JP2021509818A - Ａｎｐ３２蛋白質の宿主体内でのインフルエンザウィルスポリメラーゼ活性の維持への使用 - Google Patents

Ａｎｐ３２蛋白質の宿主体内でのインフルエンザウィルスポリメラーゼ活性の維持への使用 Download PDF

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Abstract

本発明はインフルエンザウィルスが宿主体内での複製に必要な宿主蛋白質因子であるＡＮＰ３２Ａ／Ｂの組み換え配列情報を提供する。より詳細には、本発明は、宿主蛋白質因子であるＡＮＰ３２Ａ／Ｂ蛋白質の１２９−１３０モチーフ及び１４９サイトに係るものである。これらは、該蛋白質がインフルエンザウィルスの複製を促進する役割に重要な作用をする活性サイトであり、同時に、抗インフルエンザ医薬品の潜在的な標的部位である。

Description

本発明はインフルエンザウィルスが宿主体内での複製に必要な宿主蛋白質因子に関するものである。より詳細には、インフルエンザウィルスが宿主体内での複製に必要な宿主蛋白質因子である、ＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂに関するものである。
インフルエンザはインフルエンザウィルスに起因する最悪のヒト感染症の一つであり、一つの世界的なインフルエンザの突然なパンデミック（汎流行）には、人口の約２０％−４０％が感染される可能性があるので（Ｂａｓｌｅｒ Ｃ Ｆら．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ １９１８ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｇｅｎｅ（ＮＳ）ｓｅｇｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｅａｒｉｎｇ ｔｈｅ １９１８ ＮＳ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００１，９８（５）：２７４６−２７５１．）、人の生命、健康と社会生活にとっては巨大な脅威になる。インフルエンザウィルスは、エンベロープを持つＲＮＡウィルスであり、オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）科に属し、直径８０−１２０ｎｍの球形又は多角形な粒子である。インフルエンザウィルスには、Ａ型（甲型）、Ｂ型（乙型）、Ｃ型（丙型）とＤ型（丁型）に分類される。ここで、Ａ型インフルエンザウィルスは、その変異及び進化速度が速く、抗原が変わりやすく、感染性と病原性が強く、広める速度が速いから、季節性インフルエンザと歴史上のインフルエンザ大流行の原因となる主なウィルスである（Ｈａｒｄｅｌｉｄ Ｐ，ら．Ｅｘｃｅｓｓ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎ Ｅｎｇｌａｎｄ ａｎｄ Ｗａｌｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ（Ｈ１Ｎ１）２００９ ｐａｎｄｅｍｉｃ［Ｊ］．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ，２０１１，１３９（９）：１４３１−１４３９；Ｙａｎｇ Ｌら．Ｅｘｃｅｓｓ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ２００９ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｉｎ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ［Ｊ］．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ，２０１２，１４０（９）：１５４２−１５５０）。Ａ型インフルエンザウィルスは、順番に１９１８、１９５７、１９６８と２００９年の四つの世界的なインフルエンザ大流行を作った。該ウィルスが人の群れで迅速かつ広めることは、宿主体内での適性及び複製能力の増強と関係があると考えられる。該ウィルスの宿主体内での特異な効率的な複製、及び宿主に対する適性は、主としてＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼにより決める（Ｅｉｓｆｅｌｄ ＡＪら．Ａｔ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒｅ：ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ｊａｎ；１３（１）：２８−４１．）。
インフルエンザウィルスのゲノムには、８本（分節）のネガティブ鎖ＲＮＡを含み、１１つの蛋白質をコードする。なお、ＲＮＡポリメラーゼは、前からの三つの配列でコードするＰＢ１、ＰＢ２とＰＡからなるヘテロ多量体である（Ａｒｅａ Ｅら．３Ｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅコンプレックス：ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｕｎｉｔ ｄｏｍａｉｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００４，１０１（１）：３０８−３１３；Ｅｉｓｆｅｌｄ ＡＪら．Ａｔ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒｅ：ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ｊａｎ；１３（１）：２８−４１）。ＲＮＡポリメラーゼは、インフルエンザウィルスが宿主細胞内での転写と複製の材料ベースであり、ウィルスの病原性と宿主の範囲に大切な影響を及ぼす（Ｎｅｕｍａｎｎ Ｇら．Ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｐａｎｄｅｍｉｃ［Ｊ］．Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００６，１２（６）：８８１−８８６．）。宿主細胞内のインフルエンザウィルスのポリメラーゼ及びそのサブユニットと作用する様々な因子、例えばＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ、核内移行蛋白質α等は、インフルエンザウィルスのポリメラーゼトリマーの装配及びその活性に影響を及ぼす（Ｂｏｒｔｚ Ｅら．Ｈｏｓｔ− ａｎｄ ｓｔｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．ＭＢｉｏ，２０１１，２（４）；Ｇａｂｒｉｅｌ Ｇら．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｕｓｅ ｏｆ ｉｍｐｏｒｔｉｎ−ａｌｐｈａ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｇｏｖｅｒｎｓ ｃｅｌｌ ｔｒｏｐｉｓｍ ａｎｄ ｈｏｓｔ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１１，２：１５６．）。したがって、インフルエンザウィルスのポリメラーゼと宿主のタンパク質との相互作用は、ウィルスの毒性、宿主の範囲を決める大切な因子である。
インフルエンザウィルスの種間広める及びその宿主制限メカニズムは、いつも当業界が検討しているホットスポットである。宿主蛋白質ＡＮＰ３２（ａｃｉｄｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、ウィルスＲＮＡの感染した細胞での合成と相関すると考えられる。従前の検討は、前記蛋白質が胞内輸送、細胞死亡経路、転写コントロール等の細胞生理活動における役割、並びにＡＮＰ３２蛋白質が腫瘍及び神経系疾患との関聯性に着目したものが多い。ＡＮＰ３２蛋白質ファミリーのメンバーが多く、それらの構造も類似し、一つの球形のロイシンリッチリピート（Ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ、ＬＲＲｓ）のアミノ端と、一つの伸展している酸性アミノ酸に富む（ＬＣＡＲ）カルボキシ端によって構成される（Ｒｅｉｌｌｙ Ｐ Ｔら．Ｃｒａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ＡＮＰ３２ ｗｈｉｐｓ：ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｕｎｅｑｕａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ， ａｎｄ ｈｉｎｔｓ ａｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，２０１４，３６（１１）：１０６２−１０７１．）。動植物及び原生生物には、該タンパク質ファミリーがいずれも認められるが、酵母及び他の真菌には見つかれない。これは、該タンパク質ファミリーが真核生物起源のものであり、真菌には何からの原因でなくなったことを示唆した。ヒトには該ファミリーが８つのメンバーがあることを報告された。ここで、ＡＮＰ３２Ａ、ＡＮＰ３２Ｂ、ＡＮＰ３２Ｅの３つは、脊椎動物に比較的な保存される。その中、ＡＮＰ３２Ａ及びＡＮＰ３２Ｂは、最も広く検討された。ＡＮＰ３２Ａ蛋白質とＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の間のアミノ酸配列相同性は、７０％である。ＡＮＰ３２蛋白質のアミノ端のＬＲＲｓ領域の存在によって、ＡＮＰ３２蛋白質は疎水性に呈しており、ＡＮＰ３２蛋白質と他の蛋白質との相互結合に寄与することで異なる生物学役割を果たす。該蛋白質が、カルボキシ端には酸性アミノ酸に富み、かつ一つの核移行シグナルＫＲＫＲとを含むので、細胞核内の塩基性タンパク質と相互作用することができ、核と質の間に往来することもできる（Ｍａｔｓｕｂａｅ，Ｍａｓａｍｉら．“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ａｃｉｄｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．”Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４６８．２−３（２０００）：１７１−１７５；Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｋ．ら．“Ａ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｅｕｃｉｎｅ−Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｍｕｒｉｎｅ Ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ Ｎｅｕｒｏｎｓ．”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９１．２１（１９９４）：９６７０．）。該蛋白質は、また、細胞表面に発現でき、細胞外に分泌されるさえできる。ＡＮＰ３２蛋白質は、これら特性に基づいて、胞質及び胞核内の多様な生物学過程に関与し得る。文献によって、ＡＮＰ３２Ａ、ＡＮＰ３２Ｂは細胞核において転写調節ファクターとして以下のように機能でき、（１）ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害ファクター（ＩＮＨＡＴ）複合物の構成部分として、転写の調節に関与する（Ｋａｄｏｔａ，Ｓら．“ｐｐ３２，ａｎ ＩＮＨＡＴ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ｉｓ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｒｅｃｒｕｉｔｅｒ ｆｏｒ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２４．Ｐｔ ６（２０１１）：８９２．）。（２）ｍＲＮＡ結合蛋白質ＨｕＲ及び核外輸送タンパク質ＣＲＭ１のリガンドとして、アデノシンに富むｍＲＮＡ鎖の核クスポートが加速されることができる（Ｂｒｅｎｎａｎ Ｃ Ｍら．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ Ｈｕｒ Ｍｏｄｕｌａｔｅ Ｉｔｓ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｔａｒｇｅｔ Ｍｒｎａｓ ｉｎ Ｖｉｖｏ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，１５１（１）：１．）ことを報告された。前記機能は、細胞の宿主のｍＲＮＡを制御できるとともに（Ｆｒｉｅｓ，Ｂａｒｂａｒａら．“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＨｕＲ Ｌｉｇａｎｄ ＡＰＲＩＬ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ＣＤ８３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８２．７（２００７）：４５０４−１５．）、ウィルスのｍＲＮＡを制御することもできる（Ｂｏｄｅｍ，Ｊら．“Ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ ｅｘｐｏｒｔ ｉｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８５．５（２０１１）：２３３３−２３４１．）。これ以外、ＡＮＰ３２蛋白質は、細胞質内でも重要な役割を果たし得る。例えば、ＡＮＰ３２Ａはｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎに結合でき（Ｕｌｉｔｚｕｒ，Ｎ，Ｍら．“Ｍａｐｍｏｄｕｌｉｎ：ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ．”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９４．１０（１９９７）：５０８４．）、細胞内の物質の輸送及びシグナルの伝達、細胞形態の維持及び細胞小器官の空間分布等に影響を及ぼす。ＡＮＰ３２蛋白質はアポトーシス体を活性化し、細胞死亡経路をコントロールすることができる。（Ｐａｎ，Ｗｅｉら．“ＰＨＡＰＩ／ｐｐ３２ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８４．１１（２００９）：６９４６．）。
２００９年にＳｈａｐｉｒａが酵母ツーハイブリッド方法で宿主蛋白質ＡＮＰ３２Ａをスクリーニングし、それとインフルエンザウィルスの感染に関系があることを初歩を見出した以来、研究者たちは次々と該タンパク質ファミリーとインフルエンザウィルスの相互作用について検討した。２０１１年、Ｂｒａｄｅｌ−Ｔｒｅｔｈｅｗａｙらは、プロテオミクスにて、ＡＮＰ３２Ａ、ＡＮＰ３２Ｂがインフルエンザウィルスのポリメラーゼと互いに結合することを見出した。２０１４年、Ｗａｔａｎａｂｅらは、ＲＡＮｉライブラリースクリーニングにて、ＡＮＰ３２Ａ、ＡＮＰ３２Ｂがインフルエンザウィルスの細胞を感染後ｖＲＮＡの合成に影響できることを証明した。２０１５年、Ｓｕｇｉｙａｍａらは、ＡＮＰ３２Ａ、ＡＮＰ３２Ｂはインフルエンザウィルス複製におけるｃＲＮＡ−ｖＲＮＡの合成過程を促進され得ることを見出し、ＣＯ−ＩＰ等の生物学の技術手段にて、ＡＮＰ３２蛋白質がインフルエンザウィルスのポリメラーゼの三サブイル（ＰＢ２／ＰＢ１／ＰＡ）のポリマーと相互作用しているで、ＮＰ蛋白質とは無関係であることを証明した（Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｋら．ｐｐ３２ ａｎｄ ＡＰＲＩＬ ａｒｅ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｃＲＮＡ［Ｊ］．Ｅｌｉｆｅ，２０１５，４；Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔら．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−ｈｏｓｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ｓｃｒｅｅｎ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，２０１４，１６（６）：７９５−８０５．）。その後、鳥インフルエンザウィルスのＲＮＡポリメラーゼは、哺乳動物細胞中の活性がＡＮＰ３２Ａの種類と特異的な関連があることは、イギリスの研究者Ｗｅｎｄｙ Ｓ．Ｂａｒｃｌａｙの研究チームから初めて提示した（Ｌｏｎｇ Ｊ Ｓら．Ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ＡＮＰ３２Ａ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｈｏｓｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，５２９（７５８４）：１０１−１０４．）。検討を重ねたところ、哺乳動物由来のものと比べて、鳥由来ＡＮＰ３２ＡのＬＲＲｓとＬＣＡＲ領域との間に３３つのアミノ酸インサーション配列を含むことを発見した。この配列特徴を持つことで、鳥由来ＡＮＰ３２Ａは、鳥由来インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を特異的な活性化する特性が決めた。鳥由来インフルエンザウィルス（Ｈ５Ｎ１／Ｈ７Ｎ９）は、ＰＢ２ Ｅ６２７Ｋの変異を有してこそ、ポリメラーゼが哺乳動物のＡＮＰ３２Ａにより適応するものになる。このため、ＡＮＰ３２Ａはインフルエンザウィルスの複製をサポートする肝要な宿主蛋白質であることは推定したが、それとポリメラーゼとの相互作用の具体的な分子作用機序についてさらなる探索は必要である。
Ｌｏｎｇ Ｊ Ｓら．Ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ＡＮＰ３２Ａ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｈｏｓｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，５２９（７５８４）：１０１−１０４．
季節性インフルエンザや、世界的なインフルエンザ大流行の危害は、世間では全面的な注目を集めている。従来、抗インフルエンザウィルス医薬品についての検討は初歩的な成果をあげてきた。しかし、既存医薬品は臨床で汎用されているから、インフルエンザウィルスは続けて変異して、これら医薬品に対して異なる程度の耐性を生じる。このことに鑑み、新たな抗インフルエンザウィルス医薬品の開発とスクリーニングは日増しに重要となる。本発明は、ＡＮＰ３２Ａ、ＡＮＰ３２Ｂが異なる種類（ｓｐｅｃｉｅｓ＆ｇｅｎｕｓ）の動物細胞内に共通の、インフルエンザウィルスで利用した宿主蛋白質であり、その上、前記二つの蛋白質の中の両者又は一者は、インフルエンザウィルスの宿主内の複製に必要なものであるとを証明する。さらに、本発明は前記二つの蛋白質の鍵となるアミノ酸サイトを発見した。鍵となるアミノ酸への変異により、インフルエンザウィルスの複製がほとんど進行できない。この発見は、抗インフルエンザ医薬品又は抗インフルエンザ動物のデザインに直接な根拠を提供できる。
一局面において、本発明は、変異型ＡＮＰ３２蛋白質であって、
１２９番目のアミノ酸の、イソロイシンＩ、リジンＫ、アスパラギン酸Ｄ、バリンＶ、プロリンＰ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、グリシンＧ、又はグルタミン酸Ｅへの置換、
１３０番目のアミノ酸の、アスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ、リジンＫ、ロイシンＬ、バリンＶ、プロリンＰ、イソロイシンＩ、メチオニンＭ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、又はチロシンＹへの置換、
１４９番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、
１５１番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、及び
６０と６３、８７、９０、９３と９５、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸の、アラニンへの置換、
からなる群から選ばれる１種又は複数種の変異を有し、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、アヒルＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、シチメンチヨウＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、１２９番目のアミノ酸はイソロイシンＩではなく、且つ、１３０番目のアミノ酸はアスパラギンＮではなく、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はネズミＡＮＰ３２Ａである場合、１３０番目のアミノ酸はアラニンＡではなく、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリのＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトのＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、変異型ＡＮＰ３２蛋白質。
一局面において、本発明は、変異型ＡＮＰ３２蛋白質であって、
６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、
からなる群から選ばれるアミノ酸断片の1個又は複数個の断片が、欠失又はアラニンに置換され、
ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、変異型ＡＮＰ３２蛋白質。
一局面において、本発明は、変異型ＡＮＰ３２蛋白質であって、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、
２１−３０番目のアミノ酸断片、４１−５０番目のアミノ酸断片、５１−６０番目のアミノ酸断片、１６１−１７０番目のアミノ酸断片、
からなる群から選ばれるアミノ酸断片の1個又は複数個の断片が、欠失又はアラニンに置換され、
ここで、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、変異型ＡＮＰ３２蛋白質。
一局面において、本発明は、変異型ＡＮＰ３２蛋白質であって、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、
１６１−１７０番目のアミノ酸断片、１７１−１８０番目のアミノ酸断片、１９１−２００番目のアミノ酸断片、
からなる群から選ばれるアミノ酸断片の1個又は複数個の断片が、欠失又はアラニンに置換され、
ここで、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、変異型ＡＮＰ３２蛋白質。
一実施形態において、前記ＡＮＰ３２蛋白質は、ＡＮＰ３２Ａ又はＡＮＰ３２Ｂであり、好ましくは、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、より好ましくは、ニワトリ又はヒト由来のものであり、最も好ましくは、ヒトＡＮＰ３２Ｂ、又はニワトリＡＮＰ３２Ａである。
一局面において、本発明は、ＡＮＰ３２蛋白質のインフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性の維持への使用であって、
好ましくは、ＡＮＰ３２蛋白質は鳥由来ＡＮＰ３２蛋白質であり、且つ前記インフルエンザウィルスが鳥由来又は哺乳動物由来インフルエンザウィルスであり、或いは、
ＡＮＰ３２蛋白質は哺乳動物由来ＡＮＰ３２蛋白質であり、且つ前記インフルエンザウィルスは哺乳動物由来インフルエンザウィルスであり、
好ましくは、前記インフルエンザウィルスは、ヒト、イヌ、鳥又はウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれ、
好ましくは、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質、ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質から選ばれ、
より好ましくは、前記ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、
好ましくは、前記ＡＮＰ３２蛋白質ニワトリ由来のＡＮＰ３２Ｂ又はネズミ由来のＡＮＰ３２Ａではない、前記使用。
一局面において、本発明は、ＡＮＰ３２蛋白質のインフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性の低減のための使用であって、
好ましくは、前記インフルエンザウィルスは、ヒト、イヌ、鳥又はウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれ、
好ましくは、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質、ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質から選ばれ、
より好ましくは、前記ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、
より好ましくは、ＡＮＰ３２蛋白質は請求項１−４のいずれか１項に定義した変異型ＡＮＰ３２蛋白質、或いはＡＮＰ３２蛋白質はニワトリ由来のＡＮＰ３２Ｂ蛋白質又はネズミ由来のＡＮＰ３２Ａ蛋白質である、前記使用。
一局面において、本発明は、インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を下げる方法であって、ＡＮＰ３２蛋白質を変異させることを含み、
前記変異が、
１２９番目のアミノ酸の、イソロイシンＩ、リジンＫ、アスパラギン酸Ｄ、バリンＶ、プロリンＰ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、グリシンＧ、又はグルタミン酸Ｅへの置換、
１３０番目のアミノ酸の、アスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ、リジンＫ、ロイシンＬ、バリンＶ、プロリンＰ、イソロイシンＩ、メチオニンＭ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、又はチロシンＹへの置換、
１４９番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、
１５１番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、及び
６０と６３、８７、９０、９３と９５、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸の、アラニンへの置換、
からなる群から選ばれる１種又は複数種の変異であり、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、アヒルＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、シチメンチヨウＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、１２９番目のアミノ酸はイソロイシンではなく、且つ１３０番目のアミノ酸はアスパラギンＮではなく、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はネズミＡＮＰ３２Ａである場合、１３０番目のアミノ酸はアラニンＡではなく、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を下げる方法。
一実施形態において、前記インフルエンザウィルスはポリメラーゼの活性を喪失させ、
前記変異が、
１２９番目のアミノ酸の、イソロイシンＩ、リジンＫ又はアスパラギン酸Ｄへの置換、
１３０番目のアミノ酸の、アスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ又はリジンＫへの置換、
８７、９０、９３と９５、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸の、アラニンへの置換、
からなる群から選ばれる１種又は複数種の変異である。
一局面において、本発明は、インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を下げる方法であって、ＡＮＰ３２蛋白質の1個又は複数個の断片を、欠失又はアラニンに置換させることを含み、
前記断片が、
６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、
からなる群から選ばれるアミノ酸断片であり、
ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、前記方法。
一実施形態において、前記インフルエンザウィルスのポリメラーゼの活性を喪失させ、
前記断片が、
７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、
からなる群から選ばれるアミノ酸断片である。
一局面において、本発明は、インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を下げる方法であって、
ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の1個又は複数個の断片を、欠失又はアラニンに置換させることを含み、
前記断片が、
２１−３０番目のアミノ酸断片、４１−５０番目のアミノ酸断片、５１−６０番目のアミノ酸断片、１６１−１７０番目のアミノ酸断片、
からなる群から選ばれるアミノ酸断片であり、
ここで、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトのＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、前記方法。
一局面において、本発明は、インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を下げる方法であって、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の1個又は複数個の断片を、欠失又はアラニンに置換させることを含み、
前記断片が、
１６１−１７０番目のアミノ酸断片、１７１−１８０番目のアミノ酸断片、１９１−２００番目のアミノ酸断片、
からなる群から選ばれるアミノ酸断片であり、
ここで、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、前記方法。
一実施形態において、前記インフルエンザウィルスのポリメラーゼの活性を喪失させ、
前記断片が、
１６１−１７０番目のアミノ酸断片、１７１−１８０番目のアミノ酸断片
からなる群から選ばれるアミノ酸断片である。
一実施形態において、ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ又はＡＮＰ３２Ｂから選ばれ、
好ましくは、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、
より好ましくは、ニワトリ又はヒト由来のものであり、
最も好ましくは、ヒトＡＮＰ３２Ｂ、又はニワトリＡＮＰ３２Ａであり、
好ましくは、前記インフルエンザウィルスは、ヒト、イヌ、鳥、ウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれるものである。
一局面において、本発明は、ＡＮＰ３２蛋白質のアミノ酸断片の、インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性の維持への使用であって、
前記断片が、
６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１７１−１８０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１９１−２００番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の２１−３０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の４１−５０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の５１−６０番目のアミノ酸、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、
からなる群から選ばれる1個又は複数個の断片であり、
ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
好ましくは、ＡＮＰ３２蛋白質は鳥由来ＡＮＰ３２蛋白質であり、且つ前記インフルエンザウィルスが鳥由来又は哺乳動物由来インフルエンザウィルスから選ばれ、
或いは、ＡＮＰ３２蛋白質は哺乳動物由来ＡＮＰ３２蛋白質であり、且つ前記インフルエンザウィルスは哺乳動物由来インフルエンザウィルスである、前記使用。
一局面において、本発明は、ＡＮＰ３２蛋白質のアミノ酸断片の、インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性の低減のための使用であって、
前記断片が、
６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１７１−１８０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１９１−２００番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の２１−３０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の４１−５０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の５１−６０番目のアミノ酸、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、
からなる群から選ばれる1個又は複数個の断片であり、
ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
好ましくは、ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ又はＡＮＰ３２Ｂから選ばれ、好ましくは、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、より好ましくは、ニワトリ又はヒト由来のものであり、最も好ましくは、ヒトＡＮＰ３２Ｂ、又はニワトリＡＮＰ３２Ａであり、
好ましくは、前記インフルエンザウィルスは、ヒト、イヌ、鳥、ウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれる、前記使用。
一局面において、本発明は、少なくとも１種の試薬又は組合試薬を含むキットであって、
前記少なくとも１種の試薬又は組合試薬は、
ＡＮＰ３２蛋白質の１２９番目のアミノ酸、１３０番目のアミノ酸、１４９番目のアミノ酸、１５１番目のアミノ酸、６０番目のアミノ酸、６３番目のアミノ酸、８７番目のアミノ酸、９０番目のアミノ酸、９３番目のアミノ酸、９５番目のアミノ酸、１１２番目のアミノ酸、１１５番目のアミノ酸又は１１８番目のアミノ酸、
からなる群から選ばれる１種又は複数種の番目のアミノ酸種類の同定に用いるものであり、
ここで、
１２９番目のアミノ酸はイソロイシンＩ、リジンＫ、アスパラギン酸Ｄ、バリンＶ、プロリンＰ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、グリシンＧ、又はグルタミン酸Ｅであり、
１３０番目のアミノ酸はアスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ、リジンＫ、ロイシンＬ、バリンＶ、プロリンＰ、イソロイシンＩ、メチオニンＭ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、又はチロシンＹであり、
１４９番目のアミノ酸はアラニンＡであり、
１５１番目のアミノ酸はアラニンＡであり、
６０と６３、８７、９０、９３と９５、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸はアラニンである場合、
前記ＡＮＰ３２蛋白質のインフルエンザポリメラーゼの活性をサポートする能力が低減し、
ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、前記キット。
一局面において、本発明は、ＡＮＰ３２蛋白質のアミノ酸の種類を同定するために使用する、オリゴヌクレオチドプライマーであって、
前記ＡＮＰ３２蛋白質のアミノ酸は、
１２９番目のアミノ酸、１３０番目のアミノ酸、１４９番目のアミノ酸、１５１番目のアミノ酸、６０番目のアミノ酸、６３番目のアミノ酸、８７番目のアミノ酸、９０番目のアミノ酸、９３番目のアミノ酸、９５番目のアミノ酸、１１２番目のアミノ酸、１１５番目のアミノ酸と１１８番目のアミノ酸、
からなる群から選ばれるアミノ酸であり、
ここで、
１２９番目のアミノ酸はイソロイシンＩ、リジンＫ、アスパラギン酸Ｄ、バリンＶ、プロリンＰ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、グリシンＧ、又はグルタミン酸Ｅであり、
１３０番目のアミノ酸はアスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ、リジンＫ、ロイシンＬ、バリンＶ、プロリンＰ、イソロイシンＩ、メチオニンＭ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、又はチロシンＹであり、
１４９番目のアミノ酸はアラニンＡであり、
１５１番目のアミノ酸はアラニンＡであり、
６０、６３番目のアミノ酸、又は８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸、又は１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸はアラニンである場合、
前記ＡＮＰ３２蛋白質のインフルエンザポリメラーゼの活性をサポートする能力が低減し、
ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、前記オリゴヌクレオチドプライマー。
一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、好ましくは、少なくとも２０塩基の長さを有し、例えば、少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５塩基の長さを有する。
一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５−１５６，１６３−１６６，１６７−２５６、と３７５−３８０からなる群から選ばれる。
一実施形態において、ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ又はＡＮＰ３２Ｂから選ばれ、
好ましくは、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、
より好ましくは、ニワトリ又はヒト由来のものであり、
最も好ましくは、ヒトＡＮＰ３２Ｂ、又はニワトリＡＮＰ３２Ａである。
一局面において、本発明は、動物の生産方法であって、
動物体内のＡＮＰ３２蛋白質を変異させる工程を含み、
前記変異が、
１２９番目のアミノ酸の、イソロイシンＩ、リジンＫ、アスパラギン酸Ｄ、バリンＶ、プロリンＰ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、グリシンＧ、又はグルタミン酸Ｅへの置換、
１３０番目のアミノ酸の、アスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ、リジンＫ、ロイシンＬ、バリンＶ、プロリンＰ、イソロイシンＩ、メチオニンＭ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、又はチロシンＹへの置換、
１４９番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、
１５１番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、及び
６０と６３、８７、９０、９３と９５、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸の、アラニンへの置換、
６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１７１−１８０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１９１−２００番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の２１−３０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の４１−５０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の５１−６０番目のアミノ酸、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片の、アラニンへの置換、
からなる群から選ばれる１種又は複数種の変異であり、
ここで、ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、アヒルＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、シチメンチヨウＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、１２９番目のアミノ酸はイソロイシンＩではなく、且つ、１３０番目のアミノ酸はアスパラギンＮではなく、
ＡＮＰ３２蛋白質はネズミＡＮＰ３２Ａである場合、１３０番目のアミノ酸はアラニンＡではなく、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、前記方法。
一実施形態において、前記動物は、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマからなる群から選ばれる。
一局面において、本発明は、ＡＮＰ３２蛋白質又はＡＮＰ３２蛋白質のアミノ酸の、標的としての、インフルエンザウィルス感染による疾患を治療するための医薬品の調製への使用であって、
前記アミノ酸は、
１２９番目のアミノ酸、１３０番目のアミノ酸、１４９番目のアミノ酸、１５０番目のアミノ酸、６０と６３番目のアミノ酸、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸、６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１７１−１８０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１９１−２００番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の２１−３０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の４１−５０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の５１−６０番目のアミノ酸、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、
からなる群から選ばれる１種又は複数種の位置又は断片のアミノ酸であり、
好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、前記使用。
好ましくは、前記ＡＮＰ３２蛋白質は、ＡＮＰ３２Ａ又はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質であり、好ましくは、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、好ましくは、前記インフルエンザウィルスが、ヒト、イヌ、鳥、ウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれるものである。
一局面において、本発明は、下記工程を含む、インフルエンザウィルスの感染を治療するための候補医薬品のスクリーニング方法であって、
（１）ＡＮＰ３２Ａ及び／又はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質を含む細胞株から、前記ＡＮＰ３２Ａ、ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質をノックアウすることで、ＡＮＰ３２Ａ蛋白質、ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のノックアウト細胞株を得る、工程、
（２）ＡＮＰ３２Ａ及び／又はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質をコードするプラスミドと、インフルエンザウィルスのポリメラーゼをコードするプラスミドを工程（１）で得たノックアウト細胞株へトランスフェクトする、工程、
（３）候補物を前記ノックアウトした細胞株に接触させる、工程、前記接触は、工程（２）のトランスフェクションと同時又は別々に実施してもよく、
ここで、前記候補物が、工程（３）で処理した細胞株において、ＡＮＰ３２Ａ及び／又はＡＮＰ３２Ｂを含む細胞株と比べて、インフルエンザウィルスのポリメラーゼを発現させない場合、或いはインフルエンザウィルスのポリメラーゼの発現を低減させる場合、インフルエンザウィルスの感染を治療するための候補医薬品である、前記方法。
一実施形態において、前記ＡＮＰ３２Ａ及び／又はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質は、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、好ましくは、前記インフルエンザウィルスが、ヒト、イヌ、鳥、ウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれるものである。
ＰＣＡＧＧＳベクターの模式図。 ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａベクターの模式図。 各物種においてＡＮＰ３２蛋白質発現の検出。 ノックアウト細胞株の蛍光定量ＰＣＲの検出：Ａは各細胞株中のｈｕＡＮＰ３２Ａに対する定量検出であり、Ｂは各細胞株中のｈｕＡＮＰ３２Ｂに対する定量検出である。 ２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株中の内在性ＡＮＰ３２蛋白質の検出。 Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼが２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株での活性の検出。 異なるポリメラーゼは、２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株での活性の検出。図７ＡはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼが２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株での活性の検出である。 異なるポリメラーゼは、２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株での活性の検出。図７ＢはＷＳＮポリメラーゼが２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株での活性の検出である。 異なるポリメラーゼは、２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株での活性の検出。図７ＣはＨ３Ｎ２ＧＤ１１ポリメラーゼが２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株での活性の検出である。 異なるポリメラーゼは、２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株での活性の検出。図７ＤはＨ３Ｎ８ＪＬ８９ポリメラーゼが２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株での活性の検出である。 異なるポリメラーゼは、２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株での活性の検出。図７ＥはＨ３Ｎ８ＸＪ０７ポリメラーゼが２９３Ｔ野生型及びノックアウト細胞株での活性の検出である。 Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼが、ＤＫＯ細胞株において、異なる用量のｈｕＡＮＰ３２Ａ又はｈｕＡＮＰ３２Ｂを補償するときの活性のアッセイ。 Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ（Ａ）とＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ（Ｂ）は、ＤＫＯ細胞に過剰なｈｕＡＮＰ３２Ａ又はｈｕＡＮＰ３２Ｂを補償するとき、その活性が抑制された。 ｈｕＡＮＰ３２ＡがＨ１Ｎ１ＳＣ０９インフルエンザウィルスＲＮＡ合成に対する影響は、蛍光定量で検出する。 異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質による、異なるインフルエンザウィルスの複製への影響。図１１Ａは異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質によるＨ１Ｎ１ＳＣ０９インフルエンザウィルスの複製への影響である。 異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質による、異なるインフルエンザウィルスの複製への影響。図１１Ｂは異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質によるＨ７Ｎ９ＡＨ１３インフルエンザウィルスの複製への影響である。 異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質による、異なるインフルエンザウィルスの複製への影響。図１１Ｃは異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質によるＨ３Ｎ２ＧＤ１１インフルエンザウィルスの複製への影響である。 異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質による、異なるインフルエンザウィルスの複製への影響。図１１Ｄは異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質によるＨ３Ｎ８ＸＪ０７インフルエンザウィルスの複製への影響である。 異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質による、異なるインフルエンザウィルスの複製への影響。図１１Ｅは異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質によるＨ３Ｎ８ＪＬ８９インフルエンザウィルスの複製への影響である。 異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質による、異なるインフルエンザウィルスの複製への影響。図１１Ｆは異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質によるＨ９Ｎ２ＺＪ１２インフルエンザウィルスの複製への影響である。 異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質による、異なるインフルエンザウィルスの複製への影響。図１１Ｇは異なる物種のＡＮＰ３２蛋白質によるＷＳＮインフルエンザウィルスの複製への影響である。 Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９インフルエンザウィルスの検出、図１２Ａは異なる細胞株にＨ１Ｎ１ＳＣ０９インフルエンザウィルスをトランスフェクトした時の産毒量の検出である。 Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９インフルエンザウィルスの検出、図１２Ｂは、ＤＫＯ細胞にＡＮＰ３２蛋白質を補償することによるＨ１Ｎ１ＳＣ０９インフルエンザウィルスの産毒量の影響の検出である。 ＷＳＮインフルエンザウィルスの検出、図１３Ａは異なる細胞株にＷＳＮインフルエンザウィルスを感染させた時の、ウィルスインフルエンザウイルス力価の検出である。 ＷＳＮインフルエンザウィルスの検出、図１３ＢはＤＫＯ細胞にＡＮＰ３２蛋白質を補償することは、ＷＳＮインフルエンザウィルス力価に対する影響である。 Ｈ７Ｎ９亜型インフルエンザウィルスのＰＢ２遺伝子の点変異とＡＮＰ３２の適性。 ＡＮＰ３２Ｂ配列のアラインメント、切り詰め及び断片交換であり、図１５ＡはＡＮＰ３２Ｂ配列のアラインメントである。 ＡＮＰ３２Ｂ配列のアラインメント、切り詰め及び断片交換であり、図１５ＢはＡＮＰ３２Ｂの切り詰めるストラテジーである。 ＡＮＰ３２Ｂ配列のアラインメント、切り詰め及び断片交換であり、図１５ＣはｈｕＡＮＰ３２ＢとｃｈＡＮＰ３２Ｂの断片交換の第１回である。 ＡＮＰ３２Ｂ配列のアラインメント、切り詰め及び断片交換であり、図１５ＤはｈｕＡＮＰ３２ＢとｃｈＡＮＰ３２Ｂの断片交換の第２回である。 ＡＮＰ３２Ｂの点変異、図１６ＡはＡＮＰ３２Ｂ １１０−１６１領域の配列アラインメントである。 ＡＮＰ３２Ｂの点変異、図１６ＢはｈｕＡＮＰ３２Ｂの点変異によるＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性に対する影響。 ｈｕＡＮＰ３２Ｂ単一点変異１２９、１３０によるＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性への影響。 ｈｕＡＮＰ３２Ｂ単一点変異によるＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性への影響。 ｈｕＡＮＰ３２Ａの点変異１２９、１３０によるＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性への影響。 ｈｕＡＮＰ３２Ａの点変異によるＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性への影響。 ｃｈＡＮＰ３２Ａの点変異及びｃｈＡＮＰ３２Ｂ点変異によるＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性への影響。 ｃｈＡＮＰ３２Ａ １２９点変異体によるＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性への影響。 ｃｈＡＮＰ３２Ａ １２９点変異体によるＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性への影響。 ｃｈＡＮＰ３２Ａ １２９点変異体によるＷＳＮポリメラーゼ活性への影響。 ｃｈＡＮＰ３２Ａ １３０点変異体によるＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性への影響。 ｃｈＡＮＰ３２Ａ １３０点変異体によるＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性への影響。 ｃｈＡＮＰ３２Ａ １３０点変異体によるＷＳＮポリメラーゼ活性への影響。 ｈｕＡＮＰ３２Ｂ切り詰めた変異体によるＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性影響。 ｃｈＡＮＰ３２Ａ切り詰めた変異体によるＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性に対する影響。 ｃｈＡＮＰ３２Ａ点変異体によるＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性に対する影響。 ｈｕＡＮＰ３２Ｂ点変異体によるＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性に対する影響。 ｈｕＡＮＰ３２Ａ及びｈｕＡＮＰ３２Ｂの１２９／１３０番目のアミノ酸が部位特異的変異した細胞株のシークエンサー同定結果。 ｈｕＡＮＰ３２Ａ及びｈｕＡＮＰ３２Ｂの１２９／１３０番目のアミノ酸が部位特異的変異した細胞株の蛋白質検出結果。 Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼが異なる細胞株での活性の検出。 Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼが異なる細胞株での活性の検出。 鳥由来ＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸配列アラインメント。 鳥由来ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質とｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列アラインメント。 ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質と哺乳動物ＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸配列アラインメント。 哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列アラインメント。 ネズミＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の発現の検出。 ネズミＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の点変異体がＨ７Ｎ９ＡＨ１３のポリメラーゼ活性に対する影響。
以下に実施例、図面を挙げて本発明を詳細に説明する。当業者にとって理解するように、下記実施例は説明の目的で挙げるもので、本発明はこれらの実施例により限定されると解釈されない。本発明の保護範囲は、添付する請求項により限定される。
実施例１．ＡＮＰ３２蛋白質発現ベクターの構築
ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ、ウマ等のＡＮＰ３２蛋白質のヌクレオチド配列は以下である：
ニワトリＡＮＰ３２Ａ（ｃｈＡＮＰ３２Ａ）（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ，ＸＭ＿４１３９３２．５）、ヒトＡＮＰ３２Ａ（ｈｕＡＮＰ３２Ａ）（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ，ＮＭ＿００６３０５．３）、キンカチョウＡＮＰ３２Ａ（ｚｆＡＮＰ３２Ａ）（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ ｇｕｔｔａｔａ，ＸＭ＿０１２５６８６１０．１）、アヒルＡＮＰ３２Ａ（ｄｋＡＮＰ３２Ａ）（Ａｎａｓ ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ，ＸＭ＿００５０２２９６７．１）、シチメンチヨウＡＮＰ３２Ａ（ｔｙＡＮＰ３２Ａ）（Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ ｇａｌｌｏｐａｖｏ，ＸＭ＿０１０７１７６１６．１）、ブタＡＮＰ３２Ａ（ｐｇＡＮＰ３２Ａ）（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ，ＸＭ＿００３１２１７５９．６）、ネズミＡＮＰ３２Ａ（ｍｕＡＮＰ３２Ａ）（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ，ＮＭ＿００９６７２．３）、ウマＡＮＰ３２Ａ（ｅｑＡＮＰ３２Ａ）（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ，ＸＭ＿００１４９５８１０．５）、ニワトリＡＮＰ３２Ｂ（ｃｈＡＮＰ３２Ｂ）（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ，ＮＭ＿００１０３０９３４．１）、ヒトＡＮＰ３２Ｂ（ｈｕＡＮＰ３２Ｂ）（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ，ＮＭ＿００６４０１．２）。
ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ、ウマ等のＡＮＰ３２蛋白質のアミノ酸配列は以下である：
ニワトリＡＮＰ３２Ａ（ｃｈＡＮＰ３２Ａ）（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ，ＸＰ＿４１３９３２．３）、ヒトＡＮＰ３２Ａ（ｈｕＡＮＰ３２Ａ）（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ，ＮＰ＿００６２９６．１）、キンカチョウＡＮＰ３２Ａ（ｚｆＡＮＰ３２Ａ）（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ ｇｕｔｔａｔａ，ＸＰ＿０１２４２４０６４．１）、アヒルＡＮＰ３２Ａ（ｄｋＡＮＰ３２Ａ）（Ａｎａｓ ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ，ＸＰ＿００５０２３０２４．１）、シチメンチヨウＡＮＰ３２Ａ（ｔｙＡＮＰ３２Ａ）（Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ ｇａｌｌｏｐａｖｏ，ＸＰ＿０１０７１５９１８．１）、ブタＡＮＰ３２Ａ（ｐｇＡＮＰ３２Ａ）（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ，ＸＰ＿００３１２１８０７．３）、ネズミＡＮＰ３２Ａ（ｍｕＡＮＰ３２Ａ）（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ，ＮＰ＿０３３８０２．２）、ウマＡＮＰ３２Ａ（ｅｑＡＮＰ３２Ａ）（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ，ＸＰ＿００１４９５８６０．２）、ニワトリＡＮＰ３２Ｂ（ｃｈＡＮＰ３２Ｂ）（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ，ＮＰ＿００１０２６１０５．１）、ヒトＡＮＰ３２Ｂ（ｈｕＡＮＰ３２Ｂ）（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ，ＮＰ＿００６３９２．１）。
まず、ＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇ組み換えプラスミドを構築した。Ｆｌａｇ−ｔａｇ（ＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＮ端に開始コドン（ＡＴＧ）を導入し、Ｃ端にストップコドン（ＴＧＡ）を加えて、開始コドンの前にＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）酵素消化サイトを導入し、ストップコドンの後にＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）酵素消化サイトを導入し、そして２つの酵素消化サイトの外側にＰＣＡＧＧＳベクターの１５ｂｐホモロジ−アーム（横線を引いた部分）を導入し、Ｆｌａｇ−ｔａｇ遺伝子断片と相補的な両本のプライマー Ｆｌａｇ−Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）とＦｌａｇ−Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を合成した。
Ｆｌａｇ−Ｓ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
５−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＴＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴ−３
Ｆｌａｇ−Ａ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
５−ＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＴＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴ−３
デザインした上流、下流プライマーのＦｌａｇ−ＳとＦｌａｇ−Ａは、それぞれ１００ｕＭ（ＴＥバッファーで希釈して）に希釈し、それぞれ１０ｕｌを取ってよく混ぜで９５度、５ｍｉｎに置いた。その後、ＰＣＲ器のスイッチを切って室温に放冷し（約２ｈ）、その産物はアニーリング合成サンプルとする。市販のＰＣＡＧＧＳベクター（図１に示す、バイオ会社から購入、製品ＩＤ Ｖ００５１４、製品番号 ＪＭ００４、ｗｗｗ．ｆｅｎｇｈｂｉｏ．ｃｎ）は、Ｔｈｅｒｍｏ快速制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ ＩとＸｈｏ Ｉで、３７℃水浴で１．５ ｈ二重酵素消化して、ジェル回収キット（ＯＭＥＧＡ、製品番号Ｄ２５００−０１）により酵素消化断片を回収した。得た産物は回収され、備用した。ＰＣＡＧＧＳ二重酵素消化産物とアニーリング合成サンプルは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎリガーゼ（クロンテック会社から購入、製品番号６３９６４８）で、明細書に従って連接して、ＤＨ５αコンピテント細胞へ形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスされた。シークエンサーで正しいと確認したプラスミドはＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇプラスミドは、と命名され、後続実験のコントロールプラスミドとして大量に抽出して備用した。
上で述べた各物種のＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂのヌクレオチド配列により、上に述べた各物種のＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂの配列をそれぞれ合成した。合成するとき、遺伝子断片Ｃ端にストップコドンを除去して、Ｆｌａｇ−ｔａｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）をタンデムに挿入し、Ｆｌａｇ−ｔａｇの末端にストップコドン（ＴＧＡ）を加えて、合成した断片の両端にＮｏｔ Ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）とＸｈｏ Ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の酵素消化サイトを導入した。ＰＣＡＧＧＳ−ＦｌａｇベクターはＴｈｅｒｍｏ快速制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ ＩとＸｈｏ Ｉで３７℃で酵素消化１．５ ｈした後、ジェル回収キット（ＯＭＥＧＡ、製品番号Ｄ２５００−０１）により酵素消化断片を回収した。ＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇ二重酵素消化産物と各遺伝子断片は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎリガーゼ（クロンテック会社から購入、製品番号６３９６４８）で、明細書に従って連接して、ＤＨ５αコンピテント細胞へ形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスして、最終、断片のＰＣＡＧＧＳベクターへのインサーションを完成した。例えば、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａのプラスミド模式図は図２に示す。他の物種のＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂ遺伝子のプラスミド模式図は、図２と類似し、対応する遺伝子配列だけを取り替えたものである。例えば、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミド模式図は、ｈｕＡＮＰ３２ＡをｈｕＡＮＰ３２Ｂに取り替えた配列である。
組み換えプラスミドはシークエンサーで正しいと確認した後、それぞれ１ｕｇを取ってリポフェクタミン２０００で２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。４８ｈ後、細胞溶解液を取って、イムノブロッティング方法（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）でＦｌａｇ−抗体（シグマ会社から購入、製品番号Ｆ１８０４−１ＭＧ）を用いで蛋白質の発現を検定した。細胞内βアクチン（β−ａｃｔｉｎ）は内部標準遺伝子として、抗体Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−β−Ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ（シグマ会社から購入、製品番号 Ａ１９７８−２００ＵＬ）が用いられ、結果は図３に示す。各物種のＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の発現が良い。
実施例２：細胞株の構築
本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術で細胞株を構築した。ＮＣＢＩで発表した参照ヌクレオチド配列ｈｕｍａｎ ＡＮＰ３２Ａ（ＮＭ＿００６３０５．３）とｈｕｍａｎ ＡＮＰ３２Ｂ（ＮＭ＿００６４０１．２）によって、オンラインソフトｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／で、この二つの蛋白質のｓｇＲＮＡ（配列は表１に示す）をデザインした。
Figure 2021509818
次のようにして、ｈｕｍａｎ Ｕ６プロモーター配列＋ｓｇＲＮＡ配列（ｈｕＡＮＰ３２Ａ又はｈｕＡＮＰ３２Ｂ）＋ｓｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列＋ＴＴＴＴＴＴｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６を含む組み換えプラスミドを構築した。
まず、ｈｕｍａｎ Ｕ６プロモーター配列＋ｈｕＡＮＰ３２Ａ−ｓｇＲＮＡ配列＋ｓｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列＋ＴＴＴＴＴＴを含む遺伝子断片を合成し、前記配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８である。合成した断片はそのままｐＭＤ−１８Ｔベクター（ＴａＫａＲａ，製品番号Ｄ１０１Ａ）に連接した。ｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６−ｈｕＡＮＰｓｇＲＮＡ−１組み換えプラスミド（ｈｕＡＮＰ３２ＡｓｇＲＮＡを含む）は、構築に成功した。このプラスミドを鋳型とし、ｈｕＡＮＰ３２ＢについてｓｇＲＮＡプライマーをデザインし、オーバーラップＰＣＲ法で、ＫＯＤ−ＦＸ Ｎｅｏ高効ＤＮＡポリメラーゼ（製品番号：ＫＦＸ−２０１、東洋紡から購入）が用いて増幅し（反応条件と反応系は、同ポリメラーゼの説明を参照した。別に断らない限り、以下の実施例のＰＣＲ反応では（蛍光定量ＰＣＲ反応は除外する）、全部、ＫＯＤ−ＦＸ Ｎｅｏ高効ＤＮＡポリメラーゼを用いて、反応系と反応条件もいずれも同ポリメラーゼの説明を参照して）、ｈｕＡＮＰ３２ＢのｓｇＲＮＡを含むプラスミドを構築した。プライマー配列は表２に示し、ＰＣＲ系及びプロセスはＫＯＤ−ＦＸ Ｎｅｏ明細書を参照した。得られたＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩにより３７°恒温水浴槽で３０分間消化し、その後、５ｕｌ消化産物を取って２０ｕｌ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスし、シークエンサーで正しいと確認したプラスミド、即ち、ｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６−ｈｕＡＮＰｓｇＲＮＡ−２（ｈｕＡＮＰ３２ＢｓｇＲＮＡを含む）を後続のトランスフェクション実験に付す。
Figure 2021509818
Ｃａｓ９−ＧＦＰ蛋白質を発現する真核プラスミドｐＭＪ９２０（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃４２２３４）と、ｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６−ｈｕＡＮＰｓｇＲＮＡ−１又はｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６−ｈｕＡＮＰｓｇＲＮＡ−２組み換えプラスミドは、それぞれ１ｕｇを取って、１：２．５の割合でリポフェクタミン２０００とよく混ぜ、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、超高速フローサイトメトリー選別システムにてＧＦＰ陽性細胞を選別して、一つの細胞／ウェルで９６穴プレートに播種した。約１０日前後までに、単一細胞クローニングをピックアップしてスケールアップ培養し、その後、ＳｉｍｐｌｙＰ全ＲＮＡ抽出キット（Ｂｉｏｆｌｕｘから購入、製品番号 ＢＳＣ５２Ｍ１）を用いて、作業工程に従って細胞ＲＮＡを抽出して、ＴＡＫＡＲＡ会社の逆転写キット（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ），Ｃａｔ．ＲＲ０４７Ａ）を用いてｃＤＮＡ合成した。前記ｃＤＮＡは鋳型とし、ＫＯＤ Ｆｘ ＮｅｏポリメラーゼでｈｕＡＮＰ３２Ａ及びｈｕＡＮＰ３２ＢのｓｇＲＮＡによる標的化された目的断片を増幅した。増幅プライマーは表３に示す。ここで、ｈｕＡＮＰ３２Ａ増幅断片の大きさは３９０ｂｐであり、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ増幅断片の大きさは３６２ｂｐである。シークエンサーで前記遺伝子の欠失を確認した単一細胞クローニングに対して、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇと蛍光定量による同定を行った。ｈｕＡＮＰ３２ＡとｈｕＡＮＰ３２Ｂの二重ノックアウト細胞株とは、一回りでｈｕＡＮＰ３２Ｂ単一ノックアウト細胞株を得た後、もう一回りのノックアウトスクリーニングを経ったものであり、トランスフェクト系及びスクリーニング工程は、上述の通りである。
Figure 2021509818
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇに用いた抗体は、Ａｎｔｉ−ＰＨＡＰ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ会社から購入、製品番号 ａｂ５１０１３）とＡｎｔｉ−ＰＨＡＰＩ２／ＡＰＲＩＬ ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＥＰＲ１４５８８］（Ａｂｃａｍ会社から購入、製品番号 ａｂ２００８３６）、βアクチン（β−ａｃｔｉｎ）は内部標準遺伝子として、抗体Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−β−Ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ（シグマ会社から購入、製品番号 Ａ１９７８−２００ＵＬ）を用いた。結果は図４に示す。ノックアウト細胞株の蛍光定量を同定用プライマーは表４に示す。βアクチン（β−ａｃｔｉｎ）は内部標準遺伝子として、蛍光ＰＣＲ同定結果は図５に示す。上記したように、ｈｕＡＮＰ３２Ａ単一ノックアウト細胞株（ＡＫＯ）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ単一ノックアウト細胞株（ＢＫＯ）及びｈｕＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂ二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）を成功構築されて、後続の実験に用いる。蛍光定量ＰＣＲは、ＴＡＫＡＲＡ会社のＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭII（Ｔｌｉ ＲｎａｓｅＨ ｐｌｕｓ）（製品番号 ＲＲ８２０Ａ）試薬を用いて、明細書のステップに従って作業した（下文の蛍光定量ＰＣＲも、同様にＴＡＫＡＲＡ会社のキットを用いた）。
Figure 2021509818
実施例３：インフルエンザポリメラーゼの活性の検出
本発明に係るインフルエンザポリメラーゼ報告システムは、インフルエンザポリメラーゼＰＢ２、ＰＢ１とＰＡ蛋白質、及び核プロテインＮＰを含む。これら蛋白質は、それぞれ、ヒトインフルエンザＨ１Ｎ１亜型Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ／０１／２００９（Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９）とＡ／ＷＳＮ／１９３３（ＷＳＮ）、ヒトインフルエンザＨ７Ｎ９亜型Ａ／Ａｎｈｕｉ／０１／２０１３（Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３）、イヌインフルエンザＨ３Ｎ２亜型Ａ／ｃａｎｉｎｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／２０１１（Ｈ３Ｎ２ＧＤ１１）、鳥インフルエンザＨ９Ｎ２亜型Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｚｈｅｊｉａｎｇ／Ｂ２０１３／２０１２（Ｈ９Ｎ２ＺＪ１２）とＨ７Ｎ９亜型Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｚｈｅｊｉａｎｇ／ＤＴＩＤ−ＺＪＵ０１／２０１３（Ｈ７Ｎ９ＺＪ１３）、ウマインフルエンザＡ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｊｉｌｉｎ／１／１９８９（Ｈ３Ｎ８ＪＬ８９）とＡ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｘｉｎｊｉａｎｇ／３／２００７（Ｈ３Ｎ８ＸＪ０７）由来のものである。これらインフルエンザ亜型のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡとＮＰ蛋白質の配列は表５に示す。
Figure 2021509818
Figure 2021509818
各インフルエンザウィルス亜型を含む上に述べたタンパク質のプラスミドを構築した。例えば、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼには、ヒトインフルエンザＨ１Ｎ１亜型Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ／０１／２００９（Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９）由来のＰＢ２、ＰＢ１とＰＡ蛋白質、及び核プロテインＮＰを含み、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムと命名され、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡとＮＰ蛋白質は、それぞれ、ＰＣＡＧＧＳベクターでプラスミドを構築し、各がＰＢ２プラスミド、ＰＢ１プラスミド、ＰＡプラスミドとＮＰプラスミドは、と命名された。以下、同様。
Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９のポリメラーゼ報告システムを例として、構築の過程は以下である：
ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮから購入、製品番号 ５２９０４）の作業手順書に従ってＨ１Ｎ１ＳＣ０９ウイルス株（張乾義、修士論文「「Ａ型Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスＡ／Ｓｉｃｈｕａｎ／０１／２００９株の逆向き遺伝ハンドリングシステムの樹立、甘粛農業大学、２０１１を参照して）ｍＲＮＡを抽出し、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素キット（インビトロゲンから購入，製品番号 ２８０２５−０１３）の明細書に従って、Ｕｎｉ１２（ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）を逆転写プライマーとしてｃＤＮＡを合成した。各遺伝子の断片配列情報によって、ＰＣＲ プライマーをデザインし（表７に示す）、両端に各１５ｂｐ ＰＣＡＧＧＳホモログアームを導入し、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ高効ポリメラーゼで目的遺伝子を合成した。その後、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖａｚｙｍｅから購入、製品番号Ｃ１１２−０１）であるシームレスなクローニングキットで、明細書に従ってＨ１Ｎ１ＳＣ０９の各遺伝子増幅断片を、実施例１で二重酵素消化したＰＣＡＧＧＳベクターと室温で３０ｍｉｎ連接した。２０ｕｌ前記連接産物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスした。シークエンサーで正しいと確認したプラスミドは、それぞれＰＢ２プラスミド、ＰＢ１プラスミド、ＰＡプラスミドとＮＰプラスミドは、と命名されて、後続の実験に用いる。以下、同様。他の各ウイルス株の由来は表６に参照する。
Figure 2021509818
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本発明者らは、ポリメラーゼ活性を検定ためのレポータープラスミドプラスミド（ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃ）を構築された。該レポータープラスミドは、ｐＭＤ１８Ｔプラスミドを骨格として、目的配列を含むものである。該目的配列の特徴としては、Ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの蛋白質コード配列の両端に、それぞれＨ３Ｎ８ＪＬ８９株のＨＡ遺伝子の５’端ノンコーディングエリア（配列は：ａｇｃａａａａｇｃａｇｇｇｇ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）及び３’端ノンコーディングエリア（配列は：ｇｔａｔａｃｔａａｔａａｔｔａａａａａｃａｃｃｃｔｔｇｔｔｔｃｔａｃｔ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）を導入し、該配列の３’端にヒトｐｏｌＩプロモーターを導入し、５’端にネズミｐｏｌ Ｉ終止配列を導入した。目的配列は以下に示し：ネズミｐｏｌ Ｉ終止配列（太い下線部）＋ＨＡ遺伝子の５’端ノンコーディングエリア（赤い斜体部）＋Ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子配列＋ＨＡ遺伝子の３’端ノンコーディングエリア（緑色斜体部）＋ヒトｐｏｌＩプロモーター（太い下線部）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０。合成した断片がそのままｐＭＤ１８−Ｔベクターに挿入されたものは、即ち、レポータープラスミドｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃである。
該レポータープラスミドは、インフルエンザポリメラーゼシステムと、２９３Ｔへコトランスフェクトした後、ポリメラーゼ複合体がＦｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ両端のウィルスｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ配列を認識可能になるので、Ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ及びｍＲＮＡの合成を起動する。ポリメラーゼシステムはより安定化及び謹厳にするために、本発明者らは、ポリメラーゼ二重蛍光報告システムを引き込んだ、即ち、前記インフルエンザポリメラーゼ報告システムに、さらに内部標準としてＲａｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｐＲＬ−ＴＫ）を加えて、安定なトランスフェクト系を樹立した。１２ウェルプレートを例として、１ウェルあたりＰＢ１プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＢ２プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＡプラスミド（４０ ｎｇ）、ＮＰプラスミド（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃプラスミド（８０ ｎｇ）とｐＲＬ−ＴＫプラスミド（１０ ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ、製品番号：Ｅ２２４１，ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０２５８４６）を加えて、トランスフェクト試薬ｌｉｐｏ２０００を用いてトランスフェクトした。２４ｈトランスフェクトした後、細胞液を捨て、１００ｕｌ細胞溶解液／ウェル（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ バッファー、ビフルオレセイン酵素キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）由来）で細胞を溶解し、その後、ダブルルシフェラーゼキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＣｅｎｔｒｏ ＸＳ ＬＢ ９６０ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて計測した。Ｒａｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを内部標準として、その比値はポリメラーゼの活性を示す。
本発明者らは、上に述べたシステムで、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼを実施例２で構築した細胞株ＡＫＯ、ＢＫＯ、ＤＫＯ及び野生型２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、各グループについて重複ウェルを３つ設けて、トランスフェクトした。２４ｈ後に検出を行って、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼは、ＡＫＯとＢＫＯにおいて活性が野生型２９３Ｔ細胞とは相違ないが、ＤＫＯ細胞においてＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼの活性が１００００倍以上を下がった。図６に示す。得られた結果は生物学ソフトＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）で処理して、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＤｕｎｎｅｔｔ ｔ検定を用いて分析し、各実験グループとコントロール群との差異について、結果は以下図表記号で示す：ｎｓは無差異、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１，＊＊＊はＰ＜０．００１，＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を表す。ポリメラーゼ活性の検出に関する他の図においても、記号ｎｓ、＊、＊＊、＊＊＊並びに＊＊＊＊の意味が上述と同じであり、処理方式も前述した通りである。
Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３、ＷＳＮ、Ｈ３Ｎ２ＧＤ１１、Ｈ３Ｎ８ＪＬ８９、Ｈ３Ｎ８ＸＪ０７ポリメラーゼについては、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼと同じ方法に従って、異なる細胞株ＡＫＯ、ＢＫＯ、ＤＫＯ及び野生型２９３Ｔ細胞にそれぞれトランスフェクトしたところ、いずれもＡＫＯとＢＫＯにおいて活性が野生型２９３Ｔ細胞とは相違ないが、ＤＫＯ細胞においてポリメラーゼ活性が約１００００倍を下がった。結果は図７Ａ−Ｅに示す。
実施例１で構築したｈｕＡＮＰ３２Ａ、及びｈｕＡＮＰ３２Ｂ発現プラスミドであるＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２ＡとＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂは、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼとＤＫＯ細胞へコトランスフェクトし、具体的なトランスフェクト系は：１２ウェルプレートを例として、１ウェルあたりＨ１Ｎ１ＳＣ０９ ＰＢ１プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＢ２プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＡプラスミド（４０ ｎｇ）、ＮＰプラスミド（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃプラスミド（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（１０ ｎｇ）と、異なる用量のＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂ蛋白質とを加えて、ＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂ蛋白質プラスミドの具体的な用量は、それぞれ０ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、１００ｎｇ、５００ｎｇ、１ｕｇから選ばれた。これと共に、ＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇブランクベクターコントロールを設けて、ＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇブランクベクターでプラスミドの総量まで補足し、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。トランスフェクト後の２４ｈに細胞を溶解し、上に述べた工程に従ってポリメラーゼ活性を検定した。
結果から明らかな通り、ｈｕＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の補償は、ポリメラーゼの活性を用量依存的に回復でき、２０ｎｇになる時がプラットフォーム期に到達し、ポリメラーゼ活性が３０００倍左右に回復された。ｈｕＡＮＰ３２ＡとｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質は、同じ成り行きを有する活性曲線を持って、かつ、プラットフォーム期に両者が相加効果を有さなく。図８に示す。このため、ポリメラーゼ活性は、ｈｕＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂ蛋白質に用量依存的なものであり、また、その所要用量が低く。ｈｕＡＮＰ３２ＡとｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質が過剰した時に、かえってポリメラーゼ活性を抑えてしまい。結果は図９Ａに示す。実施例１で構築したｈｕＡＮＰ３２Ａ及びｈｕＡＮＰ３２Ｂ発現プラスミドは、上に述べた異なる用量でＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼと共にＤＫＯ細胞にトランスフェクトした場合、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９と似ている結果を得って、図９Ｂに示す。
実施例４：ＡＮＰ３２蛋白質によるインフルエンザウィルスＲＮＡ合成の影響の蛍光定量検定
野生型２９３Ｔ、二重ノックアウト細胞株ＤＫＯの中のインフルエンザウィルスのｃＲＮＡ、ｖＲＮＡとｍＲＮＡの合成の違いは、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲで検定した。まず、野生型２９３Ｔ、二重ノックアウト細胞株ＤＫＯ細胞を１２ウェルプレートに接種し、２９３Ｔ細胞へ実施例３のＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼビ蛍光報告システムをトランスフェクトした。そのトランスフェクト系は：ＰＢ１プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＢ２プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＡプラスミド（４０ ｎｇ）、ＮＰプラスミド（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃプラスミド（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（１０ ｎｇ）とブランクベクターＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇプラスミド（２０ｎｇ）である。ＤＫＯ細胞へ実施例３のＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼビ蛍光報告システムをトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＢ２プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＡプラスミド（４０ ｎｇ）、ＮＰプラスミド（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃプラスミド（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（１０ ｎｇ）とＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａプラスミド（２０ ｎｇ）であり、同時に、陰性対照としてブランクベクターＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇプラスミド（２０ｎｇ）を設けた。２４ｈ後、細胞全ＲＮＡをそれぞれ抽出して、特定プライマーで（表８に示す）逆転写し、それぞれｃＲＮＡ、ｖＲＮＡとｍＲＮＡの第一本のｃＤＮＡを合成し、その後特異性プライマーで（表９に示す）蛍光定量ＰＣＲを行った。内部標準遺伝子β−ａｃｔｉｎについて、逆転写プライマーが（キットからの）ランダムプライマーを用いて、β−ａｃｔｉｎの蛍光定量プライマーが実施例２の表４に示す。結果から明らかな通り、野生型と比べて、二重ノックアウト細胞株の中のウィルスｃＲＮＡ、ｖＲＮＡとｍＲＮＡの合成は、いずれも極めて著しく引き下げる（約３０−５０倍）。ＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂの欠失した細胞株において、インフルエンザウィルスＲＮＡがほとんど複製できないことがわかった。二重ノックアウト細胞株に対してヒトＡＮＰ３２Ａを補償する場合に、ＲＮＡの複製、合成の両方は回復され、図１０に示す。ｈｕＡＮＰ３２Ａプラスミドに代えてｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミドを用いて、上に述べた実験過程を繰り返した場合は、ヒトのＡＮＰ３２Ｂも同様な機能（データは、図１０のＤＫＯ＋ｈｕＡＮＰ３２Ａに似ている）を持つことは見出した。これは、ＡＮＰ３２Ａ、ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質はインフルエンザウィルスＲＮＡの合成と複製に関与して、しかも決定的な役割を果たすことを証明した。
Figure 2021509818
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実施例５：ＡＮＰ３２蛋白質によるインフルエンザウィルスの複製への影響
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、実施例１で構築した異なる物種のＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂ蛋白質プラスミドがＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムの６つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＢ２プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＡプラスミド（４０ ｎｇ）、ＮＰプラスミド（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃプラスミド（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２Ａ又はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）であり、同時に、陰性対照としてブランクベクターＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇ（２０ｎｇ）を設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、実施例３のように細胞を溶解してポリメラーゼ活性を検出したところ、結果から、ブランクベクターと比べて、鳥由来ＡＮＰ３２Ａ例えばｃｈＡＮＰ３２Ａ、ｄｋＡＮＰ３２Ａ、ｚｆＡＮＰ３２Ａ、ｔｙＡＮＰ３２Ａ、哺乳動物ＡＮＰ３２例えばｈｕＡＮＰ３２Ａ、ｐｇＡＮＰ３２Ａ、ｅｑＡＮＰ３２Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂは、いずれもＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性をサポートできるが、ｃｈＡＮＰ３２ＢとｍｕＡＮＰ３２Ａの２つの蛋白質はＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないことは分かる。結果は図１１の図Ａに示す。
Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムに代えてＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ報告システムで上に述べた実験を再現したところ、結果から、ブランクベクターと比べて、鳥由来ＡＮＰ３２Ａ例えばｃｈＡＮＰ３２Ａ、ｄｋＡＮＰ３２Ａ、ｚｆＡＮＰ３２Ａ、ｔｙＡＮＰ３２Ａ、哺乳動物ＡＮＰ３２例えばｈｕＡＮＰ３２Ａ、ｐｇＡＮＰ３２Ａ、ｅｑＡＮＰ３２Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂは、いずれもＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性をサポートできるが、ｃｈＡＮＰ３２ＢとｍｕＡＮＰ３２Ａの2つの蛋白質は、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないことは分かる。結果は図１１の図Ｂに示す。
Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムに代えてＨ３Ｎ２ＧＤ１１ポリメラーゼ報告システムで上に述べた実験を再現したところ、結果から、ブランクベクターと比べて、鳥由来ＡＮＰ３２Ａ例えばｃｈＡＮＰ３２Ａ、ｄｋＡＮＰ３２Ａ、ｚｆＡＮＰ３２Ａ、ｔｙＡＮＰ３２Ａ、哺乳動物ＡＮＰ３２例えばｈｕＡＮＰ３２Ａ、ｐｇＡＮＰ３２Ａ、ｅｑＡＮＰ３２Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂは、いずれもＨ３Ｎ２ＧＤ１１ポリメラーゼ活性をサポートできるが、ｃｈＡＮＰ３２ＢとｍｕＡＮＰ３２Ａの2つの蛋白質はＨ３Ｎ２ＧＤ１１ポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないことは分かる。結果は図１１の図Ｃに示す。
Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムに代えてＨ３Ｎ８ＸＪ０７ポリメラーゼ報告システムで上に述べた実験を再現したところ、結果から、ブランクベクターと比べて、鳥由来ＡＮＰ３２Ａ例えばｃｈＡＮＰ３２Ａ、ｄｋＡＮＰ３２Ａ、ｚｆＡＮＰ３２Ａ、ｔｙＡＮＰ３２Ａ、哺乳動物ＡＮＰ３２例えばｈｕＡＮＰ３２Ａ、ｐｇＡＮＰ３２Ａ、ｅｑＡＮＰ３２Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂは、いずれもＨ３Ｎ８ＸＪ０７ポリメラーゼ活性をサポートできるが、ｃｈＡＮＰ３２ＢとｍｕＡＮＰ３２Ａの2つの蛋白質はＨ３Ｎ８ＸＪ０７ポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないことは分かる。結果は図１１の図Ｄに示す。
Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムに代えてＨ３Ｎ８ＪＬ８９ポリメラーゼ報告システムで上に述べた実験を再現したところ、結果から、ブランクベクターと比べて、鳥由来ＡＮＰ３２Ａ例えばｃｈＡＮＰ３２Ａ、ｄｋＡＮＰ３２Ａ、ｚｆＡＮＰ３２Ａ、ｔｙＡＮＰ３２Ａは、Ｈ３Ｎ８ＪＬ８９ポリメラーゼ活性をサポートできるが、ｃｈＡＮＰ３２Ｂと哺乳動物ＡＮＰ３２例えばｈｕＡＮＰ３２Ａ、ｐｇＡＮＰ３２Ａ、ｅｑＡＮＰ３２Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ、ｍｕＡＮＰ３２Ａは、いずれもＨ３Ｎ８ＪＬ８９ポリメラーゼ活性をサポートしないことは分かる。結果は図１１の図Ｅに示す。
Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムに代えてＨ９Ｎ２ＺＪ１２ポリメラーゼ報告システムで上に述べた実験を再現したところ、結果から、ブランクベクターと比べて、鳥由来ＡＮＰ３２Ａ例えばｃｈＡＮＰ３２Ａ、ｄｋＡＮＰ３２Ａ、ｚｆＡＮＰ３２Ａ、ｔｙＡＮＰ３２ＡはＨ９Ｎ２ＺＪ１２ポリメラーゼ活性をサポートできるが、ｃｈＡＮＰ３２Ｂと哺乳動物ＡＮＰ３２例えばｈｕＡＮＰ３２Ａ、ｅｑＡＮＰ３２Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ、ｍｕＡＮＰ３２Ａは、いずれもＨ９Ｎ２ＺＪ１２ポリメラーゼ活性をサポートしなくて、ｐｇＡＮＰ３２ＡはＨ９Ｎ２ＺＪ１２ポリメラーゼ活性をほぼサポートしないことは分かる。結果は図１１の図Ｆに示す。
Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムに代えてＷＳＮポリメラーゼ報告システムで上に述べた実験を再現したところ、結果から、ブランクベクターと比べて、鳥由来ＡＮＰ３２Ａ例えばｃｈＡＮＰ３２Ａ、ｄｋＡＮＰ３２Ａ、ｚｆＡＮＰ３２Ａ、ｔｙＡＮＰ３２Ａ、哺乳動物ＡＮＰ３２例えばｈｕＡＮＰ３２Ａ、ｐｇＡＮＰ３２Ａ、ｅｑＡＮＰ３２Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂは、いずれもＷＳＮポリメラーゼ活性をサポートできるが、ｃｈＡＮＰ３２ＢとｍｕＡＮＰ３２Ａの2つの蛋白質はＷＳＮポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないことは分かる。結果は図１１の図Ｇに示す。
実施例６：Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９インフルエンザウィルスで細胞株へのトランスフェクション
インフルエンザウィルスの逆向き遺伝システムで、ＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂ蛋白質がウィルスの複製への影響について、さらに調査した。インフルエンザＨ１Ｎ１ＳＣ０９の８つの遺伝子断片（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、ＭとＮＳ）は、それぞれ、ビプロモーターを持つｐＢＤベクターに挿入した（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｐｔ．２００５，ｐ１２０５８−１２０６４，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｕｃｋ Ｈ５Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｃｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ａ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ；「Ａ型Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスＡ／Ｓｉｃｈｕａｎ／０１／２００９株逆向き遺伝ハンドリングシステムの樹立」、張乾義ら、チャイニーズ獣医科学、２０１１、４１（０５）：４４８−４５２）。
ｐＢＤベクターの構築工程は以下である：ｐＣＩベクター（ｐｒｏｍｅｇａ会社から購入、製品番号 Ｅ１８４１、ＧｅｎＢａｎｋ番号は Ｕ４７１２０）を骨格として、ＸｂａＩ酵素消化サイト内にＰｏｌ−ＨＤＶＲ発現カセットを逆向きに挿入した。Ｐｏｌ−ＨＤＶＲ発現カセット配列は人工合成したものであり、その配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６である。即ち、ｐＣＩベクターがＸｂａＩ制限酵素（ＮＥＢ、製品番号Ｒ０１４５Ｓ）にて酵素消化した後、ジェル回収キット（ＯＭＥＧＡ、製品番号Ｄ２５００−０１）を用いて線形化ベクターを回収し、デホスホリラーゼＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ会社から購入、製品番号 Ｄ２２５０）で明細書に従って処理した後、回収して備用した。人工合成したＰｏｌ−ＨＤＶＲ発現カセットと、ｐＣＩベクターを酵素消化した断片は、いずれも左、右アームにおいて１５ｂｐのホモログアームを有した。その後、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖａｚｙｍｅから購入、製品番号 Ｃ１１２−０１）シームレスなクローニングキットで、明細書に従ってＰｏｌ−ＨＤＶＲ発現カセット断片とｐＣＩ 線形化ベクターとを室温で３０ｍｉｎ連接し、２０ｕｌ前記連接産物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスした。シークエンサーで正しいと確認したプラスミドは、即、ｐＢＤ双方向発現ベクターである。
張乾義ら、「Ａ型Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスＡ／Ｓｉｃｈｕａｎ／０１／２００９株逆向き遺伝ハンドリングシステムした樹立」、チャイニーズ獣医科学、２０１１、４１（０５）：４４８−４５２、張乾義修士論文「「Ａ型Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスＡ／Ｓｉｃｈｕａｎ／０１／２００９株逆向き遺伝ハンドリングシステムした樹立」、甘粛農業大学、２０１１年に記載した方法に従って、次のようにしてＨ１Ｎ１ＳＣ０９ ｐＢＤ ８プラスミドシステムを構築した。
ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔの作業手順書に従ってＨ１Ｎ１ＳＣ０９ウイルス株のｍＲＮＡを抽出して、インビトロゲンＭ−ＭＬＶキット明細書に従ってＵｎｉ１２（ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ、ＳＥＱ Ｄ ＮＯ：２１）を逆転写プライマーとしてｃＤＮＡを合成した。各遺伝子の断片配列情報によって（ＰＢ２の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、ＰＢ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、ＰＡの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、ＮＰの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、ＨＡの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、ＮＡの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、Ｍの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３、ＮＳの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４である）、ＰＣＲプライマーをデザインし（表１０に示す）、両端にそれぞれ１５ｂｐ ｐＢＤホモログアームを導入し、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ高効ポリメラーゼで目的遺伝子及び線形化ｐＢＤベクターを増幅した。その後ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖａｚｙｍｅから購入、製品番号Ｃ１１２−０１）シームレスなクローニングキットで、明細書に従ってＨ１Ｎ１ＳＣ０９の各遺伝子増幅断片とｐＢＤ線形化ベクターとを室温で３０ｍｉｎ連接し、２０ｕｌ前記連接産物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスした。シークエンサーで正しいと確認したプラスミドは、それぞれｐＢＤ−Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９−ＰＢ２プラスミド、ｐＢＤ−Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９−ＰＢ１プラスミド、ｐＢＤ−Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９−ＰＡプラスミド、ｐＢＤ−Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９−ＮＰプラスミド、ｐＢＤ−Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９−ＨＡプラスミド、ｐＢＤ−Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９−ＮＡプラスミド、ｐＢＤ−Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９−Ｍプラスミド、ｐＢＤ−Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９−ＮＳプラスミドは、と命名されて、後続の実験に用いる。
Figure 2021509818
実施例２で構築した細胞株ＡＫＯ、ＢＫＯ、ＤＫＯ並びに野生型２９３Ｔ細胞株は、それぞれカウントして４ｘ１０５／ウェルで６ウェルプレートに接種した。３７℃でインキュベータインで２０ｈ培養後、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ ｐＢＤ ８つのプラスミドシステムを、プラスミド毎に０．５ ｕｇで野生型２９３Ｔ及びノックアウト細胞株へトランスフェクトした。トランスフェクトした後、それぞれ、０ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈで細胞上清を収集し、ＮＰサンドイッチＥＬＩＳＡ法でイウィルス収量を測定した。９６穴ＥＬＩＳＡプレートは、まず１ｕｇ／ウェルでＮＰモノクローナル抗体２Ｂ８Ａ１１（王圧嫌、温坤、丘立文ら、Ａ型インフルエンザウィルス核衣亮蛋白質ＥＬＩＳＡ捕捉法の樹立と臨床応用、２００９、広東医学．３０（５）：７０３−７０５）でコートし、４℃でオーバーナイト。１ｘＰＢＳＴ洗浄液で３回洗浄し、洗浄毎にロータリーシェーカーで５分間振盪した。洗浄した後プレートをクリーンまで叩いて、ブロッキング液として５％仔牛血清を加え、３７℃で２ｈブロッキングした。もう一度、プレートは１ｘＰＢＳＴ洗浄液で３回洗浄し、洗浄毎にロータリーシェーカーで５分間振盪した。洗浄した後プレートをクリーンまで叩いて、被検サンプルを加えた。被検サンプルには、サンプル希釈液が１０％ウシ胎仔血清＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００であり、ＮＰ蛋白質については、（ＮＰ蛋白質構築プラスミドｐＥＴ３０ａ−ＮＰは、修士論文：姫媛媛．ウマのインフルエンザウィルスの抗原捕集ＥＬＩＳＡテスト方法の樹立及びその初歩応用［Ｄ］．中国農業科学院，２０１１）由来のものを標品として２倍の倍数比例で希釈され、収集した細胞上清については、５倍の倍数比例で希釈された。サンプル毎に３つのグラジェント、２つ重複ウェルを設けた。３７℃で２ｈ培養し、１ｘＰＢＳＴ洗浄液で３回５分間洗浄し、洗浄した後プレートをクリーンまで叩いて、１ｕｇ／ウェルでＮＰモノクローナル抗体Ｃ１６Ａ１５株（王圧嫌、温坤、丘立文ら、Ａ型インフルエンザウィルス核カプシド蛋白質ＥＬＩＳＡ捕集法の樹立と臨床応用、２００９、広東医学．３０（５）：７０３−７０５）を加えて、３７℃で１ｈ培養し、捨てて、１ｘＰＢＳＴ洗浄液で５回洗浄し、洗浄毎にロータリーシェーカーで５分間振盪した。洗浄完了後、１：１で混合したＡＢ発色液（北京泰天河バイオテクノロジー会社から購入、製品番号 ＭＥ１４２）を１００ｕｌ／ウェルで加えて、１０ｍｉｎ発色した。５０ｕｌ／ウェル２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて停止させ、ｂｉｏｔｅｃｈ Ｅｘｌ５０マイクロプレートリーダーにてＯＤ４５０ｎｍで検出した。ＮＰ蛋白質標品で検量線を作成して被検サンプルの濃度を算出した。結果から明らかな通り、２９３Ｔ細胞と比べて、トランスフェクトしたＡＫＯ／ＢＫＯ細胞の上清において、ウィルス含有率は似ている成長曲線を有するが、ＤＫＯ細胞の上清においては、ウィルス粒子がほとんど検出されなかった。ＤＫＯ細胞はもうウィルスの複製及び成長をサポートできないと説明した。結果は図１２の図Ａに示す。ＡＮＰ３２Ａ又はＡＮＰ３２Ｂの単独ノックアウトは、ウィルスの複製及び成長を害しないと説明した。
実施例２で構築したＤＫＯ細胞株をカウントし、３ｘ１０５／ウェルで６ウェルプレートに接種した。３７℃でインキュベータインで２０ｈ培養した後、トランスフェクトウェルは以下のように設けられ：１ｕｇブランクベクターＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇ、１ｕｇ ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａ、１ｕｇ ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ、０．５ ｕｇＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａ＋０．５ ｕｇＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ。２４ｈトランスフェクトした後、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ ｐＢＤ ８プラスミドシステムにて、プラスミド毎に０．５ ｕｇで異なる処理グループの細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした後、それぞれ０ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈで細胞上清を収集し、ＮＰサンドイッチＥＬＩＳＡ法でウィルス収量を測定した。具体的工程は上記工程を参照する。結果から明らかな通り、ブランクベクターＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇと比べて、ｈｕＡＮＰ３２Ａの補償する、ｈｕＡＮＰ３２Ｂの補償する、及びｈｕＡＮＰ３２ＡとｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質両者を同時に補償することは、いずれもウィルスの複製を良くサポートできる。結果は図１２の図Ｂに示す。以上説明したように、ｈｕＡＮＰ３２Ａ又はｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質は、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９の複製には不可欠な存在である。
実施例７：Ｈ１Ｎ１／ＷＳＮインフルエンザウィルスの感染実験
実施例２で構築した細胞株ＡＫＯ、ＢＫＯ、ＤＫＯ並びに野生型２９３Ｔ細胞株は、それぞれカウントして４ｘ１０５／ウェルで６ウェルプレートに接種した。３７℃でインキュベータインで２０ｈ培養した後、０．０１ ＭＯＩのＷＳＮウィルス（Ｎｅｕｍａｎｎ Ｇ；ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｅｎｔｉｒｅｌｙ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡｓ．［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１９９９，９６（１６）：９３４５−５０）で細胞を感染した。ウィルスで２ｈ吸着した後、ウィルス感染液を吸い捨てて、１ｘＰＢＳバッファーで二回洗浄し、その後、１ウェルあたりに１％トリプシン（ｓｉｇｍａ）＋１％ダイアボディ（ｇｉｂｃｏ会社）＋０．５％ウシ胎仔血清（ｓｉｇｍａ）を含む細胞維持液２ｍｌを加えて、感染後の０ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈでそれぞれ細胞感染上清を取って、−８０℃に冷凍して備用した。ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎細胞株、Ｃｈｉｎａ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入）は、１．５ ｘ１０４／ウェルで９６穴プレートに播種し、前記得られる上清は培養液ＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で１０倍の倍数比例で希釈し、１００ｕｌ／ウェルで９６穴プレートに接種し、グラジェント毎に８つの重複を設けた。ウィルスで２ｈ吸着した後、ウィルス液を捨てて、１ｘＰＢＳバッファーで二回洗浄し、その後１ウェルあたりに２％ウシ胎仔血清（ｓｉｇｍａ会社）＋１％ダイアボディ（ｇｉｂｃｏ会社）＋１％トリプシン（ｓｉｇｍａ）を含む細胞維持液１００ｕｌを加えて、４８ｈ後細胞の病変を観察してカウントした。Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法に従って異なる処理グループが異な時刻のウィルスＴＣＩＤ５０を算出した。最後、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５ソフトでウィルス成長曲線を作成した。結果から明らかな通り、ＡＫＯ、ＢＫＯ細胞でのウィルス成長曲線は、野生型２９３Ｔ細胞と一致したが、ＤＫＯ細胞はウィルスの成長をほとんどサポートしていない。図１３Ａに示す。
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は、４ｘ１０５／ウェルで６ウェルプレートに接種した。２０ｈ後、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａプラスミド（１ｕｇ）、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミド（１ｕｇ）、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａ＋ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ（０．５ ｕｇ＋０．５ ｕｇ）、ＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇブランクベクター（１ｕｇ）の四つのトランスフェクトグループを設けた。２４ｈトランスフェクトした後、０．０１ ＭＯＩのＷＳＮウィルス量で異なる処理グループの細胞に感染し、ウィルスで２ｈ吸着した後、ウィルス感染液を吸い捨てて、１ｘＰＢＳバッファーで二回洗浄し、その後、１ウェルあたりに１％トリプシン（ｓｉｇｍａ）＋１％ダイアボディ（ｇｉｂｃｏ会社）＋０．５％ウシ胎仔血清（ｓｉｇｍａ）を含む細胞維持液２ｍｌを加えて、それぞれ、感染後の０ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈで細胞感染上清を取って、−８０℃に冷凍して備用した。ＭＤＣＫ細胞は１．５ ｘ１０４／ウェルで９６穴プレートに播種し、前記得られる上清を１０倍の倍数比例で希釈し、１００ｕｌ／ウェルで９６穴プレートに接種し、グラジェント毎に８つの重複を設けた。ウィルスで２ｈ吸着した後、ウィルス液を捨てて、１ｘＰＢＳバッファーで二回洗浄し、その後、細胞維持液を加えて、４８ｈ後細胞の病変を観察してカウントした。Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法に従って、異なる処理グループが異な時刻のウィルスＴＣＩＤ５０を算出した。最後、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５ソフトでウィルス成長曲線を作成した。結果から明らかな通り、ブランクベクターと比べて、ｈｕＡＮＰ３２Ａ又はｈｕＡＮＰ３２Ｂの単独補償は、いずれもウィルスのＤＫＯ細胞中の成長を回復させることができ、ｈｕＡＮＰ３２ＡとｈｕＡＮＰ３２Ｂの二重補償によるウィルス成長曲線と一致した。結果は図１３Ｂに示す。
ｈｕＡＮＰ３２Ａ又はｈｕＡＮＰ３２Ｂの単独ノックアウトは、ウィルスの複製及び成長を害しないで、ｈｕＡＮＰ３２ＡとｈｕＡＮＰ３２Ｂはインフルエンザウィルスの複製及び成長に対して機能代償役割を果たすことを説明した。
実施例８：ホモログウィルス又はヘテロウィルス変異後、ＡＮＰ３２ＡとＡＮＰ３２Ｂ蛋白質がポリメラーゼ複製に対する影響
Ｈ７Ｎ９亜型インフルエンザウィルスＰＢ２遺伝子の点変異ベクターの構築
ヒト由来Ｈ７Ｎ９単離株のＰＢ２遺伝子上の一部の鍵となるアミノ酸サイトを分析した。鳥由来の単離株と比べて、ヒト由来の単離株には、報告された宿主適性に係る若干の点変異、例えばＡ５８８Ｖ、Ｑ５９１Ｋ、Ｑ５９１Ｒ、Ｖ５９８Ｉ、Ｅ６２７Ｋ、Ｄ７０１Ｎ等を存在することを見出した。（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７，ＰＢ２ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ Ｖ５９８Ｔ／Ｉ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｈ７Ｎ９ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．５０１，９２−１０１．；Ｍｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ Ａ／Ｈ７Ｎ９ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｏｓｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．８８（６），３５６８−３５７６；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＰＢ２−５８８ Ｖ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ１０Ｎ８，Ｈ７Ｎ９ ａｎｄ Ｈ９Ｎ２ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．６，１９４７４．；Ｙａｍａｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＰＢ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈ７Ｎ９ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｏｓｔｓ［Ｊ］．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１５，５：８０３９．；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｔｈｅ ＰＢ２ Ｅ６２７Ｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ７Ｎ９ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９５（Ｐｔ ４），７７９−７８６．）、即ち、鳥由来のインフルエンザウイルス株には、Ａ５８８Ｖ、Ｑ５９１Ｋ、Ｑ５９１Ｒ、Ｖ５９８Ｉ、Ｅ６２７Ｋ又はＤ７０１Ｎ点変異を行った後、ウイルス株は人体に適応になる。
（１）ＰＢ２遺伝子の変異及びプラスミドの構築
本発明者らは、鳥由来Ｈ７Ｎ９インフルエンザＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｚｈｅｊｉａｎｇ／ＤＴＩＤ−ＺＪＵ０１／２０１３（Ｈ７Ｎ９ＺＪ１３）のＰＢ２について、前記６つの位置の単一点変異を行った。変異用プライマーは表１１に示す（下線部は変異した塩基）。鳥由来のＨ７Ｎ９（Ｈ７Ｎ９ＺＪ１３）ＰＢ２プラスミドを鋳型とし、ＫＯＤ−ＦＸ Ｎｅｏ高効ＤＮＡポリメラーゼで増幅した。得られたＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩで３７℃恒温水浴槽で３０分間消化し、その後、５ｕｌ消化産物を取って２０ｕｌ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスし、シークエンサーで正しいと確認したプラスミドを大量に抽出して備用した。ＰＢ２（Ａ５８８Ｖ）、ＰＢ２（Ｑ５９１Ｋ）、ＰＢ２（Ｑ５９１Ｒ）、ＰＢ２（Ｖ５９８Ｉ）、ＰＢ２（Ｅ６２７Ｋ）とＰＢ２（Ｄ７０１Ｎ）変異遺伝子をそれぞれ得た。
Figure 2021509818
（２）ｈｕＡＮＰ３２ＡとｈｕＡＮＰ３２Ｂによるポリメラーゼ複製への影響
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、実施例１で構築したＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ａ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａ、ｐＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミド並びにブランクベクターＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇは、それぞれＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ報告システムプラスミドとをコトランスフェクトし、トランスフェクト系は：ＰＢ１プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＢ２プラスミド（８０ ｎｇ、即ち、それぞれ、ＰＢ２（Ａ５８８Ｖ）、ＰＢ２（Ｑ５９１Ｋ）、ＰＢ２（Ｑ５９１Ｒ）、ＰＢ２（Ｖ５９８Ｉ）、ＰＢ２（Ｅ６２７Ｋ）とＰＢ２（Ｄ７０１Ｎを用いて））、ＰＡプラスミド（４０ ｎｇ）、ＮＰプラスミド（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃプラスミド（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）であり、同時に陰性対照としてブランクベクターＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇ（２０ｎｇ）を設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定した。結果から、ブランクベクターと比べて、ｃｈＡＮＰ３２Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ａ及びｈｕＡＮＰ３２Ｂは、いずれも効果的にＡ５８８Ｖ、Ｑ５９１Ｋ、Ｑ５９１Ｒ、Ｖ５９８Ｉ、Ｄ７０１Ｎ、Ｅ６２７Ｋの点変異を持つポリメラーゼの活性を促進でき、ｈｕＡＮＰ３２ＡとｈｕＡＮＰ３２Ｂが欠失した場合は、これらの点変異がいずれもポリメラーゼに２９３Ｔにおいて複製する能力を付与できないことは分かる。これら結果から、ヒト由来インフルエンザウイルス株又は鳥由来インフルエンザウイルス株が変異することで人体に適応した変異ウイルス株の人体内の複製については、ｈｕＡＮＰ３２Ａ又はｈｕＡＮＰ３２ＢはいずれもＨ７Ｎ９ポリメラーゼの２９３Ｔ中の複製能の先決条件であることがわかった。結果は図１４に示す。
実施例９：ＡＮＰ３２蛋白質の機能ドメインの同定
実施例５の結果によって、ｃｈＡＮＰ３２Ｂ蛋白質はポリメラーゼ活性をサポートしないと示された。
ｃｈＡＮＰ３２Ｂ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ、ｐｇＡＮＰ３２Ｂの蛋白質配列アラインメントで、ＡＮＰ３２Ｂの配列には異いがある（図１５Ａ）ことを見出した。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースで開示したｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の機能ドメインによっては：１−４１ａａはＬＲＲ１領域、４２−１１０ａａはＬＲＲ２、３＆４領域、１１１−１６１ａａはＬＲＲＣＴ領域、１６２−２５１ａａはＬＣＡＲ領域である。ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の機能ドメインによって、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ遺伝子断片とｃｈＡＮＰ３２Ｂ遺伝子断片の取り替えを行った。その遺伝子断片の取り替えストラテジーは、図１５Ｂに示す。
まず、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ遺伝子配列を１−１６１ａａと１６２−２６２ａａの2つの断片に分けて、相同組換えＰＣＲ方法で、プライマーをデザインして対応する断片をｃｈＡＮＰ３２Ｂ断片に付け替えて、組み換えプラスミドを構築した。
例えば、１−１６１ａａ断片の取り替えは、まず、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、ＫＯＤ−ＦＸ Ｎｅｏ高効ＤＮＡポリメラーゼで１−１６１ａａ遺伝子断片が欠失したＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ△１−１６１遺伝子（プライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６）を増幅した。その後、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ（１−１６１）断片（プライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８）を増幅した。ｈｕＡＮＰ３２Ｂ（１−１６１）断片の増幅プライマーの両端は、それぞれＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ△１−１６１遺伝子の左右アームと同様の１５ｂｐ塩基を含む。断片の増幅が完了した後、回収してＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎリガーゼ（クロンテック会社から購入）で、明細書に従って2つの断片を連接して、ＤＨ５αコンピテント細胞へ形質転換された。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスし、シークエンサーで正しいと確認したプラスミドはｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１６２−２６２）と命名され、大量に抽出して備用した。プライマーは表１２に示す。
上に述べた方法に従って、ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１−１６１）組み換えプラスミドを構築した。まず、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、ＫＯＤ−ＦＸ Ｎｅｏ高効ＤＮＡポリメラーゼ（製品番号：ＫＦＸ−２０１、東洋紡から購入）で１６２−２６２ａａ遺伝子断片が欠失したＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ△１６２−２６２遺伝子（プライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）を増幅した。その後でＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ（１６２−２６２）断片（プライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２）を増幅し、増幅ｈｕＡＮＰ３２Ｂ（１６２−２６２）断片のプライマー両端は、それぞれとＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ△１６２−２６２遺伝子の左右アームと同様の１５ｂｐ塩基を含む。断片の増幅が完了した後、回収してＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎリガーゼ（クロンテック会社から購入）で、明細書に従って2つの断片を連接して、ＤＨ５αコンピテント細胞へ形質転換された。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスし、シークエンサーで正しいと確認したプラスミドはｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１−１６１）と命名され、大量に抽出して備用した。プライマーは表１２に示す。
Figure 2021509818
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１−１６１）とＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１６２−２６２）プラスミドは、それぞれＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムとＤＫＯ細胞株へコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＢ２プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＡプラスミド（４０ ｎｇ）、ＮＰプラスミド（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃプラスミド（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）を含み、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定し。結果は図１５Ｃに参考し：ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１−１６１）はＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力を失ったが、ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１６２−２６２）は依然としてＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力を保留した。したがって、ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のポリメラーゼ活性のサポートする鍵となる領域は、１−１６１ａａ内に位置する。
上記のようにして相同組換えＰＣＲを行って、ｈｕＡＮＰ３２Ｂを骨格として、ｃｈＡＮＰ３２Ｂ １−１６１ａａをさらに１−４１ａａ、４２−１１０ａａ、１１１−１６１ａａの３つの領域に分け、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂに対応する断片にそれぞれ取り替えて、組み換えプラスミドＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１−４１）（ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、プライマー対ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４を用いてＰＣＡＧＧＳ−ｈｕ３２Ｂ△（１−４１）遺伝子断片を増幅しており、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６プライマー対を用いてｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１−４１）遺伝子断片を増幅した）、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（４２−１１０）（ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８プライマー対を用いてＰＣＡＧＧＳ−ｈｕ３２Ｂ△（４２−１１０）遺伝子断片を増幅しており、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０プライマー対を用いてｃｈＡＮＰ３２Ｂ（４２−１１０）遺伝子断片を増幅した）と、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１１１−１６１）（ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２プライマー対を用いてＰＣＡＧＧＳ−ｈｕ３２Ｂ△（１１１−１６１）遺伝子断片を増幅しており、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４プライマー対を用いてｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１１１−１６１）遺伝子断片を増幅した）を構築した。プライマーは表１３に示す。
Figure 2021509818
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は、３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１−４１）、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（４２−１１０）とＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１１１−１６１）プラスミドを、それぞれＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムとＤＫＯ細胞株へコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＢ２プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＡプラスミド（４０ ｎｇ）、ＮＰプラスミド（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃプラスミド（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）を含み、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、実施例３のように細胞を溶解してポリメラーゼ活性を検定し。結果は図１５Ｄに参考：ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１１１−１６１）組み換えプラスミドはＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力を失ったが、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（１−４１）とＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（４２−１１０）組み換えプラスミドは依然としてＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力を保留した。
上記のようにして相同組換えＰＣＲを行って、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂの対応する１１１−１６１ａａ配列は、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂの対応する断片に取り替えて（ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６プライマー対を用いてＰＣＡＧＧＳ−ｃｈ３２Ｂ△（１１１−１６１）遺伝子断片を増幅しており、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、プライマー対ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８を用いて、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ（１１１−１６２）遺伝子断片を増幅した）、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（ｈｕ１１１−１６１）組み換えプラスミドを構築した。プライマーは表１４に示す。上に述べた系従って、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムとＤＫＯ細胞株へコトランスフェクトし、実施例３のようにポリメラーゼ活性を検定した。結果は図１５Ｄ（ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（ｈｕ１１１−１６１）一欄）に示す。結果から、ｃｈＡＮＰ３２Ｂ（ｈｕ１１１−１６１）はＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力を得たことがわかって、これはさらにＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のポリメラーゼ活性のサポートする鍵となる領域は１１１−１６１ａａ内に位置する。
Figure 2021509818
さらに鍵となる領域を同定するため、ｃｈＡＮＰ３２Ｂ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ、ｐｇＡＮＰ３２Ｂの蛋白質配列をアラインメントし、ｈｕＡＮＰ３２ＢとｐｇＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の１１１−１６１ａａ領域内のアミノ酸は相対的に保存的であり、ｃｈＡＮＰ３２Ｂと両者の間は主として８つのアミノ酸の差異があった（それぞれは、位置１１３、１１６、１２７、１２９、１３０、１３７、１５０と１６０）を見出し，図１６Ａに参照する。ｈｕＡＮＰ３２Ｂ配列の中の８つのアミノ酸について変異用プライマー（プライマーは、表１５参照、下線部は変異塩基である）をデザインし、前述したように相同組換え方法を用いて、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏポリメラーゼで、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、それぞれｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｅ１１３Ｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０のプライマー対で）、Ｋ１１６Ｈ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２のプライマー対で）、Ｎ１２７Ｍ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４のプライマー対で）、Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６のプライマー対で）、Ｋ１３７Ｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８のプライマー対で）、Ｒ１５０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０のプライマー対で）、Ａ１６０Ｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２のプライマー対で）点変異体を構築し、それぞれＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｅ１１３Ｐ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｋ１１６Ｈ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２７Ｍ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｋ１３７Ｔ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｒ１５０Ａ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ａ１６０Ｐと命名され、シークエンサーで正しいと確認した後、後続トランスフェクションに用いる。
Figure 2021509818
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、ＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂ及びＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ点変異プラスミド、即ちＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｅ１１３Ｐ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｋ１１６Ｈ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２７Ｍ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｋ１３７Ｔ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｒ１５０Ａ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ａ１６０Ｐが、それぞれ、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムとＤＫＯ細胞株へコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＢ２プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＡプラスミド（４０ ｎｇ）、ＮＰプラスミド（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃプラスミド（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）を含み、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、実施例３のように細胞を溶解してポリメラーゼ活性を検定し、図１６Ｂを参照して、結果から、ｈｕＡＮＰ３２Ｂと比べて、ｃｈＡＮＰ３２ＢとｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎは完全にＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力がなくなるが、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｅ１１３Ｐ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｋ１１６Ｈ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２７Ｍ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｋ１３７Ｔ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｒ１５０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ａ１６０Ｐ点変異体は依然としてＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力を保留したことは分かる。
１２９／１３０の2つのサイトについて、単一点変異ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２９Ｉをデザインし（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６６のプライマー対で）（プライマーは表１６に示す、下線部は変異塩基である）、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、過程は本実施例のｈｕＡＮＰ３２Ｂ配列中の８つのアミノ酸について点変異に記載されたように。得られるプラスミドは、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２９Ｉ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｄ１３０Ｎと命名された。シークエンサーで正しいと確認した後、プラスミドは大量に抽出し、後続トランスフェクションに用いる。
Figure 2021509818
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、上に述べた系に基づいてトランスフェクトした。結果から、ｈｕＡＮＰ３２Ｂと比べて、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２９ＩはＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力がほとんどなくなったが、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｄ１３０ＮがＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力が５倍左右と下がることは分かる。１２９／１３０の2つのサイトは、ＡＮＰ３２蛋白質の活性に対してとても重要であることを証明した。結果は図１７に示す。
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、ＰＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇブランクベクター、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ及びＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ点変異プラスミドは、それぞれ、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ報告システムとＤＫＯ細胞株へコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＢ２プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＡプラスミド（４０ ｎｇ）、ＮＰプラスミド（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃプラスミド（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）を含み、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、実施例３のように細胞を溶解してポリメラーゼ活性を検定した。結果から、ｈｕＡＮＰ３２Ｂと比べて、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２９ＩとｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０ＮがＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｋ１１６Ｈ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２７Ｍ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｒ１５０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ａ１６０Ｐ点変異体は依然としてＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力を保留し、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｅ１１３Ｐ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｄ１３０Ｎ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｋ１３７ＴがＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が、約３−８倍と下がることは分かる。結果は図１８に示す。
ｈｕＡＮＰ３２Ｂ点変異スクリーニング結果により、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａプラスミドを鋳型とし、過程は本実施例においてｈｕＡＮＰ３２Ｂ配列中の８つのアミノ酸の点変異体の構築について記載されたように、オーバーラップＰＣＲでｈｕＡＮＰ３２Ａに対して、同様にＮ１２９Ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６８のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７０のプライマー対で）、ＮＤ１２９／１３０ＩＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２のプライマー対で）の点変異体の構築を行った（プライマーは表１７に示し、下線部は変異塩基である）。過程は前述した通り、得られるプラスミドは、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｎ及びＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎと命名された。シークエンサーで正しいと確認した後、プラスミドは大量に抽出し、後続トランスフェクションに用いる。
Figure 2021509818
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、上に述べた系に基づいてＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムとコトランスフェクトした。結果から、ｈｕＡＮＰ３２Ａと比べて、ｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０ＮはＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなっており、ｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９ＩはＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力がほとんど完全になくなったが、ｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０ＮはＨ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ活性のサポート能力が１００倍以上と下がることは分かる。結果は図１９に示す。
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、上に述べた系に基づいてＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ報告システムとコトランスフェクトした。結果から、ｈｕＡＮＰ３２Ａと比べて、ｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ、ｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｎ、ｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０ＮはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったことは分かる。結果は図２０に示す。
ｈｕＡＮＰ３２Ｂ点変異スクリーニング結果により、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ａプラスミドを鋳型とし、オーバーラップＰＣＲでｃｈＡＮＰ３２Ａに対してＮ１２９Ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７６のプライマー対で）、Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８のプライマー対で）の点変異を行った。これと共に、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ｂプラスミドを鋳型とし、ｃｈＡＮＰ３２Ｂに対してＩ１２９Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８０のプライマー対で）、Ｎ１３０Ｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２のプライマー対で）、Ｉ１２９Ｎ／Ｎ１３０Ｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４のプライマー対で）の点変異（プライマーは表１８に示す、下線部は変異塩基である）を行った。シークエンサーで正しいと確認した後、プラスミドは大量に抽出し、後続トランスフェクションに用いる。
Figure 2021509818
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、上に述べた系に基づいてＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ報告システムとコトランスフェクトした。結果から、ｃｈＡＮＰ３２Ａと比べて、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０ＮはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力をなくなっており、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９ＩはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が１００倍以上と下がっており、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０ＮはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が５倍左右と下がっており、ｃｈＡＮＰ３２Ｂと比べて、ｃｈＡＮＰ３２Ｂ Ｉ１２９Ｎ及びｃｈＡＮＰ３２Ｂ Ｉ１２９Ｎ／Ｎ１３０ＤはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力を有するが、ｃｈＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１３０ＤはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が依然として有さないことは分かる。結果は図２１に示す。
実施例１０．ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質１２９サイト変異体の構築
詳細には、点変異用プライマーは表１９に示す（下線部は変異塩基である）、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ａプラスミドを鋳型とし、ＫＯＤ−ＦＸ Ｎｅｏ高効ＤＮＡポリメラーゼで増幅し、ｃｈＡＮＰ３２ＡのＮ１２９Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６）、Ｎ１２９Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８）、Ｎ１２９Ｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０）、Ｎ１２９Ｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９２）、Ｎ１２９Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４）、Ｎ１２９Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６）、Ｎ１２９Ｈ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８）、Ｎ１２９Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２００）、Ｎ１２９Ｌ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２）、Ｎ１２９Ｍ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０４）、Ｎ１２９Ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４）、Ｎ１２９Ｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６）、Ｎ１２９Ｑ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８）、Ｎ１２９Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０）、Ｎ１２９Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２）、Ｎ１２９Ｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４）、Ｎ１２９Ｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６）、Ｎ１２９Ｗ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８）、Ｎ１２９Ｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０）点変異体を構築した。
得られたＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩで３７°恒温水浴槽で３０分間消化し、その後５ｕｌ消化産物を取って２０ｕｌ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスし、シークエンサーで正しいと確認したプラスミドは、後続トランスフェクション実験に付す。
Figure 2021509818
Figure 2021509818
実施例１１：ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質１２９サイト変異体によるインフルエンザウィルスＨ７Ｎ９ＺＪ１３の複製への影響
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、実施例１０で構築したｃｈＡＮＰ３２Ａ １２９サイト変異体が、それぞれＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ報告システムの６つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１（８０ ｎｇ）、ＰＢ２（８０ ｎｇ）、ＰＡ（４０ ｎｇ）、ＮＰ（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃ（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫ（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）であり、同時に、陰性対照としてブランクベクター（２０ｎｇ）、陽性対照としてｃｈＡＮＰ３２Ａ（２０ｎｇ）に設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定し、結果から、ｃｈＡＮＰ３２Ａと比べて、二重点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ、並びに単一点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｒ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｋ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｄ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９ＥはＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力を有さず、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｐ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｑ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９ＧはほとんどＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｌ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｆ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｍ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｓ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｔ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｃ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｙは、いずれもＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性をサポートでき、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｖ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｗ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９ＨはＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が約１００倍と下がることは分かる。結果は図２２に示す。
実施例１２：ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質１２９サイト変異体によるインフルエンザウィルスＨ７Ｎ９ＡＨ１３の複製への影響
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、実施例１０で構築したｃｈＡＮＰ３２Ａ １２９サイト変異体と、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ報告システムの６つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１（８０ ｎｇ）、ＰＢ２（８０ ｎｇ）、ＰＡ（４０ ｎｇ）、ＮＰ（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃ（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫ（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）であり、同時に、陰性対照としてブランクベクター（２０ｎｇ）、陽性対照としてｃｈＡＮＰ３２Ａ（２０ｎｇ）に設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定し、結果から、ｃｈＡＮＰ３２Ａと比べて、二重点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ並びに単一点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｐ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｒ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｋ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｑ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｄ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｅは、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力を有さず、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉは、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力をほとんど有さず、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｆ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｍ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｓ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｇ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｔ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｃ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｙは、いずれもＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性をサポートできるが、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｌ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９ＷＨ７Ｎ９は Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が下がる３−１０倍、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９ＶとｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９ＨはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が下がる約２０−１００倍ことは分かる。結果は図２３に示す。
実施例１３：ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質１２９サイト変異体によるインフルエンザウィルスＷＳＮの複製への影響
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、実施例１０で構築したｃｈＡＮＰ３２Ａ １２９サイト変異体と、ＷＳＮポリメラーゼ報告システムの６つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１（８０ ｎｇ）、ＰＢ２（８０ ｎｇ）、ＰＡ（４０ ｎｇ）、ＮＰ（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃ（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫ（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）であり、同時に、陰性対照としてブランクベクター（２０ｎｇ）、陽性対照としてｃｈＡＮＰ３２Ａ（２０ｎｇ）に設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定し、結果から、ｃｈＡＮＰ３２Ａと比べて、二重点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ並びに単一点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｋ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｄは、ＷＳＮポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないが、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｆ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｍ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｓ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｇ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｔ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｃは、いずれもＷＳＮポリメラーゼ活性をサポートでき、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｐ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｈ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｒ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｑ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９ＥはＷＳＮポリメラーゼ活性のサポート能力が約１００倍と下がており、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｌ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｗ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｙ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９ＶはＷＳＮポリメラーゼ活性のサポート能力が約５−２０倍と下がることは分かる。結果は図２４に示す。
実施例１４：ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質１３０サイト変異体の構築
点変異用プライマーは表２０に示す（下線部は変異塩基である）、ＫＯＤ−ＦＸ Ｎｅｏ高効ＤＮＡポリメラーゼで増幅し、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ａを鋳型とし、ｃｈＡＮＰ３２ＡのＤ１３０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｈ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｌ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｍ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７６のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｑ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｗ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５４のプライマー対で）、Ｄ１３０Ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５６のプライマー対で）点変異体を構築した。
得られたＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩで３７°恒温水浴槽で３０分間消化し、その後５ｕｌ消化産物を取って２０ｕｌ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスし、シークエンサーで正しいと確認したプラスミドは、後続トランスフェクション実験に付す。
Figure 2021509818
実施例１５：ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質１３０サイト変異体によるインフルエンザウィルスＨ７Ｎ９ＺＪ１３の複製への影響
実施例２で構築したＤＫＯ細胞は３ ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、実施例１４で構築したｃｈＡＮＰ３２Ａ １３０サイト変異体と、Ｈ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ報告システムの６つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１（８０ ｎｇ）、ＰＢ２（８０ ｎｇ）、ＰＡ（４０ ｎｇ）、ＮＰ（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃ（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫ（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）であり、同時に、陰性対照としてブランクベクター（２０ｎｇ）、陽性対照としてｃｈＡＮＰ３２Ａ（２０ｎｇ）に設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定し、結果から、ｃｈＡＮＰ３２Ａと比べて、二重点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ並びに単一点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｖ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｆ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｗ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｈ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｒ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｋ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０ＹはＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないが、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｇ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｃ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｅは、いずれもＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性をサポートでき、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｓ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｔはポリメラーゼ活性のサポート能力が約３倍と下がって、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｌ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｐ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｉ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｍ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｑ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０ＮはＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力がいずれも約１０−５０倍と下がることは分かる。結果は図２５に示す。
実施例１６：ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質１３０サイト変異体によるインフルエンザウィルスＨ７Ｎ９ＡＨ１３の複製への影響
実施例２で構築したＤＫＯ細胞は、３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、実施例１４で構築したｃｈＡＮＰ３２Ａ １３０サイト変異体Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ報告システム中の６つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１（８０ ｎｇ）、ＰＢ２（８０ ｎｇ）、ＰＡ（４０ ｎｇ）、ＮＰ（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃ（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫ（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）であり、同時に、陰性対照としてブランクベクター（２０ｎｇ）、陽性対照としてｃｈＡＮＰ３２Ａ（２０ｎｇ）に設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定し、結果から、ｃｈＡＮＰ３２Ａと比べて、二重点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ並びに単一点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｆ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０ＫはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないが、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｓ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｇ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｅは、いずれもＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性をサポートでき、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｖ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｒはポリメラーゼ活性のサポート能力が１００倍以上と下がって、ほとんどポリメラーゼ活性のサポート能力を有さず、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｌ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｐ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｉ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｍ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｗ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｈ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｑ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０ＹはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力がいずれも約１０−１００倍と下がって、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｔ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｃ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０ＮはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が約３−５倍と下がることは分かる。結果は図２６に示す。
実施例１７：ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質１３０サイト変異体によるインフルエンザウィルスＷＳＮの複製への影響
実施例２で構築したＤＫＯ細胞は、３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、実施例１４で構築したｃｈＡＮＰ３２Ａ １３０サイト変異体と、ＷＳＮポリメラーゼ報告システムの６つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１（８０ ｎｇ）、ＰＢ２（８０ ｎｇ）、ＰＡ（４０ ｎｇ）、ＮＰ（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃ（８０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫ（１０ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（２０ ｎｇ）であり、同時に、陰性対照としてブランクベクター（２０ｎｇ）、陽性対照としてｃｈＡＮＰ３２Ａ（２０ｎｇ）に設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定し、結果から、ｃｈＡＮＰ３２Ａと比べて、二重点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ並びに単一点変異体であるｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｆ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｒ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｋは、ＷＳＮポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないが、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｓ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｇ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｅは、いずれもＷＳＮポリメラーゼ活性をサポートでき、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｖ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｗ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｈ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｙはポリメラーゼ活性のサポート能力がほとんどを有さず、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｌ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｐ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｉ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｍ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｑ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０ＮはＷＳＮポリメラーゼ活性のサポート能力がいずれも約１０−５０倍と下がっており、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０Ｔ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１３０ＣはＷＳＮポリメラーゼ活性のサポート能力が約２−３倍と下がることは分かる。結果は図２７に示す。
実施例１８．ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の断片化変異ベクターの構築、及びポリメラーゼ活性のアッセイ
Figure 2021509818
Figure 2021509818
Figure 2021509818
ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質に対して、断片化変異を行って、前記断片化変異には、１０つのアミノ酸を一つのグループとし、統一的にアラニンに変異させ、点変異用プライマーは表２１に示す（下線部は変異塩基である）。例えば、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１−１０Ａ変異体とは、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の２番目から９番目のアミノ酸：ＤＭＫＲＲＩＨＬＥを、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡに変異させたものであり、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１１−２０Ａ変異体とは、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の１１番目から２０番目のアミノ酸：ＬＲＮＲＴＰＡＡＶＲをＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡに変異させたものであり、以下同様である。ＫＯＤ−ＦＸ高効ＤＮＡポリメラーゼで、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂを鋳型とし、それぞれ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１−１０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５８のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１１−２０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６０のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２１−３０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ３１−４０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６４のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ４１−５０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６６のプライマー対で）、
ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ５１−６０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６８のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ６１−７０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７０のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ７１−８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ８１−９０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ９１−１００Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１０１−１１０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７８のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１１１−１２０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８０のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１２１−１３０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１３１−１４０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１４１−１５０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１５１−１６０ｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８８のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１６１−１７０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９０のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１７１−１８０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９２のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１８１−１９０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９４のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１９１−２００Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９６のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２０１−２１０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９８のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２１１−２２０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２２１−２３０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０２のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２３１−２４０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０４のプライマー対で）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２４１−２５１Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０６のプライマー対で）断片化変異体を構築し、それぞれｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１−１０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１１−２０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２１−３０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ３１−４０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ４１−５０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ５１−６０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ６１−７０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ７１−８０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ８１−９０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ９１−１００Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１０１−１１０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１１１−１２０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１２１−１３０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１３１−１４０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１４１−１５０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１５１−１６０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１６１−１７０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１７１−１８０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１８１−１９０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１９１−２００Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２０１−２１０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２１１−２２０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２２１−２３０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２３１−２４０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２４１−２５１Ａと命名された。
得られたＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩで３７°恒温水浴槽で３０分間消化し、その後２．５ ｕｌ消化産物を取って２０ｕｌ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスし、シークエンサーで正しいと確認したプラスミドは、後続トランスフェクション実験に付す。
実施例１９．ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の断片化変異体によるインフルエンザウィルスＨ７Ｎ９ＡＨ１３の複製への影響
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は、１ｘ１０＾５／ウェルで２４ウェルプレートに接種し、２０ｈ後、実施例１８で構築したｈｕＡＮＰ３２Ｂ断片化変異体と、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ報告システム中の６つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１（４０ｎｇ）、ＰＢ２（４０ ｎｇ）、ＰＡ（２０ ｎｇ）、ＮＰ（８０ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃ（４０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫ（５ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（１０ ｎｇ）であり、同時に陰性対照としてブランクベクター（１０ｎｇ）、陽性対照としてｈｕＡＮＰ３２Ｂ（１０ｎｇ）に設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定し、結果から、ｈｕＡＮＰ３２Ｂと比べて、断片化変異体であるｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ５１−６０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ６１−７０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ７１−８０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ８１−９０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ９１−１００Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１０１−１１０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１１１−１２０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１２１−１３０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１３１−１４０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１４１−１５０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１５１−１６０ＡはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないが、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１−１０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１１−２０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２１−３０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ３１−４０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１７１−１８０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１８１−１９０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１９１−２００Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２０１−２１０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２１１−２２０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２２１−２３０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２３１−２４０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ２４１−２５１Ａは、いずれもＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力を有しており、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ４１−５０Ａ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｂ１６１−１７０ＡはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が約２００倍と下がることは分かる。結果は図２８に示す。
実施例２０．ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質の断片化変異ベクターの構築及びポリメラーゼ活性のアッセイ
Figure 2021509818
Figure 2021509818
Figure 2021509818
ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質に対して、断片化変異を行って、前記断片化変異には、１０つのアミノ酸を一つのグループとし、統一的にアラニンに変異させ、点変異用プライマーは表２２に示す（下線部は変異塩基である）。例えば、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １−１０Ａ変異体は、即ちｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質の２番目から９番目のアミノ酸：ＤＭＫＫＲＩＨＬＥをＡＡＡＡＡＡＡＡＡに変異させたものであり、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １１−２０Ａ変異体は、即ちｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１１番目から２０番目のアミノ酸：ＬＲＮＲＴＰＳＤＶＫをＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡに変異させたものであり、以下同様である。ＫＯＤ−ＦＸ高効ＤＮＡポリメラーゼで、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ａを鋳型とし、それぞれ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １−１０ ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １１−２０ ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１０のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２１−３０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ３１−４０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ４１−５０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ５１−６０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ６１−７０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２０のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ７１−８０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２２のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ８１−９０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ９１−１００ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２６のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １０１−１１０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２８のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １１１−１２０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １２１−１３０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３２のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １３１−１４０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３４のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １４１−１５０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３６のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １５１−１６０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３８のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １６１−１７０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４０のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １７１−１８０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４２のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １８１−１９０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４４のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １９１−２００ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４６のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２０１−２１０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４８のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２１１−２２０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５０のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２２１−２３０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５２のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２３１−２４０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５４のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２４１−２５０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５６のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２５１−２６０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５８のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２６１−２７０ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６０のプライマー対で）、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２７１−２８１ｍｕｔＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６２）を構築して断片化変異を行って、それぞれ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １−１０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １１−２０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２１−３０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ３１−４０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ４１−５０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ５１−６０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ６１−７０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ７１−８０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ８１−９０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ９１−１００ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １０１−１１０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １１１−１２０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １２１−１３０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １３１−１４０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １４１−１５０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １５１−１６０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １６１−１７０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １７１−１８０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １８１−１９０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １９１−２００ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２０１−２１０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２１１−２２０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２２１−２３０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２３１−２４０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２４１−２５０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２５１−２６０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２６１−２７０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２７１−２８１ｍｕｔＡと命名された。得られたＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩで３７°恒温水浴槽で３０分間消化し、その後２．５ ｕｌ消化産物を取って２０ｕｌ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスし、シークエンサーで正しいと確認したプラスミドは、後続トランスフェクション実験に付す。
実施例２１．ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質の断片化変異体によるインフルエンザウィルスＨ７Ｎ９ＺＪ１３の複製への影響
ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質の断片化変異体によるインフルエンザウィルスＨ７Ｎ９ＺＪ１３の複製への影響：二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は、１ｘ１０５／ウェルで２４ウェルプレートに接種し、２０ｈ後、実施例２０で構築したｃｈＡＮＰ３２Ａ断片化変異体と、Ｈ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ報告システムの６つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１（４０ｎｇ）、ＰＢ２（４０ ｎｇ）、ＰＡ（２０ ｎｇ）、ＮＰ（８０ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃ（４０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫ（５ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（１０ ｎｇ）であり、同時に陰性対照としてブランクベクター（１０ｎｇ）、陽性対照としてｃｈＡＮＰ３２Ａ（１０ｎｇ）を設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定し、結果から、ｃｈＡＮＰ３２Ａと比べて、断片化変異体ｃｈＡＮＰ３２Ａ ７１−８０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ８１−９０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ９１−１００ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １０１−１１０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １１１−１２０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １２１−１３０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １３１−１４０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １４１−１５０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １５１−１６０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １６１−１７０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １７１−１８０ｍｕｔＡはＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないが、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １−１０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ１１−２０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２１−３０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ３１−４０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ４１−５０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ５１−６０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １８１−１９０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２０１−２１０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２１１−２２０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２２１−２３０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２３１−２４０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２４１−２５０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２５１−２６０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２６１−２７０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ２７１−２８１ｍｕｔＡは、いずれもＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性をサポートでき、ｃｈＡＮＰ３２Ａ ６１−７０ｍｕｔＡ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ １９１−２００ｍｕｔＡはＨ７Ｎ９ＺＪ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が約１００倍と下がることは分かる。結果は図２９に示す。
実施例２２．ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸サイト変異ベクターの構築、及びポリメラーゼ活性のアッセイ
Figure 2021509818
点変異用プライマーは表２３に示され（下線部は変異塩基である）、ＫＯＤ−ＦＸ高効ＤＮＡポリメラーゼで増幅し、ＰＣＡＧＧＳ−ｃｈＡＮＰ３２Ａを鋳型とし、それぞれ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１４９Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６４のプライマー対で）、Ｒ１５０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６６のプライマー対で）、Ｄ１５１Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６８のプライマー対で）、Ｄ１５２Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７０のプライマー対で）、Ｋ１５３Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２のプライマー対で）、Ｅ１５４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７４のプライマー対で）点変異体を構築し、それぞれ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１４９Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｒ１５０Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１５１Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１５２Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｋ１５３Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｅ１５４Ａと命名された。得られたＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩで３７°恒温水浴槽で３０分間消化し、その後２．５ ｕｌ消化産物を取って２０ｕｌ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスし、シークエンサーで正しいと確認したプラスミドは、後続トランスフェクション実験に付す。
実施例２３．ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質の点変異体によるインフルエンザウィルスＨ７Ｎ９ＡＨ１３の複製への影響
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は、１ｘ１０５／ウェルで２４ウェルプレートに接種し、２０ｈ後、実施例２２で構築したｃｈＡＮＰ３２Ａアミノ酸変異体と、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ報告システム中の６つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１（４０ｎｇ）、ＰＢ２（４０ ｎｇ）、ＰＡ（２０ ｎｇ）、ＮＰ（８０ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃ（４０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫ（５ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（１０ ｎｇ）であり、同時に陰性対照としてブランクベクター（１０ｎｇ）、陽性対照としてｃｈＡＮＰ３２Ａ（１０ｎｇ）を設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定し、結果から、ｃｈＡＮＰ３２Ａと比べて、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１４９ＡはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が約１０００倍と下がって、ポリメラーゼ活性のサポート能力がほぼを有さず、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１５１ＡはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が約５０倍と下がって、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｒ１５０Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｄ１５２Ａ、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｋ１５３Ａは、いずれもＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性をサポートでき、ｃｈＡＮＰ３２Ａ Ｅ１５４Ａはポリメラーゼ活性のサポート能力が約５倍と下がることは分かる。結果は図３０に示す。
実施例２４．ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸サイト変異ベクターの構築、及びポリメラーゼ活性のアッセイ
Figure 2021509818
ｈｕＡＮＰ３２Ｂの蛋白質配列を分析したところ、３つの既知の核外移行シグナル（ＮＥＳ）を含み、それぞれＮＳＥ１（ＬＰＫＬＰＫＬＫＫＬ、６０−７１番目にいる）、ＮＳＥ２（ＬＰＮＬＴＨＬＮＬ、８７−９５番目にいる）とＮＥＳ３（ＬＥＰＬＫＫＬＥＣＬＫＳＬＤＬ，１０６−１２０番目にいる）である。ｈｕＡＮＰ３２Ｂの核外移行機能ドメインは、ポリメラーゼ活性のサポート能力との相関性があるかどうかを確認するため、前記３つの核外移行領域についてそれぞれ変異させた。ＮＥＳ１領域について、６０番目及び６３番目のロイシンはアラニンに変異され、変異体はｈｕＡＮＰ３２Ｂ ＮＥＳ１ｍｕｔと命名された。ＮＥＳ２領域について、その８７番目、９０番目、９３番目及び９５番目のロイシンはアラニンに変異され、変異体はｈｕＡＮＰ３２Ｂ ＮＥＳ２ｍｕｔと命名された。ＮＥＳ３領域について、その１１２、１１５番目及び１１８番目のロイシンはアラニンに変異され、変異体はｈｕＡＮＰ３２Ｂ ＮＥＳ３ｍｕｔと命名された。点変異用プライマーは表２４に示され（下線部は変異塩基である）、ＫＯＤ−ＦＸ高効ＤＮＡポリメラーゼで増幅し、ＰＣＡＧＧＳ−ｈｕＡＮＰ３２Ｂを鋳型とし、それぞれ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ ＮＥＳ１ｍｕｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７６のプライマー対で）、ＮＥＳ２ｍｕｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７８のプライマー対で）、ＮＥＳ３ｍｕｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８０のプライマー対で）点変異体を構築し、それぞれｈｕＡＮＰ３２Ｂ ＮＥＳ１ｍｕｔ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ ＮＥＳ２ｍｕｔ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ ＮＥＳ３ｍｕｔと命名された。得られたＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩで３７°恒温水浴槽で３０分間消化し、その後２．５ ｕｌ消化産物を取って２０ｕｌ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスし、シークエンサーで正しいと確認したプラスミドは、後続トランスフェクション実験に付す。
実施例２５．ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の点変異体によるインフルエンザウィルスＨ７Ｎ９ＡＨ１３の複製への影響
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は、１ｘ１０５／ウェルで２４ウェルプレートに接種し、２０ｈ後、実施例２４で構築したｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸変異体と、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ報告システムの６つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１（４０ｎｇ）、ＰＢ２（４０ ｎｇ）、ＰＡ（２０ ｎｇ）、ＮＰ（８０ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃ（４０ ｎｇ）、ｐＲＬ−ＴＫ（５ ｎｇ）とＡＮＰ３２変異体蛋白質プラスミド（１０ ｎｇ）であり、同時に陰性対照としてブランクベクター（１０ｎｇ）、陽性対照としてｈｕＡＮＰ３２Ｂ（１０ｎｇ）を設けて、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、細胞は溶解してポリメラーゼ活性を検定し、結果から、ｈｕＡＮＰ３２Ｂと比べて、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ ＮＥＳ１ｍｕｔはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が約１０００倍と下がって、ポリメラーゼ活性のサポート能力をほぼ有さず、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ ＮＥＳ２ｍｕｔ、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ ＮＥＳ３ｍｕｔはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力を有しないことは分かる。結果は図３１に示す。
実施例２６：部位特異的変異した細胞株の構築
本発明者らはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術で部位特異的変異した細胞株を構築した。ＮＣＢＩで発表した参照ヌクレオチド配列ｈｕｍａｎ ＡＮＰ３２Ａ（ＮＭ＿００６３０５．３）とｈｕｍａｎ ＡＮＰ３２Ｂ（ＮＭ＿００６４０１．２）によって、オンラインソフトｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／で、この二つの蛋白質の１２９／１３０サイトのｓｇＲＮＡ（配列は表２５に示す）をデザインした。
Figure 2021509818
ｈｕＡＮＰ３２Ａ １２９／１３０アミノ酸サイトとｈｕＡＮＰ３２Ｂ １２９／１３０アミノ酸サイトについて、ｓｇＲＮＡ プライマーをデザインし、実施例２で構築したｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６−ｈｕＡＮＰｓｇＲＮＡ−１組み換えプラスミドを鋳型とし、点変異ＰＣＲ法にて、ＫＯＤ−ＦＸ Ｎｅｏ高効ＤＮＡポリメラーゼで（製品番号：ＫＦＸ−２０１、東洋紡から購入）増幅し、それぞれ、ｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６−ｈｕＡＮＰ３２Ａ−１２９／１３０−ｓｇＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８４のプライマー対で）、ｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ−１２９／１３０−ｓｇＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８７のプライマー対で）組み換えプラスミドを構築した。得られたＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩで３７°恒温水浴槽で３０分間消化し、その後５ｕｌ消化産物を取って２０ｕｌ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。翌日、モノクロナールをピックアップしてシークエンスし、シークエンサーで正しいと確認したプラスミド、即ち、ｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６−ｈｕＡＮＰ３２Ａ−１２９／１３０−ｓｇＲＮＡ（ｈｕＡＮＰ３２Ａ−１２９／１３０−ｓｇＲＮＡを含む）、ｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ−１２９／１３０−ｓｇＲＮＡ（ｈｕＡＮＰ３２Ｂ−１２９／１３０−ｓｇＲＮＡを含む）を後続のトランスフェクト実験に付す。同時に、細胞内のｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎの点変異に使用するドナー配列ｈｕＡＮＰ３２Ａ−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８５）及びｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ点変異に使用するドナー配列ｈｕＡＮＰ３２Ｂ−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８８）を合成した。合成したモノヌクレオチド配列は、無菌蒸留水で１０ｕＭに希釈して備用した。
Figure 2021509818
Ｃａｓ９−ＧＦＰ蛋白質を発現する真核プラスミドｐＭＪ９２０（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃４２２３４）１ ｕｇ、ｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６−ｈｕＡＮＰ３２Ａ−１２９／１３０−ｓｇＲＮＡ組み換えプラスミド１ ｕｇ、及び希釈されたｈｕＡＮＰ３２Ａ−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８５）０．５μＬは、１：２．５の割合でリポフェクタミン２０００とよく混ぜて、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。Ｃａｓ９−ＧＦＰ蛋白質を発現する真核プラスミドｐＭＪ９２０（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃４２２３４）１ ｕｇ、ｐＭＤ１８Ｔ−Ｕ６−ｈｕＡＮＰ３２Ｂ−１２９／１３０−ｓｇＲＮＡ組み換えプラスミド１ ｕｇ、及び希釈されたｈｕＡＮＰ３２Ｂ−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８８）０．５μＬは、１：２．５の割合でリポフェクタミン２０００とよく混ぜて、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、超高速フローサイトメトリー選別システムにてＧＦＰ陽性細胞を選別し、一つの細胞／ウェルで９６穴プレートに播種した。約１０日間までに、単一細胞クローニングをピックアップしてスケールアップ培養した。その後、ＳｉｍｐｌｙＰ全ＲＮＡ抽出キット（Ｂｉｏｆｌｕｘから購入、製品番号ＢＳＣ５２Ｍ１）を用いて操作手順に従って細胞ＲＮＡを抽出し、ＴＡＫＡＲＡ会社逆転写キット（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ），Ｃａｔ．ＲＲ０４７Ａ）を用いてｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏポリメラーゼで、それぞれ、ｓｇＲＮＡが標的化されたｈｕＡＮＰ３２Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９０のプライマー対で）、及びｈｕＡＮＰ３２Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９２のプライマー対で）の目的断片を増幅した。増幅プライマーは表２７に示し、ここで、ｈｕＡＮＰ３２Ａ増幅断片の大きさは５７０ｂｐであり、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ増幅断片の大きさは５７２ｂｐである。シークエンサーで前記遺伝子の変異が正しいと確認した単一細胞クローニングは、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる同定と後続の実験検討に付す。ｈｕＡＮＰ３２Ａの、ｈｕＡＮＰ３２Ｂの１２９／１３０アミノ酸サイトを同時に変異した細胞株とは、第一回りでｈｕＡＮＰ３２Ｂ単一ノックアウト細胞株を得た後、もう一回りのノックアウトスクリーニングを経ったものであり、トランスフェクト系及びスクリーニング工程は、上述の通りである。構築された細胞株らは、それらのｈｕＡＮＰ３２Ａ及びｈｕＡＮＰ３２Ｂ目的断片を増幅し、単一変異及び二重変異の効果を検証した。細胞株の同定シークエンサー結果は、図３２に示す。ここで、図３２Ａは、ｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ単一変異の細胞株（Ａ２１ ＩＮと命名され）において、ｈｕＡＮＰ３２Ａ及びｈｕＡＮＰ３２Ｂ １２９／１３０サイトアミノ酸のシークエンサー結果であり、図３２Ｂは、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ単一変異の細胞株（Ｂ５ ＩＮと命名され）において、ｈｕＡＮＰ３２Ａ及びｈｕＡＮＰ３２Ｂ １２９／１３０サイトアミノ酸のシークエンサー結果であり、図３２Ｃは二重変異の細胞株（ＡＢ ＩＮと命名され）においてｈｕＡＮＰ３２Ａ及びｈｕＡＮＰ３２Ｂ １２９／１３０サイトアミノ酸のシークエンサー結果である。
Figure 2021509818
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇに用いた抗体は、Ａｎｔｉ−ＰＨＡＰ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ会社から購入、製品番号 ａｂ５１０１３）とＡｎｔｉ−ＰＨＡＰＩ２／ＡＰＲＩＬ ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＥＰＲ１４５８８］（Ａｂｃａｍ会社から購入、製品番号 ａｂ２００８３６）であり、内部標準遺伝子として、βアクチン（β−ａｃｔｉｎ）が抗体Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−β−Ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ（シグマ会社から購入、製品番号 Ａ１９７８−２００ＵＬ）を用いた。結果は図３３に示す。
上記したように、本発明者らはｈｕＡＮＰ３２Ａ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ単一変異の細胞株（Ａ２１ ＩＮと命名され）、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ Ｎ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ単一変異の細胞株（Ｂ５ ＩＮと命名され）及びｈｕＡＮＰ３２ＡとｈｕＡＮＰ３２Ｂ二重変異の細胞株（ＡＢ ＩＮと命名され）を成功構築し、後続の実験に用いる。
実施例２７：ＡＮＰ３２蛋白質によるインフルエンザウィルスの複製への影響
実施例２で構築した二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）及び実施例２６で構築したＡ２１ ＩＮ細胞株、Ｂ５ ＩＮ細胞株、ＡＢ ＩＮ細胞株、及び野生型２９３Ｔ細胞株は、３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システム中の５つのプラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクト系は：ＰＢ１プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＢ２プラスミド（８０ ｎｇ）、ＰＡプラスミド（４０ ｎｇ）、ＮＰプラスミド（１６０ ｎｇ）、ｐＭＤ１８Ｔ−ｖＬｕｃプラスミド（８０ ｎｇ）とｐＲＬ−ＴＫプラスミド（１０ ｎｇ）を含み、各グループについて重複ウェルを３つ設けた。２４ｈトランスフェクトした後、実施例３のように細胞を溶解してポリメラーゼ活性を検定した。結果から、Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼは、単一変異細胞株Ａ２１ ＩＮ細胞株とＢ５ ＩＮ細胞株において、活性が野生型２９３Ｔ細胞との差は小さく、３−５倍と下がるが、ＡＢ ＩＮ、ＤＫＯ細胞株において、ポリメラーゼの活性が約３０００−５０００倍と顕著に低減することは分かる。結果は図３４に示す。
Ｈ１Ｎ１ＳＣ０９ポリメラーゼ報告システムに代えて、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ報告システムで上に述べた実験を再現したところ、結果から、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼは、単一変異細胞株Ａ２１ ＩＮ細胞株、Ｂ５ ＩＮ細胞株において、活性が野生型２９３Ｔ細胞との差は小さく、１０倍程度と下がるが、ＡＢ ＩＮとＤＫＯ細胞株において、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼの活性が約７０００−１００００倍と顕著に低減することは分かる。結果は図３５に示す。
実施例２８ 鳥由来ＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸配列アラインメント
鳥由来ＡＮＰ３２Ａ蛋白質（ｃｈＡＮＰ３２Ａ、ｚｆＡＮＰ３２Ａ、ｄｋＡＮＰ３２ＡとｔｙＡＮＰ３２Ａ）のアミノ酸配列を比較して、図３６に示す。ここで、各鳥由来ＡＮＰ３２Ａ蛋白質と、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の１２９、１３０、１４９、１５１位、及び６０、６３、８７、９０、９３、９５，１１２，１１５、と１１８位との対応関係は、表２８に示す。
Figure 2021509818
実施例２１で証明したように、ｃｈＡＮＰ３２Ａのアミノ酸断片７１−１８０のアミノ酸をアラニンに変異させることによって、該蛋白質はポリメラーゼ活性のサポート能力をが完全に失ったが、アミノ酸断片６１−７０と１９１−２００のアミノ酸をアラニンに変異させることによって、該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３６のｚｆＡＮＰ３２Ａ蛋白質と、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質とのアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｚｆＡＮＰ３２Ａのアミノ酸断片６１−７１、アミノ酸断片７３−７５、アミノ酸断片７７−９９、アミノ酸断片１０１−１６５、アミノ酸断片１６７−１６９、アミノ酸断片１７１−１８０及びアミノ酸断片１８１−２００の配列は、ｃｈＡＮＰ３２Ａのアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｚｆＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸断片６１−７１、アミノ酸断片７３−７５、７７−９９、１０１−１６５、１６７−１６９と１７１−１８０のアミノ酸をアラニンに変異させることと同様に、該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなって、アミノ酸断片６１−７０と１９１−２００のアミノ酸をアラニンに変異させることによって、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３６のｄｋＡＮＰ３２Ａ蛋白質と、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質とのアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｄｋＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の６６番目はＩであり、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の７６番目はＶであり、また、ｄｋＡＮＰ３２Ａは１６４−１６７番目のアミノ酸を欠失した（ｃｈＡＮＰ３２蛋白質の１７６−１７９番目と比較する場合）。これから分かるように、ｄｋＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸断片６１−６５、アミノ酸断片６７−１６６のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片５１−６０及びアミノ酸断片１７７−１８６のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３６のｔｙＡＮＰ３２Ａ蛋白質と、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質とのアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｔｙＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸配列は、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸と完全に同じものである。これから分かるように、ｔｙＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸断片６０−１７９のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなり、アミノ酸断片６０−６９とアミノ酸断片１９０−１９９のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
実施例２９ 鳥由来ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質とｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列アラインメント
鳥由来ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質（ｃｈＡＮＰ３２Ｂ、ｄｋＡＮＰ３２Ｂ（ＸＰ＿０１２９６３７２３．１）とｔｙＡＮＰ３２Ｂ（ＸＰ＿０１０７２３１７４．１））とｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列を比較して、図３７に示す。ここで、各鳥由来ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質と、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の１２９，１３０，１４９，１５１番目、及び６０、６３、８７、９０、９３、９５、１１２、１１５と１１８番目の対応関係は表２９に示す。
Figure 2021509818
実施例１９で証明したように、ｈｕＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸断片５１−１６０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片４１−５０と１６１−１７０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３７のｃｈＡＮＰ３２Ｂ蛋白質とｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｃｈＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸断片４３−４８、アミノ酸断片５０−５２、アミノ酸断片５８−６３、アミノ酸断片６８−７２、アミノ酸断片７４−７６、アミノ酸断片７８−８０、アミノ酸断片８３−８５、アミノ酸断片８８−９９、アミノ酸断片１０１−１０３、アミノ酸断片１０５−１１２、アミノ酸断片１１７−１２６、アミノ酸断片１３１−１３６、アミノ酸断片１３８−１４７及びアミノ酸断片１５３−１５９配列は、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｃｈＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸断片５０−５２、５８−６３、６８−７２、７４−７６、７８−８０、８３−８５、８８−９９、１０１−１０３、１０５−１１２、１１７−１２６、１３１−１３６、１３８−１４７及び１５３−１５９のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片４３−４８のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３７のｄｋＡＮＰ３２Ｂ蛋白質とｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｄｋＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸断片５７−６２（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片４３−４８に対応）、アミノ酸断片７０−７７（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片５６−６３に対応）、アミノ酸断片８２−８６（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片６８−７２に対応）、アミノ酸断片８８−９０（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片７４−７６に対応）、アミノ酸断片９２−９４（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片７８−８０に対応）、アミノ酸断片９７−９９（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片８３−８５に対応）、アミノ酸断片１０２−１１３（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片８８−９９に対応）、アミノ酸断片１１５−１１７（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１０１−１０３に対応）、アミノ酸断片１１９−１２６（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１０５−１１２に対応）、アミノ酸断片１３１−１４０（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１１７−１２６に対応）、アミノ酸断片１４５−１５０（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１３１−１３６に対応）、アミノ酸断片１５２−１６１（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１３８−１４７に対応）及びアミノ酸断片１６６−１７３（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１５２−１５９に対応）配列は、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｄｋＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸断片７０−７７、８２−８６、８８−９０、９２−９４、９７−９９、１０２−１１３、１１５−１１７、１１９−１２６、１３１−１４０、１４５−１５０、１５２−１６１及び１６６−１７３のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片５７−６２のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３７のｔｙＡＮＰ３２Ｂ蛋白質とｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｔｙＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸断片１０−１５（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片５８−６３に対応）、アミノ酸断片２０−２４（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片６８−７２に対応）、アミノ酸断片２６−２８（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片７４−７６に対応）、アミノ酸断片３０−３２（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片７８−８０に対応）、アミノ酸断片３５−３７（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片８３−８５に対応）、アミノ酸断片４０−５１（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片８８−９９に対応）、アミノ酸断片５３−５５（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１０１−１０３に対応）、アミノ酸断片５７−６４（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１０５−１１２に対応）、アミノ酸断片６９−７８（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１１７−１２６に対応）、アミノ酸断片８３−８８（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１３１−１３６に対応）、アミノ酸断片９０−９９（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１３８−１４７）及びアミノ酸断片１０５−１１１（ｈｕＡＮＰ３２Ｂアミノ酸断片１５３−１５９）配列は、ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｔｙＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸断片２０−２４、２６−２８、３０−３２、３５−３７、４０−５１、５３−５５、５７−６４、６９−７８、８３−８８、９０−９９及び１０５−１１１のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなった。
実施例３０ 哺乳動物ＡＮＰ３２Ａ蛋白質とｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸配列アラインメント
哺乳動物ＡＮＰ３２Ａ蛋白質（ｈｕＡＮＰ３２Ａ、ｄｏｇＡＮＰ３２Ａ（ＮＰ＿００１００３０１３．２），ｅｑＡＮＰ３２Ａ、ｍｕＡＮＰ３２Ａ、ｐｇＡＮＰ３２Ａ）は、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸配列と比較して、図３８に示す。ここで、各哺乳動物ＡＮＰ３２Ａ蛋白質と、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質とのアミノ酸の１２９，１３０，１４９，１５１番目、及び６０、６３、８７、９０、９３、９５，１１２，１１５、と１１８番目の対応関係は表３０に示す。
Figure 2021509818
実施例２１で証明したように、ｃｈＡＮＰ３２Ａのアミノ酸断片７１−１８０のアミノ酸をアラニンに変異させることで、該蛋白質はポリメラーゼ活性のサポート能力をが完全に失ったが、アミノ酸断片６１−７０と１９１−２００のアミノ酸をアラニンに変異させることで、該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３８のｈｕＡＮＰ３２Ａ蛋白質と、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質とのアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｈｕＡＮＰ３２Ａのアミノ酸断片４１−５４、アミノ酸断片５８−７５、アミノ酸断片７７−１０２、アミノ酸断片１０４−１７０とｃｈＡＮＰ３２Ａのアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｈｕＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸断片７７−１０２、１０４−１７０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片６１−７０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３８のｅｑＡＮＰ３２Ａ蛋白質と、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質とのアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｅｑＡＮＰ３２Ａのアミノ酸断片４１−５４、アミノ酸断片５６−７５、アミノ酸断片７７−１０２、アミノ酸断片１０４−１６９とｃｈＡＮＰ３２Ａのアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｅｑＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸断片７７−１０２、１０４−１６９のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片６１−７０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３８のｄｏｇＡＮＰ３２Ａ蛋白質と、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質とのアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｄｏｇＡＮＰ３２Ａのアミノ酸断片４１−５４、アミノ酸断片５６−７５、アミノ酸断片７７−１０２、アミノ酸断片１０４−１６９とｃｈＡＮＰ３２Ａのアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｄｏｇＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸断片７７−１０２、１０４−１６９のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片６１−７０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３８のｐｇＡＮＰ３２Ａ蛋白質と、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質とのアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｐｇＡＮＰ３２Ａのアミノ酸断片４１−５４、アミノ酸断片５６−７５、アミノ酸断片７７−１０２、アミノ酸断片１０６−１５５、アミノ酸断片１５７−１６９とｃｈＡＮＰ３２Ａのアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｐｇＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸断片７７−１０２、１０６−１５５、１５７−１６９のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片６１−７０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３８のｍｕＡＮＰ３２Ａ蛋白質と、ｃｈＡＮＰ３２Ａ蛋白質とのアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｍｕＡＮＰ３２Ａのアミノ酸断片４１−５４、アミノ酸断片５９−７２、アミノ酸断片８０−９０、アミノ酸断片９２−１０２、アミノ酸断片１０４−１２９、アミノ酸断片１３１−１４１、アミノ酸断片１４４−１５１、アミノ酸断片１５３−１５９、アミノ酸断片１６１−１６５とｃｈＡＮＰ３２Ａのアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｍｕＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸断片８０−９０、９２−１０２、１０４−１２９、１３１−１４１、１４４−１５１、１５３−１５９、１６１−１６５アミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片６１−７０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
実施例３１哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列アラインメント
比較された哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質（ｈｕＡＮＰ３２Ｂ、ｄｏｇＡＮＰ３２Ｂ（ＸＰ＿０１３９７３３５４．１）、ｅｑＡＮＰ３２Ｂ（ＸＰ＿０２３４８５４９１．１）、ｍｕＡＮＰ３２Ｂ（ＮＰ＿５７０９５９．１）、ｐｇＡＮＰ３２Ｂ（ＸＰ＿０２０９２２１３６．１））のアミノ酸配列、参照図３９、ここで、各哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質アミノ酸位置１２９，１３０，１４９，１５１、及び位置６０、６３、８７、９０、９３、９５，１１２，１１５、と１１８の対応関係は表３１に示す。
Figure 2021509818
実施例１９で証明したように、ｈｕＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸断片５１−１６０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片４１−５０と１６１−１７０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３９のｅｑＡＮＰ３２Ｂ蛋白質とｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｅｑＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸断片４１−７２、アミノ酸断片７４−１１２及びアミノ酸断片１１５−１７０とｈｕＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｅｑＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸断片５１−７２、７４−１１２、１１５−１６０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片４１−５０、１６１−１７０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３９のｐｇＡＮＰ３２Ｂ蛋白質とｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｐｇＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸断片４１−７２、アミノ酸断片７８−１４２、アミノ酸断片１４４−１５０及びアミノ酸断片１５４−１６９とｈｕＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｐｇＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸断片５１−７２、７８−１４２、１４４−１５０、１５４−１６０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片４１−５０、１６１−１６９のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３９のｍｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質とｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｍｕＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸断片４１−５０、アミノ酸断片６０−８１、アミノ酸断片９０−９８、アミノ酸断片１００−１１０、アミノ酸断片１１４−１２１、アミノ酸断片１２３−１２７、アミノ酸断片１３０−１３３、アミノ酸断片１３８−１４２及びアミノ酸断片１４４−１５９とｈｕＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｍｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸断片６０−８１、９０−９８、１００−１１０、１１４−１２１、１２３−１２７、１３０−１３３、１３８−１４２、１４４−１５９のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片４１−５０のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
図３９のｄｏｇＡＮＰ３２Ｂ蛋白質とｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸配列アラインメントから分かるように、ｄｏｇＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸断片４８−７９（ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸断片４１−７２に対応）、アミノ酸断片８１−１２０（ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸断片７４−１１３に対応）、アミノ酸断片１２２−１５９（ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸断片１１５−１５２に対応）、アミノ酸断片１６１−１７７（ｈｕＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸断片１５４−１７０に対応）とｈｕＡＮＰ３２Ｂのアミノ酸配列とは完全に同じものである。このため、ｄｏｇＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸断片５８−７９、８１−１２０、１２２−１５９、１６１−１６７のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、同様に該蛋白質のポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったが、アミノ酸断片４８−５７、１６８−１７７のアミノ酸をアラニンに変異させることにより、ポリメラーゼ活性のサポート能力が低減された。
実施例３２．ネズミＡＮＰ３２Ｂ蛋白質発現ベクター及び変異ベクターの構築
ネズミＡＮＰ３２Ｂ（ｍｕＡＮＰ３２Ｂ）ヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿１３０８８９．３に参照し、アミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿５７０９５９．１に参照し、実施例１で記載された構築方法によって、ＰＣＡＧＧＳ−ｍｕＡＮＰ３２Ｂ組み換えプラスミドを構築した。実施例１で記載された検出方法のように、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇで蛋白質の発現を検出した。結果は図４０に示す。
実施例８に記載されたｈｕＡＮＰ３２Ｂ点変異のスクリーニング結果によって、ＰＣＡＧＧＳ−ｍｕＡＮＰ３２Ｂ組み換えプラスミドを鋳型とし、過程は実施例８において点変異体の構築に記載のようにして、オーバーラップＰＣＲでｍｕＡＮＰ３２Ｂに対してＳ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９４のプライマー対で）点変異体の構築（プライマーは表３２に示し、下線部は変異塩基である）を行った。過程は前述した通り、得られたプラスミドは、ＰＣＡＧＧＳ−ｍｕＡＮＰ３２Ｂ Ｓ１２９Ｉ／Ｄ１３０Ｎと命名された。シークエンサーで正しいと確認した後、プラスミドは大量に抽出し、後続トランスフェクションに用いる。
Figure 2021509818
実施例３３ ネズミＡＮＰ３２Ｂ蛋白質変異体によるポリメラーゼ活性への影響
二重ノックアウト細胞株（ＤＫＯ）は３ｘ１０５／ウェルで１２ウェルプレートに接種して、２０ｈ後、実施例８に記載されたトランスフェクト系に従って、Ｈ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ報告システムとコトランスフェクトした。結果から、ｍｕＡＮＰ３２Ｂと比べて、ｍｕＡＮＰ３２Ｂ Ｓ１２９Ｉ／Ｄ１３０ＮはＨ７Ｎ９ＡＨ１３ポリメラーゼ活性のサポート能力が完全になくなったことはわかる。結果は図４１に示す。

Claims (27)

  1. 変異型ＡＮＰ３２蛋白質であって、
    １２９番目のアミノ酸の、イソロイシンＩ、リジンＫ、アスパラギン酸Ｄ、バリンＶ、プロリンＰ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、グリシンＧ、又はグルタミン酸Ｅへの置換、
    １３０番目のアミノ酸の、アスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ、リジンＫ、ロイシンＬ、バリンＶ、プロリンＰ、イソロイシンＩ、メチオニンＭ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、又はチロシンＹへの置換、
    １４９番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、
    １５１番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、及び
    ６０と６３、８７、９０、９３と９５、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸の、アラニンへの置換、
    からなる群から選ばれる１種又は複数種の変異を有し、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、アヒルＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、シチメンチヨウＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、１２９番目のアミノ酸はイソロイシンＩではなく、且つ、１３０番目のアミノ酸はアスパラギンＮではなく、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はネズミＡＮＰ３２Ａである場合、１３０番目のアミノ酸はアラニンＡではなく、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリのＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトのＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、変異型ＡＮＰ３２蛋白質。
  2. 変異型ＡＮＰ３２蛋白質であって、
    ６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、
    からなる群から選ばれるアミノ酸断片の1個又は複数個の断片が、欠失又はアラニンに置換され、
    ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、変異型ＡＮＰ３２蛋白質。
  3. 変異型ＡＮＰ３２蛋白質であって、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、
    ２１−３０番目のアミノ酸断片、４１−５０番目のアミノ酸断片、５１−６０番目のアミノ酸断片、１６１−１７０番目のアミノ酸断片、
    からなる群から選ばれるアミノ酸断片の1個又は複数個の断片が、欠失又はアラニンに置換され、
    ここで、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、変異型ＡＮＰ３２蛋白質。
  4. 変異型ＡＮＰ３２蛋白質であって、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、
    １６１−１７０番目のアミノ酸断片、１７１−１８０番目のアミノ酸断片、１９１−２００番目のアミノ酸断片、
    からなる群から選ばれるアミノ酸断片の1個又は複数個の断片が、欠失又はアラニンに置換され、
    ここで、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、変異型ＡＮＰ３２蛋白質。
  5. 前記ＡＮＰ３２蛋白質は、ＡＮＰ３２Ａ又はＡＮＰ３２Ｂであり、好ましくは、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、より好ましくは、ニワトリ又はヒト由来のものであり、最も好ましくは、ヒトＡＮＰ３２Ｂ、又はニワトリＡＮＰ３２Ａである、請求項１又は２に記載の変異型ＡＮＰ３２蛋白質。
  6. ＡＮＰ３２蛋白質のインフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性の維持への使用であって、
    好ましくは、ＡＮＰ３２蛋白質は鳥由来ＡＮＰ３２蛋白質であり、且つ前記インフルエンザウィルスが鳥由来又は哺乳動物由来インフルエンザウィルスであり、或いは、
    ＡＮＰ３２蛋白質は哺乳動物由来ＡＮＰ３２蛋白質であり、且つ前記インフルエンザウィルスは哺乳動物由来インフルエンザウィルスであり、
    好ましくは、前記インフルエンザウィルスは、ヒト、イヌ、鳥又はウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれ、
    好ましくは、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質、ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質から選ばれ、
    より好ましくは、前記ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、
    好ましくは、前記ＡＮＰ３２蛋白質ニワトリ由来のＡＮＰ３２Ｂ又はネズミ由来のＡＮＰ３２Ａではない、前記使用。
  7. ＡＮＰ３２蛋白質のインフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性の低減のための使用であって、
    好ましくは、前記インフルエンザウィルスは、ヒト、イヌ、鳥又はウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれ、
    好ましくは、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質、ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質から選ばれ、
    より好ましくは、前記ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、
    より好ましくは、ＡＮＰ３２蛋白質は請求項１−４のいずれか１項に定義した変異型ＡＮＰ３２蛋白質、或いはＡＮＰ３２蛋白質はニワトリ由来のＡＮＰ３２Ｂ蛋白質又はネズミ由来のＡＮＰ３２Ａ蛋白質である、前記使用。
  8. インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を下げる方法であって、ＡＮＰ３２蛋白質を変異させることを含み、
    前記変異が、
    １２９番目のアミノ酸の、イソロイシンＩ、リジンＫ、アスパラギン酸Ｄ、バリンＶ、プロリンＰ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、グリシンＧ、又はグルタミン酸Ｅへの置換、
    １３０番目のアミノ酸の、アスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ、リジンＫ、ロイシンＬ、バリンＶ、プロリンＰ、イソロイシンＩ、メチオニンＭ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、又はチロシンＹへの置換、
    １４９番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、
    １５１番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、及び
    ６０と６３、８７、９０、９３と９５、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸の、アラニンへの置換、
    からなる群から選ばれる１種又は複数種の変異であり、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、アヒルＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、シチメンチヨウＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、１２９番目のアミノ酸はイソロイシンではなく、且つ１３０番目のアミノ酸はアスパラギンＮではなく、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はネズミＡＮＰ３２Ａである場合、１３０番目のアミノ酸はアラニンＡではなく、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を下げる方法。
  9. 前記インフルエンザウィルスはポリメラーゼの活性を喪失させ、
    前記変異が、
    １２９番目のアミノ酸の、イソロイシンＩ、リジンＫ又はアスパラギン酸Ｄへの置換、
    １３０番目のアミノ酸の、アスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ又はリジンＫへの置換、
    ８７、９０、９３と９５、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸の、アラニンへの置換、
    からなる群から選ばれる１種又は複数種の変異である、請求項８に記載の方法。
  10. インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を下げる方法であって、ＡＮＰ３２蛋白質の1個又は複数個の断片を、欠失又はアラニンに置換させることを含み、
    前記断片が、
    ６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、
    からなる群から選ばれるアミノ酸断片であり、
    ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、前記方法。
  11. 前記インフルエンザウィルスのポリメラーゼの活性を喪失させ、
    前記断片が、
    ７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、
    からなる群から選ばれるアミノ酸断片である、請求項１０に記載の方法。
  12. インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を下げる方法であって、
    ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の1個又は複数個の断片を、欠失又はアラニンに置換させることを含み、
    前記断片が、
    ２１−３０番目のアミノ酸断片、４１−５０番目のアミノ酸断片、５１−６０番目のアミノ酸断片、１６１−１７０番目のアミノ酸断片、
    からなる群から選ばれるアミノ酸断片であり、
    ここで、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトのＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、前記方法。
  13. インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性を下げる方法であって、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の1個又は複数個の断片を、欠失又はアラニンに置換させることを含み、
    前記断片が、
    １６１−１７０番目のアミノ酸断片、１７１−１８０番目のアミノ酸断片、１９１−２００番目のアミノ酸断片、
    からなる群から選ばれるアミノ酸断片であり、
    ここで、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応する、前記方法。
  14. 前記インフルエンザウィルスのポリメラーゼの活性を喪失させ、
    前記断片が、
    １６１−１７０番目のアミノ酸断片、１７１−１８０番目のアミノ酸断片
    からなる群から選ばれるアミノ酸断片である、請求項１３に記載の方法。
  15. ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ又はＡＮＰ３２Ｂから選ばれ、
    好ましくは、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、
    より好ましくは、ニワトリ又はヒト由来のものであり、
    最も好ましくは、ヒトＡＮＰ３２Ｂ、又はニワトリＡＮＰ３２Ａであり、
    好ましくは、前記インフルエンザウィルスは、ヒト、イヌ、鳥、ウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれるものである、請求項８−１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. ＡＮＰ３２蛋白質のアミノ酸断片の、インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性の維持への使用であって、
    前記断片が、
    ６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１７１−１８０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１９１−２００番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の２１−３０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の４１−５０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の５１−６０番目のアミノ酸、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、
    からなる群から選ばれる1個又は複数個の断片であり、
    ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    好ましくは、ＡＮＰ３２蛋白質は鳥由来ＡＮＰ３２蛋白質であり、且つ前記インフルエンザウィルスが鳥由来又は哺乳動物由来インフルエンザウィルスから選ばれ、
    或いは、ＡＮＰ３２蛋白質は哺乳動物由来ＡＮＰ３２蛋白質であり、且つ前記インフルエンザウィルスは哺乳動物由来インフルエンザウィルスである、前記使用。
  17. ＡＮＰ３２蛋白質のアミノ酸断片の、インフルエンザウィルスのポリメラーゼ活性の低減のための使用であって、
    前記断片が、
    ６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１７１−１８０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１９１−２００番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の２１−３０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の４１−５０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の５１−６０番目のアミノ酸、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、
    からなる群から選ばれる1個又は複数個の断片であり、
    ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    好ましくは、ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ又はＡＮＰ３２Ｂから選ばれ、好ましくは、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、より好ましくは、ニワトリ又はヒト由来のものであり、最も好ましくは、ヒトＡＮＰ３２Ｂ、又はニワトリＡＮＰ３２Ａであり、
    好ましくは、前記インフルエンザウィルスは、ヒト、イヌ、鳥、ウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれる、前記使用。
  18. 少なくとも１種の試薬又は組合試薬を含むキットであって、
    前記少なくとも１種の試薬又は組合試薬は、
    ＡＮＰ３２蛋白質の１２９番目のアミノ酸、１３０番目のアミノ酸、１４９番目のアミノ酸、１５１番目のアミノ酸、６０番目のアミノ酸、６３番目のアミノ酸、８７番目のアミノ酸、９０番目のアミノ酸、９３番目のアミノ酸、９５番目のアミノ酸、１１２番目のアミノ酸、１１５番目のアミノ酸又は１１８番目のアミノ酸、
    からなる群から選ばれる１種又は複数種の番目のアミノ酸種類の同定に用いるものであり、
    ここで、
    １２９番目のアミノ酸はイソロイシンＩ、リジンＫ、アスパラギン酸Ｄ、バリンＶ、プロリンＰ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、グリシンＧ、又はグルタミン酸Ｅであり、
    １３０番目のアミノ酸はアスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ、リジンＫ、ロイシンＬ、バリンＶ、プロリンＰ、イソロイシンＩ、メチオニンＭ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、又はチロシンＹであり、
    １４９番目のアミノ酸はアラニンＡであり、
    １５１番目のアミノ酸はアラニンＡであり、
    ６０と６３、８７、９０、９３と９５、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸はアラニンである場合、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質のインフルエンザポリメラーゼの活性をサポートする能力が低減し、
    ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、前記キット。
  19. ＡＮＰ３２蛋白質のアミノ酸の種類を同定するために使用する、オリゴヌクレオチドプライマーであって、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質のアミノ酸は、
    １２９番目のアミノ酸、１３０番目のアミノ酸、１４９番目のアミノ酸、１５１番目のアミノ酸、６０番目のアミノ酸、６３番目のアミノ酸、８７番目のアミノ酸、９０番目のアミノ酸、９３番目のアミノ酸、９５番目のアミノ酸、１１２番目のアミノ酸、１１５番目のアミノ酸と１１８番目のアミノ酸、
    からなる群から選ばれるアミノ酸であり、
    ここで、
    １２９番目のアミノ酸はイソロイシンＩ、リジンＫ、アスパラギン酸Ｄ、バリンＶ、プロリンＰ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、グリシンＧ、又はグルタミン酸Ｅであり、
    １３０番目のアミノ酸はアスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ、リジンＫ、ロイシンＬ、バリンＶ、プロリンＰ、イソロイシンＩ、メチオニンＭ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、又はチロシンＹであり、
    １４９番目のアミノ酸はアラニンＡであり、
    １５１番目のアミノ酸はアラニンＡであり、
    ６０、６３番目のアミノ酸、又は８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸、又は１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸はアラニンである場合、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質のインフルエンザポリメラーゼの活性をサポートする能力が低減し、
    ここで、前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、前記オリゴヌクレオチドプライマー。
  20. 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、好ましくは、少なくとも２０塩基の長さを有し、例えば、少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５塩基の長さを有する、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
  21. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５−１５６，１６３−１６６，１６７−２５６、と３７５−３８０からなる群から選ばれる、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
  22. 動物の生産方法であって、
    動物体内のＡＮＰ３２蛋白質を変異させる工程を含み、
    前記変異が、
    １２９番目のアミノ酸の、イソロイシンＩ、リジンＫ、アスパラギン酸Ｄ、バリンＶ、プロリンＰ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、グリシンＧ、又はグルタミン酸Ｅへの置換、
    １３０番目のアミノ酸の、アスパラギンＮ、フェニルアラニンＦ、リジンＫ、ロイシンＬ、バリンＶ、プロリンＰ、イソロイシンＩ、メチオニンＭ、トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ、アルギニンＲ、グルタミンＱ、又はチロシンＹへの置換、
    １４９番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、
    １５１番目のアミノ酸の、アラニンＡへの置換、及び
    ６０と６３、８７、９０、９３と９５、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸の、アラニンへの置換、
    ６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１７１−１８０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１９１−２００番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の２１−３０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の４１−５０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の５１−６０番目のアミノ酸、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片の、アラニンへの置換、
    からなる群から選ばれる１種又は複数種の変異であり、
    ここで、ＡＮＰ３２蛋白質はニワトリＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、アヒルＡＮＰ３２Ｂ蛋白質、シチメンチヨウＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、１２９番目のアミノ酸はイソロイシンＩではなく、且つ、１３０番目のアミノ酸はアスパラギンＮではなく、
    ＡＮＰ３２蛋白質はネズミＡＮＰ３２Ａである場合、１３０番目のアミノ酸はアラニンＡではなく、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ａ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＸＰ＿４１３９３２．３のニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    前記ＡＮＰ３２蛋白質はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質である場合、前記アミノ酸の番目がＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿００６３９２．１のヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のアミノ酸の番目に対応し、
    好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、前記方法。
  23. 前記動物は、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマからなる群から選ばれる、請求項２２に記載の方法。
  24. ＡＮＰ３２蛋白質又はＡＮＰ３２蛋白質のアミノ酸の、標的としての、インフルエンザウィルス感染による疾患を治療するための医薬品の調製への使用であって、
    前記アミノ酸は、
    １２９番目のアミノ酸、１３０番目のアミノ酸、１４９番目のアミノ酸、１５０番目のアミノ酸、６０と６３番目のアミノ酸、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸、１１２、１１５と１１８番目のアミノ酸、６１−７０番目のアミノ酸断片、７１−８０番目のアミノ酸断片、８１−９０番目のアミノ酸断片、９１−１００番目のアミノ酸断片、１０１−１１０番目のアミノ酸断片、１１１−１２０番目のアミノ酸断片、１２１−１３０番目のアミノ酸断片、１３１−１４０番目のアミノ酸断片、１４１−１５０番目のアミノ酸断片、１５１−１６０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１７１−１８０番目のアミノ酸断片、ニワトリＡＮＰ３２Ａ蛋白質の１９１−２００番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の２１−３０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の４１−５０番目のアミノ酸断片、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の５１−６０番目のアミノ酸、ヒトＡＮＰ３２Ｂ蛋白質の１６１−１７０番目のアミノ酸断片、
    からなる群から選ばれる１種又は複数種の位置又は断片のアミノ酸であり、
    好ましくは、８７、９０、９３と９５番目のアミノ酸は哺乳動物ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質由来のものである、前記使用。
  25. 前記ＡＮＰ３２蛋白質は、ＡＮＰ３２Ａ又はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質であり、好ましくは、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、好ましくは、前記インフルエンザウィルスが、ヒト、イヌ、鳥、ウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれるものである、請求項２４に記載の使用。
  26. 下記工程を含む、インフルエンザウィルスの感染を治療するための候補医薬品のスクリーニング方法であって、
    （１）ＡＮＰ３２Ａ及び／又はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質を含む細胞株から、前記ＡＮＰ３２Ａ、ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質をノックアウすることで、ＡＮＰ３２Ａ蛋白質、ＡＮＰ３２Ｂ蛋白質のノックアウト細胞株を得る、工程、
    （２）ＡＮＰ３２Ａ及び／又はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質をコードするプラスミドと、インフルエンザウィルスのポリメラーゼをコードするプラスミドを工程（１）で得たノックアウト細胞株へトランスフェクトする、工程、
    （３）候補物を前記ノックアウトした細胞株に接触させる、工程、前記接触は、工程（２）のトランスフェクションと同時又は別々に実施してもよく、
    ここで、前記候補物が、工程（３）で処理した細胞株において、ＡＮＰ３２Ａ及び／又はＡＮＰ３２Ｂを含む細胞株と比べて、インフルエンザウィルスのポリメラーゼを発現させない場合、或いはインフルエンザウィルスのポリメラーゼの発現を低減させる場合、インフルエンザウィルスの感染を治療するための候補医薬品である、前記方法。
  27. 前記ＡＮＰ３２Ａ及び／又はＡＮＰ３２Ｂ蛋白質は、ニワトリ、ヒト、キンカチョウ、アヒル、シチメンチヨウ、ブタ、ネズミ又はウマ由来のものであり、好ましくは、前記インフルエンザウィルスが、ヒト、イヌ、鳥、ウマのインフルエンザウィルスからなる群から選ばれるものである、請求項２６に記載の方法。

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DOMINGUES, PATRICIA ET AL., CELL REPORTS, vol. 20, JPN6021015583, 12 September 2017 (2017-09-12), pages 2538 - 2546, ISSN: 0004655092 *
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WATANABE, TOKIKO ET AL., CELL HOST & MICROBE, vol. 16, JPN6021015582, 10 December 2014 (2014-12-10), pages 795 - 805, ISSN: 0004655094 *

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