SK50699A3 - Methods and compositions for delivery and expression of interferon-'alpha' nucleic acids - Google Patents

Description

1

Spôsoby z kompozície na zavedenie a expresov nukleových kyselín ir.teroercnu-a .<v tecnn r/i«

Vyr.ález sa týka spôsobov a kompozícii pre tkaninovo pacifickú expresiu interferónu-α na účely terapie. ccerajši stav techniky ľudské interferóny-α (IFN-a) patria dc rodiny proteínov, ktorá oahrňuje aspoň 24 subdrunov .Zoon, K. C., Interferón 9: 1 19E“ , Gresser, I., ed., Academic Press, NY) . Interferóny-a sa všeobecne popisujú ako činidlá schopné indukovať v bunkách ar.z i vírusový stav, v súčasnosti sú známe ako pleiotrofné lym. í o kirázy, ktoré ovplyvňujú množstve funkcií imunitného systému Gper.akker et al., Experimentia 45: 513 (1989)). 1 l . ' 1 ΙΓ.ί-α sa používa v širokom rozsahu na terapeutické účely, napríklad pri liečení leukémie vlasových buniek, Kaposiho sarkómu, karcinómu renálnych buniek, iymfómu iného ako

Kodkir.scvho, leukémie T-buniek, viacnásobnej a chronickej rnyelo cennej leukémie, maligného melanómu, karcinómu buniek močového mechúra, karcinómu hrubého čreva s 5-FU), kondylomu aru.~ir.ara, rinovírusovej infekcie a rôznych foriem chronickej vírusovej hepatitídy B, ktorá sa objavuje ako výsledok infekcie vírusom hepatitídy B (HBV), vírusom hepatitídy C (HCV), NANB s r. i vírusu hepatitídy A ani B) alebo vírusu hepatitídy δ (HDV) ŕestka AIDA Research and Human Retroviruses 8 (5) : 776-786 1992.i. Tiež sa zistilo, že IFN-α je vysoko účinný proti n.egakaryocytopoiéze a pri kontrole trombocytózy u pacientov s nyeloproliferatívnymi stavmi (Talpaz et al., Annals Int. Med. 59: " = 5--7 92 (1983), Gisslinger et al., Lancet i: 634-637 1955., Ganser et al., Blood 70: 1173-1179 (1987)).

Spôsoby génovej terapie majú potenciál vystaviť subjekt cenovému produktu, ako je interferón, prostredníctvom cielenej 2 2 expr scr.c z r. i = áe: cre: sie terapeutického génu v tkanive. Vc všeobecnom pripade nosť cielene zaviesť gén dc vybraného tkaniva je jedným vných vymožeností génovej terapie. Ako príklad cieleného génov interferónu, patentová prihláška WIPO č. WO 5c 19 popisuje zavedenie génov ir.terfercr.u do vaskulárneho iva. Takéto gény sa do oblasti poškodených stien ciev izajú za použitia katetárr.ehc systému. V inom prípade rvirusový vektor kódujúci proteín schopný enzymaticky sniť prc-liek, „samovražedný gén" a gén kódujúci cytokinín :likuje priamo do pevného nádoru. nacrt

Iné spôsoby cielenia terapeutických génov do tkanív :.ujú tri základné kategórie orar.sdukčnéno cielenia, iného cielenia a transkripôr.ého cielenia (popisuje sa L klad v publikácii Miller et s 1., Γ.-.ΞΞ3 J. 9: 190-199 : . Trar.sdukčné cielenie sa vzťahuje r.a selektívny vstup

nu.·:. zíe'. zači ľľSCZ špecifických buniek, ktoré sa dosiahne selekciou :torcvého Ugandu. Pozičné cielenie v genóme sa vzťahuje -.tegráciu do požadovaného loku, ako sú aktívne oblasti r.a tónu, alebo homológne rekombir.écie s endogénnou sotidovou sekvenciou, ako je cielcvý gén. Transkripčné znie sa vzťahuje na selektívnu expresiu, ktorá sa dosiahne znením transkripčných promótorov s vysoko špecifickou 1 éciou génovej expresie, ktoré úplne vyhovujú vybraným bunkám. ŕ

Príklady tkanivovo špecifických promótorov zahrňujú promótor kinázy kreatínu, ktorá sa používa na priamu expresiu cDKA dystrofínu vo svaloch a v kardiálnom tkanive i(Cox et al., Náture 364: 725-729 )1993)), a prcmótcrv Iankého a ťažkého reťazca imunoglobínu na expresiu samovražedných génov v B bunkách (Maxwell et al., Cancer Res. 51: 4299-4304 (1991)). Tiež sa charakterizovala endoteliálna bunkovo špecifická regulačná oblasť (Jahroudi et al., Mol. Celí. Bioll. 14: 999-1 ú C 5 (1994)). Amfotrofné retrovírusové vektory sa skonštruovali tak, že nesú gén kinázy tymidínu vírusu herpes simplex riadený buď promótorom albumínu alebo alfa-fetoproteínu (Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8C29-9043 (1991)) za účelom 3 cielenia črevných buniek a buniek hepatčmu. Takíto tkanivoví špecifickí promčtory sa môžu použiť v retrovirusových vektoroch vHart2oglcu et ai., J. Biol. Chem. 265: 17285-17293 (1990)) a v ader.bvirusových vektoroch (Friedmar. et al.# Mol. Celí. Biol. 6: 3_91-3-9~ (1986)), pričom stále uchovávajú svoju tkanivovú * . x: ' i Z toho vyplýva, že cielená expresia alfa-interferónu je r.utr.á pri liečbe rakoviny, hepatitídy a iných stavov citlivých -a ceračiu aifa-inrerferónom. ?odscaca vyna.ezu

Vynález popisuje spôsob aplikácie polypeptidu interferónu-alfa pacientovi, ktorý zahrňuje zavedenie vektoru do tkaniva pacienta, pričom uvedený vektor obsahuje segment nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid interferónu-alfa, ktorý je

I operatívne spojený s promótorom vykazujúcim špecificitu i 1 k ccžadovanému tkanivu, v ktorej sa polypeptid exprimuje.

Vynález ďalej popisuje spôsob zvýšenia množstva interferónu-alfa vo vybraných tkanivách pacienta, ktorý zahrňuje zavedenie vektoru obsahujúceho segment nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid interferónu-alfa do vybraného tkaniva, pričom segment nukleovej kyseliny je operabilne spojený s promótorom, ktorý vykazuje špecifitu k vybranému tkaniva, kde sa polypeptid interferónu-alfa exprimuje. .Vynález ďalej popisuje spôsob liečby zhubného bujnenia , reagujúci na interferón-alfa, ktorý zahrňuje aplikáciu vektoru obsahujúceho segment nukleovej kyseliny kódujúci polypeptid interferónu-alfa do karcinogénneho tkaniva, pričom segment nukleovej kyseliny je operatívne spojený s promótorom, ktorý vykazuje špecificitu k vybranému tkanivu, kde sa polypeptid interferónu-alfa exprimuje. Ďalej vynález popisuje spôsob liečby hepatitídy, ktorý zahrňuje aplikáciu vektoru obsahujúceho segment nukleovej kyseliny kódujúci polypeptid interferónu-alfa do črevných 4 buniek pacienta, pričom segment nukleovej kyseliny je operatívne spojený s promótorom špecifickým pre črevné bunky, kde sa polypeptid interferónu-alfa exprimuje.

Vynález íaiej popisuje kompcziciu zahrňujúcu vektor obsahujúci segment nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid * interferónu-alfa, pričom segment· nukleovej kyseliny je operatívne spojený s promótorom špeoifiokým pre vybrané tkanivo.

Vynález popisuje spôsoby tkanivovej špecifickej expresie IFN-α za použitia tkanivovo špecifických promótorov. Termín IFN-α zahrňuje všetky podtriedy interf erór.u-alfa, delécie, inzercie alebc ich substitučné varianty, biologicky aktívne fragmenty a aleiické formy. ’Termín „biologicky aktívne" znamená lubovo Inú antivirusovú alebo ar.tiprcliferačnú aktivitu meranú spôsobom dobre známym v odbore ;popisuje sa napríklad v publikácii Openakker et al., uvedené ďalej v texte, Mossman, J. Immunol. Methocs 65: 55 (1983). Aekcmbinan.tné interferóny-alfa sa klonovali a exprimovali v baktériách E. coli (popisuje sa napríklad v publikáciách Weissmann et al., Science 209: 1343-1349 (1980), Sreuli et al., Science 209: 1343-1347 (1980), Goeddel et al., Náture 290: 20-26 (1931), Henco et al., J.-Mol. Eiol. 185: 227-260 (1985)). Uprednostňuje sa, aby interferónom-alfa bol interferón-alfa 2a alebo 2b popisuje sa napríklad v publikácii WO 91/18927), aj keď interferón-alfa sa môže tiež použiť.

Nukleové kyseliny kódujúce polypeptid interferónu-α sú DNA alebo RNA. Termín „nukleová kyselina kódujúca" znamená nukleovú kyselinu, ktorá riadi expresiu špecifického proteínu alebc peptidu. Sekvencie nukleovej kyseliny zahrňujú ako reťazec sekvencie DNA, ktorý sa prepisuje na RNA, tak aj sekvenciu RNA, ktorá sa prekladá na proteín. Sekvencie nukleovej kyseliny zahrňujú sekvencie nukleových kyselín v plnej dĺžke, tak aj časti sekvencií, ktoré sa získali z proteínu v plnej dĺžke. Rozumie sa, že sekvencia zahrňuje degeneratívne kodóny natívnej sekvencie alebo sekvencií, ktoré 5 môžu byť zavedené tak, aby vznikol kodón, ktorý preferuje špecifické hostitelské bunka.

Ternin „vektor" znamená vírusové expresívne systémy, auoor.ómne samostatne sa replikujúce kruhovou DNA (plazmidy) a zahrňuje ako expresívne tak neexpresívne plazmidy. V prípade, » že rekonfcinantný mikroorganizmus alebo bunková kultúra sa popisuje ako hcstitel „expresívneho vektoru", môže obsahovať akc exrrachromczomálnu kruhovú DNA, kroré je začlenená do chromozómu (ov) hostiteľa. V prípade, že vektor je držaný hosoioelskcu bunkou, znamená to, že vektor sa môže buď stabilne replikovať v bunkách počas mitózy, akc autonómna štruktúra, alebc je inkorporovaný v hostiteľskom genóme. Vektor obsahuje viac genetických elementov pozične a sekvenčne orientovaných, to znamená operatívne spojených s inými nevyhnutnými elementmi tak, že sa v transfekovaných bunkách môže nukleová kyselina vo vekrcre kódujúcu IFN-α prepísať a keď je tfeba, tak aj preložiť. 1 Termín „gén" popisuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá

I kóduje pclypeptid. Táto definícia zahrňuje rôzne sekvenčné polymcrfizmy, mutácie a/alebo variácie sekvencií, kde uvedené zmer.y neovplyvňujú funkciu génového produktu. Termín «gén" zahrňuje nielen kódujúcu sekvenciu, ale tiež regulačné oblasti, ako sú promótory, zosilňovače a terminačné oblasti. Termín ďalej zahrňuje všetky intróny a iné sekvencie DNA upravené strihom z transkriptu mRNA spolu s variantmi, ktoré vznikli na základe alternatívnych miest zostrihu.

Termín „plazmid" znamená autonómnu molekulu kruhovej DNA, ktorá je schopná sa replikovať v bunke a zahrňuje ako typ expresívny tak aj typ, ktorý nie je expresívny. V prípade, že sa rekombinantný mikroorganizmus alebo bunková kultúra popisuje ako hostiteľ „expresívneho plazmidu", to znamená, že zahrňuje ako extrachromozálne kruhové molekuly DNA tak aj DNA, ktorá, je začlenená do hostiteľského chromozómu(ον). V prípade, že plazmid je obsiahnutý v hostiteľskej bunke, znamená to, že sa plazmid v bunkách buď stabilne replikuje počas fázy mitózy ako autonómna štruktúra, alebo sa začlenil do hostiteľského genómu. 6

Termín „rekombinantný proteín" alebo „rekombinantne produkovaný proteín" znamená peptid alebo proteín produkovaný za použitia neprirodzených buniek, ktoré nemajú endogénnu kópiu DKA schopnú exprimovat proteín. Bunky produkujú proteín, prereže sa zavedením sekvencie vhodnej nukleovej kyseliny genericky zmenili. Nezistilo sa, že rekombinantný proteín je asociovaný s proteinmi a so sub-bunkovými komponentmi, ktoré sú v normálnom prípade spojené s bunkami produkujúcimi proteín. Termín „proteín" a polypeptid" sú tu zameniteľné.

Vo všeobecnom prípade sa IFN-α produkuje v expresívnom vektore, ktorý obsahuje nasledujúce elementy postupne spojené vc vzdialenosti vhodnej pre funkčnú expresiu: tkanivovo špecifický promótor, iniciačné miesto pre transkripciu, 3' neprekladanú oblasť, vedúcu sekvenciu 5' mRNA, sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca polypeptid interferónu-alfa a pclysdenylačný signál. V expresívnom vektore sa môžu vyskytovať i zosilňovacie sekvencie a iné sekvencie, ktoré vedú k expresii a/alebo k sekrécii. Za účelom selekcie alebo testovania prítomnosti rekombinantného vektora sa do vektora pridávajú gény, ktoré kódujú rezistenciu na lieky. Takéto prídavné gény zahrňujú napríklad “gény kódujúce rezistenciu na neomycín, rezistenciu na viacej liekov, kir.ázu tymidinu, beta-galaktozidázu, reduktázu dihydrofolátu (DHFR) a aceryltransferázu chloramfenikolu.

Vynález popisuje cielené zavedenie IFN-α do určitého vybraného tkaniva, ktoré sa uskutočnilo použitím promótora a/alefco iného expresívneho elementu, ktoré sa s výhodou používajú vo vybranom tkanive. Príklady známych tkanivovo špecifických promótorov zahrňujú promótor kinázy kreatínu, ktorý sa používa pri riadení expresie cDNA dystrofinu vo svaloch a kardiálnom tkanive (Cox et al., Náture 364: 725-729 (1993í), promótory ťažkého a lahkého reťazca imunoglobínu na expresiu génov v B-bunkách, promótory albumínu alebo alfa-fetoproteínu, ktoré sú vhodné pre bunky čriev a bunky hepatómu. Príklady tkanivovo špecifických expresívnych elementov vhodné pre črevné bunky sú napríklad promótor HMG-CoA reduktázy HMG- 7

CoA (Luskey, Mol. Celí. Biol. 7(5):1881-1893 (1987), sterolový regulačný element 1 (SRE-1, Smith et al.; J. Biol. Chem. 265 (4 2335-2310 (1990), promótor karboxykináza fosfoenolpyruvátu (?ľ?CK vEsenberger et al., Mol. Celí Biol. 12(3):1396-1403 ',1592! , promótor ľudského C-reaktívneho proteinu (CRP) (Li .et al., J. Biol. Chem. '265 (7): 4136-4142 (1990)), ľudský glukckir.ázový promótor (Tanizawa et al., Mol. Endocrinology δ i “: : 1070-81 (1992), promótor 7-alfä-hydroylázy (CYP-7) chclescerclu (Lee et al., J. Biol. Chem. 269 (20): 14681-9 (1554) , promótor beta-galaktozidázovej alfa-2,6- siaiylcransferázy (Svensson et al., J. 3iol. Chem. 265(34): 20563-3 (1990), promótor proteinu viažuci rastový faktor podccný inzulínu (IGFEP-1) (Babajko et al., Biochem. Biophys. Res. Eonxi. 196(1): 480-6 (1993), promótor aldolázy B (Bingle et al., Biochem. J. 294 (Pt2):473-9 (1593 , promótor ľudského rrar.síerínu (Mendelzon et al., Nicl. Acids Res. 18 (19): 5717-21 1993), promótor kolagénu typ I (Houlglum et al., J. Clin.

Invesu. 94(2): 808-14 (1994)).

Príklady tkaninovo špecifických expresívnych elementov oroscacických buniek zahrňujú napríklad promótor fosfatázy kyseliny prostatickej (PAP) (Banas et al., Biochem. Biophys. Acta. 1217 (2): 188-94, promótor proscatického sekrečného proteinu 94 (PSP 94) (Nolet et al., Biochim. Biophys. ACTA 1098 (2 : 247-9 (1991)), promótor komplexu špecifického antigénu prostaty (Casper et al., J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 47 (Ιό): 127-35 (1993)), promótor ľudského glandulárneho kallikreinového génu (hgt-1) (Lilja et al., World J. Urology 11(4): 188-91 (1993).

Príklady tkaninových špecifických expresívnych elementov pre gastrické tkanivo zahrňujú napríklad promótor alfa-podjednotky H*/K*-ATPázy (Tanura et al., FEBS Letters 298: (2- 3): 137-41 (1992)) .

Príklady tkaninových špecifických expresívnych elementov pre pankreas zahrňujú napríklad promótor proteinu spojený s par.kreatitídou (PAP) (Dusetti et al., J. Biol. Chem. 268 (19.: 14470-5 (1993)), zosilňovač transkripcie elastázy 1 8 iKruse et al., Genes and Development 7 (5):774-86 (1993)), promótor zosilňovača špecifickej amylázy a elastázy špecifickej pre pankreas (Wu et al. Mol. Celí. Eiol. 11(9):4423-30 (1991)), Keiler et al., Genes and Dev. 4(8): 1316-21 (1990)), promótor génu pankreatickej esterázy cholesterolu (ľontaine et al., Eiochemistry 30(28):7008-14 (1991)).

Príklady tkaninových špecifických expresívnych elementov pre endometrium zahrňujú napríklad promótor uteroglobínu (Kelftenbein et al., Annal. NY Acad. Sci. 622: 69-79 (1991)). Fríklady tkaninových špecifických expresívnych elementov pre adrenalínové bunky zahrňujú promótor štiepenia bočného reťazca cholesterolu (SCC) (Rice et al., J. Eiol. Chem. 265: 11713-20 (1990) ).

Príklady tkaninových špecifických expresívnych elementov pre nervový systém zahrňujú napríklad promótor gamma-gamma enolázy (neurón-špecifická enoláza, NSE) (Forss-Petter et al., Neurón 5(2):187-97 (1990)).

Príklady tkanivových špecifických expresívnych elementov i * pre mozog zahrňuje napríklad promótor ťažkého reťazca neurcvlákna (NF-H) (Schwartz et al., J. Biol. Chem. 269(18): 13444-50 (1994)).

Príklady tkanivových špecifických expresívnych elementov pre lymfocyty zahrňujú napríklad promótor ludského CGL- 1/granzýmu B (Hanson et al., J. Biol. Chem. 266 (36): 24433-8 (1991) ), promótor terminačnej deoxytransferázy (TdT), lambda 5, VpreB a lck kináza tyrozínu špecifická pre lymfocyty p561ck) promótor (Lo et al., Mol. Celí. Biol. 11(10): 5229-43 (1991)), promótor ludského CD2 a jeho zosilňovač 3' transkripcie (Lake et al., EMBO J. 9(10): 3129-36 (1990)) a špecifický aktivačný promótor ľudských NK a T buniek ÍNKG5) (Houchins et al., Immunogenetics 37(2):102-7 (1993)).

Príklady tkanivových špecifických expresívnych elementov pre hrubé črevo zahrňujú napríklad promótor pp60c-src kinázy tyrozínu (Talamonti et al., J. Clin. Invest. 91 (1): 53-60 (1993)), promótor orgánovo špecifických antigénov (OSN), molekulová hmotnosť 40 000 (p40) (Ilantzis et al., Microbiol. 9

Immunol. 37 (2): 119-28 (1993)), promótor antigénu P špecifického pre hrubé črevo (Sharkev et al., Cancer 73(3 sup?.) 864-77 (1994)).

Príklady tkanivových špecifických expresívnych elementov pre bunky prsnej žlazy zahrňujú napríklad promótor alfa-lsktalalbumínu {Thean et al., British J. Cancer. 61 (5): 773-5 (.1990) ) .

Iné elementy, ktoré umožňujú špecifitu expresie vo vybranom tkanive zahrňujú sekvenciu vedúcu k sekrécii, zosilňovače, signály jadrovej lokalizácie, endosmolytické peptidy atď. Tieto elementy sa získavajú z vybraného tkaniva, čc umožňuje ich špecifitu. Spôsoby manipulácie sekvencií nukleových kyselín podlá vynálezu, ako je sub-klonovanie sekver.cií nukleových kyselín kódujúcich polypeptidy do expresívnych vektorov, značenia sond, hybridizácie DNA a podobne sa podrobne popisujú v publikácii Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989). Ak sa izolovala DNA kódujúca vybranú sekvenciu a klonovala sa, môžu sa exprimovať kódované proteíny v rôznych rekombinantných bunkách. Očakávalo sa, že v odbore je známa rada expresívnych systémov, ktoré sú dostupné na expresiu kódujúcu DNA. Tu sa používa množstvo známych metód vhodných na expresiu proteínov v prokaryontoch alebo eukaryontoch.

Expresia prirodzených alebo syntetických nukleových kyselín kódujúcich vybranú sekvenciu sa v typickom prípade dosiahne operatívnym spojením DNA alebo cDNA s promótorom (ktorý je buď konštitutívny alebo indukovatelný),, potom

I nasleduje začlenenie do expresívneho vektoru. Vektory môžu byť vhodné na replikáciu a integráciu buď v prokaryontoch alebo eukaryontoch. Typické expresívne vektory obsahujú transkripčné a translačné terminátory, iniciačné sekvencie a promótory použiteľné na reguláciu expresie vybranej polynukleotidovej sekvencie. Aby sa získala silná expresia klonovaného génu je nutné konštruovať expresívne plazmidy, ktoré obsahujú minimálne silný promótor pre riadenie transkripcie, ribozómové väzbové miesto za účelom translácie a terminátor 10 trar.skripcie/translácie. Expresívne vektory môžu tiež obsahovať generované expresívne kazety, ktoré obsahujú aspoň jednu nezávislú terminačnú sekvenciu, sekvencia umožňujúca replikáciu plazmidu akc v prokaryontoch tak v eukaryontoch, to znamená pendlujúce vektory a selekčné markéry pre prokaryontné a eukaryontné systémy (Sambrook et al., Molecular Cloning - A Läfccrazory Manual (2r'd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Labcrauory, Cold Spring Harbor, New York, (1989) .

Konštrukcie podlá vynálezu sa môžu zaviesť do vybraného tkaniva in vi vo alebo ex vivo pomocou rôznych spôsobov. V niektorých uskutočneniach vynálezu sa vektor zavedie do buniek spôsobom, ako je mikroinjekcia, precipitácia fosforečnanom vápenatým, fúziou s lipozómami alebo prostredníctvom biologickej balistiky. V inom uskutočnení vynálezu sa DNA priamo zavádza do vybraného tkaniva. V iných uskutočneniach sa konštrukcia zabalí do vírusového vektorového systému, ktorý umožní jej zavedenie do buniek. Vírusové vektorové systémy podlá vynálezu zahrňujú aáenovírusy, herpesvírusy, adeno-asociované vírusy, myší minútový vírus (MVM), HIV, sindbis vírus a retrovírusy, ako je vírus Rousovho sarkómu a MoMLV. V typickom prípade konštrukcie podlá vynálezu sa začleňujú do takých vektorov, aby umožnili balenie konštrukcie exprimujúcej interferón, väčšinou je sprevádzaná vírusovou DNA, dochádza k infekcii citlivých hostiteľských buniek a k expresii génu interferónu-α. Zvlášť výhodným vektorom je adenovírusový vektor, ktorý sa popisuje v publikácii Wills et al., Hum. ,Gene Therapy 5: 1079-1088 (1994) . V inom uskutočnení vynálezu rekombinantné konštrukcie IFN-α pcdla vynálezu sú spojené s ligandom bunkového receptoru, čo xmožňuje príjem (napríklad invaginácia potiahnutých častíc a internalizácia endozómu) prostredníctvom častíc spojených s DNA (Mu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621-14624 (1988), WO 92/06180). Konštrukcia DNA podlá vynálezu môže byť napríklad spojená prostredníctvom polylyzínov k azialo-oromukocídu, ktorý je ligandom pre azialoglykoproteínový receptor hepatocytov. 11 Vírusové obaly používané pri balení konštrukcii podlá vynálezu sa môžu modifikovať pridaním receptorových ligandov alebo protilátok špecifických pre receptor, aby mohlo dôjsť k er.docytóze do špecifických buniek sprostredkovanej receptorom .pcpisuje sa napríklad v publikácii WO 93/20221, WO 93/14188, WO 94/06923). V niektorých uskutočneniach vynálezu DNA konštrukcie pcdla vynálezu sú spojené s vírusovými proteínmi, =kc sú adenovírusové častice, aby sa umožnila endocytóza .Curiel et al., Proc. Natl. Acaa. Sci. U.S.A. 88: 8850-8854 .1591)). V inom uskutočnení vynálezu molekulové konjugáty podľa vynálezu môžu zahrňovať mikrotubulárne inhibítory (popisuje sa v publikácii WO/9406922), syntetické peptidy, ktoré napodobňujú r.err.aglutinín vírusu chrípky .popisuje sa v publikácii Plank et al., J. Biol. Chem. 269: 12918-12924 (1994)), a nukleárne lokalizačné signály ako je antigén SV40 T (popisuje sa v publikácii WO 93/19768).

Termín „liečba" znamená zavedenie nukleovej kyseliny 1 . i kčdujúcejj alfa-inťérferón do pacienta za účelom expozície zvoleného tkaniva, zvlášť tkaniva, kde jedna alebo viac buniek vykazuje patologické zmeny, afa-interferónu. Termín tkanivo „zhubného bujnenia"_znamená tkanivo, v ktorom jedna alebo viac bur.iek sa klasifikujú ako bunky zhubného bujnenia, maligné, nádorové, pre-rakovinové, transformované alebo ako adenóm alebo karcinóm alebo sa označujú iným synonymom bežne používaným v spojení s týmto stavom. „Nerakovinová" bunka tu znamená bunku, ktorá sa vymyká definícii rakovinová bunka a zahrňuje normálne bunky a bunky vykazujúce niektoré patologické rysy, ako je napríklad infekcia vírusom, baktériou, parazitom alebo iným organizmom, bunky ovplyvnené dedičnou záťažou, to znamená, že nie sú v takom optimálnom stave, ako je tomu v normálnom prípade, alebo ich protiklad divokého typu, bunky ovplyvnené neinfekčným ochorením, ako je napríklad diabetes, a bunky, ktoré prežili ľubovoľný z týchto uvedených stresov atď..

Liečba ľubovoľného stavu, ktorý sa zlepši po aplikácii IFN-a, môže začať kedykoľvek pred diagnózou stavu alebo 12 kedykoľvek po nej. Tak napríklad pacientovi, u ktorého existuje podozrenie, že má pre-rakovinové lézie alebo dispozíciu na vývoj niektorého typu zhubného bujnenia, sa môžu aplikovať kompozície pcdla vynálezu. Podobne osoba, ktorá prišla do kontaktu s patcgénom, ako je napríklad vírus hepatitídy B, sa môže liečiť kompozíciami podlá vynálezu ešte predtým, ako sa hepatitída diagnostikuje. Navyše ľudia, ktorí sú podozrelí, že sú nosiči H8V, alebo pacienti, ktorí by sa nimi mohli s veľkou pravdepodobnosťou stať, sa môžu liečiť potom, čo sa zlepšia najťažšie symptómy ochorenia.

Konštrukcie podľa vynálezu sa môžu použiť pri terapii rôznych druhov zhubného bujnenia, hepatitídy a iných stavov, kde je výhodné zvýšenie množstva IFN-α. Medzi tieto ochorenia patria napríklad vredová kolitída, rinovirusové infekcie, íitróza, alergické ochorenia spôsobené prebytkom IL-4 a produkciou IgE a granulomatózne ochorenia, ako je Crohnova choroba. Aj keď sa gén môže cielene zaviesť do ľubovoľného tkaniva, pre ktorý existuje tk^nivovo špecifický expresívny element, ako je promótor, zvláštna pozornosť sa venuje tkanivovo špecifickej aplikácii IFN-α za účelom zvýšenia množstva IFN-α v tkanive zhubného bujnenia, ako je karcinóm ľudskej prostaty a tkanivo hepatómu. Konštrukcie podľa vynálezu sa môžu ďalej použiť na zvýšenie množstva IFN-α v tkanivách, ktcré vykazujú patologické zmeny a ich nerakovinové bunky sú deficitné v produkcii interferónu, to znamená, že produkujú menej interferónu ako: zdravé bunky, ako je tomu napríklad pri ncsičoch vírusu hepatitídy B (Nouri-Aria et al., Hepatology 14(6): 1308-1311 (1991)). V niektorých uskutočneniach podľa vynálezu rekombinantné konštrukcie sa cielene zavádzajú do vedľajšieho tkaniva alebo do buniek, aby vzrástla lokálna koncentrácia interferónu-alfa vo vybranej populácii buniek.

Kompozície podľa vynálezu sa budú pripravovať pre aplikáciu, ktorá je prijateľná pre cicavcov, preferuje sa človek. V niektorých príkladoch vynálezu sa kompozície podľa vynálezu môžu aplikovať injekciou do tkaniva alebo do krvných ciev, ktoré zásobujú vybrané tkanivo. V inom príklade vynálezu 13 5α kompozície podlá vynálezu aplikujú lokálne, to znamená intravezikálne, do lézií a/alebo povrchovo. V inom uskutočnení vynálezu sa kompozícia podlá vynálezu aplikuje systematicky injekciou, inhaláciou, transdermálnym zavedením atď. V ďalšom uskutočnení vynálezu sa kompozície aplikujú katétrom alebo iným zariadením, ktorý umožní prístup kompozície do vybraného tkaniva, ako je napríklad vnútorný orgán. Kompozície podlá vynálezu sa tiež môžu aplikovať v podobe depotných nástrojov, implantétov alebo vo forme kapsúl, ktoré umožňujú pomalé alebo trvalé uvoľňovanie kompozícií.

Vynález popisuje kompozície, ktoré obsahujú roztok kompozícií podlá vynálezu rozpustený alebo suspendovaný v prijateľnom nosiči, s výhodou ide o vodný nosič. Môže sa použiť množstvo vodných nosičov, ako je voda, pufrovaná voda, 0,E * fyziologický roztok, 0,3 % glycín, kyselina hyalurónová a podobné. Tieto kompozície sa môžu sterilizovať bežnými spôsobmi alebo sa môžu sterilizovať filtráciou. Výsledné vodné roztoky sa môžu baliť tak ako sú, alebo sa môžu lyofilizovať. • 1 i

Lyofilizované roztoky sa tesne pred aplikáciou zmiešajú so sterilným roztokom. Kompozície môžu obsahovať farmaceutický prijateľné auxiliárne substancie, ktoré sú nutné vzhľadom k fyziologickému stavu. Sú to činidlá na úpravu pH a pufrovacie činidlá, činidlá na úpravu tonusu, zmáčacie činidlá a podobne. Sú to napríklad acetát sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, sorbitan monolaurát, crietanolaminoleát, atď.

Koncentrácia kompozícií podľa vynálezu vo farmaceutických formuláciách výrazne kolíše, to znamená, že môže byť menšia ako približne 0,1 %, obyčajne dosahuje aspoň okolo 2 %, až do hodnoty 20 až 50 % alebo viac (hmotnostné percentá). Kompozície sa pre určitý mód aplikácie vyberajú primárne na základe objemov kvapalín, viskozity atď.

Kompozície podľa vynálezu sa môžu aplikovať prostredníctvom lipozómov. Lipozómy zahrňujú emulziu, penu, micely, nerozpustné monovrstvy, kvapalné kryštály, fosfolipidové disperzie, lamelárne vrstvy a podobne. Do týchto 14 prípravkov sa kompozícia podlá vynálezu zaviedla ako súčasť lipczómov/ samostatne alebo v spojení s molekulou, ktorá sa viaže na vybraný ciel, ako sú protilátky alebo iné terapeutické alebo imur.cgénne kompozície. Lipozómy, ktoré sú buď naplnené alebo pokryté požadovanou kompozíciou podlá vynálezu sa môžu vnášať do organizmu systematicky alebo priamo do vybraného tkaniva, kam lipozómy donesú vybranú terapeutickú/imunogénnu peptidovú kompozíciu.

Lipozómy vhodné na použitie podlá vynálezu vznikajú zo štandardných lipidov, ktoré vo všeobecnom prípade zahrňujú neutrálne alebo negatívne nabité fosfolipidy a sterol, ako je cholesterol. Výber lipidov sprevádza zvažovanie napríklad veľkosti lipozómov, citlivosť a stabilita voči kyselinám v krvnom riečišti. Lipozómy sa môžu pripravovať množstvom spôsobov, ako sa popisuje napríklad v publikácii Szoka et al., Ar.r.. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 4 67 (1980), U. S. Patent Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 a 5,019,369. lipozómová suspenzia obsahujúca kompozíciu podľa vynálezu sa môže aplikovať intravenózne, lokálne, povrchovo atď. v dávke, ktorá záleží od spôsobu aplikácie, spôsobu zavedenia ktn.pozície a štádiaochorenia, ktoré sa lieči. 7 prípade pevných kompozícií sa môžu použiť bežné netoxické pevné nosiče, ktoré zahrňujú napríklad manitol, laktózu, škrob, stearát horečnatý, sacharín sodíka, celulózu, glukózu, uhličitan horečnatý a podobné. V prípade orálnej aplikácie sa farmaceutický prijateľné netoxické kompozície overia zmiešaním ľubovoľného normálne používaného excipientu, akc sú nosiče vymenované hore v texte, a väčšinou 10 až 95 % aktívnej látky. Výhodné je zmiešať jednu alebo viac kompozícií podľa vynálezu a uprednostňuje sa koncentrácia 25 až 75 %. V prípade aplikácie vo forme aerosólu sa kompozícia doplní povrchovo aktívnym činidlom a urýchľovačom. V typickom prípade percentuálne zastúpenie kompozície podľa vynálezu je 0,01 až 20 % 'hmotnostné percentá), uprednostňuje sa 1 až 10 %. Povrchovo aktívne činidlo nesmie byť samozrejme toxické a uprednostňuje sa jeho rozpustnosť v urýchľovači. Zástupcovia takýchto 15 činidiel sú estery mastných kyselin, ktoré obsahujú 6 až 22 atómov uhlíka, ako sú estery kyseliny kaprónovej, oktánovej, laurylovej, palmitovej, stearovej, linoelovej, olesterovej a olejovej s alifatickým polyhydrickýn alkoholom alebo jeho cyklickým anhydridom. Môžu sa použiť zmiešané estery, ako sú zmiešané alebo prirodzené glyceridy. Povrchovo aktívne činidlo môže tvoriť 0,1 až 20 * (váhové percentá) kompozície, uprednostňuje sa koncentrácia 0,25 až 5 %. Kompozíciu vyrovnáva obyčajne urýchľovač. Ak je to nutné, môže sa tiež zahrnúť nosič, napríklad lecitín pre prípad inrranazálnej aplikácie.

Konštrukcie podlá vynálezu sa môžu ďalej zavádzať depotným systémom, vo forme kapsúl alebo ako implar.tát metódami, ktoré sú dobre známe v odbore. Podobne sa môžu konštrukcie zavádzať priamo do vybraného tkaniva pomocou pumpy. V niektorých uskutočneniach vynálezu sa kompozície podlá vynálezu aplikujú ex vivo do buniek alebo do tkaniva vybratých z pacienta, potom sa toto tkanivo do pacienta vráti. Príklady aplikácie konštrukcií ex vivo pri génovej terapii, sa popisujú · i 1 t v publikáciách Arteaga et al., Cancer Research 56(5): 1098-1103 (1936), Nolta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (6): 2414-9 (1996), Koc et al., Seminár in Oncoloay 23 (1) : 46-65 (1996),

Raper et al., Annals of Surgery 223 (2): 116-26 (1996), Dalesandro et al., J. Thorac. Cardi. Surg. 11(2) : 416-22 (1996), and Makarov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1): 402-6 (1996).

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obrázku č. 1 je graf znázorňujúci antiproliferačné účinky interferónu-alfa na bunky zhubného bujnenia ľudskej prostaty.

Na obrázku č. 2 je graf znázorňujúci aktivitu luciferázy ako merania expresie luciferázy riadenej promótormi génov špecifických pre pečeň. 16

Príklady uskutočnenia vynálezu Príklad 1 Účinok interferónu-alfa na proliferéciu buniek karcinómu presvätý Študovali sa tri rozdielne druhy buniek karcinómu prostaty. Sú to LNCaP (závislé od androgénu, ATCC #CRL 1740), bunky PC-3 (nezávislé od androgénu, ATCC #HTB 81) . Bunky sa kultivovali v piatich odlišných koncentráciách interferónu-a2b 1C, 10", 103, 10% 10= lU/ml) (Schering-Plough) po dobu 72 hodín v nasledujúcom médiu: bunky PC-3 sa kultivovali v Ham F12 K médiu (GIBCO BRL) doplnenom 7 % fetálnym bovinným sérom, bunky DU-145 sa kultivovali v DMEM (GIBCO BRL) doplnenom 10 % fetálnym bovinným sérom, bunky LNCaP sa kultivovali v RPMI 1640 GIBCO BRL) doplnenom 5 % fetálnym bovinným sérom.

Antiproliferačné účinky interferónu sa stanovili testom MΓT (popisuje sa v publikácii Mossman, J. Immunol. Methods 65: 55 (1983)). Bunky PC-3 a DU-145 vykazujú konzistentnú citlivosť ku zvyšujúcej sa koncentrácii interferónu, ktorá sa vyrovnala pri koncentrácii "104 IU/ml. Bunky LNCaP citlivé na ändrogén nevykazujú žiadnu odozvu na IFN. Bunky PC-3 sú citlivejšie proti interferónu ako bunky DU-145. Údaje sú zhrnuté na obrázku č. 1. Plné stĺpce reprezentujú bunkovú líniu PC-3 (nezávislú od androgénu), čiarkované stĺpce reprezentujú bunkovú líniu DU-145 (nezávislú od androgénu), diagonálne čiarkované stĺpce reprezentujú bunky LNCaP (závislé od androgénu).

Príklad 2

Konštrukcia expresívnych kaziet

Za cielom expresie IFN-α v bunkách karcinómu prostaty sa skonštruoval expresívny vektor, ktorý obsahuje celú sekvenciu c DNA interferónu-alfa 2b (IFN-a2b) a celú signálnu sekvenciu pre IFN-a2b (Sreuli et al., Science 209: 1343-1347 (1980), 17

Goeddel et al., Náture 290: 20-26 (1981), Henco et al., J. Mol. Biol. 185: 227-260 (1985)), ktoré sú riadené bazálnym promótorom s veľkosťou približne 600 bp pre gén antigénu, ktorý je špecifický pre prostatu (PSA) . C DNA IFN-a2b v celej dĺžke obsahujúci putativnu signálnu vedúcu,sekvenciu na 5 ' konci sa klonoval do polyklonovacieho miesta HindlI a EcoRI downstream CMV promótora cicavčieho expresívneho vektora PCDNA3 (Invitrogén) za vzniku plazmidu DIFN. Sekvencie lemujúce 5'-koniec génu PSA obsahujúce promótor PSA (BBRC 161: 1151-1159 ;1989), Genebank #M27274) sa začlenil do vektoru, nahradil tak promótor CM'/ za vzniku plazmidu PSADIľN.

Príklad 3

Klonovanie bazálnych promótorov pre pečeňové špecifické gény 5' lemujúce sekvencie zahrňujú bazálne promótory zo štyroch špecifických génov ľudskej,pečene, albumín (HAL), al- 1 I i antitrypsín (HAT), alfa-fetoproteín (AFP) a hydroxy-metyl-giutaryl-CoA reduktázu (HMG), sa subklonovali z ATCC 65731, AľCC 61597, ATCC 65735 a ATCC 59567 do vektoru pCRScript za cieľom použitia pri zavedení génu interferónu a jeho tkanivovo špecifickú expresiu v hepatických bunkách (Luskey, Mol. Celí. Biol. 7(5): 1881-1893 (1987), Minghetti et al., J. Biol. Chem. 261 (15): 6747-6757 (1986), Long et al., Biochemistry 23: 4828-4837 (1984), Gibbs, Biochemistry 26: 1332-1343 (1987)).

Inzerty sa mapovali pomocou reštrikčných enzýmov vo vektore pCRScript, ktorý obsahuje 5'-lemujúce sekvencie hore uvedených génov, ktoré kódujú pečeňové špecifické enzýmy. Potom sa inzerty umiestnili z vektoru pCRScript do upstream pozície génu luciferázy do reportného plazmidu pGL3. Bunky z vaječníkov čínskych škrečkov (CHO-K1, ATCC # CCL-61), bunky ľudského hepatómu (HepG2, ATCC #NB 8065) a (Hep3B ATCC # HB 8064) sa rransfekovali elektroporáciou uvedenými štyrmi konštrukciami a kontrolným plazmidom pGLC (PROMEGA Ccrp.). pGLC obsahuje gén luciferázy riadený promótorom SV40 a zosilňovač SV40. 18

Expresia luciferázy štyrmi pre pečeň špecifickými promótorovými sekvenciami v transfekovaných bunkách sa porovnávala s kontrolným plazmidom pGLC a vektorom pGL3. Údaje sú zhrnuté na obrázku č. 2 (výsledky s HAL nie sú uvedené). Tri typy buniek sa transfekovali konštrukciami DNA, ktoré vykazujú charakteristické rysy. Plné stĺpce reprezentujú bunky ľudského hecatómu HepG2, čiarkované stĺpce reprezentujú bunky vaječníkov čínskych škrečkov (CHO), diagonálne čiarkované stĺpce reprezentujú bunky ľudského hepatómu Hep3B (Hep3B). pGLB je plazmid slúžiaci ako negatívna kontrola, pGLC je plazmid slúžiaci ako pozitívna kontrola, HAT je promótor ľudského al-ar.citrypsínu, HMG označuje promótor ľudského hydroxy-metyl-glutaryl-CoA reduktázy, AFP je promótor ľudského a- fetoproteínu. Z uvedených štyroch tkanivovo špecifických promótorov sa zdá byť najlepším kandidátom na expresiu v pečeni za uvedených podmienok promótor al- antitrypsínu (HAT).

Expresia riadená promótorom HAT sa môže ďalej. I t cpcimalizovať konštrukciou expresívneho vektoru so sekvenciou zosilňovača špecifického pre pečeň, ako je zosilňovač ľudského a- fetoproteínu (Watanabe, et al., J. Biol. Chem. 262 (10): 4512-4818 (193“), Genebank # J02693), zosilňovač ľudského albumínu (Hayashi et al., J. Biol. Chem. 267 (21): 14580-14585 (1992), GeneBank # M92816), zosilňovač ľudského a-1- mikroglobulínu/bikunin (Rouet et al., J. Biol. Chem. 267 (29): 20755-20773 (1992), GeneBank # X67032) alebo zosilňovač hepatitídy B (Valenzuela et al., Animal Virus Gerietics ed.· B. Biels et al., p.p. 57-70, Academic Press, N.Y. (1981), Galibert et al., Náture 281: 646-650 (1979)).

Claims (5)

1. N A R O K Y PATENTOVÉ Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahrňuje vektor obsahujúci segment nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid interferónu-α, ktorý je operatívne spojený s promótorom, ktorý je špecifický pre vybrané tkanivo. Kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa t ý m, že vektor je vírusový vektor. Kompozícia podlá nároku 2, vyznačujúca sa tým, že vírusovým vektorom je adenovírus. Kompozícia podlá nároku 3, vyznačujúca sa t ý m, že promótor je špecifický pre pečeň. Kompozícia podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že promótor je špecifický pre prostatu. Kompozícia podľa nároku 4 alebo 5, vyznačujúca sa t ý m, že ďalej obsahuje sekvenciu vedúcu k sekrécii interferónu-alfa operatívne spojenú s nukleovou kyselinou kódujúcou polypeptid interferónu-alfa. i Farmaceutická zmes, vyznačujúca sa tým, že obsahuje kompozíciu podľa ľubovoľného nároku 1 až 6. Spôsob vybavenia tkaniva polypeptidom interferónu-alfa, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje zavedenie vektoru, ktorý obsahuje segment nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid interferónu-alfa do vybraného tkaniva, pričom segment uvedenej nukleovej kyseliny je operatívne spojený s promótorom, ktorý je špecifický pre vybrané 20 tkanivo, kde sa v pacientovi polypeptid interferónu-alfa exprirauje.
2. 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že interf erór.-alfa je interferón-alfa 2fc. iC. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že vírusovým vektorom je adenovírusový vektor.
3. 11. Spôsob podlá nároku 10, vyznačujúci sa tým, že promótor je špecifický pre pečeň.
4. 12. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že promótor je špecifický pre prostaiu.
5. 13. Spôsob podľa nároku 11 alebo 12, vyznačujúci sa tým, že segment nukleovej kyseliny kódujúcej interferón-alfa je operatívne spojený s nukleotidovou kyselinou kódujúcou sekvenciu vedúcu k sekrécii inuerferónu-alfa.