WO1997019181A2 - Virusvektor für den transfer stabiler episome - Google Patents

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Volker Sandig
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    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the invention relates to a virus vector for the transfer of stable episomes, i. H. of extrachromosomal genetic elements.
  • Areas of application of the invention are medicine, in particular gene therapy, and basic medical-biological research.
  • the treatment of genetic diseases by means of gene therapy methods requires the transfer of the gene which is defective in the disease into the tissue in which the corresponding gene is normally expressed.
  • gene transfer must reach a high proportion of the cells of the target tissue, and the activity of the gene should be maintained for a long time, if possible for life.
  • viral vectors are still superior to non-viral gene transfer systems to this day.
  • the virus' own mechanisms allow effective protection of the genetic material from reaching the target cell.
  • the uptake and transport of the genetic material to the cell nucleus are perfected by the viral evolution.
  • Viruses from different families are used: retroviruses, adenoviruses, parvoviruses and herpes viruses.
  • retroviruses For the liver, one of the most important organs for somatic gene therapy, primarily retroviruses and adenoviruses come into question (Sandig, V. and Strauss, M. (1996) Liver directed gene transfer and application to therapy. J.Mol.Med.74 : 205-212).
  • baculoviruses which can only productively infect insect cells, are also able to transmit foreign genetic information
  • retroviruses and the parvovirus AAV allow stable gene transfer by mechanisms for integrating the viral into the cellular genome.
  • these viruses are less effective than the others.
  • the retroviral infection is bound to proliferating cells, which makes their use in resting tissues and those with low proliferation activity (brain, liver, lungs) difficult or requires special measures to stimulate cell division.
  • adenoviruses The genome of adenoviruses, herpes viruses and baculoviruses is not integrated into that of the target cell. It is extrachromosomal in the cell nucleus and is stabilized there for some time by association with proteins. However, since the viral DNA is not replicated, it is lost in the course of further cell divisions.
  • the deletion is necessary to prevent the lytic viral life cycle that would lead to the death of the infected cell.
  • viral proteins are synthesized. As strong antigens, these proteins induce an effective immune response based primarily on cytotoxic T lymphocytes. The infected cells are eliminated (Yang, YP and Wilson, JM (1995) Clearence of adenovirus infected hepatocytes by MHC class 1 restricted CTLs in vivo. J Imunol. 155: 2564-257). In the animal model, therefore, adenoviral foreign gene expression in the liver only lasts for a few days to weeks.
  • the aim of the invention is to prolong the normally short-term function of a gene after viral gene transfer by autonomous replication and at the same time to effectively switch off the expression of viral genes. It is based on the task of introducing a DNA into the target cells by means of a virus, the replication cycle of which is adapted to the cycle of these cells and which reaches the cell nuclei of the daughter cells which form during the nucleus division. A non-chromosomal DNA with these properties is called a stable episome.
  • the objective and task are achieved according to the claims, the subclaims are preferred variants.
  • the virus vector according to the invention for the transfer of stable episomes comprises the DNA of a virus, an autonomously replicable DNA sequence in which the gene to be transferred is incorporated, as well as at least 2 recognition sites for a specific recombinase and possibly a specific recombinase built into the virus DNA -Gene.
  • the structure of the vector is shown schematically in Figure 1.
  • the DNA of an adenovirus or a baculovirus is preferably used.
  • the essence of the invention is to take the replication function from a heterologous system and to refer only to that part of the original virus which contains the therapeutic gene. By separating the replicating from the non-replicating part, virus functions are also deactivated.
  • Epstein-Barr virus consisting of the oriP and the EBNA-1 gene
  • This virus shows the desired properties in the event of latent infection of B lymphocytes.
  • binding the EBNA-1 protein to the latent origin oriP one replication cycle per cell cycle is initiated and the episome is preserved.
  • OriP and EBNA-1 are sufficient for their function and can be separated from the virus itself.
  • a further possibility for realizing the invention consists in using a replication sequence of the mammalian genome for this.
  • Preferred sites for replication can be found in various mammalian genes such as. B. in the vicinity of the myc gene, the dhfr gene or in the ß-globin locus.
  • REPLACEMENT SHEET (REGEL26J In combination with certain sequences for the maintenance of an episome, these can function just like oriP, but do not require any additional viral protein.
  • the autonomously replicable part is separated from the remaining virus DNA by a sequence-specific recombination, the recognition sequence of which is highly conserved.
  • a large number of such recombinases from bacteria and yeasts are known.
  • Recombination sequences of cre recombinase (lox sites) are particularly suitable.
  • the recombination sequences of the FLP recombinase can also be used.
  • At least two recognition sites are required for the recombination. At these locations, the recombinase separates the DNA double strand and the free ends are newly connected to one another. This creates a circular molecule, the episome, which contains the sequences for autonomous replication and the therapeutic gene. Depending on the location of the recognition sites, additional viral sequences can be included, but these are separated from their natural environment and are therefore inactivated. If there are more than two recognition locations, several recombination events take place one after the other. This inactivates further virus genes in accordance with the aim of the invention.
  • the recognition sites for the specific recombinases can be positioned at different locations. They can be located both in the 5 'part and in the 3' part at the transitions between the virus DNA and the autonomously replicable DNA sequence or in the virus DNA. This results in different variants for realizing the invention.
  • recognition sites are on both sides between the virus DNA and the autonomously replicable DNA sequence. Furthermore, there is Possibility that the recognition site is in the 3 'part between the virus DNA and the autonomously replicable DNA sequence and in the 5' part in the virus DNA. Conversely, one recognition site in the 3 'part in the virus DNA and the other in the 5' part between the virus DNA and the autonomously replicable DNA sequence 1.
  • the recognition sites are located on both sides in the virus DNA.
  • the recombination of the virus vector preferably takes place in the target cell; there are two possibilities according to the invention:
  • a specific recombinase gene is built into the virus DNA. This gene is controlled by an inducible or strictly tissue-specific promoter and therefore only becomes active in the target cells.
  • the virus DNA contains no specific recombinase gene; for the method, the target cells are infected simultaneously or in succession with a second virus, which codes for the recombinase.
  • the virus DNA does not contain a specific recombinase gene, but such a gene is built into the cell used for production.
  • the replicating DNA formed during the recombination must also have sequences for packaging in the virus envelope and can then be packaged independently of the rest of the virus and infect the target cell.
  • transfer plasmids are generated which, after cotranection with defective Viru ⁇ DNA and homologous recombination, give rise to viruses which contain the replicon.
  • the transfer plasmid pdElEBORaat (Fig. 2) is based on pdElsplA (Bett AJ, Haddara W., Prevec L., Graham FL An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertion ⁇ or deletions in early regions 1 and 3. Proc Natl Acad Sei USA 1994; 91: 8802-8806.).
  • the plasmid contains the 5 ' end of adenovirus type 5.
  • a polylinker is used instead of the egg region that was deleted.
  • the following elements are inserted into the polylinker: 1.
  • REPLACEMENT BLA ⁇ (RULE 26) alphal-antitrypsin gene with the polyA signal from the gene of the bovine growth hormone under the control of the out sarcoma virus LTR.
  • the corresponding genes are transcribed in the same direction.
  • a plasmid is also constructed which contains the Cre recombinase gene under control of the CMV promoter in pdElsplA (pdElCMVcre).
  • pdElEBORaat is collaborated with pBHBlO (Bett AJ, Haddara W., Prevec L., Graham FL An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3. Proc Natl Acad Sei USA 1994; 91: 8802 -8806) by calcium phosphate coprecipitation in 293 cells and virus plaques isolated.
  • pdElCMVcre For pdElCMVcre there is a co-transfection with JM17 (McGrory W.J., Bautista D.S., Graham F.L. A simple technique for the rescue of early region I mutations into infectiou ⁇ human adenoviru ⁇ type 5. Virology 1988; 163: 614-617).
  • the viruses are cleaned again by plaque assay and checked for completeness of the insert by PCR and restriction analysis. After amplification to 293 cells, the viruses are subjected to a double purification in a CsCl gradient and the virus titer is determined by plaque assay.
  • the cassette flanked by 2 LoxP sites and the Cre expression unit are cloned into the baculovirus transfer plasmid pAcSG-HisNTA (Pharmingen).
  • the plasmid contains parts of the polyhedrin locus and is used to insert the gene cassette into this region of the baculovirus genome.
  • Another reporter gene must be used to test the function of the replicon in HuH7 cells, which themselves produce large amounts of alphalantitryp ⁇ in.
  • the Alphal antitrypsin gene is therefore
  • REPLACEMENT BLA ⁇ (RULE 26) with that of the ß-galactosidase.
  • a gene of neomycin phosphotransferase controlled by an SV40 promoter is additionally inserted.
  • the insertion of a cassette of this total size is only possible for baculovirus, but not for adenovirus.
  • the plasmids are transfected together with Baculo-Gold-DNA (pharmaceutical gene) by lipofectin into SF9 cells and the resulting viruses are purified by plaque assay on SF9 cells.
  • the viruses obtained from the cell culture supernatant are concentrated by ultracentrifugation through a 27% (w / w) saccharose cushion. The concentrated viruses were taken up in PBS and used for infection.
  • IMR90 cells and BT549 cells are infected with a 3: 1 mixture of the * replicon 'and Cre adenoviruses with a total titer of 50pfu / cell. 5 days after infection, the cells are harvested, genomic DNA is isolated and this is analyzed in a Southern blot after restriction digestion. For this purpose, restriction sites are used which make it possible to distinguish between a released episome and the cassette obtained in the virus.
  • HuH7 cells are infected with a 3: 1 mixture of the x replicon 'and Cre baculoviruses (total titer 300 pfu / cell) and analyzed in the same way 3 days after infection.
  • 95% of the adenovirus episome was released at the time of the investigation, while 80% of the baculovirus episome was separate from the virus.
  • the Cre recombinase expressed by a second virus is consequently able to effectively recognize Lox-P sites contained in the virus genome and to carry out the recombination. This also confirms the ability of the virus to simultaneously infect.
  • Adenovirus-infected cells were passaged and the alpha-antitrypsin secretion was determined twice a week. At each cell passage, 5/6 of the cells were used to isolate genetic DNA, 1/6 was used for further multiplication. When analyzing the gene expression over several weeks, it was found that it is retained over a longer period of time if an episome was released.
  • Neomycin-resistant colonies arose both in the doubly infected and in the cells transfected exclusively with the replicon vector.
  • the number of colonies from the simultaneous infection exceeded that from the simple infection by a factor of 3.
  • expression of the ⁇ -galactosidase gene was only detectable (100%) in the simultaneously infected cells.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Virusvektor für den Transfer stabiler Episome, d.h. von extrachromosomalen genetischen Elementen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, insbesondere die Gentherapie, und die medizinisch-biologische Grundlagenforschung. Die Erfindung hat das Ziel, die normalerweise nur kurzzeitige Funktion eines Gens nach viralem Gentransfer durch autonome Replikation zu verlängern und gleichzeitig die Expression viraler Gene wirksam abzuschalten. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, mittels eines Virus eine DNA in Zielzellen zu bringen, deren Replikationszyklus dem Zyklus dieser Zellen angepaßt ist und welche bei der Kernteilung in die sich bildenden Zellkerne der Tochterzellen gelangt. Die Zielstellung wird mit dem erfindungsgemäßen Virusvektor für den Transfer von stabilen Episomen erreicht. Dieser Vektor besteht aus der DNA eines Virus, einer autonom replizierbaren DNA-Sequenz, in welcher das zu transferierende Gen eingebaut ist, sowie mindestens 2 Erkennungsorten für eine spezifische Rekombinase und ggf. einem in der Virus-DNA eingebauten spezifischen Rekombinase-Gen.

Description

Virusvektor für den Transfer stabiler Episome
Beschreibung
Die Erfindung betrifft einen Virusvektor für den Transfer stabiler Episome, d. h. von extrachromosomalen genetischen Elementen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, insbesondere die Gentherapie, und die medizinisch-biologische Grundlagenforschung.
Die Behandlung genetischer Erkrankungen mittels gentherapeutischer Methoden erfordert den Transfer des bei der Krankheit defekten Gens in daε Gewebe, in dem das entsprechende Gen normalerweise exprimiert wird. Für eine wirksame Therapie muß der Gentransfer einen hohen Anteil der Zellen des Zielgewebes erreichen, und die Aktivität des Gens sollte über lange Zeit, nach Möglichkeit lebenslang, erhalten bleiben.
Hinsichtlich ihrer Effektivität sind virale Vektoren bis heute nichtviralen Gentransfersystemen überlegen. Die viruseigenen Mechanismen erlauben einen wirksamen Schutz des genetischen Materials vor dem Erreichen der Zielzelle, Aufnahme und Transport des genetischen Materials zum Zellkern sind durch die virale Evolution perfektioniert.
Viren verschiedener Familien werden verwendet: Retroviren, Adenoviren, Parvoviren und Herpesviren. Für die Leber, eines der wichtigsten Organe für somatische Gentherapie, kommen in erster Linie Retroviren und Adenoviren in Frage ( Sandig, V. and Strauss, M.(1996) Liver directed gene transfer and application to therapy. J.Mol.Med.74: 205-212). Außerdem wurde beschrieben, daß auch Baculoviren, die nur Insektenzellen produktiv infizieren können, in der Lage sind, fremdes genetisches
ERSATZBLAπ(REGEL26) Material in Leberzellen zu transportieren, ohne sich dort zu vermehren (DE 44 07 859).
Von den genannten Viren erlauben nur Retroviren und das Parvovirus AAV einen stabilen Gentransfer durch Mechanismen zur Integration des viralen in das zelluläre Genom. Diese Viren stehen jedoch in der Effektivität hinter den anderen zurück. So ist die retrovirale Infektion an proliferierende Zellen gebunden, was ihren Einsatz in ruhenden Geweben und solchen mit geringer Proliferationsaktivität (Gehirn, Leber, Lunge) erschwert bzw. besondere Maßnahmen zur Zellteilungsstimmulation erfordert.
Ein erstes auf Retroviren basierendes Gentherapieproto¬ koll für die Leber (Korrektur des LDL-Rezeptorgens zur Behandlung familiärer Hypercholesterinämie) blieb deshalb ohne therapeutischen Effekt (Grossman, M. et al. 1995 A pilot study of ex vivo gene therapy for homozygous familial hypercholesterinemia. Nature Med. 1:1148-1154).
Das Genom von Adenoviren, Herpesviren und Baculoviren wird nicht in das der Zielzelle integriert. Es liegt extrachromosomal im Zellkern vor und wird dort durch Assoziation mit Proteinen für einige Zeit stabilisiert. Da jedoch keine Replikation der viralen DNA erfolgt, geht diese im Laufe weiterer Zellteilungen verloren.
Während für Herpesviren der extrachromosomale Zustand des Virusgenoms ohne Replikation als latente Infektion im natürlichen Zustand vorkommt, wird dies bei Adenoviren durch Deletion wichtiger Aktivatoren (El Region) viraler Gene aus dem Virusgenom erreicht.
Die Deletion ist notwendig, um den lytischen viralen Lebenszyklus zu verhindern, der zum Tod der infizierten Zelle führen würde. Trotz der Replikationsinkompetenz des Virus in der Zielzelle werden jedoch virale Proteine synthetisiert. Als starke Antigene induzieren diese Proteine eine effektive hauptsächlich auf zytotoxischen T-Lymphozyten beruhende Immunantwort. Die infizierten Zellen werden eliminiert (Yang, Y.P. and Wilson, J.M. (1995) Clearence of adenovirus infected hepatocytes by MHC class 1 restricted CTLs in vivo. J Imunol. 155: 2564- 257). Im Tiermodell dauert deshalb die adenovirale Fremdgenexpression in der Leber nur für einige Tage biε Wochen an.
In letzter Zeit wurden Wege beschrieben, die adenovirale Genexpression in der Zielzelle zumindest teilweise zu unterbinden. Sie beruhen auf der Deletion weiterer früher Gene aus dem Virusgenom.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß es bisher keine Strategien zur Stabilisierung viraler Genome gibt und daß die wiederholte Anwendung von viralen Vektoren, z.B. in der Gentherapie, durch Immunreaktionen des Körpers eingeschränkt wird. Dadurch kann ein längerfristiger therapeutischer Effekt nicht erreicht werden.
Die Erfindung hat das Ziel, die normalerweise nur kurzzeitige Funktion eines Gens nach viralem Gentransfer durch autonome Replikation zu verlängern und gleichzeitig die Expression viraler Gene wirksam abzuschalten. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, mittels eines Virus eine DNA in die Zielzellen zu bringen, deren Replikationszyklus dem Zyklus dieser Zellen angepaßt ist und welche bei der Kernteilung in die sich bildenden Zellkerne der Tochterzellen gelangt. Eine nichtchromosomale DNA mit diesen Eigenschaften wird als stabiles Episom bezeichnet. Die Zielstellung und Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen erreicht, die Unteransprüche sind Vorzugεvarianten.
Der erfindungsgemäße Virusvektor für den Transfer stabiler Episome umfaßt die DNA eines Virus, eine autonom replizierbare DNA-Sequenz, in welcher das zu transferierende Gen eingebaut ist, sowie mindestens 2 Erkennungsorte für eine spezifische Rekombinase und ggf. ein in der Virus-DNA eingebautes spezifisches Rekombinase-Gen. Der Aufbau des Vektors ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt.
Bevorzugt wird die DNA eines Adenovirus bzw. eines Baculovirus verwendet.
Daε Wesen der Erfindung besteht darin, die Replikationsfunktion aus einem heterologen System zu entnehmen und nur auf den Teil deε ursprünglichen Virus zu beziehen, der daε therapeutische Gen enthält. Durch die Trennung des replizierenden vom nichtreplizierenden Teil werden außerdem Virusfunktionen inaktiviert.
Als autonom replizierbare DNA-Sequenz wird bevorzugt das Replikon von Epstein-Barr-Virus, bestehend aus dem oriP und dem EBNA-1-Gen, verwendet. Dieεe Viruε zeigt bei latenter Infektion von B-Lymphozyten die gewünεchten Eigenschaften. Durch Bindung des EBNA-1-Proteins an das latente Origin oriP wird ein Replikationszyklus pro Zellzyklus eingeleitet und die Erhaltung des Episoms bewirkt. OriP und EBNA-1 sind hinreichend für die Funktion und können vom Virus selbst getrennt werden.
Eine weitere Möglichkeit zur Realisierung der Erfindung besteht darin, dafür eine Replikationssequenz des Säugerge¬ noms zu verwenden. Bevorzugte Startorte der Replikation finden sich in verschiedenen Säugergenen wie z. B. in der Umgebung des myc-Gens, des dhfr-Gens oder im ß-Globin-Lokus.
ERSATZBLATT(REGEL26J In Kombination mit bestimmten Sequenzen zur Erhaltung eines Episoms können diese diese ebenso wie oriP funktionieren, benötigen jedoch kein zusätzlicheε viraleε Protein.
Die Trennung deε autonom replizierbaren Teils von der restlichen Virus DNA erfolgt durch eine sequenzεpezifiεche Rekombinaεe, deren Erkennungεεequenz hochkonserviert iεt. Eine Vielzahl solcher Rekombinasen aus Bakterien und Hefen ist bekannt. Beεonders geeignet εind Rekombinationssequenzen der cre-Rekombinase (Lox-sites). Auch die Rekombinations¬ sequenzen der FLP-Rekombinase können eingeεetzt werden.
Für die Rekombination sind mindestenε zwei Erkennungεorte erforderlich. An diesen Orten trennt die Rekombinase den DNA- Doppelεtrang, und die freien Enden werden neu miteinander verbunden. Dabei entsteht ein zirkuläres Molekül, das Episom, das die Sequenzen zur autonomen Replikation und daε therapeutische Gen enthält. Je nach der Lage der Erkennungsorte können zusätzlich virale Sequenzen enthalten sein, die jedoch von ihrer natürlichen Umgebung getrennt und dadurch inaktiviert sind. Liegen mehr als zwei Erkennungsorte vor, erfolgen mehrere Rekombinationsereignisse nacheinander. Dadurch wird eine Inaktivierung weiterer Virusgene entsprechend der Zielstellung der Erfindung erreicht.
Die Erkennungsorte für die spezifischen Rekombinasen können erfindungsgemäß an verschiedenen Stellen positioniert sein. Sie können sowohl im 5'-Teil als auch im 3'-Teil an den Übergängen zwischen der Virus-DNA und der autonom replizierbaren DNA-Sequenz bzw. in der Virus-DNA liegen. Dadurch ergeben εich verschiedene Varianten zur Realisierung der Erfindung.
Eine wichtige Variante besteht darin, daß die Erkennungsorte an beiden Seiten zwischen der Virus-DNA und der autonom replizierbaren DNA-Sequenz liegen. Ferner besteht die Möglichkeit, daß der Erkennungsort im 3'-Teil zwischen der Virus-DNA und der autonom replizierbaren DNA-Sequenz und im 5'-Teil in der Virus-DNA liegt. Umgekehrt kann ein Erkennungsort im 3'-Teil in der Virus-DNA und der andere im 5'-Teil zwischen der Virus-DNA und der autonom replizierbaren DNA-Sequenz 1iegen.
In manchen Fällen ist von Vorteil, wenn die Erkennungsorte an beiden Seiten in der Virus-DNA liegen.
Mitunter empfiehlt sich auch der Einbau eines dritten sowie ggf. weiterer Erkennungsorte, wobei es in diesen Fällen zweckmäßig ist, daß immer 2 dieser Orte an den Übergängen zwischen der Virus-DNA und der autonom replizierbaren DNA- Sequenz liegen.
Die Rekombination des Virusvektors findet vorzugsweise in der Zielzelle statt, es gibt erfindungsgemäß 2 Möglichkeiten:
a) In der Virus-DNA ist ein spezifiεcheε Rekombinase-Gen eingebaut. Dieses Gen wird durch einen induzierbaren oder streng gewebespezifischen Promoter kontrolliert und wird daher erst in den Zielzellen aktiv.
b) Die Virus-DNA enthält kein spezifiεcheε Rekombinase-Gen, für das Verfahren werden die Zielzellen gleichzeitig oder nacheinander mit einem zweiten Viruε, welcheε die Rekombinase kodiert, infiziert.
Alternativ dazu enthält die Virus-DNA kein spezifisches Rekombinase-Gen, dafür ist ein solches Gen in der zur Produktion verwendeten Zelle eingebaut. Die bei der Rekombination gebildete replizierende DNA muß in diesem Falle außerdem über Sequenzen zur Verpackung in die Virushülle verfügen und kann dann unabhängig vom Rest des Virus verpackt werden und die Zielzelle infizieren. Mit der Erfindung wird eine Verlängerung der Expresεion eineε therapeutischen Gens in einem viralen Vektor erreicht, wodurch eine verbesserte therapeutische Anwendbarkeit gegeben ist. Ein wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin, daß je nach Anordnung der Erkennungsorte im Vektor als Folge der Reaktion Virus-DNA gebildet wird, die funktionell inaktiviert ist.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeiεpiele näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiel
2. Herstellung von Adenoviren und Baculoviren, die ein EBV-Replikon freisetzen können
Zur Konstruktion der Viren werden Transferplasmide erzeugt, die nach Kotranεfektion mit defekter Viruε-DNA und homologer Rekombination Viren, die daε Replikon enthalten, entεtehen lassen.
a) Adenovirus
Das Transferplasmid pdElEBORaat (Abb. 2) wird auf Grundlage von pdElsplA (Bett A.J. , Haddara W. , Prevec L. , Graham F.L. An efficient and flexible syεtem for construction of adenovirus vectors with insertionε or deletions in early regions 1 and 3. Proc Natl Acad Sei USA 1994; 91: 8802-8806.) kloniert. Das Plasmid enthält das 5'-Ende von Adenovirus Type 5. Anstelle der Ei- Region, die deletiert wurde, ist ein Polylinker eingesetzt. In den Polylinker werden folgende Elemente eingefügt: 1. Das EBNA1 Gen mit eigenem Poly¬ adenylierungssignal, gesteuert vom frühen SV40 Promoter, 2. das latente Origin OriP von EBV und 3. das humane
ERSATZBLAπ(REGEL26) alphal-Antitrypsin-Gen mit dem PolyA-Signal vom Gen des bovinen Wachεtumεhormonε unter Kontrolle deε Raus- Sarcomvirus-LTR.
Die Transkription der entsprechenden Gene erfolgt jeweils in der gleichen Richtung.
Die Elemente werden von zwei LoxP-Orten flankiert. Außerdem wird ein Plasmid konstruiert, das das Gen der Cre-Rekombinase unter Kontrolle des CMV-Promoters in pdElsplA enthält(pdElCMVcre) . pdElEBORaat wird gemeinsam mit pBHBlO (Bett A.J. , Haddara W. , Prevec L. , Graham F.L. An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3. Proc Natl Acad Sei USA 1994; 91: 8802-8806) durch Calziumphosphat-Kopräzipitation in 293 Zellen trans¬ fiziert und Virusplaques isoliert. Für pdElCMVcre erfolgt eine Kotransfektion mit JM17 (McGrory W.J. , Bautista D.S., Graham F.L. A simple technique for the rescue of early region I mutations into infectiouε human adenoviruε type 5. Virology 1988; 163: 614-617). Die Viren werden durch Plaqueassay nochmals gereinigt und durch PCR und Restriktionsanalyse auf die Vollständigkeit der Insertε überprüft. Nach Amplifikation auf 293 Zellen werden die Viren einer doppelten Reinigung im CsCl-Gradienten unterzogen und der Virustiter durch Plaqueassay bestimmt.
b) Baculovirus
Die von 2 LoxP-Orten flankierte Kaεette auε pdElEBORaat und die Cre-Expressionseinheit werden jeweilε in das Baculovirus-Transferplasmid pAcSG-HisNTA (Pharmingen) kloniert. Das Plasmid enthält Teile deε Polyhedrin-Locus und dient zur Insertion der Genkassette in diese Region des Baculovirusgenoms. Zur Testung der Funktion des Replikons in HuH7-Zellen, die selbst große Mengen Alphal- Antitrypεin produzieren, muß ein andereε Reportergen verwendet werden. Das Alphal-Antitrypsin-Gen wird deshalb
ERSATZBLAπ(REGEL26) durch das der ß-Galaktosidase ersetzt. Für eine eventuelle Selektion wird zusätzlich ein SV40-Promoter gesteuerteε Gen der Neomycinphosphotransferase eingefügt. Die Insertion einer Kassette dieser Gesamtgröße ist nur für Baculovirus, nicht aber für Adenovirus möglich. Die Plasmide werden gemeinsam mit Baculo-Gold-DNA (Pharmingene) durch Lipofektin in SF9 Zellen transfiziert und entstehende Viren durch Plaqueassay auf SF9 Zellen gereinigt. Eine Konzentration der aus dem Zellkulturüberstand gewonnenen Viren erfolgt durch Ultrazentrifugation durch ein 27% (w/w) Sacharosekissen. Die konzentrierten Viren wurden in PBS aufgenommen und zur Infektion eingesetzt.
2. Testung der Funktion der Cre-Rekombinase
IMR90-Zellen und BT549-Zellen werden mit einer 3:1 Mischung der *Replikon'- und Cre Adenoviren bei einem Gesamttiter von 50pfu/Zelle infiziert. 5 Tage nach Infektion werden die Zellen geerntet, genomiεche DNA wird iεoliert und diese nach Restriktionεverdau im Southernblot analyεiert. Es werden dafür Reεtriktionεorte verwendet, die eine Unterεcheidung zwiεchen einem freigesetzen Episom und der im Viruε erhaltenen Kassette möglich machen.
HuH7-Zellen werden mit einer 3:1 Mischung der xReplikon'- und Cre-Baculoviren (Gesamttiter 300pfu/Zelle) infiziert und 3 Tage nach Infektion in gleicher Weise analysiert. In einem solchen Experiment waren zum Untersuchszeitpunkt 95% deε Adenovirus-Episoms freigesetzt, während 80% des Baculovirus-Episoms getrennt vom Virus vorlag. Die von einem 2. Virus exprimierte Cre-Rekombinase ist demzufolge in der Lage, im Virusgenom enthaltene Lox-P-Orte effektiv zu erkennen und die Rekombination auszuführen. Damit ist gleichzeitig die Fähigkeit der Viren zur simultanen Infektion bestätigt.
ERSATZBLAπ(REGEL26) 3 . Teεtung der Replikon-Funktion
Adenovirus-infizierte Zellen wurden passagiert und die Alphal-Antitrypsin-Sekretion 2x wöchentlich bestimmt. Bei jeder Zellpassage wurden 5/6 der Zellen zur Isolation von genoraischer DNA verwendet, 1/6 wurde zur weiteren Vermehrung genutzt. Bei Analyεe der Genexpreεsion über mehrere Wochen wurde festgestellt, daß diese über einen längeren Zeitraum erhalten bleibt, wenn ein Episom freigesetzt wurde.
Nach dem Baculovirus-vermittelten Gentransfer erfolgte eine vierwöchige Selektion mit G418. Es entstanden Neomycin-resistente Kolonien εowohl in den doppelt infizierten, als auch in den ausschließlich mit dem Replikon-Vektor transfizierten Zellen. Die Zahl der Kolonien aus der Simultaninfektion überstieg die aus der einfachen Infektion um den Faktor 3. Eine Expression des ß-Galaktosidasegens war jedoch nur in den simultan¬ infizierten Zellen (zu 100%) feststellbar.
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Claims

Patentansprüche
1. Virusvektor für den Transfer stabiler Episome, bestehend aus der DNA eines Virus, einer autonom replizierbaren DNA- Sequenz, in welcher das zu transferierende Gen eingebaut ist, sowie mindestens 2 Erkennungsorten für eine spezifische Rekombinase und ggf. einem in der Viruε-DNA eingebauten εpezifischen Rekombinase-Gen.
2. Virusvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Virus ein Adenovirus verwendet wird.
3. Virusvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Virus ein Baculovirus verwendet wird.
4. Virusvektor nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als autonom replizierbare DNA-Sequenz das Replikon von Epstein-Barr-Virus, bestehend aus dem oriP und dem EBNA-1- Gen, verwendet wird.
5. Virusvektor nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als autonom replizierbare DNA-Sequenz eine autonome Replikationsεequenz deε Säugergenoms verwendet wird.
6. Virusvektor nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungsorte sowohl im 5'-Teil alε auch im 3'-Teil an den Übergängen zwischen der Virus-DNA und der autonom replizierbaren DNA-Sequenz bzw. in der Virus-DNA liegen.
7. Virusvektor nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungsorte an beiden Seiten zwischen der Virus- DNA und der autonom replizierbaren DNA-Sequenz liegen.
ERSATZBLAπ(REGEL26)
8. Viruεvektor nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß der Erkennungsort im 3'-Teil zwischen der Virus-DNA und der autonom replizierbaren DNA-Sequenz und im 5'-Teil in der Virus-DNA liegt.
9. Virusvektor nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß der Erkennungsort im 3'-Teil in der Virus-DNA und im 5'-Teil zwischen der Virus-DNA und der autonom replizierbaren DNA-Sequenz liegt.
10. Virusvektor nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungsorte an beiden Seiten in der Virus-DNA liegen.
11. Virusvektor nach Anspruch 1-6 εowie 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein dritter Erkennungεort im 3x-Teil in der Virus-DNA liegt.
12. Virusvektor nach Anspruch 1-6 sowie 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein dritter Erkennungsort im 5x-Teil in der Virus-DNA liegt.
13. Virusvektor nach Anspruch 1-6 und einem der Ansprüche 7- 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungsorte aus den Rekombinationssequenzen der cre-Rekombinase (Lox-sites) bestehen.
14. Virusvektor nach Anspruch 1-6 und einem der Ansprüche 7- 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungsorte aus den Rekombinationssequenzen der FLP-Rekombinase bestehen.
15. Virusvektor nach Anspruch 1-14 mit eingebautem spezifischen Rekombinase-Gen, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität des in der Virus-DNA eingebauten spezifischen Rekombinase-Gens durch einen induzierbaren oder gewebespezifischen Promotor streng kontrolliert wird.
ERSATZBUVπ(REGEL26)
16. Virusvektor nach Anspruch 1-14 ohne eingebautes spezifisches Rekombinase-Gen.
17. Anwendung des Virusvektorε nach Anεpruch 1-15 mit einge¬ bautem Rekombinase-Gen, dadurch gekennzeichnet, daß er in einer geeigneten Produktionszellinie in ein vollständiges Virus verwandelt wird, und anschließend die Infektion der Zielzellen erfolgt.
18. Anwendung des Virusvektorε nach Anεpruch 1-14 und 16 ohne eingebautes Rekombinase-Gen, dadurch gekennzeichnet, daß die Infektion der Zielzellen zusätzlich mit einem 2. Virus, welcheε daε Rekombinaεe-Gen enthält, gleichzeitig oder nacheinander erfolgt.
19. Anwendung des Viruεvektors nach Anspruch 1-14 und 16 ohne eingebautes Rekombinase-Gen, dadurch gekennzeichnet, daß er in einer geeigneten Produktionszellinie, die die Rekombinase enthält, in ein unvollständiges Virus verwandelt wird und anschließend die Infektion der Zielzellen erfolgt.
ERSATZBLAπ(REGEL26)
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