JP2007306942A - 標的とされた発現特性に従う異種遺伝子の発現 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】異種遺伝子コーディング配列を真核細胞性宿主細胞ゲノム中の標的内因性遺伝子に挿入し、そして該異種遺伝子コーディング配列を発現させるためのベクターを提供する。このベクターは、所定の構造を有するDNA構築物を含む。本発明によれば、宿主細胞または細胞集団またはトランスジェニック生物の生存中に所望の時間的および/または空間的特性をともなう発現が提供される。
【選択図】なし
Description
5’ X−A−P−B−Q−C−Y 3’
を含み、ここで、
XおよびYは、該標的内因性遺伝子からの別々の配列と少なくとも95%相同であり、そして該A−P−B−Q−C配列を該宿主細胞ゲノムに挿入するために、該宿主細胞ゲノムとの相同組換えを受けるのに十分な長さであり;
Pは、リボゾーム内部エントリー部位(IRES)であり;
Qは、該異種遺伝子コーディング配列であり;そして
A、BおよびCは、別々に、該構築物中に必要に応じて存在するさらなるDNA配列である。
5’ X−A−P−B−Q−C−Y 3’
ここで、
XおよびYは、独立して、DNA配列であり、宿主遺伝子座と実質的に相同であり、
Pは、リボゾーム内部エントリー部位(IRES)であり、
Qは、異種遺伝子配列であり、そして
A、B、およびCは、任意のリンカー配列である。
5’T−D−X−A−Q−C−Y 3’
ここで、Tは、転写ターミネーターまたはトランケーター、
Dは、任意のリンカー配列、そして
X、Y、A、C、およびQは、先に規定したとおりである。
項1.異種遺伝子配列を真核細胞性宿主ゲノムに挿入し、そして該遺伝子配列を発現させるDNA構築物であって、以下の配列を含む、DNA構築物であり、
5’ X−A−P−B−Q−C−Y 3’
ここで、XおよびYは、内因性宿主遺伝子の一部と実質的に相同であり、Pは、リボゾーム内部エントリー部位(IRES)であり、Qは、異種遺伝子配列であり、A、B、およびCは、別々に任意のリンカー配列である、DNA構築物;
項2.XおよびYが、前記A−P−B−Q−C配列を前記宿主ゲノムに挿入するために、該宿主ゲノムとの相同組換えを受けるのに十分な長さである、項1に記載のDNA構築物;
項3.XおよびYがそれぞれ少なくとも1000塩基対の長さである、項2に記載のDNA構築物:
項4.前記宿主細胞が動物細胞である、項1、2、または3に記載のDNA構築物;
項5.XおよびYが、内因性遺伝子の発現を調節する宿主エレメントを含む、項4に記載のDNA構築物;
項6.前記リンカー配列A、B、およびCのいずれかまたは全てが存在しない、項2〜5のいずれかに記載のDNA構築物;
項7.前記遺伝子コーディング配列の3’末端(下流)にポリアデニル化シグナルをさらに含む、項2〜6のいずれかに記載のDNA構築物;
項8.前記IRESの5’(上流)に、例えばウサギb-グロビンスプライスアクセプターのようなスプライスアクセプターをさらに含む、項2〜7のいずれかに記載のDNA構築物;
項9.前記スプライスアクセプターが、前記遺伝子コーディング配列のイントロン配列への機能的組み込みを可能にする、項8に記載のDNA構築物;
項10.Xの5’(上流)に短縮/切断/転写ターミネーター配列をさらに含む、項2〜9のいずれかに記載のDNA構築物;
項11.前記短縮/切断/転写ターミネーター配列が、スプライスアクセプターおよびポリアデニル化シグナルを含む、項10に記載のDNA構築物;
項12.前記転写ターミネーターが、上流マウス配列またはSV40のポリアデニル化シグナルのようなポリA配列である、項10または11に記載のDNA構築物;
項13.前記遺伝子コーディング配列が抗生物質耐性のような選択性マーカーをコードし、該遺伝子コーディング配列を前記宿主ゲノムに挿入した細胞の選択を容易にする、項2〜12のいずれかに記載のDNA構築物;
項14.前記IRESが翻訳終結コドンの前にある、項2〜13のいずれかに記載のDNA構築物;
項15.XおよびYがプロモーターエレメントを含まない、項2〜14のいずれかに記載のDNA構築物;
項16.XおよびYが、特定の発現特性(特性E)に従って第1の細胞(細胞D)内で内因性遺伝子の発現を調節するエレメントを含むような長さであり、そして前記構築物が、第2の細胞(細胞T)のDNAへのランダムな組み込みに適応して特性Eに従って細胞T内で前記遺伝子配列を発現する、項1に記載のDNA構築物;
項17.前記遺伝子コーディング配列が選択性マーカーをコードしている、項16に記載のDNA構築物;
項18.前記リンカー配列A、B、およびCのいずれかまたは全てが存在しない、項16〜17のいずれかに記載のDNA構築物;
項19.前記遺伝子コーディング配列の3’末端(下流)にポリアデニル化シグナルを含む、項16〜18のいずれかに記載のDNA構築物;
項20.前記IRESの5’(上流)に、スプライスアクセプターを含む項16〜19のいずれかに記載のDNA構築物;
項21.前記スプライスアクセプターが、前記遺伝子コーディング配列のイントロン配列への機能的組み込みを可能にする、項20に記載のDNA構築物;
項22.遺伝子コーディング配列を宿主細胞または宿主生物内で発現させるための項2〜21のいずれかに記載のDNA構築物の使用;
項23.前記宿主が、動物細胞、胚幹細胞、および受精卵から選択される、項22に記載のDNA構築物の使用;
項24.遺伝子コーディング配列を宿主細胞ゲノム中の標的内因性遺伝子に挿入し、そして該コーディング配列を発現させる方法であって、該宿主細胞を項1〜15のいずれかに記載のDNA構築物を含むベクターで形質転換することを包含する、方法;
項25.遺伝子コーディング配列を宿主細胞のゲノムに挿入し、該コーディング配列を発現させる方法であって、該ゲノムに項16〜21に記載のDNA構築物をランダムに組み込むことを包含する、方法;
項26.遺伝子コーディング配列を宿主細胞または宿主動物内で発現させる方法であって、以下の工程:
1.項2〜21のいずれかに記載のDNA構築物を作製する工程、
2.該構築物を宿主細胞に挿入する工程、および
3.該遺伝子コーディング配列を発現している細胞または動物を同定する工程、
を包含する、方法;
項27.前記DNA構築物が、前記宿主のゲノムと相同組換えを行うのに適している、項26に記載の方法;
項28.前記DNA構築物が、前記宿主のゲノムへのランダムな組み込みに適している、項26に記載の方法;
項29.項2〜21のいずれかに記載のDNA構築物を受精卵に注入する工程を包含するトランスジェニック動物の作成方法;
項30.項2〜21のいずれかに記載のDNA構築物を用いて挿入された遺伝子コーディング配列を含む細胞または動物;
項31.前記子孫が前記導入された遺伝子コーディング配列を遺伝した、項30に記載の細胞または動物の子孫;
項32.項2〜15のいずれかに記載のDNA構築物を含むベクター;および
項33.項16〜21のいずれかに記載のDNA構築物を含むベクター。
図1〜3、および6は、本発明のDNA構築物を示す。
図4および5は、構築物作製において用いるDNA構築物を示す。
図7および8は、IRES-βgeo標的ストラテジーを示す:
図7−ジシストロニック転写においてIRESを通して仲介される翻訳の内部開始のスキームを示す。
図8−遺伝子標的におけるIRES-βgeoカセットの適用を示す。構築物は、遺伝子全部または一部を欠失させて他方lacZリポーターを組み込むか、または完全な遺伝子の改変をともなうかまたはともなわずにリポーターを付加するかのどちらかに設計され得る。そして
図9〜12は、標的されたクローンのDNAおよびmRNAのハイブリダイゼーション分析を示す:
図9−DIA/LIF標的を示す。HindIIIまたはEcoRIによって切断したゲノムDNAを、pDR100由来エクソン1特異的163bp XhoI-EaeIフラグメントまたは700bp PstI-EcoRI 3’ゲノムフラグメントのいずれかとそれぞれハイブリダイズさせた。レーン1は、CGR8の親ES細胞;レーン2、5、および6は、非短縮型の構築物によって標的されたクローン;レーン3および4は、短縮型の構築物によって標的されたクローンを示す。
DIA遺伝子標的構築物(図1および2)を、内因性DIA遺伝子座の制御下で遺伝子を発現させるために、β-geo融合遺伝子産物を発現する導入遺伝子を組み込むように設計した。第3構築物(図3)は、標的とされる相同なDNAの5’側の位置で遺伝子トラップ標的構築物に設計される場合、ランダムに組み込まれた導入遺伝子から発現を排除はしないが大いに低減させる転写ブロッカーによって得られる利点を示すように設計した。
ES細胞を、記載されたように(Smith,A.G.(1991) J.Tiss.Cult.Meth.13,89-94による)、ネズミDIA/LIFを添加した培地でフィーダーなしで規定通りに維持した。生殖系列コンピテント細胞系CGR8を公開された手順(Nichols,J.、Evans,E.P.およびSmith,A.G. (1990) Development 110,1341-1348)により129株の胚から確立した。Woodsらの方法(Wood,S.A.、Pascoe,W.S.、Schmidt,C.、Kemler,R.、Evans,M.J.およびAllen,N.D. (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90、4582-4585)の変法によりES細胞と異系交配MF1胚との間で凝集キメラを生成した。この方法では、共存培養は懸滴培養で行われた。生殖系列伝達に関しては、キメラを胚盤胞注入により産生した。相同組換え体の単離に関しては、108個の細胞を0.4cmキュベット中で3μFd、0.8kVで150μgの直鎖状プラスミドとともにエレクトロポレーションし、次いで、175μg/mlのG418の存在下で選択した。ゲノムDNAを24ウェルの平板培養由来のアガロースプラグ内で調製し(Brown,W.R.A.(1988) EMBO J.7、2377-2385)、他方同様のプレートを凍結保存した(Ure,J.、Fiering,S.、およびSmith,A.G. (1992) Trends.Genet.8、6)。DIA/LIF産生をアッセイするために、ES細胞を6mMの3−メトキシベンズアミド(3-methoxybenzamide)と共にインキュベーションすることによって分化に誘導し、そして調節培地を回収し、ES細胞の分化の阻害能力について記載されるようにアッセイした。このアッセイは、ネズミDIA/LIFに対して生じた中和ポリクローナル抗血清(AS、未公開)を含むことにより、DIA/LIFに対して特異的にした。β−ガラクトシダーゼの組織化学的染色は、X-galを用いて行い(Beddington,R.S.P.、Morgenstern,J.、Land,H.およびHogan,A.(1989) Development 106、37-46)、そして蛍光染色は、DetectaGene Green(Molecular Probes)を製造者の指示に基づいて用いて行った。
DNA操作は以下の標準的手順に従って行った。IRESは、EMCVのmRNAの5’非翻訳領域(UTR)由来の594bpの配列であり、天然の開始コドンの突然変異誘発により改変されている。翻訳は、通常の開始部位から9bpだけ3’側にあり、NcoIクローニング部位の一部を形成するATGによって開始される。
マウス129 ES細胞(CGR-8系)を調製し、Smithら(1991)によって記載されたようにDIA存在下で維持した。トランスフェクション用のプラスミドDNAをSalI切断により直鎖状にし、エタノールで沈澱させ、そしてPBS中で10〜14mg/mlの濃度で再懸濁した。新鮮な培地で10時間培養した後、ほぼ集密したES細胞をトリプシン処理によって分散させ、培地およびPBSで連続的に洗浄し、そして直ちにトランスフェクションできるようにPBS中で1.4×108/mlの濃度で再懸濁した。基本的には、0.7mlの細胞懸濁液を0.1mlのDNA含有溶液と混合し、そしてBiorad Gene Pulserおよび0.4cmキュベットを用いて0.8kVおよび3.0μFDでエレクトロポレーションを行った。トランスフェクション物質は、200μg/ml(活性)G418(Sigma)を含む選択培地を添加する前に、ゼラチンで覆った組織培養皿に5〜8×104/cm2の濃度で生育培地中で16時間プレートした。単一コロニーをトランスフェクション後8〜10日の時点で選択し、200μg/mlのG418を含む生育培地内でさらに成長させるために24ウェルの組織培養プレートに二重に移した。
選択した細胞系を、DIA添加培地中のES細胞の成長および分化または非DIA添加培地中のレチノイン酸誘導分化の後、lacZ染色パターンについてアッセイした。
選択した細胞系を以前に記載したように胚注入の前にG418非存在下で7日間培養した(Nicholsら、1990)。簡単にいうと、注入する胚盤胞をC57/B16ドナーから4d.p.cで採集し、10〜20細胞を用いて注入し、そして疑似妊娠レシピエントの子宮に移す前に培養で再成長させた。C57/BL6バックグラウンド上の砂色のコート色の斑の存在によってキメラを同定した。オスのキメラは、導入遺伝子の伝達に関してテスト交配させ得る。トランスジェニックマウスは、lacZ染色に関して分析され得る。
ランダムに感作した32P-標識プローブを用いて標準的な手順に従って、フィルターハイブリダイゼーションをナイロンメンブレン上で行った。相同組換え体を5’および3’近接配列の両方の由来のプローブにより特徴付けた。ジゴキシゲニンで標識したOct-4アンチセンスRNAとの全スライド(whole mount)インサイチュハイブリダイゼーション(Scholer,H.、Dressler,G.R.、Balling,R.、Rohdewold,H.およびGruss,P. (1990) EMBO J.9、2185-2195)を本質的に記載されているように行った(Wilkinson,D.G (1992) in situ hybridization: a practical approach,Wilkinson,D.G編(IRL Press,Oxford),pp.75-83)。
IRES機能の組織特異性の問題に取り組むために、本発明者らは、pGTIRESβgeopAをエレクトロポレーションによってES細胞に入れることにより本発明に従う一連のランダムIRES遺伝子トラップを行った。分化細胞タイプ中でのβ−ガラクトシダーゼの幅広い発現をインビトロで示すいくつかのクローンを、凝集キメラを生成するために用いた。発生の7.5日目および8.5日目に、ES細胞によってコロニーを作った全ての組織でβ−ガラクトシダーゼが検出され得、それは胚の一帯、および羊膜および内臓卵黄嚢においてである。これらの遺伝子トラップは生殖系を介して伝達されており、IRESの存在は機能的な配偶子形成と適合することを確証する。そしてヘテロ接合体に関する予備分析は、IRESが広範な種々の胚組織および成熟組織で機能的であることを示す。凝集キメラもまたOct-4標的細胞によって産生された。7.5日目におけるそのような胚の染色パターンは、Oct-4 mRNAの組織特異的分布が、β−ガラクトシダーゼ発現パターンにより正確に反映されることを示す。
IRESおよびcDNAを組織特異的遺伝子のゲノムクローンの3’非翻訳領域に挿入することによる異種分子の効果的な発現への本発明の適用および受精卵へのマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物の生成。
Claims (9)
- 異種遺伝子コーディング配列を真核細胞性宿主細胞ゲノム中の標的内因性遺伝子に挿入し、そして該異種遺伝子コーディング配列を発現させるためのベクターであって、該ベクターは、DNA構築物を含み、該DNA構築物は、以下の配列:
5’ X−A−P−B−Q−C−Y 3’
を含み、ここで、
XおよびYは、該標的内因性遺伝子からの別々の配列と少なくとも95%相同であり、そして該A−P−B−Q−C配列を該宿主細胞ゲノムに挿入するために、該宿主細胞ゲノムとの相同組換えを受けるのに十分な長さであり;
Pは、リボゾーム内部エントリー部位(IRES)であり;
Qは、該異種遺伝子コーディング配列であり;そして
A、BおよびCは、別々に、該構築物中に必要に応じて存在するさらなるDNA配列である、ベクター。 - 前記構築物が、前記A−P−B−Q−C配列を内因性遺伝子の終結コドンの3’(下流)、および該内因性遺伝子のポリアデニル化シグナルの5’(上流)の位置に挿入するように適合される、請求項1に記載のベクター。
- XおよびYがそれぞれ少なくとも1000塩基対の長さである構築物を使用する、請求項1または2に記載のベクター。
- XおよびYが前記標的内因性遺伝子の発現を調節する宿主エレメントを含む構築物を使用する、請求項3に記載のベクター。
- 前記構築物が前記異種遺伝子コーディング配列の3’(下流)末端にポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項1から4のいずれかに記載のベクター。
- 前記構築物が前記IRESの5’(上流)にスプライスアクセプターをさらに含む、請求項1から5のいずれかに記載のベクター。
- 前記スプライスアクセプターが、前記異種遺伝子コーディング配列のイントロン配列への機能的組み込みを可能にする、請求項6に記載のベクター。
- 動物細胞において異種遺伝子コーディング配列を発現するための、請求項1から7のいずれかに記載のベクター。
- 前記構築物がまた、選択性マーカーをコードする遺伝子も含む、請求項1から8のいずれかに記載のベクター。
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