 독성 또는 독성 결과를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 1차 용량은 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산을 독성 또는 독성 결과, 예를 들어, 사이토카인 방출 증후군(CRS), 중증 CRS(sCRS), 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 3일 이상동안 약 38 ℃ 이상의 열 및 약 20 mg/dL 이상의 CRP의 혈장 수준, 및/또는 신경독성의 가능성을 야기하지 않거나 감소시키는 양으로 포함한다. 일부 양태에서, 1차 용량에서 투여되는 세포의 수는, 대상이 세포 투여후 독성 또는 독성 결과, 예를 들어, CRS, sCRS, 및/또는 CRS-관련 결과를 나타낼 가능성을 기반으로 결정된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상에서 독성 결과의 발생 가능성은 종양 존재량을 기반으로 예측된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 용량 투여전에 독성 결과 및/또는 질환 존재량을 검출하거나 평가하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 2차(또는 다른 후속) 용량은, 1차 투여후에 사이토카인-방출 증후군(CRS), 대식세포 활성화 증후군, 또는 종양 용해 증후군, 또는 신경독성을 발생시킬 임상 위험이 존재하지 않거나 지나갔거나 진정된 시점에, 예를 들어, 상기 사건들이 일반적으로 진정되었고/되었거나, 예를 들어, 특정 질환 또는 병태를 갖는 대상의 60, 70, 80, 90 또는 95%에서 일어날 가능성이 적은 임계 시간대 후에 투여된다.
용량 타이밍
일부 양태에서, 2차 또는 후속 용량의 타이밍은 1차 용량의 개시로부터 후속 용량의 개시까지로 측정된다. 다른 실시양태에서, 후속 용량의 타이밍은 1차 용량의 종료로부터, 또는, 예를 들어, 용량이 하루보다 많은 날 동안, 예를 들어, 2일 또는 3일 동안 투여되는 경우 본원에 기술된 분할 투약의 맥락에서, 1차 용량 투여일의 중간날로부터 측정된다.
일부 실시양태에서, 1차 용량과 다른 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 후속 용량이 투여되는지 여부는, 대상에서 1차 용량의 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산에 대한 면역 반응 또는 검출가능한 면역반응의 존재 또는 정도를 기반으로 결정된다. 일부 양태에서, 1차 용량의 세포와 상이한 수용체를 발현하는 세포를 함유하는 후속 용량이, 검출가능한 숙주 적응 면역 반응, 또는 확정되었거나 특정 수준, 단계 또는 정도에 도달한 면역 반응을 갖는 대상에게 투여될 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 2차(또는 다른 후속) 용량은 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 2차 투여가 숙주 면역계에 의해 제거될 가능성이 있거나 제거될 것으로 예측되는 시점에 투여된다. 면역 반응을 발생시킬 가능성은 본원에 기술된 바와 같이 1차 용량의 투여후에 대상에서 수용체-특이적 면역 반응을 측정함으로써 결정된다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상은 1차(또는 다른 선행) 용량 후에 및 2차(또는 다른 후속) 용량 전에, 1차 용량후에 대상에서 면역 반응이 검출가능한지를 측정하기 위해 검사할 수 있다. 일부 상기와 같은 실시양태에서, 1차 용량에 대한 면역 반응의 검출은 2차 용량을 투여할 필요를 유발할 수 있다.
일부 양태에서, 대상으로부터의 샘플은, 1차 또는 선행 용량후에 대상에서, 본원에 기술된 바와 같이, 목적하는 노출의 감소가 있는지 또는 그보다 낮은지, 예를 들어, 세포의 특정 수 또는 농도보다 적은지를 측정하기 위해 검사할 수 있다. 일부 상기와 같은 실시양태에서, 세포에 대한 대상의 노출의 감소를 검출하는 것은 2차 용량을 투여할 필요를 유발할 수 있다.
일부 실시양태에서, 후속 용량은, 대상의 질환 또는 병태가 1차 또는 선행 용량에 반응하여 질환 존재량의 감소후 재발되지 않은 시점에서 투여된다. 일부 실시양태에서, 질환 존재량 감소는 하나 이상의 요인들, 예를 들어, 대상 또는 그의 체액 또는 장기 또는 조직에서 질환 세포의 부하량 또는 수, 종양의 질량 또는 부피, 또는 전이의 정도 또는 크기의 감소에 의해 나타난다. 상기 요인은 초기 치료 또는 투여에 반응하여 상기 요인의 감소후에 상기 요인이 이어서 증가하는 경우 재발된 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 2차 용량은 질환이 재발된 시점에서 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 재발은 하나 또는 하나 이상의 요인들, 또는 일반적으로 질환 존재량에서의 재발이다. 일부 양태에서, 후속 용량은, 대상, 질환 존재량, 또는 그의 요인이 1차 또는 선행 투여후 측정되거나 도달한 최저점에 비해 재발되었지만 1차 용량 직전의 때에 비해 여전히 더 낮은 시점에 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상은 질환 존재량 또는 그를 나타내는 요인이 변화되지 않은 시점에서, 예를 들어, 질환 존재량의 증가가 방지된 때에 후속 용량을 투여받는다.
일부 실시양태에서, 후속 용량은 숙주 적응 면역 반응이 검출되거나, 확정되었거나, 특정 수준, 정도 또는 단계에 도달했을 때 투여된다. 일부 양태에서, 후속 용량은 대상에서 기억 면역 반응의 발생후에 투여된다.
일부 양태에서, 1차 용량 투여와 후속 용량 투여 사이의 시간은 약 28 내지 약 35일, 약 29 내지 약 35일, 또는 약 35일보다 많다. 일부 실시양태에서, 2차 용량의 투여는 1차 용량 투여후 약 28일보다 많은 시점에서 이루어진다. 일부 양태에서, 1차와 후속 용량 사이의 시간은 약 28일이다.
일부 실시양태에서, 추가 용량 또는 용량들, 예를 들어, 후속 용량들은 2차 용량의 투여후에 투여된다. 일부 양태에서, 추가 용량 또는 용량들은 선행 용량 투여후 적어도 약 28일후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 선행 용량후 약 28일 이전에는 용량이 투여되지 않는다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 하나 이상의 연속 용량이 대상에게 투여되는 경우, 상기 연속 용량들은 약 7, 약 14, 약 15, 약 21, 약 27 또는 약 28일 만큼 떨어질 수 있다. 일부 양태에서, 연속 용량은 선행 용량 21일 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 연속 용량은 선행 용량 투여후 14 내지 28일 사이에 투여된다.
임의의 실시양태에서, 상기 방법은 일부 경우에서 1차 또는 선행 용량 및 후속 용량(들)의 투여를 포함하고, 다른 경우에서 1차 또는 선행 용량을 이미 받은 대상에게 후속 용량(들)의 투여를 포함하지만 1차 또는 선행 용량 자체의 투여는 포함하지 않는다. 따라서, 상기 방법은 일부 경우에서 본 발명의 단백질, 세포 또는 핵산의 용량을 이미 받은 대상에게 통합 후속 용량을 투여하는 것과 같은 통합 치료의 투여를 포함한다.
일부 실시양태에서, 질환 존재량, 종양 크기, 종양 부피, 종양 질량 및/또는 종양 부하량 또는 벌크는 후속 용량 후에 1차 또는 선행 용량 또는 2차 또는 후속 용량의 투여 직전에 비해 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90% 이상 감소된다.
본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 생산
숙련가라면 본 발명의 핵산과 같은 핵산이 단백질을 발현하는 형질도입 세포의 생산에 사용될 수 있는 적합한 방법을 인지할 것이다. 상기 방법은 본 발명의 단백질을 발현하는 본 발명의 세포의 생산에 사용될 수 있다.
단지 예로서, 본 발명의 세포 생산에 사용될 수 있는 적합한 프로토콜은 하기 실시예에서 더 기술한다.
본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 생산을 위한 방법의 다른 예도 당해 분야의 숙련가에게 익숙할 것이다. 제한하지 않고, 상기 방법들에는 본 발명의 핵산이 바이러스 또는 나노입자와 같은 수단에 의해 세포에 도입되는 방법이 포함된다.
실시예
본 발명의 단백질을 하기에서 더 논의하는 바와 같이, 예시적인 CAR을 참조하여 조사하였다.
1. CAR-함유 바이러스 역가의 최적화.
본 발명자들은 레트로바이러스 입자의 농도가, 도 1a에 나타낸 바와 같이, AMPHO Phoenix 세포의 상등액에서 72 시간동안 증가함을 밝혔다.
CAR-T 세포 형질도입 효율은 tCD34의 유세포분석 검출에 의해 평가하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 24 시간 또는 72 시간에 수집된 AMPHO 세포주 상등액을 사용하여 PBMC의 형질도입 효율에 차이는 보이지 않았다.
2. 아르기닌 경로 효소는 형질도입된 Jurkat 세포에서 활성을 나타낸다.
본 발명자들은 인간 T 림프구 세포(Jurkat 세포)의 불멸화 세포주에서 아르기닌 경로 효소의 역할을 조사하였다. 본 연구의 결과는 도 2에 나타내었다.
Jurkat 세포를 아르기닌 경로 효소 또는 대조군 CAR-T 구조물을 포함하는 융합 표적-결합 단백질 구조물로 형질도입시켰다. 실험 목적을 위해, 본 발명의 세포 및 대조군 세포를 둘 다 GD2-결합 잔기를 포함하는 단백질을 발현하도록 형질도입시켰다. 생성된 단백질-효소 구조물의 순도는 유세포분석을 이용하여 tCD34의 발현을 측정함으로써 평가하였다. 결과는 상기 단백질-효소 구조물들이, 도 2a에 나타낸 바와 같이, Jurkat 세포에서 고도의 순도로 생성될 수 있음을 보여준다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, 형질도입 세포(Jurkat가 1차 PBMC에 비해 더 높은 배경 ASS-1 발현을 가짐 주목)에서 ASS-1 및 OTC의 발현의 증가가 있었다.
본 발명자들은 형질도입 세포에서 아르기닌의 합성을 촉진하는 도메인의 그 기능을 수행하는 능력을 조사하였다.
ASS-1에 의한 시트룰린의 아르기노숙시네이트로의 이화작용을 평가하고, 대조군 구조물(ASS-1 도메인 비함유, GD2-CAR), OTC 도메인을 함유하는 융합 표적-결합 단백질(GD2-OTC), 및 ASS-1 및 OTC 도메인을 둘 다 함유하는 융합 표적-결합 단백질(GD2-ASS-OTC)과 비교하였다. GD2-ASS-형질도입 Jurkat 세포의 용해물을 시트룰린을 아르기니노숙시네이트로 직접 이화시키는 ASS-1 효소의 활성에 대해 비색 분석으로 검사하였다. 아르기닌의 합성을 촉진하는 ASS-1 도메인을 함유하는 융합 표적-결합 단백질은, 도 2c에 나타낸 바와 같이, GD2-ASS-1 융합 표적-결합 단백질이 대조군 융합 표적-결합 단백질 구조물을 함유하는 세포보다 훨씬 더 높은 ASS-1 활성을 가짐을 보여주었다.
OTC에 의한 오르니틴의 시트룰린으로의 이화작용을 평가하고, OTC 도메인을 함유하지 않는 대조군 구조물(GD2 단독), ASS-1 도메인을 함유하는 융합 표적-결합 단백질(GD2-ASS), 및 ASS-1 및 OTC 도메인을 둘 다 함유하는 융합 표적-결합 단백질(GD2-ASS-OTC)과 비교하였다. GD2-OTC-형질도입 Jurkat 세포의 용해물을 오르니틴을 시트룰린으로 직접 이화시키는 OTC 효소의 활성에 대해 비색 분석으로 검사하였다. OTC 도메인을 함유하는 융합 표적-결합 단백질(GD2-OTC), 및 ASS-1 및 OTC 도메인을 함유하는 융합 표적-결합 단백질(GD2-ASS-OTC) 구조물들은, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 대조군 CAR 구조물을 함유하는 세포보다 훨씬 더 높은 OTC 활성을 가졌다.
본 발명자들은 종양 미세환경에서 아르기닌의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 구조물로 형질도입된 융합 표적-결합 단백질 T 세포의 지속성을 조사하였다.
NOG-SCID 마우스에게 5x106 융합 표적-결합 단백질 T 세포를 이식하였다. 재조합-PEG-아르기나제를 매주 2회 투여하여 재현가능한 저-아르기닌 미세환경을 야기하였다(아르기닌 ELISA로 학인). 마우스를 희생시키고 혈중 융합 표적-결합 단백질 T 세포의 백분율을 유세포분석으로 측정하였다. ASS-1 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질 T 세포(GD2-ASS)는, 도2e에 나타낸 바와 같이, ASS-1도메인을 함유하지 않는 융합 표적-결합 단백질(GD2-CAR T 세포)에 비해 상당히 증대된 지속성을 나타내었다.
OTC 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질 T 세포(GD2-OTC)는, 도 2f에 나타낸 바와 같이, OTC 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 함유하지 않는 T 세포(GD2-CAR T 세포)에 비해 상당히 증대된 지속성을 나타내었다.
3. 아르기닌 경로 효소는 인간 공여체로부터의 PBMC에 형질도입될 수 있다.
본 발명자들은 인간 공여체 세포로부터의 PBMC에서 아르기닌 경로 효소의 역할을 조사하였다. 본 연구의 결과는 도 3에 나타내었다.
PBMC를 아르기닌 경로 효소를 포함하는 융합 표적-결합 단백질 구조물로 형질도입시켰다. 생성된 CAR-효소 구조물의 순도를 유세포분석을 이용하여 tCD34의 발현을 측정함으로써 평가하였다. 결과는, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 융합 표적-결합 단백질-효소 구조물이 PBMC에서 고도의 순도로 생성될 수 있음을 보여준다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, 형질도입 세포에서 ASS-1 및 OTC의 발현의 증가가 있었다.
본 발명자들은 아르기닌의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 구조물을 또한 함유하는 CAR-T 세포에서 동시-억제 수용체 LAG-3, TIM-3 및 PD-1의 발현에 차이가 없었음을 밝혀내었다.
아르기닌의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 구조물로 형질도입된 PBMC의 지속성을 tCD34의 유세포분석으로 검출시 7일 증식동안 측정하였다. GD2-ASS-1 구조물은 GD2 단독 구조물과 유사한 지속성을 나타내었다. 도 3d에 나타낸 바와 같이, 시간경과에 따라 GD2-OTC 및 GD2-ASS-OTC 구조물은 유지되지 않았다. 상기 실험들은 항원이 존재하지 않는 정상 아르기닌 조건에서 수행하였다. 본 발명자들은 저-아르기닌 조건에서 및 항원의 존재하에서 생존 이점을 볼 수 있는 것으로 가정하였다. 생체내에서 일어나는 세포의 임의의 손실은 세포가 신체에서 생존하는 시간을 반영하는 투여 간격하에 본 발명의 세포를 환자에게 반복 투여함으로써 극복할 수 있다.
4. ASS-1 및 OTC는 저-아르기닌 종양 조건에서 상당한 대사 및 증식 이점을 제공한다.
정상 아르기닌(RPMI+10% FCS), LAN-1 신경아세포종 조정된 상등액, 및 75% 아르기닌 고갈 배지 조건에서 배양시 시트룰린 대사를 증대시키는, 아르기닌의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질 T 세포(GD2-ASS 및 GD2-OTC)의 능력을 배양 상등액의 ELISA에 의해 검출하였다. 종양-유래 저-아르기닌 조건하에서 GD2-ASS-1 융합 표적-결합 단백질 및 GD2-OTC 융합 표적-결합 단백질은, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 대조군(아르기닌의 합성을 촉진하는 도메인 비함유, GD2 단독)에 비해 효소 발현 및 활성화와 일치하게 시트룰린 대사를 상당히 상향조절시켰다.
신경아세포종 세포주 및 골수성 백혈병 세포주 상에서 ASS-1 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질("GD2-ASS-BB") 및 OTC 도메인("GD2-OTC-BB") 융합 표적-결합 단백질 T 세포의 특이적 세포 용해를 대조군(GD2 단독: "GD2-BB")에 대해 평가하였다. 융합 표적-결합 단백질 T 세포를 상이한 효과기 대 표적 비에서 크로뮴 표지된 GD2+ LAN-1 신경아세포종 세포의 존재하에 4 시간동안 배양하였다. 모든 CAR-T 세포 구조물은 본 발명자들의 이전 데이터와 일치하게 신경아세포종 세포를 효과적으로(35 내지 45%) 사멸시킨다. ASS-1 및 OTC 첨가시 세포독성에 대한 손실은 보이지 않는다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 상기 세포파괴 활성의 특이성은, GD2-CAR T 세포(대조군이든 본 발명의 세포이든)가 골수성 백혈병 세포주(GD2-K562)의 최소 사멸을 나타내었다는 사실(<5% 특이적 용해)에 의해 입증되었다.
아르기닌의 합성을 촉진하는 도메인(ASS-1 또는 OTC)을 포함하는 CAR T 세포는 저-아르기닌 조건에서 증식의 상당한 증가를 나타내었다. CAR-T 세포는 정상 아르기닌(RPMI+10% FCS) 신경아세포종-유래 저-아르기닌 상등액, 또는 75% 아르기닌 고갈 배지에서 배양하였다. 96 시간후에 삼중수소화-티미딘 혼입에 의해 T 세포 증식을 측정하였다. CAR-T 세포는 본 발명자들의 이전 결과와 일치하게 저-아르기닌 조건에서 T 세포 증식의 감소를 나타내었다. ASS-1 도메인(GD2-ASS) 및 OTC 도메인(GD2-OTC)을 포함하는 구조물로 형질감염된 세포는, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 대조군(GD2-CAR)에 비해 상기 조건들에서 증식의 상당한 증가를 나타내었다.
5. 변형된 CAR-T 세포는 생체내에서 항-종양 활성을 증대시켰으며 비-GD2 CAR-T 세포에 적용될 수 있다.
NOG-SCID 마우스에 GD2+ 종양 세포를 이식하였다. ASS-1 도메인을 포함하sm는 CAR-T 세포(GD2-ASS) 및 포함하지 않는 CAR-T 세포(GD2-CAR)를 꼬리 정맥 주사에 의해 투여하였다. 상대적 종양 성장을 시간 경과에 따라 측정하였다. GD2-ASS-1 CAR T 세포의 투여는, 도 5a에 나타낸 바와 같이, GD2-CAR T 세포에 비해 종양 성장의 감소를 유도하였다.
GS2-ASS-1 CAR T 세포의 투여는 또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 개선된 뮤린 생존율을 유도하였다. 상기 도면에 나타낸 결과는 본 발명 세포의 세포파괴(및 따라서 치료) 활성뿐 아니라, 생체내에서 그의 개선된 지속성을 예시하는데, 그 이유는 상기 치료 활성이 대조군 세포보다 더 긴 기간에 걸쳐 관찰되기 때문이다.
CD33 및 CD33-ASS-1 CAR T 세포의 생존율을 평가하였다. CD33-ASS-1 CAR을 AML 세포주 조건 배지(저-아르기닌) 또는 50 내지 75% 아르기닌 고갈 배지에서 배양하였다. CD33-ASS-1 CAR은 CD33 CAR에 비해 저-아르기닌 조건에서 상당히 증대된 생존율을 나타내었다. 이를 예시하는 결과는 도 5c에 나타내었다.
6. 생체내 아르기닌-고갈 조건에서 본 발명 세포의 증가된 지속성 .
정맥내 투여된 5x106 항-GD2 CAR-T Jurkat 세포(대조군 세포), 또는 GD2 표적 잔기 및 ASS-1 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 Jurkat 세포(GD2-ASS), 또는 GD2 표적 잔기 및 OTC 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포(GD2-OTC)가 이식된 NOG-SCID 마우스에서 본 발명 세포의 개선된 지속성을 입증하였다. 재현가능한 저-아르기닌 미세환경을 제공하기 위해(종양 미세환경을 모방하기 위해) 재조합-PEG-아르기나제를 마우스에게 매주 2회 투여하였다. 저-아르기닌 조건은 ELISA로 확인하였다(데이터 나타내지 않음). 17일 후에 마우스를 희생시키고 혈중 CAR-T 세포(대조군이든 본 발명의 세포이든)의 백분율을 유세포분석으로 측정하였다. GD2-ASS-1 및 GD2-OTC CAR-T 세포는 비변형 GD2 CAR-T 구조물을 포함하는 대조군 세포에 비해 상당히 증대된 지속성을 나타내었다. 상기 결과들은 도 6에 나타내었다.
7. 아르기닌 경로 효소는 다양한 표적 결합 잔기를 포함하는 인간 공여체로부터의 PBMC에 형질도입될 수 있다.
인간 공여체로부터의 PBMC(특히 T 세포)를, GD2, CD33, 메소텔렌 또는 EGFRvIII로 이루어진 목록에서 선택된 표적 결합 잔기와 함께 ASS-1 도메인 및/또는 OTC 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질로 형질도입시켰다. 웨스턴 블롯은 ASS-1 및 OTC의 발현이 대조군에 비해 본 발명의 단백질로 형질도입된 세포에서 증가됨을 보여준다(각각의 웨스턴 블롯의 왼쪽 칸). 상기 결과는 도 7a에 나타내었다.
LAG-3, TIM-3 및 PD-1(암 치료에 잠재적 중요성을 갖는 동시-억제 수용체들)의 발현을 또한 ASS-1 도메인; OTC 도메인; 또는 ASS-1 도메인 및 OTC 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 형질도입된 CAR-T 세포에서 유세포분석으로 평가하였다. 항-GD2, 항-CD33, 항-MESO 및 항-EGFRvIII CAR-T 세포에 대한 예들을 도 7의 패널 B에 나타내었다.
8. CD33 표적화 도메인을 발현하는 세포의 세포파괴 활성
ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 및 OTC 도메인과 함께 CD33 표적화 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질을 발현시켜 본 발명의 CAR-T 세포를 생성하였다. CAR T 세포를 상이한 효과기 대 표적 비에서 K562 백혈병 세포의 존재하에 4 시간동안 배양하였다. 모든 CAR-T 세포 구조물들이 백혈병 세포를 효과적으로(70 내지 90%) 특이적으로 사멸시켰다. 본 발명의 단백질에 의한 CD33 CAR-T 세포의 형질도입은, 도 8에 나타낸 바와 같이, CAR T-세포의 세포독성에 불리하게 영향을 미치지 않았다. 나머지 실시예에 나타낸 바와 같이, 증가된 지속성 및 증식을 또한 나타내면서, 세포파괴 활성을 유지하는 본 발명 단백질을 포함하는 세포의 능력은 그의 치료적 유용성을 예시한다.
9. 효소 변형은 저-아르기닌 종양 조건에서 상당한 대사 및 증식 이점을 제공한다.
세포들을 하기의 본 발명의 단백질 중 하나를 발현하도록 형질도입시켰다:
- GD2-결합 도메인 및 ASS-1 도메인을 포함하는 단백질
- GD2-결합 도메인 및 OTC 도메인을 포함하는 단백질
- GD2-결합 도메인 및 ASS-1 및 OTC 도메인 둘 다를 포함하는 단백질
- CD33-결합 도메인 및 ASS-1 도메인을 포함하는 단백질
- CD33-결합 도메인 및 OTC 도메인을 포함하는 단백질
- CD33-결합 도메인 및 ASS-1 및 OTC 도메인 둘 다를 포함하는 단백질
- 메소텔린-결합 도메인 및 ASS-1 도메인을 포함하는 단백질
- 메소텔린-결합 도메인 및 OTC 도메인을 포함하는 단백질
- 메소텔린-결합 도메인 및 ASS-1 및 OTC 도메인 둘 다를 포함하는 단백질
- EGFRvIII-결합 도메인 및 ASS-1 도메인을 포함하는 단백질
- EGFRvIII-결합 도메인 및 OTC 도메인을 포함하는 단백질
- EGFRvIII-결합 도메인 및 ASS-1 및 OTC 도메인 둘 다를 포함하는 단백질
상기 세포들을 저-아르기닌 조건(75% 아르기닌 고갈 완전 배지)에서 배양하였다. 동일한 결합 도메인을 공유하지만 효소 도메인이 결여된 비변형 CAR-T 세포(즉, 항-GD2, 항-CD33, 항-메소텔린 또는 항-EGFRvIII)를 대조군으로 사용하였다. 모든 세포의 증식을 96 시간후에 유세포분석으로 측정하였다.
항-GD2 세포의 경우에, ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 및 OTC 도메인의 부가는 비변형 대조군 CAR-T 세포에 비해 CAR-T 세포 증식을 상당히 증대시켰다. 실제로, GD2-OTC CAR T-세포는 GD2 단독 대조군 세포에 비해 증식에 5배 증가를 나타내었다. 또한, GD2-ASS/OTC CAR T 세포는, 도 9 패널 A에 나타낸 바와 같이, GD2-단독 CAR T 세포 대조군에 비해 증식에 10배 증가를 나타내었다.
항-CD33 CAR-T 세포의 경우에, ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 및 OTC 도메인의 부가는 비변형 대조군 CAR-T 세포에 비해 CAR-T 세포 증식을 상당히 증대시켰다. CD33-OTC CAR T-세포는 CD33 단독 대조군 세포에 비해 증식에 대략 5배 증가를 나타내었다. 또한, CD33-ASS/OTC CAR T 세포는, 도 9 패널 B에 나타낸 바와 같이, GD2-단독 CAR T 세포 대조군에 비해 증식에 6배 증가를 나타내었다.
항-메소텔린 CAR-T 세포의 경우에, ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 및 OTC 도메인의 부가는 비변형 대조군 CAR-T 세포에 비해 CAR-T 세포 증식을 상당히 증대시켰다. 메소텔린-OTC CAR T-세포는 CD33 단독 대조군 세포에 비해 증식에 대략 4배 증가를 나타내었다. 또한, 메소텔린-ASS/OTC CAR T 세포는, 도 9 패널 C에 나타낸 바와 같이, 메소텔린-단독 CAR T 세포 대조군에 비해 증식에 3.5배 증가를 나타내었다.
항-EGFRvIII CAR-T 세포에서, ASS-1 도메인의 부가는, 도 9 패널 D에 나타낸 바와 같이, 비변형 대조군 CAR-T 세포에 비해 대략 2.5배만큼 증식을 상당히 증대시켰다.
10. 효소 변형은 종양 조정 배지( TCM )에서 상당한 대사 및 증식 이점을 제공한다.
ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 및 OTC 도메인과 함께 GD2-결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포를 신경아세포종 종양 조정 배지에서 배양하였다. 상기 배지는 종양 세포의 작용으로 인해 저-아르기닌 조건을 갖는다. 효소 도메인이 없는 항-GD2 CAR-T 세포를 대조군 세포로 사용하였다.
배양된 세포의 증식을 96 시간후에 유세포분석으로 측정하였다. ASS-1 도메인을 포함하는 본 발명 단백질의 첨가는, 도 10 패널 A에 나타낸 바와 같이, 비변형 대조군 CAR-T 세포에 비해 CAR-T 세포 증식을 상당히 증대시켰다.
ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 및 OTC 도메인과 함께 CD33-결합 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포를 백혈병 종양 조정 배지(또한 저수준의 아르기닌을 함유함)에서 배양하였다. 이 경우에, 효소 도메인을 갖지 않는 항-CD33 CAR-T 세포를 대조군 세포로 사용하였으며, 세포 증식을 (다시) 96 시간후에 유세포분석으로 측정하였다.
ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 및 OTC 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질의 부가는 비변형 대조군 CAR-T 세포에 비해 CAR-T 세포 증식을 상당히 증대시켰다. OTC 도메인을 포함하는 CD33 CAR T-세포는 증식에 대략 4배 증가를 나타내었다. ASS-1 및 OTC 도메인을 포함하는 CD33 CAR T 세포는 비변형 대조군 CAR T 세포에 비해 증식에 대략 3.5배 증가를 나타내었다. 상기 결과들은 도 10 패널 B에 나타내었다.
11. 효소 변형은 생체내 항-종양 활성을 상당히 증대시킨다.
HL-60 급성 골수성 백혈병(AML) 세포를 NOG-SCID 마우스에 이식하였다. 백혈병을 갖는 마우스를, CD33-결합 잔기와, ASS-1 도메인, OTC 도메인, 또는 ASS-1 도메인 및 OTC 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포로 처리하였다. 효소 도메인이 결여된 항-CD33 CAR-T 세포(비변형 CAR-T 세포)를 대조군으로 사용하였다. 본 발명의 세포 또는 대조군 세포는 5x106 세포의 용량으로 정맥내 투여하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, ASS-1 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 CAR-T 세포(항-CD33-ASS-1 CAR-T 세포)는 대조군 CAR-T 세포에 비해 골수로부터의 AML 제거율을 상당히 증대시켰다.
12. GD2 CART T 세포의 효소 변형은 생체내 항-종양 활성을 상당히 증대시킨다.
신경아세포종 이종이식 마우스를 GD2-결합 잔기 및 ASS-1 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포로 처리하였다. 대조군 동물들에게는 GD2 CAR-T 세포(ASS-1 도메인 비함유)를 투여하거나 CAR-T 처리를 하지 않았다. 모든 동물들의 비장을 수거하고, 추출된 백혈구를 유세포분석으로 특성화하였다. 결과는 도 12의 패널 A에 나타내었으며, 세포수가 대조군 세포에 비해 본 발명의 세포에서 현저히 증가되었음을 예시한다. 상기 결과는 본 발명의 세포(ASS-1 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는)가 대조군에 비해, 처리된 마우스의 비장에서 개선된 지속성을 가짐을 시사한다.
추출된 백혈구를 또한 항원 자극에 반응하여 증식이 일어나는 수용체에서 지속된 본 발명 세포의 능력을 조사하기 위해 생체외에서 신경아세포종 표적 세포(IMR32 세포주 또는 종양 세포)와 공배양하였다. 결과는 도 12의 패널 B에 나타내었다. 본 발명의 세포 수는 대조군보다 훨씬 더 높은 것을 볼수 있다. 상기 결과는 본 발명의 지속 세포가 대조군보다 더 큰 항원 자극에 반응하여 증식하는 능력을 유지함을 시사한다.
13. CD33 CART T 세포의 효소 변형은 생체내 항-종양 활성을 상당히 증대시킨다.
AML 이종이식 마우스를 CD33-결합 잔기와, ASS-1 도메인, OTC 도메인; 또는 ASS-1 도메인 및 OTC 도메인 중 하나를 포함하는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포로 처리하였다. 대조군에게는 CD33 CAR-T 세포(효소 도메인 비함유 - "-효소"로 나타냄)를 투여하거나 CAR-T 처리를 하지 않았다. 모든 동물들의 비장을 수거하고, 추출된 백혈구를 유세포분석으로 특성화하였다. 도 13의 패널 A에 나타낸 결과는 세포수가 대조군 세포에 비해 본 발명의 세포에서 현저히 증가되었음을 예시한다. 상기 결과는 본 발명의 세포가 AML의 맥락에서 (대조군에 비해) 처리된 마우스의 비장에서 개선된 지속성을 가짐을 시사한다.
추출된 백혈구를 또한 항원 자극에 반응하여 증식이 일어나는 수용체에서 지속된 본 발명 세포의 능력을 조사하기 위해 생체외에서 AML 표적 세포와 공배양하였다. 결과는 도 13의 패널 B에 나타내었다. 본 발명의 세포 수는, 특히 ASS-1 도메인을 갖는 본 발명의 단백질을 발현하는 세포의 경우에, 대조군보다 훨씬 더 높다. 상기 결과는 수용체내에서 지속된 본 발명의 세포가 대조군 세포보다 더 큰 항원 자극에 반응하여 증식하는 능력을 유지함을 시사한다.
본 발명 세포의 생산을 위한 프로토콜
본 발명의 세포는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 형질도입 접근방법에 의해 성공적으로 생산하였다. 본 발명 세포의 레트로바이러스 생산을 위한 예시적인 프로토콜에 대한 세부사항을 하기에 나타낸다.
인간 T 세포의 레트로바이러스 형질도입
하기는 본 발명의 핵산으로 형질감염시켜 본 발명의 세포를 생산하기 위한 프로토콜을 제공한다.
제 -2일: Pheonix Ampho 세포의 해동
늦은 오후에 -80으로부터 Phoenix Ampho 세포(인간 세포의 형질도입을 위한 레트로바이러스 패키징 세포주)를 수득하고 배양한다. Phoenix Ampho 세포는 10% FCS, 1% L-글루타민(무항생제)을 함유하는 DMEM에서 성장시킨다. Phoenix Ampho 세포는 밀집도에 도달하지 않아야 한다. 전형적으로 30 ml의 배지에 각각의 T150 플라스크에 2 내지 3 x 10 6 Phoenix Ampho 세포를 넣는다. 제 0일에 약 30 내지 40 x 106 Phoenix Ampho 세포를 수득해야 한다.
제 1일 : Phoenix Ampho 세포 준비
TryLE를 사용하여 Phoenix Ampho 세포를 트립신화시키고, 10% FCS 및 1% L-글루타민( 무항생제 )을 함유하는 30 ml DMEM에서 8x10 6 세포/플라스크로 Phoenix Ampho 세포를 준비한다(T150 플라스크에 대한 부피, 적절하게 규모조정). 세포를 밤새 배양한다(37 ℃/5% CO2).
제 2일 : Phoenix Ampho 세포의 형질감염
Phoenix Ampho 세포는 형질감염 당일에 50 내지 80% 밀집도이어야 한다. 이어서, 상기 세포는 하기의 방법(T150 플라스크에 대한 것, 다른 플라스크를 사용하는 경우 적절하게 규모조정)에 의해 형질감염시켜야 한다.
1. Phoenix 세포의 각각의 T150 플라스크에, 12 ㎍의 플라스미드 DNA(즉, CAR 플라스미드) + 12 ㎍의 pCl ampho 플라스미드를 15 ml의 작은 병에 넣고, 피펫으로 조심스럽게 OptiMEM(깁코(Gibco))을 혼합하면서 1800 ㎕까지 만든다. 또 다른 15 ml의 작은 병에 1680 ㎕ OptiMEM을 첨가하고, Fugene이 튜브의 측면에 들러붙지 않고 OptiMEM으로 바로 진입하도록 120 ㎕ Fugene 6 형질감염 시약(상점에서 입수가능)을 첨가하고; 피펫으로 조심스럽게 혼합한다. 이어서, 플라스미드 DNA를 함유하는 튜브에 1800 ㎕의 OptiMEM/Fugene 혼합물을 첨가하고 피펫으로 조심스럽게 혼합한다. 실온에서 45 분동안 배양한다. 이에 의해 Fugene은 DNA가 음으로 하전된 Phoenix Ampho 세포 막을 가로질러 수송되도록 중성 전하를 갖는 DNA와의 복합체를 형성하게 된다.
2. Phoenix Ampho 세포 상의 배지를 10% FCS 및 글루타민을 함유하는 9 ml의 새 DMEM으로 매우 조심스럽게 교체한 다음 즉시 DNA/Fugene 복합체 또는 OptiMEM(mock 대조군에 대한)을 세포위에 덮어씌운다. 플레이트를 동서남북으로 움직여 조심스럽게 혼합시킨다.
3. 세포를 24 시간동안 배양한다(37 ℃/5% CO2).
제 2일 : T 세포의 활성화
T 세포는 활성화후 처음 48 시간에는 증식하지 않을 것이므로, 전형적으로 형질도입을 위해 필요한 만큼 많은(또는 세포 사멸의 경우 더 많이) T 세포를 활성화시킨다.
항-CD3/CD28 항체를 사용하는 방법:
1. 새로운 백혈구 원뿔체를 림프처리한다.
2. 세포를 계수하고 T 세포 배지(1% 인간 혈청, 10% FCS, P/S, L-글루타민 RPMI)에서 1x106/ml로 배양한다. 전형적으로 T150 플라스크당 200 ml.
3. 3000 U/ml의 IL-2를 첨가하고, 30 ng /ml의 OKT3(항-CD33)을 첨가하고, 30 ng/ml의 항-CD28 mAB(#MAB342-SP, R&D)를 첨가한다.
4. 37 ℃/5% CO2에서 48 시간동안 배양한다.
항-CD3/CD28 디나비드(dynabead)를 사용하는 방법:
1. 새로운 원뿔체를 림프처리한다. 세포를 계수하고 PBMC의 50%가 CD3+ T 세포인 것으로 추정한다.
2. 15 ml의 작은 병에 5% 인간 혈청, PBS ml 당 10x10 6 CD3+ T 세포로 세포를 재현탁한다.
3. CD3+ 세포 당 2개의 디나비드 ® 인간 T-활성화제 CD3/CD28을 첨가한다. 디나비드를 세척한다: 30 초동안 비드 바이알을 볼텍싱한다. 필요한 부피의 비드를 꺼내고 15 ml의 작은 병에 넣는다. 1 ml의 멸균 PBS를 첨가하고 피펫으로 잘 혼합한다. 작은 병을 디나비드 자석위에 둔다 - 디나비드는 작은 병의 가장자리에 들러붙을 것이다. 비드를 흩뜨리지 않고 상등액을 조심스럽제 제거한다. 작은 병을 자석에서 떼어내고 세척 단계를 반복한다. 디나비드를 소부피의 PBS 중의 T 세포에 첨가한다.
4. T 세포를 실온에서 적어도 1 시간동안 텀블러상에서 배양한다. T 세포는 이 단계동안 디나비드에 결합하여, CD3+ T 세포의 선별 및 동시에 활성화를 가능하게 할 것이다.
5. 세포를 디나비드 자석위에 두어 미결합 세포를 제거한다. 세포를 계수하고 IL-2 300 U/ml를 함유하는 T 세포 배지(1% 인간 혈청, 10% FCS, P/S, L-글루타민 RPMI)에서 1x10 6 /ml로 배양한다.
6. 37 ℃/5% CO2에서 48 시간동안 배양한다.
제 3일 : Phoenix Ampho 배지 교체
Phoenix Ampho 세포는 플라스미드 DNA를 함유하는 레트로바이러스를 생성할 것이므로, 세포/상등액을 처리할 때 이것을 고려한다. 오토클레이브 백을 TC 후드 안에 두고 그 안에 레트로바이러스(세포/상등액)로 오염된 임의의 플라스틱을 둔다. 끝나면, 오토클레이브 백을 밀폐시키고 오토클레이브 통안에 둔다. 임의의 액체 폐기물은 폐기물 용기에 넣고 밀폐시킨다. 레트로바이러스 오염된 폐기물을 취하여 가능한 빨리 세척한다.
Phoenix Ampho 세포 상의 배지를 DMEM + 10% FCS + 2 mM L-글루타민(무항생제)의 새로운 21 ml /플라스크(T150 플라스크에 대한 부피, 적절하게 규모조정)로 조심스럽게 교체한다. 세포를 24 시간동안 더 배양한다.
제 4일 : 인간 T-세포의 형질도입
1. 2 ml의 레트로넥틴(30 ㎍/ml)(#T100B - 타카라 레트로넥틴(Takara RetroNectin)® 재조합 인간 피브로넥틴 단편)을 6-웰 플레이트(조직 배양물 처리되지 않음)의 필요한 수의 웰 각각에 첨가하고, 실온에서 3 시간동안 배양한다(또한 그 전날 준비하고 냉장고에서 밤새 코팅할 수 있다). 실험에서 mock-형질감염된 대조군용 웰을 포함시킬 것을 유의한다. 배양 플레이트를 레트로넥틴중에서 코팅시켜 T 세포 및 바이러스 입자를 공동-국소화시켜 세포의 효과적인 형질도입을 가능하게 한다.
2. 레트로넥틴을 제거하고(레트로넥틴은 고갈될 때까지 재사용할 수 있다), 2.5 ml의 멸균 PBS/2% BSA/ 웰로 30 분동안 웰을 차단한다. 차단 용액을 제거하고 웰을 2.5 ml의 멸균 PBS로 2회 세척한다(바이러스를 첨가할 준비가 될 때까지 마지막 PBS 세척액을 웰 상에 유지시킨다).
3. 일부 T 세포 배지를 예열한다.
4. 32 ℃에서 60 분동안 3160 rpm/2000g에서 빈 양동이를 사용하여 회전시켜 스핀펙션(spinfection)을 위해 원심분리기를 예열한다. 스핀펙션 준비가 되면 상기 과정을 중단할 수 있다.
5. Phoenix Ampho 세포로부터 레트로바이러스-함유 배양 상등액을 수거하고 회전시킨다(1500 rpm으로 5 분). 레트로바이러스 상등액을 새 튜브로 옮긴다. 일부의 사람은 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 레트로바이러스를 여과하여 오염 Phoenix Ampho 세포를 제거하지만, 이것은 레트로바이러스 역가를 감소시킬 수 있다. 필요한 경우, 바이러스는 드라이아이스/에탄올 슬러리 상에서 급속 냉동시키고 -80 ℃에서 저장할 수 있지만, 매 냉동 해동에 따라 역가는 반감된다.
6. 스핀펙션 : 2 ml / 웰의 바이러스 상등액(또는 mock 상등액)을 레트로넥틴 -코팅된 웰에 첨가하고 32 ℃에서 2 시간동안 3160 rpm/2000g에서 회전시킨다.
7. 상기 회전이 종료되기 45 분전에, 형질도입될 T 세포를 준비한다. T 세포를 수거하고 계수한다. T 세포를 T 세포 배지 + IL2(1000 U/ml)에 1x10 6 으로 재현탁하고 15 내지 20 분동안 배양(37 ℃/5% CO2)하여 세포를 원심분리로부터 회수한다.
8. 바이러스가 회전이 완료되면, 상등액을 제거하고 웰을 PBS(2.5 ml/웰)로 1회 세척한다.
9. 바이러스/ 레트로넥틴 코팅된 플레이트로부터 PBS를 제거하고 형질도입될 T 세포( 2 ml /웰)를 첨가한다. 동서남북으로 흔들어 세포가 플레이트 위에 고르게 분포되게한다. 플레이트를 1300 rpm에서 5 분동안 회전시킨다.
10. 플레이트를 배양기(37 ℃/5% CO2)에 넣는다.
제 5일 : 형질도입된 T 세포 공급
추가 6 ml의 T 세포 배지 + IL2(100 IU/ml)를 T 세포의 각 웰에 첨가하고 배양기(37 ℃/5% CO2)에 다시 넣는다.
CAR 형질도입 효율 측정
세포를 형질도입시켜 본 발명의 세포를 생성하는 방법의 효율은 하기의 절차를 이용하여 측정할 수 있다.
CAR T 세포 형질도입 효율은 스핀펙션 4 일후에 측정한다. mock 및 CAR T 세포 웰로부터 샘플을 취하고 다음과 같이 염색한다:
1. FACS 완충제(10% FCS, PBS)로 1회 세척한다.
2. 50 ㎕의 FAC 완충제 중에서 CD34-APC(1 ㎕/샘플), CD4-FITC(2 ㎕/샘플) 및 CD8-PE(1 ㎕/샘플)로 염색한다.
3. 얼음위에서 20 분동안 배양한다.
4. FACS 완충제로 1회 세척한다.
5. 세포를 200 ㎕의 FACS 완충제에 재현탁하고 유세포분석(LSRII)으로 분석한다.
CD34 자기-활성화 세포 분류에 의한 본 발명 세포(예를 들어 CAR T 세포)의 분류
CAR-형질도입 세포(예를 들어, T 세포)를 다음과 같이 분류시킨다:
1. T 세포를 1500 rpm에서 5 분동안 회전시키고 상등액을 따라버린다.
2. 10 ml의 냉각 MACS 완충제에 세포를 재현탁하고 1500 rpm에서 5 분동안 회전하고 상등액을 따라버린다.
3. 세포를 300 ㎕의 냉각 MACS 완충제레 재현탁하고, 100 ㎕ FcR 차단제 및 100 ㎕ CD34 미세비드(밀테나이 바이오테크(Miltenyi Biotech) 130-046-702)를 첨가한다. 상기 양들은 10 8 세포까지에 적합하다 - 그보다 많은 경우, 그에 따라 규모를 확대한다.
4. 잘 혼합하고 냉장고(2 내지 8 ℃)에서 30 분동안 배양한다.
5. 50 ml 냉각 MACS 완충제에서 세척하고 1500 rpm에서 5 분동안 회전한 후 상등액을 따라버린다.
6. 세포를 500 ㎕ 냉각 MACS 완충제에 재현탁하고 세포 현탁액을 500 ㎕ 냉각 MACS 완충제로 미리 세정된 MS 컬럼상에 부하한다.
7. 세포를 중력 유동에 의해 적하시키고, 컬럼을 500 ㎕ 냉각 MACS 완충제로 3회 세척한다.
8. 컬럼을 자석에서 떼어내고, 1 ml 냉각 MACS 완충제로 플러싱하여 세포를 멸균 튜브에 수거한다.
9. 분류된 CAR T 세포를 원심분리하고, 정상 T 세포 배지(1% 인간 혈청, 10% FBS, P/S, L-글루타민, 100 U/ml IL-2, RPMI 1640)에 ml 당 1x106 CAR T 세포의 농도로 재현탁한다.
10. 다음 날 CD34 표면 항체 염색에 의해 CAR T 세포의 순도를 검사한다.
아르기노숙시네이트 신타제 (ASS-1) 또는 아르기노숙시네이트 신테타제 ( ArgG ) 효소 활성 - L-시트룰린 고갈을 측정하기 위한 분석
1. 샘플 당 5x106 세포를 펠릿화한다(기질 대조군이 없는 경우 5x106 세포 첨가시 충분한 세포 펠릿이 있다면).
2. 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제(0.1% 트리톤-X는 분자 실험실에서 4 ℃에서 50 ml 튜브에 보관한다)에 재현탁하고, 가끔 볼텍싱하면서 20 분동안 얼음 위에서 배양한다.
3. 4 ℃에서 20 분동안 13,000 rpm에서 샘플을 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화한다.
4. 20 ㎕의 세포 용해물을 새 에펜도르프 튜브에 취하고 얼음 위에서 유지시킨다.
5. 각 샘플을 위해 새 에펜도르프 튜브를 취하고, 10 ㎕의 L-시트룰린(4 mM, pH 7.5), 10 ㎕의 L-아스파트산(4 mM, pH 7.5), 10 ㎕의 MgCl2(6 mM), 10 ㎕의 ATP(4 mM, pH 7.5), 40 ㎕의 트리스-HCl(20 mM) 및 20 ㎕의 세포 용해물을 첨가한다.
6. 효소 대조군이 없는 경우, 세포 용해물 대신 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제를 첨가한다.
7. 기질 대조군이 없이 수행하는 경우, ASS-1 또는 ArgG 기질, 즉 L-시트룰린 및 L-아스파트산을 첨가하지 않는다. 대신 트리스-HCl(20 mM)로 100 ㎕의 최종 부피로 만든다.
8. 37 ℃에서 1.5 시간동안 샘플을 배양한다. ASS-1 또는 ArgG 효소 반응이 일어날 것이다.
9. 4 mM L-시트룰린 용액의 1:4 희석을 수행하여 1 mM L-시트룰린 용액을 제조함으로써 L-시트룰린 표준물을 제조한다. 에펜도르프 튜브에 10, 20, 30, 50, 80 및 100 ㎕의 L-시트룰린(1 mM)을 첨가하고, 멸균 증류수로 각각의 표준물을 100 ㎕까지 제조한다. 이에 의해 0, 10, 20, 30, 50, 80 및 100 nM의 L-시트룰린 농도가 달성된다. 블랭크 대조군을 포함시킨다.
10. 각각의 표준물에 10 ㎕의 L-아스파트산(4 mM, pH 7.5), 10 ㎕의 MgCl2(6 mM), 10 ㎕의 ATP(4 mM, pH 7.5), 및 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제를 첨가한다. ASS-1 또는 ArgG 효소 활성 샘플내 L-시트룰린 농도를 보다 정확하게 측정하기 위해 ASS-1 또는 ArgG 효소 시약을 표준물에 첨가한다.
11. 37 ℃에서 1.5 시간후에, 80 ㎕의 정지 용액(인산 및 황산 각각의 3:1 혼합물) 및 20 ㎕의 3% 2,3 부탄다이온 모노옥심(당일에 멸균 중류수를 사용하고 지독한 냄새가 나므로 환기통에서 새로 제조한다)을 각 샘플 및 표준물에 첨가한다.
12. 볼텍싱 및 펄스 원심분리에 의해 튜브를 혼합한다. 모든 샘플 및 표준물들을 95 ℃에서 30 분동안 배양한다. 2,3 부탄다이온 모노옥심이 95 ℃에서 산성 조건하에 L-시트룰린과 반응할 때 황색/오렌지색이 나타날 것이다.
13. 튜브를 13000 rpm에서 1 분동안 원심분리하여 임의의 파편을 펠릿화한다. 이중으로, 50 ㎕의 상등액을 96-웰 평저 플레이트의 웰에 첨가한다.
14. 미세플레이트 흡광도 판독기를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 판독한다.
오르니틴 트랜스카바밀라제 (OTC) 또는 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제 ( ArgF ) 효소 활성 분석 - L-시트룰린 생성을 측정하기 위한 분석
1. 샘플 당 5x106 세포를 펠릿화한다(기질 대조군이 없는 경우 5x106 세포 첨가시 충분한 세포 펠릿이 있다면).
2. 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제(0.1% 트리톤-X는 분자 실험실에서 4 ℃에서 50 ml 튜브에 보관한다)에 재현탁하고, 가끔 볼텍싱하면서 20 분동안 얼음 위에서 배양한다.
3. 4 ℃에서 20 분동안 13,000 rpm에서 샘플을 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화한다.
4. 20 ㎕의 세포 용해물을 새 에펜도르프 튜브에 취하고 얼음 위에서 유지시킨다.
5. 각 샘플을 위해 새 에펜도르프 튜브를 취하고, 25 ㎕의 L-오르니틴(50 mM, pH 8.0), 25 ㎕의 트라이에탄올아민(피펫으로 병에서 똑바로, 용액이 매우 점성이어서 피펫으로 천천히), 25 ㎕의 새로 제조한 카바밀 포스페이트(150 mM, pH 8.0), 및 10 ㎕의 SDW를 첨가한다.
6. 이어서, 20 ㎕의 세포 용해물을 각각의 튜브에 첨가한다. 효소 대조군이 없는 경우, 세포 용해물 대신 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제를 첨가한다.
7. 기질 대조군이 없이 수행하는 경우, OTC 또는 ArgF 기질, 즉 L-오르니틴 및 카바밀 포스페이트를 첨가하지 않는다. 대신 SDW로 100 ㎕의 최종 부피로 만든다.
8. 37 ℃에서 1.5 시간동안 샘플을 배양한다. OTC 또는 ArgF 효소 반응이 일어날 것이다.
9. 4 mM L-시트룰린 용액(ASS-1 효소 활성 분석에 사용된 -20 ℃에서의 저장액)의 1:4 희석을 수행하여 1 mM L-시트룰린 용액을 제조함으로써 L-시트룰린 표준물을 제조한다. 에펜도르프 튜브에 10, 20, 30, 50, 80 및 100 ㎕의 L-시트룰린(1 mM)을 첨가하고, 멸균 증류수로 각각의 표준물을 100 ㎕까지 제조한다. 이에 의해 0, 10, 20, 30, 50, 80 및 100 nM의 L-시트룰린 농도가 달성된다. 블랭크 대조군을 포함시킨다.
10. 각각의 표준물에 25 ㎕의 L-오르니틴(50 mM), 25 ㎕의 트라이에탄올아민, 25 ㎕의 새로 제조한 카바밀 포스페이트(150 mM), 및 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제를 첨가한다. OTC 또는 ArgF 효소 활성 샘플내 L-시트룰린 농도를 보다 정확하게 측정하기 위해 OTC 효소 시약을 표준물에 첨가한다.
11. 37 ℃에서 1.5 시간후에, 80 ㎕의 정지 용액(인산 및 황산 각각의 3:1 혼합물) 및 20 ㎕의 3% 2,3 부탄다이온 모노옥심(당일에 멸균 중류수를 사용하고 지독한 냄새가 나므로 환기통에서 새로 제조한다)을 각 샘플 및 표준물에 첨가한다.
12. 볼텍싱 및 펄스 원심분리에 의해 튜브를 혼합한다. 모든 샘플 및 표준물들을 95 ℃에서 30 분동안 배양한다. 2,3 부탄다이온 모노옥심이 95 ℃에서 산성 조건하에 L-시트룰린과 반응할 때 황색/오렌지색이 나타날 것이다.
13. 튜브를 13000 rpm에서 1 분동안 원심분리하여 임의의 파편을 펠릿화한다. 이중으로, 50 ㎕의 상등액을 96-웰 평저 플레이트의 웰에 첨가한다.
14. 미세플레이트 흡광도 판독기를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 판독한다.
아르기니노숙시네이트 리아제( ASL ) 또는 ( AgrH ) 효소 활성 분석 - L- 푸마레이트 생성 또는 아르기닌 생성을 측정하기 위한 분석
1. 샘플 당 5x106 세포를 펠릿화한다(기질 대조군이 없는 경우 5x106 세포 첨가시 충분한 세포 펠릿이 있다면).
2. 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제(0.1% 트리톤-X는 분자 실험실에서 4 ℃에서 50 ml 튜브에 보관한다)에 재현탁하고, 가끔 볼텍싱하면서 20 분동안 얼음 위에서 배양한다.
3. 4 ℃에서 20 분동안 13,000 rpm에서 샘플을 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화한다.
4. 20 ㎕의 세포 용해물을 새 에펜도르프 튜브에 취하고 얼음 위에서 유지시킨다.
5. 각 샘플을 위해 새 에펜도르프 튜브를 취하고, 25 ㎕의 L-아르기니노숙신산(11.7 mM) 및 55 ㎕의 PBS를 첨가한다.
6. 이어서, 20 ㎕의 세포 용해물을 각각의 튜브에 첨가한다. 효소 대조군이 없는 경우, 세포 용해물 대신 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제를 첨가한다.
7. 기질 대조군이 없이 수행하는 경우, ASL 또는 ArgH 기질, 즉 L-아르기니노숙신산을 첨가하지 않는다. 대신 SDW로 100 ㎕의 최종 부피로 만든다.
8. 37 ℃에서 1.5 시간동안 샘플을 배양한다. ASL 또는 ArgH 효소 반응이 일어날 것이다.
9. 4 mM L-푸마레이트 용액의 1:4 희석을 수행하여 1 mM L-푸마레이트 용액을 제조함으로써 L-푸마레이트 표준물을 제조한다. 에펜도르프 튜브에 10, 20, 30, 50, 80 및 100 ㎕의 L-푸마레이트(1 mM)를 첨가하고, 멸균 증류수로 각각의 표준물을 100 ㎕까지 제조한다. 이에 의해 0, 10, 20, 30, 50, 80 및 100 nM의 L-푸마레이트 농도가 달성된다. 블랭크 대조군을 포함시킨다.
10. 각각의 표준물에 25 ㎕의 L-아르기니노숙신산(11.7 mM) 및 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제를 첨가한다. ASL 또는 ArgH 효소 활성 샘플내 L-푸마레이트 농도를 보다 정확하게 측정하기 위해 ASL 효소 시약을 표준물에 첨가한다.
11. 37 ℃에서 1.5 시간후에, 튜브를 13000 rpm에서 1 분동안 원심분리하여 임의의 파편을 펠릿화한다. 이중으로, 50 ㎕의 상등액을 96-웰 평저 플레이트의 웰에 첨가한다.
12. 미세플레이트 흡광도 판독기를 사용하여 2400 nm에서 흡광도를 판독한다.
13. 아르기닌 생성은 또한 HPLC 또는 아르기닌 ELISA를 제조사의 지시에 따라 사용하여 상기 단계 11에서 측정할 수도 있다. 세포 상등액 농도의 측정을 위해, 상기 프로토콜을 그에 따라 세포 용해물 대신 100 ㎕의 세포 상등액을 사용하여 변형시킬 수 있다.
트립토판 신타제 ( Trp5 ) 효소 활성 분석 - 인돌 고갈 또는 트립토판 생성을 측정하기 위한 분석
1. 샘플 당 5x106 세포를 펠릿화한다(기질 대조군이 없는 경우 5x106 세포 첨가시 충분한 세포 펠릿이 있다면).
2. 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제(0.1% 트리톤-X는 분자 실험실에서 4 ℃에서 50 ml 튜브에 보관한다)에 재현탁하고, 가끔 볼텍싱하면서 20 분동안 얼음 위에서 배양한다.
3. 4 ℃에서 20 분동안 13,000 rpm에서 샘플을 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화한다.
4. 20 ㎕의 세포 용해물을 새 에펜도르프 튜브에 취하고 얼음 위에서 유지시킨다.
5. 각 샘플을 위해 새 에펜도르프 튜브를 취하고, 80 ㎕의 인돌 용액(0.005 M), 400 ㎕ DL-세린 용액(0.2 M), 100 ㎕ 피리독살 포스페이트 용액, 20 ㎕ 글루타티온(0.05 M) 및 120 ㎕의 포스페이트 완충제(0.5 M, pH 7.8), 260 ㎕ 물을 첨가한다.
6. 이어서, 20 ㎕의 세포 용해물을 각각의 튜브에 첨가한다. 효소 대조군이 없는 경우, 세포 용해물 대신 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제를 첨가한다.
7. 기질 대조군이 없이 수행하는 경우, Trp5 기질, 즉 인돌 및 세린 용액을 첨가하지 않는다. 대신 SDW로 1000 ㎕의 최종 부피로 만든다.
8. 37 ℃에서 1.5 시간동안 샘플을 배양한다. Trp5 효소 반응이 일어날 것이다.
9. 4 mM L-푸마레이트 용액의 1:4 희석을 수행하여 1 mM 인돌 용액을 제조함으로써 인돌 표준물을 제조한다. 에펜도르프 튜브에 10, 20, 30, 50, 80 및 100 ㎕의 인돌(1 mM)을 첨가하고, 멸균 증류수로 각각의 표준물을 1000 ㎕까지 제조한다. 이에 의해 0, 10, 20, 30, 50, 80 및 100 nM의 인돌 농도가 달성된다. 블랭크 대조군을 포함시킨다. 각각의 표준물에 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제를 첨가한다.
10. 37 ℃에서 1.5 시간후에, 200 ㎕의 5% NaOH를 첨가한다. 4 ml의 톨루엔을 각각의 튜부에 첨가하고 원심분리하여 용액을 2개 층으로 분리시킨다.
11. 1 ml 이하의 톨루엔 층을 별도의 시험관에 피펫팅한다. 4 ml의 에탄올 및 2 ml의 p-다이메틸아미노벤즈알데하이드 용액(다음과 같이 제조함: 500 ml의 에탄올에 36 g를 용해시킨다. 180 ml의 진한 HCl을 첨가한다. 냉각되면 에탄올로 부피를 1 L가 되게한다)을 첨가한다. 60 분동안 색 변화가 일어나게 한다.
12. 미세플레이트 흡광도 판독기를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 판독한다.
13. 트립토판 생성은 또한 HPLC 또는 트립토판 ELISA를 제조사의 지시에 따라 사용하여 상기 단계 10에서 측정할 수도 있다. 세포 상등액 농도의 측정을 위해, 상기 프로토콜을 그에 따라 세포 용해물 대신 100 ㎕의 세포 상등액을 사용하여 변형시킬 수 있다.
인돌아민 2,3- 다이옥시게나제 (IDO) 효소 활성 분석 - 키뉴레닌 생성을 측정하기 위한 분석
1. 샘플 당 5x106 세포를 펠릿화한다(기질 대조군이 없는 경우 5x106 세포 첨가시 충분한 세포 펠릿이 있다면).
2. 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제(0.1% 트리톤-X는 분자 실험실에서 4 ℃에서 50 ml 튜브에 보관한다)에 재현탁하고, 가끔 볼텍싱하면서 20 분동안 얼음 위에서 배양한다.
3. 4 ℃에서 20 분동안 13,000 rpm에서 샘플을 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화한다.
4. 20 ㎕의 세포 용해물을 새 에펜도르프 튜브에 취하고 얼음 위에서 유지시킨다.
5. 각 샘플을 위해 새 에펜도르프 튜브를 취하고, 50 ㎕의 트라이클로로아세트산(30%)을 세포 용해물에 첨가한다. 볼텍싱하고 10,000 rpm에서 5 분동안 원심분리한다.
6. 상등액을 수거하고 동일 부피의 에를리히(Ehrlich) 시약(100 mg P-다이메틸벤즈알데하이드, 5 ml 아세트산)에 첨가한다.
7. 4 mM 키뉴레닌 용액의 1:4 희석을 수행하여 1 mM 키뉴레닌 용액을 제조함으로써 키뉴레닌 표준물을 제조한다. 에펜도르프 튜브에 10, 20, 30, 50, 80 및 100 ㎕의 키뉴레닌(1 mM)을 첨가하고, 멸균 증류수로 각각의 표준물을 1000 ㎕까지 제조한다. 이에 의해 0, 10, 20, 30, 50, 80 및 100 nM의 키뉴레닌 농도가 달성된다. 블랭크 대조군을 포함시킨다. 각각의 표준물에 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제를 첨가한다.
8. 미세플레이트 흡광도 판독기를 사용하여 492 nm에서 흡광도를 판독한다.
9. 키뉴레닌 생성은 또한 HPLC 또는 트립토판 ELISA를 제조사의 지시에 따라 사용하여 상기 단계 4에서 측정할 수도 있다. 세포 상등액 농도의 측정을 위해, 상기 프로토콜을 그에 따라 세포 용해물 대신 100 ㎕의 세포 상등액을 사용하여 변형시킬 수 있다.
오르니틴 디카복실라제 ( ODC1 ) 효소 활성 분석 - 폴리아민 생성을 측정하기 위한 분석
1. 샘플 당 5x106 세포를 펠릿화한다(기질 대조군이 없는 경우 5x106 세포 첨가시 충분한 세포 펠릿이 있다면).
2. 20 ㎕의 0.1% 트리톤-X + 프로테아제 억제제(0.1% 트리톤-X는 분자 실험실에서 4 ℃에서 50 ml 튜브에 보관한다)에 재현탁하고, 가끔 볼텍싱하면서 20 분동안 얼음 위에서 배양한다.
3. 4 ℃에서 20 분동안 13,000 rpm에서 샘플을 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화한다.
4. 20 ㎕의 세포 용해물을 새 에펜도르프 튜브에 취하고 얼음 위에서 유지시킨다.
5. 폴리아민 생성은 HPLC 또는 폴리아민 ELISA를 제조사의 지시에 따라 사용하여 측정한다. 세포 상등액 농도의 측정을 위해, 상기 프로토콜을 그에 따라 세포 용해물 대신 100 ㎕의 세포 상등액을 사용하여 변형시킬 수 있다.
서열 정보
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
SEQUENCE LISTING <110> Cancer Research Technology Limited <120> Fusion Proteins <130> P246716WO <140> PCT/GB2018/053771 <141> 2018-12-24 <150> GB 1721833.0 <151> 2017-12-22 <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ASS-1 enzyme domain <400> 1 Met Ser Ser Lys Gly Ser Val Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp 1 5 10 15 Thr Ser Cys Ile Leu Val Trp Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile 20 25 30 Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys Glu Asp Phe Glu Glu Ala Arg 35 40 45 Lys Lys Ala Leu Lys Leu Gly Ala Lys Lys Val Phe Ile Glu Asp Val 50 55 60 Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu Phe Ile Trp Pro Ala Ile Gln Ser Ser 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala Arg Pro 85 90 95 Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val Glu Ile Ala Gln Arg Glu Gly Ala Lys 100 105 110 Tyr Val Ser His Gly Ala Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gln Val Arg Phe 115 120 125 Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu Ala Pro Gln Ile Lys Val Ile Ala Pro 130 135 140 Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr Asn Arg Phe Lys Gly Arg Asn Asp Leu 145 150 155 160 Met Glu Tyr Ala Lys Gln His Gly Ile Pro Ile Pro Val Thr Pro Lys 165 170 175 Asn Pro Trp Ser Met Asp Glu Asn Leu Met His Ile Ser Tyr Glu Ala 180 185 190 Gly Ile Leu Glu Asn Pro Lys Asn Gln Ala Pro Pro Gly Leu Tyr Thr 195 200 205 Lys Thr Gln Asp Pro Ala Lys Ala Pro Asn Thr Pro Asp Ile Leu Glu 210 215 220 Ile Glu Phe Lys Lys Gly Val Pro Val Lys Val Thr Asn Val Lys Asp 225 230 235 240 Gly Thr Thr His Gln Thr Ser Leu Glu Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu 245 250 255 Val Ala Gly Lys His Gly Val Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg 260 265 270 Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala Gly Thr 275 280 285 Ile Leu Tyr His Ala His Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr Met Asp Arg 290 295 300 Glu Val Arg Lys Ile Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys Phe Ala Glu Leu 305 310 315 320 Val Tyr Thr Gly Phe Trp His Ser Pro Glu Cys Glu Phe Val Arg His 325 330 335 Cys Ile Ala Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu Gly Lys Val Gln Val Ser 340 345 350 Val Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu Gly Arg Glu Ser Pro Leu Ser 355 360 365 Leu Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser Met Asn Val Gln Gly Asp Tyr Glu 370 375 380 Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe Ile Asn Ile Asn Ser Leu Arg Leu Lys 385 390 395 400 Glu Tyr His Arg Leu Gln Ser Lys Val Thr Ala Lys 405 410 <210> 2 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary OTC enzyme domain <400> 2 Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn 1 5 10 15 Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln 20 25 30 Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe 35 40 45 Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys 50 55 60 Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys 65 70 75 80 Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser 85 90 95 Thr Glu Thr Gly Leu Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr 100 105 110 Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala 115 120 125 Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys 130 135 140 Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile 145 150 155 160 Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr 165 170 175 Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser 180 185 190 Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala 195 200 205 Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu 210 215 220 Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn 225 230 235 240 Gly Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly 245 250 255 Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu 260 265 270 Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met 275 280 285 Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu 290 295 300 Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg 305 310 315 320 Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala 325 330 335 Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro 340 345 350 Lys Phe <210> 3 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary GD2 target binding moiety <400> 3 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Ser 130 135 140 Leu Val Glu Pro Gly Ala Ser Val Met Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly 165 170 175 Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr 180 185 190 Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys 195 200 205 Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp 210 215 220 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr 245 250 255 Gly Arg Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 4 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary CD33 target binding moiety <400> 4 Gly Ser Asn Ile Met Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser 1 5 10 15 Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe 20 25 30 Phe Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro 35 40 45 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 50 55 60 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 80 Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 His Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 145 150 155 160 Ser Tyr Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu 165 170 175 Trp Val Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln 180 185 190 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr 195 200 205 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 225 230 235 240 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 5 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary mesothelin target binding moiety <400> 5 Met Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 20 25 30 Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys 50 55 60 Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140 Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala 145 150 155 160 Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr 165 170 175 Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val 180 185 190 Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr 195 200 205 Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220 Trp Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240 Lys <210> 6 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary EGFRVIII target binding moiety <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140 Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr 145 150 155 160 Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe 195 200 205 Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr 210 215 220 <210> 7 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary 4-1BB intracellular signalling region <400> 7 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 8 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary OX-40 intracellular signalling region <400> 8 Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr 20 25 30 Leu Ala Lys Ile 35 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary CD28 intracellular signalling region with transmembrane domain <400> 9 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 35 40 45 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 50 55 60 Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn 65 70 75 80 Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr 85 90 95 Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 100 105 <210> 10 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ICOS intracellular signalling region <400> 10 Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn 1 5 10 15 Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg 20 25 30 Leu Thr Asp Val Thr Leu 35 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary CD3 zeta intracellular signalling region <400> 11 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 12 <211> 1896 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention GD2 ASS+OTC <400> 12 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Leu Leu 355 360 365 Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser 370 375 380 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asn Thr 385 390 395 400 Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 405 410 415 Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 420 425 430 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu 435 440 445 Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro 450 455 460 Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 465 470 475 480 Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 485 490 495 Gly Gly Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Ser Leu Val Glu Pro 500 505 510 Gly Ala Ser Val Met Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr 515 520 525 Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu 530 535 540 Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln 545 550 555 560 Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 565 570 575 Ala Tyr Met His Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 580 585 590 Tyr Cys Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 595 600 605 Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Gly Arg Val Thr 610 615 620 Val Ser Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 625 630 635 640 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 645 650 655 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 660 665 670 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 675 680 685 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 690 695 700 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 705 710 715 720 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 725 730 735 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 740 745 750 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 755 760 765 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 770 775 780 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 785 790 795 800 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 805 810 815 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 820 825 830 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 835 840 845 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys 850 855 860 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 865 870 875 880 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 885 890 895 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 900 905 910 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 915 920 925 Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 930 935 940 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 945 950 955 960 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg 965 970 975 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln 980 985 990 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 995 1000 1005 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 1010 1015 1020 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 1025 1030 1035 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 1040 1045 1050 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 1055 1060 1065 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 1070 1075 1080 Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys 1085 1090 1095 Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Ser Lys 1100 1105 1110 Gly Ser Val Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Ser Cys 1115 1120 1125 Ile Leu Val Trp Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile Ala Tyr 1130 1135 1140 Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys Glu Asp Phe Glu Glu Ala Arg Lys 1145 1150 1155 Lys Ala Leu Lys Leu Gly Ala Lys Lys Val Phe Ile Glu Asp Val 1160 1165 1170 Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu Phe Ile Trp Pro Ala Ile Gln Ser 1175 1180 1185 Ser Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala 1190 1195 1200 Arg Pro Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val Glu Ile Ala Gln Arg Glu 1205 1210 1215 Gly Ala Lys Tyr Val Ser His Gly Ala Thr Gly Lys Gly Asn Asp 1220 1225 1230 Gln Val Arg Phe Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu Ala Pro Gln Ile 1235 1240 1245 Lys Val Ile Ala Pro Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr Asn Arg Phe 1250 1255 1260 Lys Gly Arg Asn Asp Leu Met Glu Tyr Ala Lys Gln His Gly Ile 1265 1270 1275 Pro Ile Pro Val Thr Pro Lys Asn Pro Trp Ser Met Asp Glu Asn 1280 1285 1290 Leu Met His Ile Ser Tyr Glu Ala Gly Ile Leu Glu Asn Pro Lys 1295 1300 1305 Asn Gln Ala Pro Pro Gly Leu Tyr Thr Lys Thr Gln Asp Pro Ala 1310 1315 1320 Lys Ala Pro Asn Thr Pro Asp Ile Leu Glu Ile Glu Phe Lys Lys 1325 1330 1335 Gly Val Pro Val Lys Val Thr Asn Val Lys Asp Gly Thr Thr His 1340 1345 1350 Gln Thr Ser Leu Glu Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu Val Ala Gly 1355 1360 1365 Lys His Gly Val Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg Phe Ile 1370 1375 1380 Gly Met Lys Ser Arg Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala Gly Thr Ile 1385 1390 1395 Leu Tyr His Ala His Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr Met Asp Arg 1400 1405 1410 Glu Val Arg Lys Ile Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys Phe Ala Glu 1415 1420 1425 Leu Val Tyr Thr Gly Phe Trp His Ser Pro Glu Cys Glu Phe Val 1430 1435 1440 Arg His Cys Ile Ala Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu Gly Lys Val 1445 1450 1455 Gln Val Ser Val Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu Gly Arg Glu 1460 1465 1470 Ser Pro Leu Ser Leu Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser Met Asn Val 1475 1480 1485 Gln Gly Asp Tyr Glu Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe Ile Asn Ile 1490 1495 1500 Asn Ser Leu Arg Leu Lys Glu Tyr His Arg Leu Gln Ser Lys Val 1505 1510 1515 Thr Ala Lys Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys 1520 1525 1530 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Phe Asn Leu Arg 1535 1540 1545 Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn Gly His Asn Phe Met 1550 1555 1560 Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln Asn Lys Val Gln 1565 1570 1575 Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe Thr Gly Glu 1580 1585 1590 Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys Phe Arg 1595 1600 1605 Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys Ser 1610 1615 1620 Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser 1625 1630 1635 Thr Glu Thr Gly Leu Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu 1640 1645 1650 Thr Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp 1655 1660 1665 Thr Ala Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg 1670 1675 1680 Val Tyr Lys Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser 1685 1690 1695 Ile Pro Ile Ile Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln 1700 1705 1710 Ile Leu Ala Asp Tyr Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu 1715 1720 1725 Lys Gly Leu Thr Leu Ser Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu 1730 1735 1740 His Ser Ile Met Met Ser Ala Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln 1745 1750 1755 Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys 1760 1765 1770 Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn Gly Thr Lys Leu Leu Leu 1775 1780 1785 Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly Gly Asn Val Leu Ile 1790 1795 1800 Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu Glu Lys Lys Lys 1805 1810 1815 Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met Lys Thr Ala 1820 1825 1830 Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu Pro Arg 1835 1840 1845 Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg Ser 1850 1855 1860 Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala 1865 1870 1875 Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys 1880 1885 1890 Pro Lys Phe 1895 <210> 13 <211> 1521 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention GD2 ASS1 <400> 13 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Leu Leu 355 360 365 Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser 370 375 380 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asn Thr 385 390 395 400 Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 405 410 415 Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 420 425 430 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu 435 440 445 Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro 450 455 460 Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 465 470 475 480 Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 485 490 495 Gly Gly Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Ser Leu Val Glu Pro 500 505 510 Gly Ala Ser Val Met Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr 515 520 525 Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu 530 535 540 Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln 545 550 555 560 Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 565 570 575 Ala Tyr Met His Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 580 585 590 Tyr Cys Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 595 600 605 Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Gly Arg Val Thr 610 615 620 Val Ser Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 625 630 635 640 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 645 650 655 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 660 665 670 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 675 680 685 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 690 695 700 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 705 710 715 720 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 725 730 735 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 740 745 750 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 755 760 765 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 770 775 780 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 785 790 795 800 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 805 810 815 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 820 825 830 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 835 840 845 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys 850 855 860 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 865 870 875 880 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 885 890 895 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 900 905 910 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 915 920 925 Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 930 935 940 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 945 950 955 960 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg 965 970 975 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln 980 985 990 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 995 1000 1005 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 1010 1015 1020 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 1025 1030 1035 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 1040 1045 1050 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 1055 1060 1065 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 1070 1075 1080 Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys 1085 1090 1095 Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Ser Lys 1100 1105 1110 Gly Ser Val Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Ser Cys 1115 1120 1125 Ile Leu Val Trp Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile Ala Tyr 1130 1135 1140 Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys Glu Asp Phe Glu Glu Ala Arg Lys 1145 1150 1155 Lys Ala Leu Lys Leu Gly Ala Lys Lys Val Phe Ile Glu Asp Val 1160 1165 1170 Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu Phe Ile Trp Pro Ala Ile Gln Ser 1175 1180 1185 Ser Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala 1190 1195 1200 Arg Pro Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val Glu Ile Ala Gln Arg Glu 1205 1210 1215 Gly Ala Lys Tyr Val Ser His Gly Ala Thr Gly Lys Gly Asn Asp 1220 1225 1230 Gln Val Arg Phe Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu Ala Pro Gln Ile 1235 1240 1245 Lys Val Ile Ala Pro Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr Asn Arg Phe 1250 1255 1260 Lys Gly Arg Asn Asp Leu Met Glu Tyr Ala Lys Gln His Gly Ile 1265 1270 1275 Pro Ile Pro Val Thr Pro Lys Asn Pro Trp Ser Met Asp Glu Asn 1280 1285 1290 Leu Met His Ile Ser Tyr Glu Ala Gly Ile Leu Glu Asn Pro Lys 1295 1300 1305 Asn Gln Ala Pro Pro Gly Leu Tyr Thr Lys Thr Gln Asp Pro Ala 1310 1315 1320 Lys Ala Pro Asn Thr Pro Asp Ile Leu Glu Ile Glu Phe Lys Lys 1325 1330 1335 Gly Val Pro Val Lys Val Thr Asn Val Lys Asp Gly Thr Thr His 1340 1345 1350 Gln Thr Ser Leu Glu Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu Val Ala Gly 1355 1360 1365 Lys His Gly Val Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg Phe Ile 1370 1375 1380 Gly Met Lys Ser Arg Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala Gly Thr Ile 1385 1390 1395 Leu Tyr His Ala His Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr Met Asp Arg 1400 1405 1410 Glu Val Arg Lys Ile Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys Phe Ala Glu 1415 1420 1425 Leu Val Tyr Thr Gly Phe Trp His Ser Pro Glu Cys Glu Phe Val 1430 1435 1440 Arg His Cys Ile Ala Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu Gly Lys Val 1445 1450 1455 Gln Val Ser Val Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu Gly Arg Glu 1460 1465 1470 Ser Pro Leu Ser Leu Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser Met Asn Val 1475 1480 1485 Gln Gly Asp Tyr Glu Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe Ile Asn Ile 1490 1495 1500 Asn Ser Leu Arg Leu Lys Glu Tyr His Arg Leu Gln Ser Lys Val 1505 1510 1515 Thr Ala Lys 1520 <210> 14 <211> 1463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention GD2 OTC <400> 14 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Leu Leu 355 360 365 Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser 370 375 380 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asn Thr 385 390 395 400 Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 405 410 415 Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 420 425 430 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu 435 440 445 Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro 450 455 460 Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 465 470 475 480 Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 485 490 495 Gly Gly Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Ser Leu Val Glu Pro 500 505 510 Gly Ala Ser Val Met Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr 515 520 525 Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu 530 535 540 Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln 545 550 555 560 Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 565 570 575 Ala Tyr Met His Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 580 585 590 Tyr Cys Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 595 600 605 Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Gly Arg Val Thr 610 615 620 Val Ser Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 625 630 635 640 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 645 650 655 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 660 665 670 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 675 680 685 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 690 695 700 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 705 710 715 720 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 725 730 735 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 740 745 750 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 755 760 765 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 770 775 780 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 785 790 795 800 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 805 810 815 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 820 825 830 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 835 840 845 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys 850 855 860 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 865 870 875 880 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 885 890 895 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 900 905 910 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 915 920 925 Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 930 935 940 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 945 950 955 960 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg 965 970 975 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln 980 985 990 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 995 1000 1005 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 1010 1015 1020 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 1025 1030 1035 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 1040 1045 1050 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 1055 1060 1065 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 1070 1075 1080 Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys 1085 1090 1095 Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Phe Asn 1100 1105 1110 Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn Gly His Asn 1115 1120 1125 Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln Asn Lys 1130 1135 1140 Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe Thr 1145 1150 1155 Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys 1160 1165 1170 Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly 1175 1180 1185 Lys Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg 1190 1195 1200 Leu Ser Thr Glu Thr Gly Leu Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys 1205 1210 1215 Phe Leu Thr Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu 1220 1225 1230 Thr Asp Thr Ala Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu 1235 1240 1245 Ala Arg Val Tyr Lys Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu 1250 1255 1260 Ala Ser Ile Pro Ile Ile Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro 1265 1270 1275 Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser 1280 1285 1290 Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn 1295 1300 1305 Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala Ala Lys Phe Gly Met His 1310 1315 1320 Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu Pro Asp Ala Ser Val 1325 1330 1335 Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn Gly Thr Lys Leu 1340 1345 1350 Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly Gly Asn Val 1355 1360 1365 Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu Glu Lys 1370 1375 1380 Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met Lys 1385 1390 1395 Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu 1400 1405 1410 Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro 1415 1420 1425 Arg Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile 1430 1435 1440 Met Ala Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu 1445 1450 1455 Gln Lys Pro Lys Phe 1460 <210> 15 <211> 1637 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention Mesothelin ASS1+OTC <400> 15 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Met Gln Val Gln 355 360 365 Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 370 375 380 Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn 385 390 395 400 Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile 405 410 415 Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys 420 425 430 Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu 435 440 445 Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 450 455 460 Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 465 470 475 480 Thr Val Ser Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 485 490 495 Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala 500 505 510 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val 515 520 525 Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg 530 535 540 Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe 545 550 555 560 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val 565 570 575 Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr 580 585 590 Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr 595 600 605 Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro 610 615 620 Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val 625 630 635 640 His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 645 650 655 Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu 660 665 670 Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro 675 680 685 Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys 690 695 700 Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe 705 710 715 720 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu 725 730 735 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 740 745 750 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 755 760 765 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 770 775 780 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 785 790 795 800 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 805 810 815 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala 820 825 830 Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 835 840 845 Gly Pro Met Ser Ser Lys Gly Ser Val Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly 850 855 860 Leu Asp Thr Ser Cys Ile Leu Val Trp Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp 865 870 875 880 Val Ile Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys Glu Asp Phe Glu Glu 885 890 895 Ala Arg Lys Lys Ala Leu Lys Leu Gly Ala Lys Lys Val Phe Ile Glu 900 905 910 Asp Val Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu Phe Ile Trp Pro Ala Ile Gln 915 920 925 Ser Ser Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala 930 935 940 Arg Pro Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val Glu Ile Ala Gln Arg Glu Gly 945 950 955 960 Ala Lys Tyr Val Ser His Gly Ala Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gln Val 965 970 975 Arg Phe Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu Ala Pro Gln Ile Lys Val Ile 980 985 990 Ala Pro Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr Asn Arg Phe Lys Gly Arg Asn 995 1000 1005 Asp Leu Met Glu Tyr Ala Lys Gln His Gly Ile Pro Ile Pro Val 1010 1015 1020 Thr Pro Lys Asn Pro Trp Ser Met Asp Glu Asn Leu Met His Ile 1025 1030 1035 Ser Tyr Glu Ala Gly Ile Leu Glu Asn Pro Lys Asn Gln Ala Pro 1040 1045 1050 Pro Gly Leu Tyr Thr Lys Thr Gln Asp Pro Ala Lys Ala Pro Asn 1055 1060 1065 Thr Pro Asp Ile Leu Glu Ile Glu Phe Lys Lys Gly Val Pro Val 1070 1075 1080 Lys Val Thr Asn Val Lys Asp Gly Thr Thr His Gln Thr Ser Leu 1085 1090 1095 Glu Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu Val Ala Gly Lys His Gly Val 1100 1105 1110 Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg Phe Ile Gly Met Lys Ser 1115 1120 1125 Arg Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala Gly Thr Ile Leu Tyr His Ala 1130 1135 1140 His Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr Met Asp Arg Glu Val Arg Lys 1145 1150 1155 Ile Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys Phe Ala Glu Leu Val Tyr Thr 1160 1165 1170 Gly Phe Trp His Ser Pro Glu Cys Glu Phe Val Arg His Cys Ile 1175 1180 1185 Ala Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu Gly Lys Val Gln Val Ser Val 1190 1195 1200 Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu Gly Arg Glu Ser Pro Leu Ser 1205 1210 1215 Leu Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser Met Asn Val Gln Gly Asp Tyr 1220 1225 1230 Glu Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe Ile Asn Ile Asn Ser Leu Arg 1235 1240 1245 Leu Lys Glu Tyr His Arg Leu Gln Ser Lys Val Thr Ala Lys Gly 1250 1255 1260 Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1265 1270 1275 Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn 1280 1285 1290 Asn Ala Ala Phe Arg Asn Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe 1295 1300 1305 Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg 1310 1315 1320 Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr 1325 1330 1335 Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys Phe Arg Ile Lys Gln Lys 1340 1345 1350 Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys Ser Leu Gly Met Ile 1355 1360 1365 Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser Thr Glu Thr Gly 1370 1375 1380 Leu Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr Thr Gln Asp 1385 1390 1395 Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala Arg Val 1400 1405 1410 Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys Gln 1415 1420 1425 Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile 1430 1435 1440 Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp 1445 1450 1455 Tyr Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr 1460 1465 1470 Leu Ser Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met 1475 1480 1485 Met Ser Ala Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro 1490 1495 1500 Lys Gly Tyr Glu Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln 1505 1510 1515 Tyr Ala Lys Glu Asn Gly Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro 1520 1525 1530 Leu Glu Ala Ala His Gly Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp 1535 1540 1545 Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala 1550 1555 1560 Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala 1565 1570 1575 Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu Pro Arg Lys Pro Glu Glu 1580 1585 1590 Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg Ser Leu Val Phe Pro 1595 1600 1605 Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala Val Met Val Ser 1610 1615 1620 Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro Lys Phe 1625 1630 1635 <210> 16 <211> 1262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention Mesothelin ASS <400> 16 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Met Gln Val Gln 355 360 365 Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 370 375 380 Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn 385 390 395 400 Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile 405 410 415 Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys 420 425 430 Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu 435 440 445 Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 450 455 460 Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 465 470 475 480 Thr Val Ser Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 485 490 495 Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala 500 505 510 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val 515 520 525 Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg 530 535 540 Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe 545 550 555 560 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val 565 570 575 Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr 580 585 590 Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr 595 600 605 Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro 610 615 620 Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val 625 630 635 640 His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 645 650 655 Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu 660 665 670 Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro 675 680 685 Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys 690 695 700 Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe 705 710 715 720 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu 725 730 735 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 740 745 750 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 755 760 765 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 770 775 780 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 785 790 795 800 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 805 810 815 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala 820 825 830 Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 835 840 845 Gly Pro Met Ser Ser Lys Gly Ser Val Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly 850 855 860 Leu Asp Thr Ser Cys Ile Leu Val Trp Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp 865 870 875 880 Val Ile Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys Glu Asp Phe Glu Glu 885 890 895 Ala Arg Lys Lys Ala Leu Lys Leu Gly Ala Lys Lys Val Phe Ile Glu 900 905 910 Asp Val Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu Phe Ile Trp Pro Ala Ile Gln 915 920 925 Ser Ser Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala 930 935 940 Arg Pro Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val Glu Ile Ala Gln Arg Glu Gly 945 950 955 960 Ala Lys Tyr Val Ser His Gly Ala Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gln Val 965 970 975 Arg Phe Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu Ala Pro Gln Ile Lys Val Ile 980 985 990 Ala Pro Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr Asn Arg Phe Lys Gly Arg Asn 995 1000 1005 Asp Leu Met Glu Tyr Ala Lys Gln His Gly Ile Pro Ile Pro Val 1010 1015 1020 Thr Pro Lys Asn Pro Trp Ser Met Asp Glu Asn Leu Met His Ile 1025 1030 1035 Ser Tyr Glu Ala Gly Ile Leu Glu Asn Pro Lys Asn Gln Ala Pro 1040 1045 1050 Pro Gly Leu Tyr Thr Lys Thr Gln Asp Pro Ala Lys Ala Pro Asn 1055 1060 1065 Thr Pro Asp Ile Leu Glu Ile Glu Phe Lys Lys Gly Val Pro Val 1070 1075 1080 Lys Val Thr Asn Val Lys Asp Gly Thr Thr His Gln Thr Ser Leu 1085 1090 1095 Glu Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu Val Ala Gly Lys His Gly Val 1100 1105 1110 Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg Phe Ile Gly Met Lys Ser 1115 1120 1125 Arg Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala Gly Thr Ile Leu Tyr His Ala 1130 1135 1140 His Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr Met Asp Arg Glu Val Arg Lys 1145 1150 1155 Ile Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys Phe Ala Glu Leu Val Tyr Thr 1160 1165 1170 Gly Phe Trp His Ser Pro Glu Cys Glu Phe Val Arg His Cys Ile 1175 1180 1185 Ala Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu Gly Lys Val Gln Val Ser Val 1190 1195 1200 Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu Gly Arg Glu Ser Pro Leu Ser 1205 1210 1215 Leu Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser Met Asn Val Gln Gly Asp Tyr 1220 1225 1230 Glu Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe Ile Asn Ile Asn Ser Leu Arg 1235 1240 1245 Leu Lys Glu Tyr His Arg Leu Gln Ser Lys Val Thr Ala Lys 1250 1255 1260 <210> 17 <211> 1204 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention Mesothelin OTC <400> 17 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Met Gln Val Gln 355 360 365 Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 370 375 380 Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn 385 390 395 400 Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile 405 410 415 Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys 420 425 430 Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu 435 440 445 Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 450 455 460 Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 465 470 475 480 Thr Val Ser Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 485 490 495 Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala 500 505 510 Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val 515 520 525 Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg 530 535 540 Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe 545 550 555 560 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val 565 570 575 Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr 580 585 590 Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr 595 600 605 Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro 610 615 620 Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val 625 630 635 640 His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 645 650 655 Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu 660 665 670 Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro 675 680 685 Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys 690 695 700 Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe 705 710 715 720 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu 725 730 735 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 740 745 750 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 755 760 765 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 770 775 780 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 785 790 795 800 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 805 810 815 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala 820 825 830 Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 835 840 845 Gly Pro Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe 850 855 860 Arg Asn Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro 865 870 875 880 Leu Gln Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys 885 890 895 Asn Phe Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp 900 905 910 Leu Lys Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln 915 920 925 Gly Lys Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg 930 935 940 Leu Ser Thr Glu Thr Gly Leu Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe 945 950 955 960 Leu Thr Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp 965 970 975 Thr Ala Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val 980 985 990 Tyr Lys Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro 995 1000 1005 Ile Ile Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu 1010 1015 1020 Ala Asp Tyr Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly 1025 1030 1035 Leu Thr Leu Ser Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser 1040 1045 1050 Ile Met Met Ser Ala Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala 1055 1060 1065 Thr Pro Lys Gly Tyr Glu Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala 1070 1075 1080 Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn Gly Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn 1085 1090 1095 Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp 1100 1105 1110 Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu Glu Lys Lys Lys Arg Leu 1115 1120 1125 Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met Lys Thr Ala Lys Val 1130 1135 1140 Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu Pro Arg Lys Pro 1145 1150 1155 Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg Ser Leu Val 1160 1165 1170 Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala Val Met 1175 1180 1185 Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro Lys 1190 1195 1200 Phe <210> 18 <211> 1644 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention CD33 ASS+OTC <400> 18 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Asn Ile 355 360 365 Met Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys 370 375 380 Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Ser Ser Ser 385 390 395 400 Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Ser Pro 405 410 415 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 420 425 430 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 435 440 445 Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu 450 455 460 Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly 465 470 475 480 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val 485 490 495 Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val 500 505 510 Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile 515 520 525 His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly Val 530 535 540 Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 545 550 555 560 Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln 565 570 575 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 580 585 590 Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val 595 600 605 Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 610 615 620 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 625 630 635 640 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 645 650 655 Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu 660 665 670 Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu 675 680 685 Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln 690 695 700 Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly 705 710 715 720 Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 725 730 735 Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 740 745 750 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 755 760 765 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 770 775 780 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 785 790 795 800 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 805 810 815 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 820 825 830 Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala 835 840 845 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Ser Lys Gly Ser Val 850 855 860 Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Ser Cys Ile Leu Val Trp 865 870 875 880 Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly 885 890 895 Gln Lys Glu Asp Phe Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ala Leu Lys Leu Gly 900 905 910 Ala Lys Lys Val Phe Ile Glu Asp Val Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu 915 920 925 Phe Ile Trp Pro Ala Ile Gln Ser Ser Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr 930 935 940 Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala Arg Pro Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val 945 950 955 960 Glu Ile Ala Gln Arg Glu Gly Ala Lys Tyr Val Ser His Gly Ala Thr 965 970 975 Gly Lys Gly Asn Asp Gln Val Arg Phe Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu 980 985 990 Ala Pro Gln Ile Lys Val Ile Ala Pro Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr 995 1000 1005 Asn Arg Phe Lys Gly Arg Asn Asp Leu Met Glu Tyr Ala Lys Gln 1010 1015 1020 His Gly Ile Pro Ile Pro Val Thr Pro Lys Asn Pro Trp Ser Met 1025 1030 1035 Asp Glu Asn Leu Met His Ile Ser Tyr Glu Ala Gly Ile Leu Glu 1040 1045 1050 Asn Pro Lys Asn Gln Ala Pro Pro Gly Leu Tyr Thr Lys Thr Gln 1055 1060 1065 Asp Pro Ala Lys Ala Pro Asn Thr Pro Asp Ile Leu Glu Ile Glu 1070 1075 1080 Phe Lys Lys Gly Val Pro Val Lys Val Thr Asn Val Lys Asp Gly 1085 1090 1095 Thr Thr His Gln Thr Ser Leu Glu Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu 1100 1105 1110 Val Ala Gly Lys His Gly Val Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn 1115 1120 1125 Arg Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala 1130 1135 1140 Gly Thr Ile Leu Tyr His Ala His Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr 1145 1150 1155 Met Asp Arg Glu Val Arg Lys Ile Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys 1160 1165 1170 Phe Ala Glu Leu Val Tyr Thr Gly Phe Trp His Ser Pro Glu Cys 1175 1180 1185 Glu Phe Val Arg His Cys Ile Ala Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu 1190 1195 1200 Gly Lys Val Gln Val Ser Val Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu 1205 1210 1215 Gly Arg Glu Ser Pro Leu Ser Leu Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser 1220 1225 1230 Met Asn Val Gln Gly Asp Tyr Glu Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe 1235 1240 1245 Ile Asn Ile Asn Ser Leu Arg Leu Lys Glu Tyr His Arg Leu Gln 1250 1255 1260 Ser Lys Val Thr Ala Lys Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu 1265 1270 1275 Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Phe 1280 1285 1290 Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn Gly His 1295 1300 1305 Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln Asn 1310 1315 1320 Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe 1325 1330 1335 Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu 1340 1345 1350 Lys Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln 1355 1360 1365 Gly Lys Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr 1370 1375 1380 Arg Leu Ser Thr Glu Thr Gly Leu Ala Leu Leu Gly Gly His Pro 1385 1390 1395 Cys Phe Leu Thr Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser 1400 1405 1410 Leu Thr Asp Thr Ala Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val 1415 1420 1425 Leu Ala Arg Val Tyr Lys Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys 1430 1435 1440 Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His 1445 1450 1455 Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr 1460 1465 1470 Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser Trp Ile Gly Asp Gly Asn 1475 1480 1485 Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala Ala Lys Phe Gly Met 1490 1495 1500 His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu Pro Asp Ala Ser 1505 1510 1515 Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn Gly Thr Lys 1520 1525 1530 Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly Gly Asn 1535 1540 1545 Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu Glu 1550 1555 1560 Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met 1565 1570 1575 Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys 1580 1585 1590 Leu Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser 1595 1600 1605 Pro Arg Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr 1610 1615 1620 Ile Met Ala Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln 1625 1630 1635 Leu Gln Lys Pro Lys Phe 1640 <210> 19 <211> 1269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention CD33 ASS1 <400> 19 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Asn Ile 355 360 365 Met Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys 370 375 380 Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Ser Ser Ser 385 390 395 400 Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Ser Pro 405 410 415 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 420 425 430 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 435 440 445 Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu 450 455 460 Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly 465 470 475 480 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val 485 490 495 Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val 500 505 510 Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile 515 520 525 His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly Val 530 535 540 Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 545 550 555 560 Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln 565 570 575 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 580 585 590 Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val 595 600 605 Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 610 615 620 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 625 630 635 640 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 645 650 655 Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu 660 665 670 Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu 675 680 685 Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln 690 695 700 Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly 705 710 715 720 Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 725 730 735 Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 740 745 750 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 755 760 765 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 770 775 780 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 785 790 795 800 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 805 810 815 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 820 825 830 Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala 835 840 845 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Ser Lys Gly Ser Val 850 855 860 Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Ser Cys Ile Leu Val Trp 865 870 875 880 Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly 885 890 895 Gln Lys Glu Asp Phe Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ala Leu Lys Leu Gly 900 905 910 Ala Lys Lys Val Phe Ile Glu Asp Val Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu 915 920 925 Phe Ile Trp Pro Ala Ile Gln Ser Ser Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr 930 935 940 Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala Arg Pro Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val 945 950 955 960 Glu Ile Ala Gln Arg Glu Gly Ala Lys Tyr Val Ser His Gly Ala Thr 965 970 975 Gly Lys Gly Asn Asp Gln Val Arg Phe Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu 980 985 990 Ala Pro Gln Ile Lys Val Ile Ala Pro Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr 995 1000 1005 Asn Arg Phe Lys Gly Arg Asn Asp Leu Met Glu Tyr Ala Lys Gln 1010 1015 1020 His Gly Ile Pro Ile Pro Val Thr Pro Lys Asn Pro Trp Ser Met 1025 1030 1035 Asp Glu Asn Leu Met His Ile Ser Tyr Glu Ala Gly Ile Leu Glu 1040 1045 1050 Asn Pro Lys Asn Gln Ala Pro Pro Gly Leu Tyr Thr Lys Thr Gln 1055 1060 1065 Asp Pro Ala Lys Ala Pro Asn Thr Pro Asp Ile Leu Glu Ile Glu 1070 1075 1080 Phe Lys Lys Gly Val Pro Val Lys Val Thr Asn Val Lys Asp Gly 1085 1090 1095 Thr Thr His Gln Thr Ser Leu Glu Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu 1100 1105 1110 Val Ala Gly Lys His Gly Val Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn 1115 1120 1125 Arg Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala 1130 1135 1140 Gly Thr Ile Leu Tyr His Ala His Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr 1145 1150 1155 Met Asp Arg Glu Val Arg Lys Ile Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys 1160 1165 1170 Phe Ala Glu Leu Val Tyr Thr Gly Phe Trp His Ser Pro Glu Cys 1175 1180 1185 Glu Phe Val Arg His Cys Ile Ala Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu 1190 1195 1200 Gly Lys Val Gln Val Ser Val Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu 1205 1210 1215 Gly Arg Glu Ser Pro Leu Ser Leu Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser 1220 1225 1230 Met Asn Val Gln Gly Asp Tyr Glu Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe 1235 1240 1245 Ile Asn Ile Asn Ser Leu Arg Leu Lys Glu Tyr His Arg Leu Gln 1250 1255 1260 Ser Lys Val Thr Ala Lys 1265 <210> 20 <211> 1211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention CD33 OTC <400> 20 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Asn Ile 355 360 365 Met Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys 370 375 380 Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Ser Ser Ser 385 390 395 400 Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Ser Pro 405 410 415 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 420 425 430 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 435 440 445 Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu 450 455 460 Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly 465 470 475 480 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val 485 490 495 Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val 500 505 510 Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile 515 520 525 His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly Val 530 535 540 Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 545 550 555 560 Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln 565 570 575 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 580 585 590 Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val 595 600 605 Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 610 615 620 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 625 630 635 640 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 645 650 655 Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu 660 665 670 Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu 675 680 685 Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln 690 695 700 Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly 705 710 715 720 Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 725 730 735 Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 740 745 750 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 755 760 765 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 770 775 780 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 785 790 795 800 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 805 810 815 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 820 825 830 Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala 835 840 845 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile 850 855 860 Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn Gly His Asn Phe Met Val Arg 865 870 875 880 Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly 885 890 895 Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr 900 905 910 Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly 915 920 925 Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu 930 935 940 Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser Thr Glu Thr Gly Leu Ala Leu 945 950 955 960 Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr Thr Gln Asp Ile His Leu Gly 965 970 975 Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala Arg Val Leu Ser Ser Met Ala 980 985 990 Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu 995 1000 1005 Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile Asn Gly Leu Ser Asp Leu 1010 1015 1020 Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr Leu Thr Leu Gln Glu 1025 1030 1035 His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser Trp Ile Gly Asp 1040 1045 1050 Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala Ala Lys Phe 1055 1060 1065 Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu Pro Asp 1070 1075 1080 Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn Gly 1085 1090 1095 Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly 1100 1105 1110 Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu 1115 1120 1125 Glu Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val 1130 1135 1140 Thr Met Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu 1145 1150 1155 His Cys Leu Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe 1160 1165 1170 Tyr Ser Pro Arg Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys 1175 1180 1185 Trp Thr Ile Met Ala Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser 1190 1195 1200 Pro Gln Leu Gln Lys Pro Lys Phe 1205 1210 <210> 21 <211> 1651 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention EGFR ASS1+OTC <400> 21 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu 355 360 365 Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu 370 375 380 Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp 385 390 395 400 Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser 405 410 415 Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe 420 425 430 Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser 435 440 445 Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr 450 455 460 Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 465 470 475 480 Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 485 490 495 Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val 500 505 510 Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile 515 520 525 Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys 530 535 540 Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe 545 550 555 560 Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr 565 570 575 Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Asn Val 580 585 590 Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Lys Ala Leu Glu Gln 595 600 605 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala 610 615 620 Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 625 630 635 640 Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 645 650 655 Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 660 665 670 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 675 680 685 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 690 695 700 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 705 710 715 720 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 725 730 735 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 740 745 750 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 755 760 765 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 770 775 780 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 785 790 795 800 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 805 810 815 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 820 825 830 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn 835 840 845 Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 850 855 860 Met Ser Ser Lys Gly Ser Val Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp 865 870 875 880 Thr Ser Cys Ile Leu Val Trp Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile 885 890 895 Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys Glu Asp Phe Glu Glu Ala Arg 900 905 910 Lys Lys Ala Leu Lys Leu Gly Ala Lys Lys Val Phe Ile Glu Asp Val 915 920 925 Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu Phe Ile Trp Pro Ala Ile Gln Ser Ser 930 935 940 Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala Arg Pro 945 950 955 960 Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val Glu Ile Ala Gln Arg Glu Gly Ala Lys 965 970 975 Tyr Val Ser His Gly Ala Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gln Val Arg Phe 980 985 990 Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu Ala Pro Gln Ile Lys Val Ile Ala Pro 995 1000 1005 Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr Asn Arg Phe Lys Gly Arg Asn Asp 1010 1015 1020 Leu Met Glu Tyr Ala Lys Gln His Gly Ile Pro Ile Pro Val Thr 1025 1030 1035 Pro Lys Asn Pro Trp Ser Met Asp Glu Asn Leu Met His Ile Ser 1040 1045 1050 Tyr Glu Ala Gly Ile Leu Glu Asn Pro Lys Asn Gln Ala Pro Pro 1055 1060 1065 Gly Leu Tyr Thr Lys Thr Gln Asp Pro Ala Lys Ala Pro Asn Thr 1070 1075 1080 Pro Asp Ile Leu Glu Ile Glu Phe Lys Lys Gly Val Pro Val Lys 1085 1090 1095 Val Thr Asn Val Lys Asp Gly Thr Thr His Gln Thr Ser Leu Glu 1100 1105 1110 Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu Val Ala Gly Lys His Gly Val Gly 1115 1120 1125 Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg 1130 1135 1140 Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala Gly Thr Ile Leu Tyr His Ala His 1145 1150 1155 Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr Met Asp Arg Glu Val Arg Lys Ile 1160 1165 1170 Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys Phe Ala Glu Leu Val Tyr Thr Gly 1175 1180 1185 Phe Trp His Ser Pro Glu Cys Glu Phe Val Arg His Cys Ile Ala 1190 1195 1200 Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu Gly Lys Val Gln Val Ser Val Leu 1205 1210 1215 Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu Gly Arg Glu Ser Pro Leu Ser Leu 1220 1225 1230 Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser Met Asn Val Gln Gly Asp Tyr Glu 1235 1240 1245 Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe Ile Asn Ile Asn Ser Leu Arg Leu 1250 1255 1260 Lys Glu Tyr His Arg Leu Gln Ser Lys Val Thr Ala Lys Gly Ser 1265 1270 1275 Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu 1280 1285 1290 Asn Pro Gly Pro Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn 1295 1300 1305 Ala Ala Phe Arg Asn Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg 1310 1315 1320 Cys Gly Gln Pro Leu Gln Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp 1325 1330 1335 Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met 1340 1345 1350 Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly 1355 1360 1365 Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys Ser Leu Gly Met Ile Phe 1370 1375 1380 Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser Thr Glu Thr Gly Leu 1385 1390 1395 Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr Thr Gln Asp Ile 1400 1405 1410 His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala Arg Val Leu 1415 1420 1425 Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys Gln Ser 1430 1435 1440 Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile Asn 1445 1450 1455 Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr 1460 1465 1470 Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu 1475 1480 1485 Ser Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met 1490 1495 1500 Ser Ala Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys 1505 1510 1515 Gly Tyr Glu Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr 1520 1525 1530 Ala Lys Glu Asn Gly Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu 1535 1540 1545 Glu Ala Ala His Gly Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile 1550 1555 1560 Ser Met Gly Gln Glu Glu Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe 1565 1570 1575 Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser 1580 1585 1590 Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val 1595 1600 1605 Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg Ser Leu Val Phe Pro Glu 1610 1615 1620 Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala Val Met Val Ser Leu 1625 1630 1635 Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro Lys Phe 1640 1645 1650 <210> 22 <211> 1276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention EGFR ASS1 <400> 22 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu 355 360 365 Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu 370 375 380 Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp 385 390 395 400 Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser 405 410 415 Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe 420 425 430 Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser 435 440 445 Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr 450 455 460 Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 465 470 475 480 Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 485 490 495 Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val 500 505 510 Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile 515 520 525 Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys 530 535 540 Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe 545 550 555 560 Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr 565 570 575 Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Asn Val 580 585 590 Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Lys Ala Leu Glu Gln 595 600 605 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala 610 615 620 Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 625 630 635 640 Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 645 650 655 Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 660 665 670 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 675 680 685 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 690 695 700 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 705 710 715 720 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 725 730 735 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 740 745 750 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 755 760 765 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 770 775 780 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 785 790 795 800 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 805 810 815 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 820 825 830 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn 835 840 845 Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 850 855 860 Met Ser Ser Lys Gly Ser Val Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp 865 870 875 880 Thr Ser Cys Ile Leu Val Trp Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile 885 890 895 Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys Glu Asp Phe Glu Glu Ala Arg 900 905 910 Lys Lys Ala Leu Lys Leu Gly Ala Lys Lys Val Phe Ile Glu Asp Val 915 920 925 Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu Phe Ile Trp Pro Ala Ile Gln Ser Ser 930 935 940 Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala Arg Pro 945 950 955 960 Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val Glu Ile Ala Gln Arg Glu Gly Ala Lys 965 970 975 Tyr Val Ser His Gly Ala Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gln Val Arg Phe 980 985 990 Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu Ala Pro Gln Ile Lys Val Ile Ala Pro 995 1000 1005 Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr Asn Arg Phe Lys Gly Arg Asn Asp 1010 1015 1020 Leu Met Glu Tyr Ala Lys Gln His Gly Ile Pro Ile Pro Val Thr 1025 1030 1035 Pro Lys Asn Pro Trp Ser Met Asp Glu Asn Leu Met His Ile Ser 1040 1045 1050 Tyr Glu Ala Gly Ile Leu Glu Asn Pro Lys Asn Gln Ala Pro Pro 1055 1060 1065 Gly Leu Tyr Thr Lys Thr Gln Asp Pro Ala Lys Ala Pro Asn Thr 1070 1075 1080 Pro Asp Ile Leu Glu Ile Glu Phe Lys Lys Gly Val Pro Val Lys 1085 1090 1095 Val Thr Asn Val Lys Asp Gly Thr Thr His Gln Thr Ser Leu Glu 1100 1105 1110 Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu Val Ala Gly Lys His Gly Val Gly 1115 1120 1125 Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg 1130 1135 1140 Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala Gly Thr Ile Leu Tyr His Ala His 1145 1150 1155 Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr Met Asp Arg Glu Val Arg Lys Ile 1160 1165 1170 Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys Phe Ala Glu Leu Val Tyr Thr Gly 1175 1180 1185 Phe Trp His Ser Pro Glu Cys Glu Phe Val Arg His Cys Ile Ala 1190 1195 1200 Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu Gly Lys Val Gln Val Ser Val Leu 1205 1210 1215 Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu Gly Arg Glu Ser Pro Leu Ser Leu 1220 1225 1230 Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser Met Asn Val Gln Gly Asp Tyr Glu 1235 1240 1245 Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe Ile Asn Ile Asn Ser Leu Arg Leu 1250 1255 1260 Lys Glu Tyr His Arg Leu Gln Ser Lys Val Thr Ala Lys 1265 1270 1275 <210> 23 <211> 1218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary protein of the invention EGFR OTC <400> 23 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu 355 360 365 Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu 370 375 380 Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp 385 390 395 400 Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser 405 410 415 Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe 420 425 430 Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser 435 440 445 Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr 450 455 460 Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 465 470 475 480 Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 485 490 495 Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val 500 505 510 Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile 515 520 525 Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys 530 535 540 Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe 545 550 555 560 Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr 565 570 575 Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Asn Val 580 585 590 Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Lys Ala Leu Glu Gln 595 600 605 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala 610 615 620 Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 625 630 635 640 Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 645 650 655 Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 660 665 670 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 675 680 685 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 690 695 700 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 705 710 715 720 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 725 730 735 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 740 745 750 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 755 760 765 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 770 775 780 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 785 790 795 800 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 805 810 815 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 820 825 830 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn 835 840 845 Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 850 855 860 Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn 865 870 875 880 Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln 885 890 895 Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe 900 905 910 Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys 915 920 925 Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys 930 935 940 Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser 945 950 955 960 Thr Glu Thr Gly Leu Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr 965 970 975 Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala 980 985 990 Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys 995 1000 1005 Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile 1010 1015 1020 Ile Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala 1025 1030 1035 Asp Tyr Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu 1040 1045 1050 Thr Leu Ser Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile 1055 1060 1065 Met Met Ser Ala Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr 1070 1075 1080 Pro Lys Gly Tyr Glu Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu 1085 1090 1095 Gln Tyr Ala Lys Glu Asn Gly Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp 1100 1105 1110 Pro Leu Glu Ala Ala His Gly Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr 1115 1120 1125 Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln 1130 1135 1140 Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met Lys Thr Ala Lys Val Ala 1145 1150 1155 Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu Pro Arg Lys Pro Glu 1160 1165 1170 Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg Ser Leu Val Phe 1175 1180 1185 Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala Val Met Val 1190 1195 1200 Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro Lys Phe 1205 1210 1215 <210> 24 <211> 1236 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding ASS1 <400> 24 atgtccagca aaggctccgt ggttctggcc tacagtggcg gcctggacac ctcgtgcatc 60 ctcgtgtggc tgaaggaaca aggctatgac gtcattgcct atctggccaa cattggccag 120 aaggaagact tcgaggaagc caggaagaag gcactgaaac ttggggccaa aaaggtgttc 180 attgaggatg tcagcaggga gtttgtggag gagttcatct ggccggccat ccagtccagc 240 gcactgtatg aggaccgcta cctcctgggc acctctcttg ccaggccctg catcgcccgc 300 aaacaagtgg aaatcgccca gcgggagggg gccaagtatg tgtcccacgg cgccacagga 360 aaggggaacg atcaggtccg gtttgagctc agctgctact cactggcccc ccagataaag 420 gtcattgctc cctggaggat gcctgaattc tacaaccggt tcaagggccg caatgacctg 480 atggagtacg caaagcaaca cgggattccc atcccggtca ctcccaagaa cccgtggagc 540 atggatgaga acctcatgca catcagctac gaggctggaa tcctggagaa ccccaagaac 600 caagcgcctc caggtctcta cacgaagacc caggacccag ccaaagcccc caacacccct 660 gacattctcg agatcgagtt caaaaaaggg gtccctgtga aggtgaccaa cgtcaaggat 720 ggcaccaccc accagacctc cttggagctc ttcatgtacc tgaacgaagt cgcgggcaag 780 catggcgtgg gccgtattga catcgtggag aaccgcttca ttggaatgaa gtcccgaggt 840 atctacgaga ccccagcagg caccatcctt taccatgctc atttagacat cgaggccttc 900 accatggacc gggaagtgcg caaaatcaaa caaggcctgg gcttgaaatt tgctgagctg 960 gtgtataccg gtttctggca cagccctgag tgtgaatttg tccgccactg catcgccaag 1020 tcccaggagc gagtggaagg gaaagtgcag gtgtccgtcc tcaagggcca ggtgtacatc 1080 ctcggccggg agtccccact gtctctctac aatgaggagc tggtgagcat gaacgtgcag 1140 ggtgattatg agccaactga tgccaccggg ttcatcaaca tcaattccct caggctgaag 1200 gaatatcatc gtctccagag caaggtcact gccaaa 1236 <210> 25 <211> 1062 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding OTC <400> 25 atgctgttta atctgaggat cctgttaaac aatgcagctt ttagaaatgg tcacaacttc 60 atggttcgaa attttcggtg tggacaacca ctacaaaata aagtgcagct gaagggccgt 120 gaccttctca ctctaaaaaa ctttaccgga gaagaaatta aatatatgct atggctatca 180 gcagatctga aatttaggat aaaacagaaa ggagagtatt tgcctttatt gcaagggaag 240 tccttaggca tgatttttga gaaaagaagt actcgaacaa gattgtctac agaaacaggc 300 ttagcacttc tgggaggaca tccttgtttt cttaccacac aagatattca tttgggtgtg 360 aatgaaagtc tcacggacac ggcccgtgta ttgtctagca tggcagatgc agtattggct 420 cgagtgtata aacaatcaga tttggacacc ctggctaaag aagcatccat cccaattatc 480 aatgggctgt cagatttgta ccatcctatc cagatcctgg ctgattacct cacgctccag 540 gaacactata gctctctgaa aggtcttacc ctcagctgga tcggggatgg gaacaatatc 600 ctgcactcca tcatgatgag cgcagcgaaa ttcggaatgc accttcaggc agctactcca 660 aagggttatg agccggatgc tagtgtaacc aagttggcag agcagtatgc caaagagaat 720 ggtaccaagc tgttgctgac aaatgatcca ttggaagcag cgcatggagg caatgtatta 780 attacagaca cttggataag catgggacaa gaagaggaga agaaaaagcg gctccaggct 840 ttccaaggtt accaggttac aatgaagact gctaaagttg ctgcctctga ctggacattt 900 ttacactgct tgcccagaaa gccagaagaa gtggatgatg aagtctttta ttctcctcga 960 tcactagtgt tcccagaggc agaaaacaga aagtggacaa tcatggctgt catggtgtcc 1020 ctgctgacag attactcacc tcagctccag aagcctaaat tt 1062 <210> 26 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding GD2 scFv <400> 26 gatattctgc tcacacagac cccactctcc ctgcccgtgt cactcgggga tcaggctagc 60 atttcttgcc gctcatctca gtctctggtc caccggaatg ggaacacata cctccattgg 120 tacctccaga aacctggaca gagccctaaa ctgctcatcc acaaagtctc aaatcggttc 180 tccggcgtgc ccgatcgctt tagcggatcc ggatctggga ccgacttcac actgaaaatc 240 tcacgagtgg aggctgagga tctcggcgtc tacttctgta gtcagagtac ccacgtccca 300 cccctcacct ttggcgctgg aacaaaactg gagctgaaac gagccgatgc tgctcctacc 360 gtgtccatct ttcctggctc cgggggaggc gggagcggag gcgaagtgaa actccagcag 420 tctggccctt ctctcgtgga acctggcgct tctgtgatga tctcctgtaa ggcctctgga 480 tcttccttta ccggctacaa catgaactgg gtccggcaga acattggcaa atccctggaa 540 tggattggcg ccatcgatcc ttactacggc ggcacatcat acaatcagaa attcaagggg 600 cgagcaacac tcactgtcga caaatcttca tccaccgcct acatgcacct gaaatctctc 660 acatccgagg atagtgctgt ctactactgt gtctctggca tggaatactg gggacaggga 720 acttctgtca ccgtgtctag tgccaaaacc acacctccct ccgtgtacgg acgagtcact 780 gtctcatct 789 <210> 27 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding CD33 scFv <400> 27 ggatccaaca tcatgctgac ccagagccct agcagcctgg ccgtgtctgc cggcgagaaa 60 gtgaccatga gctgcaagag cagccagagc gtgttcttca gcagctccca gaagaactac 120 ctagcctggt atcagcagat cccaggccag agccctaagc tgctgatcta ctgggccagc 180 accagagaaa gcggcgtgcc cgatagattc accggaagcg gttctggcac cgacttcacc 240 ctgacaatca gcagcgtgca gagcgaggac ctggccatct actactgcca ccagtacctg 300 agcagccgga cctttggcgg aggcaccaag ctggaaatca agagaggcgg cggaggctca 360 ggcggaggcg gatctagtgg cggaggatct caggtgcagc tgcagcagcc aggcgccgag 420 gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaagatg tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc 480 agctactaca tccactggat caagcagacc cctggacagg gcctggaatg ggtgggagtg 540 atctaccccg gcaacgacga catcagctac aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg 600 accgccgaca agtctagcac caccgcctac atgcagctgt ccagcctgac cagcgaggac 660 agcgccgtgt actactgcgc cagagaagtg cggctgcggt acttcgatgt gtggggagcc 720 ggcaccaccg tgaccgtgtc atct 744 <210> 28 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding Mesothelin scFv <400> 28 atgcaggtac aactgcagca gtctgggcct gagctggaga agcctggcgc ttcagtgaag 60 atatcctgca aggcttctgg ttactcattc actggctaca ccatgaactg ggtgaagcag 120 agccatggaa agagccttga gtggattgga cttattactc cttacaatgg tgcttctagc 180 tacaaccaga agttcagggg caaggccaca ttaactgtag acaagtcatc cagcacagcc 240 tacatggacc tcctcagtct gacatctgaa gactctgcag tctatttctg tgcaaggggg 300 ggttacgacg ggaggggttt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 ggtgtaggcg gttcaggcgg cggtggctct ggcggtggcg gatcggacat cgagctcact 420 cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca ggggagaagg tcaccatgac ctgcagtgcc 480 agctcaagtg taagttacat gcactggtac cagcagaagt caggcacctc ccccaaaaga 540 tggatttatg acacatccaa actggcttct ggagtcccag gtcgcttcag tggcagtggg 600 tctggaaact cttactctct cacaatcagc agcgtggagg ctgaagatga tgcaacttat 660 tactgccagc agtggagtgg ttaccctctc acgttcggtg ctgggacaaa gttggaaata 720 aaa 723 <210> 29 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding EGFRvIII scFv <400> 29 caggtacaac tccagcagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagcgtc tctgaaactc 60 tcctgtgtaa cctctggatt cactttcaga aaatttggca tgtcttgggt tcgccagact 120 agtgacaaga ggctggaatg ggtcgcatcc attagtactg gcggttataa cacgtactat 180 tcagacaatg taaagggccg attcaccatc tccagagaga atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gtagtctgaa gtctgaggac acggccttgt attactgtac aagaggctat 300 tctagtacct cttatgctat ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 agtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat cgagctcact 420 cagtctccag catccctgtc cgtggctaca ggagaaaaag tcactatcag atgcatgacc 480 agcactgata ttgatgatga tatgaactgg taccagcaga agccagggga accccctaag 540 ttccttattt cagaaggcaa tactcttcgg ccgggagtcc catcccgatt ttccagcagt 600 ggcactggca cagattttgt ttttacaatt gaaaacacac tctcggaaga tgttggagat 660 tactactgtt tgcaaagctt taacgtgcct cttacattcg gtgatggcac caagcttgaa 720 aaagctctag agcagaaact gatctcggaa gaagatctgg cgaagccc 768 <210> 30 <211> 17555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding ASL <400> 30 gacgccatcc cggccagaaa agccctggcc agtggcgggc gcgacactat ccgtgcggcc 60 aggcggaggt gagtgcgcgg cggccggatg ggcgggacgg gcgtggagga cgccgagcac 120 cgtggcgcgc gctcacgtcc gcgtccccaa gggctgcgct ccctcaagcg cagtgcccag 180 aactcggagc cagcccggcc cgggggaccc tgctggccaa ggaggtcgtc agtccggtct 240 tgtcttccag acccggagga ccgaagcttc cggacgacga ggaaccgccc aacatggcct 300 cggaggtgag tgggacctcg gggactccgg tcctcctagc ctccaaagga gagagtgggg 360 gcgccagacc tgcctcgggc caccctgctg ggaatcgccc tccaggaagc aattttgaaa 420 attacctagg aagcctgcac ccccagccct cccgggcgca tcatctggag cccagcagtc 480 acctttacca ggactcacca gtatccgcag gcagcccttg tggcaaaccc accaacccac 540 actactaggg gtagagtggc tctgccctca cctcacagtg atgcctgcct ggccaggaaa 600 agtggctccc aagccttcag ccttccaact cttccttcct tcttaccacg tgtcctcctg 660 tcaggtccca ccccacacca catcccttct cctgctagag caattgtccc tgtttataga 720 ataaagctca gcccctaagt gttcttgtcc ttgactgtgg catgtggaaa gagccaggaa 780 aaaggggacg tcgcctcgtg gctccagcaa ccctggtgcc tggtcccttc ctgtctcact 840 ggaccctgcc tcttagggtc agtggctcct ggcctctcct cctgaccact gagatgctgg 900 attcccaggc agaggttttc cttccttggg ccatagttga tttatctggc aatgggggta 960 ataatagctg tcggcctcac tctgtaaggc actagattat gaggccattg ctttggaccc 1020 ttcaggtgag aggggctgtt cgcctgatgc ttgatgaagg gaactccggg aagcaggagg 1080 tctgggttcc aggccctttt ggccttcatt agctagcaat tcacttcctc tttctcaatg 1140 ccctgcaagc tcagtgccct gcaagcttct gggtcatggc aggggggtag ggcctggact 1200 ttggagccaa acagacttgg tttctgtacc agtcacttga gccctttaaa cctctttcct 1260 catttgtgaa ataggggtaa tattgcccac ctcataaaag gccgtaataa catatgtgaa 1320 atccctagca cagggctgag caacagtagg tgctcaataa atggtggcta accacaacaa 1380 tactgatatt tctactttgg gaggccgagg cgggaggact gctgaagccc aggaattcca 1440 gaccagccag ggcaatgtaa tgagaccctg tctctacaaa aagattttga aaattaccca 1500 ggtgtggtgg cgtacacctg tagtctcaca ggaggcggag gcatgaggat tgcttgagcc 1560 caggagtttg agactgcagt gagcatgatc tcaccactgc actccagccc aggcaacaga 1620 gtgagatcca gtttcaaaaa aataaaaata aaaaaacctg gcaggcatgg tggctcacac 1680 ctgtaatccc agcactttgg gaggtcgagg tgggcagatc acctgaggtc aggagtttga 1740 gaccagcctg gccaacatgg tgaaaccccg tctctactaa aaatgcaaaa attagctggg 1800 tgtagtggtg ggtgcctgta gtcccagcta ttcgggaggc tgaggcagga gaatcgcttg 1860 aactcgggag gcggaggttg cagtgagctg agatcgcacc actgcactcc agcctgggcg 1920 acaaagcaag actccacctc aaaaaaagaa aaaaaaccca caagtcccaa aaccaaaact 1980 ggtatttccc atgtacattc gaccttaact gttgctcatt caacccagcc caactcagtg 2040 ccccatcccc tggccctgaa gagaccattc tggcccagat gtgtcctggc ttggagtagc 2100 accttctgct accacactag gcctccactc tcctcagtgc ccaaggggag gcacctcact 2160 ctgatctccc tgtggggtcc tcttatgcct gccagtaagg ataggagttt ggttctagag 2220 cagagtggtc tggcttccaa caagcccagt gttctaggtg acctcaggtt gccccaggcc 2280 ttcctgtagg ttggcactaa ttggtttggc tgcagctcca cttattaagt agttattttt 2340 attactaaca acctaggcag ggtggcccag gagcccgctg ggggaggcgg tgccaggctc 2400 ctggctgagg ggcaggctgg ccccaattct gactggctgg ctccagtgat caggaccagg 2460 gccccacgtg gtgctttgct ggagatctag gcttggtggg gcagctgtgg ggtaaggggc 2520 aggaccagct caaagatggg gtgggggcgg aggctgcctc tgcagggcag agtcctttgg 2580 cagtcgggac tgttgggcat agaggagtca gctcacagct cagggccaga gcactggaga 2640 ggtctctggg gtgcatacag gaaccaggag tggagctgaa gcatgtccta tcccctgcca 2700 gccctccctt agtaacagct ggcatttctc gagtccttcc tgagcaccag gcaccgtgtt 2760 atgtatgcaa tttgcaaata ttatctgatt aaatgctcac aataaggcta tcagagaggt 2820 actattatta tccttatctt attattatta ttattattat ttttaagaag gagtcttgct 2880 ctgtcgccca agctggagta caatggcgcc atctctgctc accgcaacct ctacctccag 2940 gattcaagtg attctcctgc ttcagactcc caagtggctg ggactacagc ttcctgccac 3000 cgcgcctggc taatgtttat atttttagta cagatgaggt ttcaccatgt tggccaggct 3060 gatctcgaac tcctgacctc aagcgatcca cctgcctggg cctcccaacc ctgagggttt 3120 ttgtttttgt ttttgttttg agacagagtc ttgctctgtc gcccaggctg gagtgcagtg 3180 gcacgatctc agctcactgc aagctccgcc tcccgggttc acgccattct cctgcctcag 3240 cctcccaagt agctgggact acaggcgccc aacaccccca tgcctggcta atttttttgt 3300 gtgtgttttc agtagagacg gagtttcacc atgttagcca ggatggtctc catctcctga 3360 cctcgtgatc tgcccacctc agcctcccaa agtgctagga ttataggtgt gagccaccac 3420 gcccagcccc tgaggtttaa taataggtgc caggccaggt ggttaataga agtctggggc 3480 attgtagggg gacagaggag gatatatgtc cccattggcc attgtagact cccttccaca 3540 aaaaggacgt cagtgaagtg acatgcccac ctctacccca ccctcctccc agtcctgggc 3600 actagggctg ctccccaggt gttctgtacc ccctccccac tctgtcccat gccctggcct 3660 ctgccctctt tcaaaacata gatgtggctg gcgcctaggc tcatgcctat aatctcagca 3720 ctttgggaag ctgaggctgg aggacagctt gagcccagga attcaagacc agcctgggca 3780 acatagtgag accctgtctc taccaattat tttattttat tttattttgt tcatttattt 3840 atttattttg agacagagtt ttgctctgtc acctaggctg gagtgcagtg gcgtgatctt 3900 ggctcactgc aacctccgcc tcccgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcctaagt 3960 agctggaact acaggcgagt gccaccacgc ctggctaatt tttgtatttt tagtagagac 4020 caggtttcac catgttgacc aggatggtct ctgtctcctg acctcatgat ccacccacct 4080 tagccttcca aaatgctggg attacaggca tgagccacca ctcccagtcc tataaaattt 4140 taaaaaaatg tctgggtgtg gtggcgcatg cttgtagtcc caactattgg ggaggctgag 4200 gcaagaggat tggttgagac caggagtttg aggctgcagt gagctatgat ggtgccaccg 4260 cactccaacc tgggtaacaa agtgagaccc tgtgtctaaa aaagaattta aaggccgggt 4320 gtggtggctc acacccgtaa tcccaggact ttgggaggcc gaggtgggca gatcacgagg 4380 tcagattaag accatcctgg ctaacaaggt gaaaccacgt ctctactgaa aaaaaaaaat 4440 acaaaaaatt agccaggcat ggtggtgggc acctgtagtc ccagctactc aggaggctga 4500 ggcaggagaa tggcgtgaat ctgggaggtg gagcttgcag tgagccaaga tcctgccact 4560 gcactccagc ctgggtgaca aagagagact ccatctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 4620 attaaaaaag atttttttaa tgaacaaaac aggctcggca cagtggctca tgcctgtaat 4680 cccaagcact tcgggatgcc aaggtcaggg gatcacctga gatcaggagt tcgagaccag 4740 cctgaccaac atggtgaaac cccgtctcta ctaaaaatat aaaactcagc caggtgtggt 4800 ggcacacgcc tgaaattcca gctactcggg aggctgaggc aggaaaattg gcttgaagcc 4860 gggaggtgga ggttgcagtg agccgagatc acgccactgc actccagcct aggcaacaga 4920 gtgagactct atctcaaaga aaacgaacaa aacatagatg cctacatacc attcctctgc 4980 ccttggctcc tggggagtaa gggatcaccc agtgacctcc tagaaggcca gtgacaatgg 5040 ggggtgtcag ggtgcttttc agagccaagg gagtggtagg aattgggatc ttagtccagc 5100 tccaagctgt gagggagaga gttgcagggc acttaagctt ggtggagacc ctcaaggcct 5160 ctttgcctgt ccctgcagca aaggttctgg acaccagagc caagtccaga agccctggtg 5220 gaacaggggt gaaaagcata ggttctgact tcagactgct gggccgcagc cctggctatc 5280 ccaccccagg tgagagcagg ctgctctgtg cctcagtttc cccatcttca tagtggaatt 5340 gtattggtgc ctacccagag ggttgtgtca acaattagga tggcacctag caccttggtc 5400 agtggtggga aaggttccag aagttctgct gtggtcccag gggtgtctca ggccctgcca 5460 tcatctcctt ggaggggtgc catgtggtgg gaaagaaccc caacttcaag gccacacaca 5520 gtggctcatg cctgtaatcc tagcactttc agaggccaag atgggaggat cacctgaggt 5580 caggagttca agaccagcct ggccaacatg gtgaaacccc atctctacta atgatacaaa 5640 aattagctgg gtgtggtggc acgtgcctgt aatcccagct acttgggagt ctgaggcagg 5700 agaatctctt gaacctggga ggcagagttt gcagtgagct gagatggcac cactgtactc 5760 cagcctggcc gacaaagtga gactctgtct caaaaaaaaa aaaaaagaac ccaaactttt 5820 ggtgttcagc catgttccca tgctcactcc cagggtggtg actctgggaa ggtctcagcc 5880 tccttgtctg cccagttaga atgatctgat gcccctgcta ccatcagact tgataagttt 5940 cccaaagact ctttgcaaga agcactgttc tggagggtgg aggagagact aattgttctt 6000 gctctcctgg ccagagtggg aagctttggg gtggccggtt tgtgggtgca gtggacccca 6060 tcatggagaa gttcaacgcg tccattgcct acgaccggca cctttgggag gtggatgttc 6120 aaggcagcaa agcctacagc aggggcctgg agaaggcagg gctcctcacc aaggccgaga 6180 tggaccagat actccatggc ctagacaagg tacttgccgt ggcccaagcc ccacccaagg 6240 ccccttccct gtggccccag gctcccacca aatccctgag caaacagtgc agtgttgccc 6300 atctgtggtt tcacattgaa ctaattatat actcaagtgc tgtttaactg tgtgccttga 6360 tgactgcctc tctccatcct ttaatgaccc ctgtggccca catggctcat gggtaaaggt 6420 gtgctgggcc tgagatgccc cctcccaggg tgcgcttcca ggactcagct cctgggcagg 6480 gacagtcagt caccagggat agggtgggac caaggcaggg gctctcttgg ctgctgatgc 6540 ctgctcacct gaccccggca ttgctgctac ccactacagg tggctgagga gtgggcccag 6600 ggcaccttca aactgaactc caatgatgag gacatccaca cagccaatga gcgccgcctg 6660 aaggtacgac ccctggagcc ccaccgcttt ccttgcctcc cctctccacc ttgcccaggg 6720 ccactttgag cattagcacc attctgttta cttcgccatt ggcagacagc atgtgagacc 6780 tcaggacatg agccaggcac cctggctcat gcctataatc ctagcacttt gggaggctga 6840 ggtgggagga ttgcttgaga ccaggagttc gagaccagcc tgggcaacat aatgaggtcc 6900 cacagctaca aaaattaaaa aaagaaaaga aaaaaagaac aggcctcagc agaaatggcg 6960 agagatttgg ggaggacccg gagccctggg gtatggaggt aggttggcag ggctgatgag 7020 gaaaactgcc ctgcctgggt tgactcctct gggggtatag accgtgaccc tgggtctccc 7080 ttcacctcca ggagctcatt ggtgcaacgg cagggaagct gcacacggga cggagccgga 7140 atgaccaggt gctttagccc ctccaccccc tgctccgtgt tgtcccaacc ttgaggagcc 7200 cagggggcag ttagagttct gcagcggtcc tggctcctca gggaagcaac acatcggcct 7260 ccctgagcac catctcctcc ttgcacaggt ggtcacagac ctcaggctgt ggatgcggca 7320 gacctgctcc acgctctcgg gcctcctctg ggagctcatt aggaccatgg tggatcgggc 7380 agaggcgtga gtcctacagg gacacccagg gggcagacag aggtgtgatg gaagcctgaa 7440 caggagacct agggggcagg ggtgaacagc gtgggggtgc caggccctgg gggacagggg 7500 catcccagaa ctccaggatc gaggcagagc agccaggagt gggccatttc ctgcaggccc 7560 caatactccc atgccagtct agctcagcag gcagagaaga ctaacccttc gtggggctgg 7620 gtgcggtggc tcacgcctgt aatctcagca ctttgggagg ccgaggtggg tggatcacct 7680 gaggtcagga gttcgagacc agcctggcca acatgggaaa actctgtctc tactaaaaat 7740 acaaaaatta ggcaatgtgg tggtgtgcgc ctgtaatccc agctactcgg gagcctgagg 7800 cagaagaact gcttgaaccc gggaggagga ggttgcaatg agccgagatc gcgccattgc 7860 actccagcct gggctacaga gcgagactcc tgtctcaaaa aaaaagaaaa aaaaaaaaga 7920 aaactcacca tttgcagatt tgaaggcagg aagctaagcc aagcacagct agcttggctg 7980 tgcctggagc agccagagtc actccccaca ctgcctgtcc cccagatccc ccatcctaag 8040 cttcgcctcc ccatccagcc catctggcaa aagacagagc caaaggctgc ctcctgctgg 8100 cctcatttca ggctttggct tctgggacct ggtgtctttg ggactggatt tgttccttgc 8160 agacctggac gaagagctgc tgagaagtct ccatgtgttg tcagagaccc ctcctcttcc 8220 tcaactccct gtgacccctg ttgtgcagac ttgggggaaa acaagggcac aagaattgtc 8280 acccagcagg tggtgtgggg ctgctaggag gaacagggag tgtctgctac tgagttcagg 8340 gtttctttaa ttttttgttg ttgttgtttg ttgttgtttt tttttttttg agacagggtt 8400 ttgctctgtc acctagtctg gagtgtagtg gcgctatctg agctaactgc aaactctgcc 8460 tcctgggttc aagtgattct agtgcctcag cctcccaagt agctgagatt acaggtgtgc 8520 accaccatgt ccagctaatt tttgtatttt tttcagtaga gatgggtttt gccatgttga 8580 ccaggctggt cttgaactcc tgagctcagg tgatctgccc gcgtcggcct gccaaagtgc 8640 taggattaca cccataagcc actgcgctca gcttaatttt taaattttta actttttaaa 8700 ttgtctttag agatgagatc ctgctctgtc acctaggctg gagtgcaatg gcttggtaat 8760 agctcactgc agtctcaaac tcctggactc aaatgatcct cccacctcag ctttctgagt 8820 agctaggacc acaggtgtgc accacctgtg agacagagtc ttgctctgtt gcccaggctg 8880 gagtgcagtg gcgtgatctc cactcactgc aacctctgcc tcccaggttc acgccattct 8940 cctgcctcag cctcccgagt agctgggagt acaggtgccc accaccacgc ccggctaatt 9000 ttttgtattt ttagtagaga cggggtttca ccatgttagc caggatggtc tcaatctccc 9060 gacctcatga tccacccacc tcggactctc aaagtgctgg gattacaggt gtgagccacc 9120 gtgcccagcc gcgaattctt taaatttttt gtagaaacag ggtctcacta tgtggctcag 9180 gctggtctca aactcccggc cttaagtgat ccttccctct tggcctccca aagtgctggg 9240 attaaagact tgagccaccg tgcctggcct tgagtacaga atttcttcat ggggtgatga 9300 aaatgttcta aaattggttg tggtgatggt tgtacagtaa agtgtaaact ttaaatgagt 9360 aaattgtgaa tgatatctca gtaaagctgg tttatttaaa acaacaggcc aggtgctgtg 9420 gctcacgcct gtaatcccag cactttggaa ggctgaggcg ggtgaatcac ctgaggtcaa 9480 gagttcgaga ccagcctggc caacatggtg aaaccccatc tctactaaaa atacacaaaa 9540 ttagctgggt gtgatggtgg gcacctgtag tcccagctac ttgggaggca ggagaatctc 9600 ttggacctgg gaggtggagg ttgtagtgag ccgagatcac gccactgcat tccagcctgg 9660 gcaacaagag cgaaactctt tctcaaaaac aacaacaaca aaaaaacagg ccaggtatgg 9720 tggctcatat ctgtaatccc agccctttgg gaggccaagg caggaggact gcctgaaacc 9780 aggagtttca gaccactctg ggcaacatag caagacccca tctttttttt tttttttgag 9840 acggagtctc gctctgtcgc ccaggctgaa gtgcaatggt gcaatctcaa ctcactgcaa 9900 gctctgcctc ctgggttcat gccattctcc tgcctcagcc ctcctgagta gctggaacta 9960 caggcgccca ccactacgcc cggctaattt tttgtatttt tagtatagat ggggtttcac 10020 cgtgttagcc aggatggtct cgatctcctg accttgtgat ctgcccgcct cggcctccca 10080 aagtgctggg attacaggcg tgagttaccg cgcctggcca caagacccca tctttacaaa 10140 aaactaaaaa ttagctgggc atggtggcat gtccctttag tcccagctac tcaggaggct 10200 gagacaggag gatcgcttga gcccaggaga tcgaggcagc agtgagctat gatcatgcca 10260 ctgcactcca gtctgggcaa cagaacgaga ccttgtctct aaaaataaaa acaaaacaaa 10320 acaacaagaa aacaggacca tcactcacag cacctctgcc tctgccctgc ctacttgaat 10380 gaggtgcagg gcatctcacc tgctcagagc agcccttgaa tgagccccag ctatttctag 10440 ggtcctcaaa cgaaacctcc cacggccaag tcatacccaa catgggcctc ctcccctatt 10500 ctggcccctg ctcggagatg ctgagtgaca gaggctggac ttggggtgtt tctggcaaag 10560 cctcactgca ggaagcccca cagctcaggc ccagtccttg gttcacacgg tcccacttcc 10620 agcttctttt gcccttaaga ctgatttgtc cctgggagat caccagatcc ctcattcagg 10680 tggagtgctg cagcgtgaca ctttttccag gggtgaccca ggcctgcagg gttccagtgt 10740 cacaggcagg ccttgcatga gcctccaccc gagcttctgc tcctcctctc ccacagggaa 10800 cgtgatgttc tcttcccggg gtacacccat ttgcagaggg cccagcccat ccgctggagc 10860 cactggattc tgaggtgagc caggtgaggt gcaggggctg tgctagaggg gaggaccccg 10920 gctgccctga ccctcctgcc cctggcttcc cacagccacg ccgtggcact gacccgagac 10980 tctgagcggc tgctggaggt gcggaagcgg atcaatgtcc tgcccctggg gaggtgggtg 11040 aggctccagt gccccgaggg cctggtgggg gtggctgctg catagcctta gggattgaca 11100 gagctgggaa gtgcagagtg ggacagaaaa ccgccttatc tgctcagcgg gggactctgc 11160 atggagcccc agctctcgct aaggtgacga ccaagccatt gaatgtgtct gagcagggcc 11220 agagccctcc agcaaggctc ctggcaagcc cagcctgctg ccctcagcct gacatgtggg 11280 aacatgtgtc aggagacaag tgtcctgcac ccagggtgac ttagtgcttg gggacaagtg 11340 ttttgtggac acttggggac aagtattctg tacccaagga gactgggcca gggaagaggc 11400 taagcgccag gtggttgccc tggcaaccag gacttggttc tctgtgtgtg cgttcgtgtg 11460 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtcaggg ctgcctgcca ggagccctgg 11520 tcaccatgaa tccctgtccc tgcagtgggg ccattgcagg caatcccctg ggtgtggacc 11580 gagagctgct ccgagcaggt gagacgtcct gcccctcctc cccagggaga atcaccctca 11640 gcacccgcca agacctgcag acacacctga aaccagaggg caggggcctg tggctcctgg 11700 tgaaaccttc attcattgcc tatgggcact gaggtcatca agttcagggg tcactcatgg 11760 cagggatgcc tggtactgag agactcaggg ctcctgcctc cctcctggga ctgtgcaaaa 11820 gatccctccc cccagctgtt gccccaccct gatcagggga gggggctggg caacctagtt 11880 gggggagagg gggccactcc ctgtcctcca gcttagccct gcttcctccc acccccccag 11940 aactcaactt tggggccatc actctcaaca gcatggatgc cactagtgag cgggactttg 12000 tgggtgagtc ctggggagcc agtcccctgc cctgtgcctc actttagtcc ttcagcccag 12060 cttctctcca gtttcctccc acacctccac ggacaggctg gttgtggtga tattgtacac 12120 tgaagtataa accttaaatg ggtaaagtgg gtggggcatg gtggttcacc atgcccagca 12180 ctggccaaca tggtgaaacc ccatctctac taagaataca aaatttagct gggtgtgtgg 12240 tggcaggtgc ctgtaatccc agctactcag gagttctgag gccagagaat cacttgaacc 12300 caggaggcgg aggctgcagt gagccaagat cacgccagtg cactccagcc tgggcaacaa 12360 gagcgaaact ccatctcaaa aaataaaata aaataaaata aaaataaata ggccaggcat 12420 ggtggctcac gcccgtaatc ctagcacttt gggagtccga ggcaggtgga tcacatgagg 12480 tcaggagttt aagaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc catctctact aaaagcacaa 12540 aaattagctg ggcatggtgg tgcatgcctg taatcccagc tactcgggag gctaaggaag 12600 gagattcgct ggaacctggg aggtagaggt tgcagtgagc caagattgtg ccactgtact 12660 ccagcctgtg cattgggagc gagactccat ctcaataaat aaataaataa ataaatggat 12720 aaattgtatg tgagtgataa ctcagtaaag ctggtttatt taaaacaaca acaataacaa 12780 aaaacacgct aggtgcaatg gcttacgttt gtaatcctag cactttggga ggccaaagca 12840 gaaggattgc ttgagcccac aagtttcaga acagcttggg cgacatagca cgaccccatc 12900 tttgcgaaaa atgaaaattt agccgggtcc ccccaccgcc taacctcctc ctgccccctg 12960 tatggtcagg ctgggtgggg atgggagagg cctggtgact gggaaccttt tctcccagcc 13020 gagttcctgt tctgggcttc gctgtgcatg acccatctca gcaggatggc cgaggacctc 13080 atcctctact gcaccaagga attcagcttc gtgcagctct cagatgccta caggtaagcc 13140 ctgaactgcc acctccatct gccgctgccg gcctctgtat cccccgccgc ccgcggacgt 13200 ggctgccttc ctccccgtcc cacccctccg ccagacctgg ccattgcggc gctggaccag 13260 ccaagggtcc agccccttca gcgccagcac ctctgtcccc agcacgggaa gcagcctgat 13320 gccccagaag aaaaaccccg acagtttgga gctgatccgg agcaaggctg ggcgtgtgtt 13380 tgggcgggtg agcaaggcag ggggaggggc ggggcctctg ggctgatggt gggtggccag 13440 gggggcagga tcccgggtcc agcccctgtg cctccctctt cccgcagtgt gccgggctcc 13500 tgatgaccct caagggactt cccagcacct acaacaaaga cttacaggtg cgaggccggg 13560 ggaggcctgg ctagtacgtg ccagttctca gggctctggc acactcaggc agggccccac 13620 cccgggattg ccatacatcc tcccatcctg tgcacacagc tccatccgtg gctgcccttg 13680 aactctctgc ccttcctttg ttggggtatt gagtgttctt cccatggaag gcagtgggga 13740 tgcctcagtg ggggggtggg gctgtgggga ccctgggtgc cagggggctg ctaggccctc 13800 acctcctgcc atgtgcctcc caggaggaca aggaagctgt gtttgaagtg tcagacacta 13860 tgagtgccgt gctccaggtg gccactggcg tcatctctac gctgcaggca agacatcacc 13920 cccctgcttc tcctccccta ggtcccaggc actggggtgg gcatgcgggg agggtggcct 13980 tgggaggagg tgaggtgggg ctggaggacc tggggcaggg aaggagaggt gtgctcgctc 14040 ctgctcctgg ggaacaggga aaggacagaa actgctgcca tgcagtggaa gtagatgaga 14100 ctcagggggc ctggggcctg tcaaatggcc tgaccagaac tctttaaaaa aagaaaatct 14160 aaacaaaagg ccaggtgcag tggctcatgc ctggaatctc acactttggg aggccgaggc 14220 agatggagca cttgaggtca ggggtttgag accagcctgg ccaacatggc gtaaccacgt 14280 ctctactaaa aatacaaaaa ttagccaggc gtgatggccc acacctgtaa tcccagctac 14340 tcaggaggcg gaggcagaag aatagcttga acccaggaga tggaagttgt agtgagccaa 14400 gatcatgccg ctgcactcca gcctggacca cagagtaaaa ctccatctac aaatatataa 14460 attaaattaa attaaattaa atatctttaa aaaacatttt ttagagacag ggtcactctc 14520 tgtcgcccag gctggagtgc agtggtgcgg tcgtagctca ctgcagcctc aaactcttgg 14580 gctcaagtga tcttcccacc tcagtctcca gagtagctgg gactacaaac atgcgccacc 14640 acgcctggct aattttttta ttttttgtag agacagggtc tccctatgtt tcccaggctg 14700 gtctcaaatt cctggcccca agccatcctc ccaccttggt ctcccaaggt gctgggatta 14760 taggcatgag ccactttgcc tggctgattt cttttaaaat caattattat gggaaattta 14820 tgtatataac agctagagaa tgcataatga accctatgta ccgacaccca gcttcaatga 14880 taatcaactc acggacatcc tggctccagc tgtctttacc cacagctctc tcccactccc 14940 ttaccccctt attttgaagc aaattcccat catcacatca tttcattcct aaatagttca 15000 ggatatgtct tgaaatcagt gtttcttggc tgggtgcaga gcctcatgcc tgtaatccca 15060 tcaatttgcg agactaaggt gggcagatca ctcgaggtca ggagttcgag accagcctgg 15120 ccaacatggc gaaaccccgt ctttactaaa aatataaaaa ttagctgggt gtggtggtac 15180 acgcctgtaa tcccagctac tcaggaggct gaggcaggag aattgcttga acccgggaga 15240 tggagactgc agtgagcaga gatcacgcca ctgcgctcca gcctgtgtga cagtgcaaga 15300 ctccatctca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aggcagtgtt tctggaggct agtcccccaa 15360 ctagcagcac cagcatcacc tcagaagtcc tgagaaatgt gatgtgaggc cccactccag 15420 atggctgaat cagagactct gggggtgctc cccagcaatt tgtatttttc ttagtaaatt 15480 ctccagtggc taggcctggt ggctcatgct tgtaatccca gcactttgag aagctgaggc 15540 aggagaagcg cttgagccca ggagttcaaa accagcctga gcaacatagc gagaccttgt 15600 ctgtaaaatt aaaaaaatta aattagccag tcgtgatggc gtgtacctgt ggtcccagcc 15660 acttaggaga ctgatgtggg aggatccctt gagcccagga gctcaaggat gcagagagcc 15720 aggattgtgc cattgcactc caacatgggc gaccctgtct caaaaaagcc caaaacaaca 15780 acaacaaatt agctaggcac ggtggtgtgc atggctgtag tcccagctac ttgggaggct 15840 gaggctggaa gatcccttga gtccaggctg cagagggcta taatggccac tgcactccag 15900 cctggacaac agagcaagac cctgtctcct aaaacagaaa acaaatcctc caggaacatc 15960 tgatgcatgc tgaagataag gactctttga aaacataaag gccagtaaaa catacaggcc 16020 agtaagtgtt catagcacat gtaaatatta tcgataatta tgagaagatg gttcaagttg 16080 agagtgagac agagccgagt gggtaagaga gtatctgccc aaggcaggga tgtcctggca 16140 gaggggcagg tcctgggcct ggcagcttca gatcccaggg tccccagggc tcaccactcg 16200 cccacctgtg cccccagatt caccaagaga acatgggaca ggctctcagc cccgacatgc 16260 tggccactga ccttgcctat tacctggtcc gcaaaggggt aagtgtgtag cagccagggg 16320 gagggtgagg agatggggtg ccccccccag agggtggggg agctcaggaa tgggtgcaag 16380 cggcccagcc tggtggctca cccctgtaat cccagcactt tgggaagccg aggtgggcgg 16440 gtcacttgag gccaggagtt cgagaccagc ctggtcaaca tggtgaaacc ccgtctcttt 16500 tgatgtaaaa atacaacaat tagctgggtg tggtggcaca ctcctgtaat cccagttact 16560 cgggaggctg aggcaggaga attgattgaa ctgggaggtg gagtttgcgg tgaggtgaga 16620 tcgcgccact gcactccagc ctgggcaaca gagcgagact ttgtgtcaaa aagaaaaaaa 16680 aaaaaaaaag gaagggggtg caggcaatgg aggcagatca gggcatggag aaacctgcct 16740 cagcgccatc ttcctccctg gcacccagat gccattccgc caggcccacg aggcctccgg 16800 gaaagctgtg ttcatggccg agaccaaggg ggtcgccctc aaccagctgt cactgcagga 16860 gctgcagacc atcaggtacg gcccatcccc ttccccatgc tgcctcctag gaagtgagcc 16920 tgggtgcctg gagcccaggg tggcctggcg ccctggccca cctcttcctc tctccccagc 16980 cccctgttct cgggcgacgt gatctgcgtg tgggactacg ggcacagtgt ggagcagtat 17040 ggtgccctgg gcggcactgc gcgctccagc gtcgactggc agatccgcca ggtgcgggcg 17100 ctactgcagg cacagcaggc ctaggtcctc ccacacctgc cccctaataa agtgggcgcg 17160 agaggaggct gctgtgtgtt tcctgcccca gcctggctcc ctcgttgctg ggctttcggg 17220 gctggccagt ggggacagtc agggactgga gaggcagggc agggtggcct gtaatcccag 17280 cactttggaa gggcaaggtg cgaggatgct tgaggccagg agtttgacac agcctgggca 17340 acacagggag acccccatct ctactcaata ataaaacaaa tagcctggcg tggtggccca 17400 tgcatatagt cccagctact tgtaaggctg aggtgagagg acacttgtgc ccaggagtgg 17460 aggctgcagt gagctatgat cacgccactg cattccagcc tggataacag agtgagaacc 17520 tatctctaaa aataaataaa taaacgaaaa ataaa 17555 <210> 31 <211> 8184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding ODC1 <400> 31 gaagccgggg gcgggggcca cgcgtggggc aggcggtgct cggctcggct gacgtcggcc 60 cgccggcgcc ccaccagctc cgcgcgggcc cgggttggcc accgccgggc ccccgcccct 120 cccccggcgg tgtcccggcc ggaaccgatc gtggctggtt tgagctggtg cgtctccatg 180 gcgacccgcc ggtgctataa gtagggagcg gcgtgccgtg gggctttgtc agtccctcct 240 gtagccgccg ccgccgccgc ccgccgcccc tctgccagca gctccggcgc cacctcgggc 300 cggcgtctcc ggcgggcggg agccaggcgc tgacgggcgc ggcgggggcg gccgagcgct 360 cctgcggctg cgactcaggc tccggcgtct gcgcttcccc atggggctgg cctgcggcgc 420 ctgggcgctc tgaggtgagg gactccccgg ccgcggagga agggagggag cgagggcggg 480 agccggggcg ggctgcgggc cccgggcccc gggcacgtgt gcggcgcgcc tcgccggcct 540 gcggagacac gtggtcgccg agcgggccac gaccttgagg cgccgcttcc tcccggcccg 600 gggttctccc gcggctggat aagggtgatc cgggcgcctc gttctgcccc cgtcttcaca 660 gctcggggct ggaggggcct aggggagacc cacccggaga ccctgcggcc ccgcgccggc 720 ctctttccca acccttcggc ggccgcgcgc tggccgggga gccgttgggg aggccctggc 780 ggccgcgcag caggtgcagg ggcgcagagc ccgggctcgc cttggtacag acgagcgggc 840 cccggccttg gcgccttcag tttccttcca gtttttattt tcgctgtgtc tacagagcag 900 atgacaccaa tttggaaacc cgcgagagtg ggtagagcta agatagtctt gctgtagtag 960 ctgtgatatt agatgctcgg ccatgactta gaggtgttta tttaaggact gtgaatgact 1020 cggtgatttc ggaaaagctt ggcttagatg aacggacata cacaggggag acagccctaa 1080 ggtttgcaga aaaggctgat tgtgctgttt gcgaagtcga aataattggt gaaagtgtag 1140 aaggcagaac ctctcaggaa tgtctgggga ggacaaagaa tgtgttggct gactttgttt 1200 aaacataaaa ttgggcagac tttaattgat ttgtgaaatt tttttcaaag tttgtttgaa 1260 ttagccccta tctcttctaa cattatcctc ttgtgctaat tgattgacca ttttaaataa 1320 cttagctgtt acagaaagac cgaaaggtgt tcttcagtaa aatatattca agtaagttac 1380 ttaagtaacg ccttaaaaga tacagaaaag caaaaaagta ttggcgtatt aaaaagaaat 1440 caaaactttc caagtttagg cctgaacatt gccttaaaaa tatttaataa ggcctcaaat 1500 gacccagtcc gagactgcat gagcctattt attattaaat tgtaaatatt cttcatataa 1560 acaaaaatat ataaccatgt ctgtaacaaa aatggttttg ctagcgttgt tactctcttc 1620 ccttctccga ggggtgattt aggcaacttc ggaggttgac aatgccaagc agtcacaata 1680 gatagagctt taaagcaaat tctatgcatg ggtttggatt tatgacaggc ccgtcaccct 1740 gggcctgtca tagtacccca tgccagagca aactgtgtcc ccgaaccatt gcctggcctc 1800 tgtgcccgta ggctgctggc actgaagtgg gttgcacagt ggaaaagaag aaagctctac 1860 ctggcagaaa tttttaaagg ttaaaataaa taattttaag aaagctggtt cacaaggtgc 1920 cacatttgat gaaagcaaaa tacagtggct tttattgtta ctagagtgat gttcttgctt 1980 gtttttcttt tttggtgaag ttagccccaa attattctca tagctaagca aatacgagag 2040 tgactgtaag gacagttggc attcccggaa ttgctaaact tggtaggcaa cgctggttta 2100 agaatactga gttctagccg ggcgtggtgg ctcacgcctg taatcccaac actttgggag 2160 gctgaggcag gcggatcacc tgaggtcggg agttggagac cagcctgact aacatggaga 2220 aacgccatct ccactaaaaa tataaaatta gccaggcccc gggtgtggtg gcacatgccg 2280 gtaatcccag ctactcggga gactgaggca ggagaatcgc ttgaacccag gaggcggagg 2340 ttgaggtgag ccgagatcat gccattgcac tccagcctgg gcaacaagag taaaactctg 2400 tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aatactgaat tctgatcagg taacagcaac tgtaatacaa 2460 tgtgataagt tgacttgaag attacagttt ttaagaagta tatacccagc taatacatga 2520 aaattaactc gtaaaatctc aaatgctcca gacatttcca tgatgcctgt tggtcagtaa 2580 aaatcattct aagacttagt ggaagtagga aatgtttgta tggctgtgta taaaggctat 2640 aatgtaatcc cagcactttg gaagaccgag gcgggtggat cacctggggt caggagtttg 2700 agacccacct ggacaacgtg gtgaaatcct gtctctacta aaaacacaaa aattagccgg 2760 gcatggtggc aggcgcctgt aatcccagct gctggggagg ctgaggcagg agaatcgctt 2820 gaacccggga ggcagaggtt gcagtgagcc aagattgcac cgctgcactc cagcctgggt 2880 gacagcgtga gactctgtct caaaaaaaat aaaaaagtct ataatgctat tttaagtttc 2940 taaggaactg aaactgctct gaaataaatc agaccattat aagacttttt tccatatcag 3000 tgagctaagt gcagataagc ttctgaaact tgcatgctag atttttttgg tacaaatatt 3060 tgaaatgctt agtgtgctgc cttggaaaaa cctggtattt tttgttgtgt ccttatactg 3120 ccaaggttta tggaatcatg taccttatgc ctagtaataa ttaggatgac caggccagtg 3180 agtggttcat atccggggca tgattagctc tgcgtgtgct cagccagtgc cccatcttca 3240 actcgatgtg ttcctaaggt agacagcaaa ttccctattt tatttctcag attgtcactg 3300 ctgttccaag ggcacacgca gagggatttg gaattcctgg agagttgcct ttgtgagaag 3360 ctggaaatat ttctttcaat tccatctctt agttttccat gtaagtattc agtttacatt 3420 tatgttgcag gttaatctta agaattgtat tgctaaggct tctaagtgaa tttctccact 3480 ctatttgcat tttgttgcat ttcagaggaa catcaagaaa tcatgaacaa ctttggtaat 3540 gaagagtttg actgccactt cctcgatgaa ggttttactg ccaaggacat tctggaccag 3600 aaaattaatg aagtttcttc ttctgtaagt atatgaggcc catgctggca gtgcagctga 3660 gagtgccagg caagtggaaa actttggcaa ggtctaagga agagcaatga ggcttacatg 3720 tcttgttatg gaatgtagaa attaattcac tggtggtaaa ttaatagtga taatggtgat 3780 actcatatca gtggctagac tcaaaagagc aggattcatt gtgactgatg ggaatgaagg 3840 tcgctggcta ttggtgtggt gtgtggtgag gctgctagtg agtcacctgt gaccactctt 3900 gtttcaggat gataaggatg ccttctatgt ggcagacctg ggagacattc taaagaaaca 3960 tctgaggtgg ttaaaagctc tccctcgtgt cacccccttt tatgcagtca aatgtaatga 4020 tagcaaagcc atcgtgaaga cccttgctgc taccgggaca ggatttgact gtgctagcaa 4080 ggtaagcgat agcagcaggc ctcaaaagcg ttgtataaaa tgggcctggt attccccacg 4140 aggcagatac aagttgtgtt ttttgggcaa taaatgctca ctaaaggcaa atggggcggg 4200 ggggtacatg acaacttccc atgcttttct gtttattcca cgtgttaagc cacatatgga 4260 tagcatgaca ccactcttct ttttcagact gaaatacagt tggtgcagag tctgggggtg 4320 cctccagaga ggattatcta tgcaaatcct tgtaaacaag tatctcaaat taagtatgct 4380 gctaataatg gagtccagat gatgactttt gatagtgaag ttgagttgat gaaagttgcc 4440 agagcacatc ccaaagcaaa gtgagttatt cccccatctg agggcaagat cgggagcata 4500 agatatgtgg attcttatca aacaaactta aatttctgat tattatattt ctatacttta 4560 gtagaaagta gttgaaaccc ccattgagtc atgaagcctg ggactcaaac tacagaatat 4620 atcagcgaca gtatttagaa caggattgtt tttattttaa ttgtggctat aagtgaacat 4680 ctatcatgag acatttgctg cactttcctt gcttgtaggt tggttttgcg gattgccact 4740 gatgattcca aagcagtctg tcgtctcagt gtgaaattcg gtgccacgct cagaaccagc 4800 aggctccttt tggaacgggc gaaagagcta aatatcgatg ttgttggtgt caggtgagat 4860 tttggtggga tagctagagg tcaagacatt gaacagtttg agttttacag gctttctcct 4920 agtgtttgct attattttaa gaaatactaa gacacagtgt ctcgtctctt tattttaccc 4980 cagcttccat gtaggaagcg gctgtaccga tcctgagacc ttcgtgcagg caatctctga 5040 tgcccgctgt gtttttgaca tgggggtgag tatacgtgac cctgttaggg aagggcggga 5100 cacaactgac aataactagt cttaattcta gagttaactt tttatggcag ttggttctgt 5160 attacatggg tttcagccta tctgctgcat acatttttgt tattagctgt ggatctggct 5220 gacttatttt cttgattcta ggctgaggtt ggtttcagca tgtatctgct tgatattggc 5280 ggtggctttc ctggatctga ggatgtgaaa cttaaatttg aagaggtaat ttagaacaaa 5340 actgtaatac tcagtagccg ttctaataaa ttcctttttg gaatatttca aaatttaagt 5400 gtcttaacta ataccacaat gggctgaagt gtcttggtgt gatattttga gtgatttctt 5460 tgtgctgtct gacattacac ttgataccat ttggttttct aaagtgtgaa tcagctttcc 5520 cagaagtctt ggataattgg ttacattgga aatcatggct cacacctgta atccagcact 5580 tggggaggcc aaggtggtag gatcacttga gcccaggagt ttgagaccag cctgggcaac 5640 acagtgagac cccatctcta caaaaaaaat tttaaaatta gcctggtgtg gtggcgggca 5700 cctgtaatcc cagctacttg gaaggctgag gtgggaggat cacttgagcc caggaggttg 5760 aggctgcagt gagccatgat catgccactg cactcagcct gggctacaga gtgagaccct 5820 gtctcaaaaa aaaaaaagaa aaagcatgtt gctgtgggct tcctagagaa tatgctgact 5880 gtagcacatc atcaccccaa atgtgctttg ctagacctat gcttcctctc cttaaaatac 5940 ttgaaatgtt tagtcactta ggaagttaag ccattatatt ggtgcttgaa tttataaaat 6000 atatccacat ggtttgttaa aatcatgacg taggcagaat aggattttta tcctgttggc 6060 atgtatttgt taaaatgttt tgacatcttg atgccttcct aggtagtagt tagttgcgta 6120 ctgttctttg ataaaaatca tacccataac atcctaaagg agatagggtg cctggagggg 6180 aatgaaaacg agccacctgg gatatgtagc ctggttttca gggagatgtt gatgtttttt 6240 tgcttttgtt actttaatga taaacctgtc tgttgatgcc tggtctcatg atgtcatgtc 6300 acaaggccct gtgatgttac tcccccatgt gaatttccca caatgaaggc tgctctttct 6360 tttctgtttc actctcttag atcaccggcg taatcaaccc agcgttggac aaatactttc 6420 cgtcagactc tggagtgaga atcatagctg agcccggcag atactatgtt gcatcagctt 6480 tcacgcttgc agttaatatc attgccaaga aaattgtatt aaaggaacag acgggctctg 6540 atggtatgta taaaggacga atcacttcat gtataactga aagctgatgc aaaaagtcat 6600 taagattgtt gatctgcctt tctagacgaa gatgagtcga gtgagcagac ctttatgtat 6660 tatgtgaatg atggcgtcta tggatcattt aattgcatac tctatgacca cgcacatgta 6720 aagccccttc tgcaaaaggt aatttctgag catactgtat aaaacaatta agaggactgg 6780 tcacaacacg tgtaattaag tagtacttcc tctctccgtc tctttatata gagacctaaa 6840 ccagatgaga agtattattc atccagcata tggggaccaa catgtgatgg cctcgatcgg 6900 attgttgagc gctgtgacct gcctgaaatg catgtgggtg attggatgct ctttgaaaac 6960 atgggcgctt acactgttgc tgctgcctct acgttcaatg gcttccagag gccgacgatc 7020 tactatgtga tgtcagggcc tgcgtggtaa gtaagccatg catgttgatg gtgctgccaa 7080 gaataggcac cttcttggat gtgtgcttct tgtctagacg aataagaaat tgtcttgcct 7140 aagattaaat atatatggat atttttccta agaaaagttt tagaaaagac tgatgagtgt 7200 atttctatgt aattggaata tatttaagtt catgccatgt gtcttgtggt ttccttatta 7260 ccaaaacggt gactgaagaa acgcttgctt tagaaataca ttgaattggc caggtgtgct 7320 ggctcacacc tgaaatcaca acacattggg aggccaaggc agaaggatca cttgagccca 7380 ggagttcgag cctgggcaac atagtgagac cctgtctcta caaaaaatta aaaaattagt 7440 tggccatggt agtgggcgcc tgtagtccca gctgcttggc taaggtgaga ggtttgcttg 7500 agcctgggag gttgaggctg cggtgagcta tgatagcacc attgtattcc agcctgagta 7560 acagagaaag accctgtctc agaaaaaaaa aaaatacatt gaattgtttc ctgatgggaa 7620 gtaaatactc tcatgcccag ttaggagtga gtcagggttt ttaatatgcc actttttctt 7680 tctcaggcaa ctcatgcagc aattccagaa ccccgacttc ccacccgaag tagaggaaca 7740 ggatgccagc accctgcctg tgtcttgtgc ctgggagagt gggatgaaac gccacagagc 7800 agcctgtgct tcggctagta ttaatgtgta gatagcactc tggtagctgt taactgcaag 7860 tttagcttga attaagggat ttggggggac catgtaactt aattactgct agttttgaaa 7920 tgtctttgta agagtagggt cgccatgatg cagccatatg gaagactagg atatgggtca 7980 cacttatctg tgttcctatg gaaactattt gaatatttgt tttatatgga tttttattca 8040 ctcttcagac acgctactca agagtgcccc tcagctgctg aacaagcatt tgtagcttgt 8100 acaatggcag aatgggccaa aagcttagtg ttgtgacctg tttttaaaat aaagtatctt 8160 gaaataatta ggcattggga cgtt 8184 <210> 32 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding ArgG <400> 32 atgacgacga ttctcaagca tctcccggta ggtcaacgta ttggtatcgc tttttctggc 60 ggtctggaca ccagtgccgc actgctgtgg atgcgacaaa agggagcggt tccttatgca 120 tatactgcaa acctgggcca gccagacgaa gaggattatg atgcgatccc tcgtcgtgcc 180 atggaatacg gcgcggagaa cgcacgtctg atcgactgcc gcaaacaact ggtggccgaa 240 ggtattgccg ctattcagtg tggcgcattt cataacacca ccggcggcct gacctatttc 300 aacacgacgc cgctgggccg cgccgtgact ggtaccatgc tggttgctgc gatgaaagaa 360 gatggcgtga atatctgggg tgacggtagc acctacaaag gaaacgatat cgaacgtttc 420 tatcgttatg gtctgctgac caatgctgaa ctgcagattt acaaaccgtg gcttgatact 480 gactttattg atgaactggg cggccgtcat gagatgtctg aatttatgat tgcctgcggt 540 ttcgactaca aaatgtctgt cgaaaaagcc tactccacag actccaacat gcttggtgca 600 acgcatgaag cgaaggatct ggaatacctc aactccagcg tcaaaatcgt caacccgatt 660 atgggcgtga aattctggga tgagagcgtg aagatcccgg cagaagaagt cacagtacgc 720 tttgaacaag gtcatccggt ggcgctgaac ggtaaaacct ttagcgacga cgtagaaatg 780 atgctggaag ctaaccgcat cggcggtcgt cacggcctgg gcatgagcga ccagattgaa 840 aaccgtatca tcgaagcgaa aagccgtggt atttacgaag ctccggggat ggcactgctg 900 cacattgcgt atgaacgcct gttgaccggt attcacaacg aagacaccat tgagcagtat 960 cacgcgcatg gtcgtcagtt gggccgtctg ctgtaccagg ggcgttggtt tgactcccag 1020 gcgctgatgc tgcgtgactc tctgcaacgc tgggttgcca gccagatcac tggtgaagtt 1080 accctggagc tgcgccgtgg gaacgattat tcaatcctga ataccgtctc agagaacctg 1140 acctacaagc cagagcgtct gacgatggaa aaaggcgact cggtgttctc gccagatgat 1200 cgtattggtc aattgaccat gcgtaacctg gatatcactg atacccgcga gaaacttttc 1260 ggttatgcca aaactggcct gctttcctcc tctgccgctt caggcgtgcc gcaggtggag 1320 aatctggaaa acaaaggcca gtaa 1344 <210> 33 <211> 1374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding ArgH <400> 33 atggcacttt ggggcgggcg ttttacccag gcagcagatc aacggttcaa acaattcaac 60 gactcactgc gctttgatta ccgtctggcg gagcaggata ttgttggctc tgtggcctgg 120 tccaaagccc tggtcacggt aggcgtgtta accgcagaag agcaggcgca actggaagag 180 gcgctgaacg tgttgctgga agatgttcgc gccaggccac aacaaatcct tgaaagcgac 240 gccgaagata tccatagctg ggtggaaggc aaactgatcg acaaagtggg ccagttaggc 300 aaaaagctgc ataccgggcg tagccgtaat gatcaggtag cgactgacct gaaactgtgg 360 tgcaaagata ccgttagcga gttactgacg gctaaccggc agctgcaatc ggcgctggtg 420 gaaaccgcac aaaacaatca ggacgcggta atgccaggtt acactcacct gcaacgcgcc 480 cagccggtga cgttcgcgca ctggtgcctg gcctatgttg agatgctggc gcgtgatgaa 540 agccgtttgc aggatgcgct taagcgtctg gatgtcagcc cgctaggctg tggcgcgctg 600 gcgggaacgg cctatgaaat cgaccgtgaa cagttagcag gctggctggg ctttgcttcg 660 gcgacccgta acagtctcga cagcgtttct gaccgtgacc atgtgttgga actgctttct 720 gctgccgcta tcggcatggt gcatctgtcg cgttttgctg aagatctgat tttctttaac 780 accggcgaag cggggtttgt ggagctttct gaccgcgtga cttccggttc atcattaatg 840 ccgcagaaga aaaacccgga tgcgctggag ctgattcgcg gtaaatgcgg ccgggtgcag 900 ggggcgttaa ccggcatgat gatgacgctg aaaggtttgc cgctggctta caacaaagat 960 atgcaggaag acaaagaagg tctgttcgac gcgctcgata cctggctgga ctgcctgcat 1020 atggcggcgc tggtgctgga cggcattcag gtgaaacgtc cacgttgcca ggaagcggct 1080 cagcagggtt acgccaacgc caccgaactg gcggattatc tggtggcgaa aggcgtaccg 1140 ttccgcgagg cgcaccatat tgttggtgaa gcggtggtgg aagccattcg tcagggcaaa 1200 ccgctggaag atctgccgct cagtgagttg cagaaattca gtcaggtgat tgacgaagat 1260 gtctatccga ttctgtcgct gcaatcgtgc ctcgacaagc gtgcggcaaa aggcggcgtc 1320 tcaccgcagc aggtggcgca ggcgattgct tttgcgcagg ctcggttagg gtaa 1374 <210> 34 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding ArgF <400> 34 atgtccgatt tatacaaaaa acactttctg aaactgctcg actttacccc tgcacagttc 60 acttctctgc tgacccttgc cgcacagctc aaagccgata aaaaaaatgg caaggaagta 120 cagaagctta ccggtaaaaa catcgcgctc atcttcgaaa aagactcgac tcgtacccgt 180 tgctctttcg aagttgccgc atttgaccag ggcgcgcgcg ttacctattt agggccgagc 240 ggcagccaga ttgggcataa agagtcaatt aaggacaccg cgcgggttct cgggcggatg 300 tatgacggca ttcagtatcg cggtcacggc caggaagtgg tcgaaacgct ggcgcagtat 360 gcgggcgtgc cggtgtggaa cgggctgacc aacgagttcc acccgaccca gctgctggcg 420 gacctgatga ccatgcagga gcacctgccg ggcaaggcgt ttaacgagat gacgctggtc 480 tacgcgggcg atgcgcgcaa caacatgggc aactcgatgc tggaagcggc ggcgctgacc 540 gggctggatc tgcgcctgtt ggccccgaaa gcctgctggc cggaagagag cctggtggcg 600 gagtgcagcg cgctggcgga gaagcacggc gggaaaatta ctctgacgga agacgtggcg 660 gcaggcgtta agggcgcgga ctttatctat accgacgtgt gggtgtcgat gggcgaggcc 720 aaagagaagt gggcagagcg gattgcgctg ctgcgcgggt atcaggtgaa cgcgcagatg 780 atggcgctga ccgacaaccc gaacgtgaag ttcctgcact gtctgccggc gttccatgac 840 gaccagacta cgctcggcaa gcagatggcg aaggagttcg atctgcacgg cgggatggag 900 gtgacggacg aggtgtttga gtcggcggcg agcatcgtgt tcgaccaggc ggaaaaccgg 960 atgcatacga ttaaggcggt gatgatggca acgcttgggg agtga 1005 <210> 35 <211> 2124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding Trp5 <400> 35 atgtcagaac aactcagaca aacatttgct aacgctaaaa aagaaaacag gaacgccttg 60 gtcacattta tgaccgcagg ttacccaaca gtcaaagaca ctgtccctat tctcaagggt 120 ttccaggatg gtggtgtaga tatcatcgaa ttgggtatgc ccttctctga tccaattgca 180 gatggtccta caattcaatt atctaatact gtggctttgc aaaacggtgt taccttgcct 240 caaactctag aaatggtctc ccaagctaga aatgaaggtg ttaccgtacc cataatccta 300 atgggttact ataaccctat tctaaactac ggtgaagaaa gatttattca ggacgctgcc 360 aaggctggtg ctaatggttt tatcatcgtc gatttgccac cagaggaggc gttgaaggtc 420 agaaactaca tcaatgataa tggtttgagc ctgatcccac tagtggctcc ttctaccacc 480 gacgaaagat tggaattact atcgcatatt gccgattcgt ttgtctacgt tgtgtctaga 540 atgggtacta ctggtgttca aagttctgtg gccagtgatt tggatgaact catctctaga 600 gtcagaaagt acaccaagga tactcctttg gccgttgggt ttggtgtctc taccagagaa 660 catttccaat cagttggtag tgttgctgac ggtgtagtga ttggttccaa aatcgtcaca 720 ttatgtggag atgctccaga gggcaaaagg tacgacgttg ctaaggaata tgtacaggga 780 attctaaatg gtgctaagca taaggttctg tccaaggacg aattctttgc ctttcaaaaa 840 gagtccttga agtccgcaaa cgttaagaag gaaatactgg acgaatttga tgaaaatcac 900 aagcacccaa ttagatttgg ggactttggt ggtcagtatg tcccagaagc tcttcatgca 960 tgtctaagag agttggaaaa gggttttgat gaagctgtcg ccgatcccac attctgggaa 1020 gacttcaaat ccttgtattc ttatattggc cgtccttctt cactacacaa agctgagaga 1080 ttaactgagc attgtcaagg tgctcaaatc tggttgaaga gagaagatct taaccacacg 1140 ggatctcaca agatcaacaa tgctttagca caagttcttc tagctaaaag attaggcaag 1200 aagaacgtta ttgctgaaac cggtgctggt caacacggtg ttgccactgc cactgcatgt 1260 gctaaatttg gcttaacctg tactgtgttc atgggtgcag aagatgttcg tcgccaagct 1320 ttaaacgtct tcagaatgag aattctcggt gctaaagtaa ttgctgttac taatggtaca 1380 aagactctaa gagacgctac ttcagaggca ttcagatttt gggttactaa cttgaaaact 1440 acttactacg tcgtcggttc tgccattggt cctcacccat atccaacttt ggttagaact 1500 ttccaaagtg tcattggtaa agaaaccaag gaacagtttg ctgccatgaa caatggtaaa 1560 ttacctgacg cagttgttgc atgtgttggg ggtggttcca actctacagg tatgttttca 1620 ccattcgagc atgatacttc cgttaagtta ttgggtgtgg aagccggtgg tgatggtgta 1680 gatacaaagt tccactctgc tactctaact gccggtagac ctggtgtctt ccatggtgtc 1740 aagacttatg tcttgcaaga tagtgatggt caagtccatg atactcattc tgtttctgct 1800 gggttagact acccaggtgt cggtccagaa ttggcatatt ggaaatctac tggccgtgct 1860 caattcattg cagctactga cgctcaggct ctgcttggct ttaaattatt atctcaatta 1920 gaaggtatta ttcccgcttt ggaatcttct catgctgttt atggcgcttg cgaattggct 1980 aagacgatga agcctgatca acatttggtt atcaatattt ctggtagagg tgataaagat 2040 gtccaaagtg tcgctgaagt cttgccgaaa ttaggtccaa agataggttg ggatttgaga 2100 ttcgaagaag acccatctgc ctaa 2124 <210> 36 <211> 2124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding IDO <400> 36 atgtcagaac aactcagaca aacatttgct aacgctaaaa aagaaaacag gaacgccttg 60 gtcacattta tgaccgcagg ttacccaaca gtcaaagaca ctgtccctat tctcaagggt 120 ttccaggatg gtggtgtaga tatcatcgaa ttgggtatgc ccttctctga tccaattgca 180 gatggtccta caattcaatt atctaatact gtggctttgc aaaacggtgt taccttgcct 240 caaactctag aaatggtctc ccaagctaga aatgaaggtg ttaccgtacc cataatccta 300 atgggttact ataaccctat tctaaactac ggtgaagaaa gatttattca ggacgctgcc 360 aaggctggtg ctaatggttt tatcatcgtc gatttgccac cagaggaggc gttgaaggtc 420 agaaactaca tcaatgataa tggtttgagc ctgatcccac tagtggctcc ttctaccacc 480 gacgaaagat tggaattact atcgcatatt gccgattcgt ttgtctacgt tgtgtctaga 540 atgggtacta ctggtgttca aagttctgtg gccagtgatt tggatgaact catctctaga 600 gtcagaaagt acaccaagga tactcctttg gccgttgggt ttggtgtctc taccagagaa 660 catttccaat cagttggtag tgttgctgac ggtgtagtga ttggttccaa aatcgtcaca 720 ttatgtggag atgctccaga gggcaaaagg tacgacgttg ctaaggaata tgtacaggga 780 attctaaatg gtgctaagca taaggttctg tccaaggacg aattctttgc ctttcaaaaa 840 gagtccttga agtccgcaaa cgttaagaag gaaatactgg acgaatttga tgaaaatcac 900 aagcacccaa ttagatttgg ggactttggt ggtcagtatg tcccagaagc tcttcatgca 960 tgtctaagag agttggaaaa gggttttgat gaagctgtcg ccgatcccac attctgggaa 1020 gacttcaaat ccttgtattc ttatattggc cgtccttctt cactacacaa agctgagaga 1080 ttaactgagc attgtcaagg tgctcaaatc tggttgaaga gagaagatct taaccacacg 1140 ggatctcaca agatcaacaa tgctttagca caagttcttc tagctaaaag attaggcaag 1200 aagaacgtta ttgctgaaac cggtgctggt caacacggtg ttgccactgc cactgcatgt 1260 gctaaatttg gcttaacctg tactgtgttc atgggtgcag aagatgttcg tcgccaagct 1320 ttaaacgtct tcagaatgag aattctcggt gctaaagtaa ttgctgttac taatggtaca 1380 aagactctaa gagacgctac ttcagaggca ttcagatttt gggttactaa cttgaaaact 1440 acttactacg tcgtcggttc tgccattggt cctcacccat atccaacttt ggttagaact 1500 ttccaaagtg tcattggtaa agaaaccaag gaacagtttg ctgccatgaa caatggtaaa 1560 ttacctgacg cagttgttgc atgtgttggg ggtggttcca actctacagg tatgttttca 1620 ccattcgagc atgatacttc cgttaagtta ttgggtgtgg aagccggtgg tgatggtgta 1680 gatacaaagt tccactctgc tactctaact gccggtagac ctggtgtctt ccatggtgtc 1740 aagacttatg tcttgcaaga tagtgatggt caagtccatg atactcattc tgtttctgct 1800 gggttagact acccaggtgt cggtccagaa ttggcatatt ggaaatctac tggccgtgct 1860 caattcattg cagctactga cgctcaggct ctgcttggct ttaaattatt atctcaatta 1920 gaaggtatta ttcccgcttt ggaatcttct catgctgttt atggcgcttg cgaattggct 1980 aagacgatga agcctgatca acatttggtt atcaatattt ctggtagagg tgataaagat 2040 gtccaaagtg tcgctgaagt cttgccgaaa ttaggtccaa agataggttg ggatttgaga 2100 ttcgaagaag acccatctgc ctaa 2124 <210> 37 <211> 5691 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding exemplary CAR GD2 ASS1+OTC without MP71 vector <400> 37 atgcctcgcg gctggacagc cctgtgcctg ctgtctctgc tgccatccgg cttcatgagc 60 ctggataata acggcacagc caccccagag ctgcctacac agggcacctt cagcaatgtg 120 tccacaaacg tgagctatca ggagaccaca accccttcta ccctgggatc cacaagcctg 180 caccccgtgt ctcagcacgg caacgaagcc accaccaaca tcaccgagac cacagtgaag 240 tttacctcca cctctgtgat tacctctgtg tacggaaata caaactccag cgtgcagtct 300 cagacatctg tgatctccac agtgtttaca acacctgcca atgtgtccac cccagagaca 360 accctgaagc ccagcctgtc tcctggaaat gtgtccgatc tgtctaccac ctccaccagc 420 ctggccacct ctcccaccaa gccctatacc tcctcttctc ccatcctgag cgatatcaaa 480 gccgagatca aatgcagcgg gattcgggaa gtgaaactga cacagggcat ctgcctggaa 540 cagaataaga catccagctg cgccgagttt aagaaagata gaggagaggg actggccagg 600 gtgctgtgtg gcgaagagca ggccgacgcc gatgccggcg cccaggtgtg ttccctgctg 660 ctggcccagt ctgaggtgcg cccccagtgc ctgctgctgg tgctggccaa tcggacagaa 720 attagcagca agctgcagct gatgaaaaaa caccagagcg atctgaaaaa gctgggcatc 780 ctggacttta ccgagcagga cgtggcctct caccagagct acagccagaa aacactgatc 840 gccctggtga ccagcggagc cctgctggcc gtgctgggca tcaccggata tttcctgatg 900 aataggcgca gctggagccc caccggcgaa cggctggagc tggagcctgt cgaccgagtg 960 aagcagaccc tgaactttga tctgctgaag ctggccggcg acgtggagtc caaccccggg 1020 ccagggaata tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cgctggcctt gctgctccac 1080 gccgccaggc cggatattct gctcacacag accccactct ccctgcccgt gtcactcggg 1140 gatcaggcta gcatttcttg ccgctcatct cagtctctgg tccaccggaa tgggaacaca 1200 tacctccatt ggtacctcca gaaacctgga cagagcccta aactgctcat ccacaaagtc 1260 tcaaatcggt tctccggcgt gcccgatcgc tttagcggat ccggatctgg gaccgacttc 1320 acactgaaaa tctcacgagt ggaggctgag gatctcggcg tctacttctg tagtcagagt 1380 acccacgtcc cacccctcac ctttggcgct ggaacaaaac tggagctgaa acgagccgat 1440 gctgctccta ccgtgtccat ctttcctggc tccgggggag gcgggagcgg aggcgaagtg 1500 aaactccagc agtctggccc ttctctcgtg gaacctggcg cttctgtgat gatctcctgt 1560 aaggcctctg gatcttcctt taccggctac aacatgaact gggtccggca gaacattggc 1620 aaatccctgg aatggattgg cgccatcgat ccttactacg gcggcacatc atacaatcag 1680 aaattcaagg ggcgagcaac actcactgtc gacaaatctt catccaccgc ctacatgcac 1740 ctgaaatctc tcacatccga ggatagtgct gtctactact gtgtctctgg catggaatac 1800 tggggacagg gaacttctgt caccgtgtct agtgccaaaa ccacacctcc ctccgtgtac 1860 ggacgagtca ctgtctcatc tgctgaacca aaatcctgtg acaaaacaca cacatgccca 1920 ccttgtcctg cccctgaact gctcggcgga ccttccgtct ttctgtttcc ccccaaaccc 1980 aaggatacac tcatgatttc taggaccccc gaagtcactt gtgtcgtggt cgatgtgtct 2040 cacgaggatc ctgaagtgaa attcaactgg tacgtggacg gagtcgaggt ccacaatgcc 2100 aaaacaaaac cccgggagga acagtacaat agcacctacc gagtcgtgtc cgtgctcacc 2160 gtcctccatc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gtaaagtgag taacaaggct 2220 ctccccgctc ctattgaaaa aaccatctca aaagcaaaag gccagcctag ggagcctcag 2280 gtctacacac tgccaccctc acgggacgaa ctcaccaaaa atcaggtgtc cctcacttgc 2340 ctggtgaaag gcttctaccc ttccgatatc gctgtggaat gggagtcaaa tgggcagccc 2400 gaaaacaact acaaaacaac cccccctgtg ctcgattccg atggctcttt tttcctgtac 2460 tccaaactca ccgtggacaa atcacgctgg cagcagggga atgtcttttc ttgctccgtg 2520 atgcacgagg ccctccacaa tcattacacc cagaaatccc tctcactctc acccggcaaa 2580 aaggacccta aaaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 2640 tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 2700 acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 2760 ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 2820 ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 2880 tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 2940 aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 3000 ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 3060 gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 3120 aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 3180 cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 3240 atgcaggccc tgccccctcg cggcagcggc gccaccaact tcagcctgct gaagcaggcc 3300 ggcgacgtgg aggaaaaccc tggccccatg tccagcaaag gctccgtggt tctggcctac 3360 agtggcggcc tggacacctc gtgcatcctc gtgtggctga aggaacaagg ctatgacgtc 3420 attgcctatc tggccaacat tggccagaag gaagacttcg aggaagccag gaagaaggca 3480 ctgaaacttg gggccaaaaa ggtgttcatt gaggatgtca gcagggagtt tgtggaggag 3540 ttcatctggc cggccatcca gtccagcgca ctgtatgagg accgctacct cctgggcacc 3600 tctcttgcca ggccctgcat cgcccgcaaa caagtggaaa tcgcccagcg ggagggggcc 3660 aagtatgtgt cccacggcgc cacaggaaag gggaacgatc aggtccggtt tgagctcagc 3720 tgctactcac tggcccccca gataaaggtc attgctccct ggaggatgcc tgaattctac 3780 aaccggttca agggccgcaa tgacctgatg gagtacgcaa agcaacacgg gattcccatc 3840 ccggtcactc ccaagaaccc gtggagcatg gatgagaacc tcatgcacat cagctacgag 3900 gctggaatcc tggagaaccc caagaaccaa gcgcctccag gtctctacac gaagacccag 3960 gacccagcca aagcccccaa cacccctgac attctcgaga tcgagttcaa aaaaggggtc 4020 cctgtgaagg tgaccaacgt caaggatggc accacccacc agacctcctt ggagctcttc 4080 atgtacctga acgaagtcgc gggcaagcat ggcgtgggcc gtattgacat cgtggagaac 4140 cgcttcattg gaatgaagtc ccgaggtatc tacgagaccc cagcaggcac catcctttac 4200 catgctcatt tagacatcga ggccttcacc atggaccggg aagtgcgcaa aatcaaacaa 4260 ggcctgggct tgaaatttgc tgagctggtg tataccggtt tctggcacag ccctgagtgt 4320 gaatttgtcc gccactgcat cgccaagtcc caggagcgag tggaagggaa agtgcaggtg 4380 tccgtcctca agggccaggt gtacatcctc ggccgggagt ccccactgtc tctctacaat 4440 gaggagctgg tgagcatgaa cgtgcagggt gattatgagc caactgatgc caccgggttc 4500 atcaacatca attccctcag gctgaaggaa tatcatcgtc tccagagcaa ggtcactgcc 4560 aaaggaagcg gagagggcag aggaagtctg ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct 4620 ggacctatgc tgtttaatct gaggatcctg ttaaacaatg cagcttttag aaatggtcac 4680 aacttcatgg ttcgaaattt tcggtgtgga caaccactac aaaataaagt gcagctgaag 4740 ggccgtgacc ttctcactct aaaaaacttt accggagaag aaattaaata tatgctatgg 4800 ctatcagcag atctgaaatt taggataaaa cagaaaggag agtatttgcc tttattgcaa 4860 gggaagtcct taggcatgat ttttgagaaa agaagtactc gaacaagatt gtctacagaa 4920 acaggcttag cacttctggg aggacatcct tgttttctta ccacacaaga tattcatttg 4980 ggtgtgaatg aaagtctcac ggacacggcc cgtgtattgt ctagcatggc agatgcagta 5040 ttggctcgag tgtataaaca atcagatttg gacaccctgg ctaaagaagc atccatccca 5100 attatcaatg ggctgtcaga tttgtaccat cctatccaga tcctggctga ttacctcacg 5160 ctccaggaac actatagctc tctgaaaggt cttaccctca gctggatcgg ggatgggaac 5220 aatatcctgc actccatcat gatgagcgca gcgaaattcg gaatgcacct tcaggcagct 5280 actccaaagg gttatgagcc ggatgctagt gtaaccaagt tggcagagca gtatgccaaa 5340 gagaatggta ccaagctgtt gctgacaaat gatccattgg aagcagcgca tggaggcaat 5400 gtattaatta cagacacttg gataagcatg ggacaagaag aggagaagaa aaagcggctc 5460 caggctttcc aaggttacca ggttacaatg aagactgcta aagttgctgc ctctgactgg 5520 acatttttac actgcttgcc cagaaagcca gaagaagtgg atgatgaagt cttttattct 5580 cctcgatcac tagtgttccc agaggcagaa aacagaaagt ggacaatcat ggctgtcatg 5640 gtgtccctgc tgacagatta ctcacctcag ctccagaagc ctaaatttta a 5691 <210> 38 <211> 4566 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding exemplary CAR of GD2 ASS1 without MP71 vector <400> 38 atgcctcgcg gctggacagc cctgtgcctg ctgtctctgc tgccatccgg cttcatgagc 60 ctggataata acggcacagc caccccagag ctgcctacac agggcacctt cagcaatgtg 120 tccacaaacg tgagctatca ggagaccaca accccttcta ccctgggatc cacaagcctg 180 caccccgtgt ctcagcacgg caacgaagcc accaccaaca tcaccgagac cacagtgaag 240 tttacctcca cctctgtgat tacctctgtg tacggaaata caaactccag cgtgcagtct 300 cagacatctg tgatctccac agtgtttaca acacctgcca atgtgtccac cccagagaca 360 accctgaagc ccagcctgtc tcctggaaat gtgtccgatc tgtctaccac ctccaccagc 420 ctggccacct ctcccaccaa gccctatacc tcctcttctc ccatcctgag cgatatcaaa 480 gccgagatca aatgcagcgg gattcgggaa gtgaaactga cacagggcat ctgcctggaa 540 cagaataaga catccagctg cgccgagttt aagaaagata gaggagaggg actggccagg 600 gtgctgtgtg gcgaagagca ggccgacgcc gatgccggcg cccaggtgtg ttccctgctg 660 ctggcccagt ctgaggtgcg cccccagtgc ctgctgctgg tgctggccaa tcggacagaa 720 attagcagca agctgcagct gatgaaaaaa caccagagcg atctgaaaaa gctgggcatc 780 ctggacttta ccgagcagga cgtggcctct caccagagct acagccagaa aacactgatc 840 gccctggtga ccagcggagc cctgctggcc gtgctgggca tcaccggata tttcctgatg 900 aataggcgca gctggagccc caccggcgaa cggctggagc tggagcctgt cgaccgagtg 960 aagcagaccc tgaactttga tctgctgaag ctggccggcg acgtggagtc caaccccggg 1020 ccagggaata tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cgctggcctt gctgctccac 1080 gccgccaggc cggatattct gctcacacag accccactct ccctgcccgt gtcactcggg 1140 gatcaggcta gcatttcttg ccgctcatct cagtctctgg tccaccggaa tgggaacaca 1200 tacctccatt ggtacctcca gaaacctgga cagagcccta aactgctcat ccacaaagtc 1260 tcaaatcggt tctccggcgt gcccgatcgc tttagcggat ccggatctgg gaccgacttc 1320 acactgaaaa tctcacgagt ggaggctgag gatctcggcg tctacttctg tagtcagagt 1380 acccacgtcc cacccctcac ctttggcgct ggaacaaaac tggagctgaa acgagccgat 1440 gctgctccta ccgtgtccat ctttcctggc tccgggggag gcgggagcgg aggcgaagtg 1500 aaactccagc agtctggccc ttctctcgtg gaacctggcg cttctgtgat gatctcctgt 1560 aaggcctctg gatcttcctt taccggctac aacatgaact gggtccggca gaacattggc 1620 aaatccctgg aatggattgg cgccatcgat ccttactacg gcggcacatc atacaatcag 1680 aaattcaagg ggcgagcaac actcactgtc gacaaatctt catccaccgc ctacatgcac 1740 ctgaaatctc tcacatccga ggatagtgct gtctactact gtgtctctgg catggaatac 1800 tggggacagg gaacttctgt caccgtgtct agtgccaaaa ccacacctcc ctccgtgtac 1860 ggacgagtca ctgtctcatc tgctgaacca aaatcctgtg acaaaacaca cacatgccca 1920 ccttgtcctg cccctgaact gctcggcgga ccttccgtct ttctgtttcc ccccaaaccc 1980 aaggatacac tcatgatttc taggaccccc gaagtcactt gtgtcgtggt cgatgtgtct 2040 cacgaggatc ctgaagtgaa attcaactgg tacgtggacg gagtcgaggt ccacaatgcc 2100 aaaacaaaac cccgggagga acagtacaat agcacctacc gagtcgtgtc cgtgctcacc 2160 gtcctccatc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gtaaagtgag taacaaggct 2220 ctccccgctc ctattgaaaa aaccatctca aaagcaaaag gccagcctag ggagcctcag 2280 gtctacacac tgccaccctc acgggacgaa ctcaccaaaa atcaggtgtc cctcacttgc 2340 ctggtgaaag gcttctaccc ttccgatatc gctgtggaat gggagtcaaa tgggcagccc 2400 gaaaacaact acaaaacaac cccccctgtg ctcgattccg atggctcttt tttcctgtac 2460 tccaaactca ccgtggacaa atcacgctgg cagcagggga atgtcttttc ttgctccgtg 2520 atgcacgagg ccctccacaa tcattacacc cagaaatccc tctcactctc acccggcaaa 2580 aaggacccta aaaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 2640 tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 2700 acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 2760 ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 2820 ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 2880 tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 2940 aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 3000 ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 3060 gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 3120 aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 3180 cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 3240 atgcaggccc tgccccctcg cggcagcggc gccaccaact tcagcctgct gaagcaggcc 3300 ggcgacgtgg aggaaaaccc tggccccatg tccagcaaag gctccgtggt tctggcctac 3360 agtggcggcc tggacacctc gtgcatcctc gtgtggctga aggaacaagg ctatgacgtc 3420 attgcctatc tggccaacat tggccagaag gaagacttcg aggaagccag gaagaaggca 3480 ctgaaacttg gggccaaaaa ggtgttcatt gaggatgtca gcagggagtt tgtggaggag 3540 ttcatctggc cggccatcca gtccagcgca ctgtatgagg accgctacct cctgggcacc 3600 tctcttgcca ggccctgcat cgcccgcaaa caagtggaaa tcgcccagcg ggagggggcc 3660 aagtatgtgt cccacggcgc cacaggaaag gggaacgatc aggtccggtt tgagctcagc 3720 tgctactcac tggcccccca gataaaggtc attgctccct ggaggatgcc tgaattctac 3780 aaccggttca agggccgcaa tgacctgatg gagtacgcaa agcaacacgg gattcccatc 3840 ccggtcactc ccaagaaccc gtggagcatg gatgagaacc tcatgcacat cagctacgag 3900 gctggaatcc tggagaaccc caagaaccaa gcgcctccag gtctctacac gaagacccag 3960 gacccagcca aagcccccaa cacccctgac attctcgaga tcgagttcaa aaaaggggtc 4020 cctgtgaagg tgaccaacgt caaggatggc accacccacc agacctcctt ggagctcttc 4080 atgtacctga acgaagtcgc gggcaagcat ggcgtgggcc gtattgacat cgtggagaac 4140 cgcttcattg gaatgaagtc ccgaggtatc tacgagaccc cagcaggcac catcctttac 4200 catgctcatt tagacatcga ggccttcacc atggaccggg aagtgcgcaa aatcaaacaa 4260 ggcctgggct tgaaatttgc tgagctggtg tataccggtt tctggcacag ccctgagtgt 4320 gaatttgtcc gccactgcat cgccaagtcc caggagcgag tggaagggaa agtgcaggtg 4380 tccgtcctca agggccaggt gtacatcctc ggccgggagt ccccactgtc tctctacaat 4440 gaggagctgg tgagcatgaa cgtgcagggt gattatgagc caactgatgc caccgggttc 4500 atcaacatca attccctcag gctgaaggaa tatcatcgtc tccagagcaa ggtcactgcc 4560 aaataa 4566 <210> 39 <211> 4398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding exemplary CAR of GD2 OTC without MP71 vector <400> 39 atgcctcgcg gctggacagc cctgtgcctg ctgtctctgc tgccatccgg cttcatgagc 60 ctggataata acggcacagc caccccagag ctgcctacac agggcacctt cagcaatgtg 120 tccacaaacg tgagctatca ggagaccaca accccttcta ccctgggatc cacaagcctg 180 caccccgtgt ctcagcacgg caacgaagcc accaccaaca tcaccgagac cacagtgaag 240 tttacctcca cctctgtgat tacctctgtg tacggaaata caaactccag cgtgcagtct 300 cagacatctg tgatctccac agtgtttaca acacctgcca atgtgtccac cccagagaca 360 accctgaagc ccagcctgtc tcctggaaat gtgtccgatc tgtctaccac ctccaccagc 420 ctggccacct ctcccaccaa gccctatacc tcctcttctc ccatcctgag cgatatcaaa 480 gccgagatca aatgcagcgg gattcgggaa gtgaaactga cacagggcat ctgcctggaa 540 cagaataaga catccagctg cgccgagttt aagaaagata gaggagaggg actggccagg 600 gtgctgtgtg gcgaagagca ggccgacgcc gatgccggcg cccaggtgtg ttccctgctg 660 ctggcccagt ctgaggtgcg cccccagtgc ctgctgctgg tgctggccaa tcggacagaa 720 attagcagca agctgcagct gatgaaaaaa caccagagcg atctgaaaaa gctgggcatc 780 ctggacttta ccgagcagga cgtggcctct caccagagct acagccagaa aacactgatc 840 gccctggtga ccagcggagc cctgctggcc gtgctgggca tcaccggata tttcctgatg 900 aataggcgca gctggagccc caccggcgaa cggctggagc tggagcctgt cgaccgagtg 960 aagcagaccc tgaactttga tctgctgaag ctggccggcg acgtggagtc caaccccggg 1020 ccagggaata tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cgctggcctt gctgctccac 1080 gccgccaggc cggatattct gctcacacag accccactct ccctgcccgt gtcactcggg 1140 gatcaggcta gcatttcttg ccgctcatct cagtctctgg tccaccggaa tgggaacaca 1200 tacctccatt ggtacctcca gaaacctgga cagagcccta aactgctcat ccacaaagtc 1260 tcaaatcggt tctccggcgt gcccgatcgc tttagcggat ccggatctgg gaccgacttc 1320 acactgaaaa tctcacgagt ggaggctgag gatctcggcg tctacttctg tagtcagagt 1380 acccacgtcc cacccctcac ctttggcgct ggaacaaaac tggagctgaa acgagccgat 1440 gctgctccta ccgtgtccat ctttcctggc tccgggggag gcgggagcgg aggcgaagtg 1500 aaactccagc agtctggccc ttctctcgtg gaacctggcg cttctgtgat gatctcctgt 1560 aaggcctctg gatcttcctt taccggctac aacatgaact gggtccggca gaacattggc 1620 aaatccctgg aatggattgg cgccatcgat ccttactacg gcggcacatc atacaatcag 1680 aaattcaagg ggcgagcaac actcactgtc gacaaatctt catccaccgc ctacatgcac 1740 ctgaaatctc tcacatccga ggatagtgct gtctactact gtgtctctgg catggaatac 1800 tggggacagg gaacttctgt caccgtgtct agtgccaaaa ccacacctcc ctccgtgtac 1860 ggacgagtca ctgtctcatc tgctgaacca aaatcctgtg acaaaacaca cacatgccca 1920 ccttgtcctg cccctgaact gctcggcgga ccttccgtct ttctgtttcc ccccaaaccc 1980 aaggatacac tcatgatttc taggaccccc gaagtcactt gtgtcgtggt cgatgtgtct 2040 cacgaggatc ctgaagtgaa attcaactgg tacgtggacg gagtcgaggt ccacaatgcc 2100 aaaacaaaac cccgggagga acagtacaat agcacctacc gagtcgtgtc cgtgctcacc 2160 gtcctccatc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gtaaagtgag taacaaggct 2220 ctccccgctc ctattgaaaa aaccatctca aaagcaaaag gccagcctag ggagcctcag 2280 gtctacacac tgccaccctc acgggacgaa ctcaccaaaa atcaggtgtc cctcacttgc 2340 ctggtgaaag gcttctaccc ttccgatatc gctgtggaat gggagtcaaa tgggcagccc 2400 gaaaacaact acaaaacaac cccccctgtg ctcgattccg atggctcttt tttcctgtac 2460 tccaaactca ccgtggacaa atcacgctgg cagcagggga atgtcttttc ttgctccgtg 2520 atgcacgagg ccctccacaa tcattacacc cagaaatccc tctcactctc acccggcaaa 2580 aaggacccta aaaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 2640 tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 2700 acgagggggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 2760 gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 2820 agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 2880 aagcattacc agccctatgc cccacctcgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 2940 ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac aagcagggcc agaaccagct ctataacgag 3000 ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 3060 gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 3120 aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 3180 aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 3240 cttcacatgc aggccctgcc ccctcgcggc agcggcgcca ccaacttcag cctgctgaag 3300 caggccggcg acgtggagga aaaccctggc cccatgctgt ttaatctgag gatcctgtta 3360 aacaatgcag cttttagaaa tggtcacaac ttcatggttc gaaattttcg gtgtggacaa 3420 ccactacaaa ataaagtgca gctgaagggc cgtgaccttc tcactctaaa aaactttacc 3480 ggagaagaaa ttaaatatat gctatggcta tcagcagatc tgaaatttag gataaaacag 3540 aaaggagagt atttgccttt attgcaaggg aagtccttag gcatgatttt tgagaaaaga 3600 agtactcgaa caagattgtc tacagaaaca ggcttagcac ttctgggagg acatccttgt 3660 tttcttacca cacaagatat tcatttgggt gtgaatgaaa gtctcacgga cacggcccgt 3720 gtattgtcta gcatggcaga tgcagtattg gctcgagtgt ataaacaatc agatttggac 3780 accctggcta aagaagcatc catcccaatt atcaatgggc tgtcagattt gtaccatcct 3840 atccagatcc tggctgatta cctcacgctc caggaacact atagctctct gaaaggtctt 3900 accctcagct ggatcgggga tgggaacaat atcctgcact ccatcatgat gagcgcagcg 3960 aaattcggaa tgcaccttca ggcagctact ccaaagggtt atgagccgga tgctagtgta 4020 accaagttgg cagagcagta tgccaaagag aatggtacca agctgttgct gacaaatgat 4080 ccattggaag cagcgcatgg aggcaatgta ttaattacag acacttggat aagcatggga 4140 caagaagagg agaagaaaaa gcggctccag gctttccaag gttaccaggt tacaatgaag 4200 actgctaaag ttgctgcctc tgactggaca tttttacact gcttgcccag aaagccagaa 4260 gaagtggatg atgaagtctt ttattctcct cgatcactag tgttcccaga ggcagaaaac 4320 agaaagtgga caatcatggc tgtcatggtg tccctgctga cagattactc acctcagctc 4380 cagaagccta aattttaa 4398 <210> 40 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding an alternative CD3z <400> 40 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 342 <210> 41 <211> 786 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding an alternative EGFRvIII target binding moiety (EGFRvIII scFv sequence derived from MR1 antibody) <400> 41 atggactgga tttggcgcat ccttttcctt gtcggcgctg ctaccggcgc gcattctcag 60 gtacaactcc agcagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagcgtctct gaaactctcc 120 tgtgtaacct ctggattcac tttcagaaaa tttggcatgt cttgggttcg ccagactagt 180 gacaagaggc tggaatgggt cgcatccatt agtactggcg gttataacac gtactattca 240 gacaatgtaa agggccgatt caccatctcc agagagaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagta gtctgaagtc tgaggacacg gccttgtatt actgtacaag aggctattct 360 agtacctctt atgctatgga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaagt 420 ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cggacatcga gctcactcag 480 tctccagcat ccctgtccgt ggctacagga gaaaaagtca ctatcagatg catgaccagc 540 actgatattg atgatgatat gaactggtac cagcagaagc caggggaacc ccctaagttc 600 cttatttcag aaggcaatac tcttcggccg ggagtcccat cccgattttc cagcagtggc 660 actggcacag attttgtttt tacaattgaa aacacactct cggaagatgt tggagattac 720 tactgtttgc aaagctttaa cgtgcctctt acattcggtg atggcaccaa gcttgaaaaa 780 gctcta 786 <210> 42 <211> 1283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of an exemplary CAR of EGFRvIII (employing the alternative EGFRvIII target binding moiety encoded by SEQ ID NO: 41) including an ASS-1 domain <400> 42 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Met Asp Trp Ile 355 360 365 Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly Ala His Ser Gln 370 375 380 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 385 390 395 400 Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly 405 410 415 Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala 420 425 430 Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 435 440 445 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 450 455 460 Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr 465 470 475 480 Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 485 490 495 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 500 505 510 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser 515 520 525 Leu Ser Val Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser 530 535 540 Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu 545 550 555 560 Pro Pro Lys Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val 565 570 575 Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr 580 585 590 Ile Glu Asn Thr Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln 595 600 605 Ser Phe Asn Val Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Lys 610 615 620 Ala Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 625 630 635 640 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 645 650 655 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 660 665 670 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 675 680 685 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 690 695 700 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 705 710 715 720 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 725 730 735 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln 740 745 750 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 755 760 765 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 770 775 780 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 785 790 795 800 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 805 810 815 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 820 825 830 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 835 840 845 Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp 850 855 860 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Ser Lys Gly Ser Val Val Leu 865 870 875 880 Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Ser Cys Ile Leu Val Trp Leu Lys 885 890 895 Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys 900 905 910 Glu Asp Phe Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ala Leu Lys Leu Gly Ala Lys 915 920 925 Lys Val Phe Ile Glu Asp Val Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu Phe Ile 930 935 940 Trp Pro Ala Ile Gln Ser Ser Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Leu Leu 945 950 955 960 Gly Thr Ser Leu Ala Arg Pro Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val Glu Ile 965 970 975 Ala Gln Arg Glu Gly Ala Lys Tyr Val Ser His Gly Ala Thr Gly Lys 980 985 990 Gly Asn Asp Gln Val Arg Phe Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu Ala Pro 995 1000 1005 Gln Ile Lys Val Ile Ala Pro Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr Asn 1010 1015 1020 Arg Phe Lys Gly Arg Asn Asp Leu Met Glu Tyr Ala Lys Gln His 1025 1030 1035 Gly Ile Pro Ile Pro Val Thr Pro Lys Asn Pro Trp Ser Met Asp 1040 1045 1050 Glu Asn Leu Met His Ile Ser Tyr Glu Ala Gly Ile Leu Glu Asn 1055 1060 1065 Pro Lys Asn Gln Ala Pro Pro Gly Leu Tyr Thr Lys Thr Gln Asp 1070 1075 1080 Pro Ala Lys Ala Pro Asn Thr Pro Asp Ile Leu Glu Ile Glu Phe 1085 1090 1095 Lys Lys Gly Val Pro Val Lys Val Thr Asn Val Lys Asp Gly Thr 1100 1105 1110 Thr His Gln Thr Ser Leu Glu Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu Val 1115 1120 1125 Ala Gly Lys His Gly Val Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg 1130 1135 1140 Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala Gly 1145 1150 1155 Thr Ile Leu Tyr His Ala His Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr Met 1160 1165 1170 Asp Arg Glu Val Arg Lys Ile Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys Phe 1175 1180 1185 Ala Glu Leu Val Tyr Thr Gly Phe Trp His Ser Pro Glu Cys Glu 1190 1195 1200 Phe Val Arg His Cys Ile Ala Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu Gly 1205 1210 1215 Lys Val Gln Val Ser Val Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu Gly 1220 1225 1230 Arg Glu Ser Pro Leu Ser Leu Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser Met 1235 1240 1245 Asn Val Gln Gly Asp Tyr Glu Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe Ile 1250 1255 1260 Asn Ile Asn Ser Leu Arg Leu Lys Glu Tyr His Arg Leu Gln Ser 1265 1270 1275 Lys Val Thr Ala Lys 1280 <210> 43 <211> 1225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of an exemplary CAR of EGFRvIII (employing the alternative EGFRvIII target binding moiety encoded by SEQ ID NO: 41) including an OTC domain <400> 43 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Met Asp Trp Ile 355 360 365 Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly Ala His Ser Gln 370 375 380 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 385 390 395 400 Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly 405 410 415 Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala 420 425 430 Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 435 440 445 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 450 455 460 Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr 465 470 475 480 Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 485 490 495 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 500 505 510 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser 515 520 525 Leu Ser Val Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser 530 535 540 Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu 545 550 555 560 Pro Pro Lys Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val 565 570 575 Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr 580 585 590 Ile Glu Asn Thr Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln 595 600 605 Ser Phe Asn Val Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Lys 610 615 620 Ala Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 625 630 635 640 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 645 650 655 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 660 665 670 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 675 680 685 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 690 695 700 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 705 710 715 720 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 725 730 735 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln 740 745 750 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 755 760 765 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 770 775 780 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 785 790 795 800 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 805 810 815 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 820 825 830 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 835 840 845 Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp 850 855 860 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu 865 870 875 880 Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe 885 890 895 Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp 900 905 910 Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu 915 920 925 Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr 930 935 940 Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg 945 950 955 960 Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser Thr Glu Thr Gly Leu Ala Leu Leu Gly 965 970 975 Gly His Pro Cys Phe Leu Thr Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn 980 985 990 Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala 995 1000 1005 Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr 1025 1030 1035 His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr Leu Thr Leu Gln Glu His 1040 1045 1050 Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser Trp Ile Gly Asp Gly 1055 1060 1065 Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala Ala Lys Phe Gly 1070 1075 1080 Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu Pro Asp Ala 1085 1090 1095 Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn Gly Thr 1100 1105 1110 Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly Gly 1115 1120 1125 Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu 1130 1135 1140 Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr 1145 1150 1155 Met Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His 1160 1165 1170 Cys Leu Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr 1175 1180 1185 Ser Pro Arg Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp 1190 1195 1200 Thr Ile Met Ala Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro 1205 1210 1215 Gln Leu Gln Lys Pro Lys Phe 1220 1225 <210> 44 <211> 1658 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of an exemplary CAR of EGFRvIII (employing the alternative EGFRvIII target binding moiety encoded by SEQ ID NO: 41) including an ASS-1 domain and an OTC domain <400> 44 Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro 20 25 30 Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser 50 55 60 Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro 100 105 110 Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro 115 120 125 Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser 130 135 140 Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly 165 170 175 Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys 180 185 190 Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala 195 200 205 Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln 260 265 270 Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser 290 295 300 Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val 305 310 315 320 Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu 325 330 335 Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 340 345 350 Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Met Asp Trp Ile 355 360 365 Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly Ala His Ser Gln 370 375 380 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 385 390 395 400 Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly 405 410 415 Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala 420 425 430 Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys 435 440 445 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 450 455 460 Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr 465 470 475 480 Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 485 490 495 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 500 505 510 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser 515 520 525 Leu Ser Val Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser 530 535 540 Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu 545 550 555 560 Pro Pro Lys Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val 565 570 575 Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr 580 585 590 Ile Glu Asn Thr Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln 595 600 605 Ser Phe Asn Val Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Lys 610 615 620 Ala Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 625 630 635 640 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 645 650 655 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 660 665 670 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 675 680 685 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 690 695 700 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 705 710 715 720 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 725 730 735 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln 740 745 750 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 755 760 765 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 770 775 780 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 785 790 795 800 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 805 810 815 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 820 825 830 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 835 840 845 Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp 850 855 860 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Ser Lys Gly Ser Val Val Leu 865 870 875 880 Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Ser Cys Ile Leu Val Trp Leu Lys 885 890 895 Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys 900 905 910 Glu Asp Phe Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ala Leu Lys Leu Gly Ala Lys 915 920 925 Lys Val Phe Ile Glu Asp Val Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu Phe Ile 930 935 940 Trp Pro Ala Ile Gln Ser Ser Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Leu Leu 945 950 955 960 Gly Thr Ser Leu Ala Arg Pro Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val Glu Ile 965 970 975 Ala Gln Arg Glu Gly Ala Lys Tyr Val Ser His Gly Ala Thr Gly Lys 980 985 990 Gly Asn Asp Gln Val Arg Phe Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu Ala Pro 995 1000 1005 Gln Ile Lys Val Ile Ala Pro Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr Asn 1010 1015 1020 Arg Phe Lys Gly Arg Asn Asp Leu Met Glu Tyr Ala Lys Gln His 1025 1030 1035 Gly Ile Pro Ile Pro Val Thr Pro Lys Asn Pro Trp Ser Met Asp 1040 1045 1050 Glu Asn Leu Met His Ile Ser Tyr Glu Ala Gly Ile Leu Glu Asn 1055 1060 1065 Pro Lys Asn Gln Ala Pro Pro Gly Leu Tyr Thr Lys Thr Gln Asp 1070 1075 1080 Pro Ala Lys Ala Pro Asn Thr Pro Asp Ile Leu Glu Ile Glu Phe 1085 1090 1095 Lys Lys Gly Val Pro Val Lys Val Thr Asn Val Lys Asp Gly Thr 1100 1105 1110 Thr His Gln Thr Ser Leu Glu Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu Val 1115 1120 1125 Ala Gly Lys His Gly Val Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg 1130 1135 1140 Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala Gly 1145 1150 1155 Thr Ile Leu Tyr His Ala His Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr Met 1160 1165 1170 Asp Arg Glu Val Arg Lys Ile Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys Phe 1175 1180 1185 Ala Glu Leu Val Tyr Thr Gly Phe Trp His Ser Pro Glu Cys Glu 1190 1195 1200 Phe Val Arg His Cys Ile Ala Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu Gly 1205 1210 1215 Lys Val Gln Val Ser Val Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu Gly 1220 1225 1230 Arg Glu Ser Pro Leu Ser Leu Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser Met 1235 1240 1245 Asn Val Gln Gly Asp Tyr Glu Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe Ile 1250 1255 1260 Asn Ile Asn Ser Leu Arg Leu Lys Glu Tyr His Arg Leu Gln Ser 1265 1270 1275 Lys Val Thr Ala Lys Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu 1280 1285 1290 Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Phe Asn 1295 1300 1305 Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn Gly His Asn 1310 1315 1320 Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln Asn Lys 1325 1330 1335 Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe Thr 1340 1345 1350 Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys 1355 1360 1365 Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly 1370 1375 1380 Lys Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg 1385 1390 1395 Leu Ser Thr Glu Thr Gly Leu Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys 1400 1405 1410 Phe Leu Thr Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu 1415 1420 1425 Thr Asp Thr Ala Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu 1430 1435 1440 Ala Arg Val Tyr Lys Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu 1445 1450 1455 Ala Ser Ile Pro Ile Ile Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro 1460 1465 1470 Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser 1475 1480 1485 Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn 1490 1495 1500 Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala Ala Lys Phe Gly Met His 1505 1510 1515 Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu Pro Asp Ala Ser Val 1520 1525 1530 Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn Gly Thr Lys Leu 1535 1540 1545 Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly Gly Asn Val 1550 1555 1560 Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu Glu Lys 1565 1570 1575 Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met Lys 1580 1585 1590 Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu 1595 1600 1605 Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro 1610 1615 1620 Arg Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile 1625 1630 1635 Met Ala Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu 1640 1645 1650 Gln Lys Pro Lys Phe 1655

Claims (51)

  1. 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인이 효소 도메인을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  3. 제 2 항에 있어서,
    효소 도메인이 ASS-1 도메인; OTC 도메인; ASL 도메인; OCD1 도메인; ArgG 도메인; ArgH 도메인; 및 ArgF 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 표적-결합 단백질.
  4. 제 3 항에 있어서,
    ASS-1 도메인이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    OTC 도메인이 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ASL 도메인이 서열번호 30에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ODC1 도메인이 서열번호 31에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  8. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ArgG 도메인이 서열번호 32에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  9. 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ArgH 도메인이 서열번호 33에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  10. 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ArgF 도메인이 서열번호 34에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  11. 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질.
  12. 제 11 항에 있어서,
    트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인이 효소 도메인을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    효소 도메인이 TRP5 도메인; 및 IDO 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 표적-결합 단백질.
  14. 제 13 항에 있어서,
    TRP5 도메인이 서열번호 35에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    IDO 도메인이 서열번호 36에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 결합 잔기가 GD2 표적 결합 잔기; CD33 표적 결합 잔기; 메소텔린 표적 결합 잔기; 및 EGFRvIII 표적 결합 잔기로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 표적-결합 단백질.
  17. 제 16 항에 있어서,
    GD2 표적 결합 잔기가 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  18. 제 16 항에 있어서,
    CD33 표적 결합 잔기가 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  19. 제 16 항에 있어서,
    메소텔린 표적 결합 잔기가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  20. 제 16 항에 있어서,
    EGFRvIII 표적 결합 잔기가 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 신호전달 영역이 4-1BB 신호전달 영역; OX-40 신호전달 영역; CD28 신호전달 영역; ICOS 신호전달 영역; 및 CD3ζ 신호전달 영역으로 이루어진 군에서 선택되는 영역을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  22. 제 21 항에 있어서,
    세포내 신호전달 영역이 4-1BB 신호전달 영역을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
    4-1BB 세포내 신호전달 영역이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포내 신호전달 영역이 CD3ζ 도메인을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  25. 제 24 항에 있어서,
    CD3ζ 도메인이 서열번호 11 또는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 표적-결합 단백질.
  26. 제 21 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    4-1BB 도메인 및 CD3ζ 도메인을 둘 다 포함하는 융합 표적-결합 단백질.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 12 내지 23으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 융합-표적 결합 단백질.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로 사용하기 위한 융합-표적 결합 단백질.
  29. 제 28 항에 있어서,
    암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 융합 표적-결합 단백질.
  30. 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 포함하는 세포.
  31. 제 30 항에 있어서,
    융합 표적-결합 단백질이 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 16 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 세포.
  32. 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 포함하는 세포.
  33. 제 32 항에 있어서,
    융합 표적-결합 단백질이 제 11 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 세포.
  34. 제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로 사용하기 위한 세포.
  35. 제 34 항에 있어서,
    암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 세포.
  36. 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 아르기닌 또는 아르기닌 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 암호화하는 핵산.
  37. 제 36 항에 있어서,
    융합 표적-결합 단백질이 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 16 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 핵산.
  38. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서,
    서열번호 38, 서열번호 39 또는 서열번호 37의 DNA 서열을 포함하는 핵산.
  39. 표적 결합 잔기, 세포내 신호전달 영역, 및 트립토판 또는 트립토판 전구체의 합성을 촉진하는 도메인을 포함하는 융합 표적-결합 단백질을 암호화하는 핵산.
  40. 제 39 항에 있어서,
    융합 표적-결합 단백질이 제 11 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 핵산.
  41. 제 36 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로 사용하기 위한 핵산.
  42. 제 41 항에 있어서,
    암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 핵산.
  43. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 융합 표적-결합 단백질; 및/또는 제 30 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 세포; 및/또는 제 36 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 약학 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서,
    약제로 사용하기 위한 약학 조성물.
  45. 제 44 항에 있어서,
    암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
  46. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 융합 표적-결합 단백질을 치료를 필요로 하는 대상에게 제공하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 병태를 치료하는 방법.
  47. 제 45 항에 있어서,
    융합 표적-결합 단백질이 제 37 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열의 세포 발현에 의해 제공되는, 방법.
  48. 제 30 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 세포를 치료를 필요로 하는 대상에게 제공하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 병태를 치료하는 방법.
  49. 제 36 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 치료를 필요로 하는 대상에게 제공하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 병태를 치료하는 방법.
  50. 제 46 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료에 있어서의 방법.
  51. 제 46 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스 감염의 치료에 있어서의 방법.
KR1020207021180A 2017-12-22 2018-12-24 융합 단백질 KR20200110347A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1721833.0A GB201721833D0 (en) 2017-12-22 2017-12-22 Fusion proteins
GB1721833.0 2017-12-22
PCT/GB2018/053771 WO2019122936A1 (en) 2017-12-22 2018-12-24 Fusion proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200110347A true KR20200110347A (ko) 2020-09-23

Family

ID=61131454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207021180A KR20200110347A (ko) 2017-12-22 2018-12-24 융합 단백질

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20200308557A1 (ko)
EP (1) EP3728299A1 (ko)
JP (1) JP2021507716A (ko)
KR (1) KR20200110347A (ko)
CN (1) CN111770933A (ko)
AU (1) AU2018387430A1 (ko)
BR (1) BR112020012717A2 (ko)
CA (1) CA3085925A1 (ko)
GB (1) GB201721833D0 (ko)
IL (1) IL275560A (ko)
MX (1) MX2020006671A (ko)
SG (1) SG11202005761SA (ko)
WO (1) WO2019122936A1 (ko)
ZA (1) ZA202003845B (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023515806A (ja) * 2020-02-21 2023-04-14 スカイ パーフェクト インターナショナル リミテッド 免疫細胞においてアルギニン濃度をモジュレートするための方法および組成物
CN113736812A (zh) * 2021-09-06 2021-12-03 武汉翼康基因科技有限公司 一种pcMINI载体及其构建方法与应用
CN118510890A (zh) * 2022-01-07 2024-08-16 原启生物科技(上海)有限责任公司 靶向cldn18.2和msln的嵌合抗原受体及其用途
CN115779097B (zh) * 2022-11-09 2024-01-30 四川大学 基于工程化线粒体的肿瘤抗原递送系统及应用
CN116003638B (zh) * 2023-01-20 2023-09-05 北京基因启明生物科技有限公司 一种有效杀伤胆管型肝癌的CAR-iNKT细胞技术

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6420150B1 (en) * 2000-11-27 2002-07-16 Pe Corporation (Ny) Isolated human drug-metabolizing proteins, nucleic acid molecules encoding human drug-metabolizing proteins, and uses thereof
EP1578991A2 (en) * 2002-06-05 2005-09-28 Metabolex, Inc. Methods of diagnosing & treating diabetes and insulin resistance
JP5882735B2 (ja) * 2008-09-19 2016-03-09 ネステク ソシエテ アノニム 抗癌治療の間の骨髄麻痺又は好中球減少を阻止又は緩和するための栄養支援
SG190997A1 (en) * 2010-12-09 2013-07-31 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
SG192010A1 (en) * 2011-01-18 2013-08-30 Univ Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
CA2903096A1 (en) * 2013-03-05 2014-09-12 Baylor College Of Medicine Oncolytic virus
US10287331B2 (en) * 2013-04-15 2019-05-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Mitochondrial proteins constructs and uses thereof
US8912147B2 (en) * 2013-04-15 2014-12-16 BioBlast Pharma Ltd. Mitochondrial proteins constructs and uses thereof
EP3087101B1 (en) * 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
WO2015188141A2 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Ceneter Mesothelin-targeted chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2016008973A1 (en) * 2014-07-16 2016-01-21 Universitaet Zu Koeln Chimeric antigen receptor and its use
US11161907B2 (en) * 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
JP6784687B2 (ja) * 2015-02-24 2020-11-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 結合誘発型転写スイッチ及びその使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20200308557A1 (en) 2020-10-01
CN111770933A (zh) 2020-10-13
IL275560A (en) 2020-08-31
AU2018387430A1 (en) 2020-07-09
WO2019122936A1 (en) 2019-06-27
ZA202003845B (en) 2022-12-21
MX2020006671A (es) 2020-10-28
CA3085925A1 (en) 2019-06-27
SG11202005761SA (en) 2020-07-29
GB201721833D0 (en) 2018-02-07
EP3728299A1 (en) 2020-10-28
JP2021507716A (ja) 2021-02-25
BR112020012717A2 (pt) 2020-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20200110347A (ko) 융합 단백질
CN111094345B (zh) 具有人结构域的抗b细胞成熟抗原嵌合抗原受体
US20210189342A1 (en) Compositions and methods for modulating monocyte and macrophage inflammatory phenotypes and immunotherapy uses thereof
CN109790543B (zh) 用于减少tau表达的化合物和方法
KR20220078565A (ko) 분자에 연결된 세포외 소포 및 이의 용도
CN112585276A (zh) 产生表达重组受体的细胞的方法和相关组合物
AU2021200783B2 (en) Mitigating tissue damage and fibrosis via latent transforming growth factor beta binding protein (LTBP4)
TWI834177B (zh) 用於減少tau表現之組合物及方法
KR20180016970A (ko) 타우 안티센스 올리고머와 그 용도
KR20190009804A (ko) 비-erk mapk 경로 억제제-내성 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물
KR20220119038A (ko) 종양 침윤 림프구의 활성화 및 확장을 위한 방법
CN108602873A (zh) 工程化抗原呈递细胞及其用途
KR20200043549A (ko) 면역자극성 수지상 세포를 얻는 방법
KR20200106217A (ko) 면역억제성 수지상 세포를 얻는 방법
CN107267517A (zh) 用于治疗、延缓和/或预防人类遗传性疾病如强直性肌营养不良症1型的新化合物
ES2208145T3 (es) Ensayos de seleccion para agonistas o antagonistas del receptor activador de nf-kb.
KR102517872B1 (ko) 암의 예방 또는 치료용 조성물
KR20160098259A (ko) 인간 메조텔린 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
KR20200079505A (ko) ENaC 발현의 조절제
KR20230160823A (ko) 치료 전달을 위한 조성물 및 방법
KR20230146603A (ko) 최적화 링커와 고정 모이어티를 통해 생물학적 활성 분자에 연결된 세포외 소포체
US20220062338A1 (en) Psca car-t cells
US20240000835A1 (en) Nucleic acid constructs and cells
CN107475438A (zh) Wnt7b在作为胃癌检测标记物中的应用
WO2003014340A2 (en) Human histone deacetylase-related gene and protein hdac10

Legal Events

Date Code Title Description
WITB Written withdrawal of application