DE69532115T2

DE69532115T2 - P75 tnf-rezeptor-promotoren

Info

Publication number: DE69532115T2
Application number: DE69532115T
Authority: DE
Inventors: David Wallach; Peter Kuhnert; Gotz Ehrhardt; Oliver Kemper
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1994-05-11
Filing date: 1995-05-11
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2015-05-12
Also published as: DE69532115D1; PT759759E; EP0759759A1; IL109633A0; WO1995031206A1; ES2206505T3; ZA953841B; AU2546895A; CA2189984C; CA2189984A1; EP0759759B1; DK0759759T3; EP0759759A4; AU699280B2; CY2524B1; ATE254173T1; IL109633A; JPH10500304A; JP3663211B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Promotorsequenz für den p75-Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNF-R), seine Herstellung und Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
TNF ist ein Cytokin des Entzündungsprozesses mit vielen Funktionen, das einen großen Bereich an zellulären Funktionen beeinflußt. Einerseits ist TNF beim Schutz des Organismus beteiligt, kann jedoch andererseits, wenn es überproduziert wird, eine wichtige pathogene Rolle bei mehreren Krankheiten spielen. Von TNF ist bekannt, dass es an den entzündlichen Vorgängen beteiligt ist und beim septischen Schock (1), bei den Graft-versus-Host-Reaktionen (2) und bei rheumatischen Erkrankungen (3) Gewebeschäden vermittelt.
TNF übt diese Wirkungen durch Bindung an zwei verschiedene Zelloberflächenrezeptoren aus, die sich in der Größe unterscheiden (etwa 55 und 75 kDa) und strukturell verschiedene intrazelluläre Domänen besitzen, was nahe legt, dass sie unterschiedliche Signale vermitteln (4–11). Fast alle Zellen exprimieren TNF-Rezeptoren (TNF-Rs), die Mengen und die relativen Anteile der zwei Rezeptoren sind jedoch in verschiedenen Zellarten unterschiedlich. Diese Unterschiede sind zum Teil durch den Entwicklungszustand kontrolliert; sie stehen in Bezug zum Phänotyp der Zelle und ihrem Differenzierungszustand und können teilweise transient durch Cytokine und immunstimulierende Komponenten von Pathogenen induziert werden (12–22). Untersuchungen der Funktion der zwei TNF-Rs zeigen, dass sie verschiedene, aber wechselwirkende Aktivitäten haben (23–28) und dass ihr Aktivitätsniveau mit dem Ausmaß ihrer Expression durch die Zelle korreliert werden kann (29, 30). Eine partielle Charakterisierung des Promotors des menschlichen p55-TNF-Rezeptors wurde beschrieben (74).
Diese Ergebnisse besagen, dass Mechanismen, die die Mengen und den relativen Anteil der TNF-Rs beeinflussen, einen bedeutenden Einfluß auf die Art und das Ausmaß der zellulären Antwort auf TNF haben können und somit wichtige Determinanten der physiologischen und pathologischen Manifestation der Funktion dieses Cytokins darstellen.
Um die schädlichen Wirkungen von TNF zu inhibieren, wurden Wege gesucht, die mit der Bindung von TNF an seine Rezeptoren interferieren würden. Dabei wurden neutralisierende Antikörper gegen TNF erzeugt ( EP 186 833 ). Ein anderer Weg zur Inhibierung der Wirkung von TNF war die Bereitstellung von löslichen TNF-Rezeptoren, die mit den TNF-Rs der Zelloberfläche um die Bindung von TNF konkurrieren ( EP 308 378 und EP 398 327 ).
Da für die Ausübung seiner Wirkung die Bindung von TNF an seine Rezeptoren erforderlich ist, sollte es möglich sein, die schädlichen Wirkungen von TNF zu vermindern oder zu inhibieren, wenn weniger oder keine Oberflächenrezeptoren exprimiert werden. Andererseits kann es in gewissen Fällen erwünscht sein, die nützliche Wirkung von TNF zu verstärken, und in einem solchen Fall könnte dies möglicherweise durch Erhöhung der Zahl an exprimierten Zelloberflächenrezeptoren erreicht werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung stellt eine Promotorsequenz des menschlichen p75-TNF-R-Gens bereit, die ausgewählt ist aus einer Sequenz, die sich stromaufwärts vom 5'-Ende des Gens befindet, und einer Sequenz, die sich im ersten Intron des Gens befindet. Die 5' stromaufwärts gelegene Promotorsequenz (genannt Promotorsequenz der 5'-Region) ist innerhalb einer Sequenz von 2,1 kbp enthalten, und die Intron-Promotorsequenz ist innerhalb einer Sequenz von 1,9 kbp enthalten. Die Promotorsequenz der 5'-Region ist in der Lage, die Expression des Produkts des nativen p75-TNF-R-Gens zu kontrollieren, während die Promotorsequenz der Intron-Region in der Lage ist, die Expression eines verkürzten Produkts des p75-TNF-R-Gens zu kontrollieren. Darüber hinaus kann der Promotor der Intron-Region auch als ein Enhancer-Element für die Transkription des p75-TNF-R-Gens fungieren. Darüber hinaus hat der Promotor der Intron-Region stromaufwärts vom Intron-Promotor eine Region der Inhibierung der Transkription, die als Modulator für die Expression des verkürzten Produkts des p75-TNF-R-Gens dienen kann.
In bevorzugten Ausführungsformen stellt die Erfindung das NcoI-Fragment von 2,18 kbp bereit, das die Promotorsequenz der 5'-Region codiert, und das SmaI-Fragment von 1,8 kbp, das die Intron-Promotorsequenz codiert, wobei beide Fragmente von einer genomischen Bibliothek abgeleitet sind, die das menschliche p75-TNF-R enthalten. Andere bevorzugte Ausführungsformen, die von der Endung bereitgestellt werden, sind ein Teil der Promotorsequenz der 5'-Region, der die wesentliche Promotoraktivität enthält und der sich mindestens zwischen den Nucleotiden 1335 und 1527 de Sequenz erstreckt, die in 2A dargestellt ist; ein Teil der Intron-Promotorsequenz, der die wesentliche Promotoraktivität enthält und der sich mindestens zwischen den Nucleotiden 1569 und 1768 oder mindestens zwischen den Nucleotiden 1569 und 1827 der Sequenz erstreckt, die in 2B dargestellt ist; und ein Teil der Intron-Promotorregionsequenz, der die Region der Inhibierung der Transkription enthält und sich zwischen den Nucleotiden 1 und 1569 der Sequenz erstreckt, die in 2B dargestellt ist.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Sequenzmotive bereit, die in den vorstehend beschriebenen Promotorsequenzen vorhanden sind, einschließlich der Promotoren der 5' stromaufwärts gelegenen Region und der Intron-Region ebenso wie die Region der Inhibierung der Transkription der Intron-Region. Von solchen Motiven ist gezeigt worden, dass sie gewisse Transkriptionsfaktoren binden, die für die Promotoraktivität erforderlich sein könnten und in die Regulierung dieses Promotors involviert sein könnten.
Die Motive können durch Deletion der unerwünschten Sequenzen stromaufwärts und/oder stromabwärts des gewünschten Motivs in der vollen Sequenz hergestellt werden, z. B. durch Verwendung von Restriktionsenzymen, um die volle Promotorsequenz zu schneiden, um zu den gewünschten Motiven zu kommen, und das resultierende Motiv kann dann mit geeigneten Kontrollsequenzen und anderen erforderlichen herkömmlichen Mitteln in einen Vektor inseriert werden, um einen Vektor zu erhalten, der bei Inserierung in einen geeigneten prokaryontischen Stamm bei Züchtung des Stamms zur Expression des gewünschten Motivs in der Lage ist.
Das so erhaltene Motiv kann verwendet werden, um z. B. eine menschliche genomische Bibliothek oder eine cDNA-Bibliothek nach Faktoren zu durchmustern, z. B. Transkriptionsfaktoren, die daran binden. Nachdem dieses Faktoren mittels jedes herkömmlichen Verfahrens isoliert, gereinigt und identifiziert wurden, sollte ihre Inhibierung die TNF-R-Bildung inhibieren, während ihre erhöhte Produktion eine erhöhte Expression von TNF-R verursachen sollte, was zu den gewünschten Wirkungen führen sollte, d. h. Inhibierung oder Verstärkung der TNF-Bindung an seine Rezeptoren.
Da die in vivo vorhandene Menge an spezifischen Transkriptionsfaktoren nicht unbeschränkt ist, könnte die Inhibierung der TNF-R-Expression und als Konsequenz die Inhibierung der schädlichen Wirkungen von TNF auch durch die Expression einer großen Zahl von Motiven oder Motivregionen erreicht werden. Diese werden mit Promotoren, die solche Motive oder Motivregionen enthalten, um die Bindung der Transkriptionsfaktoren konkurrieren. Eine "Motivregion" umfaßt das Motiv selbst, zusammen mit Sequenzen, die es auf beiden Seiten flankieren, oder mehrere Motive, die durch Teile der gesamten Promotorsequenz verknüpft sind und auf beiden Seiten von Sequenzteilen flankiert sind. Es sollte verstanden werden, dass ein Motiv oder eine Motivregion gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend festgehalten und wie nachstehend ausgeführt, diejenigen umfaßt, die in den aktiven Promotorregionen und der die Transkription inhibierenden Region gemäß der Erfindung umfaßt. Vergleichbar umfassen die Transkriptionsfaktoren der Erfindung diejenigen, die die aktiven Promotorregionen binden, und diejenigen, die die Transkription inhibierende Region umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit, die ein Sequenzmotiv gemäß der Erfindung umfassen.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Arzneimittel bereit, die eine Motivregion gemäß der Erfindung umfassen.
Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt schematisch die partielle Restriktionskarte und verschiedene pBluescript-Subclone der 5'-Region, einschließlich der 5' stromaufwärts gelegenen Region, das erste Exon, das erste Intron und das zweite Exon des menschlichen p75-TNF-R-Gens, wie in Beispiel 1 beschrieben.
2 (A und B) zeigt schematisch die Nucleotidsequenz der 5' stromaufwärts gelegenen Promotorregion (2A) und die Intron-Promotorregion (2B), wie in Beispiel 2 beschrieben.
3 zeigt graphisch die Resultate der Bestimmung der Aktivität der 5' stromaufwärts gelegenen Promotorregion und die Intron-Promotorregion, bestimmt in einem Test, bei dem diese Promotorregionen verwendet wurden, um die Expression (angegeben in relativen Lichteinheiten – RLU) des Luciferase-Gens in Expressionsvektoren zu kontrollieren, die Luciferase codieren, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Eine menschliche genomische Bibliothek, die den menschlichen p75-TNF-R enthält, wurde von Stratagene erhalten. Diese Bibliothek war eine Phagen-Bibliothek, bei der 8 Phagen positiv als Träger des menschlichen p75-TNF-R-Gens identifiziert wurden, wobei 6 Phagen unterschiedlich waren. Verschiedene Fragmente von den positiven Phagen wurden isoliert, cloniert und sequenziert.
Wie hier nachstehend in den Beispielen im Detail dargestellt, haben wir die Sequenz der 5'-Region des menschlichen p75-TNF-Rezeptor-Gens bestimmt. Wir zeigen, dass eine Region von 2 kb 5' stromaufwärts von der publizierten cDNA ebenso wie eine Region im 3'-Teil des ersten Introns Promotoraktivität enthalten. Es gibt Berichte über verschiedene mRNA-Größen für den p75-R, und es sieht so aus, dass dies nicht nur von verschiedenen 3'-Enden resultiert, sondern auch von verschiedenen 5'-Enden. Das Auffinden von Promotoraktivität in den Regionen des Gens, die wir sequenziert haben, ist ein starker Hinweis darauf, dass wir mindestens einen der Promotoren für das menschliche p75-TNF-Rezeptor-Gen cloniert haben. Die Analyse der Primerverlängerung und RACE werden zeigen, wo das 5'-Ende des Gens ist und welche Produkte des p75-TNF-R-Gens erhalten werden, wenn die Expression dieses Gens von verschiedenen Promotorregionen kontrolliert wird. Es wurden eine Reihe von Cloven abgeleitet (wie in Beispiel 1 und 2 dargestellt), die die gesamte 5' stromaufwärts gelegenen Promotorregion oder Teile davon oder die gesamte Intron-Promotorregion oder Teile davon codieren. Die Aktivität der 5' stromaufwärts gelegenen Promotorregion und der Intron-Promotorregion wurde durch Insertion dieser Regionen in einen Vektor gezeigt, der Luciferase codiert, wobei anschließend gezeigt wurde, dass sie zur positiven Kontrolle der Expression des Luciferase-Gens in der Lage sind (Beispiel 3).
Die Untersuchung der Promotorsequenzen, die in der 5' stromaufwärts gelegenen Region und in der ersten Intron-Region des p75-TNF-R-Gens (vgl. nachstehend Beispiel 2) liegen, offenbart eine Vielzahl von Sequenzmotiven, die eine Antwort auf Transkriptionsfaktoren ermöglichen können, die durch induzierende Mittel beeinflußt sind, einschließlich zum Beispiel TATA-Boxen, CAP-Stellen und Consensus-Sequenzen für AP-2 und NF-κB (vgl. auch 2A und 2B). Diese regulatorischen Elemente können induzierte transiente Änderungen zulassen, die dem Muster der konstitutiven Expression des Rezeptors überlagert sind, vielleicht durch Wirkungen von gewissen Cytokinen, die sich an den Stellen der Entzündung bilden.
Unter den vermutlichen Motiven, die in den Promotorregionen unterschieden werden (5' stromaufwärts gelegene Region und erste Intron-Region) scheinen die folgenden von besonderem Interesse zu sein: in der 5' stromaufwärts gelegenen Promotorregion sind drei kanonische TATA-Boxen, von denen zwei sehr dicht von CAP-Stellen gefolgt werden; drei nahe beieinander liegende kappa-E2-Motive mit gleichem Abstand; vier benachbarte GC-Boxen; und Bindungsmotive für mehrere Transkriptionsfaktoren, die die Wirkungen einiger induzierender Faktoren vermitteln können, von denen bekannt ist, dass sie die p75-TNF-R-Expression erhöhen, einschließlich NF-κB, dem Cytokin-2-Motiv und AP-2. In der ersten Intron-Promotorregion, insbesondere am 3'-Ende des ersten Introns, gibt es unter anderem eine TATA-Box, der 25 bp stromabwärts eine CAP-Stelle folgt, und ein dreifaches TCC-Wiederholungsmotiv, das in der p55-TNF-R-Promotorregion zweimal auftritt.
Man nimmt daher an, dass die 5' stromaufwärts gelegenen Promotorregion des p75-TNF-R-Gens die Region ist, die für die Promotoraktivität des p75-TNF-R-Gens erforderlich ist, nämlich die Kontrolle der Expression des Gens, damit letztlich die Produktion des normalen p75-TNF-Rezeptorprodukts resultiert, während die Promotorregion im ersten Intron ein Zeichen dafür ist, dass das p75-TNF-R-Gen andere Formen des Rezeptors codiert. Darüber hinaus kann die Promotorregion im ersten Intron auch als Enhancer-Element für die Transkription des p75-TNF-R-Gens fungieren. Weiterhin enthält die Promotorregion im ersten Intron auch eine Region der Inhibierung der Transkription stromaufwärts von der aktiven Intron-Promotorregion, wobei diese inhibierende Region in die Modulation der Expression von anderen Formen von p75-TNF-R involviert sein kann.
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele illustriert:
Zelllinien und Kulturbedingungen:
Babyhamster-Nierenzellen (BHK) wurden unter Standard-BHK-Zellkulturbedingungen (DMEM + 10% FCS + 2 mM Glutamin) wachsen gelassen und gehalten.
BEISPIEL 1
Clonierung und Analyse von Clonen, die die 5'-Region des p75-TNF-R-Gens enthalten
Zwei menschliche genomische Bibliotheken wurden mit der cDNA voller Länge, die menschliches p75-TNF-R codiert (auch bekannt als TNF-RII), durchmustert (unter Verwendung von Standard-Hybridisierungsverfahren). Diese cDNA enthielt die Sequenz von den Basen 90-1475 der Sequenz gemäß Smith et al. (10). Die folgenden menschlichen genomischen Bibliotheken in der Form von rekombinanten Phagen-Bibliotheken wurden verwendet: eine ATCC-Bibliothek (ATCC Nr. 57738), spezifisch für das menschliche Chromosom 1; und eine menschliche Lymphocyten-Bibliothek von Stratagene (Stratagene-Nr. 943202). Mehrere Durchmusterungen der ATCC-Bibliothek ergaben keine positiven Phagen, d. h. keine Phagen, die eine Sequenz enthielten, die mit der cDNA-Sonde von p75-TNF-R hybridisieren konnte, waren in der Bibliothek enthalten. Die Durchmusterungen der Stratagene-Bibliothek ergab 8 positive Phagen, von denen 6 sich voneinander unterschieden, wie durch eine vergleichende Analyse mit Restriktionsenzymen gezeigt wurde (Ergebnisse nicht gezeigt).
Zwei der vorstehenden unterschiedlichen positiven Phagen, U und H genannt, wurden mittels Hybridisierung mit verschiedenen Fragmenten der p75-TNF-R-cDNA weiter untersucht: U und H hybridisierten beide mit einem Fragment von 250 bp des 5'-Endes der cDNA, einschließlich der nicht translatierten Region (UTR), hybridisierten aber nicht mit einem etwas kürzeren Fragment von 160 bp der cDNA, die in dem vorstehenden Fragment von 250 bp am äußersten 5'-Ende enthalten war. Ein dritter Phage von den vorstehenden unterschiedlichen Phagen, G genannt, wurde mit dem vorstehenden Fragment von 160 bp der 5'-Region der cDNA isoliert. Somit codiert auch G eine 5'-Region des p75-TNF-R-Gens.
Die weitere Charakterisierung der drei Phagen (U, H, G) durch Hybridisierung mit den 5'-cDNA-Fragmenten (Sonden) ergab, dass: (i) bei U und H zwei SmaI-Restriktionsfragmenten mit Größen von 1,9 und 3,6 kb, erhalten von der p75-TNF-R-Sequenz, die in diesen Phagen enthalten ist, mit der vorstehend erwähnten cDNA-Sonde von 250 bp hybridisierten; und (ii) bei G die vorstehend erwähnte cDNA-Sonde von 160 bp mit den zwei NcoI-Fragmenten mit Größen von 2 und 1,1 kb und auch mit einem EcoRI-Fragment von 2,4 kb und einem PstI-Fragment von 1,5 kb hybridisierte, wobei alle diese NcoI-, EcoRI- und PstI-Fragmente von der p75-TNF-R-Sequenz erhalten wurden, die im Phagen G enthalten ist. Alle vorstehenden Fragmente von den Phagen U, H und G, die mit den cDNA-Sonden von 250 oder 160 bp hybridisierten, wurden dann in Plasmide subcloniert. Die Subclonierung wurde mittels Standardverfahren unter Verwendung des Plamids pBluescript (Stratagene) vorgenommen. Nach der Subclonierung wurden die verschiedenen subclonierten Fragmente der Phagen U, H und G mittels Analyse mit Restriktionsenzymen analysiert, um eine Restriktionskarte zu erhalten. In 1 ist schematisch die Restriktionskarte (partiell) der Plasmidclone gezeigt, die die 5'-Region des menschlichen p75-TNF-R-Gens abdecken. Es sollte festgehalten werden, dass die in 1 gezeigten Plasmide vom Phagen G abgeleitet waren (gNco1, gNco2, gPst, gEco und die verschiedenen Subclone von gNco2, die unter gNco2 gezeigt werden), während der SmaI-Clon (Usm1) vom Phagen U abgeleitet war. In 1 zeigen die schwarzen Balken die Regionen, die hier sequenziert wurden (d. h. von den Subclonen gNco2, gNco1 und Usm1 – vgl. nachstehend Beispiel 2); die gefüllten Boxen zeigen die Regionen mit bekannter cDNA-Sequenz von Smith et al. (10); und die Exon-/Introngrenzen werden mit "GT" (Start von Intron I/Ende von Exon I) und "AG" (Start von Exon II/Ende von Intron I) gekennzeichnet.
Um sicherzustellen, dass die Phagen der vorstehenden Stratagene-Bibliothek die genomische Organisation des p75-Gens repräsentieren und nicht das Ergebnis von Rekombination sind, wurden die folgenden Tests (oder "Check-ups") durchgeführt:

(i) Dass das SmaI-Fragment von 1,9 kb das genomische SmaI-Fragment darstellt, kann indirekt durch die Tatsache gezeigt werden, dass zwei unabhängige Phagen (U und H) dasselbe Fragment enthalten, das mit der cDNA-Sonde von 250 bp hybridisiert.
(ii) Um zu testen, ob das einzelne Phagenisolat G von der äußersten 5'-Region ( d. h. dem äußersten 5'-Ende des p75-TNF-R-Gens) die genomische Organisation repräsentiert, wurde ein Vergleich des Restriktionsmusters des Phagen mit dem von nativer genomischer DNA von U937-Zellen durch Verdau des Phagen und der genomischen DNA mit BamHI, EcoRI und PstI, gefolgt von Hybridisierung mit dem NcoI-Fragment von 2 kb (von Subclon gNco2), vorgenommen. Der Vergleich des genomischen Restriktionsmusters und des Restriktionsmusters des Phagen und die Hybridisierung der Restriktionsfragmente mit der NcoI-Fragment-Sonde von 2 kb zeigte, dass der Phage und die genomischen DNA dasselbe Restriktionsmuster hatten, wobei dieselben Fragmente mit der Sonde hybridisierten (Resultate nicht gezeigt). Somit stellt das einzelne Phagenisolat G die aktuelle genomische Organisation der 5'-Region des p75-TNF-R-Gens dar.

Darüber hinaus ergeben sich aus der vorstehenden Clonierungs-, Hybridisierungs- und Restriktionsanalyse die folgenden Fakten: a) unter Verwendung des ersten Teils (90-1475 bp) der publizierten cDNA als Sonde können 8 unabhängige Phagen (wobei sich 6 voneinander unterscheiden) aus der Stratagene-Bibliothek isoliert werden, von denen jeder eine Insertion von etwa 15–20 kbp hat, wobei dies darauf hindeutet, dass das p75-TNF-R-Gen relativ groß ist und sich über mehrere Dutzend kbp erstreckt; und b) angesichts der Tatsache, dass die Phagen U und H unabhängig voneinander nicht die äußerste 5'-Region des p75-TNF-R-Gens enthielten, ist das erste Intron (Intron I) auch relativ lang (> 10 kb).
BEISPIEL 2
Seguenz und Charakterisierung der 5'-Region des p75-TNF-R-Gens
Um die Struktur der 5'-Region des p75-TNF-R-Gens zu ermitteln, d. h. die Lage und Natur der Promotorregion, wurden die verschiedenen Clone (Subclone in pBluescript – vgl. vorstehend Beispiel 1) entweder teilweise oder vollständig sequenziert (vgl. schwarze Balken in 1). Insbesondere wurden die Clone gNco2 und Usm1 vollständig sequenziert, während die Clone gNco1, gPst und gEco teilweise sequenziert wurden. In 2 (A und B) sind schematisch die Sequenzen der zwei Teile der 5'-Region des p75-TNF-R-Gens gezeigt, die vollständig sequenziert wurden. Die Sequenzierung erfolgte mittels Standardverfahren, bei denen die vorstehenden Clone in pBluescript in beiden Richtungen entweder mittels des Sequenase Version 2.0-Kits (USB) oder automatisch mit dem automatischen Sequenziergerät von Applied Biosystems (Modell 737A-DNA-Sequenziergerät, Applied Biosystems, USA) sequenziert wurden. Nach der Sequenzierung wurde eine allgemeine Sequenzanalyse unter Verwendung des GCG (Genetics Computer Group, Madison, U.S.A., Standard-Computersoftwarepaket)-Pakets durchgeführt und die spezifische Sequenzanalyse, d. h. Identifikation von Bindungsmotiven für Transkriptionsfaktoren, wurde mit der FINDPATTERNS-Option des vorstehenden Standard-Softwarepaket durchgeführt. In 2A ist die Sequenz der äußersten 5'-Region des p75-TNF-R-Gens dargestellt, einschließlich des ersten Exons und der Exon/Intron-Grenze (die ersten Exonsequenzen und die Exon/Intron-Grenze wurden unter Berücksichtigung der cDNA-Sequenz von Smith et al. (10) bestimmt). Die Aminosäuresequenz der cDNA ist oberhalb der Nucleotidsequenz angezeigt. Unterstrichen sind vier kanonische TATA-Boxen ebenso wie andere Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren (d. h. kappa-E2-Stellen und GC-Boxen). Der Stern (*) zeigt den Start der cDNA gemäß Smith et al. (10). In 2B ist die Sequenz des Endes des ersten Introns und ein Teil des zweiten Exons dargestellt (auch dies basiert auf Information von der cDNA-Sequenz von Smith et al. (10)). Unterstrichen sind vermutliche TATA-Boxen, die hypersensitive Stelle für S1-Nuclease (S1-HS), die eine TCC-Wiederholung ist, die CAP-Stelle und verschiedene andere, vermutliche Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren. Die Aminosäuresequenz der cDNA ist oberhalb der Nucleotidsequenz angezeigt (d. h. dies ist der Start des zweiten Exons).
Die Sequenzanalyse zeigte die folgenden charakteristischen Eigenschaften der 5'-Region des p75-TNF-R-Gens:

(i) Am äußersten 5'-Ende des p75-TNF-R-Gens (d. h. die Sequenz von 2A und die angezeigte Sequenzregion von verschiedenen Subclonen vom Phagen G, dargestellt in 1 und beschrieben in Beispiel 1): In dieser Region zeigte ein Vergleich der cDNA-Sequenz mit unserem genomischen Clon der 5'-Region, dass die Basen 1-166 der cDNA-Sequenz identisch sind mit unserer Sequenz in derselben Region, wobei das 3'-Ende dieser Region die codierende Sequenz für die Aminosäuren 1–26 enthält und zusammenhängend gefolgt wird von der Intronsequenz mit der charakteristischen GT-Dinucleotid-Consensus-Splicestelle an der 5'-Grenze des Introns. Der besagten Sequenz geht die 89 Nucleotide lange nicht translatierte 5'-Region (UTR) der publizierten cDNA-Sequenz (10) voraus. Da eine ähnliche UTR-Länge von einer anderen Gruppe für die p75-R-cDNA (35) beschrieben wurde, entspricht sie wahrscheinlich der ursprünglichen Größe der p75-TNF-R-Botschaft. Das erste Nucleotid in dieser UTR-Sequenz, welches die Stelle der Transkriptions-Initiation sein kann, ist mit einem Stern gekennzeichnet. Die Sequenz stromaufwärts davon enthält drei kanonische TATA-Boxen (an den Positionen 1139, 1183 und 1431 der Sequenz von 2A) und zusätzlich eine unkonventionelle TATA-Box an Position 1318. Auf zwei TATA-Boxen, an den Positionen 1318 und 1431, folgen CAP-Stellen. In beiden Fällen ist jedoch der Abstand zwischen der CAP-Stelle und der TATA-Box außergewöhnlich klein (5 bp). Welche der vorstehenden TATA-Boxen (oder alle) funktionell aktiv ist, kann mittels Standard-Analyse bestimmt werden. In der Sequenz ist kein CCAAT-Motiv vorhanden. Eine Sequenz ähnlich dem Initiations-Motiv, von der gezeigt wurde, dass sie in die Definition der Transkriptions-Startstelle involviert ist (36), liegt an Position 1918 (YY1). Zwei überlappende GC-Boxen sind an den Positionen 1938 und 1943 vorhanden und zwei andere an den Positionen 2082 und 2164 der Sequenz von 2A. Die zwei überlappenden GC-Boxen liegen innerhalb eines GC-Abschnittes von 22 bp. Solch lange GC-Sequenzen wurden als Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor ETF vorgeschlagen (37, 38). An Position 1566 gibt es eine AT-reiche Sequenz von 31 bp, die als ein HMGI-Bindungsmotiv dienen kann. Bei gewissen Promotoren ist gezeigt worden, dass solche Motive zur Wirkung des Promotores beitragen (39). Eine 3-fache Wiederholung des kappa E2-Motivs, welches einen Teil des Enhancers des Gens für die leichte Immunglobulin-kappa-Kette (40) darstellt, wird an den Positionen 1732, 1747 und 1762 der Sequenz von 2A gefunden. Die drei Wiederholungen werden sehr eng und mit gleichem Abstand durch die beiden gleichen Hexanucleotide (AGGCCG) getrennt. Unter den vermutlichen Transkriptionsfaktor-Bindungsmotiven in der flankierenden 5'-Region gibt es mehrere, die eine Antwort auf Mittel übertragen könnten, von denen gezeigt wurde, dass sie die Expression von p75-R beeinflussen. Diese umfassen ein NF-κB-Motiv (32) an den Positionen 130 (Umkehrstrang), 194 (Umkehrstrang) und 577 und eine Stelle, die homolog ist mit dem Cytokin-1-Motiv (41), das mit dem NF-κB-Motiv an Position 194 der Sequenz von 2A überlappt. NF-κB-Stellen können Ansprechen auf TNF und IL-1 (42) übertragen, während das Cytokin-1-Motiv von TNF induzierte Faktoren bindet. Von TNF und IL-1 ist gezeigt worden, dass sie die Expression von p75-R in gewissen Zellen erhöhen (43, 44). Das Hexanucleotid AAGTGA, das in einer repetitiven Form ein auf Interferon ansprechendes Motiv darstellt (45), befindet sich an den Positionen 599 (Umkehrstrang), 1356 (Umkehrstrang) und 1616. Eine kürzlich definierte Consensussequenz, die F6-Consensussequenz G A/G A A G C N G A A A G, die den von Interferon induzierten Transkriptionsfaktor IRF-1 (46) bindet, liegt bei Position 1982 (Umkehrstrang). Die Consensusstelle für AP-2 T/C C G/C C C A/C N G/C G/C G/C (47) findet man an der Position 1938, mit der potentiellen ETF-Stelle überlappend, und Umkehr-Kopien dieses Elements liegen an den Positionen 269, 874 und 1904 der Sequenz von 2A. Da jedoch diese Consensussequenz fast vollständig aus degenerierten Basen besteht, ist ihre Bedeutung unsicher. AP-2 ist in die Antwort auf PMA und auf CAMP involviert (33). Von beiden Mitteln ist gezeigt worden, dass sie den p75-TNF-Boten induzieren (48, 49, 50). Eine Sequenz, ähnlich dem auf CAMP ansprechenden Element, TGAGTCA (51), tritt an Positionen 1242 auf, obgleich mit zwei Fehlpaarungen. Von dem p75-Boten wurde auch berichtet, dass er bei T- und B-Zellaktivierung aktiviert wird. Bei diesem Prozeß wurde gezeigt, dass Oktamer-Bindungsfaktoren (für B- und T-Zellen) (52, 53) und ein Faktor, der die P-Sequenz des IL-4-Promotors bindet, CGAAAATTTCC, (für T-Zellen) (54) eine Rolle spielen. Eine Sequenz ähnlich dem Oktamer-Motiv, ATGTAAAT, tritt an Position 918 und die P-Kernsequenz, AAATTTTT, an Position 1222 der Sequenz von 2A. auf.
(ii) Die Intron-Sequenz: Dieses erste Intron wurde nur partiell sequenziert (vgl. die schwarzen Balken in 1, das Ende der Sequenz in 2A – d. h. beginnend mit dem GT-Diducleotid und dann getrennt nach einer langen (etwa 10 kb) nicht sequenzierten Strecke die gesamte Sequenz in 2B bis zu und einschließlich des AG-Dinucleotids unmittelbar vor der angezeigten translatierten Sequenz).

Der Vergleich der cDNA mit der Sequenz des clonierten genomischen SmaI-Fragments von 1.828 bp (2B) offenbarte, dass sie an ihrem äußersten 3'-Ende die Fortsetzung der cDNA enthält, wiederum mit dem charakteristischen AG-Dinucleotid an der 3'-Grenze des Introns, d. h. der Consensus-Spleißstelle: (C/U)₁₁NCAG (55), welche der codierenden Sequenz an Position 1795 der Sequenz von 2B vorausgeht, beginnend mit Val27 im Leader von p75-TNF-R. Wir nehmen daher an, dass diese Sequenz Teil des ersten Introns des p75-TNF-R-Gens ist. Überraschenderweise konnten wir innerhalb dieser Intron-Sequenz (vgl. unterstrichene Stellen in 2B) mehrere Stellen oder Regionen definieren, die für Promotoren und Induzierbarkeit durch Cytokine charakteristisch sind: an Position 630 gibt es eine kanonische TATA-Box, der 26 bp stromabwärts eine Sequenz folgt, die der Initiator-Bindungsstelle YY1 (36) ähnlich ist. Obwohl stromaufwärts von der TATA-Box kein CCAAT-Motiv aufzufinden ist, tritt an Position 668 gerade stromabwärts vom Initiator-Motiv eine umgekehrte Kopie des Elements auf. Ein TCC-Wiederholungsmotiv, das in verschiedenen Proto-Oncogenen und Promotoren von Haushaltsgenen ebenso wie zweimal im p55-TNF-R-Promotor (56) gefunden wird, tritt an den Positionen 238 und 1310 (umgekehrt) der Sequenz von 2B auf.
Ebenso enthält die Intron-Sequenz Consensus-Stellen für Transkriptionsfaktoren, die bei der Regulation der p75-R-Expression beteiligt sein können. Diese umfassen eine NF-B-Consensus-Sequenz (32) an Position 255, zwei Kopien einer Form des Cytokin-1-Motivs (von dem auch berichtet wurde, dass es auf TNF reagiert), wie es im menschlichen GM-CSF-Promotor vorkommt (41), an den Positionen 288 und 422 und eine auf Interferon reagierende Sequenz, AAGTGA (45) (vgl. vorstehend), an den Positionen 388, 567 (umgekehrt) und 757, ein Cytokin-2-Element an der Position 709 (57), und drei umgekehrte Kopien der AP-2-Consensus-Sequenz G G G/C C A/T G/C G/C C (47) an den Positionen 359, 406 und 774. Eine Consensus-Sequenz für den Glucocorticoid-Rezeptor, AGAWCAGW (58), kann an Position 1025 gefunden werden. Diese Stelle könnte zu der berichteten Hochregulierung der p75-R-mRNA in U937-Zellen durch Glucosteroide (59) beitragen. Eine Sequenz, die dem auf cAMP ansprechenden Element TGACGTCA (51) bis auf zwei Fehlpaarungen ähnelt, kann an den Positionen 381 und 530 gefunden werden.
Der unerwartete Befund von Promotoraktivität in einem Intron des p75-TNF-R-Gens deutet auf die mögliche Existenz von zusätzlichen Translationsprodukten dieses Gens, neben der bekannten Form des Rezeptors. Es gibt eine Reihe von ATGs stromabwärts von dem vermutlichen Initiations-Bindungsmotiv in dieser Sequenz. Dasjenige, das sich vor dem längsten ORF (150 bp) an Position 874 befindet, liegt innerhalb einer fast perfekten Kozak-Box. Die abgeleitete Sequenz von 50 Aminosäuren, die an diesem Punkt beginnt, zeigte keine Ähnlichkeit zu irgendeinem der Proteine, die in der Swiss-Proteindatenbank gefunden wurden (überprüft unter Verwendung des FASTA-Programms [GCG, 1991 – vgl. auch Ref. Nr. 60).
An der Position 1768, nahe am 3'-Ende des Introns, gibt es ein ATG-Startcodon, im Rahmen mit der codierenden Sequenz des Rezeptors. Die Sequenz, die dieses ATG umgibt, paßt nicht sehr gut mit der von Kozak (61) vorgeschlagenen Consensus-Sequenz zusammen, da sie ein T an Position –3 hat, was nur bei 1% der von Kozak analysierten 699 Sequenzen vorkommt. Auch der Translationsstart des p75-TNF-R-Rezeptors paßt jedoch nicht präzis zu der Consensus-Sequenz, da das C in seiner –3-Position nur in 3% der Sequenzen auftritt. Die an diesem "Intron"-ATG startende Translation würde eine verkürzte Form des Rezeptors ergeben, bei der die 26 N-terminalen Aminosäuren, die einen größeren Teil der Leader-Sequenz des beschriebenen TNF-R ausmachen, durch 9 andere Reste ersetzt sind, was darin resultieren kann, dass dieses Proteinprodukt ein intrazelluläres Protein ist. Es sollte auch festgehalten werden, dass auch ein Protein, von dem bekannt ist, dass es sezerniert wird, in einer intrazellulären Form existieren kann, wie es für den Antagonisten des IL-1-Rezeptors gezeigt wurde. Noch eine andere Möglichkeit könnte sein, dass die Translation der mRNA an einem Met innerhalb des cDNA-Teils stromabwärts von dem SmaI-Clon startet und somit einen Rezeptor codiert, dem nicht nur die Leader-Sequenz fehlt, sondern auch ein Teil der extrazellulären Domäne.
In jedem Fall erscheint es von der vorstehenden Analyse wahrscheinlich, dass die Promotorregion innerhalb der Intron-Sequenz des p75-TNF-R-Gens zwei neue Proteinprodukte codiert; ein neues Protein und einen neuen Leader. Unsere kürzliche Deletionsanalyse der clonierten ersten Intronregion, insbesondere der clonierten Intronregion von etwa 1,9 kb (vgl. nachstehend, Beispiel 3), ergab jedoch, dass stromaufwärts von dem vorgeschlagenen neuen Protein kein aktiver Promotor ist, und daher ist es nicht offensichtlich, wie solch ein neues Protein exprimiert werden kann. Demgemäß wird solch ein neues Protein, das von einer Sequenz (dem beobachteten ORF) innerhalb des ersten Introns des p75-TNF-R-Gens codiert wird, wahrscheinlich nicht exprimiert. Die neue Leader-Sequenz scheint jedoch angesichts dieser kürzlichen Deletionsanalyse in hohem Maße geeignet zu sein, was zeigt, dass ein starker Promotor genau stromaufwärts vom Beginn des Leaders vorhanden ist.
Im Folgenden ist die Sequenz dieses neuen Leaders, wobei die Numerierung der in 2B entspricht.
NEUER LEADER
Es sollte festgehalten werden, dass bei der vorstehenden Sequenz die Sequenznumerierung mit der Nucleotidsequenznummer wie in 2B beginnt und gefolgt wird von der Aminosäuresequenznummer, z. B. bei der ersten Sequenz (neuer Leader) ist die Nucleotidsequenz von 1768 bis 1827 und die Aminosäuresequenz ist von 1–20.
Darüber hinaus ist es auch möglich, dass die Promotorsequenz der Intronregion außer ihrer Fähigkeit der Kontrolle der Expression des vorstehend festgehaltenen neuen Leaderprodukts auch als ein Enhancerelement für die Transkription des p75-TNF-R-Gens fungieren kann. Solche stromabwärts gelegenen Enhancer sind in vielen eukaryontischen Genen wohl bekannt.
Darüber hinaus wurde nun gefunden (vgl. Beispiel 3 nachstehend), dass die Promotorregion des Introns eine die Transkription inhibierende Region stromaufwärts des aktiven Intronpromotors enthält, wobei diese inhibitorischen Region möglicherweise in die Modulation der Expression des p75-TNF-R-Gens involviert ist, insbesondere die Expression eines neuen p75-TNF-R-Produkts, das an dem vorstehenden neuen Leader anfängt, das heißt eine verkürzte Form des nativen p75-TNF-R.
Um die vorstehende Sequenzanalyse der zwei Promotorregionen des p75-TNF-R-Gens (des 5' stromaufwärts gelegenen Promotors und des Intronpromotors) weiter aufzuklären, ist das folgende eine Zusammenfassung des Vergleichs der Sequenzen von den Clonen G (5' stromaufwärts gelegene Promotorregion) und U (Intronpromotorregion) und von bekannten Sequenzmotiven, die als "Ref." angegeben sind.
Die Motive werden in zwei Gruppen dargestellt: diejenigen, die in exakt der Form gefunden wurden, wie sie von anderen berichtet wurde ("keine Fehlpaarung"), und diejenigen, die sicht leicht unterscheiden ("Fehlpaarung"). Somit wird für jedes Motiv die folgende Information gegeben: der Name des Motivs und seine berichtete Nucleotidsequenz; und die verwandten Sequenzen, die in den p75-R-Promotorsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung gefunden wurden.
Die vorstehende Information wird auf die folgende Weise angeboten:

(i) Der Phage, in dem wir das betreffende Motiv fanden. G bezeichnet den Phagenclon, in dem die 5' stromaufwärts gelegene Promotorsequenz gefunden wurde. U bezeichnet den Phagenclon, in dem die Promotorsequenz innerhalb des Introns gefunden wurde;
(ii) Die Positionen innerhalb der Sequenz mit Bezug auf die 2A (Clon G) und 2B (Clon U), in der wir das Motiv und die exakte Sequenz des Motivs beobachteten; und
(iii) Ref Bezug auf die Veröffentlichung, in der das Motiv definiert wurde (einschließlich seiner exakten Sequenz).

Es sollte festgehalten werden, dass einige der nachstehend aufgeführten Motive hier vorstehend nicht beschrieben sind und zusätzliche vermutliche Motive des 5' stromaufwärts gelegenen Promotors und des ersten Intron-Promotors darstellen:
Keine Fehlpaarung
BEISPIEL 3:
Funktionelle Analyse – Promotoraktivität der 5'-Region und der ersten Intronregion des p75-TNF-R-Gens
Um einen ersten Einblick in die funktionelle Bedeutung einiger 5'-Regionen des p75-Rezeptorgens zu erhalten, wurden mehrere Regionen in einen Vektor cloniert, der das Luciferase-Reportergen enthielt. Die Konstrukte wurden in BHK-Zellen transfiziert, die sich in unseren Händen als das zweckmäßigste System für eine erste Idee über Promotoraktivität erwiesen. Obwohl unser Hauptinteresse im äußersten 5'-Teil des p75-TNF-R-Gens lag, trieb uns das Auffinden einer vermutlichen TATA-Box und CAP-Stelle in dem Intron an, auch diese Region in einem Funktionstest zu testen.
Für den funktionellen Test des Promotors/der Promotoren des p75-TNF-R-Gens wurden die folgenden Verfahren durchgeführt: BHK-Zellen wurden mittels des Calciumphosphatverfahrens gemäß Sambrook et al. (31) transfiziert. In jedem Experiment wurden 10 g Plamid-DNA zu halb-konfluenten Gefäßen von 6 cm transfiziert. Nach Inkubation über Nacht (8–12 Std.) wurden die Zellen 3-mal mit PBS gewaschen und mit frischem Medium ergänzt. Nach weiteren 24 Stunden Inkubation wurden die Zellen geerntet und die Luciferase-Aktivität unter Verwendung einer Lumitron-Luminometer-Vorrichtung mit einer Integration von 10 sec (62) in den Überständen des Lysats bestimmt. Die Werte wurden als relative Lichteinheiten (RLU) berechnet. In die verschiedenen Vektoren, die das Luciferase-Gen codieren, waren verschiedene Promotoren cloniert, um die Expression des Luciferase-Gens wie folgt zu kontrollieren:

i) CMV: positive Kontrolle (Luciferase-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors); LUC-0: negative Kontrolle (Luciferase-Gen ohne regulierende Sequenz); gBX: 5'-Region des p75-TNF-R-Gens (nt 1-2089 in 2A) ohne ATG in der "Sense"-Orientierung; gBS: 5'-Region (Nucleotide 1-2089 in 2A) ohne ATG in der "Antisense"-Orientierung; UsBX: Intron-Fragment (nt 1-1827 in 2B) in der "Sense"-Orientierung; UsBH: Intron-Fragment (nt 1-1827 in 2B) in der "Antisense"-Orientierung; UBX: Intron-Fragment (nt 1-869 in 2B) ohne ATG in der "Sense"-Orientierung; UBS: Intron-Fragment (nt 1-869 in 2B) ohne ATG in der "Antisense"-Orientierung.

Es sollte festgehalten werden, dass die verschiedenen mutmaßlichen Promotortragenden Fragmente (und Kontrollpromotoren und Fragmente), wie vorstehend festgehalten, in den promotorlosen Luciferase-Vektor LUCO cloniert wurden, der das Luciferase-Gen (63) enthält, das das CAT-Gen in dem Expressionsvektor pBLCAT6 ersetzt (64).
Die 3 zeigt Mittelwerte (Standardabweichung) von drei unabhängigen Transfektionen und anschließenden Luciferase-Tests. Die äußerste 5'-Region (gBX) zeigt im Vergleich mit der positiven Kontrolle (CMV-Promotor) eine sehr hohe Aktivität. Die Promotoraktivität dieser Region hängt von der Orientierung ab, wie mit demselben Fragment in der Antisense-Orientierung (gBS) gezeigt werden kann, in der ein deutlicher Abfall in der Aktivität beobachtet wird. Interessanterweise zeigt auch die Intronregion (UsBX) eine signifikante Promotoraktivität, auch hier zeigt die interne Kontrolle in der Antisense-Orientierung (UsBH) viel weniger Aktivität. Die Aktivität des Intron-Promotors ist nicht mehr nachweisbar, wenn nur der Teil stromaufwärts vom ersten ATG (UBX oder UBS) mit dem Luciferase-Gen verknüpft ist, was anzeigt, dass die beobachtete Promotoraktivität hauptsächlich durch den stromabwärts gelegenen Teil definiert ist (d. h. derjenige in UsBX in der richtigen "Sense"-Orientierung). Diese beiden vermutlichen Promotoren werden mittels Standardverfahren weiter analysiert.
Deletionsanalyse der 5'-Promotorregion und der Region des ersten Intron-Promotors des p75-TNF-R-Gens
Die Deletionsanalyse der Promotorregionen, die den 5' stromauwärts gelegenen Promotor und den Intron-Promotor enthalten, wurden durchgeführt, um die Sequenzregionen präziser festzulegen, die die aktiven Promotoren definieren. Zu diesem Zweck wurden zusätzliche Konstrukte hergestellt, wie vorstehend im Detail beschrieben, bei denen verschiedene Deletionsfragmente der 5' stromaufwärts gelegenen Promotorregion und verschiedene Deletionsfragmente des 3'-Endes der ersten Intron-Promotorregion in Expressionsvektoren inseriert wurden, die das Luciferase-Reportergen enthielten, und in transfizierten BHK-Zellen auf Promotoraktivität getestet wurden. Die Deletionsfragmente wurden unter Verwendung der vorstehend erwähnten Vektoren, die die 5' stromaufwärts gelegene Promotorregion voller Länge und die Intron-Promotorregion enthielten, und anschließender Deletion verschiedener Teile von den 5'-Enden dieser Promotorregionen, um Deletionsfragmente davon zu erhalten, alles mittels Standardverfahren, hergestellt. Die funktionellen Tests dieser Deletionsfragmente auf Promotoraktivität wurde, wie vorstehend im Detail beschrieben, durchgeführt.
Die Deletionsfragmente der 5' stromaufwärts gelegenen Promotorregion umfaßten: (i) ein Fragment, das als "GN2BX" bezeichnet wird und sich von Nucleotid Nr. 197 bis Nucleotid Nr. 2086 der Sequenz von 2A erstreckt; (ii) ein Fragment, das als "75" bezeichnet wird und sich von Nucleotid Nr. 682 bis Nucleotid Nr. 2086 der Sequenz von 2A erstreckt; (iii) ein Fragment, das als "PIII" bezeichnet wird und sich von Nucleotid Nr. 709 bis Nucleotid Nr. 2086 der Sequenz von 2A erstreckt; (iv) ein Fragment, das als "76" bezeichnet wird und sich von Nucleotid Nr. 1335 bis Nucleotid Nr. 2086 der Sequenz von 2A erstreckt; und (v) ein Fragment, das als "PI" bezeichnet wird und sich von Nucleotid Nr. 1527 bis Nucleotid Nr. 2086 der Sequenz von 2A erstreckt.
Die Deletionsfragmente der Intron-Promotorregion umfaßten: (vi) ein Fragment, das als "74" bezeichnet wird und sich von Nucleotid Nr. 872 bis Nucleotid Nr. 1827 der Sequenz von 2B erstreckt; und (vii) ein Fragment, das als "UIIP" bezeichnet wird und sich von Nucleotid Nr. 1569 bis Nucleotid Nr. 1827 der Sequenz von 2B erstreckt.
Alle der vorstehenden Deletionsfragmente (i)–(vii) wurden mittels Standardverfahren und auf eine Weise in Expressionsvektoren cloniert, dass sie alle in der „Sense"-Orientierung waren.
Aus den Resultaten (nicht gezeigt) war es offensichtlich, dass:

(a) Für die 5' stromaufwärts gelegene Promotorregion hatten die Deletionsfragmente (i)–(iv), d. h. "GN2BX", "75", "PIII" und "76" alle die volle Promotoraktivität, vergleichbar der der nicht deletierten clonierten Promotorregion (Nucleotide 1-2089 von 2A, vgl. vorstehend), aber das Deletionsfragment (v), d. h. "PI", hatte eine sehr reduzierte Promotoraktivität.
(b) Für die Intron-Promotorregion zeigte das Deletionsfragment (vi), d. h. "74", eine sehr geringe Promotoraktivität, damit vergleichbar mit der sehr niedrigen (wenn überhaupt) Promotoraktivität des clonierten Fragments voller Länge ("USBX", Nucleotide 1-1827 von 2B) und mit dem anderen clonierten Fragment, das nur die Region 5' der Intron-Promotorregion hat (Nucleotide 1-874 von 2B). Das Deletionsfragment (vii) jedoch, d. h. "UIIP", hatte einen sehr signifikant erhöhte Promotoraktivität (vergleichbar der von "75", "PIII" und "76", vorstehend festgehalten).

Von den vorstehenden Resultaten kann man daher schließen, dass:

(a) für den 5' stromaufwärts gelegenen Promotor das 5'-Ende des Promotors zwischen dem 5'-Ende von Deletionsfragment (iv). d. h. "76" (Nucleotid Nr. 1335 von 2A), und dem 5'-Ende von Deletionsfragment (v). d. h. "PI" (Nucleotid Nr. 1527 von 2A), liegt.
(b) Für die erste Intron-Promotorregion gibt es nur einen Promotor in dem Fragment von etwa 1,9 kb am 3'-Ende des Introns. Das 5'-Ende dieses Promotors liegt zwischen dem 5'-Ende von Deletionsfragment (vii), d. h. "UIIP" (Nucleotid Nr. 1569 von 2B), und 1768 (Start des neuen Leaders, vgl. vorstehend). Darüber hinaus ergaben die Resultate auch die überraschende Beobachtung, dass es eine inhibierende Region gibt, die zwischen dem 5'-Ende des Intronfragments voller Länge (Nucleotid 1 von 2B) und dem 5'-Ende von "UIIP" (Nucleotid 1569 von 2B) liegt. Mindestens ein Teil der Sequenz dieser inhibierenden Region liegt zwischen dem 5'-Ende von Deletionsfragment (vii), d. h. "74" (Nucleotid Nr. 872 von 2B), und dem 5'-Ende von "UIIP" (Nucleotid 1569 von 2B).

Der 5' stromaufwärts gelegene Promotor wurde somit jetzt vollständiger definiert, dass er innerhalb der Region liegt, die durch die Nucleotide 1335 und 1527 von 2A definiert ist.
Für den Intron-Promotor zeigen die Resultate an, dass in der Region zwischen Nucleotid 1 von 2B und dem 5'-Ende von "74" (Nucleotid 872 von 2B) kein Promotor ist, sondern dass dort eher eine die Transkription inhibierende Region existiert. Weiterhin scheint sich diese inhibierende Region in das Fragment "74" bis zum 5'-Ende (Nucleotid 1569 von 2B) des kleineren "UIIP"-Fragments zu erstrecken.
Somit erstreckt sich die Intron-Promotorregion vom 5'-Ende von "UIIP" (Nucleotid 1569 von 2B) bis Nucleotid 1768 von 2B, dem Start des neuen Leaders.
Dieser neue Intron-Promotor ist auch einzigartig, weil neben seiner Anwesenheit in einem Intron ihm offensichtlich eine große Zahl von Motiven fehlen, die üblicherweise in Promotoren vorhanden sind, wobei alle beobachteten Motive, außer einer TCC-Wiederholung (vgl. vorstehend und 2B), stromaufwärts in dieser Region sind, von der man nun annimmt, dass sie inhibierend ist.
Die Existenz dieses Promotors in dem Intron macht es wahrscheinlich, dass eine alternative Form von p75-TNF-R exprimiert wird, nämlich eine, bei der der vermuteten neuen Leader-Sequenz die Regionen folgen, die von Exon 2 und den übrigen Exons des p75-TNF-R-Gens codiert werden. Dieser alternativen Form von p75-TNF-R fehlt daher die Region, die vom ersten Exon codiert wird, nämlich der N-terminale Teil der Region der extrazellulären Domäne, von der bekannt ist, dass sie direkt stromaufwärts von der Cystein-reichen Region liegt (der TNF-Bindungsregion).
Es ist bei andern Proteinen bekannt (z. B. Dystrophin), dass wenn das Protein von verschiedenen Promotoren transkribiert wird, gleichzeitig ein Mechanismus von alternativem Spleißen auftritt. Demgemäß ist es möglich, dass die vermutete neue Form von p75-TNF-R, die von dem Intron-Promotor transkribiert wird, auch ein alternatives Spleißen erfährt, um ein Endprodukt zu ergeben, das eine lösliche Form von p75-TNF-R ist, die nur die Cystein-reiche Domäne enthält; welche die TNF-Bindungsregion ist. Dieser Mechanismus von alternativem Spleißen des p75-TNF-R-Transkripts, das von dem Intron-Promotor transkribiert wird, kann ein anderer Weg sein (neben dem zuvor beschriebenen Protease-Spaltverfahren), durch den die natürlicherweise vorkommende lösliche Form von p75-TNF-R produziert wird.
Das Auffinden der die Transkription inhibierenden Region im Intron stromaufwärts vom Intron-Promotor zeigt die Möglichkeit an, dass diese inhibierende Region als ein Modulator der Expression des p75-TNF-R-Gens dient, und genauer von der vermuteten neuen Form von p75-TNF-R. Diese Modulation kann mittels der Wirkung von Cytokinen sein, insbesondere TNF und IL-1, oder mittels durch Differenzierung induzierter Änderungen. Vorläufige Resultate (nicht gezeigt) haben gezeigt, dass TNF in der Tat in der Lage ist, die Funktion des Intron-Promotors durch Unterdrückung der inhibierenden Region zu verstärken. Weiterhin scheint es auch eine zellspezifische Expression des Intron-Promotors zu geben, wobei einige Zellen natürlicherweise eine hohe Expression dieses Promotors haben und andere nicht, wobei diese Unterschiede mit Änderungen bei der Differenzierung zusammenhängen, die offensichtlich zu einer Inaktivierung der inhibierenden Region in einigen Zellarten führten.
Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch die vorstehende inhibierende Region.
BEISPIEL 4
Reinigung von Transkriptionsfaktoren, die an die Promotorregion binden
Funktionelle Motive in der Promotorregion (d. h. die 5' stromaufwärts gelegenen Promotoren und die des ersten Introns) und der inhibierenden Region, die in der ersten Intronregion stromaufwärts vom Intron-Promotor vorhanden ist (vgl. Beispiel 3), können mittels schrittweiser Deletion von Nucleinsäuresequenz vom 3'- und/oder 5'-Ende der Regionen des Promotors und/oder der inhibierenden Region mittels herkömmlicher Mittel (Erase-a-Base-Kit, Promega Corp.) identifiziert werden. Die deletierten Promotorfragmente oder die deletierten Fragmente der inhibierenden Region werden dann auf Aktivität getestet. In ähnlicher Weise können interne Sequenzen durch in vitro-Mutagenese oder Linker-Scanning (31) deletiert oder verändert werden. Motive, die aktivierende Transkriptionsfaktoren binden, werden durch einen Verlust der Promotoraktivität entdeckt, wenn sie deletiert oder mutiert werden. Umgekehrt werden Motive, die Transkriptionsfaktoren binden, die die Promotoraktivität unterdrücken, durch mutierte oder deletierte Promotorfragmente identifiziert, die im Vergleich mit dem Wildtyp-Promotor eine erhöhte Aktivität haben. In ähnlicher Weise können auch Motive, die die Aktivierung oder Inhibierung der die Transkription inhibierenden Region betreffen und die inhibierende Faktoren oder die Inhibierung unterdrückende Faktoren binden, identifiziert werden. Eine detaillierte Analyse dieser Motive wird dann durch chemische Synthese von Oligonucleotiden mit der Sequenz des ursprünglichen Motivs und von mutierten Formen davon durchgeführt. Diese Oligonucleotide werden mit den Promotorfragmenten verknüpft, denen das entsprechende Motiv fehlt, und das resultierende Konstrukt wird auf Promotoraktivität getestet. Wenn die ursprüngliche Aktivität wiederhergestellt ist, kann das Motiv als funktionell unverändert angesehen werden, d. h. diejenigen Mutationen, die in das Motiv eingebracht wurden, interferieren nicht mit seiner Funktion. Wenn andererseits eine geringere Promotoraktivität mit dem mutierten Motiv beobachtet wird, kann gefolgert werden, dass die Nucleotide, die im Vergleich zum Wildtyp-Motiv geändert wurden, für seine Funktion essentiell sind.
Somit können alle der vorstehend in Beispiel 2 dargestellten verschiedenen Motive innerhalb der 5' stromaufwärts gelegenen Promotorregionen und der Intron-Promotorregionen dem vorstehenden Analyseverfahren unterworfen werden, um zu bestimmen, welche die voll funktionsfähigen sind.
Nachdem ein Bindungsmotiv für einen Transkriptionsfaktor identifiziert wurde, wird der entsprechende Transkriptionsfaktor isoliert. Zu diesem Zweck werden Extrakte von verschiedenen Quellen auf hohe Expression dieses Transkriptionsfaktors durchmustert. Die vorhandene Menge an Transkriptionsfaktor kann durch Gelverschiebungs-Tests unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Oligonucleotide gemessen werden, die die Sequenz des funktionellen Motivs an am 5'-Ende markierten ds DNA-Sonden enthalten.
Nachdem man eine reichliche Quelle des Transkriptionsfaktors identifiziert hat, können die Bedingungen definiert werden, die für die optimale Bindung erforderlich sind. Verschiedene chemische Parameter wie der pH-Wert, die Anwesenheit verschiedener ein- und zweiwertiger Kationen, die Salzkonzentration und die Anwesenheit reduzierender Mittel, z. B. DTT oder Mercaptoethanol, werden angepaßt, um dieses Ziel zu erreichen.
Nachdem man optimale Bindungsbedingungen für den Transkriptionsfaktor festgelegt hat, wird die Reinigung mit herkömmlichen Mittel durchgeführt, d. h. Salzfällung, Phosphocellulose- und/oder DEAE-Chromatographie. Ein angereicherter Niederschlag des Transkriptionsfaktors wird dann auf einer DNA-Affinitätssäule weiter gereinigt, bei der das Oligonucleotid, das das entsprechende Motiv enthält, an eine unlösliche Matrix gebunden wird und die den Transkriptionsfaktor enthaltende Lösung unter optimalen Bindungsbedingungen über die Säule gegeben wird. Nach dem Wegwaschen von Verunreinigungen wird der gereinigte Transkriptionsfaktor unter Bedingungen eluiert, die eine DNA-Bindung nicht zulassen, z. B. Verschiebung des pH-Werts, geänderte Salzkonzentration oder Chelatierung von zweiwertigen Salzen, die für eine DNA-Bindung erforderlich sind (üblicherweise Zn⁺⁺).
Die erfolgte Reinigung des Transkriptionsfaktors erlaubt die Anwendung der „Umkehrgenetik" bei diesem Molekül: Proteinsequenzierung, die cDNA-Clonierung unter Verwendung von degenerierten Oligonucleotiden, die der Proteinsequenz entsprechen, und letztlich die Clonierung des Gens, das den Transkriptionsfaktor codiert, durch Durchmusterung von genomischen Bibliotheken unter Verwendung der cDNA als Sonde.
Nachdem man alle diese Werkzeuge hat: genomische Clone, cDNA und gereinigte Transkriptionsfaktoren, ist man in der Lage, Wege zu definieren, um die Aktivität des Transkriptionsfaktors durch eines der folgenden Mittel zu regulieren: (1) Beinflussung seines Promotors; (2) Beinflussung seiner Bindung an das Ziel im Promotor des p75-Gens; oder (3) Modulation seiner Aktivität.
Ein detailliertes Verfahren für (1) ist in Beispiel 5 dargestellt. Die Verfahren (2) und (3) können mittels Durchmusterung einer großen Zahl von Wirkstoffen auf Beinflussung der Funktion dieses Transkriptionsfaktors erreicht werden.
Auf ähnliche Weise kann ein analoges Verfahren, wie vorstehend detailliert beschrieben, durchgeführt werden, um die Aktivität der Faktoren zu identifizieren, clonieren, charakterisieren und regulieren, die die inhibierende Region erkennen, die im ersten Intron stromaufwärts des Intron-Promotors anwesend ist (vgl. Beispiel 3).
BEISPIEL 5
Modulierung der Promotoraktivität durch spezifische Sequenzreigonen
Die Aktivität eines Promotors kann durch das Wegfangen von Transkriptionsfaktoren reguliert werden, die nur knapp zur Verfügung stehen. Dies kann durch die Expression von vielen Kopien des entsprechenden Motivs erreicht werden, an das die Transkriptionsfaktoren binden. Dieser Mechanismus wurde kürzlich durch Pai et al. (34) gezeigt, die die negative Promotordomäne des c-myc-Promotors in der Hamster-CHO-Zelllinie exprimierten und amplifizierten. Danach beobachteten die Autoren eine erhöhte Expression von c-myc des Hamsters und die entsprechenden Veränderungen beim Zellwachstum und bei der Morphologie, die vom c-myc-Protein induziert werden. Auf ganz ähnliche Weise ist es möglich, Promotorregionen zu amplifizieren, die die Promotoraktivität aktivieren und verstärken und damit die Expression des entsprechenden Proteins verringern.
Beim p75-Promotor können entweder die gesamte äußerste 5'-Promotorregion oder der gesamte Promotor im ersten Intron (vgl. Beispiel 2), oder Teile davon, die als negative oder positive regulatorische Domänen identifiziert wurden, durch Restriktionsverdau oder Exonuclease-Deletion von irrelevanten Sequenzen aus der Promotorsequenz ausgeschnitten werden. Die erhaltenen Fragmente werden dann mit einem Vektor verknüpft, der die Genamplifikation erlaubt und in eine Wirtszelle, z. B. CHO-Zellen, transfiziert, die die Selektion auf amplifizierte Vektorsequenzen zulassen. Nach der Selektion und Amplifikation werden die erhaltenen Clone der CHO-Zellen auf die Expression des p75-Gens auf der Ebene der mRNA und des Proteins überprüft. Zusätzlich wird die Funktion des Rezeptors durch einen Cytotoxizitäts-Test mit TNF oder mit TNF nachahmenden Antikörpern überprüft, wie beschrieben in der Israelischen Patentanmeldung Nr. 103051.
Nachdem die Promotorregionen etabliert sind, die bei Amplifikation in diesem Sytem die Aktivität des p75-Rezeptors modulieren, werden dieselben Regionen auf zwei Wegen in Zellen eingebracht, die die Selektion auf amplifizierte Genprodukte nicht erlauben:

(1) Co-Expression von Promotorregionen, die mit einem Vektor verknüpft sind, der einen viralen Replikationsursprung hat (z. B. SV40 oder EBNA), mit einem Vektor, der das T-Antigen (von SV40) oder das EBNA-Antigen exprimiert. Dies erlaubt die Replikation von hohen Zahlen von episomalen Kopien des in den Kern der Zielzellen eingebrachten Promotorfragments und ahmt somit den Effekt der DNA-Amplifikation von integrierten Sequenzen nach.
(2) Die chemische Synthese eines ds Oligonucleotids, das die Promotordomäne umfaßt, und Anwendung ausreichender Mengen dieses Oligonucleotids auf Zellen macht es in ähnlicher Weise möglich, die entsprechenden Transkriptionsfaktoren abzufangen und somit die Promotoraktivität zu beeinflussen. Die Chemie der Oligonucleotide muß verändert werden, um (a) das Oligonucleotid lipophiler zu machen, so daß es die cytoplasmatische Membran passieren kann, und (b) seine Stabilität zu erhöhen, um den Abbau zu minimieren. Dies wird mittels herkömmlicher Mittel erreicht, z. B. unter Verwendung von Phosphothioat gekoppelten Oligonucleotiden.

REFERENCES

1. Tracey, J. T. et al. (1987) Nature 330: 662–664.
2. Piquet, P. F. et al. (1987) J. Exp. Med. 166: 1280–1289.
3. Beutler, B. und Cerami, C. (1987) NEJM, 315: 379–385.
4. Hohmann, H. -P. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 14927–14934.
5. Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem., 265: 1531–1536.
6. Brockhause, M. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3127–3131.
7. Loetscher, H, et al. (1990) Cell 61: 351–359.
8. Schall, T. J. et al. (1990) Cell 61: 361–370.
9. Nophar, Y. et al. (1990) EMBO J. 9: 3269–3278.
10. Smith, C. A. et al. (1990) Science 248: 1019–1023.
11. Heller, R. A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6151–6155.
12. Aggarwal, B. H. et al. (1985) Nature 318: 665–667.
13. Israel, S. et al. (1986) Immunol. Lett. 12: 217–224.
14. Tsujimoto, M. et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137: 1094–1100.
15. Ruggiero, V. J. et al. (1986) J. Immunol. 136: 2445.
16. Holtman, H. und D. Wallach (1987) J. Immunol. 139: 1161–1167.
17. Ding, A. H. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 3924.
18. Porteu, F. und Nathan, C. (1990) J. Exp. Med. 17: 599–607.
19. Porteu, F. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 18846.
20. Ware, C. F. et al. (1991) J. Immunol. 147: 4229.
21. Erikstein, B. K. et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21: 1033.
22. Winzen, R. et al. (1992) J. Immunol. 148: 3454.
23. Espevik, T. et al. (1990) J. Exp. Med. 171: 415–426.
24. Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 14497–14504.
25. Thoma, B. et al. (1990) J. Exp. Med. 172: 1019–1023.
26. Tartaglia, L. A. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9292–9296.
27. Gehr, G. et al. (1992) J. Immunol. 149: 911.
28. Heller, R. A. et al. (1992) Cell 70: 47.
29. Brakebusch, C. et al. (1992) EMBO J. 11: 943–950.
30. Vandenabeele, P. et al. (1992) J. Exp. Med. 176: 1015.
31. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
32. Lenardo, M. J. und Baltimore, D. (1989). Cell 58: 227–229.
33. Imagawa, M. et al. (1987) Cell 51: 251–260.
34. Pai et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 12428–12431.
35. Kohno T. et al, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8331–8335
36. Seto E. et al. (1991) Nature 354: 241–245
37. Kageyama R. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 217–224.
38. Kageyama R. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 15508–14.
39. Fashena S. J. et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12: 894–903.
40. Murre C. et al. (1989) Cell 56: 777–83.
41. Shannon M. T. et al. (1990) Mol Cell Biol. 10: 2950–2959.
42. Anisowicz A. et al. (1991) J. Immunol. 147: 520–527.
43. Winzen R. et al. (1993) J. Immunol. 150: 4346–53.
44. Kalthoff H. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 2762–6.
45. Fujita T. et al. (1987) Cell 49: 357–67.
46. Harroch S. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 9092–9097.
47. Mitchell P. et al. (1987) Cell 50: 847–61.
48. Scheurich P. et al. (1989) J. Exp. Med. 170: 947–58.
49. Hohmann H-P. et al. (1990) – J. Biol. Chem. 265: 22409–17.
50. Aggarwal B. B. et al. (1993) Lymph. Cyt. Res. 12: 149–58.
51. Lewis E. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3550–4.
52. Ullman K. S. et al. (1991) Science 254: 558–62.
53. Corcoran L. M. et al. (1993) Genes Dev. 7: 570–82.
54. Abe E. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2864–8.
55. Aebi M. und Weismann C. (1987) TIG 3: 102–107.
56. Kemper O. und Wallach, D. (1993) Gene 134: 209-216.
57. Shannon M. F. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 674–678.
58. Okret S. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5899–903.
59. Chambaut-Geurin, A-M. und Thomopoulos, P. (1991) Eur. Cyt. Netw. 2: 355–60
60. GCG Computer Program, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin USA 53711 (1991).
61. Kozak M. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 8125–8148.
62. Ausubel F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, N.Y. 15.4.1
63. Nordeen S. K. (1988) Biotechniques 6: 454–8.
64. Boshart K, et al. (1992) Gene 110: 129–130.
65. Koizumi, M. et al. (1993) Biol. Pharm. Bull. (Japan) 16: 879–83.
66. Crisell, P. et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 5251–5.
67. Barinaga, M. (1993) Science 262: 1512–4.
68. Cantor, G. H. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10932–6.
69. Shimayama, T. et al. (1993) Nucleic Acids Symp. Ser. 29: 177–8.
70. Joseph, S. und Burke, J. M. (1993) J. Biol. Chem. 268: 24515–8.
71. Chen, C. J. et al. (1992) Ann N. Y. Acad. Sci. 660: 271–3.
72. Shore, S. K. et al. (1993) Oncogene 8: 3183–8.
73. Zhao, J. J. und Pick, L. (1993) Nature 365: 448–51.
74. Kemper, O. et al. (1993) Gene 134: 209–216

Claims

Promotersequenz des menschlichen p75-Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNF-R)-Gens, die eine 5'stromaufwärts gelegene Promotersequenz ist und wenigstens die Sequenz zwischen Nucleotid 1335 und 1527 der Nucleotidsequenz aus 2A umfasst.
Promotersequenz des menschlichen p75-TNF-R-Gens, die sich in dem ersten Intron zwischen dem ersten und dem zweiten Exon befindet und wenigstens die Sequenz zwischen den Nucleotiden 1569 und 1768 der Sequenz aus 2B umfasst.
Sequenz, enthaltend eine Transkriptions-inhibierende Region, die sich in der Sequenz des 1,9 kbp Smal-Fragments des genomischen Clons, der die menschlichen p75-TNF-R-Gene dargestellt in 1 codiert, stromaufwärts der Intron-Promotersequenz befindet, wobei die Transkriptions-inhibierende Region die Sequenz zwischen Nucleotid 1 und 1569 der Sequenz aus 2B umfasst.