CN104204196A - 新型减毒脊髓灰质炎病毒：PV-1单-cre-X - Google Patents

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Abstract

通过将天然复制元件(cre)工程化入5’非翻译基因组区域(位于2C(单-crePV)的编码区中的天然ere元件失活)，和用具有减少的密码子对偏好性的替代PI编码区替换衣壳编码区(PI)的全部或部分的核酸序列来产生新型的且稳定的减毒脊髓灰质炎病毒。稳定的减毒脊髓灰质炎病毒对于疫苗和免疫是有效的。

Description

新型减毒脊髓灰质炎病毒:PV-1单-cre-X
发明领域
本发明涉及新型减毒脊髓灰质炎病毒。减毒脊髓灰质炎病毒在组织培养中显示优良的生长表型同时稳定地维持极低的神经毒性。因此，将减毒病毒优选用于疫苗。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年12月16日提交的美国申请No.61/576,706(将所述申请通过引用整体并入本文)的优先权。
发明背景
脊髓灰质炎病毒(“PV”)基因组包含发夹结构，称为顺式作用复制元件(cre)，其为基因组复制所必需的。该cre元件位于2CATP酶蛋白的编码区中(在P2结构域内)。该环内的特定突变导致无复制表型。在P2中具有失活的cre的PV基因组可通过将在其它地方合成的cre插入PV基因组，例如5'非翻译区(5'NTR)来恢复活性。合成的cre在5’NTR的苜蓿叶式立体交叉与IRES之间的插入产生被称为PV-1(单-cre)的变体，其在HeLa细胞中以野生型动力学复制。在表达CD155的转基因小鼠中，脊髓灰质炎病毒受体PV-1(单-cre)被减毒，具有大于107个颗粒的LD50。然而，PV-1(单-cre)在33℃和37℃于Vero和MRC5细胞中生长良好。病毒对减毒作用的丢失具有抗性，因为cre元件必须被维持来进行病毒复制。
密码子在人mRNA的开放阅读框架中紧邻出现的频率不是在统计上从每一个密码子单独使用的频率所预期的。在人基因组的每一个基因中存在被过度代表的密码子对和未被充分代表的密码子对。通过使用全基因组化学合成，我们已显示未被充分代表的密码子对的过量减弱病毒基因的表达。此外，病毒的一个或数个ORF中的密码子对去最优化(相对于过度代表的密码子对增加未被充分代表的密码子对)可导致巨大的减弱。
我们先前已构建了密码子对去最优化的脊髓灰质炎病毒基因组PV-X。在该PV基因组中，759nt“X”区段(衣壳结构域的前三分之一)相较于wt PV基因组包含181个核苷酸的变化。PV基因组的该设计不仅被减毒，而且还具有减毒的表型将因X中的大量突变而不回复至完全毒力的有利方面。在完整区段的背景中，单个核苷酸逆转在表型上仅赋予极小的差异(如果有的话)。
发明概述
本发明提供了减毒脊髓灰质炎病毒，其在组织培养中显示优良的生长表型，同时稳定地维持极低的神经毒性。本发明提供了减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其包含位于苜蓿叶式立体交叉与内部核糖体进入位点(IRES)之间的5’-NTR的间隔区中的单个活性顺式作用复制元件(cre)和脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列(所述脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列的密码子对偏好性少于其所源自的亲代脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列的密码子对偏好性)。在本发明的实施方案中，活性cre元件被插入在核苷酸102/103。在本发明的实施方案中，cre元件如SEQ ID NO:1中一样定位。
在本发明的实施方案中，蛋白质编码序列的密码子对偏好性比亲代蛋白质编码序列的密码子对偏好性少至少约0.05，或少至少约0.1，少至少约0.2。在本发明的实施方案中，蛋白质编码序列具有约-0.05或更少，或约-0.1或更少，或约-0.3或更少，或约-0.4或更少的密码子对偏好性。在本发明的实施方案中，蛋白质编码序列与亲代病毒的蛋白质编码序列具有小于90％的同一性或小于80％的同一性。
在本发明的实施方案中，虽然在序列内交换密码子，但所得的蛋白质编码序列和亲代蛋白质编码序列编码相同的蛋白质。在本发明的实施方案中，蛋白质序列是蛋白质的天然分离物的蛋白质序列。在本发明的实施方案中，编码的蛋白质是Mahoney株的蛋白质。
在某些实施方案中，减毒脊髓灰质炎病毒基因组编码与天然分离物相异约10个氨基酸或更少，或约20个氨基酸或更少的蛋白质。在某些实施方案中，减毒脊髓灰质炎病毒基因组编码与其所源自的亲代蛋白质相异约10个氨基酸或更少或约20个氨基酸或更少的蛋白质。在本发明的实施方案中，减毒脊髓灰质炎病毒基因组包含PV-Min(SEQIDNO:2)的从核苷酸755至核苷酸1514的核苷酸序列。在另一个实施方案中，减毒脊髓灰质炎病毒基因组包含SEQ IDNO:3。
本发明提供了包含上述脊髓灰质炎病毒基因组中任一种减毒脊髓灰质炎病毒。本发明还提供了包含这样的减毒脊髓灰质炎病毒的疫苗组合物，以及用于通过给受试者施用有效剂量的疫苗组合物来引发受试者的免疫反应的方法。
本发明提供了产生减毒脊髓灰质炎病毒基因组的方法，其包括制备核酸序列，所述核酸序列包含位于苜蓿叶式立体交叉与内部核糖体进入位点(IRES)之间的5’-NTR的间隔区中的顺式作用复制元件(cre)，和脊髓灰质炎病毒蛋白质编码核苷酸序列，其具有比其所源自的亲代脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列的密码子对偏好性少的密码子对偏好性。根据本发明，减少的密码子对偏好性蛋白质编码序列通过重排亲代脊髓灰质炎病毒核苷酸序列的密码子来制备。在本发明的实施方案中，重排的序列编码与亲代脊髓灰质炎病毒核苷酸序列相同的蛋白质。本发明还提供了将脊髓灰质炎病毒引入适当的宿主细胞和培养所述宿主细胞以产生脊髓灰质炎病毒。本发明还提供了包含这样的重组脊髓灰质炎病毒及其使用说明材料的试剂盒。
附图简述
图1.野生型PV和亲代减毒PV株的基因组结构。举例说明了脊髓灰质炎病毒1型Mahoney(“PV(M)”)和使用的嵌合病毒的基因组结构。PVM的IRES序列以黑色显示。2C编码区中的cre元件显示为茎-环。在单-cre株中，天然cre(2C)通过其保守序列中由"X"指示的突变来灭活(Toyoda,H.,等人,Cancer Res March15,2007,67；2857)。将野生型cre的第二拷贝插入苜蓿叶式立体交叉与IRES之间。在命名为PV-X的株系中，P1编码区的部分(nt755-nt1513，显示为灰色条块)包含未被充分代表的密码子对(Coleman,J.R.,等人,Science,2008年6月27日,320(5884):1784-7)。
图2.PVM和PV-1(单cre-X)的生长表型。在左边举例说明了PVM和PV-1(单cre-X)的基因组结构。将RNA转录物转染进入HeLa(R19)细胞并通过噬菌斑测定在CPE滴定获得病毒(如果有的话)。
图3.单-cre-X病毒在HeLa(R19)、MRC5和293T细胞中的一步生长曲线。以0.5的MOI感染细胞并将其在33℃、37℃和39.5℃下进行温育。通过在HeLa(R19)细胞的单层上进行噬菌斑测定来确定病毒滴度。
图4.PV(M)脊髓灰质炎病毒、单-crePV和双重-crePV的基因组组织。单链RNA在非翻译区(5’-NTR)的5’末端共价连接于病毒编码的蛋白质VPg。5’-NTR由被间隔区分隔的两个顺式作用结构域、苜蓿叶式立体交叉和内部核糖体进入位点(IRES)组成。IRES控制由结构(P1)区和非结构区(P2和P3)组成的多聚蛋白质(空心框)的翻译，指定了复制蛋白质。在2CATP酶编码区内，指示了顺式复制元件(cre)。3’-NTR包含杂聚区域并且被多腺苷酸化。RNA复制需要所有三个结构元件，苜蓿叶式立体交叉、cre和3’-NTR。将复制的cre插入苜蓿叶式立体交叉与IRES(双重-crePV)之间的间隔区。通过如由茎环(单-crePV)上的X指示的突变灭活2CATP酶中的天然cre。
图5.(A)确定人和病毒ORF的密码子对偏好性。每一个点代表针对其长度作图的一个ORF的平均密码子对分数每密码子对。计算14,795个注释的人基因的密码子对偏好性(CPB)。未被充分代表的密码子对产生负分数。将不同脊髓灰质炎病毒P1构建体(由具有箭头的符号代表的)的CPB作图。图举例说明了大量人基因簇集在0.1周围。显示了PV(M)-wt(标记的“WT”)(-0.02)、自定义的合成的脊髓灰质炎病毒衣壳PV-Max(+0.25)、PV-Min(-0.48)以及PV(M)-wt:PV-Min嵌合衣壳PV-Min755-2470(＝“PV-MinXY”)(-0.31)和PV-Min2470-3386(＝“PV-MinZ”)(-0.20)的CPB。(B)描绘了不同嵌合的、部分合成的脊髓灰质炎病毒构建体的结构。PV-Min X在本文中也称为PV-X。
发明详述
本发明提供了高度减毒的脊髓灰质炎病毒，其适合用于疫苗和用于治疗或改善人实体瘤例如儿童的神经母细胞瘤。本发明的减毒脊髓灰质炎病毒包含调节减毒作用的两个特征。一个特征是称为顺式作用复制元件(cre)的发夹结构至脊髓灰质炎病毒基因组的5’非翻译区(5’NTR)的插入。第二特征是脊髓灰质炎病毒基因组的蛋白质编码部分的密码子对偏好性的减少。
根据本发明，可使脊髓灰质炎病毒分离株稳定地减毒，和增强复制性质。这样的脊髓灰质炎病毒可以是天然存在的分离株或其衍生物。本文中例举了脊髓灰质炎病毒1型(Mahoney)(PV1(M))。神经毒性脊髓灰质炎病毒的其它非限定性实例包括P3/Leon/37(减毒沙宾(Sabin)疫苗所源自的)以及那些P3/Leon/37和Mahoney的神经毒性衍生物。例如，存在于减毒脊髓灰质炎病毒(例如沙宾)中的非减毒突变在本领域中与引起减毒作用的那些突变是有区别的。其它实例为来自长期分泌疫苗来源的脊髓灰质炎病毒的个体的脊髓灰质炎病毒分离株。
Cre至5’NTR的插入
当脊髓灰质炎病毒基因组的苜蓿叶式立体交叉与IRES之间的间隔区被病毒不能承受其缺失的必需RNA复制元件中断时，产生稳定的减毒表型。这样的元件为cre，定位至天然脊髓灰质炎病毒中的病毒蛋白质2CATP酶的编码区的茎环结构(图1，顶图)。根据本发明，在脊髓灰质炎病毒基因组的5’-NTR中在导致病毒减毒的位置上提供单个活性cre元件，其中将可逆转减毒作用的元件的任何突变导致cre元件的失活使得脊髓灰质炎病毒变成不能存活的。根据本发明，将活性cre元件插入苜蓿叶式立体交叉与内部核糖体进入位点(IRES)之间的5’-NTR的间隔区内。在具体实施方案中，将cre元件插入在核苷酸102/103的间隔区。这样的cre元件的再工程化描述于美国专利8,066,983中，将所述美国专利通过引用并入本文。
应理解，减毒的能力取决于位于5’-NTR中的为唯一活性cre元件的cre元件。因此，位于脊髓灰质炎病毒基因组的2C编码区中的天然cre元件被灭活。通常地，存在于编码区中的天然cre元件的序列被突变来灭活cre元件，但不改变由cre元件的核苷酸编码的氨基酸。然而，导致保守氨基酸置换的突变是可允许的。保守氨基酸置换是利用具有一般相似性质(如，酸性、碱性、芳香族、尺寸、带正电荷或带负电荷的、极性、非极性)的氨基酸的置换以便置换大体上不改变肽、多肽或蛋白质特征(如，电荷、等电点、亲和力、亲合力、构象和溶解度)或活性。对于这样的保守氨基酸置换可进行的典型置换可在如下的氨基酸的组之中：
甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)；
天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；
组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸(R)：
天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；
苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
根据本发明，将cre元件插入苜蓿叶式立体交叉与内部核糖体进入位点(IRES)之间的5’-NTR，以便产生减毒病毒。如本文中所例举的，将cre元件插入在PV1(M)的5’-NTR(参见SEQ ID NO:1)的核苷酸102/103上产生的NheI位点，但定位不必这样精确。可以例如通过噬菌斑测定或本领域已知用于测量病毒复制的其它技术来确定减毒作用。已在几种小核糖核酸病毒包括脊髓灰质炎病毒1型和3型、人鼻病毒(如，HRV2和HRV14)中鉴定cre元件。cre元件经预测与发夹的环部分上的约14个核苷酸的保守序列形成发夹结构。在本发明的实施方案中，cre元件来自指定为PV1(M)的脊髓灰质炎病毒1型。
如本文中例举的，减毒脊髓灰质炎病毒的复制性质可通过体外和体内传代来增强。如本文中所显示的，突变在传代过程中在本发明的减毒病毒中发生，但未观察到在被工程化入5’-NTR的cre元件中发生。因此，病毒的减毒作用未被克服。相反地，突变提供了增强有益于肿瘤的溶瘤治疗的复制性质。此外，这样的突变是可容易获得的。因此，本发明提供了在5’-NTR中包含单个活性cre调控元件的稳定地减毒脊髓灰质炎病毒。
密码子对偏好性
大多数氨基酸由不止一个密码子编码。例如，丙氨酸由GCU、GCC、GCA和GCG编码。三个氨基酸(Leu、Ser和Arg)由六个不同的密码子编码，然而仅Trp和Met具有唯一密码子。“同义”密码子是编码相同氨基酸的密码子。因此，例如CUU、CUC、CUA、CUG、UUA和UUG是编码Leu的同义密码子。同义密码子不以相同的频率使用。一般地，特定生物体中最频繁使用的密码子是关联tRNA对于所述密码子是丰富的那些密码子，并且这些密码子的使用增加蛋白质翻译的速率和/或准确性。相反地，很少使用的密码子的tRNA以相对低的水平被发现，并且稀有密码子的使用被认为减小翻译速率和/或准确性。因此，用同义但不太频繁使用的密码子替代核酸中给定的密码子是将“去最优化的”密码子置换入核酸。
此外，给定的生物体对于给定的密码子的最近密码子邻居具有优先选择，称为密码子对利用的偏好性。密码子对偏好性的改变可影响蛋白质合成的速率和蛋白质的产生。重要地，可利用未被充分代表的密码子对设计基因，所述基因不使用不同的密码子(密码子偏好性未改变)和/或不改变编码的蛋白质的氨基酸序列。因此，利用不太频繁使用的编码相同氨基酸的密码子对替代给定的密码子对是使密码子对选择去最优化。
密码子对偏好性可通过考虑氨基酸对Ala-Glu来举例说明，所述氨基酸对可由8个不同的密码子对来编码。如果除每一个个别密码子的频率外的因素都不负责密码子对的频率，则8个编码的每一个的预期频率可通过将两个相关密码子的频率相乘来计算。例如，通过该计算，密码子对GCA-GAA预期可以在所有Ala-Glu编码对中以0.097的频率(0.23x0.42，基于表1中的频率)发生。为了使每一个密码子对的预期(理论)频率与在人基因组中实际观察到的频率有关联，使用包含总共14,795个人基因的始终注释的人编码区的共有CDS(CCDS)数据库。该组基因是人编码序列的最广泛代表。使用该组基因通过将密码子出现的次数除以编码相同氨基酸的所有同义密码子的数目来重新计算密码子选择的频率。如所预期的，频率与先前公布的频率例如表1中给出的频率密切相关。微小的频率变化可能归因于由Kazusa DNA研究所的密码子选择数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/codon.html)提供的数据的采样过密效应，其中在计算中包括了84949个人编码序列(远多于人基因的实际数目)。因此将所计算的密码子频率然后如下用于计算预期的密码子对频率：首先将两个相关密码子的频率彼此相乘(参见表2预期的频率)，然后将该结果乘以观察到的由谈及的所述密码子对编码的氨基酸对出现的频率(在整个CCDS数据集中)。在密码子对GCA-GAA的实例中，该第二计算给出了0.098的预期频率(相较于使用Kazusa数据集的第一计算中的0.97)。最后，如下确定在一组14,795个人基因中观察到的实际密码子对频率：计数组中每一个密码子对出现的总数，将其除以组中编码相同氨基酸对的所有同义编码对的数目(表3；观察到的频率)。将基于14,795个人基因的组的3721个(612)密码子对的完全组的频率和观察到的/预期的值作为表1的补充提供于此。
如果密码子对的观察到的频率/预期的频率的比率大于一，则密码子对被认为是被过度代表的。如果比率小于一，则其被认为是未被充分代表的。在实例中，密码子对GCA-GAA被过度代表1.65倍，然而密码子对GCC-GAA未被充分代表超过5倍。
许多其它密码子对显示极强的偏好性；一些对未被充分代表，然而其它对被过度代表。例如，密码子对GCCGAA(AlaGlu)和GATCTG(AspLeu)未被充分代表三至六倍(优选对分别为GCAGAG和GACCTG)，然而密码子对GCCAAG(AlaLys)和AATGAA(AsnGlu)被过度代表约两倍。值得注意地，密码子对偏好性与成对的氨基酸的频率无关，与个别密码子的频率也无关。例如，未被充分代表的对GATCTG(AspLeu)恰好使用最常用的Leu密码子(CTG)。
如下文中更全面论述的，密码子对偏好性考虑了在编码序列的整个长度上平均的编码序列中的每一个密码子对的分数。根据本发明，密码子对偏好性通过来确定。
因此，编码序列的类似密码子对偏好性可以例如通过使子序列上的密码子对分数最小化或使编码序列的全长上的密码子对分数适度减小来获得。例如，图4A显示包含PV-Min的“XY”或“Z”片段的P1序列的中等密码子对减少。通过PV-MinZ达到的相同密码子对偏好性的减少可通过交换整个P1序列内的密码子来实现，但每碱基对的减少不太极端。通过密码子对偏好性的减少进行的脊髓灰质炎病毒的减毒由PCT/US/2008/058952(将其通过引用并入本文)公开。
密码子对偏好性的计算.
包含可能的非-"终止"的密码子对的每一个个别的密码子对(如，GTT-GCT)具有对于给定的基因的"训练集"是特异性的分配的“密码子对分数”或“CPS”。给定的密码子对的CPS被定义为观察到的出现数目对可在该组基因(在本实例中为人基因组)中预期的数目的对数比率。确定特定密码子对出现的实际数目(或换句话说由特定密码子对编码的特定氨基酸对的可能性)不过是计数特定组的编码序列中密码子对出现的实际数目。然而，确定预期的数目需要另外的计算。计算预期的数目以便不依赖于氨基酸频率和与Gutman和Hatfield相似的密码子偏好性。即，基于由特定密码子编码的氨基酸的次数的相对比例来计算预期的频率。正CPS值表示给定的密码子对在统计上被过度代表，负CPS表示对在基因组中在统计上未被充分代表。
为了在人背景内进行这些计算，使用包含总共14,795个基因的注释的人编码区的共有CDS(CCDS)数据库。该数据集提供了密码子和密码子对，以及从而基因组尺度上的氨基酸和氨基酸对的频率。
Federov等人(2002)的范例被用于进一步增强Gutman和Hatfield(1989)的方法。这允许不依赖于编码特定氨基酸对的相邻密码子的密码子频率和非随机关联性计算给定密码子对的预期的频率。
S ( P ij ) = ln ( N o ( P ij ) N E ( P ij ) ) = ln ( N o ( P ij ) F ( C i ) F ( C j ) N o ( X ij ) )
在计算中，Pij是在其同义组中以NO(Pij)的频率出现的密码子对。Ci和Cj是包含Pij的分别以频率F(Ci)和F(Cj)出现在它们的同义组中两个密码子。更具体地，F(Ci)是由密码子Ci遍及所有编码区编码对应氨基酸Xi的频率，并且F(Ci)＝NO(Ci)/NO(Xi)，其中NO(Ci)和NO(Xi)分别是密码子Ci和氨基酸Xi的观察到的出现数目。相应地计算F(Cj)。此外，NO(Xij)是氨基酸对Xij遍及所有编码区出现的数目。Pij的密码子对偏好性分数S(Pij)被计算为观察到的频率No(Pij)对预期的Ne(Pij)出现数目的对数差异比。
通过使用上述公式，从而可确定当与通过使用整个人CCDS数据集计算的对应基因组Ne(Pij)值比较时，个别编码序列中的个别密码子对被过度代表还是未被充分代表。该计算对于人编码区中的被过度代表的密码子对产生正S(Pij)分值，对于未被充分代表的密码子对产生负值(图4)。
个别编码序列的“组合”密码子对偏好性通过按照下列公式平均所有密码子对分数来计算：
S ( P ij ) = Σ l = 1 k S ( Pij ) l k - 1 .
整个编码区的密码子对偏好性从而通过将所有包含所述区域的个别密码子对分数相加，然后将该总数除以编码序列的长度来计算。
减毒PV可来源于脊髓灰质炎病毒1型(Mahoney；“PV(M)”)、脊髓灰质炎病毒2型(Lansing)、脊髓灰质炎病毒3型(Leon)、单价口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)病毒或三价OPV病毒。在某些实施方案中，减毒脊髓灰质炎病毒包含PV-Min的衣壳编码区(从核苷酸755至核苷酸3385的P1区域)的全部或部分(SEQ ID NO:1)，其被从PV(M)重新设计来引入最大可能数目的很少使用的密码子对。在某些实施方案中，减毒脊髓灰质炎病毒包含PV-Min的从核苷酸755-1513(如，PV-Min X)、从核苷酸755-2470(如，PV-Min XY)、从核苷酸1513-3385(如，PV-Min YZ)、从核苷酸2470-3385(如，PV-Min Z)或从核苷酸1513-2470(如，PV-Min Y)的核苷酸。命名反映了其中PV编码区的部分被PV-Min的核苷酸替代的脊髓灰质炎病毒基因组。本发明不限于上述部分。
应理解，许多核苷酸序列可通过改组编码序列内的同义密码子来产生。例如，始于任何特定蛋白质编码核苷酸序列，可通过改组该序列中的存在的同义密码子产生许多编码相同蛋白质序列并具有减少的密码子对偏好性的核苷酸序列。因此，本发明的减毒病毒包括包含在本文中明确例举的核苷酸序列以及编码相同PV蛋白质的具有减少的密码子对偏好性的其它核酸序列的那些病毒。
本发明还包括脊髓灰质炎病毒蛋白质序列的变化，包括脊髓灰质炎病毒分离株间的氨基酸序列变化以及可在疫苗开发中引入的氨基酸变化。这样的变化可以与或可以不与病毒的减毒或复制适应性相关。应理解，这样的密码子置换可升高或降低密码对分数，但所述效应与在序列中产生的和从序列除去的密码子对相关，而不与被置换的密码子的频率相关。因此，在其中同义密码子被改组的核苷酸序列中，还可存在密码子置换。即便如此，可计算序列的密码子对偏好性，减少的密码子对偏好性反映病毒的减毒作用。在本发明的实施方案中，具有减少的密码子对偏好性的脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列编码与天然分离株相异10个氨基酸或更少的蛋白质。在本发明的另一个实施方案中，具有减少的密码子对偏好性的脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列编码与天然分离株相异20个氨基酸或更少的蛋白质。在本发明的另一个实施方案中，设计脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列，该序列具有减少的密码子对偏好性并且编码与初始蛋白质序列相异10个氨基酸或更少的设计的蛋白质。在本发明的另一个实施方案中，设计脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列，该序列具有减少的密码子对偏好性并且编码与初始蛋白质序列相异20个氨基酸或更少的设计的蛋白质。在某些实施方案中，置换是保守置换，如上文中所示的。
疫苗组合物
本发明提供了用于诱导受试者的保护性免疫反应的疫苗组合物，其包含本文中描述的任何减毒病毒和药学上可接受的载体。
应当理解，当用于引发受试者的保护性免疫反应或防止受试者患有病毒相关疾病时，以额外地包含药学上可接受的载体的组合物的形式给受试者施用本发明的减毒病毒。药学上可接受的载体对于本领域技术人员来说是公知的，包括但不限于0.01-0.1M，优选0.05M的磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲盐溶液(PBS)或0.9％的生理盐水中的一种或多种。这样的载体还包括含水或非含水溶液、悬浮液和乳液。含水载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬浮液、盐水和缓冲介质。非含水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液和不挥发油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂例如基于林格氏葡萄糖的那些补充剂等。固体组合物可包含无毒固体载体例如葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素或纤维素衍生物、碳酸钠和碳酸镁。为了以气雾剂施用，例如为了经肺和/或鼻内递送，优选用无毒表面活性剂例如C6至C22脂肪酸的酯或部分酯或天然甘油酯和推进剂配制试剂或组合物。另外的载体例如卵磷脂可被包含来促进鼻内递送。药学上可接受的载体还可包含少量辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和其它添加剂例如抗微生物剂、抗氧化剂和螯合剂，其增加活性成分的贮存期限和/或功效。如在本领域是公知的，可这样配制本发明的组合物以在给受试者施用后提供活性成分的快速、持久或延迟的释放。
在本发明的疫苗组合物的不同实施方案中，减毒病毒(i)大体上不改变病毒蛋白质在被感染的细胞中的合成和加工；(ii)产生与wt病毒相似量的病毒体每被感染的细胞；和/或(iii)显示比wt病毒显著更低的病毒体特异感染性。在其它实施方案中，减毒病毒在宿主动物中诱导与对应wt病毒大体上相似的免疫反应。
本发明还提供了特别地分离的或经工程化以允许不能在野生型宿主细胞中存活的减毒病毒在其中存活的修饰宿主细胞系。由于减毒病毒不能在正常(野生型)宿主细胞中生长，其绝对依赖于特异性辅助细胞系来进行生长。这为用于疫苗生产的病毒的产生提供了极高水平的安全性。本发明的修饰细胞系的不同实施方案允许减毒病毒生长，其中所述细胞系的基因组已被改变来增加编码稀有tRNA的基因的数目。
此外，本发明提供了用于引发受试者的保护性免疫反应的方法，其包括给受试者施用在预防或治疗有效剂量的本文中描述的任何疫苗组合物。本发明还提供了用于预防受试者患有病毒相关疾病的方法，其包括给受试者施用预防有效剂量的任何本发明的疫苗组合物。在上述方法的实施方案中，受试者已被暴露于致病病毒。“暴露于”致病病毒意指与病毒接触以便可发生感染。
本发明还提供了用于在被病毒感染的受试者中延迟病毒相关疾病发作、或减慢其进展速度的方法，其包括给受试者施用治疗上有效剂量的任何本发明的疫苗组合物。
如本文中所用，“施用”意指使用对于本领域技术人员来说是已知的不同方法和递送系统的任一个进行的递送。可以通过例如腹膜内、大脑内、静脉内、口服、经粘膜、皮下、经皮肤、皮内、肌内、局部、胃肠外、通过植入、鞘内、淋巴管内、伤口内、经心包或硬膜外途径进行施用。还可以以气雾剂形式施用试剂或组合物，例如用于经肺和/或鼻内递送。可例如一次、多次和/或超过一个或多个延长的时期进行施用。
引发受试者的保护性免疫反应可以例如通过给受试者施用主剂量的疫苗，随后在一段适当的时期后通过一个或多个疫苗的随后施用来实现。疫苗施用之间的适当时期可容易地由本领域技术人员来确定，通常为约数周至数月。然而，本发明不限于施用的任何特定方法、途径或频率。
“受试者”意指任何动物或人工修饰动物。动物包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、马、绵羊、猪、犬、猫、兔、白鼬、啮齿类动物例如小鼠、大鼠和豚鼠以及禽类。人工修饰动物包括但不限于具有人免疫系统的SCID小鼠和表达人脊髓灰质炎病毒受体CD155的CD155tg转基因小鼠。在优选实施方案中，受试者为人。禽类的优选实施方案是家养的家禽种类，包括但不限于鸡、火鸡、鸭和鹅。
“预防有效剂量”是当给易受病毒感染或易患病毒相关病症的受试者施用时，诱发受试者的保护受试者免受病毒感染或免患所述病症的免疫反应的疫苗的任何量。“保护”受试者意指至少两倍，优选至少十倍地减少受试者被病毒感染的概率或病症在受试者中发作的概率。例如，如果受试者具有1％的被病毒感染的可能性，则受试者被病毒感染的概率的两倍减少可导致受试者具有0.5％的被病毒感染的可能性。最优选，“预防有效剂量”诱发受试者的完全防止受试者被病毒感染或完全防止受试者的病症发作的免疫反应。
如本文中所用，“治疗上有效剂量”是当给患有疫苗针对其是有效的病症的受试者施用时，诱发受试者的免疫反应的疫苗的任何量，所述免疫反应引起受试者经历病症和/或其症状的减少、缓解或消退。在优选实施方案中，病症和/或其症状的复发被阻止。在其它优选实施方案中，受试者的病症和/或其症状被治愈。
本发明的免疫和治疗法的任何方法的某些实施方案还包括给受试者施用至少一种佐剂。“佐剂”意指适合用于增强抗原的免疫原性和加强受试者的免疫反应的任何试剂。适合用于基于蛋白质和核酸的疫苗的许多佐剂，包括颗粒佐剂和将佐剂与抗原组合的方法对于本领域技术人员来说是公知的。用于基于核酸的疫苗的适当的佐剂包括但不限于Quil A、咪喹莫特、瑞喹莫德和以纯化的蛋白质或核酸形式递送的白细胞介素-12。适合与蛋白质免疫一起使用的佐剂包括但不限于矾、弗氏不完全佐剂(FIA)、皂苷、Quil A和QS-21。
本发明还提供了用于利用本发明的减毒病毒免疫受试者的试剂盒。试剂盒包括减毒病毒、药学上可接受的载体、涂药器及其使用说明书。在其它实施方案中，减毒病毒可以是一种或多种脊髓灰质炎病毒、一种或多种鼻病毒、一种或多种流感病毒等。超过一种病毒可以是优选的，其中期望免疫宿主以抵御特定病毒的许多不同分离株。本发明包括对于本领域技术人员来说是已知的试剂盒的其它实施方案。说明书可提供用于指导减毒病毒的施用的任何信息。
在整个本申请中，各种出版物、参考书、教科书、技术手册、专利和专利申请已被提及。将这些出版物、专利、专利申请以及其它文献的教导和公开内容通过引用整体并入本申请以更全面描述本发明所属领域的状态。然而，本文中引用的参考资料不应当被理解为这样的参考资料是本发明的现有技术的确认。
应当理解和预期，本文中公开的本发明的原理的变化可由本领域技术人员来产生，并且期望这样的修改包括在本发明的范围内。下列实施例进一步举例说明本发明，但不应当理解为以任何方式限定本发明的范围。常规方法例如用于重组质粒的构建、利用病毒构建体对宿主细胞的转染、聚合酶链式反应(PCR)和免疫学技术的详细说明可获自许多出版物，包括Sambrook等人(1989)和Coligan等人(1994)。将本文中提及的所有参考资料通过引用整体并入本申请。
实施例1
脊髓灰质炎病毒和重组疫苗候选者的特异感染性和减毒作用。
比较重组脊髓灰质炎病毒疫苗候选者与PVM野生型脊髓灰质炎病毒的特异感染性和减毒作用。病毒在HeLa细胞上生长。病毒颗粒浓度通过光密度(1OD260＝9.4x1012个颗粒/ml)来确定。蚀斑形成单位/ml通过HeLa(R19)噬菌斑测定来确定并计算病毒颗粒对PFU的比率。相对特异感染性通过针对野生型值标准化颗粒/PFU来确定。通过脑内注射将病毒施用至CD155转基因小鼠(其表达PV受体)，并确定引起50％的小鼠瘫痪的剂量(PLD50)。
表3显示wt PV的基因组中的cre元件的工程化显著减小病毒的神经毒力和相对特异感染性。令人惊讶地，PV1-X的表征显示PV基因组的前三分之一的去最优化不赋予神经减毒的(neuroattenuated)表型，但减小去最优化的病毒的相对特异感染性。
表3显示PV1-单-cre-X产生约为任一减毒亲代三倍的病毒颗粒每蚀斑形成单位。此外，相对特异感染性相对于亲代减毒病毒显著减小。该结果表明在减小高度神经减毒的PV1-单-cre-X病毒的相对特异感染性上在cre元件与去最优化的P1之间存在协同效应。
实施例2
具有回复突变的病毒是神经神经减毒的。
脊髓灰质炎病毒的神经减毒作用通常因少数位置上的突变而引起。例如沙宾脊髓灰质炎病毒疫苗株的IRES内的点突变是减毒表型的决定子。因此，这样的减毒脊髓灰质炎病毒频繁地回复至完全神经毒性的野生型表型。在于神经元细胞中重复传代后，PV1-单-cre病毒(Ld50>108)和PV1-单-cre-X病毒(Ld50>108)显示A133G突变，该突变增加小鼠的神经病发生力，尽管突变的病毒相较于wt脊髓灰质炎病毒(LD50＝101.9)仍然是减毒的。A133GPV1-单-cre病毒和A133G PV1-单-cre–X病毒的LD50分别是104.5和105.6。
PV1-单-cre病毒和PV1-单-cre-X病毒的相对特异感染性分别为0.25和0.084。同时，A133G PV1-单-cre病毒和A133G PV1-单-cre–X病毒的相对特异感染性分别为0.44和0.25。这些数据表明A133G突变还与突变的病毒的特异感染性的增强相关，尽管仍然低于wt PV1(相对特异感染性＝1)。
总而言之，这些结果表明如果可发生逆转，在逆转病毒中，PV1-单-cre病毒的去最优化改善了A133G逆转的效应，因为A133G PV1-单-cre–X病毒比A133G PV1-单-cre病毒减弱1个log10，并且突变的去最优化的病毒的相对特异感染性比A133G PV-单-cre病毒低。更重要地，我们的数据表明如果发生逆转，那么PV1-单-cre-X的逆转病毒仍然被高度神经减毒，与对于回复至完全野生型神经毒力表型的沙宾株观察到的相反。
实施例3
质粒的构建和DNA操作。
神经毒性脊髓灰质炎病毒1型(Mahoney)是用于实验室的株系(Cello,2002)。脊髓灰质炎病毒cDNA序列是由Cello等人(2002)用于cDNA合成的序列(质粒pT7PVM)(van der Werf,等人,1986,Proc NatlAcad Sci U S A83:2330–4)。“pT7PVMcre(2CATP酶)突变体”是全长脊髓灰质炎病毒cDNA克隆，其中2CATP酶编码区中的天然cre元件通过在nt4462(G至A)、4465(C至U)和4472(A至C)上引入三个突变来灭活(Yin,等人,2003,J.Virol.77:5152–66；Paul,2003,在:Semler BL,Wimmer E,编辑。Molecular biology of picornaviruses.Washington(DC):ASM Press；2002.第227–46页；Rieder,等人,2000,J.Virol.74:10371–80)。双重-cre PV是具有两个活性cre元件的pT7PVM的衍生物；一个在5’-NTR的nt102/103上，在所述5’-NTR上产生新的NheI限制位点。第二cre元件在2CATP酶编码区中(图1A)。单-crePV在间隔区中具有活性cre，而2CATP酶编码区中的天然cre已被灭活(图1A)。图4显示单-crePV基因组的结构：将单链RNA在非翻译区的5’末端(5’-NTR)共价地连接于病毒编码的蛋白质VPg。5’-NTR由通过间隔区分隔的两个顺式作用结构域、苜蓿叶式立体交叉和内部核糖体进位位点(IRES)组成。IRES控制由结构(P1)区和非结构区(P2和P3)组成的多聚蛋白质(空心框)的翻译，指定了复制蛋白质。在2CATP酶编码区内，指示了顺式复制元件(cre)。3’-NTR包含杂聚区域并且被多腺苷酸化。RNA复制需要所有三个结构元件，苜蓿叶式立体交叉、cre和3’-NTR。2CATP酶中的天然cre通过由X指示的突变灭活(单-crePV)。
实施例4
体外转录、转染和一步生长曲线。
利用DraI线性化所有质粒。利用噬菌体T7RNA聚合酶合成RNA，利用先前所述的DEAE-葡聚糖法(vanderWerf,1986)将RNA转录物转染进入HeLa细胞单层。温育时间达到2天，通过噬菌斑测定(Pincus,等人,1986,J.Virol.57:638–46.)确定病毒滴度。如下进行HeLa、MRC5和293T细胞的一步生长曲线。以为10的感染复数(MOI)感染细胞单层(1x106个细胞)。将板在如所指定的33℃、37℃或39.5℃进行温育，并在感染后0、2、4、6、8、12、24、48和72h收集细胞。将板经历三个连续的冻融循环，并如先前所述(Pincus,1986)，通过在HeLa细胞单层上进行噬菌斑测定来确定上清液的病毒滴度。
结果示于图3中。单-cre-X在所有三个温度下于HeLa细胞中高效复制。使用MRC5也在33℃和37℃获得单-cre-X的高滴度，但在39.5℃复制减少。在293T细胞中，复制在37℃和39.5℃被强烈限制。

Claims (16)

1.一种减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其包含：
单个活性顺式作用复制元件(cre)，所述cre元件位于苜蓿叶式立体交叉与内部核糖体进入位点(IRES)之间的5’-NTR的间隔区中，和
脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列，所述脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列的密码子对偏好性少于其所源自的亲代脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列的密码子对偏好性。
2.根据权利要求1所述的减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其包含插入在核苷酸102/103处的单个活性cre元件。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其中所述cre元件如SEQIDNO:1中一样定位。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其中所述蛋白质编码序列的密码子对偏好性比所述亲代蛋白质编码序列的密码子对偏好性少至少约0.05，优选少至少约0.1，更优选少至少约0.2。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其中所述蛋白质编码序列具有约-0.05或更少，优选约-0.1或更少，更优选约-0.2或更少，更优选约-0.3或更少，更优选约-0.4或更少的密码子对偏好性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其中所述蛋白质编码序列与所述亲代病毒的蛋白质编码序列具有小于90％的同一性，优选小于80％的同一性。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其中所述蛋白质编码序列和所述亲代蛋白质编码序列编码相同的蛋白质。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其中所述亲代蛋白质编码序列编码蛋白质的天然分离物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其中所述亲代蛋白质编码序列是Mahoney株的蛋白质编码序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其中所述蛋白质编码序列编码与天然分离物相异约10个氨基酸或更少，优选约20个氨基酸或更少的蛋白质。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其中所述修饰的蛋白质编码序列包含PV-Min(SEQIDNO:2)的从核苷酸755至核苷酸1514的序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的减毒脊髓灰质炎病毒基因组，其包含SEQIDNO:3。
13.一种减毒脊髓灰质炎病毒，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的脊髓灰质炎病毒基因组。
14.一种产生减毒脊髓灰质炎病毒基因组的方法，其包括：
制备核酸序列，其包含
位于所述苜蓿叶式立体交叉与内部核糖体进入位点(IRES)之间的5’-NTR的间隔区中的顺式作用复制元件(cre)，和
脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列，所述脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列的密码子对偏好性少于其所源自的亲代脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列的密码子对偏好性。
15.根据权利要求14所述的方法，其中通过重排所述亲代脊髓灰质炎病毒核苷酸序列的密码子以获得突变的核苷酸序列来产生所述减毒脊髓灰质炎病毒基因组的脊髓灰质炎病毒蛋白质编码序列，所述突变的核苷酸序列编码与所述亲代脊髓灰质炎病毒核苷酸序列相同的氨基酸序列。
16.根据权利要求14或15中任一项所述的方法，其还包括将所述脊髓灰质炎病毒引入适当的宿主细胞以及培养所述宿主细胞来产生所述脊髓灰质炎病毒。
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