JPH10108687A - ハイブリッドプロモーターを含む遺伝子治療用核酸構築物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子治療および遺伝子操作に用いるハイブ
リッドプロモーターを含む核酸構築物の提供。 【解決手段】 宿主細胞中で遺伝子を精確に制御して発
現させるための核酸構築物であって、遺伝子の適正な発
現を阻害する第一の突然変異を含む少なくとも一つの核
酸配列と、第一の突然変異による阻害を除く少なくとも
一つの追加の核酸配列を含む核酸構築物。核酸構築物を
含む単離細胞、および医薬の製造および過度の細胞増殖
を伴う疾患の治療のための核酸構築物の使用も開示され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本発明は、遺伝子操作、特に、疾病の予防または治療
（以後、遺伝子治療と呼ぶ）に用いることができる核酸
構築物に関する。遺伝子治療では、生体で発現する遺伝
子を生体に導入する。これらの遺伝子の発現を制御する
ことは、遺伝子治療の予防または治療効果にとって重要
である。

【０００２】背景技術 遺伝子の発現のレギュレーターは、ＰＣＴ／ＧＢ９５／
０２０００号、ＰＣＴ／ＥＰ９５／０３３７０号、ＰＣ
Ｔ／ＥＰ／０３３７１号、ＰＣＴ／ＥＰ９５／０３３６
８号およびＰＣＴ／ＥＰ９５／０３３３９号の特許出願
明細書に記載されている。これらのレギュレーターは、
例えば基礎転写の細胞特異的またはウイルス特異的活性
化の機能を有するアクチベーター配列を含んでいる。こ
のアクチベーター配列のＤＮＡ配列の３′末端は、プロ
モーターモジュールの５′末端に連結している。また、
構造遺伝子は、その５′末端でプロモーターモジュール
の３′末端に連結している。

【０００３】プロモーターモジュールはＣＤＦおよびＣ
ＨＦ類、またはＥ２ＦおよびＣＨＦ類の転写因子同士を
結合するための核酸配列からなっている。細胞サイクル
のＧ０およびＧ１相では、この結合は上流のアクチベー
ター配列を阻害し、従って下流（すなわち、転写の方
法）に位置する構造遺伝子を阻害または転写する。

【０００４】細胞分裂のＧ０およびＧ１相では、細胞に
含まれるＤＮＡは二倍体状態である。Ｇ０相では、細胞
は静止しているが、Ｇ１相では、細胞サイクルの進行が
阻害される。Ｇ１相に続いてＳ相となり、ＤＮＡ合成が
起こり、ゲノムが複製される。次いで、Ｇ２相となり、
細胞は四倍体状態である。Ｇ２相に続いて細胞分裂が
（有糸分裂＝Ｍ相）起こる。次いで、娘細胞がＧ０状態
またはＧ１状態となる。

【０００５】従って、細胞特異的またはウイルス特異的
アクチベーター配列と、Ｇ０およびＧ１相でのこのアク
チベーター配列を阻害するプロモーターモジュールとの
組み合わせにより、細胞特異的またはウイルス特異的お
よび細胞サイクル特異的（すなわち、ＳおよびＧ２相に
限定された）に構造遺伝子の発現を制御することが可能
となる。

【０００６】アクチベーター配列とプロモーターモジュ
ールとの組み合わせは、キメラプロモーターと呼ばれ
る。遺伝子治療におけるキメラプロモーターは多くの用
途に用いることができるが、欠点から生じる多くの制限
もある。

【０００７】これらの制限の例は、アクチベーター配列
が弱く、構造遺伝子の転写が起こり難い、選択されたプ
ロモーターモジュールによって十分に細胞サイクル依存
的に阻害することができないアクチベーター配列の使
用、構造遺伝子の転写の２種類の（例えば、細胞特異的
またはウイルス特異的および細胞サイクル特異的）レギ
ュレーターへの制限、細胞中に導入された構造遺伝子の
転写生成物の細胞内輸送が不適切であることである。

【０００８】本発明は、本発明の核酸構築物を提供する
ことによって異種遺伝子を発現する目的で既知のキメラ
プロモーターを用いることの欠点を解消することによっ
て、宿主細胞での異種遺伝子の発現を制御することがで
きる。

【０００９】

【発明の概要】本発明は、核酸構築物を用いることによ
り、宿主細胞での異種遺伝子（導入遺伝子）の発現を精
確に制御することができるようにすることをその目的と
する。従って、本発明は、核酸構築物であって、導入遺
伝子の適正な発現を阻害する第一の突然変異を示す少な
くとも１種類の核酸配列によって導入遺伝子を精確に制
御し、かつ少なくとも１種類の別の核酸配列が、第一の
（複数の）核酸配列での突然変異による阻害を除く（ab
olish ）第二の突然変異を示す核酸構築物に関する。

【００１０】

【発明の具体的説明】更に詳細には、本発明の核酸構築
物は、別の構築物を用いて宿主細胞中の導入遺伝子の発
現を制御する。第一の突然変異を含む核酸配列が、上記
導入遺伝子の転写および／または翻訳を阻害するまたは
薬理学的に活性な物質（薬理活性化合物）の機能を阻害
する突然変異を含む導入遺伝子(b) であるときには、核
酸構築物は更に第一のプロモーターまたはエンハンサー
配列(a) であって、導入遺伝子の５′末端の上流に配置
されているものを含んでなり、あるいは第一の突然変異
を含む核酸配列が第一のプロモーターまたはエンハンサ
ー配列(a')であって、第一のプロモーターの機能を阻害
する突然変異を含むものであるときには、核酸構築物は
薬理活性化合物をコードする導入遺伝子(b')も含んでい
る。いずれの場合にも、第二の突然変異を含む少なくと
も１種類の核酸配列により、第一の突然変異による阻害
が除かれる。

【００１１】これらの核酸配列は同一または異なるプロ
モーター配列によって制御されており、これら総てのプ
ロモーター配列が活性化されるときにだけ、導入遺伝子
を発現することができる。

【００１２】新規な核酸構築物は、少なくとも５′末端
から３′末端への読取りの方向で表記されている下記の
成分 非特異的、細胞特異的またはウイルス特異的であるか、
またはテトラサイクリンによりまたは代謝的におよび／
または細胞サイクル特異的に活性化することができ、ト
ランス遺伝子の転写を活性化し、かつプロモーターの機
能を阻害する突然変異(a')を含むことができる第一の
(I) プロモーターまたはエンハンサー配列(a) 、構造遺
伝子として、活性化合物をコードし、この構造遺伝子の
転写および／または翻訳を停止しまたは構造遺伝子の生
成物の機能を阻害する突然変異を含むことができるトラ
ンス遺伝子(b')、非特異的、細胞特異的またはウイルス
特異的であるか、または代謝的におよび／または細胞サ
イクル特異的に活性化することができ、成分d)または(d
')の基礎転写を活性化し、かつプロモーターの機能を阻
害する突然変異を含むことができる第二の(II)プロモー
ターまたはエンハンサー配列(c) または(c')、プロモー
ターの１個以上またはトランス遺伝子において突然変異
を緩和するためのｔＲＮＡ（サプレッサーｔＲＮＡ）ま
たは制御タンパク質(d) または(d')の遺伝子を含んでな
るのが好ましい。

【００１３】第一の(I) プロモーター配列またはエンハ
ンサー配列(a) と、第二の(II)プロモーター配列または
エンハンサー配列(c) は同一であってもまたは異なるも
のであってもよく、成分a)およびc)の少なくとも１つは
非特異的に、細胞特異的にまたはウイルス特異的に活性
化することができ、テトラサイクリンによってまたは代
謝的に、特に低酸素により活性化することができ、また
は細胞サイクル特異的に活性化することができる。

【００１４】本発明は、核酸構築物であって、成分b)
が、そのｃＤＮＡが５′末端で構造遺伝子の３′末端に
直接または間接的に連結している核保持シグナルを示
し、核保持シグナルの転写生成物が核輸出因子に結合す
るための構造を示すことを特徴とする核酸構築物にも関
する。

【００１５】本発明は、成分a)〜d)の他に、下記の成分 核輸出因子の基礎転写を活性化するもう一つのプロモー
ターまたはエンハンサー配列(i) 、および核保持シグナ
ル(h) の転写生成物に結合することにより、トランス遺
伝子の転写生成物の細胞核から細胞質への輸出を媒介す
る核輸出因子(k) をコードする核酸を示す核酸構築物に
も関する。

【００１６】本発明においては、プロモーター配列また
はエンハンサー配列(a) および(c)の少なくとも１つは
キメラプロモーターであることができ、プロモーターモ
ジュールＣＤＥ−ＣＨＲまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲは、
細胞特異的、ウイルス特異的または代謝的に活性化し得
る上流のアクチベーター配列と相互作用することがで
き、それにより下流の遺伝子の発現に影響を与え、特に
阻害することができる。

【００１７】成分a)およびc)は、アクチベーター応答プ
ロモーター単位であってもよい。このような構築物は、
下記の成分 非特異的に、ウイルス特異的に、代謝的に、テトラサイ
クリンにより、または細胞特異的および／または細胞サ
イクル特異的に活性化することができる少なくとも１つ
のプロモーターまたはエンハンサー配列(e) 、プロモー
ターまたはエンハンサー配列(e) の下流に位置し、その
転写がプロモーターまたはエンハンサー配列(e) によっ
て活性化される少なくとも１つのアクチベーターサブユ
ニット(f) 、(f) に記載のアクチベーターサブユニット
または数個の同一または異なる活性化因子サブユニット
(f')の発現生成物によって活性化されるアクチベーター
応答プロモーター(g)も示す。

【００１８】本発明のもう一つの態様では、核酸構築物
は、プロモーター配列またはエンハンサー配列(a) およ
び／または(c) および／または(i) アクチベーター応答
プロモーター(g) がキメラプロモーターであり、かつア
クチベーターサブユニット(f) がアクチベーター応答プ
ロモーターのキメラプロモーターを活性化する少なくと
も１つの転写因子に対する遺伝子である核酸構築物であ
る。

【００１９】本発明は、２つの活性化サブユニット(f,
f') 、例えばＳＶ４０プロモーターと共にＬｅｘＡオペ
レーター（モノマーまたはマルチマー）によって活性化
されるアクチベーター応答プロモーター(g) を含む核酸
構築物にも関する。アクチベーターサブユニット(f)
は、アミノ酸１〜８１または１〜２０２をコードするＬ
ｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質に対するｃＤＮＡを含ん
でなり、その３′末端がＧａｌ８０タンパク質（アミノ
酸１〜４３５）に対するｃＤＮＡの５′末端に連結して
いる。第二のアクチベーターサブユニット(f')は、アミ
ノ酸８５１〜８８１をコードするＧａｌ４タンパク質の
Ｇａｌ８０結合ドメインのｃＤＮＡを含んでなり、その
３′末端はアミノ酸１２６〜１３２をコードするＳＶ４
０大型Ｔ抗原のｃＤＮＡの５′末端に連結しており、上
記ｃＤＮＡの３′末端はアミノ酸４０６〜４８８をコー
ドするＨＳＶ−１ ＶＰ１６のトランス作用ドメインに
対するｃＤＮＡの５′末端に連結している。

【００２０】２つのアクチベーターサブユニット(f, f
') によって活性化されるアクチベーター応答プロモー
ター(g) のもう一つの例では、上記のＬｅｘＡオペレー
ターがＧａｌ４結合領域で置換され（単一または連続し
て複数個配置）、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質に対
する遺伝子がＧａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン
（ＡＡ１〜１４７）に対する遺伝子で置換される。

【００２１】本発明は、アクチベーター応答プロモータ
ー(g) として、Ｇａｌ４結合タンパク質に対する結合配
列のモノマーおよびマルチマーを含み、アクチベーター
サブユニット(f) がＳＶ４０の核局在化シグナル（ＮＬ
Ｓ）（ＳＶ４０大型Ｔ；アミノ酸１２６〜１３２；ＰＫ
ＫＫＲＫＶ，配列番号１）、ＨＳＶ−１ ＶＰ１６由来
の酸トランス作用ドメイン（ＴＡＤ）（アミノ酸４０６
〜４８８）、およびＣＤ４糖タンパク質の細胞質残基
（アミノ酸３９７〜４３５）を含み、アクチベーターサ
ブユニット(f) がＳＶ４０の核局在化シグナル（ＮＬ
Ｓ）（ＳＶ４０大型Ｔ；アミノ酸１２６〜１３２；ＰＫ
ＫＫＲＫＶ）、Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイ
ンに対するｃＤＮＡ（アミノ酸１〜１４７）、およびｐ
５６Ｉｃｋタンパク質のＣＤ４結合配列に対するｃＤＮ
Ａ（アミノ酸１〜７１）を含む核酸構築物にも関する。

【００２２】アクチベーター応答プロモーター(g) がＧ
ａｌ４の結合配列であるアクチベーター応答プロモータ
ー単位のもう一つの例では、アクチベーターサブユニッ
ト(f) におけるＧａｌ８０タンパク質のｃＤＮＡ（アミ
ノ酸１〜４３５）はＣＤ４糖タンパク質の細胞質残基に
対するｃＤＮＡ（アミノ酸３９７〜４３７；Simpsonet
al., Oncogene 4: 1141 (1989); Maddon et al., Cell
42: 93 (1985)）で置換され、アクチベーターサブユニ
ット(f) におけるＧａｌ４タンパク質のＧａｌ８０結合
ドメインのｃＤＮＡ（アミノ酸８５１〜８８１をコー
ド）は、ｐ５６Ｉｃｋタンパク質のＣＤ４結合配列のｃ
ＤＮＡ（アミノ酸１〜７１；Shaw et al., Cell 59: 62
7 (1989); Turner et al., Cell 60: 755 (1990); Perl
mutter et al., J. Cell. Biochem. 38: 117 (1988) ）
で置換されている。

【００２３】更に好ましい態様では、新規な核酸構築物
は、読取り方向で下流で（すなわち、ＤＮＡの５′末端
によって）トランス遺伝子(b) に（すなわち、トランス
遺伝子の３′末端で）連結している核保持シグナル（Ｎ
ＲＳ）を示すことができる。

【００２４】もう一つの好ましい態様では、核保持シグ
ナルの転写生成物は、核輸出因子（ＮＥＦ）を結合する
ための構造を有する。この核輸出因子に対するｃＤＮＡ
は、その５′末端によって、プロモーター配列a)および
／またはc)と同一であるかまたは異なるものであること
ができるもう一つのプロモーター配列またはエンハンサ
ー配列の３′末端に連結しているのが好ましい。

【００２５】核輸出因子(k) は、ＨＩＶ−１またはＨＩ
Ｖ−２ウイルス、ビスナ−マエディ（visna-maedi ）ウ
イルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイ
ルス、ネコ免疫不全症ウイルス、およびＨＴＬＶのよう
なレトロウイルスのｒｅｖ遺伝子からなる群から選択さ
れる遺伝子であるか、またはｈｎＲＮＰ−Ａ１タンパク
質に対する遺伝子、または転写因子ＴＦＩＩＩ−Ａに対
する遺伝子であるのが好ましい。

【００２６】原則としては、核酸はＤＮＡである。新規
な核酸構築物は、通常はベクター、特にプラスミドベク
ター（非ウイルス）またはウイルスベクターとして用い
られる。

【００２７】原則としては、トランス遺伝子は、サイト
カイン、成長因子、抗体または抗体断片、サイトカイン
または成長因子に対するレセプター、増殖防止または細
胞増殖抑制作用を有するタンパク質、酵素、脈管形成抑
制剤、血栓誘発物質、および凝集抑制剤、フィブリン溶
解作用を有するタンパク質、血漿タンパク質、補体活性
化タンパク質、ウイルスコートタンパク質、細菌性抗原
および寄生動物性抗原、腫瘍抗原、血液循環に効果を有
するタンパク質、ペプチドホルモン、およびリボザイム
およびアンチセンスＲＮＡのようなリボ核酸からなる群
から選択される薬理活性化合物をコードする構造遺伝子
である。

【００２８】特定の態様では、トランス遺伝子は、制御
された細胞死を引き起こすタンパク質をコードする構造
遺伝子であることができる。これらのタンパク質の一例
は、スフィンゴミエリナーゼである。

【００２９】もう一つの態様では、トランス遺伝子(b)
は、薬剤の前駆物質を開裂させ、薬剤を形成する酵素を
コードする構造遺伝子である。特定の態様では、トラン
ス遺伝子は、リガンドと、上記のタンパク質またはペプ
チド活性を有する化合物の１つからなる融合タンパク質
をコードする構造遺伝子であることができる。このリガ
ンドは、例えば抗体、抗体断片、サイトカイン、成長因
子、ペプチドホルモン、またはレセプターであることが
できる。特定の態様では、構造遺伝子はリガンド−酵素
融合タンパク質をコードすることができ、酵素が薬剤の
前駆物質を開裂することによって、薬剤を形成し、リガ
ンドは、好ましくは内皮細胞または腫瘍細胞の細胞表面
に結合する。

【００３０】プロモーター配列、エンハンサー配列また
はアクチベーター配列は、内皮細胞、平滑筋細胞、横紋
筋、マクロファージ、リンパ球、腫瘍細胞、肝細胞、白
血球細胞およびグリア細胞中で活性化する遺伝子制御ヌ
クレオチド配列、またはＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰ
Ｖ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたはＨＩＶウイルス由来のプロ
モーター配列の群から選択することができる。

【００３１】アクチベーター配列は、更にテトラサイク
リンオペレーターを相当するリプレッサーと組み合わせ
たものであることもできる。

【００３２】本発明は、新規な核酸構築物を含み、患者
に局所または経口投与し、または注射するウイルスまた
は非ウイルスベクターに関する。また、新規な核酸構築
物は、静脈内、動脈内、体腔内、臓器内または皮下投与
することもできる。

【００３３】本発明は、新規な核酸構築物を有し、患者
に局所投与しまたは注射する単離細胞または細胞系にも
関する。

【００３４】このような細胞の例は、腫瘍細胞、マクロ
ファージまたはリンパ球のような免疫細胞、または内皮
細胞である。この種の細胞は、疾患を治療するための医
薬の製造に用いることもでき、この医薬の製造は、核酸
構築物の標的細胞への導入を含んでいる。

【００３５】新規な核酸構築物は、任意のプロモータ
ー、エンハンサーまたはアクチベーター配列を用いるこ
とができる。

【００３６】トランス遺伝子(b) 中または上での新規な
突然変異は、１種類以上のアミノ酸に対する核酸配列の
置換であることができるので、この置換の結果、発現し
たタンパク質は最早作用しなくなる。この場合には、成
分d)は、一方ではトランス遺伝子(b) における突然変異
したヌクレオチド配列のｍＲＮＡにそのアンチコドンに
よって結合し、他方ではトランス遺伝子(b) における突
然変異を緩和するための精確なアミノ酸を採取する末端
基を有するｔＲＮＡをコードする核酸配列である。

【００３７】しかしながら、トランス遺伝子(b) 中また
は上での新規な突然変異は、構造遺伝子中の翻訳停止コ
ドンであることもでき、このコドンは哺乳動物細胞には
見られないかまたはごくまれにしか見られないので、構
造遺伝子は効果的には翻訳されない。この場合には、成
分d)は、一方では、停止コドンに相補性であるアンチコ
ドンを有するｔＲＮＡをコードすることにより、構造遺
伝子(b) における翻訳停止コドンによる翻訳の阻害を緩
和し、他方では、トランス遺伝子(b) における突然変異
を緩和するための精確なアミノ酸を採取する末端基を有
する核酸配列である。

【００３８】もう一つの態様では、トランス遺伝子(b)
中または上の突然変異は、構造遺伝子の５′末端の上流
に位置するプロモーター配列のＴＡＴＡボックスの突然
変異であることができる。この突然変異により、構造遺
伝子の転写の開始が遮断される。この場合には、成分d)
は、突然変異したＴＡＴＡボックスに結合するタンパク
質をコードする核酸配列であり、従って転写を起こすこ
とができる。

【００３９】本発明は、細胞を、トランス遺伝子の適正
な発現を阻害する第一の突然変異を含む少なくとも１つ
の核酸配列と、第一の突然変異による阻害を除く第二の
突然変異を含む少なくとも１つの核酸配列とを含む核酸
構築物の細胞増殖抑制量と接触させることによって細胞
の増殖を抑制する方法にも関する。

【００４０】本発明は、過度の細胞増殖を伴う疾患を有
する患者の治療法であって、患者に、本発明の核酸構築
物の細胞増殖抑制量を投与することを含んでなる方法に
も関する。核酸構築物が特に有用である疾患は、腫瘍、
および血管中の細胞の増殖を伴う循環器疾患である。

【００４１】本発明は、薬学上許容可能な担体中に核酸
構築物の細胞増殖抑制量を含む医薬組成物にも関する。

【００４２】図面に示した核酸構築物は、好ましい態様
の単なる例であり、本発明を本明細書に開示されている
具体的成分に限定することを意味するものではない。

【００４３】本発明は、トランス遺伝子の適正な発現を
阻害する第一の突然変異を含む少なくとも１つの核酸配
列と、第一の（複数の）核酸配列での突然変異による阻
害をなくする第二の突然変異を含む少なくとも１つの別
の核酸配列とを含む宿主細胞中での制御された発現に使
用する核酸構築物に関する。

【００４４】これらのヌクレオチド配列は同一または異
なるプロモーター配列によって制御されるので、トラン
ス遺伝子は、これらのプロモーター配列総てが活性化さ
れるときにしか発現することができない。

【００４５】新規な核酸構築物は、５′から３′末端方
向の読み取り枠内で表記された少なくとも下記の成分 トランス遺伝子の転写を活性化し、場合によっては第一
のプロモーター(a')の機能を阻害する突然変異を含む第
一のプロモーターまたはエンハンサー配列(a) 、トラン
ス遺伝子の転写および／または翻訳を停止する、または
薬理活性化合物の機能を阻害する突然変異(b) を場合に
よっては含む薬理活性化合物をコードするトランス遺伝
子(b')、成分(d) の基礎転写を活性化し、場合によって
は第二のプロモーターの機能を阻害する突然変異を含む
第二のプロモーターまたはエンハンサー配列(c) 、およ
びｔＲＮＡ（サプレッサーｔＲＮＡ）、またはプロモー
ター(a) および(c)の少なくとも一つまたはトランス遺
伝子(b) における突然変異をなくするための制御タンパ
ク質に対する遺伝子を含んでなるのが好ましい。

【００４６】個々の成分の配置を、図１Ａおよび１Ｂ
（スキームＡおよびＢ）において例として示している。
これらの図は、核酸構築物の別の態様を示している。

【００４７】本発明の新規な核酸構築物において、成分
a)またはc)のプロモーターまたはエンハンサー配列は同
一であるかまたは異なるものであることができ、更に成
分c)およびd)を成分a)およびb)の上流または下流に配置
することができる。

【００４８】ＣＭＶ（ＥＰ−Ａ−０１７３１７７号明細
書）またはＳＶ４０から誘導されたものなどの少なくと
も１種類の強力なプロモーター配列またはエンハンサー
配列、またはテトラサイクリンオペレーターを相当する
リプレッサーと組み合わせたもの、または任意の他のプ
ロモーター配列またはエンハンサー配列であって、当業
者に知られているものは、プロモーター配列またはエン
ハンサー配列として好ましく用いられる。

【００４９】好ましい態様では、新規な核酸構築物中の
少なくとも１種類の１つのプロモーター配列またはエン
ハンサー配列を、細胞特異的に、代謝的に（例えば、低
酸素により）、ウイルス特異的に、または細胞サイクル
特異的に活性化することができる。

【００５０】下記のプロモーターまたはエンハンサー配
列が特に好ましい。内皮細胞、平滑筋細胞、横紋筋細
胞、造血細胞、リンパ球、マクロファージ、グリア細胞
または腫瘍細胞中で細胞特異的に転写を活性化するプロ
モーター配列またはエンハンサー配列、ＨＢＶ、ＨＣ
Ｖ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたは
ＨＩＶウイルスのプロモーター配列またはエンハンサー
配列、および／または低酸素によって誘導することがで
きるエンハンサー（Semenza et al., PNAS 88, 5680 (1
991)）またはプロモーター（Mc Burney et al., Nuclei
c AcidsRes. 19, 5755 (1991)；ＷＯ９５／２１９２７
号明細書）のような代謝的に活性化することができるプ
ロモーター配列またはエンハンサー配列、および／また
はｃｄｃ２５Ｃ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、ｃｄｃ２
遺伝子（Lucibelloet al., EMBO J. 14, 132 (1995), Z
wicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995),Zwicker et
al., Nucl. Acids Res. 23, 2833 (1995) ）、Ｂ−ｍｙ
ｂ遺伝子（Lam et al., EMBO J. 12, 2705 (1993) ）、
ＤＨＦＲ遺伝子（Means et al., Mol. Cell Biol. 12,
1054 (1992) ）、およびＥ２Ｆ−１遺伝子（Johnson et
al., Genes Dev. 8, 1514 (1994), Hsiao et al., Gen
es Dev. 8, 15256 (1994) ）のプロモーターのような細
胞サイクル特異的に活性化することができるプロモータ
ー、あるいは細胞増殖中に現れまたは活性化される転写
因子を結合する配列。これらの結合配列の例は、Ｍｙｃ
Ｅボックスと呼ばれるヌクレオチド配列のモノマーまた
はマルチマーである（Blackwood and Eisenmann, Scien
ce 251, 1211 (1991) ）。

【００５１】更に、テトラサイクリンによって活性化す
ることができるプロモーター、例えばテトラサイクリン
オペレーターを相当するリプレッサーと組み合わせたも
の（Gossen et al., TIBS 18, 471 (1993), Dinermann
et al., EMBO J. 11, 1487 (1992), Gossen et al., Sc
ience 268, 1766 (1995)）も、本発明の範囲内で利用さ
れるものである。

【００５２】もう一つの好ましい態様では、新規な核酸
構築物中の少なくとも１種類のプロモーター配列または
エンハンサー配列はキメラプロモーターである。本発明
の意味において、キメラプロモーターは、細胞特異的
に、代謝的に、またはウイルス特異的に活性化すること
ができる上流のアクチベーター配列と下流のプロモータ
ーモジュールとの組み合わせである。プロモーターモジ
ュールはＣＤＥ−ＣＨＲ要素またはＥ２ＦＢＳ−（Ｂｍ
ｙｂ）−ＣＨＲ要素を含むヌクレオチド配列を含んでな
り、これによって細胞サイクルのＧ０およびＧ１相にお
いて上流のアクチベーター配列の活性化を阻害すること
ができることが好ましい（Lucibello et al., EMBO J.
14, 132 (1994), ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２０００；Zwic
ker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995); Zwicker et a
l., Science 271, 1595 (1996) ）。

【００５３】もう一つの好ましい態様では、新規な核酸
構築物中の少なくとも１種類のプロモーター配列または
エンハンサー配列（成分a)またはc)）はアクチベーター
応答プロモーター単位である。

【００５４】それに関しては、アクチベーター応答プロ
モーター単位は、下記の成分 １種類以上の同一であるかまたは異なるプロモーターま
たはエンハンサー配列(e) であって、例えば細胞サイク
ル特異的に、代謝的に、細胞特異的に、またはウイルス
特異的に、または細胞サイクル特異的かつ代謝的に、細
胞特異的に、またはウイルス特異的に活性化することが
できるもの（いわゆるキメラプロモーター）、１種類以
上の同一であるかまたは異なるアクチベーターサブユニ
ット(f)であって、それぞれの場合にプロモーターまた
はエンハンサー配列の下流に位置しており、その基礎転
写をこれらの後者の配列によって活性化するもの、およ
び１種類以上のアクチベーターサブユニットの発現生成
物によって活性化されるアクチベーター応答プロモータ
ー(g)からなっている。

【００５５】アクチベーター応答プロモーター単位の個
々の成分の配置を、例えば図２のスキームＣで表す。

【００５６】新規な核酸構築物への好ましいアクチベー
ター応答プロモーター単位の挿入を、例えば図３のスキ
ームＤ）で表す。

【００５７】それらの最も単純な形態では、アクチベー
ター応答プロモーター単位は、例えば図４のスキームＥ
に表されているキメラプロモーター構築物であることが
できる。

【００５８】もう一つの態様では、本発明によるアクチ
ベーター応答プロモーター単位は、ＤＮＡ結合ドメイ
ン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、および
トランス作用ドメインからなるキメラ転写因子を結合す
る配列であることができる。薬理活性化合物として好ま
しい構造遺伝子は、サイトカイン、成長因子、サイトカ
インまたは成長因子のレセプター、抗体または抗体断
片、リガンド（例えば、抗体または抗体断片）と、サイ
トカインまたは成長因子とからなる融合タンパク質、増
殖防止または細胞増殖抑制作用を有するタンパク質、血
管形成抑制剤、血栓誘発タンパク質、凝集抑制剤、血漿
タンパク質、補体活性化タンパク質、ウイルスのコート
物質、および細菌のコート物質からなる群から選択され
るタンパク質および糖タンパク質である。

【００５９】本発明によれば、１つの特定の態様におけ
る構造遺伝子（トランス遺伝子−成分b)）は、機能タン
パク質（またはペプチド）の発現を防止する突然変異を
備えている。

【００６０】この突然変異は、１個以上のアミノ酸につ
いてのヌクレオチド配列の置換であることがあり、この
置換の結果、発現したタンパク質は最早機能することが
できず（ミスセンス変異）、すなわち活性化合物または
機能を有する酵素を最早産生しない。この種の構造遺伝
子（トランス遺伝子−化合物b)）の突然変異の場合に
は、成分d)は、一方ではそのアンチコドンによって構造
遺伝子（成分b)）のｍＲＮＡの突然変異部位に結合し、
他方では、トランス遺伝子（サプレッサーｔＲＮＡ）に
おける突然変異を緩和するための精確なアミノ酸を取り
上げる（take up）末端基を有するｔＲＮＡをコードす
る核酸配列である。

【００６１】これに関して、哺乳動物細胞で通常はごく
まれにしか用いられないｔＲＮＡは、特にサプレッサー
ｔＲＮＡに突然変異して、細胞の一般的翻訳効率につい
て負の結果をできるだけ少なくすべきである。

【００６２】もう一つの態様では、構造遺伝子での突然
変異は、１個以上の翻訳停止コドンの導入（ナンセンス
変異）である。ｍＲＮＡでは、ヌクレオチド配列ＵＡ
Ａ、ＵＧＡおよびＵＡＧは翻訳停止コドンであることが
知られている。これらの停止コドンに対する相当するＤ
ＮＡ配列は、ＴＡＡ、ＴＧＡおよびＴＡＧ／ＤＮＡのコ
ード鎖である。これらの停止コドンの１つを、突然変異
として構造遺伝子のＤＮＡ配列（成分b)）中に挿入する
のが好ましい。

【００６３】この種の構造遺伝子（成分b)）の突然変異
の場合には、成分d)は一方ではそのアンチコドンによっ
て構造遺伝子（成分b)）のｍＲＮＡの突然変異、すなわ
ち導入された停止コドンに結合し、他方では、突然変異
の部位における元のＤＮＡ配列によってコードされた精
確なアミノ酸を取り上げる末端基を有するｔＲＮＡ（サ
プレッサーｔＲＮＡ）をコードする核酸配列である。こ
の種の核酸配列(b) は、大腸菌、酵母および植物細胞に
ついて既に記載されている（Dingermann et al., Mol.
Cell Biol. 12, 4038 (1992), EMBO J. 11, 1487 (199
2); Gossen et al., TIBS 18, 471 (1993); Gatz et a
l., Plant J. 2, 397 (1992)）。本発明によれば、哺乳
動物細胞で通常はごくまれにしか用いられないｔＲＮＡ
は、この場合にもサプレッサーｔＲＮＡに突然変異すべ
きである。

【００６４】従って、例えば、下記の組み合わせを選択
することができる（Lewin 監修、遺伝子IV（Genes IV),
Oxford University Press 1990, 151頁）。 表１： アミノ酸 コドン 停止突然 サプレッサー サプレッサー 遺伝子座 変異（コ ｔＲＮＡ（ア ｔＲＮＡに結 ドン） ンチコドン） 合したアミノ 酸 Tyr UAU UAG CUA Tyr sup F(su⁺ 3) Tyr UAC UAA UUA Tyr sup C(su⁺ 4) Ser UCG UAG CUA Ser sup D(su⁺ 1) Gln CAG UAG CUA Gln sup E(su⁺ 2) Lys AAA UAA UUA Lys sup G(su⁺ 5) Lys AAG UAG UUA Lys sup G(su⁺ 5) Trp UGG UGA UCA Trp sup U(su⁺ 7) Trp UGG UCA Trp sup U(su⁺ 7)

【００６５】もう一つの態様では、構造遺伝子中または
上の突然変異は、構造遺伝子（成分b)）の５′末端の上
流に位置するプロモーター配列（成分a)）のＴＡＴＡボ
ックスの突然変異であることができる。ＴＡＴＡボック
ス（ＴＡＴＡＡＡ）は、細胞核に含まれるＲＮＡポリメ
ラーゼIIおよびIII に対する中央の開始部位であると考
えられている。転写は、細胞核に含まれるＲＮＡポリメ
ラーゼ総て(I、II、III)の転写に本質的に関与するＴＡ
ＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）の結合によって
ＴＡＴＡボックスで開始される。厳密な意味でＴＡＴＡ
ボックス依存性であるプロモーターの一例は、ＲＮＡポ
リメラーゼIII によって転写されかつその遺伝子生成物
がｍＲＮＡのスプライシングに本質的に関与しているＵ
６遺伝子に対するプロモーターである。

【００６６】本発明によれば、突然変異したＴＡＴＡボ
ックスに依存するプロモーター（成分a)）は、構造遺伝
子（成分b)）の５′末端の上流に位置している。このよ
うな突然変異の一例はＴＧＴＡＡＡであることができ
る。この突然変異の結果、通常のＴＢＰのＤＮＡ結合部
位は最早認識されず、構造遺伝子(b) は最早効率的に転
写されない。この種の突然変異の場合には、成分d)は、
交換したＴＢＰをコードする核酸配列である。この交換
の結果、ＴＢＰは成分a)中の交換したＴＡＴＡボックス
（例えば、ＴＧＴＡＡＡ）に結合するので、構造遺伝子
（成分b)）が効率的に転写される。ＴＢＰ遺伝子のこの
ような交換は、例えばStrubin and Struhl(Cell 68, 72
1 (1992))およびHeard et al. (EMBO J. 12, 3519 (199
3))によって報告されている。

【００６７】もう一つの好ましい態様では、核保持シグ
ナル（ＮＲＳ）(h) および適当な場合には核輸出シグナ
ルを新規な核酸構築物に加える。新規な核酸構築物にお
ける個々の成分の配置を、図５にスキームF)およびG)に
示す。

【００６８】もう一つの好ましい態様では、スキームF)
およびG)に示される核酸構築物を互いに結合させる。こ
の方法で結合することによって、別のプロモーター（プ
ロモーターIV、成分e)）を包含することができる。この
組み合わせにおける個々の成分の配置を、例えば図６の
スキームH)に示す。

【００６９】核保持シグナルは、核膜を介して結合して
いるが、一方で核輸出因子と呼ばれる輸出タンパク質と
結合する構造を有しているプレメッセンジャーＲＮＡの
輸送を妨げるヌクレオチド配列である。この核輸出因子
（ＮＥＦ）は、細胞核から細胞質へのプレメッセンジャ
ーまたはメッセンジャーＲＮＡを含むＮＲＳの輸送を媒
介している。従って、ＮＲＳを含むプレメッセンジャー
またはメッセンジャーＲＮＡは、ＮＥＦに結合すること
によって細胞核から分泌される（Fischer et al., Cell
82, 475 (1995) ）。

【００７０】ＮＲＳ（成分h)）は、レトロウイルスのｒ
ｅｖ応答要素（ＲＲＥ）配列であるのが好ましい。ＨＩ
Ｖ−１の場合には、このＲＲＥは、ｅｎｖ遺伝子（Mali
m etal., Nature 338, 254 (1989); Kjems et al., PNA
S 88, 683 (1991) ）における２４３個のヌクレオチド
を包含する配列（ヌクレオチド７３６２〜７５９５；Mu
esing et al., Nature 313, 450 (1985)）である。しか
しながら、本発明の意味においては、核保持シグナル
（ＮＲＳ）は、例えばＨＢＶウイルス中のＲＲＥと同等
な要素のような任意の相同性および／または機能的に同
様な（類似の）ヌクレオチド配列であることもできる(H
uang et al., Mol Cell Biol. 13, 7476 (1993))。

【００７１】新規な核酸構築物では、核輸出因子（ＮＥ
Ｆ、成分k)）は、ＮＲＳのｍＲＮＡに結合し、ＮＲＳを
含むプレメッセンジャーＲＮＡまたはメッセンジャーＲ
ＮＡの細胞核から細胞質への（または細胞質から細胞核
への）輸送を媒介するヌクレオチド配列である。本発明
に関しては、レトロウイルス由来の、特にＨＩＶ−１ウ
イルスまたはＨＩＶ−２ウイルス由来のｒｅｖ遺伝子が
特に用いられる（Dayet al., Nature 342, 816 (1989);
Emerman et al., Cell 57, 1155 (1989); Felber et a
l., PNAS 86, 1495 (1989); Fischer et al., EMBO J.
13, 4105 (1994)) 。

【００７２】レトロウイルスのｒｅｖ遺伝子のｒｅｖタ
ンパク質はそのＮ末端ドメイン（Zapp et al., Nature
342, 714 (1989); Malim et al., Cell 65, 241 (199
1)）によってプレ−ｍＲＮＡのＲＲＥに結合する（Iwai
et al., Nucl. Acids Res. 20, 6465 (1992) ）。ＲＲ
Ｅとｒｅｖタンパク質との間の結合により、スプライシ
ングされていないプレメッセンジャーＲＮＡ、およびＲ
ＲＥを含む任意の他のＲＮＡを細胞核から細胞質へ輸送
することができ（Fischer et al., EMBO J. 13,4105 (1
994); Fischer et al., Cell 82, 475 (1995)）、従っ
て翻訳が実質的に増加する。

【００７３】本発明に関しては、ビスナ−マエディウイ
ルス（VMV; Tiley et al., J. Virol. 65, 3877 (199
1)）ｒｅｖ遺伝子またはヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAE
V; Tiley et al., J. Virol. 65, 3877 (1991) ）ｒｅ
ｖ遺伝子のようなＨＩＶ−１ｒｅｖタンパク質（Bogerd
et al., Cell 82, 485 (1995)）に相同性でありかつ機
能的に類似しているタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列をＮＥＦとして用いることもできる。

【００７４】しかしながら、本発明に関しては、ｒｅｖ
タンパク質と相似性が僅かであるかまたはまったく相似
性でないが、ＨＩＶ−１ｒｅｖタンパク質と機能的に類
似しているタンパク質をコードする遺伝子を用いること
もできる。

【００７５】これらの遺伝子の例は、ＨＴＬＶ−１ｒｅ
ｘ遺伝子（Cullen, Microbiol. Rev. 56, 375 (199
2)）、ウマの感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ｒｅｖ遺
伝子およびネコの免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）ｒｅｖ
遺伝子（Manusco et al., J. Virol. 68, 1988 (1994)
）である。

【００７６】もう一つの態様では、ＮＥＦは、ＲＮＡが
ＮＲＳによって核に保持されていることがなくともこの
ＲＮＡを核を分泌するタンパク質のヌクレオチド配列で
あることもできる。このようなタンパク質の例は、転写
因子ＴＦＩＩＩＡ（Gaddat et al., Cell 60, 619 (199
0); Drew et al., Gene 159, 215 (1995) ）、またはヘ
テロ核リボ核タンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰＡ１−タンパ
ク質；Pinol-Roma etal., Nature 355, 730 (1992))で
ある。

【００７７】広義には、核輸送タンパク質は、ヒート・
ショック・タンパク質７０（ｈｓｃ７０；Mandell et a
l., J. Cell Biol. 111, 1775 (1990)）およびタンパク
質キナーゼ阻害剤ＣＰＫＩ(Fantozzi et al., J. Biol.
Chem. 269, 2676 (1994), Wen et al., J. Biol. Che
m. 269, 32214 (1994))も包含する。

【００７８】ＮＥＦおよびその相同および類似タンパク
質が共通に有する特徴は、アミノ末端方向に位置してお
り、モノマー性タンパク質をＮＲＳのＲＡに結合するた
めのドメイン(J. Virol 64, 881 (1990); Kjems et a
l., EMBO J. 11, 1119 (1992))、および大部分はロイシ
ン含量が高く（ｈｎＲＮＰＡ１はこの例外である）かつ
ＮＥＦ輸送機能に必要なドメイン(Wen et al., Cell 8
2, 463 (1995); Fischeret al., Cell 82, 475 (1995);
Malim et al., J. Virol. 65, 4248 (1991); Venkates
h et al., Virol. 178, 327 (1990)) である。

【００７９】ＮＥＦ遺伝子（成分k)）の発現は、ＮＥＦ
遺伝子の５′末端の上流に位置するプロモーター配列
（成分i)＝プロモーターおよびエンハンサー配列III ）
によって制御することができる。

【００８０】プロモーターおよびエンハンサー配列Ｉお
よびII（成分a)およびc)について既に記載されている核
酸配列の１つは、本発明によるプロモーターおよびエン
ハンサー配列III またはIVとして選択することができる
（図６のスキームＨを参照されたい）。

【００８１】核酸構築物は、ＤＮＡからなるのが好まし
い。「核酸構築物」という用語は、標的細胞中で転写す
ることができる人工的核酸構造を意味するものと理解さ
れる。それらは、好ましくはベクター中に、特に好まし
くは非ウイルスベクター、プラスミドベクターまたはウ
イルスベクターに挿入される。これらのベクターを薬学
上許容可能な担体と混合して、遺伝子治療に用いられる
医薬組成物を製造する。薬学上許容可能な担体は、当業
者には周知であり、核酸構築物を含むベクターの最適投
与量は、通常の手法を用いて容易に決定することができ
る。次に、医薬組成物を、疾患の予防または治療の目的
で患者に局所投与し、または静脈内、動脈内、体腔内、
臓器内または皮下に注射または投与する。腫瘍の治療の
場合には、医薬組成物を腫瘍に直接注射する。しかしな
がら、カテーテルに基づく遺伝子送出のような、適当な
担体を用いる他の既知の投与法を用いることもできる。

【００８２】「治療」という用語は、それが本発明の核
酸構築物を含むベクターを患者に投与することに関する
ので、疾患の予防および回復を目的として患者への投与
を包含するものと理解される。これらのベクターは、過
度の細胞増殖を伴う疾患に特に有用である。

【００８３】新規な核酸構築物は、細胞特異的にまたは
ウイルス特異的にまたは一定の代謝条件下でまたはテト
ラサイクリンに暴露した後に、および細胞サイクル特異
的にも、トランス遺伝子（成分b)）を発現させるのに用
いることができ、構造遺伝子は薬理活性化合物をコード
する遺伝子であるか、または薬剤の不活性な前駆物質を
開裂して活性薬剤を形成する酵素であるのが好ましい。
構造遺伝子は、この薬理活性化合物またはこの酵素を融
合タンパク質としてのリガンドと共に発現し、このリガ
ンドが細胞、例えば増殖する内皮細胞または腫瘍細胞の
表面に結合するように選択することができる。

【００８４】本発明は、新規な核酸構築物を有する酵母
細胞または哺乳動物細胞にも関する。特に好ましい態様
では、核酸構築物を細胞系に導入し、次いでトランスフ
ェクションの後にトランス遺伝子を発現するのに用いる
ことができる。従って、これらの細胞は、患者に対する
医薬を製造するのに用い、疾患の予防または治療の目的
で患者に局所投与または注射することもできる。

【００８５】新規な核酸構築物は、天然にはこの形態で
は存在せず、すなわち活性化合物に対するまたは酵素に
対するまたはリガンド／酵素融合タンパク質に対するト
ランス遺伝子または構造遺伝子は天然では突然変異せ
ず、かつ天然ではこの突然変異を緩和する核酸配列と結
合せず、またこれは天然では核保持シグナル（ＮＲＳ）
と結合せず、２種類の配列は天然ではプロモーターI(a)
およびプロモーターII(c) と連結せず、この組み合わせ
は、また天然ではプロモーターIII および核輸出因子
（ＮＥＦ）からなるヌクレオチド配列と結合しない。

【００８６】プロモーターＩ、II、III およびIV、およ
び新規な核酸構築物の活性化合物に対する（または酵素
に対する）構造遺伝子は、用途によって選択される。

【００８７】核酸構築物の使用方法に従って、下記の態
様を選択することができる。

【００８８】1. 増殖する内皮を阻害することによる
腫瘍および慢性炎症の治療 1.1.a) 内皮細胞で活性化されるプロモーターまたはア
クチベーター配列の選択 本発明に関しては、プロモーターまたはエンハンサーか
らなる好ましいプロモーターまたはアクチベーター配列
としては、特に内皮細胞（または増殖する内皮細胞の隣
接する細胞）で検出することができるタンパク質をコー
ドする遺伝子制御配列および／または遺伝子の要素が挙
げられる。

【００８９】これらのタンパク質の幾つかは、Borrows
et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994))およびPlate
et al. (Brain Pathol. 4, 207 (1994))によって報告さ
れている。これらの内皮細胞に特異的なタンパク質の具
体例は、下記の通りである。脳特異的な内皮グルコース−１−輸送物質 プロモーター配列は、Murakami et al. (J. Biol. Che
m. 267, 9300 (1992)) によって報告された。エンドグリン プロモーター配列の一部は、Bellon et al. (Eur. J. I
mmunol. 23, 2340(1993))およびGe et al. (Gene 138,
201 (1994))によって報告された。ＶＥＧＦレセプター ２種類の異なるレセプターが認められている(Plate et
al., Int. J. Cancer, 59, 520 (1994)): ＶＥＧＦレセプター−１（ｆｌｔ−１） （de Vries et al., Science 255, 989 (1992); Wakiya
et al. J. Vascul. Res. 33, 105 (1996)) 、および ＶＥＧＦレセプター−２（ｆｌｋ−１，ＫＤＲ） (Terman et al., BBRC 187, 1579 (1992))。 いずれのレセプターも内皮細胞上に極めて例外的に見い
だされている(Sengeret al., Cancer Metast. Rev. 12,
303 (1993)) 。他の内皮細胞特異的レセプターチロシンキナーゼ ｔｉｌ−１またはｔｉｌ−２ (Partanen et al., Mol. Cell. Biol. 12, 1698 (199
2), Schnuerch and Risau, Development 119, 957 (199
3), Dumont et al., Oncogene 7,1471 (1992)) Ｂ６１レセプター（Ｅｃｋレセプター） (Bartley et al., Nature 368, 558 (1994), Pandey et
al., Science268,567 (1995), van der Geer et al.,
Ann. Rev. Cell. Biol. 10,251 (1994))Ｂ６１ Ｂ６１分子は、Ｂ６１レセプターに対するリガンドであ
る。(Holzman et al., J. Am. Soc. Nephrol. 4, 466
(1993), Bartley et al., Nature 368, 558 (1994))エンドセリン エンドセリンＢ プロモーター配列は、Benatti et al., J. Clin. Inves
t. 91, 1149 (1993)によって報告された。 エンドセリン−１ プロモーター配列は、Wilson et al., Mol. Cell. Bio
l. 10, 4654(1994) によって報告された。エンドセリンレセプター 特に、エンドセリンＢレセプター (Webb et al., Mol. Pharmacol. 47,730 (1995), Haend
ler et al., J.Cardiovasc. Pharm. 20, 1 (1992))マンノース−６−ホスフェートレセプター プロモーター配列は、Ludwig et al. (Gene 142, 311
(19949), Oshimaet al. (J. Biol. Chem. 263, 2553 (1
988)およびPohlmann et al. (PNASUSA 84, 5575 (198
7))に記載されている。von Willebrand因子 プロモーター配列は、Jahroudi and Lynch (Mol. Cell.
Biol. 14, 999(1994))、Ferreira et al. (Biochem.
J. 293, 641 (1993)) およびAirdet al. (PNAS USA 92,
4567 (1995))に記載された。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β プロモーター配列は、Hangen et al., Mol. Carinog.
2, 68 (1986), Turner et al., J. Immunol. 143, 3556
(1989), Fenton et al., J. Immunol. 138, 3972 (198
7), Bensi et al., Cell Growth Diff. 1, 491 (1990),
Hiscott et al., Mol. Cell. Biol. 13, 6231 (1993)
およびMori et al., Blood 84, 1688 (1994)に記載され
た。ＩＬ−１レセプター プロモーター配列は、Ye et al., PNAS USA 90, 2295
(1993) に記載された。 血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１） ＶＣＡＭ−１のプロモーター配列は、Neish et al., Mo
l. Cell. Biol.15, 2558 (1995), Ahmad et al., J. Bi
ol. Chem. 270, 8976 (1995), Neish et al., J. Exp.
Med. 176, 1583 (1992), Jademarco et al., J. Biol.
Chem. 267, 16323 (1992), およびCybulsky et al., PN
AS USA 88,7859 (1991) に記載された。合成アクチベーター配列 天然の内皮特異的プロモーターの代替品として、内皮細
胞で優先的にまたは選択的に活性を有する転写因子のオ
リゴマー化した結合部位を含んでいる合成アクチベータ
ー配列を使用することもできる。このような転写因子の
一例は転写因子ＧＡＴＡ−２であり、内皮−１遺伝子の
結合部位は５′−ＴＴＡＴＣＴ−３′である(Lee et a
l., Biol. Chem. 266, 16188 (1991), Dorfmann et a
l., J. Biol. Chem. 267, 1279 (1992)およびWilsonet
al., Mol. Cell Biol. 10, 4854 (1990)) 。

【００９０】1.1.b) 活性化した内皮細胞の近傍におけ
る細胞で活性化されるプロモーターまたはアクチベータ
ー配列の選択 内皮細胞が増殖しているとき、隣接する細胞は、密着結
合を開くことによって血液由来のマクロ分子となり易
い。機能的および解剖学的相互関係の結果、活性化した
内皮細胞に隣接する細胞は、本発明の意味における標的
細胞である。ＶＥＧＦ ＶＥＧＦ遺伝子の遺伝子制御配列は、下記の通りであ
る。 ＶＥＧＦ遺伝子のプロモーター配列（５′フランキング
領域） (Michenko et al., Cell. Mol. Biol. Res. 40, 35 (19
94), Tischeret al., J. Biol. Chem. 266, 11947 (199
1))、または ＶＥＧＦ遺伝子のエンハンサー配列（３′フランキング
領域） (Michenko et al., Cell. Mol. Biol. Res. 40, 35 (19
94))、または ｃ−Ｓｒｃ遺伝子 (Mukhopadhyay et al., Nature 375, 577 (1995), Bonh
am et al., Oncogene 8, 1973 (1993), Parker et al.,
Mol. Cell. Biol. 5, 831 (1985), Anderson et al.,
Mol. Cell. Biol. 5, 112 (1985)) 、または ｖ−Ｓｒｃ遺伝子 (Mukhopadhyay et al., Nature 375, 577 (1995), Ande
rson et al.,Mol. Cell. Biol. 5, 112 (1985), Gibbs
et al., J. Virol. 53, 19(1985))ステロイドホルモンレセプターおよびそれらのプロモー
ター要素（Truss and Beato, Endocr. Rev. 14, 459 (19
93)) 特に、マウス哺乳動物腫瘍ウイルスプロモーター ＭＭＴＶの長末端反復領域のプロモーター領域のｃＤＮ
Ａ配列は、Chalepakis et al., Cell 53, 371 (1988)お
よびTruss and Beato (Endocr.Rev. 14, 459 (1993)に
記載されている。

【００９１】1.2. 抗腫瘍（または抗炎症）物質の構造
遺伝子 1.2.a) 増殖の抑制剤 本発明において、抗腫瘍または抗炎症物質は、内皮細胞
の増殖を抑制するタンパク質のＤＮＡ配列であると理解
すべきである。これらのＤＮＡ配列の例は、網膜芽細胞
腫（ｐＲｂ／ｐ１１０）またはその類似体ｐ１０７およ
び１２０、ｐ５３タンパク質、ｐ２１（ＷＡＦ−１）タ
ンパク質、ｐ１６タンパク質、他のＣｄＫ阻害剤、ＧＡ
ＤＤ４５タンパク質、ｂａｋタンパク質のＤＮＡ配列で
ある。

【００９２】これらの細胞サイクル抑制剤の速やかな細
胞内不活性化を防止するには、発現したタンパク質の機
能を損なうことなくこれらのタンパク質の不活性化部位
に突然変異を示す遺伝子を用いるのが好ましい。

【００９３】網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）および
関連のｐ１０７およびｐ１３０タンパク質は、リン酸化
によって不活性化される。従って、点突然変異を生じる
ｐＲｂ／ｐ１１０、ｐ１０７またはｐ１３０ｃＤＮＡ配
列を用いて、コードされるタンパク質のリン酸化部位を
リン酸化されないアミノ酸で置換するのが好ましい。

【００９４】抗腫瘍または抗炎症物質も、凝集を誘発す
るおよび／または脈管形成を阻害するタンパク質のＤＮ
Ａ配列であると理解すべきである。これらのタンパク質
の例は、下記の通りである。 組織因子（ＴＦ）およびその凝集活性を有する断片 (Morrissey et al., Cell 50, 129 (1987), Scarpati e
t al., Biochem. 26, 5234 (1987), Spicer et al., PN
AS USA 84, 5148 (1987), Rehemtullaet al., Thromb.
Heamost. 65, 521 (1991)) プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−
１） ＰＡＩ−２ ＰＡＩ−３ アンギオスタチンおよび同様な脈管形成防止ペプチド (O'Reilly et al., Nature Med. 2, 689 (1996); Folkm
an et al., New Engl. J. Med. 26, 1757 (1995)) インターフェロン ＩＦＮα ＩＦＮβ ＩＦＮγ トロンボスポンディン ＴＮＦα 血小板因子４ ＩＬ−１２ ＴＩＭＰ−１ ＴＩＭＰ−２ ＴＩＭＰ−３ 白血病阻害因子（ＬＩＦ）

【００９５】1.2.c) 細胞増殖抑制および細胞毒性タン
パク質 しかしながら、抗腫瘍性または抗炎症性物質も、腫瘍に
対して直接または間接的に細胞増殖抑制作用を示すタン
パク質のＤＮＡ配列であると理解すべきである。これら
のタンパク質としては、特に下記のものが挙げられる。 抗体および抗体開裂生成物 パーフォリン グランチーム ＩＬ−２ ＩＬ−４ ＩＬ−１２ インターフェロン、例えば ＩＦＮα ＩＦＮβ ＩＦＮγ ＴＮＦ ＴＮＦα ＴＮＦβ オンコスタチンＭ スフィンゴミエリナーゼ (Jarvis et al., PNAS USA 91, 73 (1994)) マガイニンおよびマガイニン誘導体 (Cruciani et al., PNAS 88, 3792 (1991); Jacob et a
l., Ciba Found. Symp. 186, 197 (1994); Peck-Miller
et al., Cancer Chemother. Pharmac.32, 109 (1993))

【００９６】1.2.d) 炎症誘導物質 抗腫瘍性物質も、抗腫瘍作用の他に、炎症の刺激も行う
ことによって腫瘍細胞を除去するのを助けるタンパク質
のＤＮＡ配列と理解すべきである。これらのタンパク質
の例は、下記の通りである。 ＲＡＮＴＥＳ（ＭＣＰ−２） 単球走化性およびアクチベーター因子（ＭＣＡＦ） ＩＬ−８ マクロファージ炎症性タンパク質−１（ＭＩＰ−１αお
よび−β） 好中球活性化タンパク質−２（ＮＡＰ−２） ＩＬ−３ ＩＬ−４ ＩＬ−５ ヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ） ＩＬ−７ ＩＬ−１１ ＩＬ−１３ ＧＭ−ＣＳＦ Ｇ−ＣＳＦ Ｍ−ＣＳＦ コブラ毒因子（ＣＶＦ）またはＣＶＦの部分配列であっ
て、機能的にはヒト補体因子Ｃ３ｂに相当し、すなわち
補体因子Ｂに結合することができ、因子Ｄで開裂した
後、Ｃ３コンバターゼを構成するもの。ＣＶＦのＤＮＡ
配列およびその部分配列は、Frikinger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91,12775 (1994) によって公表
されている。ヒト補体因子Ｃ３およびその部分配列Ｃ３
ｂ。Ｃ３のＤＮＡ配列およびその部分配列は、De Bruij
n et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 708 (198
5) によって公表されている。この種の開裂生成物は、O
'Keffe et al., J.Biol. Chem. 263, 12690 (1988)によ
って記載されている。Slmonella typhimurium ポーリン
(Galdiero et al., Infection and Immunity 46, 55 (1
994)) 、Staphylococcus arreus クランピング因子(Esp
ersenActa Path. Microb. Et Imm. Scandin. Sect C 9
3, 59 (1985)) 、モジュリン、特にグラム陰性菌のモジ
ュリン(Henderson et al., Inflam. Res. 44,187 (199
5)) 、llegionellas(Bellinger-Kawahara et al., J. E
xp. Med.172, 1201 (1990))またはHaemophillus influe
nzaＢ型(Hetherington et al., Infection and Immunit
y 60, 19 (1992)) またはklebsiellas(Albertiet al.,
Infection and Immunity 61, 852 (1992))由来の主要な
外膜タンパク質、または群Ｇのストレプトコッカス由来
のＭ分子(Campo et al., J. Infect. Dis. 171, 601 (1
995)) のような補体を活性化しまたは炎症を引起こす細
菌性タンパク質。

【００９７】一方で上記サイトカインまたは成長因子
と、他方で細胞膜上のレセプターのリガンド（例えば、
内皮細胞または腫瘍細胞、またはヒト免疫グロブリンの
Ｆｃ部分に特異的な抗体）との間に形成される融合タン
パク質のＤＮＡ配列を、本発明に関する活性物質として
用いることもできる。この種のＤＮＡ配列およびその製
造は、例えばＥＰＡ０４６４ ６３３ Ａ１号明細書に
記載されている。

【００９８】1.2.e) 細胞増殖抑制剤の前駆物質を活性
化するための酵素 しかしながら、抗腫瘍性または抗炎症性物質は、抗腫瘍
活性を有する化合物の前駆物質を抗腫瘍活性を有する化
合物へ転換することができる酵素のＤＮＡ配列であると
も理解すべきである。

【００９９】不活性な前駆物質（プロドラッグ）を開裂
することによって活性な細胞増殖抑制剤（ドラッグ）を
形成するこの種の酵素、およびそれぞれの場合に関連し
ているプロドラッグおよびドラッグは、Deonarain et a
l. (Br. J. Cancer 70, 786(1994)) 、Mullen, Pharma
c. Ther. 63, 199 (1994) 、およびHarris et al. (Gen
e Ther. 1, 170 (1994))によって既に概説されている。

【０１００】例えば、下記の酵素の１つのＤＮＡ配列が
用いられる。 単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ (Garapain et al., PNAS USA 76, 3755 (1979), Vile e
t al., Cancer Res.53, 3860 (1993), Wagner et al.,
PNAS USA 78, 1441 (1981), Moelten et al., Cancer R
es. 46, 5276 (1986), J. Natl. Cancer Inst. 82, 297
(1990)) 水痘状帯状ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ (Huber et al., PNAS USA 88, 8039 (1991), Snoeck, I
nt. J. Antimicrob.Agents 4, 211 (1994)) 細菌性ニトリロレダクターゼ (Michael et al., FEMS Microbiol. Letters 125, 195
(1994), Bryant etal., J. Biol. Chem. 266, 4126 (19
91), Watanabe et al., Nucleic AcidsRes. 18, 1059
(1990)) 細菌性β−グルクロニダーゼ (Jefferson et al., PNAS USA 83, 8447 (1986)) Secale cereale由来の植物β−グルクロニダーゼ (Schluz et al., Phytochemistry 26, 933 (1987)) ヒトβ−グルクロニダーゼ (Bossler et al., Br. J. Cancer 65, 234 (1992), Osh
ima et al., PNAS USA 84, 685 (1987)) ヒトカルボキシペプチダーゼ（ＣＢ）、例えば 肥満細胞ＣＢ−Ａ (Reynolds et al., J. Clin. Invest. 89, 273 (1992)) 膵臓ＣＢ−Ｂ (Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 267, 2575 (1992),
Catasus et al.,J. Biol. Chem. 270, 6651 (1995)) 細菌性カルボキシペプチダーゼ (Hamilton et al., J. Bacteriol. 174, 1626 (1992),
Osterman et al.,J. Protein Chem. 11, 561 (1992)) 細菌性β−ラクタマーゼ (Rodrigues et al., Cancer Res. 55, 63 (1995), Huss
ain et al., J. Bacteriol. 164, 223 (1985), Coque e
t al., EMBO J. 12, 631 (1993)) 細菌性シトシンデアミナーゼ (Mullen et al., PNAS USA 89, 33 (1992), Austin et
al., Mol. Pharmac.43, 380 (1993), Danielson et a
l., Mol. Microbiol. 6, 1335 (1992)) ヒトカタラーゼまたはペルオキシダーゼ (Ezurum et al., Nucl. Acids Res. 21, 1607 (1993)) ホスファターゼ、特にヒトアルカリホスファターゼ (Gum et al., Cancer Res. 50, 1085 (1990)) ヒト酸性前立腺ホスファターゼ (Sharieff et al., Am. J. Hum. Gen. 49, 412 (1991),
Song et al., Gene 129, 291 (1993), Tailer et al.,
Nucl. Acids Res. 18, 4928 (1990)) ５型酸性ホスファターゼ (Gene 130, 201 (1993)) オキシダーゼ、特にヒトリシルオキシダーゼ (Kimi et al., J. Biol. Chem. 270, 7176 (1995)) ヒト酸性Ｄ−アミノオキシダーゼ (Fukui et al., J. Biol. Chem. 267, 18631 (1992)) ペルオキシダーゼ、特にヒトグルタチオンペルオキシダ
ーゼ (Chada et al., Genomics 6, 268 (1990), Ishida et a
l., Nucl. AcidsRes. 15, 10051 (1987)) ヒト好酸球ペルオキシダーゼ (Ten et al., J. Exp. Med. 169, 1757 (1989), Sahama
ki et al., J. Biol. Chem. 264, 16828 (1989)) ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ (Kimura et al., PNAS USA 84, 5555 (1987)) ガラクトシダーゼ

【０１０１】上記の酵素の分泌を促進するため、それぞ
れの場合にＤＮＡ配列に含まれる相同シグナル配列を、
細胞外分泌を改善する異種シグナル配列で置換すること
ができる。

【０１０２】従って、β−グルクロニダーゼのシグナル
配列（ＤＮＡ位置≦２７〜９３；Oshima et al., PNAS
84, 685 (1987)) を、例えば免疫グロブリンのシグナル
配列（ＤＮＡ位置≦６３〜≧１０７；Riechmann et a
l., Nature 332, 323 (1988))で、またはＣＥＡのシグ
ナル配列（ＤＮＡ位置≦３３〜≧１３４；Schrewe et a
l., Mol. Cell. Biol. 10, 2738 (1990), Berling et a
l., Cancer Res. 50, 6534 (1990))で、またはヒト呼吸
器シンシチウムウイルス糖タンパク質のシグナル配列
（アミノ酸のｃＤＮＡ≦３８〜≧５０または４８〜６
５；Lichtenstein etal., J. General Virol. 77, 109
(1996))で置換することができる。

【０１０３】また、点突然変異の結果、リソソームでご
く僅かしか保存されず、分泌される割合が増加する酵素
のＤＮＡを選択するのが好ましい。この種の点突然変異
は、例えばβ−グルクロニダーゼについて記載されてい
る(Shiplex et al., J. Biol. Chem. 268, 12193 (199
3))。

【０１０４】トランスメンブレンドメインに対する配列
を、代わりにまたは更に、シグナル配列に導入して、酵
素形成細胞の細胞膜に酵素を固定することができる。

【０１０５】従って、ヒトマクロファージコロニー刺激
因子のトランスメンブレン配列（ＤＮＡ位置≦１４８５
〜≧１５５４；Cosman et al., Behring Inst. Mitt. 8
3, 15 (1988)) 、またはヒト呼吸器多核体ウイルス（Ｒ
ＳＶ）糖タンパク質Ｇのシグナルおよびトランスメンブ
レン領域に対するＤＮＡ配列（アミノ酸１〜６３または
その部分配列、アミノ酸３８〜６３；Vijaya et al., M
ol. Cell Biol. 8, 1709 (1988), Lichtenstein et a
l., J. General Virol. 77, 109 (1996)) 、またはイン
フルエンザウイルスノイラミニダーゼのシグナルおよび
トランスメンブレン領域に対するＤＮＡ配列（アミノ酸
７〜３５または部分配列アミノ酸７〜２７；Brown et a
l., J. Virol. 62, 3824 (1988))を、プロモーターのＤ
ＮＡ配列と、酵素（例えば、β−グルクロニダーゼ）の
ＤＮＡ配列との間に挿入することができる。

【０１０６】翻訳を増幅するため、ヌクレオチド配列Ｇ
ＣＣＡＣＣまたはＧＣＣＧＣＣをプロモーターの３′末
端であって、シグナルまたはトランスメンブラン配列の
介しシグナル（ＡＴＧ）の５′末端の直前に挿入するこ
とができる(Kozak, J. Cell.Biol. 108, 299 (1989))
。

【０１０７】しかしながら、糖リン脂質アンカーのヌク
レオチド配列を挿入して、酵素形成細胞の細胞膜に酵素
を固定することもできる。

【０１０８】糖リン脂質は酵素に対するヌクレオチド配
列の３′末端に挿入され、この挿入はシグナル配列の挿
入の他に行うことができる。

【０１０９】糖リン脂質アンカーは、例えばＣＥＡ（Ｄ
ＮＡ位置≦８９３〜≧１０７９；Berling et al., Canc
er Res. 50, 6534 (1990))、Ｎ−ＣＡＭ(Cunningham et
al., Science 236, 799 (1987))について、およびＴｈ
ｙ−１(Clissold, Biochem.J. 281, 129 (1992)) また
はＣＤ１６(Selvaray et al., Nature 333, 565 (198
8)) のような他の膜タンパク質について記載されてい
る。

【０１１０】Ferguson et al. (Ann. Rev. Biochem. 5
7, 285 (1988)) は、糖リン脂質で固定した膜タンパク
質の総説を公表している。

【０１１１】本発明による細胞膜に酵素を固定するもう
一つの方法は、リガンド−酵素融合タンパク質に対する
ＤＮＡ配列を用いることである。この融合タンパク質の
リガンドの特異性は、増殖している内皮細胞または腫瘍
細胞の細胞膜上に存在する膜構造に対するものである。

【０１１２】増殖している内皮細胞の表面に結合するリ
ガンドとしては、例えばBurrows etal. (Pharmac. The
r. 64, 155 (1994))、Hughes et al. (Cancer Res. 49,
6214 (1989)) 、およびMaruyama et al. (PNAS USA 8
7, 5744 (1990))によって報告されている、例えば内皮
細胞の膜構造に対する抗体または抗体断片が挙げられ
る。それらは、特にＶＥＧＦレセプターに対する抗体が
挙げられる。

【０１１３】ネズミのモノクローン性抗体を、人体に適
応した形態で用いるようにするのが好ましい。人体適応
は、Winter et al. (Nature 349, 293 (1991))およびHo
ogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36,
19 (1993)) によって記載された方法で行う。抗体断片
は、当該技術の状態に従って、例えばWinter et al.(Na
ture 349, 293 (1991))、Hoogenbooms et al. (Rev. T
r. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) 、Girol, Mo
l. Immunol. 28, 1379 (1991)) またはHuston et al.
(Intern. Rev. Immunol. 10, 195 (1993))によって記載
された方法で製造する。

【０１１４】リガンドとしては、更に膜構造または内皮
細胞上の膜レセプターに結合する総ての活性化合物が挙
げられる。これらの活性化合物としては、例えば末端マ
ンノースを含む物質、およびＩＬ−１または成長因子ま
たはそれらの断片、またはそれらの部分配列であって、
内皮細胞によって発現されるレセプターに結合するも
の、例えばＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＧβ(P
usztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)) 、また
はキニンおよびキニンの誘導体または類似体が挙げられ
る。更に、それらには、活性化したおよび／または増殖
している内皮細胞に結合する接着分子が挙げられる。Ｓ
ｌｅｘ、ＬＦＡ−１、ＭＡＣ−１、ＬｅＣＡＭ−１、Ｖ
ＬＡ−４またはビトロネクチンおよびビトロネクチンの
誘導体および類似体のようなこの種の接着分子は、既に
記載されている（Augustin-Voss etal., J. Cell. Bio
l. 119, 483 (1992)、Pauli et al., Cancer Metast. R
ev.9, 175 (1990) 、Honn et al., Cancer Metast. Re
v. 11, 353 (1992) 、Varneret al., Cell Adhesion an
d Commun. 3, 367 (1995)) の総説）。

【０１１５】しかしながら、リガンドとしては、腫瘍細
胞膜上の腫瘍特異性または腫瘍結合抗原に対する抗体ま
たはそれらの断片も挙げられる。

【０１１６】この種の抗原および関連抗体の例は、Sedl
acek et al., Contrib. Oncol. 32(1988)およびContri
b. Oncol. 43 (1992) に示されている。抗体−酵素融合
タンパク質は、例えばBosslet et al., Br. J. Cancer
65, 234 (1992)によって記載されている。引用されたリ
ガンド／酵素融合タンパク質の分泌を促進するため、そ
れぞれの場合に酵素のＤＮＡ配列に含まれる相同シグナ
ル配列を、既述のように、細胞外分泌を向上させる異種
シグナル配列で置換することができる。

【０１１７】1.3. 数種類の抗腫瘍または抗炎症性物質
の組み合わせ 本発明は、数種類の同一の抗腫瘍性または抗炎症性物質
（Ａ，Ａ）または異なる好腫瘍性物質（Ａ，Ｂ）のＤＮ
Ａ配列の組み合わせを含む核酸構築物にも関する。２種
類のＤＮＡ配列を発現させるため、内部リボソームエン
トリー部位（internal ribosome entry site：ＩＲＥ
Ｓ）のｃＤＮＡを制御要素として挿入するのが好ましい
（図７を参照されたい）。

【０１１８】この種のＩＲＥＳは、例えばMountford an
d Smith (TIG 11, 179 (1995))、Kaufman et al., Nuc
l. Acids Res. 19, 4485 (1991)、Morgan et al., Nuc
l. Acids Res. 20, 1293 (1992) 、Dirks et al., Gene
128, 247 (1993)、Pelletierand Sonenberg, Nature 3
34, 320 (1988) 、およびSugimoto et al., BioTechn.1
2, 694 (1994) によって記載されている。

【０１１９】従って、ポリオウイルスのＩＲＥＳ配列の
ｃＤＮＡ（位置≦１４０〜≧６３０、５′ＵＴＲ；Pell
etier and Sonenberg, Nature 334, 320 (1988))を用い
て、抗炎症性物質ＡのＤＮＡ（３′末端）と抗炎症性物
質ＢのＤＮＡ（５′末端）とを連結することができる。

【０１２０】組み合わせによっては、この種の活性化合
物は、本発明に関して相加（Ａ＋Ａ，Ａ＋Ｂ１）または
相乗効果を有する。

【０１２１】2. 血液細胞の血管形成を緩和するための
活性化合物 2.1. 造血細胞のプロモーターまたはアクチベーター配
列の選択 本発明に関して、遺伝子制御配列、または遺伝子の要素
であって、造血細胞で特に強力にまたは選択的に発現す
るタンパク質をコードするものは、プロモーターまたは
エンハンサーからなるプロモーターまたはアクチベータ
ー配列として好ましく用いられる。これらの遺伝子制御
配列としては、サイトカインの遺伝子に対するプロモー
ター配列またはそのレセプターであって、未成熟造血細
胞での（または支質のような隣接細胞での）発現が起こ
った後、活性化合物として望ましくかつ造血細胞に作用
する次のサイトカインの発現が起こるものが挙げられ
る。未成熟造血細胞に作用するこの種のサイトカインの
例は、下記の通りである。 幹細胞因子 ＩＬ−１ ＩＬ−３ ＩＬ−６ ＧＭ−ＣＳＦ

【０１２２】2.2. 造血細胞の活性物質に対する構造遺
伝子の選択 本発明に関して、活性物質は、発現したタンパク質が血
液細胞の増殖および／または分化を生じるＤＮＡ配列で
あると理解すべきである。

【０１２３】3. 自己免疫疾患、アレルギーおよび炎症
の治療用および臓器移植拒絶反応の防止のための活性化
合物 3.1. 特に自己免疫疾患に対するプロモーターまたはア
クチベーター配列の選択 免疫反応の際にマクロファージおよび／またはリンパ球
で多量に形成されるタンパク質に対する遺伝子の遺伝子
制御配列を、プロモーターまたはエンハンサーからなる
プロモーターまたはアクチベーター配列として用いる。
この種のタンパク質の例は、下記の通りである。 ＩＬ−１ ＩＬ−１β ＩＬ−１レセプター ＩＬ−２ ＩＬ−２レセプター ＩＬ−３ ＩＬ−３レセプター ＩＦＮγ ＩＬ−４ ＩＬ−４レセプター ＩＬ−５ ＩＬ−６ ＬＩＦ ＩＬ−７ ＩＬ−１０ ＩＬ−１１ ＩＬ−１２ ＩＬ−１３ ＧＭ−ＣＳＦ ＧＭ−ＣＳＦレセプター インテグリンβ２タンパク質

【０１２４】3.2. 特に自己免疫疾患に対するプロモー
ターまたはアクチベーター配列の選択 本発明に関して、活性物質は、抗体、抗体断片、サイト
カイン、ケモカイン、成長因子またはその抑制剤の一
つ、血漿タンパク質、ＤＮＡ配列の１つの転写生成物に
対してまたは細胞サイクル制御タンパク質をコードする
遺伝子の転写生成物に対して触媒作用を有するリボザイ
ムをコードするＤＮＡ配列、または抗体または酵素に対
するＤＮＡ配列である。活性物質の選択は、治療を行う
基本的疾患および選択されるプロモーター配列によって
変わる。

【０１２５】4. 関節炎治療用の活性化合物 4.1. 関節炎に対するプロモーターまたはアクチベータ
ー配列の選択 本発明に関して、プロモーター、プロモーターまたはエ
ンハンサーからなるアクチベーター配列、または遺伝子
制御配列は、平滑細胞および炎症細胞中で形成されまた
は活性を有する転写因子が相互作用を行う遺伝子と結合
しているものが好ましいと理解すべきである。本発明に
関して、好ましいプロモーター配列としては、遺伝子制
御配列または特に平滑細胞および炎症細胞中で発現する
タンパク質をコードする遺伝子由来の要素が挙げられ
る。

【０１２６】4.2. 関節炎に対する活性物質の構造遺伝
子の選択 本発明に関して、活性物質は、発現タンパク質が直接ま
たは間接的に関節などの炎症を抑制し、および／または
関節における細胞外マトリックス（軟骨、結合組織）の
再構成を促進するＤＮＡ配列であると理解すべきであ
る。

【０１２７】5. 感染性作用物に対する活性化合物の製
造 活性化合物は、基本的に異なる２種類の形態で製造する
ことができる。ウイルス感染症および寄生動物の侵襲の
治療用、またはウイルス、細菌または寄生動物による感
染性疾患の予防用。

【０１２８】ワクチンは、感染性疾患の予防に用いられ
る。しかしながら、通常の方法で有効なワクチンを製造
する可能性は限定されている(Brown, Int. J. Technol.
Assessm. Health Care 10, 161 (1994), Ellis, Adv.
Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992), Arnon. et al., FA
SEB J. 6, 3265 (1992))。

【０１２９】従って、ＤＮＡワクチンの技術が開発され
た。しかしながら、これらのＤＮＡワクチンでは、効力
の程度、安全性および副作用に関して疑問が起きている
(Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995),
Donnelly et al., Immunol.2, 20 (1994))。

【０１３０】本発明に関しては、感染性疾患の予防用の
活性化合物は、その細胞特異性および細胞サイクル制御
のために高度の安全性が見られる。

【０１３１】5.1. プロモーターまたはアクチベーター
配列の選択 5.1.a) 感染性疾患の治療用 活性が、特に細菌や規制動物の感染によって変化する細
胞遺伝子のプロモーター配列は、アクチベーター配列と
して選択すべきであり、またはウイルスが感染した細胞
を形質転換し、これらの細胞を刺激して増殖させるウイ
ルスから誘導されるプロモーター配列を選択すべきであ
る。これらのウイルスの例は、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳ
Ｖ、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶおよびＨＴＬＶである。

【０１３２】5.2. 活性物質に対する構造遺伝子の選択 5.2.a) 感染性疾患の治療用 細胞増殖抑制、細胞毒性、抗細菌または抗ウイルス作用
を示すタンパク質のＤＮＡを、活性物質として選択すべ
きである。細胞毒性または細胞増殖抑制タンパク質の例
は、既に上記に引用されている。抗体または抗体断片
は、抗細菌または抗ウイルスタンパク質の例として挙げ
られる。酵素を選択するときには、この酵素によって開
裂することができる抗ウイルス性の細胞毒性または抗寄
生動物物質の前駆物質を続いて投与しなければならな
い。

【０１３３】本発明に関する抗ウイルスタンパク質に対
する活性物質は、更に抗ウイルス活性を示すサイトカイ
ンおよび成長因子である。これらの物質としては、例え
ば下記の活性物質に対するＤＮＡ配列が挙げられる。 ＩＦＮα ＩＦＮβ ＩＦＮγ ＴＮＦβ ＴＮＦα ＩＬ−１ ＴＧＦβ

【０１３４】しかしながら、一方では上記のサイトカイ
ン、成長因子またレセプターの細胞外残基と、他方では
リガンドとの間に形成される融合タンパク質のＤＮＡ配
列を、本発明に関して活性物質として用いることもで
き、例えばヒト免疫グロブリンのＦｃ残基を含む融合タ
ンパク質は、ＥＰＡ０４６４ ６３３ Ａ１号明細書に
記載されている。

【０１３５】細胞サイクル制御タンパク質の遺伝子のｍ
ＲＮＡまたはウイルスのｍＲＮＡを漿果するリボザイム
の遺伝子も、活性物質と考えられる。ＨＩＶに対する触
媒作用を有するリボザイムは、例えばChristoffersen e
t al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995)によって概説さ
れている。

【０１３６】更に、本発明に関する活性物質は、関連ウ
イルスを不活性化する特異性を有する抗体のＤＮＡ配
列、またはそのＶ_Ｈ−およびＶ_Ｌ−含有断片、またはリ
ンカーによって接続されているそのＶ_Ｈ−およびＶ_Ｌ−
含有断片であり、その断片は例えばMarasco et al. (Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889 (1993)) によって
記載された方法に従って製造される。この種の特異性を
有する抗体の例を、5.2.b)節に示す。

【０１３７】5.2.b) 感染性疾患の予防用 選択される活性物質は、感染性作用物に特異的な抗体ま
たは抗体断片のＤＮＡであるか、または感染性作用物に
よって形成され、かつ免疫反応を誘発することによっ
て、すなわち抗体結合によりおよび／または細胞毒性Ｔ
リンパ球により、作用物を中和しおよび／または破壊す
るタンパクのＤＮＡである。この種のいわゆる中和抗原
は、既にワクチン抗原として用いられている（Ellis, A
dv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992) の総説を参照さ
れたい）。中和抗原をコードするＤＮＡ配列の例は、下
記の刊行物から得ることができる。 インフルエンザＡウイルス抗原 (Ulmer et al., Science 259, 1745 (1993), Robinson
et al., Vaccine 11, 957 (1993), Fynan et al., Int.
J. Immunopharmac. 17, 79 (1995)) ＨＩＶ抗原 (Wang et al., PNAS USA 90, 4156 (1993)) 狂犬病ウイルス抗原 (Donnelly et al., Immunol. 2/1, 20 (1994)) ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）抗原 (Fleckenstein et al., Nature 274, 57 (1978)) ＲＳＶ（呼吸器シンシチウムウイルス）抗原 (Du et al., Bio/Techn. 12, 813 (1994), Hall, Scien
ce 265, 1393 (1993)) パラインフルエンザウイルス抗原 (Du et al., Bio/Techn. 12, 813 (1994)) ロタウイルス抗原 (Albert et al., J. Clin. Microbiol. 25, 183 (198
7), Anderson et al.,J.Infect. Dis. 153, 823 (198
6), Battaglia et al., J. Infect. Dis. 155, 140 (19
87), Chanock et al., J. Infect. Dis. 148, 49 (198
3), Dyall-Smith et al., J. Virol. 38, 1099 (1981),
Glass et al., Science 265,1389 (1994)) ＶＺＶ（水痘−帯状疱疹ウイルス）抗原 (Straus et al., Ann. Intern. Med. 109, 438 (1988),
Gershon, Pediatr.Infect. Dis. 2, 171 (1991), Kinc
hington et al., J. Virol. 64, 4540(1990)) ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）抗原 (Plotkin, Science 265,1383 (1994)) 麻疹ウイルス抗原 (Katz and Kellin, Science 265, 1391 (1994)) ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）抗原 (Tindl and Frazer, Curr. Topics Microbiol. Immuno
l. 186, 217 (1994)) ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）抗原 (Valenzuela et al., Nature 280, 815 (1979), Heerma
n et al., J. Virol. 52, 396 (1984)) ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）抗原 (Cerny et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 18
9, 169 (1994), Esteban et al., Progr. Liver Dis. 1
0, 253 (1992), Jung et al., Eur. J.Clin. Invest. 2
4, 641 (1994)) ＨＤＶ（Ｄ型肝炎ウイルス）抗原 (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 24, 129 (1992), C
onsolo et al., Nephron. 61, 251 (1992)) ＨＥＶ（Ｅ型肝炎ウイルス）抗原 (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 24, 129 (1992), C
onsolo et al., Nephron. 61, 251 (1992)) ＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）抗原 (d'Hondt, Vaccine 10, 48 (1992), Andre, J. Infect.
Dis. 171, 33 (1995), Lemon et al., Vaccine 10, 40
(1992), Melnick et al., Vaccine 10,24 (1992), Fle
hmig, Baillieres Clin. Gastroenterol. 4, 707 (199
0)) コレラ菌抗原 (Levine and Kaper, Vaccine 11, 207 (1993)) Borrelia burgdorferi抗原 (Schaible et al., Immunol. Letters 36, 219 (1993),
Wallich et al., Lab. Med. 17, 669 (1993)) Helicobacter pylori 抗原 (Crabtree et al., Lnacet 338, 332 (1991), Blaser,
J. Infect. Dis. 161, 626 (1990), Cover and Blaser,
J. Biol. Chem. 267, 10570 (1993), Cover et al., I
nfect. Immunol. 58, 603 (1990), Dunn et al., J. Bi
ol.Chem. 265, 9464 (1990), Dunn et al., Infect. Im
munol. 60, 1946 (1992), Lage et al., Acta Gastroen
terol. 56 (suppl.), 61 (1993), Mobleyet al., Scan
d. J. Gastroint. 26 (suppl. 187), 39 (1991)) マラリア抗原 (Nussenzweig and Long, Science 265, 1381 (1994), M
aurice, Science 267, 320 (1995), Enders et al., Va
ccine 10, 920 (1992), Knapp et al.,Infect. Imm. 6
0, 2397 (1992))

【０１３８】しかしながら、本発明に関しては、この種
の活性物質としては、アンチイディオタイプ抗体または
その抗原結合断片であって、その抗原結合構造、相補性
決定領域が感染性作用物の中和抗原のタンパク質構造ま
たは炭水化物構造のコピーを構成するものが挙げられ
る。

【０１３９】この種のアンチイディオタイプ抗体は、特
に細菌性感染性作用物の場合には炭水化物抗原を置換す
ることができる。

【０１４０】この種のアンチイディオタイプ抗体および
それらの開裂生成物は、Hawkins etal. (J. Immunothe
r. 14, 273 (1993))およびWesterink and Apicella (Sp
ringer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993))に
よって総説が報告されている。

【０１４１】5.3 感染性疾患の治療または予防のため
の同一または異なる活性物質の組み合わせ 本発明は、同一の活性物質（Ａ，Ａ）または異なる活性
物質（Ａ，Ｂ）のＤＮＡ配列の組み合わせを含んでなる
活性化合物にも関する。２種類の配列を発現させるため
に、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）のｃＤ
ＮＡを制御要素として挿入するのが好ましい。

【０１４２】この種のＩＲＥＳは、例えばMontford and
Smith, TIG 11, 179 (1995), Kaufman et al., Nucl.
Acids Res. 19, 4485 (1991), Morgan et al., Nucl. A
cidsRes. 20, 1293 (1992), Dirks at al., Gene 128,2
47 (1993), Pelletier andSonenberg, Nature 334,320
(1988)およびSugimoto et al., BioTechn. 12. 694(199
4) によって記載されている。

【０１４３】従って、ポリオウイルスＩＲＥＳ配列（５
４′ＵＴＲの位置≦１４０〜≧６３０(Pelletier and S
onenberg, Nature 334, 320 (1988)) を用いて、ウイル
ス性物質Ａ（３′末端）のＤＮＡと抗ウイルス性物質Ｂ
（５′末端）のＤＮＡとを連結することができる（図８
を参照されたい）。

【０１４４】組み合わせによっては、この種の活性化合
物は、本発明に関しては相加的（Ａ＋Ａ，Ａ＋Ｂ）また
は相乗的効果を示す。

【０１４５】従って、ウイルス性疾患の治療には、例え
ば２種類の同一のまたは２種類の異なる抗ウイルス性活
性物質を互いに組み合わせることができる。

【０１４６】感染性疾患の予防には、１種類の感染性作
用物または異なる感染性作用物の異なる抗原をコードす
る数種類の活性物質を互いに組み合わせることができ
る。更に、１種類の感染性作用物の抗原をコードする活
性物質をサイトメガロウイルスまたはサイトカインレセ
プターをコードする活性物質と組み合わせることができ
る。

【０１４７】このようにして（活性化合物の注射の後
に）感染性作用物抗原と同時に形成されたサイトカイン
またはサイトカインレセプターは、開発している免疫反
応の性質および強度に影響を与えることができる。

【０１４８】体液性免疫反応を増幅するサイトカインお
よびサイトカインレセプターのＤＮＡ配列は5.2.d)で既
に記載しており、細胞性免疫反応を増幅するためのもの
は5.2.a)および5.2.c)で記載している。

【０１４９】下記のものは、全体として免疫反応を増幅
するサイトカインのＤＮＡ配列の例である。 Ｉｌ−１α (Fenton, Int. J. Immunopharm. 14, 401 (1992), Furn
tani et al. Nucl.Acids Res. 14, 3167 (1986), Lafag
e et al., Blood 73, 104 (1989), March et al., Natu
re 315, 641 (1985)) Ｉｌ−１β (Bensi et al., Gene 52, 95 (1987), Auron et al., P
NAS USA 81, 7907(1984), Clark et al., Nucl. Acids
Res. 14, 7897 (1986)) Ｉｌ−２ (Fletscher et al., Lymphok. Res. 6, 45 (1987), Mat
sui et al., Lymphokines 12, 1 (1985), Tanaguchi et
al., Nature 302, 305 (1983)) ＧＭ−ＣＳＦ (Gough et al., Nature 309, 763 (1984), Nichola et
al., J. Biol. Chem. 254, 5290 (1979), Wong et al.,
Science 228, 810 (1985))

【０１５０】6. 腫瘍治療用の活性化合物 6.1. 腫瘍細胞に対するプロモーターまたはアクチベー
ター配列の選択 腫瘍細胞中で形成されるまたは活性を有する転写因子が
相互作用する遺伝子制御ヌクレオチド配列は、プロモー
ターまたはアクチベーター配列と呼ばれている。

【０１５１】新規な核酸構築物に直接利用できる腫瘍が
好ましい。これらの腫瘍は、例えば（異なる種類の固形
腫瘍の近傍における増殖する内皮細胞の他に）核酸構築
物の静脈内注射の後の白血病細胞、例えば構築物の腹腔
内注射の後の卵巣癌および膵臓癌、および例えば構築物
の気管支内投与の後の肺癌である。

【０１５２】本発明に関しては、好ましいプロモーター
またはアクチベーター配列としては、特に白血病細胞、
癌細胞または肉腫細胞に形成されるタンパク質をコード
する遺伝子由来の遺伝子制御配列または要素が挙げられ
る。従って、Ｎ−ＣＡＭタンパク質のプロモーターは、
小細胞気管支癌の場合に好ましく用いられ、肝炎成長因
子またはＬ−プラスチンのプロモーターは卵巣癌の場合
に好ましく用いられ、Ｌ−プラスチンまたは多形上皮ム
チン（ＰＥＭ）のプロモーターは膵臓癌の場合に好まし
く用いられ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のプロモーター
は前立腺腫瘍の場合に好ましく用いられる。

【０１５３】6.2. 腫瘍細胞に対する活性物質の構造遺
伝子の選択 本発明に関しては、活性物質は、発現したタンパク質
が、細胞、特に白血病細胞の増殖も抑制するＤＮＡ配列
であると理解すべきである。これらの細胞サイクル抑制
剤としては、例えば上記したように、抑制性の細胞増殖
抑制および細胞毒性タンパク質、抗体または抗体開裂生
成物、および酵素のＤＮＡ配列が挙げられる。

【０１５４】細胞サイクル抑制剤は、また腫瘍細胞また
は白血病細胞に直接または間接的に細胞増殖抑制または
細胞毒性作用を示すタンパク質を発現するＤＮＡ配列で
あると理解すべきである。

【０１５５】また、細胞サイクル抑制剤は、細胞サイク
ル制御タンパク質の遺伝子のｍＲＮＡを触媒するリボザ
イムのＤＮＡ配列であるとも理解すべきである。腫瘍細
胞の活性物質も、発現したタンパク質またはペプチド
が、免疫反応を誘発する腫瘍抗原を構成するＤＮＡ配列
であるとも理解すべきである。

【０１５６】7. 血管閉塞に関する平滑筋の増殖を抑制
する活性化合物 7.1. 平滑筋のプロモーターまたはアクチベーター配列
の選択 本発明に関して用いられるプロモーターまたはエンハン
サーからなるプロモーターまたはアクチベーター配列
は、特に平滑筋細胞で形成されるタンパク質をコードす
る遺伝子由来の遺伝子制御配列または要素であるのが好
ましい。

【０１５７】7.2. 平滑筋細胞の活性物質に対する構造
遺伝子の選択 本発明に関して、活性物質は、発現したタンパク質が平
滑筋細胞の増殖を抑制するＤＮＡ配列であると理解され
る。これらの増殖抑制剤としては、1,2,a)および1.2.c)
に既述したタンパク質が挙げられる。

【０１５８】しかしながら、活性物質は、細胞増殖抑制
剤の不活性な前駆物質を細胞増殖抑制剤へ変換する酵素
のＤＮＡ配列であるとも理解される（1.2.e)を参照され
たい）。

【０１５９】しかしながら、活性物質は、細胞サイクル
制御タンパク質の遺伝子のｍＲＮＡに特異的なリボザイ
ムのＮＤＡ配列であるとも理解される（1.2.f)を参照さ
れたい）。

【０１６０】8. 凝集に影響を及ぼす活性化合物 8.1. 凝集に影響を及ぼすプロモーターまたはアクチベ
ーター配列の選択 本発明に関して、用いられるプロモーターまたはアクチ
ベーター配列は、平滑筋細胞、活性化した内皮細胞、活
性化したマクロファージまたは活性化したリンパ球で検
出されるタンパク質をコードする遺伝子由来の遺伝子制
御配列または要素であるのが好ましい。

【０１６１】8.1.a) 平滑筋細胞 平滑筋細胞中の遺伝子のプロモーター配列の例は、既に
示している。

【０１６２】8.1.b) 活性化した内皮細胞 活性化した内皮細胞で形成されるタンパク質の例は、特
にBurrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994))に
よって記載されている。これらのタンパク質としては、
特に内皮細胞で多量に見られるタンパク質、例えば遺伝
子のプロモーター配列とともに既に上記されているタン
パク質が挙げられる。

【０１６３】8.1.c) 活性化したマクロファージおよび
／または活性化したリンパ球 本発明に関して、アクチベーター配列は、免疫反応の際
にマクロファージおよび／またはリンパ球で多量に形成
されるタンパク質の遺伝子のプロモーター配列でアルト
も理解される。この種のタンパク質は、既に引用してい
る。

【０１６４】8.2. 凝固に影響を及ぼす活性物質の構造
遺伝子の選択 本発明において用いられる活性物質は、直接または間接
的に血小板凝集または血液凝固因子を抑制し、またはフ
ィブリン溶解を刺激するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列である。

【０１６５】この種の活性物質は、凝固抑制剤と呼ばれ
る。プラスミンまたはプラスミノーゲンアクチベーター
（ＰＡｓ）、例えば組織ＰＡ（ｔＰＡ）またはウロキナ
ーゼ様ＰＡ（ｕＰＡ）、またはタンパク質Ｃ、アンチト
ロンビンIII 、Ｃ−１Ｓ抑制剤、α１−アンチトリプシ
ン、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）またはヒルジンの
遺伝子が、凝固抑制剤として用いられる。

【０１６６】しかしながら、血液凝固を促進するタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列は、本発明に関して活性物
質としても用いられる。この種のタンパク質の例は、血
漿タンパク質、例えばＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ、または
組織因子である。

【０１６７】9. ＣＮＳ損傷を防御する活性化合物 9.1. ＣＮＳ損傷を防御する活性化合物のプロモーター
またはエンハンサーから形成されるプロモーターまたは
アクチベーター配列 9.1.a) 内皮細胞で活性化されるプロモーターまたはア
クチベーター配列 これらには、特に内皮細胞特異性タンパク質の遺伝子の
プロモーター配列が挙げられる。

【０１６８】9.1.b) グリア細胞で活性化されるプロモ
ーターまたはアクチベーター配列 好ましいアクチベーター配列は、グリア細胞で形成され
るまたは特定の程度まで活性を有する転写因子と相互作
用を行うヌクレオチド配列（プロモーター配列またはエ
ンハンサー配列）であるとも理解される。

【０１６９】9.2. 神経特異的因子の構造遺伝子の選択 本発明に関して、神経特異的因子は、神経成長因子をコ
ードするＤＮＡ配列であると理解される。

【０１７０】

【実施例】本発明を下記の例を用いて更に詳細に説明す
るが、これらの例に限定されるものではない。

【０１７１】実施例１ ハイブリッドプロモーターの調
製 新規なハイブリッドプロモーターは、下記の異なるヌク
レオチド配列からなり、互いに下流方向に続いている。

【０１７２】要素Ｉ ＶＥＧＦレセプターＩ遺伝子のプロモーター （ヌクレオチド−１１９５〜１００；Morishita et a
l., J. Biol. Chem.270, 27948 (1995) 。ＴＡＴＡボッ
クス（位置−３１〜−２６のヌクレオチドＴＡＴＡＡ
Ａ）は突然変異によりＴＧＴＡＡＡとなっている） 配列ＧＣＣＡＣＣ (Kodak, J. Cell Biol. 108, 229 (1989)) 免疫グロブリンシグナルペプチドのｃＤＮＡ （ヌクレオチド配列６３〜１０７；Riechmann et al.,
Nature 332, 323 (1988)) β−グルクロニダーゼのｃＤＮＡ （ヌクレオチド配列９３〜１９８２；Oshima et al., P
NAS USA 84, 685 (1987))

【０１７３】要素II ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（ヌクレオチド−４
８７〜＋１２１、好ましくはヌクレオチド−４８７〜＋
２４７；Jahroudi and Lynch, Mol. Cell Biol. 14, 99
9 (1994)、特にヌクレオチド−２９０〜＋１２１） ＴＡＴＡボックス結合タンパク質の遺伝子 （ヌクレオチド配列＋１〜＋１００１であって、ヌクレ
オチド８６２（ＡがＴで置換）、８８９および８９０
（ＧＴがＡＣで置換）、および８９５（ＣがＧで置換）
で突然変異しているもの）(Strubin and Struhl, Cell
68, 721 (1992); Heard et al., EMBO J. 12, 3519 (19
93))

【０１７４】要素Ｉおよび要素IIのヌクレオチド配列
を、図９のスキームに示すように連結する。

【０１７５】この方法で調製したヌクレオチド構築物を
ｐＵＣ１８／１９またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐ由来のプラ
スミドベクターにクローニングした後、直接またはコロ
イド分散系でイン・ビボ投与に用いる。

【０１７６】この構築物の個々の成分は適当な制限部位
によって連結されており、これらの部位はＰＣＲ増幅の
際に異なる要素の末端に導入される。連結は、制限部位
に特異的でありかつ当業者に知られている酵素と、ＤＮ
Ａリガーゼを用いて行われる。

【０１７７】培養において保持されているヒト臍帯内皮
細胞および線維芽細胞（Ｗｉ−３８）を、当業者に知ら
れている方法を用いて上記プラスミドの１つとともにト
ランスフェクションし(Lucibello et al., EMBO J. 14,
132 (1995))、内皮細胞によって産生されるβ−グルク
ロニダーゼの量を４−メチルウンベリフェリル−β−グ
ルクロニドを基質として用いて測定する。

【０１７８】細胞サイクル特異性をチェックするため、
内皮細胞をＧ０／Ｇ１で４８時間に亙ってメチオニンを
除くことによって同期させる（Nettelbeck et al. 、印
刷中）。細胞のＤＮＡ含量を、Hoechst 33258 で染色し
た後、蛍光活性化細胞ソーターで測定する(Lucibello e
t al., EMBO J. 14, 132 (1995))。

【０１７９】下記の結果が得られた。β−グルクロニダ
ーゼの増加は、トランスフェクションしていない線維芽
細胞と比較してトランスフェクションした線維芽細胞で
は検出することができない。トランスフェクションした
内皮細胞は、トランスフェクションしていない内皮細胞
よりも実質的に多量のβ−グルクロニダーゼを発現す
る。トランスフェクションした内皮細胞（ＤＮＡ＞２
Ｓ；Ｓ＝単一の染色体の組）は、Ｇ０／Ｇ１で同期した
内皮細胞（ＤＮＡ＝２Ｓ）でよりも、実質的に多量のβ
−グルクロニダーゼを分泌する。従って、記載されてい
る多重プロモーター単位は、β−グルクロニダーゼ構造
遺伝子の細胞特異的、細胞サイクル依存性発現を生じ
る。

【０１８０】実施例２ 核保持シグナル（ＮＲＳ）およ
び核輸出因子（ＮＥＦ）と組み合わせたハイブリッドプ
ロモーターの調製 新規なハイブリッドプロモーターは、下記の異なるヌク
レオチド配列からなり、互いに下流方向に続いている。要素III ＶＥＧＦレセプターＩ遺伝子のプロモーター （ヌクレオチド−１１９５〜１００；Morishita et a
l., J. Biol. Chem.270, 27948 (1995) 。ＴＡＴＡボッ
クス（位置−３１〜−２６のヌクレオチドＴＡＴＡＡ
Ａ）は、突然変異によりＴＧＴＡＡＡとなっている） 配列ＧＣＣＡＣＣ (Kodak, J. Cell Biol. 108, 229 (1989)) 免疫グロブリンシグナルペプチドのｃＤＮＡ （ヌクレオチド配列６３〜１０７；Riechmann et al.,
Nature 332, 323 (1988)) β−グルクロニダーゼのｃＤＮＡ （ヌクレオチド配列９３〜１９８２；Oshima et al., P
NAS USA 84, 685 (1987)) 核保持シグナル（ＮＲＳ）としてのＨＩＶ−１ウイルス
ＲＥＲのｃＤＮＡ （ヌクレオチド配列７３５７〜７６０２；Ratner et a
l., Nature 313, 277(1985); Malim et al., Nature 33
8,254 (1989))要素IIa ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（ヌクレオチド−２
９０〜＋１２１、zwicker et al., EMBO J. 14, 4514
(1995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res.23, 3822
(1995)) 共突然変異を含むＴＡＴＡボックス結合タンパク質の遺
伝子 （ヌクレオチド配列１〜１００１であって、ヌクレオチ
ド８６２（ＡがＴで置換）、８８９および８９０（ＧＴ
がＡＣで置換）、および８９５（ＣがＧで置換）で突然
変異しているもの）(Strubin and Struhl, Cell 68, 72
1 (1992); Heard et al., EMBO J. 12, 3519 (1993))要素IV von Willebrand因子（ｖＷＦ）遺伝子のプロモーター （ヌクレオチド−４８７〜＋２４７；Jahroudi and Lyn
ch, Mol.Cell Biol.14, 999 (1994)) 核輸出因子（ＮＥＦ）としてのＨＩＶ−１ウイルスＲＥ
ＶのｃＤＮＡ アミノ酸配列１〜１１７；Ratner et al., Nature 313,
277 (1985)

【０１８１】要素II、III およびIVのヌクレオチド配列
は、図１０におけるスキームに示されるように連結され
る。

【０１８２】この方法で調製したヌクレオチド構築物を
ｐＵＣ１８／１９またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐ由来のプラ
スミドベクターにクローニングした後、直接またはコロ
イド分散系でイン・ビボ投与に用いる。

【０１８３】この構築物の個々の成分は適当な制限部位
によって連結されており、これらの部位はＰＣＲ増幅の
際に異なる要素の末端に導入される。連結は、制限部位
に特異的でありかつ当業者に知られている酵素と、ＤＮ
Ａリガーゼを用いて行われる。

【０１８４】培養において保持されているヒト臍帯内皮
細胞および線維芽細胞（Ｗｉ−３８）を、当業者に知ら
れている方法を用いて上記プラスミドの１つとともにト
ランスフェクションし(Lucibello et al., EMBO J. 14,
132 (1995))、内皮細胞によって産生されるβ−グルク
ロニダーゼの量を４−メチルウンベリフェリル−β−グ
ルクロニドを基質として用いて測定する。

【０１８５】細胞サイクル特異性をチェックするため、
内皮細胞をＧ０／Ｇ１で４８時間に亙ってメチオニンを
除くことによって同期させる（Nettelbeck et al. 、印
刷中）。細胞のＤＮＡ含量を、Hoechst 33258 で染色し
た後、蛍光活性化細胞ソーターで測定する(Lucibello e
t al., EMBO J. 14, 132 (1995))。

【０１８６】下記の結果が得られる。β−グルクロニダ
ーゼの増加は、トランスフェクションしていない線維芽
細胞と比較してトランスフェクションした線維芽細胞で
は検出することができない。トランスフェクションした
内皮細胞は、トランスフェクションしていない内皮細胞
よりも実質的に多量のβ−グルクロニダーゼを発現す
る。トランスフェクションした内皮細胞（ＤＮＡ＞２
Ｓ）は、Ｇ０／Ｇ１で同期した内皮細胞（ＤＮＡ＝２
Ｓ）でよりも、実質的に多量のβ−グルクロニダーゼを
分泌する。従って、記載されている多重プロモーター単
位は、β−グルクロニダーゼ構造遺伝子の細胞特異的、
細胞サイクル依存性発現を生じる。

【０１８７】実施例３ アクチベーター応答プロモータ
ー単位と組み合わせたハイブリッドプロモーターの調製 新規なアクチベーター応答プロモーター単位は、下記の
異なるヌクレオチド配列からなり、互いに下流方向に続
いている。

【０１８８】要素Ｖ アクチベーターサブユニットＡ ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター （ヌクレオチド−２９０〜＋１２１、zwicker et al.,
EMBO J. 14, 4514(1995); Zwicker et al., Nucl. Acid
s Res. 23, 3822 (1995)) Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインのｃＤＮＡ （アミノ酸１〜１４７；Chasman and Kornberg, Mol. C
ell Biol. 10, 2916(1990)) Ｇａｌ８０のｃＤＮＡ （アミノ酸１〜４３５；Leuther et al., Science 256,
1333 (1992))

【０１８９】アクチベーターサブユニットＢ ＶＥＧＦレセプターＩ遺伝子のプロモーター （ヌクレオチド−１１９５〜＋１００；Morishita et a
l., J. Biol. Chem.270, 27948 (1995) 。ＴＡＴＡボッ
クス（位置−３１〜−２６のヌクレオチドＴＡＴＡＡ
Ａ）は、突然変異によりＴＧＴＡＡＡとなっている） Ｇａｌ１４のＧａｌ８０結合ドメインのｃＤＮＡ （アミノ酸８５１〜８８１；Leuther et al., Science
256, 1333 (1992)) ＳＶ４０の核局在化シグナル（ＮＬＳ） ＳＶ４０大型Ｔ；アミノ酸１２６〜１３２： ＰＫＫＫ
ＲＫＶ；Dingwallet al., TIBS 16, 478 (1991)) ＨＳＶ−１ＶＰ１６の酸トランス作用ドメイン （アミノ酸４０６〜４８８；Triezenberg et al., Gene
s Developm. 2, 718(1988), Treazenberg, Curr. Opin.
Gen. Developm. 5, 190 (1995))

【０１９０】アクチベーター応答プロモーター ＳＶ４０基底プロモーター（ヌクレオチド４８〜５１９
１；Tooze （監修）、ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor V
iruses) （Cold Spring Harbor New York 、ニューヨー
ク、Cold Spring Harbor Laboratory ）にカップリング
したヌクレオチド配列５′−ＣＧＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴ
ＧＡＣ ＣＧ−３′（配列番号２、Chasman and Kornbe
rg, Mol.Cell Biol. 10. 2916 (1999)) を有するＧａｌ
４の結合配列

【０１９１】アクチベーター応答プロモーター単位のヌ
クレオチド配列の順序を、図１１のスキームに示す。

【０１９２】上記アクチベーター配列は、下記のように
機能する。ｃｄｃ２５Ｃプロモーターは、Ｇａｌ４結合
タンパク質およびＧａｌ８０の組み合わせたｃＤＮＡの
転写を細胞サイクル特異的に制御する。ＶＥＧＦレセプ
ターＩプロモーターは、Ｇａｌ８０結合ドメイン、ＳＶ
４０ＮＳＬおよびＴＡＰのカップリングしたｃＤＮＡの
内皮細胞への転写を制限する。しかしながら、その活性
化は、突然変異によって阻害される。アクチベーターサ
ブユニットＡおよびＢの発現生成物は、Ｇａｌ４ｋＧａ
ｌ８０結合ドメインがＧａｌ８０に結合することによっ
て二量体化する。

【０１９３】二量体化を、図１２に概略的に示す。

【０１９４】二量体タンパク質は、Ｇａｌ４結合ドメイ
ン／ＳＶ４０プロモーターのアクチベーター応答プロモ
ーターＤＮＡ配列のキメラ転写因子である。

【０１９５】プロモーターを次にその３′末端で配列Ｇ
ＣＣＡＣＣ(Kocak, J. Cell Biol.108, 229 (1989))に
連結し、後者を免疫グロブリンシグナルペプチドのヌク
レオチドのｃＤＮＡに連結する（ヌクレオチド配列６３
〜１０７；Riechmann et al., Nature 332, 323 (198
8)) 。この後に、図１３のスキームに従って、β−グル
クロニダーゼのｃＤＮＡ（ヌクレオチド配列９３〜１９
８２；Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987)) を続
ける。

【０１９６】この単位を次にその３′末端で要素VIに接
続するが、好ましくは要素VIは、ヌクレオチド構築物の
５′末端に添加することもできる。

【０１９７】要素VI 要素VIは、下記のものを含んでいる。 von Willebrand因子遺伝子のプロモーター （ヌクレオチド−４８７〜＋２４７；Jahroudi and Lyn
ch, Mol. Cell. Biol. 14, 999 (1994)) ヌクレオチド８６２（ＡをＴで置換）、８８９および８
９０（ＧＴをＡＣで置換）および８９５（ＣをＧで置
換）に突然変異を有するＴＡＴＡボックス結合タンパク
質の遺伝子（ヌクレオチド配列１〜１００１）

【０１９８】ＴＡＴＡボックス結合タンパク質の共変異
（comutation）により、ＶＥＧＦレセプタープロモータ
ー（アクチベーターサブユニットＢ）の活性化の阻害が
緩和される。

【０１９９】この方法で調製したヌクレオチド構築物
を、ｐＵＣ１８／１９またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐ由来の
プラスミドベクターにクローニングした後、直接または
コロイド分散系でイン・ビボ投与に用いる。

【０２００】この構築物の個々の成分は、ＰＣＲ増幅の
際に異なる要素の末端に導入される適当な制限部位によ
って連結される。連結は、制限部位に特異的でありかつ
当業者に知られている酵素と、ＤＮＡリガーゼを用いて
行われる。

【０２０１】培養において保持されているヒト臍帯内皮
細胞および線維芽細胞（Ｗｉ−３８）を、当業者に知ら
れている方法を用いて上記プラスミドの１つとともにト
ランスフェクションし(Lucibello et al., EMBO J. 14,
132 (1995))、内皮細胞によって産生されるβ−グルク
ロニダーゼの量を４−メチルウンベリフェリル−β−グ
ルクロニドを基質として用いて測定する。

【０２０２】細胞サイクル特異性をチェックするため、
内皮細胞をＧ０／Ｇ１で４８時間に亙ってメチオニンを
除くことによって同期させる（Nettelbeck et al. 、印
刷中）。細胞のＤＮＡ含量を、Hoechst 33258 で染色し
た後、蛍光活性化細胞ソーターで測定する(Lucibello e
t al., EMBO J. 14, 132 (1995))。

【０２０３】下記の結果が得られた。β−グルクロニダ
ーゼの増加は、トランスフェクションしていない線維芽
細胞と比較してトランスフェクションした線維芽細胞で
は検出することができない。トランスフェクションした
内皮細胞は、トランスフェクションしていない内皮細胞
よりも実質的に多量のβ−グルクロニダーゼを発現す
る。増殖させた内皮細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ；Ｓ＝単一の染
色体の組）は、Ｇ０／Ｇ１で同期した内皮細胞（ＤＮＡ
＝２Ｓ）でよりも、実質的に多量のβ−グルクロニダー
ゼを分泌する。従って、記載されている多重プロモータ
ー単位は、β−グルクロニダーゼ構造遺伝子の細胞特異
的、細胞サイクル依存性的発現を生じる。

【０２０４】本発明による活性化合物は、実施例１〜３
に記載したように、局部投与の後、例えば腫瘍の部位、
または頭蓋内またはクモ膜下投与の後に、または全身、
好ましくは静脈内または動脈内投与の後に、アクチベー
ター応答プロモーター単位の細胞サイクル特異性または
内皮細胞特異性の結果として（これらに限定されるわけ
ではないが）、β−グルクロニダーゼを分泌する内皮細
胞の増殖だけを主として確保する効果を有する。このβ
−グルクロニダーゼは、注射されている十分な耐性を有
するドキソルビシン−β−グルクロニダーゼ（Jacquest
y et al., ＥＰＯ ０ ５１１９１７ Ａ１号明細書）
を開裂して細胞増殖抑制作用を有するドキソルビシンを
生じる。ドキソルビシンは内皮細胞の増殖を抑制してこ
れらの細胞および隣接する腫瘍細胞上で細胞増殖抑制作
用を示す。これにより、腫瘍の成長を抑制することがで
きる。

【０２０５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１．．７ 配列 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5

【０２０６】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．１７ 配列 CGGACAACTG TTGACCG 17

【図面の簡単な説明】

【図１】核酸構築物の個々の成分の配置を示す。

【図２】アクチベーター応答プロモーター単位の個々の
成分の配置を示す。

【図３】核酸構築物の好ましいアクチベーター応答プロ
モーター単位を示す。

【図４】キメラプロモーター構築物を用いるアクチベー
ター応答プロモーター単位を示す。

【図５】核酸構築物の個々の成分の配置を示す。

【図６】核酸構築物の個々の成分の配置を示す。

【図７】別の核酸構築物における数個の同一な抗腫瘍性
または抗炎症性鎖（Ａ，Ａ）または異なる抗腫瘍性物質
（Ａ，Ｂ）の個々の成分の配置を示す。

【図８】ウイルス性物質Ａと抗ウイルス性物質Ｂの個々
の成分の配置を示す。

【図９】互いに連結した要素Ｉおよび要素IIを含む本発
明のハイブリッドプロモーターを示す。

【図１０】互いに連結した要素IIa 、III およびIVを含
む本発明のハイブリッドプロモーターを示す。

【図１１】本発明の好ましいアクチベーター応答プロモ
ーター単位の１つのヌクレオチド配列を示す。

【図１２】アクチベーターサブユニットＡの融合タンパ
ク質を示す。

【図１３】アクチベーターサブユニットＢの融合タンパ
ク質を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦ 39/395 ＡＤＺ ＡＤＳ 48/00 ＡＤＵ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】宿主細胞でのトランス遺伝子の発現を制御
   するための核酸構築物であって、トランス遺伝子の適正
   な発現を阻害する第一の突然変異を含む少なくとも一つ
   の核酸配列と、第一の突然変異による阻害を除く第二の
   突然変異を含む少なくとも一つの核酸配列とを含んでな
   る、核酸構築物。
2. 【請求項２】宿主細胞でのトランス遺伝子の発現を制御
   するための、請求項１に記載の核酸構築物であって、 (i) 第一の突然変異を含む核酸配列が、トランス遺伝
   子の転写および／または翻訳を阻害するまたは薬理学的
   に活性な化合物の機能を阻害する突然変異を含むトラン
   ス遺伝子(b) であるときには、核酸構築物はトランス遺
   伝子の５′末端の上流に配置されている第一のプロモー
   ターまたはエンハンサー配列(a) を更に含む、または(i
   ') 第一の突然変異を含む核酸配列が、第一のプロモー
   ターの機能を阻害する突然変異を含む第一のプロモータ
   ーまたはエンハンサー配列(a')であるときには、核酸構
   築物は薬理学的に活性な化合物をコードするトランス遺
   伝子(b')を更に含む、核酸構築物。
3. 【請求項３】宿主細胞でのトランス遺伝子の発現を制御
   するための、請求項１に記載の核酸構築物であって、
   ５′から３′末端の方向の読取り枠において、 (i) トランス遺伝子の転写を活性化する第一のプロモ
   ーターまたはエンハンサー配列(a) 、または第一のプロ
   モーター(a')の機能を阻害する突然変異を含む第一のプ
   ロモーターまたはエンハンサー配列(a')、 (ii) 薬理学的に活性な化合物、またはトランス遺伝子
   (b) の転写および／または翻訳を阻害するまたは上記ト
   ランス遺伝子によってコードされる薬理学的に活性な化
   合物の機能を阻害する突然変異を含むトランス遺伝子
   (b) をコードするトランス遺伝子(b')、 (iii) 成分(d) の基礎転写を活性化するまたは第二のプ
   ロモーターの機能を阻害する突然変異を含む第二のプロ
   モーターまたはエンハンサー配列(c) 、および (iv) ｔＲＮＡ、またはプロモーター(a) および(c) の
   少なくとも一つにおけるまたはトランス遺伝子(b) にお
   ける突然変異を除くための制御タンパク質をコードする
   遺伝子を含んでなる、核酸構築物。
4. 【請求項４】プロモーター(a) および(c) が非特異的、
   細胞特異的またはウイルス特異的であり、プロモーター
   (a) および(c) の少なくとも一つを非特異的、ウイルス
   特異的、代謝的、テトラサイクリンにより、低酸素によ
   り、細胞特異的、および細胞サイクル特異的を含む数種
   類の活性化機構の少なくとも一つによって活性化するこ
   とができる、請求項３に記載の核酸構築物。
5. 【請求項５】トランス遺伝子(b) が、５′末端でトラン
   ス遺伝子の３′末端に直接または間接的に連結している
   核保持シグナル（ＮＲＳ）を含み、ＮＲＳの転写生成物
   が核輸出因子（ＮＥＦ）と結合するための構造を提供す
   る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
6. 【請求項６】下記の成分： (v) ＮＥＦの基礎転写を活性化する第三のプロモータ
   ーまたはエンハンサー配列(i) 、および (vi) ＮＲＳの転写生成物に結合することによって、細
   胞核からのトランス遺伝子の転写生成物の細胞質への移
   動を媒介するＮＥＦをコードする核酸配列(k)を更に含
   んでなる、請求項５に記載の核酸構築物。
7. 【請求項７】プロモーターまたはエンハンサー配列(a)
   および(c) が同一である、請求項３または４に記載の核
   酸構築物。
8. 【請求項８】プロモーターまたはエンハンサー配列(a)
   および(c) の少なくとも一つが、プロモーターモジュー
   ルＣＤＥ−ＣＨＲまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲを含むキメ
   ラプロモーターであり、上記プロモーターモジュールが
   下流の遺伝子の発現に影響を及ぼし、かつ隣接した上流
   のアクチベーター配列と相互作用する、請求項３〜７の
   いずれか一項に記載の核酸構築物。
9. 【請求項９】下流の遺伝子の発現を細胞サイクル特異的
   に阻害する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸
   構築物。
10. 【請求項１０】プロモーターまたはエンハンサー配列
    (a) 、(c) および(i) の少なくとも一つが、下記の成分 (vii) 非特異的、ウイルス特異的、代謝的、テトラサ
    イクリンにより、細胞特異的、および細胞サイクル特異
    的を含む数種類の活性化機構の少なくとも一つによって
    活性化することができる少なくとも一つのプロモーター
    またはエンハンサー配列(e) 、 (viii) プロモーターまたはエンハンサー配列(e) の下
    流に配置されている少なくとも一つのアクチベーターサ
    ブユニット(f) であって、アクチベーターサブユニット
    の基礎転写がプロモーターまたはエンハンサー配列(e)
    によって活性化されるもの、および (ix) アクチベーターサブユニット(f) または数種類
    の同一の(f) サブユニットの発現生成物によって、また
    は異なる(f')アクチベーターサブユニットによって活性
    化されるアクチベーター応答プロモーター(g)を含んで
    なるアクチベーター応答プロモーター単位である、請求
    項６に記載の核酸構築物。
11. 【請求項１１】プロモーターまたはエンハンサー配列
    (a) 、(c) および(i) およびアクチベーター応答プロモ
    ーター(g) の少なくとも一つがキメラプロモーターであ
    り、かつアクチベーターサブユニット(f) がキメラプロ
    モーターを活性化する少なくとも一つの転写因子をコー
    ドする遺伝子である、請求項１０に記載の核酸構築物。
12. 【請求項１２】アクチベーター応答プロモーター(g)
    が、ＳＶ４０プロモーターと組み合わせたＬｅｘＡオペ
    レーターのモノマーまたはマルチマーであり、かつ２種
    類のアクチベーターサブユニット(f) および(f')によっ
    て活性化され、 アクチベーターサブユニット(f) が、その３′末端がＧ
    ａｌ８０タンパク質をコードするｃＤＮＡの５′末端に
    連結されているＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質をコー
    ドするｃＤＮＡを含んでなり、 アクチベーターサブユニット(f')が、５′から３′末端
    への読取り枠において、Ｇａｌ４タンパク質のＧａｌ８
    ０−結合ドメインをコードするｃＤＮＡ、ＳＶ４０大型
    Ｔ抗原をコードするｃＤＮＡ、およびＨＳＶ−１ ＶＰ
    １６のトランス作用ドメインをコードするｃＤＮＡを含
    んでなる、請求項１０または１１に記載の核酸構築物。
13. 【請求項１３】ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質をコー
    ドするｃＤＮＡがＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質の１
    〜８１番のアミノ酸配列または１〜２０２番のアミノ酸
    配列をコードし、Ｇａｌ８０タンパク質をコードするｃ
    ＤＮＡがＧａｌ８０タンパク質の１〜４３５番のアミノ
    酸配列をコードし、Ｇａｌ４タンパク質のＧａｌ８０結
    合ドメインをコードするｃＤＮＡがＧａｌ４タンパク質
    の８５１〜８８１番のアミノ酸配列をコードし、ＳＶ４
    ０大型Ｔ抗原をコードするｃＤＮＡがＳＶ４０大型Ｔ抗
    原の１２６〜１３２番のアミノ酸配列をコードし、トラ
    ンス作用ドメインをコードするｃＤＮＡがＨＳＶ−１
    ＶＰ１６の４０６〜４８８番のアミノ酸配列をコードす
    る、請求項１２に記載の核酸構築物。
14. 【請求項１４】ＬｅｘＡオペレーターのモノマーまたは
    マルチマーがＧａｌ４結合領域のモノマーまたはマルチ
    マーで置換され、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質をコ
    ードするｃＤＮＡがＧａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ド
    メインをコードするｃＤＮＡで置換された、請求項１２
    または１３に記載の核酸構築物。
15. 【請求項１５】アクチベーター応答プロモーター(g) が
    Ｇａｌ４結合タンパク質の結合配列をコードするモノマ
    ーまたはマルチマーであり、かつアクチベーターサブユ
    ニット(f) がＳＶ４０大型Ｔ抗原からの核局在化シグナ
    ルおよびＨＳＶ−１ ＶＰ１６由来の酸トランス作用ド
    メイン（ＴＡＤ）を含むか、またはアクチベーターサブ
    ユニット(f')がＳＶ４０大型Ｔ由来の核局在化シグナル
    （ＮＬＳ）、Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン
    をコードするｃＤＮＡ、およびｐ５６Ｉｃｋタンパク質
    のＣＤ４結合配列をコードするｃＤＮＡを含む、請求項
    １０〜１３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
16. 【請求項１６】ＮＬＳが配列番号１のアミノ酸配列をコ
    ードし、ＴＡＤがＨＳＶ−１ ＶＰ１６の４０６〜４８
    ８番のアミノ酸配列をコードし、Ｇａｌ４タンパク質の
    ＤＮＡ結合ドメインのｃＤＮＡがＧａｌ４タンパク質の
    １〜１４７番のアミノ酸配列をコードし、ＣＤ４結合配
    列のｃＤＮＡがｐ５６Ｉｃｋタンパク質の１〜７１番の
    アミノ酸配列をコードする、請求項１５に記載の核酸構
    築物。
17. 【請求項１７】ＮＲＳをコードする核酸配列が、ＨＩＶ
    −１またはＨＩＶ−２由来のＲｅｖ応答要素（ＲＲ
    Ｅ）、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２以外のレトロウイル
    ス由来のＲＲＥ等価保持シグナル、およびＨＢＶ由来の
    ＲＲＥ等価保持シグナルからなる群から選択される、請
    求項６に記載の核酸構築物。
18. 【請求項１８】ＮＥＦ(k) が、レトロウイルス由来のｒ
    ｅｖ遺伝子、ｈｎＲＮＰ−Ａ１タンパク質をコードする
    遺伝子、または転写因子ＴＦＩＩＩ−Ａをコードする遺
    伝子からなる群から選択される、請求項６に記載の核酸
    構築物。
19. 【請求項１９】レトロウイルスが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ
    −２、ビスナ−マエディウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイ
    ルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全症ウイル
    ス、およびＨＴＬＶからなる群から選択される、請求項
    ６に記載の核酸構築物。
20. 【請求項２０】プロモーター(a) 、(c) 、(g) および
    (i) の少なくとも一つにおける少なくとも一つのＴＡＴ
    Ａ配列を突然変異させ、成分(d) が突然変異させ、かつ
    突然変異したＴＡＴＡボックスに結合し、転写を行うこ
    とができるＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）をコード
    する遺伝子である、請求項１０に記載の核酸構築物。
21. 【請求項２１】ＴＡＴＡボックスを突然変異させてＴＧ
    ＴＡＡＡとし、ＴＢＰをコードする遺伝子を突然変異さ
    せて、Ｎ８６２ではＴ、Ｎ８８９ではＡ、Ｎ８９０では
    Ｃ、およびＮ８９５ではＧとする、請求項２０に記載の
    核酸構築物。
22. 【請求項２２】５′から３′末端方向への読取り枠にお
    いて、下記の要素：−１１９５〜＋１００番のヌクレオ
    チド配列を含むＶＥＧＦレセプターＩ遺伝子のプロモー
    ターであって、位置−３１〜−２６におけるＴＡＴＡＡ
    ＡのＴＡＴＡボックスのヌクレオチドを突然変異させて
    ＴＧＴＡＡＡとした配列、 配列ＧＣＣＡＣＣ、 免疫グロブリンシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ
    の６３〜１０７番のヌクレオチド配列、およびβ−グル
    クロニダーゼをコードするｃＤＮＡの９３〜１９８２番
    のヌクレオチド配列を含んでなる要素Ｉ、およびｃｄｃ
    ２５Ｃ遺伝子のプロモーターの−４８７〜＋１２１番の
    ヌクレオチド配列、 ＴＡＴＡボックス結合タンパク質の＋１〜＋１００１番
    のヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド８６２のＡ
    がＴで置換され、８８９および８９０のＧＴがＡＣで置
    換され、および８９５のＣがＧで置換されている配列を
    含んでなる要素IIを含むハイブリッドプロモーターを含
    んでなる、請求項２〜２１のいずれか一項に記載の核酸
    構築物。
23. 【請求項２３】５′から３′末端方向への読取り枠にお
    いて、下記の要素：−１１９５〜１００番のヌクレオチ
    ド配列を含むＶＥＧＦレセプターＩ遺伝子のプロモータ
    ーであって、位置−３１〜−２６におけるＴＡＴＡＡＡ
    のＴＡＴＡボックスのヌクレオチドを突然変異させてＴ
    ＧＴＡＡＡとした配列、 配列ＧＣＣＡＣＣ、 免疫グロブリンシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ
    の６３〜１０７番のヌクレオチド配列、およびβ−グル
    クロニダーゼをコードするｃＤＮＡの９３〜１９８２番
    のヌクレオチド配列、および核保持シグナル（ＮＲＳ）
    としてのＨＩＶ−１ウイルスＲＥＲをコードする７３５
    ７〜７６０２番のヌクレオチド配列を含んでなる要素
    Ｉ、およびｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーターの−２９
    ０〜＋１２１番のヌクレオチド配列、 ＴＡＴＡボックス結合タンパク質の＋１〜＋１００１番
    のヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド８６２のＡ
    がＴで置換され、８８９および８９０のＧＴがＡＣで置
    換され、および８９５のＣがＧで置換されている配列を
    含んでなる要素IIａ、およびvon Willebrand因子（ｖＷ
    Ｆ）遺伝子のプロモーターの−４８７〜＋２４７番のヌ
    クレオチド配列、および核輸出因子（ＮＥＦ）としての
    １〜１１７番のアミノ酸配列をコードするＨＩＶ−１ウ
    イルスＲＥＶに対するｃＤＮＡを含んでなる要素IVを含
    むハイブリッドプロモーターを含んでなる、請求項２〜
    ２１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
24. 【請求項２４】ハイブリッドプロモーターと、５′から
    ３′末端方向への読取り枠に、下記の要素： 1) ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーターの−２９０〜
    ＋１２１番のヌクレオチド配列、 Ｇａｌ４タンパク質の１〜１４７番のアミノ酸配列のＤ
    ＮＡ結合ドメインに対するｃＤＮＡ、およびＧａｌ８０
    の１〜４３５番のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを
    含んでなるアクチベーターサブユニットＡ、 2) −３１〜−２６番のヌクレオチド配列にＴＧＴＡ
    ＡＡを含んでいる−１１９５〜＋１００番のヌクレオチ
    ド配列を含むＶＥＧＦレセプターＩ遺伝子のプロモータ
    ー、 Ｇａｌ４の８５１〜８８１番のアミノ酸配列のＧａｌ８
    ０結合ドメインに対するｃＤＮＡ、 配列番号１のアミノ酸配列をコードする核局在化シグナ
    ル（ＮＬＳ）、およびＨＳＶ−１ ＶＰ１６の４０６〜
    ４８８番のアミノ酸配列をコードする酸トランス作用ド
    メイン（ＴＡＤ）を含んでなるアクチベーターサブユニ
    ットＢ、および 3) ＳＶ４０基底プロモーターの４８〜５１９１番の
    ヌクレオチド配列に操作可能に連結した配列番号２のヌ
    クレオチド配列を有するＧａｌ４に対する結合配列、 配列ＧＣＣＡＣＣ、 免疫グロブリンシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ
    の６３〜１０７番のヌクレオチド配列、およびβ−グル
    クロニダーゼに対するｃＤＮＡの９３〜１９８２番のヌ
    クレオチド配列を含んでなるアクチベーター応答プロモ
    ーターを含んでなる要素Ｖと、 von Willebrand因子（ｖＷＦ）遺伝子のプロモーターの
    −４８７〜＋２４７番のヌクレオチド配列、およびＴＡ
    ＴＡボックス結合タンパク質（１〜１００１番のヌクレ
    オチド配列）の遺伝子であって、ヌクレオチド８６２の
    ＡがＴで置換され、８８９および８９０のＧＴがＡＣで
    置換され、および８９５のＣがＧで置換されているもの
    を含んでなる要素VIとを含むアクチベーター応答プロモ
    ーター単位とを含んでなる、請求項２〜２１のいずれか
    一項に記載の核酸構築物。
25. 【請求項２５】トランス遺伝子(b) 、核輸出因子(k) 、
    ＴＢＰ(d) 、およびアクチベーター応答プロモーター
    (g) の結合タンパク質(f) および／または(f')を含む成
    分の少なくとも一つにおける少なくとも一つの遺伝子を
    突然変異させて、発現したタンパク質が機能できないよ
    うにし、かつ成分 d) が突然変異に相補性のアンチコド
    ンを有するかまたは上記成分での突然変異を除くための
    精確なアミノ酸を取りこむ末端基を有するｔＲＮＡに対
    する遺伝子である、請求項２０に記載の核酸構築物。
26. 【請求項２６】下記のコドンＵＡＵ、ＵＵＧ、ＵＡＣ、
    ＵＣＧ、ＣＡＧ、ＡＡＡ、ＡＡＧまたはＵＧＧの少なく
    とも一つを突然変異させてＵＡＧ、ＵＡＡ、ＵＡＧ、Ｕ
    ＧＡまたはＵＧＧとし、サプレッサーｔＲＮＡ（成分
    d)）が遺伝子ｓｕｐＦ（ｓｕ＋３）、ｓｕｐＣ（ｓｕ＋
    ４）、ｓｕｐＤ（ｓｕ＋１）、ｓｕｐＥ（ｓｕ＋２）、
    ｓｕｐＧ（ｓｕ＋５）またはｓｕｐＵ（ｓｕ＋７）であ
    る、請求項２５に記載のヌクレオチド構築物。
27. 【請求項２７】核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の
    核酸構築物。
28. 【請求項２８】核酸構築物が、プラスミドベクターまた
    はウイルスベクターを含むベクターである、請求項２７
    に記載の核酸構築物。
29. 【請求項２９】トランス遺伝子(b) が、サイトカイン、
    インターフェロン、成長因子、抗体、サイトカインまた
    は成長因子に対するレセプター由来の抗体断片、増殖防
    止、細胞消滅、細胞増殖抑制または細胞溶解作用を有す
    るタンパク質、血管形成抑制剤、および／または血栓誘
    発タンパク質、凝集抑制剤、フィブリン溶解作用を有す
    るタンパク質、血漿タンパク質、補体活性化タンパク
    質、コブラ毒因子、ヒトＣ３ｂ、改質Ｃ３ｂ、細菌性タ
    ンパク質、ウイルスコートタンパク質、細菌性抗原、寄
    生動物性抗原、腫瘍抗原、血液循環に効果を有するタン
    パク質、ペプチドホルモン、酵素、リガンドと活性化合
    物とからなる融合タンパク質、アンチセンスＲＮＡ、お
    よびリボザイムからなる群から選択される薬理学的に活
    性な化合物をコードする構造遺伝子である、請求項１〜
    ２８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
30. 【請求項３０】トランス遺伝子(b) が、薬剤の前駆物質
    を開裂させて薬剤を形成する酵素をコードする、および
    ／またはリガンド／酵素融合タンパク質をコードする構
    造遺伝子である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載
    の核酸構築物。
31. 【請求項３１】リガンドが、増殖している内皮細胞また
    は腫瘍細胞に結合するものであり、かつ抗体およびその
    断片、マンノースを末端に含むタンパク質、サイトカイ
    ン、成長因子、および接着分子からなる群から選択され
    る、請求項３０に記載の核酸構築物。
32. 【請求項３２】サイトカインがＩＬ−１またはＴＮＦで
    あり、成長因子がＰＤＧＦ、Ｇ−ＦＧＦ、ＶＥＧＦまた
    はＴＧＦβであり、接着分子がＳＬｅｘ、ＬＦＡ−１、
    ＭＡＣ−１、ＬＥＣＡＭ−１またはＶＬＡ−１である、
    請求項２９に記載の核酸構築物。
33. 【請求項３３】請求項１〜３２のいずれか一項に記載の
    核酸構築物を含む単離細胞。
34. 【請求項３４】細胞がマクロファージ、リンパ球、内皮
    細胞または腫瘍細胞である、請求項３３に記載の単離細
    胞。
35. 【請求項３５】過度の細胞増殖、腫瘍、循環器疾患、自
    己免疫疾患、アレルギー、炎症、臓器移植拒絶反応、関
    節炎、感染性疾患またはニューロン疾患を含む疾患の患
    者を治療するための、細胞増殖抑制量の核酸構築物を含
    む医薬を製造することによる細胞増殖を抑制する方法。
36. 【請求項３６】細胞増殖抑制量の請求項１〜３２のいず
    れか一項に記載の核酸構築物と、薬学上許容可能な担体
    とを含む医薬組成物。