CN115975001A - Anp32蛋白在宿主体内维持流感病毒聚合酶活性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供流感病毒在宿主体内复制所必须的关键宿主因子ANP32A/B的重组序列信息。更具体地，本发明涉及宿主因子ANP32A/B蛋白的129‑130基序和149位点，它们是发挥其促流感病毒复制的关键活性位点，也是抗流感药物潜在的靶向位点。

Description

ANP32蛋白在宿主体内维持流感病毒聚合酶活性中的应用
技术领域
本发明涉及流感病毒在宿主体内复制所必须的关键宿主因子。更具体地，涉及流感病毒在宿主体内复制所必须的关键宿主因子ANP32A和ANP32B。
背景技术
流感是由流感病毒引起的人类最严重的传染病之一，一次突然爆发的全球流感疫情将会感染约20％-40％的人口(Basler C F，et al.Sequence of the 1918pandemicinfluenza virus nonstructural gene(NS)segment and characterization ofrecombinant viruses bearing the 1918NS genes[J].Proc Nat l Acad Sci U S A，2001，98(5)：2746-2751.)，对人类的生命健康和社会生活形成巨大的威胁。流感病毒是具有包膜的RNA病毒，属于正粘病毒科，病毒为直径80-120nm的球形或多形颗粒。流感病毒可分为甲型(A型)、乙型(B型)、丙型(C型)和丁型(D型)，其中甲型流感病毒因其变异及进化速度快、抗原多变、感染性和致病性强、传播速度快而成为造成季节性流感和历史上流感大流行的主要病毒(Hardelid P，，et al.Excess mortality monitoring in England andWales during the influenza A(H1N1)2009pandemic[J].Epidemiol Infect，2011，139(9)：1431-1439；Yang L，et al.Excess mortality associated with the 2009pandemicof influenza A(H1N1)in Hong Kong[J].Epidemiol Infect，2012，140(9)：1542-1550)。甲型流感病毒先后造成了1918、1957、1968和2009年四次全球性流感大流行，该病毒能在人群中迅速且广泛传播可能与其在宿主体内的适应性及复制能力增强有关，而其在宿主体内特异高效的复制及对宿主的适应性主要由RNA依赖的RNA聚合酶决定(Eisfeld AJ，etal.At the centre：influenza A virus ribonucleoproteins.[J].Nat RevMicrobiol.2015Jan；13(1)：28-41.)。
流感病毒的基因组含有八个片段的负链RNA，共编码11个蛋白，其中RNA聚合酶是由前三个序列编码的PB1、PB2和PA组成的异源多聚体(Area E，et al.3D structure ofthe influenza virus polymerase complex：localization of subunit domains[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101(1)：308-313；Eisfeld AJ，et al.At the centre：influenza Avirus ribonucleoproteins.[J].Nat Rev Microbiol.2015Jan；13(1)：28-41)。RNA聚合酶是流感病毒在宿主细胞内进行转录与复制的物质基础，对于病毒的致病力和宿主范围有重要影响(Neumann G，et al.Host range restriction and pathogenicityin the context of influenza pandemic[J].Emerg Infect Dis，2006，12(6)：881-886.)。宿主细胞内与流感病毒聚合酶及其亚基作用的各种因子如RNA解旋酶DDX、输入蛋白α等，对于流感病毒聚合酶三聚体的组装及活性均有影响(Bortz E，et al.Host-andstrain-specific regulation of influenza virus polymerase activity by interacting cellular proteins[J].MBio，2011，2(4)；Gabriel G，et al.Differential useof importin-alpha isoforms governs cell tropism and host adapta tion ofinfluenza virus[J].Nat Commun，2011，2：156.)。因此，流感病毒聚合酶与宿主蛋白的相互作用是决定病毒毒力和宿主范围的重要因素。
流感病毒跨种间传播及其宿主限制机制一直是本领域研究热点。宿主蛋白ANP32(acidic nuclear phosphoprotein)被认为与感染细胞中病毒RNA的合成相关。以往的研究多集中在该蛋白在细胞内运输、细胞死亡途径、转录调控等细胞生理活动中的作用，以及ANP32蛋白与肿瘤及神经系统疾病的相关性。ANP32蛋白家族成员众多且结构类似，由一个球形的富含亮氨酸重复序列(LRRs)的氨基端和一个伸展的富含酸性氨基酸(LCAR)的羧基端组成(Reilly P T，et al.Cracking the ANP32 whips：important functions，unequalrequirement，and hints at disease implications[J].Bioessays，2014，36(11)：1062-1071.)。该蛋白家族在动植物及原生生物中均有发现，而在酵母及其他真菌中未有发现，这说明该蛋白家族起源于真核生物，在真菌中由于某些因素造成其丢失。据报道，该家族在人类中有8个成员，其中有3个在脊椎动物中比较保守，包括ANP32A、ANP32B及ANP32E，而研究最为广泛的是ANP32A及ANP32B。ANP32A、B蛋白氨基酸序列同源性为70％。ANP32蛋白氨基端LRRs区域的存在使其呈疏水性，有助于ANP32蛋白与其他蛋白相互结合，从而发挥不同的生物学作用；羧基端富含酸性氨基酸且含有一个核定位信号KRKR，使该蛋白可与细胞核内的碱性蛋白相互作用，也可使该蛋白在核质中穿梭(Matsubae，Masami，et al.″Characterization of the nuclear transport of a novel leucine-rich acidicnuclear protei n-like protein.″Febs Letters 468.2-3(2000)：171-175；Matsuoka，K.，et al.″A Nuclear Factor Containing the Leucine-Rich Repeats Expressed inMurine Cerebel lar Neurons.″Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 91.21(1994)：9670.)。该蛋白还可在细胞表面表达，甚至能分泌到细胞外。这些特点使ANP32蛋白可参与胞质及胞核内的多种生物学过程。已有的文献报道，ANP32A和ANP32B在细胞核中可作为转录调节因子发挥作用：①作为组蛋白乙酰化转移酶抑制因子(INHAT)复合物的组成部分，参与调节转录(Kadota，S，et al.″pp32，an INHAT component，is a transcription machinery recruiter for maximalinduction of IFN-stimulated genes.″Journal of Cell Science 124.Pt 6(2011)：892.)；②作为mRNA结合蛋白HuR及核输出因子CRM1的配体，可加速富含腺苷元素的mRNA链的核输出(Brennan C M，et al.Protein Ligands to Hur Modulate Its Interactionwith Target Mrnas in Vivo[J].Jo urnal of Cell Biology，2000，151(1)：1.)，这个功能既能控制细胞宿主的mRNA(Fries，Barbara，et al.″Analysis of NucleocytoplasmicTrafficking of the HuR Ligand APRIL and Its Influe nce on CD83 Expression.″Journal of Biological Chemistry 282.7(2007)：4504-15.)，同时也能控制病毒的mRNA(Bodem，J，et al.″Foamy virus nuclear RNA export is distinct from that of otherretroviruses.″Journal of Virology 85.5(2011)：2333-2341.)。除此之外，ANP32蛋白在细胞质内也能发挥重要作用，如ANP32A可与微管相关蛋白结合(Ulitzur，N，M，et al.″Mapmodulin：a possible modulator of the interaction of microtubule-associatedproteins with micro tubules.″Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America94.10(1997)：5084.)，影响细胞内物质的运输及信号传递，维持细胞形态及细胞器的空间分布等；ANP32蛋白可激活凋亡小体，调控细胞死亡途径(Pan，Wei，et al.″PHAPI/pp32 Suppresses Tumorigenesis by StimulatingApoptosis.″Journal of Biological Chemistry 284.11(2009)：6946.)。
自2009年Shapira通过酵母双杂交方法筛选到宿主蛋白ANP32A，初步发现其与流感病毒的感染相关后，相继有科学家进行相关该蛋白家族与流感病毒相互作用研究。2011年Bradel-Tretheway等通过蛋白质组学发现ANP32A与ANP32B与流感病毒聚合酶相互结合；2014年，Watanabe等通过RANi文库筛选证明ANP32A与ANP32B能影响流感病毒感染细胞后vRNA的合成；2015年，Sugiyama等发现，ANP32A和ANP32B能促进流感病毒复制中cRNA-vRNA的合成过程，并通过CO-IP等生物学技术手段证明ANP32蛋白与流感病毒聚合酶三亚基(PB2/PB1/PA)聚合体互作，而与NP蛋白无关(Sugiyama K，et al.pp32 and APRIL arehost cell-derived regulators of influenza virus RNA synthe sis from cRNA[J].Elife，2015，4；Waanabe T，et al.Influenza virus-host interactome screen as aplatform for antiviral drug develop ment[J].Cell Host Microbe，2014，16(6)：795-805.)。随后，英国学者Wendy S.Barclay研究团队首次揭示了禽流感病毒RNA聚合酶在哺乳动物细胞中的活性与ANP32A的种属特异性相关(Long J S，et al.Species difference inANP32A underlies influenza A virus polymerase host restrictio n[J].Nature，2016，529(7584)：101-104.)。研究发现，与哺乳动物相比，禽源ANP32A在LRRs与LCAR区域之间含有33个氨基酸插入序列。这一序列特征决定了禽源ANP32A特异性激活禽源流感病毒聚合酶活性的特性。禽源流感病毒(H5N1/H7N9)只有获得PB2 E627K的突变才能使聚合酶更适应哺乳动物的ANP32A。因此推断ANP32A是支持流感病毒复制的一个重要宿主蛋白，但其与聚合酶相相互作用的具体分子作用机制仍待进一步探索。
季节性流感和全球性大流感的危害已普遍受到社会各界的关注。目前，抗流感病毒的药物研究已取得初步成果，但是，由于现有药物在临床上广泛应用，流感病毒不断发生变异，并对这些药物产生了不同程度的耐药性，使得研发与筛选新的抗流感病毒药物日益重要。本发明证明了ANP32A和ANP32B是不同种属动物细胞内共有的被流感病毒利用的宿主蛋白，且这两个蛋白或其中之一是流感病毒在宿主内的复制所必须的。更进一步的，本发明也找到了这两个蛋白上的关键氨基酸位点，关键氨基酸的突变使得流感病毒几乎不能复制，这一发现可为进一步设计抗流感药物或抗流感动物提供直接依据。
发明内容
在本发明的一个方面，涉及突变的ANP32蛋白，其具有选自以下组成的组中的一种或多种的突变：
第129位的氨基酸被置换为异亮氨酸I，赖氨酸K，天冬氨酸D，缬氨酸V，脯氨酸P，色氨酸W，组氨酸H，精氨酸R，谷氨酰胺Q，甘氨酸G，或谷氨酸E，
第130位的氨基酸被置换为天冬酰胺N，苯丙氨酸F，赖氨酸K，亮氨酸L，缬氨酸V，脯氨酸P，异亮氨酸I，甲硫氨酸M，色氨酸W，组氨酸H，精氨酸R，谷氨酰胺Q，或酪氨酸Y，
第149位的氨基酸被置换为丙氨酸A，
第151位的氨基酸被置换为丙氨酸A，和
第60和63位，第87、90、93和95位，或第112、115和118位的氨基酸被置换为丙氨酸，
当ANP32蛋白为鸡ANP32B蛋白、鸭ANP32B蛋白、火鸡ANP32B蛋白时，第129位氨基酸不是异亮氨酸I和第130位氨基酸不是天冬酰胺N，
当ANP32蛋白为鼠ANP32A时，第130位氨基酸不是丙氨酸A，
其中当所述ANP32蛋白为ANP32A蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.XP_413932.3的鸡的ANP32A蛋白的氨基酸位置；
当所述ANP32蛋白为ANP32B蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人的ANP32B蛋白的氨基酸位置，
其中优选地，第87、90、93和95位氨基酸来自哺乳动物ANP32B蛋白。
在本发明的一个方面，涉及突变的ANP32蛋白，其中选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个被缺失或被置换为丙氨酸：第61-70位置的氨基酸，第71-80位置的氨基酸，第81-90位置的氨基酸，第91-100位置的氨基酸，第101-110位置的氨基酸，第111-120位置的氨基酸，第121-130位置的氨基酸，第131-140位置的氨基酸，第141-150位置的氨基酸，第151-160位置的氨基酸，
其中当所述ANP32蛋白为ANP32A蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.XP_413932.3的鸡ANP32A蛋白的氨基酸位置；
当所述ANP32蛋白为ANP32B蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人ANP32B蛋白的氨基酸位置。
在本发明的一个方面，涉及突变的ANP32蛋白，其中当ANP32蛋白为人ANP32B蛋白时，选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个被缺失或置换为丙氨酸：第21-30位置的氨基酸，第41-50位置的氨基酸，第51-60位氨基酸或第161-170位置的氨基酸，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人ANP32B蛋白的氨基酸位置。
在本发明的一个方面，涉及突变的ANP32蛋白，其中当ANP32蛋白为鸡ANP32A蛋白，选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个被缺失或置换为丙氨酸：第161-170位置的氨基酸，第171-180位置的氨基酸或第191-200位置的氨基酸，所述氨基酸位置对应GenBank No.XP_413932.3的鸡ANP32A蛋白的氨基酸位置。
在本发明的实施方案中，ANP32蛋白选自ANP32A或ANP32B，优选为来源于鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠或马，更优选来源于鸡或人，最优选为人ANP32B，或鸡ANP32A
在本发明的一个方面，涉及ANP32蛋白在维持流感病毒的聚合酶活性中的应用，优选地，ANP32蛋白为禽源ANP32蛋白，并且所述流感病毒选自禽源或哺乳动物来源的流感病毒；或者，ANP32蛋白为哺乳动物来源的ANP32蛋白，并且所述流感病毒哺乳动物来源的流感病毒；优选地，所述流感病毒选自人、犬、禽或马流感病毒，优选地，所述ANP32蛋白选自ANP32A蛋白和ANP32B蛋白，更优选地，所述ANP32蛋白来源于鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠或马，优选地，所述ANP32蛋白不是来源于鸡的ANP32B或来源于鼠的ANP32A。
在本发明的一个方面，涉及ANP32蛋白在降低流感病毒聚合酶活性中的应用，优选地，所述流感病毒选自人、犬、禽或马流感病毒，优选地，所述ANP32蛋白选自ANP32A蛋白和ANP32B蛋白，更优选地，所述ANP32蛋白来源于鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠或马，更优选地，ANP32蛋白为权利要求1-4任一项所定义的突变的ANP32蛋白，或ANP32蛋白是来源于鸡的ANP32B蛋白或来源于鼠的ANP32A蛋白。
在本发明的一个方面，涉及降低流感病毒聚合酶活性的方法，包括将ANP32蛋白进行选自以下组成的组中的一种或多种的突变：
第129位的氨基酸被置换为异亮氨酸I，赖氨酸K，天冬氨酸D，缬氨酸V，脯氨酸P，色氨酸W，组氨酸H，精氨酸R，谷氨酰胺Q，甘氨酸G，或谷氨酸E，
第130位的氨基酸被置换为天冬酰胺N，苯丙氨酸F，赖氨酸K，亮氨酸L，缬氨酸V，脯氨酸P，异亮氨酸I，甲硫氨酸M，色氨酸W，组氨酸H，精氨酸R，谷氨酰胺Q，或酪氨酸Y，
第149位的氨基酸被置换为丙氨酸A，
第151位的氨基酸被置换为丙氨酸A，和
第60和63位，第87、90、93和95位，第112、115和118位的氨基酸被置换为丙氨酸，
当ANP32蛋白为鸡ANP32B蛋白、鸭ANP32B蛋白、火鸡ANP32B蛋白时，第129位氨基酸不是异亮氨酸和第130位氨基酸不是天冬酰胺N，
当ANP32蛋白为鼠ANP32A时，第130位氨基酸不是丙氨酸A，
其中当所述ANP32蛋白为ANP32A蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.XP_4139323的鸡ANP32A蛋白的氨基酸位置；
当所述ANP32蛋白为ANP32B蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人ANP32B蛋白的氨基酸位置，
其中优选地，第87、90、93和95位氨基酸来自哺乳动物ANP32B蛋白。
在本发明的实施方案中，其中所述流感病毒聚合酶活性丧失，
其中将ANP32蛋白进行选自以下组成的组中的一种或多种的突变：
第129位的氨基酸被置换为异亮氨酸I，赖氨酸K或天冬氨酸D，
第130位的氨基酸被置换为天冬酰胺N，苯丙氨酸F或赖氨酸K，第87、90、93和95位，第112、115和118位的氨基酸被置换为丙氨酸。
在本发明的一个方面，涉及降低流感病毒聚合酶活性的方法，包括将ANP32蛋白的选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个缺失或置换为丙氨酸：第61-70位置的氨基酸，第71-80位置的氨基酸，第81-90位置的氨基酸，第91-100位置的氨基酸，第101-110位置的氨基酸，第111-120位置的氨基酸，第121-130位置的氨基酸，第131-140位置的氨基酸，第141-150位置的氨基酸，第151-160位置的氨基酸，
其中当所述ANP32蛋白为ANP32A蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.XP_413932.3的鸡ANP32A蛋白的氨基酸位置；
当所述ANP32蛋白为ANP32B蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人ANP32B蛋白的氨基酸位置。
在本发明的实施方案中，其中所述流感病毒聚合酶活性丧失，
其中ANP32蛋白的选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个缺失或置换为丙氨酸：第71-80位置的氨基酸，第81-90位置的氨基酸，第91-100位置的氨基酸，第101-110位置的氨基酸，第111-120位置的氨基酸，第121-130位置的氨基酸，第131-140位置的氨基酸，第141-150位置的氨基酸，第151-160位置的氨基酸。
在本发明的一个方面，涉及降低流感病毒聚合酶活性的方法，包括将人ANP32B蛋白的选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个缺失或置换为丙氨酸：第21-30位置的氨基酸，第41-50位置的氨基酸，第51-60位氨基酸或第161-170位置的氨基酸，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人的ANP32B蛋白的氨基酸位置。
在本发明的一个方面，涉及降低流感病毒聚合酶活性的方法，包括将鸡ANP32A蛋白的选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个缺失或置换为丙氨酸：第161-170位置的氨基酸，第171-180位置的氨基酸或第191-200位置的氨基酸，所述氨基酸位置对应GenBank No.XP_413932.3的鸡ANP32A蛋白的氨基酸位置。
在本发明的实施方案中，其中所述流感病毒聚合酶活性丧失，
其中鸡ANP32A蛋白的选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个缺失或置换为丙氨酸：第161-170位置的氨基酸，第171-180位置的氨基酸。
在本发明的实施方案中，其中ANP32蛋白选自ANP32A或ANP32B，优选为来源于鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠或马，更优选来源于鸡或人。最优选为人ANP32B，或鸡ANP32A，优选，所述流感病毒选自人、犬、禽或马流感病毒。
在本发明的一个方面，涉及ANP32蛋白的选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个在维持流感病毒聚合酶活性中的应用，
第61-70位置的氨基酸，第71-80位置的氨基酸，第81-90位置的氨基酸，第91-100位置的氨基酸，第101-110位置的氨基酸，第111-120位置的氨基酸，第121-130位置的氨基酸，第131-140位置的氨基酸，第141-150位置的氨基酸，第151-160位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第161-170位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第171-180位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第191-200位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第21-30位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第41-50位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第51-60位氨基酸或人ANP32B蛋白的第161-170位置的氨基酸，
其中当所述ANP32蛋白为ANP32A蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.XP_413932.3的鸡ANP32A蛋白的氨基酸位置；
当所述ANP32蛋白为ANP32B蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人ANP32B蛋白的氨基酸位置，优选地，ANP32蛋白为禽源ANP32蛋白，并且所述流感病毒选自禽源或哺乳动物来源的流感病毒；
或者，ANP32蛋白为哺乳动物来源的ANP32蛋白，并且所述流感病毒哺乳动物来源的流感病毒。
在本发明的一个方面，涉及ANP32蛋白的选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个在降低流感病毒聚合酶活性中的应用，
第61-70位置的氨基酸，第71-80位置的氨基酸，第81-90位置的氨基酸，第91-100位置的氨基酸，第101-110位置的氨基酸，第111-120位置的氨基酸，第121-130位置的氨基酸，第131-140位置的氨基酸，第141-150位置的氨基酸，第151-160位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第161-170位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第171-180位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第191-200位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第21-30位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第41-50位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第51-60位氨基酸或人ANP32B蛋白的第161-170位置的氨基酸，
其中当所述ANP32蛋白为ANP32A蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.XP_413932.3的鸡ANP32A蛋白的氨基酸位置；
当所述ANP32蛋白为ANP32B蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人ANP32B蛋白的氨基酸位置，
优选地，其中ANP32蛋白选自ANP32A或ANP32B，优选为来源于鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠或马，更优选来源于鸡或人，最优选为人ANP32B，或鸡ANP32A，
优选地，所述流感病毒选自人、犬、禽或马流感病毒。
在本发明的一个方面，涉及试剂盒，其包含至少一种试剂或成组试剂，其中所述至少一种试剂或成组试剂用于确定ANP32蛋白选自以下组成的组中的一种或多种位置的氨基酸种类：第129位置的氨基酸，第130位置的氨基酸，第149位置的氨基酸，第151位置的氨基酸，第60位置的氨基酸，第63位置的氨基酸，第87位置的氨基酸，第90位置的氨基酸，第93位置的氨基酸，第95位置的氨基酸，第112位置的氨基酸，第115位置的氨基酸或第118位置的氨基酸，其中
当第129位的氨基酸为异亮氨酸I，赖氨酸K，天冬氨酸D，缬氨酸V，脯氨酸P，色氨酸W，组氨酸H，精氨酸R，谷氨酰胺Q，甘氨酸G，或谷氨酸E，
第130位的氨基酸为天冬酰胺N，苯丙氨酸F，赖氨酸K，亮氨酸L，缬氨酸V，脯氨酸P，异亮氨酸I，甲硫氨酸M，色氨酸W，组氨酸H，精氨酸R，谷氨酰胺Q，或酪氨酸Y，
第149位的氨基酸为丙氨酸A，
第151位的氨基酸为丙氨酸A时，
第60和63位，第87、90、93和95位，第112、115和118位的氨基酸为丙氨酸时，所述ANP32蛋白支持流感聚合酶活性的能力下降，
其中当所述ANP32蛋白为ANP32A蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.XP_413932.3的鸡ANP32A蛋白的氨基酸位置；
当所述ANP32蛋白为ANP32B蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人ANP32B蛋白的氨基酸位置，其中优选地，第87、90、93和95位氨基酸来自哺乳动物ANP32B蛋白。
在本发明的一个方面，涉及用于确定ANP32蛋白选自以下组成的组中的氨基酸种类的寡核苷酸引物：第129位置的氨基酸，第130位置的氨基酸，第149位置的氨基酸，第151位置的氨基酸，第60位置的氨基酸，第63位置的氨基酸，第87位置的氨基酸，第90位置的氨基酸，第93位置的氨基酸，第95位置的氨基酸，第112位置的氨基酸，第115位置的氨基酸和第118位置的氨基酸，
其中
当第129位的氨基酸为异亮氨酸I，赖氨酸K，天冬氨酸D，缬氨酸V，脯氨酸P，色氨酸W，组氨酸H，精氨酸R，谷氨酰胺Q，甘氨酸G，或谷氨酸E，
第130位的氨基酸为天冬酰胺N，苯丙氨酸F，赖氨酸K，亮氨酸L，缬氨酸V，脯氨酸P，异亮氨酸I，甲硫氨酸M，色氨酸W，组氨酸H，精氨酸R，谷氨酰胺Q，或酪氨酸Y，
第149位的氨基酸为丙氨酸A，
第151位的氨基酸为丙氨酸A，
第60、63位置的氨基酸，或第87、90、93和95位置的氨基酸，或第112、115和118位置的氨基酸为丙氨酸时，
所述ANP32蛋白支持流感聚合酶活性的能力下降，
其中当所述ANP32蛋白为ANP32A蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.XP_413932.3的鸡ANP32A蛋白的氨基酸位置；
当所述ANP32蛋白为ANP32B蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人ANP32B蛋白的氨基酸位置，
其中优选地，第87、90、93和95位氨基酸来自哺乳动物ANP32B蛋白。
在本发明的实施方案中，所述寡核苷酸引物优选至少20个碱基长度。例如至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个碱基长度。
在本发明的实施方案中，所述寡核苷酸序列选自SEQ ID NO：155-156，163-166，167-256和375-380。
在本发明的实施方案中，ANP32蛋白选自ANP32A或ANP32B，优选为来源于鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠或马，更优选来源于鸡或人。最优选为人ANP32B，或鸡ANP32A。
在本发明的一个方面，涉及生产动物的方法，包括将动物体内的ANP32蛋白进行选自由以下各项组成的组的一种或多种突变的步骤：
第129位的氨基酸被置换为异亮氨酸I，赖氨酸K，天冬氨酸D，缬氨酸V，脯氨酸P，色氨酸W，组氨酸H，精氨酸R，谷氨酰胺Q，甘氨酸G，或谷氨酸E，
第130位的氨基酸被置换为天冬酰胺N，苯丙氨酸F，赖氨酸K，亮氨酸L，缬氨酸V，脯氨酸P，异亮氨酸I，甲硫氨酸M，色氨酸W，组氨酸H，精氨酸R，谷氨酰胺Q，或酪氨酸Y，
第149位的氨基酸被置换为丙氨酸A，
第151位的氨基酸被置换为丙氨酸A，和
第60和63位，第87、90、93和95位，第112、115和118位的氨基酸被置换为丙氨酸，
第61-70位置的氨基酸，第71-80位置的氨基酸，第81-90位置的氨基酸，第91-100位置的氨基酸，第101-110位置的氨基酸，第111-120位置的氨基酸，第121-130位置的氨基酸，第131-140位置的氨基酸，第141-150位置的氨基酸，第151-160位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第161-170位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第171-180位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第191-200位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第21-30位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第41-50位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第51-60位氨基酸或人ANP32B蛋白的第161-170位置的氨基酸置换为丙氨酸，
其中当ANP32蛋白为鸡ANP32B蛋白、鸭ANP32B蛋白、火鸡ANP32B蛋白时，第129位氨基酸不是异亮氨酸I和第130位氨基酸不是天冬酰胺N，
其中当ANP32蛋白为鼠ANP32A时，第130位氨基酸不是丙氨酸A，
其中当所述ANP32蛋白为ANP32A蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.XP_413932.3的鸡ANP32A蛋白的氨基酸位置；
当所述ANP32蛋白为ANP32B蛋白时，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人ANP32B蛋白的氨基酸位置，
其中优选地，第87、90、93和95位氨基酸来自哺乳动物ANP32B蛋白。
在本发明的实施方案中，所述动物选自鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠或马。
在本发明的一个方面，涉及ANP32蛋白或ANP32蛋白的选自下述位置或区段的氨基酸作为靶标在制备用于治疗流感病毒感染导致的疾病的药物中的应用，
其中所述氨基酸选自以下氨基酸的一种或多种：第129位氨基酸，第130位氨基酸，第149位氨基酸，第150位氨基酸，第60和第63位氨基酸，第87、90、93和95位氨基酸，第112、115和118位氨基酸，第61-70位置的氨基酸，第71-80位置的氨基酸，第81-90位置的氨基酸，第91-100位置的氨基酸，第101-110位置的氨基酸，第111-120位置的氨基酸，第121-130位置的氨基酸，第131-140位置的氨基酸，第141-150位置的氨基酸，第151-160位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第161-170位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第171-180位置的氨基酸，鸡ANP32A蛋白的第191-200位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第21-30位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第41-50位置的氨基酸，人ANP32B蛋白的第51-60位氨基酸或人ANP32B蛋白的第161-170位置的氨基酸，优选地，第87、90、93和95位氨基酸为来自哺乳动物ANP32B蛋白。优选地，所述ANP32蛋白为ANP32A或ANP32B蛋白，优选来源于鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠或马，优选所述流感病毒为选自人、犬、禽或马流感病毒。
在本发明的一个方面，涉及筛选治疗流感病毒感染的候选药物的方法，包括下述步骤：
(1)将含有ANP32A和/或ANP32B蛋白的细胞系敲除所述ANP32A和ANP32B蛋白，以获得敲除ANP32A蛋白和ANP32B蛋白的细胞系，
(2)将编码ANP32A和/或ANP32B蛋白的质粒和编码流感病毒聚合酶的质粒转染步骤(1)获得的敲除细胞系，
(3)用候选物接触所述敲除的细胞系，其中所述接触可以与步骤(2)的转染同时或分开进行，
其中与含有ANP32A和/或ANP32B的细胞系相比，经步骤(3)处理的细胞系不表达流感病毒聚合酶或流感病毒聚合酶的表达下降，说明所述候选物为治疗流感病毒感染的候选药物。
在一个实施方案中，其中所述ANP32A和/或ANP32B蛋白来源于鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠或马，优选所述流感病毒为选自人、犬、禽或马流感病毒。
附图说明：
图1：PCAGGS载体图谱。
图2：PCAGGS-huANP32A载体图谱。
图3：各物种ANP32蛋白表达检测。
图4：敲除细胞系荧光定量PCR检测：A为各细胞系上huANP32A的定量检测，B为各细胞系上huANP32B的定量检测。
图5：293T野生型及敲除细胞系内源性ANP32蛋白的检测。
图6：H1N1SC09聚合酶在293T野生型及敲除细胞系上活性检测。
图7：不同聚合酶在293T野生型及敲除细胞系上的活性检测。图7A为H7N9AH13聚合酶在293T野生型及敲除细胞系上活性检测；图7B为WSN聚合酶在293T野生型及敲除细胞系上活性检测；图7C为H3N2GD11聚合酶在293T野生型及敲除细胞系上活性检测；图7D为H3N8JL89聚合酶在293T野生型及敲除细胞系上活性检测；图7E为H3N8XJ07聚合酶在293T野生型及敲除细胞系上活性检测。
图8：H1N1SC09聚合酶在DKO细胞系上补回不同剂量huANP32A或huANP32B时活性测定。
图9：H1N1SC09聚合酶(A)和H7N9AH13聚合酶(B)在DKO细胞上补回过量huANP32A或huANP32B时活性会被抑制。
图10：荧光定量检测huANP32A对H1N1SC09流感病毒RNA合成的影响。
图11：不同物种ANP32蛋白对不同流感病毒复制的影响。图11A为不同物种ANP32蛋白对H1N1SC09流感病毒复制的影响；图11B为不同物种ANP32蛋白对H7N9AH13流感病毒复制的影响；图11C为不同物种ANP32蛋白对H3N2GD11流感病毒复制的影响；图11D为不同物种ANP32蛋白对H3N8XJ07流感病毒复制的影响；图11E为不同物种ANP32蛋白对H3N8JL89流感病毒复制的影响；图11F为不同物种ANP32蛋白对H9N2ZJ12流感病毒复制的影响；图11G为不同物种ANP32蛋白对WSN流感病毒复制的影响。
图12：H1N1SC09流感病毒检测；图12A为不同细胞系上转染H1N1SC09流感病毒检测出毒量；图12B为在DKO细胞上补回ANP32蛋白检测对H1N1SC09流感病毒出毒量的影响。
图13：WSN流感病毒检测；图13A为不同细胞系上感染WSN流感病毒检测病毒滴度；图13B为在DKO细胞上补回ANP32蛋白检测对WSN流感病毒滴度的影响。
图14：H7N9亚型流感病毒PB2基因点突变与ANP32的适应性。
图15：ANP32B序列对比、截短及片段互换；图15A为ANP32B序列比对；图15B为ANP32B截短策略；图15C为huANP32B与chANP32B片段互换第一轮；图15D为huANP32B与chANP32B片段互换第二轮。
图16：ANP32B点突变；图16A为ANP32B 110-161区域序列比对；图16B为huANP32B点突变对H1N1SC09聚合酶活性的影响。
图17huANP32B单点突变129、130对H1N1SC09聚合酶活性的影响。
图18：huANP32B单点突变对H7N9AH13聚合酶活性的影响。
图19：huANP32A点突变129、130对H1N1SC09聚合酶活性的影响。
图20：huANP32A点突变对H7N9AH13聚合酶活性的影响。
图21：chANP32A点突变及chANP32B点突变对H7N9AH13聚合酶活性的影响。
图22：chANP32A129点突变体对H7N9ZJ13聚合酶活性的影响。
图23：chANP32A 129点突变体对H7N9AH13聚合酶活性的影响。
图24：chANP32A 129点突变体对WSN聚合酶活性的影响。
图25：chANP32A 130点突变体对H7N9ZJ13聚合酶活性的影响。
图26：chANP32A130点突变体对H7N9AH13聚合酶活性的影响。
图27：chANP32A130点突变体对WSN聚合酶活性的影响。
图28：huANP32B截短突变体对H7N9AH13聚合酶活性的影响。
图29：chANP32A截短突变体对H7N9ZJ13聚合酶活性的影响。
图30：chANP32A点突变体对H7N9AH13聚合酶活性的影响。
图31：huANP32B点突变体对H7N9AH13聚合酶活性的影响。
图32：huANP32A及huANP32B 129/130位氨基酸定点突变细胞系测序鉴定结果。
图33：huANP32A及huANP32B 129/130位氨基酸定点突变细胞系蛋白检测结果。
图34：H1N1SC09聚合酶在不同细胞系上的活性检测。
图35：H7N9AH13聚合酶在不同细胞系上的活性检测。
图36：禽源ANP32A蛋白的氨基酸序列比对。
图37：禽源ANP32B蛋白与huANP32B蛋白的氨基酸序列比对。
图38：鸡ANP32A蛋白与哺乳动物ANP32A蛋白的氨基酸序列比对。
图39：哺乳动物ANP32B蛋白的氨基酸序列比对。
图40：鼠ANP32B蛋白的表达检测。
图41：鼠ANP32B蛋白点突变体对H7N9AH13聚合酶活性的影响
具体实施方式
下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
实施例1.ANP32蛋白表达载体的构建
鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠、马等ANP32蛋白的核苷酸序列如下：
鸡ANP32A(chANP32A)(Gallus gallus，XM_413932.5)，人ANP32A(huANP32A)(Homosapiens，NM_006305.3)，斑胸草雀ANP32A(zfANP32A)(Taeniopygia guttata，XM_012568610.1)，鸭ANP32A(dkANP32A)(Anas platyrhynchos，XM_005022967.1)，火鸡ANP32A(tyANP32A)(Meleagris gallopavo，XM_010717616.1)，猪ANP32A(pgANP32A)(Sus scrofa，XM_003121759.6)，鼠ANP32A(muANP32A)(Mus musculus，NM_009672.3)，马ANP32A(eqANP32A)(Equus caballus，XM_001495810.5)，鸡ANP32B(chANP32B)(Gallus gallus，NM_001030934.1)，人ANP32B(huANP32B)(Homo sapiens，NM_006401.2)。
鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠、马等ANP32蛋白的氨基酸序列如下：
鸡ANP32A(chANP32A)(Gallus gallus，XP_413932.3)，人ANP32A(huANP32A)(Homosapiens，NP_006296.1)，斑胸草雀ANP32A(zfANP32A)(Taeniopygia guttata，XP_012424064.1)，鸭ANP32A(dkANP32A)(Anas platyrhynchos，XP_005023024.1)，火鸡ANP32A(tyANP32A)(Meleagris gallopavo，XP_010715918.1)，猪ANP32A(pgANP32A)(Sus scrofa，XP_003121807.3)，鼠ANP32A(muANP32A)(Mus musculus，NP_033802.2)，马ANP32A(eqANP32A)(Equus caballus，XP_001495860.2)，鸡ANP32B(chANP32B)(Gallus gallus，NP_001026105.1)，人ANP32B(huANP32B)(Homo sapiens，NP_006392.1)。
首先构建PCAGGS-Flag重组质粒，在Flag-tag(GGCAGCGGAGACTACAAGGATGACGATGACAAG，SEQ ID NO：1)的N端引入起始密码子(ATG)，C端加入终止密码子(TGA)，起始密码子之前引入NotI(GCGGCCGC，SEQ ID NO：2)酶切位点，终止密码子之后引入XhoI(CTCGAG，SEQ IDNO：3)酶切位点，并在两个酶切位点的外端引入PCAGGS载体的15bp同源臂(划横线部分)，合成Flag-tag基因片段互补的两条引物Flag-S(SEQ ID NO：4)与Flag-A(SEQ ID NO：5)，Flag-S：SEQ ID NO：4
5-AAAGAATTCGAGCTCGCGGCCGCATGGGCAGCGGAGACTACAAG GATGACGATGACAAGTGACTCGAGCTAGCAGATCTTTTT-3
Flag-A：SEQ ID NO：5
5-AAAAAGATCTGCTAGCTCGAGTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGT CTCCGCTGCCCATGCGGCCGCGAGCTCGAATTCTTT-3
取设计的上下游引物Flag-S与Flag-A各稀释至100uM(用TE buffer进行稀释)，各取10ul混匀并置于95度5min，随后关掉PCR仪自然降至室温(约2h)，该产物即为退火合成样品。商品化PCAGGS载体(见附图1，购自丰晖生物，产品编号V00514，产品货号JM004，www.fenghbio.cn)经Thermo快速限制性内切酶Not I和Xho I在37℃水浴条件双酶切1.5h，并利用胶回收试剂盒(OMEGA，货号D2500-01)回收酶切片段，得到的产物回收备用。利用In-Fusion连接酶(购自Clontech公司，货号639648)将PCAGGS双酶切产物与退火合成样品按照说明书连接，并转化DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，测序正确的质粒命名为PCAGGS-Flag质粒，作为后续实验对照质粒，大量提取备用。
根据上述的各个物种的ANP32A和ANP32B的核苷酸序列，分别合成上述各个物种的ANP32A和ANP32B的序列，合成时在基因片段C端去除终止密码子并串联入Flag-tag(SEQ IDNO：1)，在Flag-tag末端加入终止密码子(TGA)，并在合成片段两端引入Not I(SEQ ID NO：2)和Xho I(SEQ ID NO：3)酶切位点。将PCAGGS-Flag载体利用Thermo快速限制性内切酶NotI和Xho I在37℃酶切1.5h后，利用胶回收试剂盒(OMEGA，货号D2500-01)回收酶切片段。利用In-Fusion连接酶(购自Clontech公司，货号639648)将PCAGGS-Flag双酶切产物与各基因片段按照说明书连接，并转化DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，最终完成将片段插入到PCAGGS载体中。例如，PCAGGS-huANP32A的质粒图谱见附图2。其它物种ANP32A和ANP32B基因的质粒图谱与图2类似，仅替换相应基因序列。例如，PCAGGS-huANP32B质粒图谱是将huANP32B替换huANP32A的序列。
重组质粒测序正确后，各取1ug经lipofectamine 2000试剂转染293T细胞，48h后取细胞裂解液，利用免疫印迹方法(western blotting)使用Flag-抗体(购自Sigma公司，货号F1804-1MG)检测蛋白表达情况，细胞内β肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，使用抗体Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse(购自Sigma公司，货号为A1978-200UL)，结果见附图3，各物种ANP32A和ANP32B蛋白表达良好。
实施例2：细胞系的构建
我们利用CRISPR-Cas9技术进行细胞系构建。根据NCBI已公布的参考核苷酸序列human ANP32A(NM_006305.3)与human ANP32B(NM_006401.2)，利用在线软件http：//crispr.mit.edu/设计针对这两个蛋白的sgRNA(序列见表1)。
表1：sgRNA序列
如下构建pMD18T-U6重组质粒，其包含有human U6启动子序列+sgRNA序列(huANP32A或huANP32B)+sgRNAscaffold序列+TTTTTT。
首先合成基因片段，该片段包含有human U6启动子序列+huANP32A-sgRNA序列+sgRNAscaffold序列+TTTTTT，序列即SEQ ID NO：8。合成的片段直接连接到pMD-18T载体(TaKaRa，货号D101A)中，成功构建pMD18T-U6-huANPsgRNA-1重组质粒(含有huANP32AsgRNA)。以此质粒为模板，设计针对huANP32B的sgRNA引物，利用重叠PCR方法，使用KOD-FX Neo高效DNA聚合酶(货号：KFX-201，购自东洋纺)扩增(反应条件和体系参见该聚合酶的说明，除非特殊说明，在以下实施例的PCR反应中，除荧光定量PCR反应以外，均使用KOD-FX Neo高效DNA聚合酶，且反应体系和反应条件均参见该聚合酶的说明)，构建含有huANP32B的sgRNA的质粒，引物序列见表2，PCR体系及程序参考KOD-FX Neo说明书进行。所得PCR产物利用Dpn I在37°恒温水浴锅消化30分钟，然后取5ul消化产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，将测序正确的质粒即pMD18T-U6-huANPsgRNA-2(含有huANP32BsgRNA)进行后续转染实验。
表2：引物序列
表达Cas9-GFP蛋白的真核质粒pMJ920(Addgene plasmid#42234)与pMD18T-U6-huANPsgRNA-1或pMD18T-U6-huANPsgRNA-2重组质粒各取1ug，与lipofectamine 2000以1∶2.5的比例混匀，转染293T细胞。48小时后，经超速流式细胞分选系统筛选出GFP阳性细胞，并以单个细胞/孔铺于96孔板，约10天左右，挑取单细胞克隆扩大培养，然后使用SimplyP总RNA提取试剂盒(购自Bioflux，货号BSC52M1)按照操作步骤提取细胞RNA，并使用宝生物公司反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)，Cat.RR047A)合成cDNA，以cDNA为模板，利用KOD Fx Neo聚合酶扩增huANP32A及huANP32B的sgRNA靶向目标片段，扩增引物见表3，其中huANP32A扩增片段大小为390bp，huANP32B扩增片段大小为362bp。经测序验证基因缺失的单细胞克隆进行western blotting和荧光定量鉴定。huANP32A和huANP32B双敲除细胞系是在第一轮获得huANP32B单敲除细胞系后再进行一轮敲除筛选，转染体系及筛选步骤如上。
表3：huANP32A及huANP32B敲除细胞系鉴定引物序列
Western bloting使用抗体为Anti-PHAP1 antibody(购自Abcam公司，货号为ab51013)和Anti-PHAPI2/APRIL antibody[EPR14588](购自Abcam公司，货号为ab200836)；β肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，使用抗体Monoclonal Anti-β-Actin antibodyproduced in mouse(购自Sigma公司，货号为A1978-200UL)，结果见附图4。敲除细胞系荧光定量鉴定引物见表4，β肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，荧光PCR鉴定结果见图5。基于以上，我们成功构建了huANP32A单敲除的细胞系(AKO)、huANP32B单敲除的细胞系(BKO)及huANP32A和ANP32B双敲除的细胞系(DKO)，并用于后续实验。荧光定量PCR采用TAKARA公司的Premix Ex TaqTM II(Tli RnaseH plus)(货号为RR820A)试剂并按照说明书步骤进行操作(后面的荧光定量PCR同样采用TAKARA公司的试剂盒进行)。
表4：huANP32A及huANP32B荧光定量引物序列
实施例3：流感聚合酶活性检测
本发明中涉及的流感聚合酶报告系统包括流感聚合酶PB2、PB1和PA蛋白，及核蛋白NP。这些蛋白分别来源于人流感H1N1亚型A/Sichuan/01/2009(H1N1SC09)和A/WSN/1933(WSN)，人流感H7N9亚型A/Anhui/01/2013(H7N9AH13)，犬流感H3N2亚型A/canine/Guangdong/1/2011(H3N2GD11)，禽流感H9N2亚型A/chicken/Zhejiang/B2013/2012(H9N2ZJ12)和H7N9亚型A/chicken/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013(H7N9ZJ13)，马流感A/equine/Jilin/1/1989(H3N8JL89)和A/equine/Xinjiang/3/2007(H3N8XJ07)。这些流感亚型的PB2，PB1，PA和NP蛋白的序列如表5所示。
表5.PB2，PB1，PA和NP蛋白的核苷酸序列
构建包含各个流感病毒亚型的上述蛋白的质粒，例如H1N1SC09聚合酶包含来源于人流感H1N1亚型A/Sichuan/01/2009(H1N1SC09)的PB2、PB1和PA蛋白，及核蛋白NP，命名为H1N1SC09聚合酶报告系统，将PB2，PB1，PA和NP蛋白分别用载体PCAGGS构建质粒，分别命名为PB2质粒，PB1质粒，PA质粒和NP质粒。其它类同。
以H1N1SC09聚合酶报告系统为例，构建过程如下：
按照QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(购自QIAGEN，货号为52904)操作手册提取H1N1SC09毒株(张乾义硕士论文““甲型H1N1流感病毒A/Sichuan/01/2009株反向遗传操作系统的建立，甘肃农业大学，2011)mRNA，再按照M-MLV反转录酶试剂盒(购自Invitrogen，货号28025-013)说明书以Uni12(AGCAAAAGCAGG，SEQ ID NO：21)为反转录引物合成cDNA。根据各基因片段序列信息，设计PCR引物(见表7)，在两端分别引入15bp PCAGGS同源臂，利用KODFX Neo高效聚合酶合成目的基因，随后利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(购自Vazyme品牌，货号C112-01)无缝克隆试剂盒，按照说明书将H1N1SC09各基因扩增片段与实施例1中双酶切的PCAGGS载体室温连接30min，连接产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序。将测序正确的质粒分别命名为PB2质粒，PB1质粒，PA质粒和NP质粒，并用于后续实验。其它类同。其它各个毒株来源参见表6。
表6
表7：聚合酶构建引物：
我们构建了一个报告质粒(pMD18T-vLuc)用于检测聚合酶活性，该报告质粒以pMD18T质粒为骨架，包含目的序列，该目的序列特征为：在Firefly luciferase的蛋白编码序列两端分别引入H3N8JL89株HA基因的5’端非编码区(序列为：agcaaaagcagggg，SEQ IDNO：78)及3’端非编码区(序列为：gtatactaataattaaaaacacccttgtttctact，SEQ ID NO：79)，在该序列3’端引入人polI启动子，在5’端引入鼠pol I终止序列。目的序列见下：鼠polI终止序列(加粗划线部分)+HA基因的5’端非编码区(红色斜体部分)+Firefly luciferase基因序列+HA基因的3’端非编码区(绿色斜体部分)+人polI启动子(加粗划线部分)，SEQ IDNO：80。合成的片段直接连入pMD18-T载体，即为报告质粒pMD18T-vLuc。
将该报告质粒与流感聚合酶系统共转染293T后，聚合酶复合体可识别Fireflyluciferase两端的病毒非编码序列，从而启动Firefly luciferase基因vRNA、cRNA及mRNA的合成。为了使聚合酶系统更趋于稳定及严谨，我们引入聚合酶双荧光报告系统，即在上述流感聚合酶报告系统中另外加入海肾荧光素酶(pRL-TK)作为内参，并建立了稳定转染体系：以12孔板为例，每孔加入PB1质粒(80ng)、PB2质粒(80ng)、PA质粒(40ng)、NP质粒(160ng)、pMD18T-vLuc质粒(80ng)和pRL-TK质粒(10ng，Promega货号：E2241，GenBank号：AF025846)，使用转染试剂lipo2000进行转染。转染24h后，将细胞液弃掉，100ul细胞裂解液/孔(passive lysis buffer，来源于双荧光素酶试剂盒(Promega))裂解细胞，然后使用双荧光素酶试剂盒(Promega)利用Centro XS LB 960luminometer(Bertholdtechnologies)仪器进行测量。以海肾荧光素酶为内参，比值即可代表聚合酶的活性。
我们将H1N1SC09聚合酶以上述体系转染在实施例2中构建的细胞系AKO、BKO、DKO及野生型293T细胞，每组设置3个重复孔，转染24h后检测，H1N1SC09聚合酶在AKO与BKO上的活性与野生型293T细胞并无差异，而在DKO细胞上H1N1SC09聚合酶活性下降10000倍以上，见附图6。所得结果经生物学软件GraphPad Prism 5(https：//www.graphpad.com)处理并经单因素方差分析(one-way ANOVA)及Dunnett t检验分析，各实验组与对照组差异结果见图表符号：ns代表无差异，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001，****代表P＜0.0001。其它涉及聚合酶活性检测的附图中符号ns，*，**，***以及****代表的含义同上，处理方式同上。
H7N9AH13、WSN、H3N2GD11、H3N8JL89、H3N8XJ07聚合酶按照H1N1SC09聚合酶同样方法分别转染不同细胞系AKO、BKO、DKO及野生型293T细胞，结果均是在AKO与BKO上的活性与野生型293T细胞并无差异，而在DKO细胞上聚合酶活性下降10000倍左右，结果见附图7A-E。
将实施例1中构建的huANP32A及huANP32B表达质粒：PCAGGS-huANP32A和PCAGGS-huANP32B与H1N1SC09聚合酶共转染DKO细胞，具体转染体系：以12孔板为例，每孔加入H1N1SC09PB1质粒(80ng)、PB2质粒(80ng)、PA质粒(40ng)、NP质粒(160ng)、pMD18T-vLuc质粒(80ng)、pRL-TK质粒(10ng)和不同剂量的ANP32A和ANP32B蛋白，ANP32A和ANP32B蛋白质粒的具体剂量分别选自以下剂量：0pg、10pg、100pg、1ng、5ng、10ng、20ng、100ng、500ng、1ug，同时设置PCAGGS-Flag空载体对照，质粒总量以PCAGGS-Flag空载体补齐，每组设置3个重复孔。转染后24h裂解细胞，按照上述步骤检测聚合酶活性。
结果显示huANP32A和ANP32B蛋白的补回能恢复聚合酶的活性，并呈剂量依赖性，在20ng时达到平台期，可以恢复聚合酶活性3000倍左右。huANP32A与huANP32B蛋白有相同趋势的活性曲线，且在平台期二者没有叠加效应，见附图8。因此聚合酶对huANP32A和ANP32B蛋白呈剂量依赖性，且剂量需求量低。而当huANP32A与huANP32B蛋白过量时，反而会抑制聚合酶活性，结果见附图9A。将实施例1中构建的huANP32A及huANP32B表达质粒以上述不同剂量与H7N9AH13聚合酶共同转染DKO细胞，得到与H1N1SC09相似的结果，见附图9B。
实施例4：荧光定量检测ANP32蛋白对流感病毒RNA合成的影响
利用real time PCR检测了在野生型293T与双敲除细胞系DKO上流感病毒cRNA、vRNA和mRNA的合成差异。首先将野生型293T与双敲除细胞系DKO细胞铺于12孔板中，在293T细胞上转染实施例3中的H1N1SC09聚合酶双荧光报告系统，转染体系为：PB1质粒(80ng)、PB2质粒(80ng)、PA质粒(40ng)、NP质粒(160ng)、pMD18T-vLuc质粒(80ng)、pRL-TK质粒(10ng)和空载体PCAGGS-Flag质粒(20ng)；在DKO细胞上转染实施例3中的H1N1SC09聚合酶双荧光报告系统，转染体系为：PB1质粒(80ng)、PB2质粒(80ng)、PA质粒(40ng)、NP质粒(160ng)、pMD18T-vLuc质粒(80ng)、pRL-TK质粒(10ng)和PCAGGS-huANP32A质粒(20ng)，同时设置空载体PCAGGS-Flag质粒(20ng)作为阴性对照。24h后分别提取细胞总RNA，并利用特定引物反转录(见表8)，分别合成cRNA、vRNA和mRNA的第一条cDNA，随后以特异性引物(见表9)进行荧光定量PCR，内参基因β-actin反转录引物使用随机引物(试剂盒内含)，而β-actin荧光定量引物见实施例2的表4。结果表明，与野生型相比，双敲除细胞系上病毒cRNA、vRNA和mRNA 合成都极显著减低(约30-50倍)，这表明在缺失ANP32A和ANP32B的细胞系上，流感病毒RNA几乎不能复制。当在双敲除细胞系上补回人ANP32A后，RNA的复制合成均能得到恢复，见附图10。以huANP32B质粒代替huANP32A质粒，重复上述实验过程，发现人的ANP32B也有同样功能(数据类似图10的DKO+huANP32A)。这说明ANP32A和ANP32B蛋白参与到流感病毒RNA的合成与复制中，并在其中起决定作用。
表8：反转录引物
表9：荧光定量PCR引物
实施例5：ANP32蛋白对流感病毒复制的影响
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将实施例1中构建的不同物种ANP32A和ANP32B蛋白质粒与H1N1SC09聚合酶报告系统6个质粒共同转染，转染体系为：PB1质粒(80ng)、PB2质粒(80ng)、PA质粒(40ng)、NP质粒(160ng)、pMD18T-vLuc质粒(80ng)、pRL-TK质粒(10ng)和ANP32A或ANP32B蛋白质粒(20ng)，同时设置空载体PCAGGS-Flag(20ng)作为阴性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，如实施例3所述裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与空载体相比，禽源ANP32A如chANP32A、dkANP32A、zfANP32A、tyANP32A，哺乳动物ANP32如huANP32A、pgANP32A、eqANP32A、huANP32B都可以支持H1N1SC09聚合酶活性，而chANP32B和muANP32A这两个蛋白并不具有支持H1N1SC09聚合酶活性的能力，结果见附图11的图A。
以H7N9AH13聚合酶报告系统代替H1N1SC09聚合酶报告系统重复上述实验，结果显示：与空载体相比，禽源ANP32A如chANP32A、dkANP32A、zfANP32A、tyANP32A，哺乳动物ANP32如huANP32A、pgANP32A、eqANP32A、huANP32B都可以支持H7N9AH13聚合酶活性，而chANP32B和muANP32A这两个蛋白并不具有支持H7N9AH13聚合酶活性的能力，结果见附图11的图B。
以H3N2GD11聚合酶报告系统代替H1N1SC09聚合酶报告系统重复上述实验，结果显示：与空载体相比，禽源ANP32A如chANP32A、dkANP32A、zfANP32A、tyANP32A，哺乳动物ANP32如huANP32A、pgANP32A、eqANP32A、huANP32B都可以支持H3N2GD11聚合酶活性，而chANP32B和muANP32A这两个蛋白并不具有支持H3N2GD11聚合酶活性的能力，结果见附图11的图C。
以H3N8XJ07聚合酶报告系统代替H1N1SC09聚合酶报告系统重复上述实验，结果显示：与空载体相比，禽源ANP32A如chANP32A、dkANP32A、zfANP32A、tyANP32A，哺乳动物ANP32如huANP32A、pgANP32A、eqANP32A、huANP32B都可以支持H3N8XJ07聚合酶活性，而chANP32B和muANP32A这两个蛋白并不具有支持H3N8XJ07聚合酶活性的能力，结果见附图11的图D。
以H3N8JL89聚合酶报告系统代替H1N1SC09聚合酶报告系统重复上述实验，结果显示：与空载体相比，禽源ANP32A如chANP32A、dkANP32A、zfANP32A、tyANP32A可以支持H3N8JL89聚合酶活性，而chANP32B和哺乳动物ANP32如huANP32A、pgANP32A、eqANP32A、huANP32B、muANP32A都不支持H3N8JL89聚合酶活性，结果见附图11的图E。
以H9N2ZJ12聚合酶报告系统代替H1N1SC09聚合酶报告系统重复上述实验，结果显示：与空载体相比，禽源ANP32A如chANP32A、dkANP32A、zfANP32A、tyANP32A可以支持H9N2ZJ12聚合酶活性，而chANP32B和哺乳动物ANP32如huANP32A、eqANP32A、huANP32B、muANP32A都不支持H9N2ZJ12聚合酶活性，pgANP32A基本不支持H9N2ZJ12聚合酶活性。结果见附图11的图F。
以WSN聚合酶报告系统代替H1N1SC09聚合酶报告系统重复上述实验，结果显示：与空载体相比，禽源ANP32A如chANP32A、dkANP32A、zfANP32A、tyANP32A，哺乳动物ANP32如huANP32A、pgANP32A、eqANP32A、huANP32B都可以支持WSN聚合酶活性，而chANP32B和muANP32A这两个蛋白并不具有支持WSN聚合酶活性的能力，结果见附图11的图G。
实施例6：H1N1SC09流感病毒转染细胞系
利用流感病毒反向遗传系统针对ANP32A和ANP32B蛋白对病毒复制的影响进行进一步探究。将流感H1N1SC098个基因片段(PB2，PB1，PA，NP，HA，NA，M和NS)分别连入具有双启动子的pBD载体中(Joumal of Virology，Sept.2005，p12058-12064，“Molecular Basis ofReplication of Duck H5N1 influencza Viruses in a Mammalian Mouse Model；“甲型H1N1流感病毒A/Sichuan/01/2009株反向遗传操作系统的建立”，张乾义等，中国兽医科学，2011，41(05)：448-452)。
pBD载体构建步骤如下：以pCI载体(购自promega公司，货号E1841，GenBank号为U47120)为骨架，将Pol-HDVR表达盒反向插入XbaI酶切位点内。Pol-HDVR表达盒序列为人工合成，序列为SEQ ID NO：86。即将pCI载体经XbaI限制性酶(NEB，货号R0145S)酶切后，使用胶回收试剂盒(OMEGA，货号D2500-01)回收线性化载体，并经去磷酸化酶CIAP(购自TAKARA公司，货号D2250)按照说明书处理，然后回收待用。人工合成的Pol-HDVR表达盒与pCI载体酶切后片段左右臂均有15bp同源臂，随后利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(购自Vazyme品牌，货号C112-01)无缝克隆试剂盒，按照说明书将Pol-HDVR表达盒片段与pCI线性化载体室温连接30min，连接产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序。测序正确的质粒即为pBD双向表达载体。
按照张乾义等；“甲型H1N1流感病毒A/Sichuan/01/2009株反向遗传操作系统的建立”，中国兽医科学，2011，41(05)：448-452和张乾义硕士论文““甲型H1N1流感病毒A/Sichuan/01/2009株反向遗传操作系统的建立”，甘肃农业大学，2011年的方法，如下构建H1N1SC09pBD 8质粒系统：
按照QIAamp Viral RNA Kit试剂盒操作手册提取H1N1SC09毒株mRNA，再按照Invitrogen M-MLV试剂盒说明书以Uni12(AGCAAAAGCAGG，SEQ ID NO：21)为反转录引物合成cDNA。根据各基因片段序列信息(PB2的序列为SEQ ID NO：87，PB1的序列为SEQ ID NO：88，PA的序列为SEQ ID NO：89，NP的序列为SEQ ID NO：90，HA的序列为SEQ ID NO：91，NA的序列为SEQ ID NO：92，M的序列为SEQ ID NO：93和NS的序列为SEQ ID NO：94)，设计PCR引物(见表10)，在两端分别引入15bp pBD同源臂，利用KOD FX Neo高效聚合酶扩增目的基因及线性化pBD载体，随后利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(购自Vazyme品牌，货号C112-01)无缝克隆试剂盒，按照说明书将H1N1SC09各基因扩增片段与pBD线性化载体室温连接30min，连接产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序。将测序正确的质粒分别命名为pBD-H1N1SC09-PB2质粒、pBD-H1N1SC09-PB1质粒、pBD-H1N1SC09-PA质粒、pBD-H1N1SC09-NP质粒、pBD-H1N1SC09-HA质粒、pBD-H1N1SC09-NA质粒、pBD-H1N1SC09-M质粒、pBD-H1N1SC09-NS质粒并用于后续实验。
表10：H1N1SC09pBD八质粒构建引物
将实施例2中构建的细胞系AKO、BKO、DKO以及野生型293T细胞系分别计数并以4x105/孔铺于6孔板中。37℃培养箱培养20h后，将H1N1SC09pBD 8质粒系统以每个质粒0.5ug转染野生型293T及敲除细胞系，转染后分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h收集细胞上清，利用NP双抗夹心ELISA方法测定病毒产量：96孔ELISA板先以1ug/孔NP单抗2B8A11(王压娣，温坤，丘立文等，A型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法的建立和临床应用，2009，广东医学.30(5)：703-705)包被，4℃过夜。以1xPBST洗涤液润洗3次，摇床震荡，每次5分钟，清洗完后将板子拍干净，加入5％小牛血清为封闭液，37℃封闭2h。再次以1xPBST洗涤液润洗板子3次，摇床震荡，每次5分钟，清洗完后将板子拍干净，加入待测样品。待测样品是以10％胎牛血清+0.1％TritonX-100为样品稀释液，其中NP蛋白(NP蛋白构建质粒pET30a-NP引自硕士论文：姬媛媛.马流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立及其初步应用[D].中国农业科学院，2011)为标准品，2倍倍比稀释，收集的细胞上清液5倍倍比稀释。每个样品设置3个梯度，2个重复孔。37℃孵育2h，以1xPBST洗涤液润洗3次，每次5分钟，清洗完后将板子拍干净，1ug/孔加入NP单抗C16A15株(王压娣，温坤，丘立文等，A型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法的建立和临床应用，2009，广东医学.30(5)：703-705)，37℃孵育1h，弃去，以1xPBST洗涤液润洗5次，摇床震荡，每次5分钟。清洗完毕后，加入1∶1混合的AB显色液(购自北京泰天河生物技术公司，货号ME142)100ul/孔，显色10min。加入50ul/孔2M H2SO4终止，使用biotech Exl50酶标仪检测OD450nm。以NP蛋白标准品绘制标准曲线并计算待测样品的浓度。结果显示：与293T细胞相比，转染后AKO/BKO细胞上清中病毒含量有着相似的生长曲线，而DKO细胞上清中几乎检不到病毒粒子。这说明DKO细胞已不支持病毒的复制及生长，结果见附图12的图A。说明单独敲除ANP32A或ANP32B不影响病毒的复制及生长。
将实施例2中构建的DKO细胞系计数并以3x105/孔铺于6孔板中。37℃培养箱培养20h后，设置转染孔：1ug空载体PCAGGS-Flag、1ug PCAGGS-huANP32A、1ug PCAGGS-huANP32B、0.5ugPCAGGS-huANP32A+0.5ugPCAGGS-huANP32B。转染24h后，将H1N1SC09pBD 8质粒系统以每个质粒0.5ug转染不同处理组细胞，转染后分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h收集细胞上清，利用NP双抗夹心ELISA方法测定病毒产量，具体步骤见上述。结果显示：与空载体PCAGGS-Flag相比，补回huANP32A、补回huANP32B及同时补回huANP32A和huANP32B蛋白都能很好的支持病毒的复制，结果见附图12的图B。综上，huANP32A或huANP32B蛋白在H1N1SC09的复制中是不可或缺的。
实施例7：H1N1/WSN流感病毒感染实验
将实施例2中构建的细胞系AKO、BKO、DKO以及野生型293T细胞系分别计数并以4x105/孔铺于6孔板中。37℃培养箱培养20h后，以0.01MOI的WSN病毒(Neumann G；etal.Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica，1999，96(16)：9345-50)感染细胞，病毒吸附2h后，吸弃病毒感染液，用1xPBS缓冲液润洗两遍，然后每孔加入2ml含1％胰酶(sigma)+1％双抗(gibco公司)+0.5％胎牛血清(sigma)的细胞维持液，分别在感染后0h、12h、24h、36h、48h取细胞感染上清，冻于-80℃备用。将MDCK细胞(犬肾细胞系，购自中监所)以1.5x104/孔铺于96孔板中，将上述所得上清液用培养液DMEM(Hyclone)以10倍倍比稀释，100ul/孔接入96孔板中，每个梯度8个重复。病毒吸附2h后，弃去病毒液并用1xPBS缓冲液润洗两遍，随后每孔加入100ul含2％胎牛血清(sigma公司)+1％双抗(gibco公司)+1％胰酶(sigma)的细胞维持液，48h后观察细胞病变并计数，按照Reed-Muench方法计算不同处理组不同时间点病毒TCID50，最后用Graphpadprism 5软件绘制病毒生长曲线。结果显示：AKO、BKO细胞上的病毒生长曲线与野生型293T细胞一致，而DKO细胞几乎不支持病毒生长。见附图13A。
将双敲除细胞系(DKO)以4x105/孔铺于6孔板中，20h后，设置四个转染组：PCAGGS-huANP32A质粒(1ug)、PCAGGS-huANP32B质粒(1ug)、PCAGGS-huANP32A+PCAGGS-huANP32B(0.5ug+0.5ug)、PCAGGS-Flag空载体(1ug)。转染24h后，用0.01MOI的WSN病毒量感染不同处理组细胞，病毒吸附2h后，吸弃病毒感染液，用1xPBS缓冲液润洗两遍，然后每孔加入2ml含1％胰酶(sigma)+1％双抗(gibco公司)+0.5％胎牛血清(sigma)的细胞维持液，分别在感染后0h、12h、24h、36h、48h取细胞感染上清，冻于-80℃备用。将MDCK细胞以1.5x104/孔铺于96孔板中，将上述所得上清液以10倍倍比稀释，100ul/孔接入96孔板中，每个梯度8个重复。病毒吸附2h后，弃去病毒液并用1xPBS缓冲液润洗两遍，随后加入细胞维持液，48h后观察细胞病变并计数，按照Reed-Muench方法计算不同处理组不同时间点病毒TCID50，最后用Graphpad prism 5软件绘制病毒生长曲线。结果显示：与空载体相比，单独补回huANP32A或huANP32B都可以使病毒恢复在DKO细胞上的生长，与双补回huANP32A和huANP32B的病毒生长曲线一致。结果见附图13B。
说明单独敲除huANP32A或huANP32B不影响病毒的复制及生长，huANP32A与huANP32B对流感病毒的复制及生长存在功能补偿作用。
实施例8：ANP32A和ANP32B蛋白对同源病毒或异源病毒突变后对于聚合酶复制的影响
H7N9亚型流感病毒PB2基因点突变载体构建
对人源H7N9分离株的PB2基因上的一些关键氨基酸位点进行分析，发现与禽源分离株相比，人源分离株存在一些已报道的宿主适应性相关的点突变，如A588V、Q591K、Q591R、V598I、E627K、D701N等(Hu et al.，2017，PB2 substitutions V598T/I increasethe virulence of H7N9 influenza Avirus in mam mals.Virology.501，92-101.；Moket al.，2014，Amino acid substitutions in polymerase basic protein 2genecontribute to the pathog enicity of the novel A/H7N9 influenza virus inmammalian hosts.Joumal of virology.88(6)，3568-3576；Xiao et al.，2016，PB2-588 Vpromotes the mammalian adaptation of H10N8 ，H7N9 and H9N2 avian influenzaviruses.Sci Rep.6，19474.；Yamayoshi et al.，2015，Amino acids substitutions inthe PB2 protein of H7N9 influenza A viruses are import ant for virulence inmammalian hosts[J].Sci Rep，2015，5：8039.；Zhang et al.，2014，The PB2 E627Kmutation contributes to the high polymerase activity and enhanced replication of H7N9 influenza virus.J Gen Virol.95(Pt 4)，779-786.)，即在禽源流感毒株上进行A588V、Q591K、Q591R、V598I、E627K或D701N点突变后，毒株变得适应于人体。
(1)突变PB2基因及质粒构建
我们针对禽源H7N9流感A/chicken/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013(H7N9ZJ13)的PB2进行上述六个位置的单点突变，突变引物如表11所示(划线部分为突变碱基)，以禽源H7N9(H7N9ZJ13)PB2质粒为模板，利用KOD-FX Neo高效DNA聚合酶扩增，所得PCR产物利用Dpn I在37℃恒温水浴锅消化30分钟，然后取5ul消化产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，测序正确的质粒大量提取备用。分别获得PB2(A588V)，PB2(Q591K)、PB2(Q591R)、PB2(V598I)、PB2(E627K)和PB2(D701N)突变基因。
表11：突变引物
(2)huANP32A和huANP32B对聚合酶复制的影响
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将实施例1中构建的PCAGGS-chANP32A、PCAGGS-huANP32A、pCAGGS-huANP32B质粒以及空载体PCAGGS-Flag分别与H7N9ZJ13聚合酶报告系统质粒共同转染，转染体系为：PB1质粒(80ng)、PB2质粒(80ng，即分别使用PB2(A588V)，PB2(Q591K)、PB2(Q591R)、PB2(V598I)、PB2(E627K)和PB2(D701N))、PA质粒(40ng)、NP质粒(160ng)、pMD18T-vLuc质粒(80ng)、pRL-TK质粒(10ng)和ANP32蛋白质粒(20ng)，同时设置空载体PCAGGS-Flag(20ng)作为阴性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与空载体相比，chANP32A、huANP32A及huANP32B都能有效地促进带有A588V、Q591K、Q591R、V598I、D701N、E627K点突变的聚合酶活性；在huANP32A 和huANP32B缺失的情况下，这些点突变均不能使聚合酶获得在293T上复制的能力，这些结果都表明，对于无论是人源流感毒株还是禽源流感毒株经过突变从而适应人体的突变毒株在人体中的复制而言，huANP32A或huANP32B均是H7N9聚合酶能在293T上的复制的先决条件。结果见附图14。
实施例9：ANP32蛋白功能域的确定
根据实施例5中的结果，显示chANP32B这个蛋白不支持聚合酶活性。
通过比对chANP32B、huANP32B、pgANP32B的蛋白序列，发现ANP32B的序列存在差异(图15A)。根据UniProtKB数据库展示huANP32B蛋白的功能域：1-41aa为LRR1区域；42-110aa为LRR2，3&4区域；111-161aa为LRRCT区域；162-251aa为LCAR区域。根据huANP32B蛋白的功能域，进行huANP32B基因片段与chANP32B基因片段的替换，基因片段替换策略见附图15B。
首先将huANP32B基因序列分为1-161aa和162-262aa两个片段，利用同源重组PCR方法，设计引物将相应片段替换为chANP32B片段，构建重组质粒。
例如1-161aa片段的替换，首先以PCAGGS-chANP32B质粒为模板，KOD-FX Neo高效DNA聚合酶扩增缺失1-161aa基因片段的PCAGGS-chANP32BΔ1-161基因(引物为SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126)，然后再以PCAGGS-huANP32B质粒为模板扩增huANP32B(1-161)片段(引物为SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128)，扩增huANP32B(1-161)片段的引物两端分别含有15bp碱基与PCAGGS-chANP32BΔ1-161基因的左右臂相同。片段完成扩增后，回收后并利用In-Fusion连接酶(购自Clontech公司)，按照说明书将两片段连接，并转化DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，测序正确的质粒命名为chANP32B(162-262)，并大量提取备用。引物见表12。
按照上述方法，构建chANP32B(1-161)重组质粒。首先以PCAGGS-chANP32B质粒为模板，KOD-FX Neo高效DNA聚合酶(货号：KFX-201，购自东洋纺)扩增缺失162-262aa基因片段的PCAGGS-chANP32BΔ162-262基因(引物为SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130)，然后再以PCAGGS-huANP32B质粒为模板扩增huANP32B(162-262)片段(引物为SEQ ID NO：131和SEQID NO：132)，扩增huANP32B(162-262)片段的引物两端分别含有15bp碱基与PCAGGS-chANP32BΔ162-262基因的左右臂相同。片段完成扩增后，回收后并利用In-Fusion连接酶(购自Clontech公司)，按照说明书将两片段连接，并转化DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，测序正确的质粒命名为chANP32B(1-161)，并大量提取备用。引物见表12。
表12：引物
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将PCAGGS-huANP32B、PCAGGS-chANP32B、PCAGGS-chANP32B(1-161)和PCAGGS-chANP32B(162-262)质粒分别与H1N1SC09聚合酶报告系统共转染DKO细胞系，转染体系为：PB1质粒(80ng)、PB2质粒(80ng)、PA质粒(40ng)、NP质粒(160ng)、pMD18T-vLuc质粒(80ng)、pRL-TK质粒(10ng)和ANP32蛋白质粒(20ng)，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果见图15C显示：chANP32B(1-161)失去了支持H1N1SC09聚合酶活性的能力，而chANP32B(162-262)依然保留了支持H1N1SC09聚合酶活性的能力。因此，ANP32B蛋白支持聚合酶活性的关键区域位于1-161aa内。
如上所述进行同源重组PCR，以huANP32B为骨架，将chANP32B 1-161aa进一步分成1-41aa、42-110aa、111-161aa三个区域并分别替换PCAGGS-huANP32B相应片段构建重组质粒PCAGGS-chANP32B(1-41)(以PCAGGS-huANP32B质粒为模板，使用引物对SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：134扩增PCAGGS-hu32BΔ(1-41)基因片段；以PCAGGS-chANP32B质粒为模板，使用引物对SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136扩增chANP32B(1-41)基因片段)、PCAGGS-chANP32B(42-110)(以PCAGGS-huANP32B质粒为模板，使用引物对SEQ ID NO：137和SEQ IDNO：138扩增PCAGGS-hu32BΔ(42-110)基因片段；以PCAGGS-chANP32B质粒为模板，使用引物对SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140扩增chANP32B(42-110)基因片段)和PCAGGS-chANP32B(111-161)(以PCAGGS-huANP32B质粒为模板，使用引物对SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142扩增PCAGGS-hu32BΔ(111-161)基因片段；以PCAGGS-chANP32B质粒为模板，使用引物对SEQID NO：143和SEQ ID NO：144扩增chANP32B(111-161)基因片段)。引物见表13。
表13：引物
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将PCAGGS-huANP32B、PCAGGS-chANP32B、PCAGGS-chANP32B(1-41)、PCAGGS-chANP32B(42-110)和PCAGGS-chANP32B(111-161)质粒分别与H1N1SC09聚合酶报告系统共转染DKO细胞系，转染体系为：PB1质粒(80ng)、PB2质粒(80ng)、PA质粒(40ng)、NP质粒(160ng)、pMD18T-vLuc质粒(80ng)、pRL-TK质粒(10ng)和ANP32蛋白质粒(20ng)，每组设置3个重复孔。转染24h后，如实施例3所述裂解细胞检测聚合酶活性，结果见图15D显示：PCAGGS-chANP32B(111-161)重组质粒失去了对H1N1SC09聚合酶活性的支持，而PCAGGS-chANP32B(1-41)和PCAGGS-chANP32B(42-110)重组质粒依然保持了对H1N1SC09聚合酶活性的支持。
如上所述进行同源重组PCR，将PCAGGS-huANP32B相对应111-161aa序列替换PCAGGS-chANP32B相应片段(以PCAGGS-chANP32B质粒为模板，使用引物对SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：146扩增PCAGGS-ch32BΔ(111-161)基因片段；以PCAGGS-huANP32B质粒为模板，使用，引物对SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148扩增huANP32B(111-162)基因片段)，构建PCAGGS-chANP32B(hu111-161)重组质粒，引物见表14。按上述体系与H1N1SC09聚合酶报告系统共转染DKO细胞系，如实施例3所述检测聚合酶活性，结果见图15D(chANP32B(hu111-161)一栏)，表明，chANP32B(hu111-161)获得了支持H1N1SC09聚合酶活性的能力，这进一步表明ANP32B蛋白支持聚合酶活性的关键区域位于111-161aa内。
表14：引物
为了进一步确定关键区域，比对chANP32B、huANP32B、pgANP32B的蛋白序列发现，huANP32B与pgANP32B蛋白111-161aa区域内氨基酸相对保守，而chANP32B与二者存在主要8个氨基酸的差异(分别为位置113，116，127，129，130，137，150和160)，见图16A。针对huANP32B序列上这8个氨基酸设计突变引物(引物见列表15，下划线部分为突变碱基)，如前所述使用同源重组方法，利用KOD FX Neo聚合酶，以PCAGGS-huANP32B质粒为模板，分别构建huANP32B E113P(使用引物对SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：150)、K116H(使用引物对SEQID NO：151和SEQ ID NO：152)、N127M(使用引物对SEQ ID NO：153和SEQ ID NO：154)、N129I/D130N(使用引物对SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：156)、K137T(使用引物对SEQ IDNO：157和SEQ ID NO：158)、R150A(使用引物对SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：160)、A160P(使用引物对SEQ ID NO：161和SEQ ID NO：162)点突变体，分别命名为PCAGGS-huANP32BE113P、PCAGGS-huANP32B K116H、PCAGGS-huANP32B N127M、PCAGGS-huANP32B N129I/D130N、PCAGGS-huANP32B K137T、PCAGGS-huANP32B R150A、PCAGGS-huANP32B A160P，经测序验证正确后用于下一步转染。
表15：氨基酸突变引物
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将PCAGGS-Flag、PCAGGS-huANP32B、PCAGGS-chANP32B及PCAGGS-huANP32B点突变质粒，即PCAGGS-huANP32B E113P、PCAGGS-huANP32B K116H、PCAGGS-huANP32B N127M、PCAGGS-huANP32B N29I/D130N、PCAGGS-huANP32B K137T、PCAGGS-huANP32B R150A、PCAGGS-huANP32B A160P分别与H1N1SC09聚合酶报告系统共转染DKO细胞系，转染体系为：PB1质粒(80ng)、PB2质粒(80ng)、PA质粒(40ng)、NP质粒(160ng)、pMD18T-vLuc质粒(80ng)、pRL-TK质粒(10ng)和ANP32突变体蛋白质粒(20ng)，每组设置3个重复孔。转染24h后，如实施例3所述裂解细胞检测聚合酶活性，图16B结果显示：与huANP32B相比，chANP32B与huANP32B N129I/D130N完全丧失了对H1N1SC09聚合酶活性的支持，而huANP32B E113P、huANP32B K116H、huANP32B N127M、huANP32B K137T、huANP32B R150A、huANP32B A160P点突变体依然保留了对H1N1SC09聚合酶活性的支持。
针对129/130这两个位点设计单点突变huANP32B N129I(使用引物对SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：164)、D130N(使用引物对SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：166)(引物见表16，下划线部分为突变碱基)，以PCAGGS-huANP32B质粒为模板，过程如本实施例中关于huANP32B序列上8个氨基酸的点突变所述，所得质粒命名为PCAGGS-huANP32B N129I、PCAGGS-huANP32B D130N。经测序验证正确后大量提取质粒用于下一步转染。
表16：单点突变huANP32B N129I、D130N引物
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，按照上述体系转染，结果显示：与huANP32B相比，huANP32B N129I几乎丧失了对HIN1SC09聚合酶活性的支持，而huANP32B D130N对H1N1SC09聚合酶活性的支持下降5倍左右。这说明129/130这两个位点对ANP32蛋白的活性均很重要。结果见附图17。
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将PCAGGS-Flag空载体、PCAGGS-huANP32B及PCAGGS-huANP32B点突变质粒分别与H7N9AH13聚合酶报告系统共转染DKO细胞系，转染体系为：PB1质粒(80ng)、PB2质粒(80ng)、PA质粒(40ng)、NP质粒(160ng)、pMD18T-vLuc质粒(80ng)、pRL-TK质粒(10ng)和ANP32突变体蛋白质粒(20ng)，每组设置3个重复孔。转染24h后，如实施例3所述裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与huANP32B相比，huANP32B N129I与huANP32B N129I/D130N完全丧失了对H7N9AH13聚合酶活性的支持，huANP32B K116H、huANP32B N127M、huANP32B R150A、huANP32B A160P点突变体依然保留了对H7N9AH13聚合酶活性的支持，huANP32B E113P、huANP32B D130N、huANP32B K137T支持H7N9AH13聚合酶活性的能力下降约3-8倍。结果见附图18。
根据huANP32B点突变筛选结果，以PCAGGS-huANP32A质粒为模板，过程如本实施例中关于huANP32B序列上8个氨基酸的点突变体的构建所述，利用重叠PCR对huANP32A同样进行N1291(使用引物对SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：168)、D130N(使用引物对SEQ ID NO：169和SEQ ID NO：170)、ND129/130IN(使用引物对SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：172)的点突变体构建(引物见表17，下划线部分为突变碱基)。过程如上所述，所得质粒命名为PCAGGS-huANP32AN1291、PCAGGS-huANP32AD130N及PCAGGS-huANP32A N129I/D130N。经测序验证正确后大量提取质粒用于下一步转染。
表17：huANP32A进行N129I、D130N、N129I/D130N的点突变的引物
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，按照上述体系与H1N1SC09聚合酶报告系统共转染，结果显示：与huANP32A相比，huANP32A N129I/D130N完全丧失了对H1N1SC09聚合酶活性的支持，huANP32A N129I几乎完全丧失了对H1N1SC09聚合酶活性的支持，huANP32A D130N对H1N1SC09聚合酶活性的支持能力下降100倍以上，结果见附图19。
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，按照上述体系与H7N9AH13聚合酶报告系统共转染，结果显示：与huANP32A相比，huANP32A N129I、huANP32A D130N、huANP32A N129I/D130N完全丧失了对H7N9AH13聚合酶活性的支持。结果见附图20。
根据huANP32B点突变筛选结果，以PCAGGS-chANP32A质粒为模板，利用重叠PCR对chANP32A进行N129I(使用引物对SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：174)、D130N(使用引物对SEQID NO：175和SEQ ID NO：176)、N129I/D130N(使用引物对SEQ ID NO：177和SEQ ID NO：178)的点突变，同时以PCAGGS-chANP32B质粒为模板，对chANP32B进行T129N(使用引物对SEQ IDNO：179和SEQ ID NO：180)、N130D(使用引物对SEQ ID NO：181和SEQ ID NO：182)、I129N/N130D(使用引物对SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184)的点突变(引物见表18，下划线部分为突变碱基)。经测序验证正确后大量提取质粒用于下一步转染。
表18：chANP32A和chANP32B的点突变的引物
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，按照上述体系与H7N9AH13聚合酶报告系统共转染，结果显示：与chANP32A相比，chANP32AN129I/D130N丧失了对H7N9AH11聚合酶活性的支持，chANP32A N1291支持H7N9AH13聚合酶活性的能力下降100倍以上，chANP32A D130N支持H7N9AH13聚合酶活性的能力下降5倍左右；与chANP32B相比，chANP32BI129N及chANP32B I129N/N130D具有支持H7N9AH13聚合酶活性的能力，而chANP32B N130D依然不具有支持H7N9AH13聚合酶活性的能力。结果见附图21。
实施例10.chANP32A蛋白129位点突变体构建
具体地，点突变引物如表19所示(下划线部分为突变碱基)，以PCAGGS-chANP32A质粒为模板，利用KOD-FX Neo高效DNA聚合酶扩增，构建chANP32A的N129A(使用引物对SEQ IDNO：185和SEQ ID NO：186)、N129C(使用引物对SEQ ID NO：187和SEQ ID NO：188)、N129D(使用引物对SEQ ID NO：189和SEQ ID NO：190)、N129E(使用引物对SEQ ID NO：191和SEQ IDNO：192)、N129F(使用引物对SEQ ID NO：193和SEQ ID NO：194)、N129G(使用引物对SEQ IDNO：195和SEQ ID NO：196)、N129H(使用引物对SEQ ID NO：197和SEQ ID NO：198)、N129K(使用引物对SEQ ID NO：199和SEQ ID NO：200)、N129L(使用引物对SEQ ID NO：201和SEQ IDNO：202)、N129M(使用引物对SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：204)、N129I(使用引物对SEQ IDNO：173和SEQ ID NO：174)、N129P(使用引物对SEQ ID NO：205和SEQ ID NO：206)、N129Q(使用引物对SEQ ID NO：207和SEQ ID NO：208)、N129R(使用引物对SEQ ID NO：209和SEQ IDNO：210)、N129S(使用引物对SEQ ID NO：211和SEQ ID NO：212)、N129T(使用引物对SEQ IDNO：213和SEQ ID NO：214)、N129V(使用引物对SEQ ID NO：215和SEQ ID NO：216)、N129W(使用引物对SEQ ID NO：217和SEQ ID NO：218)、N129Y(使用引物对SEQ ID NO：219和SEQ IDNO：220)点突变体。
所得PCR产物利用Dpn I在37°恒温水浴锅消化30分钟，然后取5ul消化产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，将测序正确的质粒进行后续转染实验。
表19：点突变引物
实施例11：chANP32A蛋白129位点突变体对流感病毒H7N9ZJ13复制的影响
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，分别将实施例10中构建的chANP32A129位点突变体与H7N9ZJ13聚合酶报告系统6个质粒共同转染，转染体系为：PB1(80ng)、PB2(80ng)、PA(40ng)、NP(160ng)、pMD18T-vLuc(80ng)、pRL-TK(10ng)和ANP32突变体蛋白质粒(20ng)，同时设置空载体(20ng)作为阴性对照，chANP32A(20ng)作为阳性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与chANP32A相比，双点突变体chANP32AN129I/D130N以及单点突变体chANP32AN129I、chANP32AN129R、chANP32AN129K、chANP32AN129D、chANP32A N129E不具有支持H7N9ZJ13聚合酶活性的能力；chANP32AN129P、chANP32AN129Q、chANP32AN129G几乎完全丧失了支持H7N9ZJ13聚合酶活性的能力，而chANP32AN129L、chANP32A N129F、chANP32A N129A、chANP32A N129M、chANP32AN129S、、chANP32A N129T、chANP32AN129C、chANP32A N129Y都可以支持H7N9ZJ13聚合酶活性；chANP32A N129V、chANP32A N129W、chANP32A N129H支持H7N9ZJ13聚合酶活性的能力下降大约100倍，结果见附图22。
实施例12：chANP32A蛋白129位点突变体对流感病毒H7N9AH13复制的影响
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将实施例10中构建的chANP32A 129位点突变体与H7N9AH13聚合酶报告系统6个质粒共同转染，转染体系为：PB1(80ng)、PB2(80ng)、PA(40ng)、NP(160ng)、pMD18T-vLuc(80ng)、pRL-TK(10ng)和ANP32突变体蛋白质粒(20ng)，同时设置空载体(20ng)作为阴性对照，chANP32A(20ng)作为阳性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与chANP32A相比，双点突变体chANP32AN129I/D130N以及单点突变体chANP32AN129P、chANP32A N129R、chANP32A N129K、chANP32A N129Q、chANP32A N129D、chANP32A N129E不具有支持H7N9AH13聚合酶活性的能力，chANP32A N129I几乎不具有支持H7N9AH13聚合酶活性的能力；chANP32AN129F、chANP32A N129A、chANP32A N129M、chANP32A N129S、chANP32A N129G、chANP32AN129T、chANP32A N129C、chANP32A N129Y都可以支持H7N9AH13聚合酶活性；chANP32AN129L、chANP32A N129W支持H7N9AH13聚合酶活性的能力下降3-10倍，chANP32A N129V与chANP32A N129H支持H7N9 AH13聚合酶活性的能力下降大约20-100倍，结果见附图23。
实施例13：chANP32A蛋白129位点突变体对流感病毒WSN复制的影响
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将实施例10中构建的chANP32A 129位点突变体与WSN聚合酶报告系统6个质粒共同转染，转染体系为：PB1(80ng)、PB2(80ng)、PA(40ng)、NP(160ng)、pMD18T-vLuc(80ng)、pRL-TK(10ng)和ANP32突变体蛋白质粒(20ng)，同时设置空载体(20ng)作为阴性对照，chANP32A(20ng)作为阳性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与chANP32A相比，双点突变体chANP32A N129I/D130N以及单点突变体chANP32A N129K、chANP32A N129D不具有支持WSN聚合酶活性的能力；而chANP32A N129F、chANP32A N129A、chANP32A N129M、chANP32AN129S、chANP32A N129G、chANP32A N129T、chANP32A N129C都可以支持WSN聚合酶活性；chANP32A N129P、chANP32A N129I、chANP32A N129H、chANP32A N129R、chANP32AN129Q、chANP32A N129E支持WSN聚合酶活性的能力下降大约100倍；chANP32A N129L、chANP32A N129W、chANP32A N129Y、chANP32A N129V支持WSN聚合酶活性的能力下降大约5-20倍，结果见附图24
实施例14：chANP32A蛋白130位点突变体构建
点突变引物如表20所示(下划线部分为突变碱基)，利用KOD-FX Neo高效DNA聚合酶扩增，以PCAGGS-chANP32A为模板，构建chANP32A的D130A(使用引物对SEQ ID NO：221和SEQ ID NO：222)、D130C(使用引物对SEQ ID NO：223和SEQ ID NO：224)、D130E(使用引物对SEQ ID NO：225和SEQ ID NO：226)、D130F(使用引物对SEQ ID NO：227和SEQ ID NO：228)、D130G(使用引物对SEQ ID NO：229和SEQ ID NO：230)、D130H(使用引物对SEQ ID NO：231和SEQ ID NO：232)、D130K(使用引物对SEQ ID NO：233和SEQ ID NO：234)、D130L(使用引物对SEQ ID NO：235和SEQ ID NO：236)、D130M(使用引物对SEQ ID NO：237和SEQ ID NO：238)、D130N(使用引物对SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：176)、D130P(使用引物对SEQ ID NO：239和SEQ ID NO：240)、D130Q(使用引物对SEQ ID NO：241和SEQ ID NO：242)、D130R(使用引物对SEQ ID NO：243和SEQ ID NO：244)、D130S(使用引物对SEQ ID NO：245和SEQ ID NO：246)、D130T(使用引物对SEQ ID NO：247和SEQ ID NO：248)、D130V(使用引物对SEQ ID NO：249和SEQ ID NO：250)、D130W(使用引物对SEQ ID NO：251和SEQ ID NO：252)、D130Y(使用引物对SEQ ID NO：253和SEQ ID NO：254)、D130I(使用引物对SEQ ID NO：255和SEQ ID NO：256)点突变体。
所得PCR产物利用Dpn I在37°恒温水浴锅消化30分钟，然后取5ul消化产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，将测序正确的质粒进行后续转染实验。
表20：130位点点突变引物
实施例15：chANP32A蛋白130位点突变体对流感病毒H7N9ZJ13复制的影响
将实施例2中构建的DKO细胞以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将实施例14中构建的chANP32A 130位点突变体与H7N9ZJ13聚合酶报告系统6个质粒共同转染，转染体系为：PB1(80ng)、PB2(80ng)、PA(40ng)、NP(160ng)、pMD18T-vLuc(80ng)、pRL-TK(10ng)和ANP32突变体蛋白质粒(20ng)，同时设置空载体(20ng)作为阴性对照，chANP32A(20ng)作为阳性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与chANP32A相比，双点突变体chANP32A N129I/D130N以及单点突变体chANP32A D130V、chANP32A D130F、chANP32A D130W、chANP32A D130H、chANP32A D130R、chANP32A D130K、chANP32A D130Y不具有支持H7N9ZJ13聚合酶活性的能力；而chANP32A D130A、chANP32A D130G、chANP32AD130C、chANP32A D130E都可以支持H7N9ZJ13聚合酶活性；chANP32A D130S、chANP32A D130T支持聚合酶活性的能力下降约3倍，chANP32A D130L、chANP32A D130P、chANP32A D130I、chANP32AD130M、chANP32A D130Q、chANP32A D130N支持H7N9ZJ13聚合酶活性的能力均有所下降，约10-50倍，结果见附图25。
实施例16：chANP32A蛋白130位点突变体对流感病毒H7N9AH13复制的影响
将实施例2中构建的DKO细胞以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将实施例14中构建的chANP32A 130位点突变体与H7N9AH13聚合酶报告系统6个质粒共同转染，转染体系为：PB1(80ng)、PB2(80ng)、PA(40ng)、NP(160ng)、pMD18T-vLuc(80ng)、pRL-TK(10ng)和ANP32突变体蛋白质粒(20ng)，同时设置空载体(20ng)作为阴性对照，chANP32A(20ng)作为阳性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与chANP32A相比，双点突变体chANP32A N129I/D130N以及单点突变体chANP32AD130F、chANP32A D130K不具有支持H7N9AH13聚合酶活性的能力；而chANP32A D130A、chANP32A D130S、chANP32A D130G、chANP32A D130E都可以支持H7N9AH13聚合酶活性；chANP32AD130V、chANP32A D130R支持聚合酶活性的能力下降100倍以上，几乎不具有支持聚合酶活性的能力；chANP32A D130L、chANP32A D130P、chANP32A D130I、chANP32A D130M、chANP32A D130W、chANP32A D130H、chANP32A D130Q、chANP32A D130Y支持H7N9AH13聚合酶活性的能力均有所下降，约10-100倍，chANP32A D130T、chANP32A D130C、chANP32A D130N支持H7N9AH13聚合酶活性的能力下降约3-5倍，结果见附图26。
实施例17：chANP32A蛋白130位点突变体对流感病毒WSN复制的影响
将实施例2中构建的DKO细胞以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将实施例14中构建的chANP32A 130位点突变体与WSN聚合酶报告系统6个质粒共同转染，转染体系为：PB1(80ng)、PB2(80ng)、PA(40ng)、NP(160ng)、pMD18T-vLuc(80ng)、pRL-TK(10ng)和ANP32突变体蛋白质粒(20ng)，同时设置空载体(20ng)作为阴性对照，chANP32A(20ng)作为阳性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与chANP32A相比，双点突变体chANP32A N129I/D130N以及单点突变体chANP32A D130F、chANP32A D130R、chANP32A D130K、不具有支持WSN聚合酶活性的能力；而chANP32A D130S、chANP32A D130G、chANP32A D130E都可以支持WSN聚合酶活性；chANP32A D130V、chANP32A D130W、chANP32AD130H、chANP32A D130Y几乎不具有支持聚合酶活性的能力；chANP32A D130L、chANP32AD130P、chANP32A D130I、chANP32A D130M、chANP32A D130Q、chANP32A D130N支持WSN聚合酶活性的能力均有所下降，约10-50倍，chANP32A D130A、chANP32A D130T、chANP32A D130C支持WSN聚合酶活性的能力下降约2-3倍，结果见附图27。
实施例18.huANP32B蛋白分段突变载体构建及聚合酶活性测定
表21huANP32B蛋白分段突变引物序列
对huANP32B蛋白进行分段突变，每10个氨基酸为一组，统一突变为丙氨酸，点突变引物如表21所示(下划线部分为突变碱基)。例如，huANP32B B1-10A突变体即是将huANP32B蛋白的第2位到第9位氨基酸DMKRRIHLE突变为AAAAAAAAA，huANP32B B11-20A突变体即是将huANP32B蛋白的第11位到第20位氨基酸LRNRTPAAVR突变为AAAAAAAAAA，依次类推。利用KOD-FX高效DNA聚合酶，以PCAGGS-huANP32B为模板，分别构建huANP32B B1-10A(使用引物对SEQ ID NO：257和SEQ ID NO：258)、huANP32B B11-20A(使用引物对SEQ ID NO：259和SEQID NO：260)、huANP32B B21-30A(使用引物对SEQ ID NO：261和SEQ ID NO：262)、huANP32BB31-40A(使用引物对SEQ ID NO：263和SEQ ID NO：264)、huANP32B B41-50A(使用引物对SEQ ID NO：265和SEQ ID NO：266)、huANP32B B51-60A(使用引物对SEQ ID NO：267和SEQID NO：268)、huANP32B B61-70A(使用引物对SEQ ID NO：269和SEQ ID NO：270)、huANP32BB71-80A(使用引物对SEQ ID NO：271和SEQ ID NO：272)、huANP32B B81-90A(使用引物对SEQ ID NO：273和SEQ ID NO：274)、huANP32B B91-100A(使用引物对SEQ ID NO：275和SEQID NO：276)、huANP32B B101-110A(使用引物对SEQ ID NO：277和SEQ ID NO：278)、huANP32B B111-120A(使用引物对SEQ ID NO：279和SEQ ID NO：280)、huANP32B B121-130A(使用引物对SEQ ID NO：281和SEQ ID NO：282)、huANP32B B131-140A(使用引物对SEQ IDNO：283和SEQ ID NO：284)、huANP32B B141-150A(使用引物对SEQ ID NO：285和SEQ ID NO：286)、huANP32B B151-160tA(使用引物对SEQ ID NO：287和SEQ ID NO：288)、huANP32BB161-170A(使用引物对SEQ ID NO：289和SEQ ID NO：290)、huANP32B B171-180A(使用引物对SEQ ID NO：291和SEQ ID NO：292)、huANP32B B181-190A(使用引物对SEQ ID NO：293和SEQ ID NO：294)、huANP32B B191-200A(使用引物对SEQ ID NO：295和SEQ ID NO：296)、huANP32B B201-210A(使用引物对SEQ ID NO：297和SEQ ID NO：298)、huANP32B B211-220A(使用引物对SEQ ID NO：299和SEQ ID NO：300)、huANP32B B221-230A(使用引物对SEQ IDNO：301和SEQ ID NO：302)、huANP32B B231-240A(使用引物对SEQ ID NO：303和SEQ ID NO：304)、huANP32B B241-251A(使用引物对SEQ ID NO：305和SEQ ID NO：306)分段突变体，分别命名为huANP32B B1-10A、huANP32B B11-20A、huANP32B B21-30A、huANP32B B31-40A、huANP32B B41-50A、huANP32B B51-60A、huANP32B B61-70A、huANP32B B71-80A、huANP32BB81-90A、huANP32B B91-100A、huANP32B B101-110A、huANP32B B111-120A、huANP32BB121-130A、huANP32B B131-140A、huANP32B B141-150A、huANP32B B151-160A、huANP32BB161-170A、huANP32B B171-180A、huANP32B B181-190A、huANP32B B191-200A、huANP32BB201-210A、huANP32B B211-220A、huANP32B B221-230A、huANP32B B231-240A、huANP32BB241-251A。所得PCR产物利用Dpn I在37°恒温水浴锅消化30分钟，然后取2.5ul消化产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，将测序正确的质粒进行后续转染实验。
实施例19.huANP32B蛋白分段突变体对流感病毒H7N9AH13复制的影响
双敲除细胞系(DKO)以1x10^5/孔铺于24孔板中，20h后，将实施例18中构建的huANP32B分段突变体与H7N9AH13聚合酶报告系统6个质粒共同转染，转染体系为：PB1(40ng)、PB2(40ng)、PA(20ng)、NP(80ng)、pMD18T-vLuc(40ng)、pRL-TK(5ng)和ANP32突变体蛋白质粒(10ng)，同时设置空载体(10ng)作为阴性对照，huANP32B(10ng)作为阳性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与huANP32B相比，分段突变体huANP32B B51-60A、huANP32B B61-70A、huANP32B B71-80A、huANP32B B81-90A、huANP32B B91-100A、huANP32B B101-110A、huANP32B B111-120A、huANP32B B121-130A、huANP32B B131-140A、huANP32B B141-150A、huANP32B B151-160A不具有支持H7N9AH13聚合酶活性的能力；而huANP32B B1-10A、huANP32B B11-20A、huANP32B B21-30A、huANP32BB31-40A、huANP32B B171-180A、huANP32B B181-190A、huANP32B B191-200A、huANP32BB201-210A、huANP32B B211-220A、huANP32B B221-230A、huANP32B B231-240A、huANP32BB241-251A都具有支持H7N9AH13聚合酶活性的能力；huANP32B B41-50A、huANP32B B161-170A支持H7N9AH13聚合酶活性的能力下降大约200倍，结果见附图28。
实施例20.chANP32A蛋白分段突变载体构建及聚合酶活性测定
表22chANP32A蛋白分段突变引物序列
对chANP32A蛋白进行分段突变，每10个氨基酸为一组，统一突变为丙氨酸，点突变引物如表22所示(下划线部分为突变碱基)。例如，chANP32A 1-10A突变体即是将chANP32A蛋白的第2位到第9位氨基酸DMKKRIHLE突变为AAAAAAAAA，chANP32A 11-20A突变体即是将chANP32A蛋白的第11位到第20位氨基酸LRNRTPSDVK突变为AAAAAAAAAA，依次类推。利用KOD-FX高效DNA聚合酶，以PCAGGS-chANP32A为模板，分别构建chANP32A 1-10mutA(使用引物对SEQ ID NO：307和SEQ ID NO：308)、chANP32A 11-20mutA(使用引物对SEQ ID NO：309和SEQ ID NO：310)、chANP32A21-30mutA(使用引物对SEQ ID NO：311和SEQ ID NO：312)、chANP32A 31-40mutA(使用引物对SEQ ID NO：313和SEQ ID NO：314)、chANP32A 41-50mutA(使用引物对SEQ ID NO：315和SEQ ID NO：316)、chANP32A 51-60mutA(使用引物对SEQ IDNO：317和SEQ ID NO：318)、chANP32A61-70mutA(使用引物对SEQ ID NO：319和SEQ ID NO：320)、chANP32A 71-80mutA(使用引物对SEQ ID NO：321和SEQ ID NO：322)、chANP32A 81-90mutA(使用引物对SEQ ID NO：323和SEQ ID NO：324)、chANP32A 91-100mutA(使用引物对SEQ ID NO：325和SEQ ID NO：326)、chANP32A 101-110mutA(使用引物对SEQ ID NO：327和SEQ ID NO：328)、chANP32A 111-120mutA(使用引物对SEQ ID NO：329和SEQ ID NO：330)、chANP32A121-130mutA(使用引物对SEQ ID NO：331和SEQ ID NO：332)、chANP32A 131-140mutA(使用引物对SEQ ID NO：333和SEQ ID NO：334)、chANP32A 141-150mutA(使用引物对SEQ ID NO：335和SEQ ID NO：336)、chANP32A 151-160mutA(使用引物对SEQ ID NO：337和SEQ ID NO：338)、chANP32A 161-170mutA(使用引物对SEQ ID NO：339和SEQ ID NO：340)、chANP32A 171-180mutA(使用引物对SEQ ID NO：341和SEQ ID NO：342)、chANP32A181-190mutA(使用引物对SEQ ID NO：343和SEQ ID NO：344)、chANP32A 191-200mutA(使用引物对SEQ ID NO：345和SEQ ID NO：346)、chANP32A 201-210mutA(使用引物对SEQ ID NO：347和SEQ ID NO：348)、chANP32A211-220mutA(使用引物对SEQ ID NO：349和SEQ ID NO：350)、chANP32A 221-230mutA(使用引物对SEQ ID NO：351和SEQ ID NO：352)、chANP32A 231-240mutA(使用引物对SEQ ID NO：353和SEQ ID NO：354)、chANP32A 241-250mutA(使用引物对SEQ ID NO：355和SEQ ID NO：356)、chANP32A 251-260mutA(使用引物对SEQ ID NO：357和SEQ ID NO：358)、chANP32A 261-270mutA(使用引物对SEQ ID NO：359和SEQ ID NO：360)、chANP32A 271-281mutA(使用引物对SEQ ID NO：361和SEQ ID NO：362)分段突变，分别命名为chANP32A 1-10mutA、chANP32A11-20mutA、chANP32A 21-30mutA、chANP32A 31-40mutA、chANP32A41-50mutA、chANP32A 51-60mutA、chANP32A61-70mutA、chANP32A 71-80mutA、chANP32A 81-90mutA、chANP32A 91-100mutA、chANP32A 101-110mutA、chANP32A 111-120mutA、chANP32A 121-130mutA、chANP32A 131-140mutA、chANP32A 141-150mutA、chANP32A151-160mutA、chANP32A 161-170mutA、chANP32A171-180mutA、chANP32A181-190mutA、chANP32A191-200mutA、chANP32A201-210mutA、chANP32A211-220mutA、chANP32A 221-230mutA、chANP32A231-240mutA、chANP32A241-250mutA、chANP32A 251-260mutA、chANP32A 261-270mutA、chANP32A 271-281mutA。所得PCR产物利用Dpn I在37°恒温水浴锅消化30分钟，然后取2.5ul消化产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，将测序正确的质粒进行后续转染实验。
实施例21.chANP32A蛋白分段突变体对流感病毒H7N9ZJ13复制的影响
chANP32A蛋白分段突变体对流感病毒H7N9ZJ13复制的影响：双敲除细胞系(DKO)以1x105/孔铺于24孔板中，20h后，将实施例20中构建的chANP32A分段突变体与H7N9ZJ13聚合酶报告系统6个质粒共同转染，转染体系为：PB1(40ng)、PB2(40ng)、PA(20ng)、NP(80ng)、pMD18T-vLuc(40ng)、pRL-TK(5ng)和ANP32突变体蛋白质粒(10ng)，同时设置空载体(10ng)作为阴性对照，chANP32A(10ng)作为阳性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与chANP32A相比，分段突变体chANP32A 71-80mutA、chANP32A81-90mutA、chANP32A 91-100mutA、chANP32A 101-110mutA、chANP32A 111-120mutA、chANP32A121-130mutA、chANP32A 131-140mutA、chANP32A 141-150mutA、chANP32A 151-160mutA、chANP32A 161-170mutA、chANP32A 171-180mutA不具有支持H7N9ZJ13聚合酶活性的能力；而chANP32A 1-10mutA、chANP32A11-20mutA、chANP32A 21-30mutA、chANP32A 31-40mutA、chANP32A 41-50mutA、chANP32A 51-60mutA、chANP32A 181-190mutA、chANP32A201-210mutA、chANP32A 211-220mutA、chANP32A 221-230mutA、chANP32A 231-240mutA、chANP32A 241-250mutA、chANP32A 251-260mutA、chANP32A 261-270mutA、chANP32A271-281mutA都可以支持H7N9ZJ13聚合酶活性；chANP32A61-70mutA、chANP32A 191-200mutA支持H7N9ZJ13聚合酶活性的能力下降大约100倍，结果见附图29。
实施例22.chANP32A蛋白氨基酸位点突变载体构建及聚合酶活性测定
表23chANP32A蛋白氨基酸位点突变引物序列
点突变引物如表23所示(下划线部分为突变碱基)，利用KOD-FX高效DNA聚合酶扩增，以PCAGGS-chANP32A为模板，分别构建chANP32A D149A(使用引物对SEQ ID NO：363和SEQ ID NO：364)、R150A(使用引物对SEQ ID NO：365和SEQ ID NO：366)、D151A(使用引物对SEQ ID NO：367和SEQ ID NO：368)、D152A(使用引物对SEQ ID NO：369和SEQ ID NO：370)、K153A(使用引物对SEQ ID NO：371和SEQ ID NO：372)、E154A(使用引物对SEQ ID NO：373和SEQ ID NO：374)点突变体，分别命名为chANP32A D149A、chANP32A R150A、chANP32AD151A、chANP32A D152A、chANP32AK153A、chANP32AE154A。所得PCR产物利用Dpn I在37°恒温水浴锅消化30分钟，然后取2.5ul消化产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，将测序正确的质粒进行后续转染实验。
实施例23.chANP32A蛋白点突变体对流感病毒H7N9AH13复制的影响
双敲除细胞系(DKO)以1x105/孔铺于24孔板中，20h后，将实施例22中构建的chANP32A氨基酸突变体与H7N9AH13聚合酶报告系统6个质粒共同转染，转染体系为：PB1(40ng)、PB2(40ng)、PA(20ng)、NP(80ng)、pMD18T-vLuc(40ng)、pRL-TK(5ng)和ANP32突变体蛋白质粒(10ng)，同时设置空载体(10ng)作为阴性对照，chANP32A(10ng)作为阳性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与chANP32A相比，chANP32A D149A支持H7N9AH13聚合酶活性的能力下降大约1000倍，基本不具有支持聚合酶活性的能力；chANP32A D151A 支持H7N9AH13聚合酶活性的能力下降大约50倍；chANP32AR150A、chANP32AD152A、chANP32A K153A、都可以支持H7N9AH13聚合酶活性，chANP32A E154A支持聚合酶活性的能力下降约5倍，结果见附图30。
实施例24.huANP32B蛋白氨基酸位点突变载体构建及聚合酶活性测定
表24huANP32B蛋白氨基酸位点突变引物序列
分析huANP32B的蛋白序列，其含有3个已知的核输出信号(NES)，分别为NSE1(LPKLPKLKKL，位于60-71位)、NSE2(LPNLTHLNL，位于87-95位)和NES3(LEPLKKLECLKSLDL，位于106-120位)。为确定huANP32B的核输出功能域是否与其支持聚合酶活性的能力相关，分别针对这三个核输出区域进行突变。针对NES1区域，将其第60位及63位亮氨酸均突变为丙氨酸，突变体命名为huANP32B NES1mut。针对NES2区域，将其第87位、90位、93位及95位亮氨酸均突变为丙氨酸，突变体命名为huANP32B NES2mut。针对NES3区域，将其第112位、115位及118位亮氨酸均突变为丙氨酸，突变体命名为huANP32B NES3mut。点突变引物如表24所示(下划线部分为突变碱基)，利用KOD-FX高效DNA聚合酶扩增，以PCAGGS-huANP32B为模板，分别构建huANP32B NES1mut(使用引物对SEQ ID NO：375和SEQ ID NO：376)、NES2mut(使用引物对SEQ ID NO：377和SEQ ID NO：378)、NES3mut(使用引物对SEQ ID NO：379和SEQ ID NO：380)点突变体，分别命名为huANP32B NES1mut、huANP32B NES2mut、huANP32B NES3mut。所得PCR产物利用Dpn I在37°恒温水浴锅消化30分钟，然后取2.5ul消化产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，将测序正确的质粒进行后续转染实验。
实施例25.huANP32B蛋白点突变体对流感病毒H7N9AH13复制的影响
将双敲除细胞系(DKO)以1x105/孔铺于24孔板中，20h后，将实施例24中构建的huANP32B氨基酸突变体与H7N9AH13聚合酶报告系统6个质粒共同转染，转染体系为：PB1(40ng)、PB2(40ng)、PA(20ng)、NP(80ng)、pMD18T-vLuc(40ng)、pRL-TK(5ng)和ANP32突变体蛋白质粒(10ng)，同时设置空载体(10ng)作为阴性对照，huANP32B(10ng)作为阳性对照，每组设置3个重复孔。转染24h后，裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：与huANP32B相比，huANP32B NES1mut支持H7N9AH13聚合酶活性的能力下降大约1000倍，基本不具有支持聚合酶活性的能力；huANP32B NES2mut、huANP32B NES3mut不具有支持H7N9AH13聚合酶活性的能力，结果见附图31。
实施例26：定点突变细胞系的构建
我们利用CRISPR-Cas9技术进行定点突变细胞系构建。根据NCBI已公布的参考核苷酸序列human ANP32A(NM_006305.3)与human ANP32B(NM_006401.2)，利用在线软件http：//crispr.mit.edu/设计针对这两个蛋白的129/130位点的sgRNA(序列见表25)。
表25：sgRNA序列
设计针对huANP32A 129/130氨基酸位点和huANP32B 129/130氨基酸位点的sgRNA引物，以实施例2中构建的pMD18T-U6-huANPsgRNA-1重组质粒为模板，利用点突变PCR的方法，使用KOD-FX Neo高效DNA聚合酶(货号：KFX-201，购自东洋纺)扩增，分别构建pMD18T-U6-huANP32A-129/130-sgRNA(使用引物对SEQ ID NO：383和SEQ ID NO：384)和pMD18T-U6-huANP32B-129/130-sgRNA(使用引物对SEQ ID NO：386和SEQ ID NO：387)重组质粒，所得PCR产物利用Dpn I在37°恒温水浴锅消化30分钟，然后取5ul消化产物转化到20ul DH5α感受态细胞，次日挑取单克隆进行测序，将测序正确的质粒即pMD18T-U6-huANP32A-129/130-sgRNA(含有huANP32A-129/130-sgRNA)和pMD18T-U6-huANP32B-129/130-sgRNA(含有huANP32B-129/130-sgRNA)进行后续转染实验。同时合成用于细胞内huANP32A N129I/D130N点突变的供体序列huANP32A-sgRNA-ssODN(SEQ ID NO：385)及huANP32B N129I/D130N点突变的供体序列huANP32B-sgRNA-ssODN(SEQ ID NO：388)。合成的单核苷酸序列用无蒸馏水稀释到10uM备用。
表26：引物序列
表达Cas9-GFP蛋白的真核质粒pMJ920(Addgene plasmid#42234)1ug、pMD18T-U6-huANP32A-129/130-sgRNA重组质粒1ug以及稀释好的huANP32A-sgRNA-ssODN(SEQ ID NO：385)0.5μL，与lipofectamine 2000以1∶2.5的比例混匀，转染293T细胞；表达Cas9-GFP蛋白的真核质粒pMJ920(Addgene plasmid#42234)1ug、pMD18T-U6-huANP32B-129/130-sgRNA重组质粒1ug以及稀释好的huANP32B-sgRNA-ssODN(SEQ ID NO：388)0.5μL，与lipofectamine2000以1∶2.5的比例混匀，转染293T细胞。48小时后，经超速流式细胞分选系统筛选出GFP阳性细胞，并以单个细胞/孔铺于96孔板，约10天左右，挑取单细胞克隆扩大培养，然后使用SimplyP总RNA提取试剂盒(购自Bioflux，货号BSC52M1)按照操作步骤提取细胞RNA，并使用宝生物公司反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)，Cat.RR047A)合成cDNA，以cDNA为模板，利用KOD Fx Neo聚合酶分别扩增sgRNA靶向huANP32A(使用引物对SEQ ID NO：389和SEQ ID NO：390)及huANP32B(使用引物对SEQID NO：391和SEQ ID NO：392)的目标片段，扩增引物见表27，其中huANP32A扩增片段大小为570bp，huANP32B扩增片段大小为572bp。经测序验证基因突变正确的单细胞克隆进行western blotting的鉴定和后续的实验研究。huANP32A和huANP32B的129/130氨基酸位点同时突变细胞系是在第一轮获得huANP32B单敲除细胞系后再进行一轮敲除筛选，转染体系及筛选步骤如上。针对所构建的细胞系，均扩增其huANP32A及huANP32B目的片段，验证单突变及双突变的效果，细胞系鉴定测序结果见附图32，其中附图32A为huANP32A N129I/D130N单突变的细胞系(命名为A21 IN)的huANP32A及huANP32B 129/130位点氨基酸测序结果，附图32B为huANP32B N129I/D130N单突变的细胞系(命名为B5 IN)的huANP32A 及huANP32B129/130位点氨基酸测序结果，附图32C为双突变的细胞系(命名为AB IN)的huANP32A及huANP32B 129/130位点氨基酸测序结果。
表27：huANP32A及huANP32B点突变细胞系鉴定引物序列
Western bloting使用抗体为Anti-PHAP1 antibody(购自Abcam公司，货号为ab51013)和Anti-PHAPI2/APRIL antibody[EPR14588](购自Abcam公司，货号为ab200836)；β肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，使用抗体Monoclonal Anti-β-Actin antibodyproduced in mouse(购自Sigma公司，货号为A1978-200UL)，结果见附图33。
基于以上，我们成功构建了huANP32A N129I/D130N单突变的细胞系(命名为A21IN)、huANP32B N129I/D130N单突变的细胞系(命名为B5 IN)及huANP32A和huANP32B双突变的细胞系(命名为AB IN)，并用于后续实验。
实施例27：ANP32蛋白对流感病毒复制的影响
将实施例2中构建的双敲除细胞系(DKO)及实施例26中构建的A21 IN细胞系、B5IN细胞系、AB IN细胞系以及野生型293T细胞系以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，将H1N1SC09聚合酶报告系统5个质粒共同转染，转染体系为：PB1质粒(80ng)、PB2质粒(80ng)、PA质粒(40ng)、NP质粒(160ng)、pMD18T-vLuc质粒(80ng)和pRL-TK质粒(10ng)，每组设置3个重复孔。转染24h后，如实施例3所述裂解细胞检测聚合酶活性，结果显示：H1N1SC09聚合酶在单突变细胞系A21 IN细胞系与B5 IN细胞系上的活性与野生型293T细胞差异较小，仅下降3-5倍，而AB IN与DKO细胞系上聚合酶的活性下降明显，约3000-5000倍，结果见附图34。
以H7N9AH13聚合酶报告系统代替H1N1SC09聚合酶报告系统重复上述实验，结果显示，H7N9AH13聚合酶在单突变细胞系A21 IN细胞系与B5 IN细胞系上的活性与野生型293T细胞差异较小，仅下降10倍左右，而AB IN与DKO细胞系上H7N9AH13聚合酶的活性下降明显，约7000-10000倍，结果见附图35。
实施例28禽源ANP32A蛋白的氨基酸序列比对
比较了禽源ANP32A蛋白(chANP32A，zfANP32A，dkANP32A和tyANP32A)的氨基酸序列，参见图36，其中各禽源ANP32A蛋白与chANP32A蛋白的氨基酸位置129，130，149，151，以及位置60，63，87，90，93，95，112，115，和118的对应关系如表28所示。
表28
chANP32A 129 130 149 151 60 63 87 90 93 95 112 115 118
zfANP32A 129 130 149 151 60 63 87 90 93 95 112 115 118
dkANP32A 119 120 139 141 50 53 77 80 83 85 102 105 108
tyANP32A 128 129 148 150 59 62 86 89 92 94 111 114 117
如实施例21所证明，chANP32A的氨基酸区段71-180的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力，而氨基酸区段61-70和191-200的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白支持聚合酶活性的能力下降。
从图36的zfANP32A蛋白与chANP32A蛋白的氨基酸序列比对可知，zfANP32A的氨基酸区段61-71，氨基酸区段73-75，氨基酸区段77-99，氨基酸区段101-165，氨基酸区段167-169，氨基酸区段171-180以及氨基酸区段181-200的序列与chANP32A的氨基酸序列完全相同，因而zfANP32A蛋白的氨基酸区段61-71，氨基酸区段73-75、77-99、101-165、167-169和171-180的氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段61-70和191-200的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
从图36的dkANP32A蛋白与chANP32A蛋白的氨基酸序列比对可知，dkANP32A蛋白的氨基酸在位置66为I，而chANP32A蛋白的氨基酸在位置76为V，以及dkANP32A缺失位置164-167的氨基酸(与chANP32蛋白的位置176-179对比)。由此可知，dkANP32A蛋白的氨基酸区段61-65，氨基酸区段67-166的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力，而氨基酸区段51-60以及氨基酸区段177-186的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白支持聚合酶活性的能力下降。
从图36的tyANP32A蛋白与chANP32A蛋白的氨基酸序列比对可知，tyANP32A蛋白的氨基酸序列与chANP32A蛋白的氨基酸完全相同。由此可知，tyANP32A蛋白的氨基酸区段60-179的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白完全丧失支持聚合酶活性的能力，而氨基酸区段60-69和氨基酸区段190-199的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白支持聚合酶活性的能力下降。
实施例29禽源ANP32B蛋白与huANP32B蛋白的氨基酸序列比对
比较了禽源ANP32B蛋白(chANP32B，dkANP32B(XP_012963723.1)和tyANP32B(XP_010723174.1))与huANP32B蛋白的氨基酸序列，参见图37，其中各禽源ANP32B蛋白与huANP32B蛋白的氨基酸位置129，130，149，151，以及位置60，63，87，90，93，95，112，115，和118的对应关系如表29所示。
如实施例19所证明，huANP32B的氨基酸区段51-160的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力，而氨基酸区段41-50和161-170的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白支持聚合酶活性的能力下降。
从图37的chANP32B蛋白与huANP32B蛋白的氨基酸序列比对可知，chANP32B的氨基酸区段43-48，氨基酸区段50-52，氨基酸区段58-63，氨基酸区段68-72，氨基酸区段74-76，氨基酸区段78-80，氨基酸区段83-85，氨基酸区段88-99，氨基酸区段101-103，氨基酸区段105-112，氨基酸区段117-126，氨基酸区段131-136，氨基酸区段138-147以及氨基酸区段153-159序列与huANP32B蛋白的氨基酸序列完全相同，因而chANP32B蛋白的氨基酸区段50-52、58-63、68-72、74-76、78-80、83-85、88-99、101-103、105-112、117-126、131-136、138-147及153-159的氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段43-48的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
从图37的dkANP32B蛋白与huANP32B蛋白的氨基酸序列比对可知，dkANP32B的氨基酸区段57-62(对应huANP32B氨基酸区段43-48)，氨基酸区段70-77(对应huANP32B氨基酸区段56-63)，氨基酸区段82-86(对应huANP32B氨基酸区段68-72)，氨基酸区段88-90(对应huANP32B氨基酸区段74-76)，氨基酸区段92-94(对应huANP32B氨基酸区段78-80)，氨基酸区段97-99(对应huANP32B氨基酸区段83-85)，氨基酸区段102-113(对应huANP32B氨基酸区段88-99)，氨基酸区段115-117(对应huANP32B氨基酸区段101-103)，氨基酸区段119-126(对应huANP32B氨基酸区段105-112)，氨基酸区段131-140(对应huANP32B氨基酸区段117-126)，氨基酸区段145-150(对应huANP32B氨基酸区段131-136)，氨基酸区段152-161(对应huANP32B氨基酸区段138-147)以及氨基酸区段166-173(对应huANP32B氨基酸区段152-159)序列与huANP32B蛋白的氨基酸序列完全相同，因而dkANP32B蛋白的氨基酸区段70-77、82-86、88-90、92-94、97-99、102-113、115-117、119-126、131-140、145-150、152-161及166-173的氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段57-62的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
从图37的tyANP32B蛋白与huANP32B蛋白的氨基酸序列比对可知，tyANP32B的氨基酸区段10-15(对应huANP32B氨基酸区段58-63)，氨基酸区段20-24(对应huANP32B氨基酸区段68-72)，氨基酸区段26-28(对应huANP32B氨基酸区段74-76)，氨基酸区段30-32(对应huANP32B氨基酸区段78-80)，氨基酸区段35-37(对应huANP32B氨基酸区段83-85)，氨基酸区段40-51(对应huANP32B氨基酸区段88-99)，氨基酸区段53-55(对应huANP32B氨基酸区段101-103)，氨基酸区段57-64(对应huANP32B氨基酸区段105-112)，氨基酸区段69-78(对应huANP32B氨基酸区段117-126)，氨基酸区段83-88(对应huANP32B氨基酸区段131-136)，氨基酸区段90-99(对应huANP32B氨基酸区段138-147)以及氨基酸区段105-111(对应huANP32B氨基酸区段153-159)序列与huANP32B蛋白的氨基酸序列完全相同，因而tyANP32B蛋白的氨基酸区段20-24、26-28、30-32、35-37、40-51、53-55、57-64、69-78、83-88、90-99及105-111的氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力。
实施例30哺乳动物ANP32A蛋白与chANP32A蛋白氨基酸序列比对
比较了哺乳动物ANP32A蛋白(huANP32A，dogANP32A(NP_001003013.2)，eqANP32A，muANP32A，pgANP32A)与chANP32A 蛋白的氨基酸序列，参见图38，其中各哺乳动物ANP32A蛋白与chANP32A蛋白的氨基酸位置129，130，149，151，以及位置60，63，87，90，93，95，112，115，和118的对应关系如表30所示。
表30
如实施例21所证明，chANP32A的氨基酸区段71-180的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力，而氨基酸区段61-70和191-200的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白支持聚合酶活性的能力下降。
从图38的huANP32A蛋白与chANP32A蛋白的氨基酸序列比对可知，huANP32A的氨基酸区段41-54，氨基酸区段58-75，氨基酸区段77-102，氨基酸区段104-170与chANP32A的氨基酸序列完全相同，因而huANP32A 蛋白的氨基酸区段77-102、104-170氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段61-70的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
从图38的eqANP32A蛋白与chANP32A蛋白的氨基酸序列比对可知，eqANP32A的氨基酸区段41-54，氨基酸区段56-75，氨基酸区段77-102，氨基酸区段104-169与chANP32A的氨基酸序列完全相同，因而eqANP32A蛋白的氨基酸区段77-102、104-169氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段61-70的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
从图38的dogANP32A蛋白与chANP32A蛋白的氨基酸序列比对可知，dogANP32A的氨基酸区段41-54，氨基酸区段56-75，氨基酸区段77-102，氨基酸区段104-169与chANP32A的氨基酸序列完全相同，因而dogANP32A蛋白的氨基酸区段77-102、104-169氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段61-70的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
从图38的pgANP32A蛋白与chANP32A蛋白的氨基酸序列比对可知，pgANP32A的氨基酸区段41-54，氨基酸区段56-75，氨基酸区段77-102，氨基酸区段106-155，氨基酸区段157-169与chANP32A的氨基酸序列完全相同，因而pgANP32A蛋白的氨基酸区段77-102、106-155、157-169氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段61-70的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
从图38的muANP32A蛋白与chANP32A蛋白的氨基酸序列比对可知，muANP32A的氨基酸区段41-54，氨基酸区段59-72，氨基酸区段80-90，氨基酸区段92-102，氨基酸区段104-129，氨基酸区段131-141，氨基酸区段144-151，氨基酸区段153-159，氨基酸区段161-165与chANP32A的氨基酸序列完全相同，因而muANP32A蛋白的氨基酸区段80-90、92-102、104-129、131-141、144-151、153-159、161-165氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段61-70的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
实施例31哺乳动物ANP32B蛋白氨基酸序列比对
比较了哺乳动物ANP32B蛋白(huANP32B，dogANP32B(XP_013973354.1)，eqANP32B(XP_023485491.1)，muANP32B(NP_570959.1)，pgANP32B(XP_020922136.1))的氨基酸序列，参见图39，其中各哺乳动物ANP32B蛋白氨基酸位置129，130，149，151，以及位置60，63，87，90，93，95，112，115，和118的对应关系如表31所示。
表31
huANP32B 129 130 149 151 60 63 87 90 93 95 112 115 118
dogANP32B 136 137 156 158 67 70 94 97 100 102 119 122 125
eqANP32B 129 130 149 151 60 63 87 90 93 95 112 115 118
muANP32B 129 130 149 151 60 63 87 90 93 95 112 115 118
pgANP32B 129 130 149 151 60 63 87 90 93 95 112 115 118
如实施例19所证明，huANP32B的氨基酸区段51-160的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力，而氨基酸区段41-50和161-170的氨基酸突变为丙氨酸导致该蛋白支持聚合酶活性的能力下降。
从图39的eqANP32B蛋白与huANP32B蛋白的氨基酸序列比对可知，eqANP32B的氨基酸区段41-72、氨基酸区段74-112及氨基酸区段115-170与huANP32B的氨基酸序列完全相同，因而eqANP32B蛋白的氨基酸区段51-72、74-112、115-160氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段41-50、161-170的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
从图39的pgANP32B蛋白与huANP32B蛋白的氨基酸序列比对可知，pgANP32B的氨基酸区段41-72，氨基酸区段78-142，氨基酸区段144-150及氨基酸区段154-169与huANP32B的氨基酸序列完全相同，因而pgANP32B蛋白的氨基酸区段51-72、78-142、144-150、154-160氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段41-50、161-169的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
从图39的muANP32B蛋白与huANP32B蛋白的氨基酸序列比对可知，muANP32B的氨基酸区段41-50，氨基酸区段60-81，氨基酸区段90-98，氨基酸区段100-110，氨基酸区段114-121，氨基酸区段123-127，氨基酸区段130-133，氨基酸区段138-142及氨基酸区段144-159与huANP32B的氨基酸序列完全相同，因而muANP32B蛋白的氨基酸区段60-81、90-98、100-110、114-121、123-127、130-133、138-142、144-159氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段41-50的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
从图39的dogANP32B蛋白与huANP32B蛋白的氨基酸序列比对可知，dogANP32B的氨基酸区段48-79(对应huANP32B蛋白的氨基酸区段41-72)，氨基酸区段81-120(对应huANP32B蛋白的氨基酸区段74-113)，氨基酸区段122-159(对应huANP32B蛋白的氨基酸区段115-152)，氨基酸区段161-177(对应huANP32B蛋白的氨基酸区段154-170)与huANP32B的氨基酸序列完全相同，因而dogANP32B蛋白的氨基酸区段58-79、81-120、122-159、161-167氨基酸突变为丙氨酸同样导致该蛋白完全丧失了支持聚合酶活性的能力；氨基酸区段48-57、168-177的氨基酸突变为丙氨酸导致支持聚合酶活性的能力下降。
实施例32.鼠ANP32B蛋白表达载体及突变载体的构建
鼠ANP32B(muANP32B)核苷酸序列参见GenBank No.NM_130889.3，氨基酸序列参见GenBank No.NP_570959.1，根据实施例1中所述构建方法，构建PCAGGS-muANP32B重组质粒，并如实施例1中所述检测方法，Western blotting检测蛋白表达情况，结果见附图40。
根据实施例8中所述huANP32B点突变筛选结果，以PCAGGS-muANP32B重组质粒为模板，过程如实施例8中点突变体构建所述，利用重叠PCR对muANP32B进行S129I/D130N(使用引物对SEQ ID NO：393和SEQ ID NO：394)的点突变体构建(引物见表32，下划线部分为突变碱基)。过程如上所述，所得质粒命名为PCAGGS-muANP32B S129I/D130N。经测序验证正确后大量提取质粒用于下一步转染。
表32：muANP32B进行S129I/D130N的点突变的引物
实施例33鼠ANP32B蛋白突变体对聚合酶活性的影响
双敲除细胞系(DKO)以3x105/孔铺于12孔板中，20h后，按照实施例8中所述转染体系与H7N9AH13聚合酶报告系统共转染，结果显示：与muANP32B相比，muANP32B S129I/D130N完全丧失了对H7N9AH13聚合酶活性的支持，结果见附图41。

Claims (10)

1.突变的ANP32蛋白，其包括将ANP32蛋白的选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个缺失或置换为丙氨酸：第21-30位置的氨基酸，第31-40位置的氨基酸，第41-50位置的氨基酸，第51-60位氨基酸，第61-70位置的氨基酸，第71-80位置的氨基酸，第81-90位置的氨基酸，第91-100位置的氨基酸，第101-110位置的氨基酸，第111-120位置的氨基酸，第121-130位置的氨基酸，第131-140位置的氨基酸，第141-150位置的氨基酸，第151-160位置的氨基酸，第161-170位置的氨基酸，第171-180位置的氨基酸或第191-200位置的氨基酸。
2.如权利要求1所述的突变的ANP32蛋白，其中当ANP32蛋白为鸡ANP32A蛋白，选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个被缺失或置换为丙氨酸：第161-170位置的氨基酸，第171-180位置的氨基酸或第191-200位置的氨基酸，所述氨基酸位置对应GenBankNo.XP_413932.3的鸡ANP32A蛋白的氨基酸位置。
3.如权利要求1所述的突变的ANP32蛋白，其中当ANP32蛋白为人ANP32B蛋白时，选自由以下各项组成的组的氨基酸区段的一个或多个被缺失或置换为丙氨酸：第21-30位置的氨基酸，第41-50位置的氨基酸，第51-60位氨基酸或第161-170位置的氨基酸，所述氨基酸位置对应GenBank No.NP_006392.1的人ANP32B蛋白的氨基酸位置。
4.权利要求1-3所述的突变的ANP32蛋白在制备降低流感病毒聚合酶活性的系统中的应用。
5.权利要求1-3所述的突变的ANP32蛋白在制备维持流感病毒聚合酶活性的系统中的应用。
6.一种试剂盒，其包含至少一种试剂或成组试剂，其中所述至少一种试剂或成组试剂用于确定ANP32蛋白进行了如权利要求1-3任一项所述突变ANP32蛋白所进行的突变。
7.生产动物的方法，包括将动物体内的ANP32蛋白进行如权利要求1-3任一项所述的突变的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述动物选自鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠或马。
9.筛选治疗流感病毒感染的候选药物的方法，包括下述步骤：
(1)将含有ANP32A和/或ANP32B蛋白的细胞系敲除所述ANP32A和ANP32B蛋白，以获得敲除ANP32A蛋白和ANP32B蛋白的细胞系，
(2)将编码ANP32A和/或ANP32B蛋白的质粒和编码流感病毒聚合酶的质粒转染步骤(1)获得的敲除细胞系，
(3)用候选物接触所述敲除的细胞系，其中所述接触可以与步骤(2)的转染同时或分开进行，
其中与含有ANP32A和/或ANP32B的细胞系相比，经步骤(3)处理的细胞系不表达流感病毒聚合酶或流感病毒聚合酶的表达下降，说明所述候选物为治疗流感病毒感染的候选药物。
10.权利要求9的方法，其中所述ANP32A和/或ANP32B蛋白来源于鸡、人、斑胸草雀、鸭、火鸡、猪、鼠或马，优选所述流感病毒为选自人、犬、禽或马流感病毒。
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