CN116249708A - 通过去优化修饰的口蹄疫活减毒毒株及其用途 - Google Patents
通过去优化修饰的口蹄疫活减毒毒株及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116249708A CN116249708A CN202180061079.7A CN202180061079A CN116249708A CN 116249708 A CN116249708 A CN 116249708A CN 202180061079 A CN202180061079 A CN 202180061079A CN 116249708 A CN116249708 A CN 116249708A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- deoptimized
- virus
- fmdv
- foot
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 title claims abstract description 203
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 title claims description 26
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title description 26
- 238000005457 optimization Methods 0.000 title description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 178
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 127
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 143
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 13
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 10
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- 230000037452 priming Effects 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004075 alteration Effects 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 37
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 35
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 21
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 20
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 17
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 16
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 12
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 10
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 9
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 8
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 5
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 GCCGAA Chemical compound 0.000 description 4
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 4
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 4
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 4
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-(octadecanoyloxy)propyl octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N L-alanyl-L-glutamic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 2
- 101800001554 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N alpha-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 2
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100024002 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U Human genes 0.000 description 1
- 108010085697 Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoprotein U Proteins 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000711897 Rinderpest morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 208000032140 Sleepiness Diseases 0.000 description 1
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001266 bandaging Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PASHVRUKOFIRIK-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate dihydrate Chemical compound O.O.[Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O PASHVRUKOFIRIK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013552 cultured cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N cytidylyl-(3'->5')-guanosine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O)[C@@H](CO)O1 CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940057307 dihydrate calcium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229940074045 glyceryl distearate Drugs 0.000 description 1
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- KJLLKLRVCJAFRY-UHFFFAOYSA-N mebutizide Chemical compound ClC1=C(S(N)(=O)=O)C=C2S(=O)(=O)NC(C(C)C(C)CC)NC2=C1 KJLLKLRVCJAFRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000017610 release of virus from host Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 102200126728 rs587777863 Human genes 0.000 description 1
- 102220233283 rs759453873 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 231100000735 select agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000007940 sugar coated tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000006656 viral protein synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000007485 viral shedding Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
- A61K39/135—Foot- and mouth-disease virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
- C12N2770/32121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
- C12N2770/32134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本公开描述了去优化的口蹄疫病毒及其在哺乳动物受试者的预防性和治疗性治疗中的用途。本文提供的重组病毒包括几个基因组区域中的改变以及区分感染动物和接种疫苗动物(DIVA)标记。
Description
交叉引用
本申请要求2020年5月27日提交的美国临时专利申请序列号63/030,431(其内容通过引用明确并入本文)的优先权。
发明背景
发明领域
本发明涉及减毒病毒和病毒性疾病的预防性和治疗性治疗。
背景技术
口蹄疫(FMD)是偶蹄类动物中接触传染性最高的病毒性疾病之一，并且其由小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)的成员FMD病毒(FMDV)引起。该病毒可感染超过70种家畜和野生动物，包括牛、猪、绵羊、山羊和鹿。FMD被国际动物卫生组织(OIE)列为须报告的疾病，并且在爆发通知后施加严格的贸易限制。先前没有FMD的国家中的疾病暴发最初通过扑杀受感染和接触的动物、限制易感动物活动、对受感染场所进行消毒以及偶尔用灭活的全病毒抗原制品接种疫苗来控制。在疾病地方性流行的国家中，对动物进行预防性接种疫苗。尽管对人类健康无害，但FMD爆发带来严重的经历损失。例如，最近2001年英国爆发造成经济损失超过120亿美元，严重影响了受影响地区的总体经济。
除了灭活的全抗原疫苗制剂外，近年来也已经成功测试了一种涉及复制缺陷型人腺病毒5(其递送空FMDV衣壳)(Ad5-FMD)的重组疫苗，然而迄今为止，该疫苗仅在美国被授予有条件许可，并且其生产成本高。灭活疫苗和Ad5-FMD疫苗两者均需要近似7天才能在猪和牛中诱导保护性免疫力，并且免疫力的持续时间比自然感染所赋予的持续时间更短。因此，如果在接种后7天前或接种后近似6个月后暴露于FMDV，则接种疫苗的动物易患疾病。
全球口蹄疫研究联盟(GFRA)(一个成立于2003年的国际组织)，作为其五个主要目标的一部分，已经设定开发下一代控制措施和策略，包括改进的疫苗和生物疗法。
已经报道，通常通过用活减毒疫苗(LAV)接种疫苗最好地实现针对病毒感染的快速和持久保护。事实上，使用减毒病毒疫苗，天花和牛瘟病毒已被根除，并且麻疹已从世界的一些部分消除。由于动物中的全部或部分毒力或对实验性改进的减毒FMDV候选物的毒力的逆转，尚未成功开发或实施LAV来控制FMDV。先前描述的检查基因工程改造的无前导FMDV毒株(携带非结构病毒蛋白Lpro编码区的缺失)的努力显示在猪和牛中的致病性降低。然而，用无前导病毒接种的动物在用某些野生型(WT)病毒攻击时并未被完全保护。更近来，开发了一种高度减毒的标记无前导FMDV(称为“FMDLL3B3D”)(Uddowla等人，J.Virol.(2012)86：11675-11685)，其在活着施用时在自然宿主中没有显示疾病体征。事实上，包括FMDLL3B3D骨架中引入的负抗原(3B和3D)标记的额外修饰以及病毒基因组中三个3B拷贝之一的缺失，使得这种突变病毒非常稳定，并进一步限制其在牛或猪中的复制(Uddowla等人，同上；Eschbaumer等人，Pathogens，(2020)9：129)。这种新型疫苗候选物的减毒使得FMD-LL3B3DA24 Cruzeiro疫苗平台毒株和大量衣壳编码盒在2018年4月被排除出美国选择代理程序法规之外(Select Agent Program.(2020).Foot and MouthDisease.www.selectagents.gov/exclusions-usda.htm1#footmouth)并且目前，它已在美国被许可，用于作为化学灭活的安全FMDV标记疫苗(而非LAV)进行制造。该疫苗平台编码两个独特的限制性位点，以侧接衣壳编码区，以容纳交换衣壳编码盒。还已经描述了携带在保守蛋白基序SAF-A/B、Acinus和PIAS(SAP)结构域中引入的Lpro突变的其他实验性LAV疫苗(de los Santos等人，J.Virol.，(2009)83：1800-1810)。具体地，FMDVA12中该结构域中两个保守氨基酸残基的取代在细胞培养物和猪中生成减毒突变病毒。有趣的是，当将修饰的减毒毒株作为疫苗候选物在猪中进行测试时，动物甚至当早在接种疫苗后两天就受到攻击时也被完全保护。然而，由于只有两个氨基酸残基被取代，对SAP突变体的毒力的逆转带来相当大的风险。
密码子使用偏倚是所有生物系统特征性的，因为每个氨基酸的同义密码子使用的频率是不相等的。尽管RNA病毒中的密码子使用偏倚低，但P1/衣壳区域的去优化已证明是一种有效的减毒脊髓灰质炎病毒的基因工程改造技术，所述脊髓灰质炎病毒与FMDV一样属于小核糖核酸病毒科。独立于“密码子偏倚”概念，一些同义密码子对的使用频率或多于或低于统计预测，导致每个检查物种中都存在特定的“密码子对偏倚”。
发明内容
以下实施方案及其方面结合组合物和方法进行描述和举例说明，所述组合物和方法意在为示例性和说明性的，而不是限制范围。
在一个实施方案中，本公开提供了去优化口蹄疫病毒(FMDV)，其含有取代的基因组区域，其中所述取代的基因组区域是与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7具有至少95％同一性的核酸，且分别与SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：7编码相同的多肽，或分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7编码相同且具有最多达10个氨基酸替换、缺失或添加的多肽。在一些实施方案中，去优化FMDV具有取代的基因组区域，其包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7具有至少99％同一性或100％同一性的核酸。在一些实施方案中，去优化FMDV还含有DIVA标记，诸如3B和3D编码区中的突变。
在一个额外实施方案中，本公开进一步提供了去优化的修饰的口蹄疫病毒(FMDV)，其通过用编码相同蛋白序列或编码具有最多达10个氨基酸替换、缺失或添加的蛋白序列的密码子去优化区域或密码子对去优化区域取代P2结构域或P3结构域而构建，其中修饰序列的密码子对偏倚小于亲本FMDV的密码子对偏倚，并减少0.05、0.1或0.2。在具体实施方案中，去优化基因组区域是P2结构域、P3结构域或P2和P3结构域。在具体实施方案中，去优化FMDV是A24-P2-3B3D、A24-P3-3B3D或A24-P2/P3-3B3D。
本公开进一步提供了方法实施方案，包括通过向哺乳动物受试者施用本文所述的任何去优化的修饰的病毒来引发对口蹄疫的免疫应答的方法。在一些实施方案中，施用去优化的修饰的病毒通过施用102、103、104或105pfu/哺乳动物受试者的去优化的修饰的病毒来完成。在一些实施方案中，所述受试者是牛科动物或猪科动物。在额外实施方案中，施用去优化的修饰的病毒需要向哺乳动物受试者施用引发剂量和一个或多个加强剂量。在该方法的一些实施方案中，当哺乳动物受试者没有患有口蹄疫时施用引发剂量。在该方法的一些实施方案中，当哺乳动物受试者没有患有口蹄疫时施用一个或多个加强剂量。在该方法的一些实施方案中，当哺乳动物受试者已经暴露于口蹄疫时施用一个或多个加强剂量。在一些实施方案中，由该方法引发的免疫应答是保护性免疫应答。
结合附图，本发明的其他特征和优点将从以下详述变得显而易见，所述附图以实例的方式举例说明本发明的实施方案的各种特征。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请都具体且单独地指明通过引用并入。
附图简要说明
本发明的新颖特征在权利要求中具体阐述。本发明的特征和优点在以下详述及附图中提及，在所述附图中：
图1A、图1B和图1C描绘具有去优化的P2和/或P3和3B3D DIVA标记的A24Cru的序列。图1A描绘SEQ ID NO：1。图1B描绘SEQ ID NO：2。图1C描绘SEQ ID NO：3。
图2A、图2B和图2C描绘去优化FMDV的生成。图2A：A24Cru野生型(WT)感染性克隆(Rieder等人2005)的示意图，其具有一个独特添加的NheI位点。描绘了用于克隆的相关限制性位点(NheI、MfeI和BamHI)。(图2B)合成含有去优化密码子的NheI/MfeI、MfeI/BamHI或NheI/BamHI片段(Burns等人，2006)，并分别在pA24CruNheI中替换。合成的片段含有DIVA标记，包括3B中的小缺失以及3B和3D中的氨基酸取代(Uddowla等人，2012)。图2C：在BHK-21细胞中分析WT和去优化病毒的噬斑形态。噬斑在48hpi发展。(参见实施例1)。
图3描绘细胞培养物中的生长动力学和噬斑形态。BHK-21和IBRS2细胞系或PK和EBK原代细胞被FMDV A24Cru野生型(A24-WT)或去优化变体A24-P2Deopt3B3D、A24-P3Deopt3B3D和A24-P2/3Deopt3B3D以MOI＝2感染。孵育1小时后，通过用150mM NaCl、20mM MES(pH＝6.0)洗涤、随后添加MEM完全培养基并在37℃下孵育来除去未吸附的病毒。在1、3、6和24hpi取样，并且通过对BHK-21细胞的噬斑测定来确定病毒滴度。
图4A、图4B和图4C描绘去优化的病毒在小鼠体内减毒。6至7周龄的雌性C57BL/6小鼠(n＝6/组)在足垫中用FMDV A24-去优化突变体、A24-P2/P3Deopt、A24-P2Deopt或A24-P3Deopt以指定剂量(噬斑形成单位-pfu-/动物)皮下接种。一组用1x105pfu/动物的A24-野生型(WT)接种作为对照。图4A：接种后每天测定的存活率。图4B：在接种后持续7天(dpi)收集的血清样品中测量病毒滴度。图4C：在用去优化变体接种后0、5、7、14和21天以及在初始接种后存活的所有动物中在攻击后7天和14天(dpc)后收集的血清样品中测量FMDV特异性抗体中和滴度。
图5描绘用A24-WT接种的动物中的临床结果。18-23kg去势雄性约克夏猪(n＝3/组)用105噬斑形成单位(pfu)的FMDV A24-WT接种。监测动物7天，并且每天收集肝素化血液、血清和鼻拭子的样品。每只动物的临床评分(蓝色条)和淋巴细胞的％(绿色线)表示在顶部小图中；血清(红色线)和鼻腔分泌物(蓝色线)中的病毒分离以及每ml血清(红色虚线)和鼻腔分泌物(蓝色虚线)中存在的病毒拷贝数(GCN)表示在底部小图中。
图6描绘用A24-P2Deopt3B3D接种的动物中的临床结果。18-23kg去势雄性约克夏猪(n＝3/组)用106噬斑形成单位(pfu)[动物8至10]或107pfu[动物12至14]的FMDV A24-P2Deopt3B3D接种。在整个实验持续时间过程中，一只未处理的动物[#11和#15]与每组接触圈养。监测动物7天，并且每天收集肝素化血液、血清和鼻拭子的样品。每只动物的临床评分(蓝色条)和淋巴细胞的％(绿色线)表示在顶部小图中；血清(红色线)和鼻腔分泌物(蓝色线)中的病毒分离以及每ml血清(红色虚线)和鼻腔分泌物(蓝色虚线)中存在的病毒拷贝数(GCN)表示在底部小图中。
图7描绘用A24-P3Deopt3B3D接种的动物中的临床结果。18-23kg去势雄性约克夏猪(n＝3/组)用106噬斑形成单位(pfu)的FMDV A24-P3Deopt3B3D接种。在整个实验持续时间过程中，一只未处理的动物[#7]与接种的猪接触。监测动物7天，并且每天收集肝素化血液、血清和鼻拭子的样品。每只动物的临床评分(蓝色条)和淋巴细胞的％(绿色线)表示在顶部小图中；血清(红色线)和鼻腔分泌物(蓝色线)中的病毒分离以及每ml血清(红色虚线)和鼻腔分泌物(蓝色虚线)中存在的病毒拷贝数(GCN)表示在底部小图中。
图8描绘用A24-P2/P3Deopt3B3D接种的动物中的临床结果。18-23kg去势雄性约克夏猪(n＝3/组)用106噬斑形成单位(pfu)[动物16至18]或107pfu[动物20至22]的FMDV A24-P2/P3Deopt3B3D接种。在整个实验持续时间过程中，一只未处理的动物[#19和#23]与每组接触圈养。监测动物7天，并且每天收集肝素化血液、血清和鼻拭子的样品。每只动物的临床评分(蓝色条)和淋巴细胞的％(绿色线)表示在顶部小图中；血清(红色线)和鼻腔分泌物(蓝色线)中的病毒分离以及每ml血清(红色虚线)和鼻腔分泌物(蓝色虚线)中存在的病毒拷贝数(GCN)表示在底部小图中。
图9描绘用A24-P2、P3或P2/P3Deopt3B3D或A24Cru野生型(A24-WT)接种的动物的血清中FMDV中和抗体的测定。
图10描绘用低剂量的A24-P2/P3Deopt3B3D接种的猪中的临床结果。18-23kg去势雄性约克夏猪(n＝4/组)用102、103或105pfu/动物的FMDV A24-P2/P3Deopt3B3D接种。另一组用103pfu/动物的FMDVA24WT接种作为对照。监测动物7天。每天测定每只动物的临床评分(蓝色条)和淋巴细胞的％(绿色线)。
图11描绘用低剂量A24-P2/P3 Deopt3B3D接种的动物的血清和鼻腔分泌物中病毒或病毒RNA的测定。通过血清(红色线)和鼻腔分泌物(蓝色线)中的病毒分离检测病毒量。病毒RNA的存在通过qPCR测量并表示为每ml血清(红色虚线)或每ml鼻腔分泌物(蓝色虚线)的基因组拷贝数(GCN)。
图12描绘用A24-P2/P3Deopt3B3D或A24Cru野生型(A24-WT)接种的动物的血清中FMDV中和抗体的测定。FMDV中和抗体的存在通过如下评估：在接种后指定时间点用不同剂量的A24-P2/P3Deopt3B3D或WT接种的动物血清中对BHK-21细胞进行微量滴定中和测定。滴度报告为中和50％孔中的病毒的血清最高稀释度的倒数的log10。每个数据点代表每组的平均值±标准偏差(SD)。
图13描绘在A24Cru IC中具有去优化P1区的A24Cru的序列，其含有3B3D DIVA标记并表示用于克隆的限制性位点(FsseI和NheI)(SEQ ID NO：4)。
图14描绘Asial去优化的P1的序列。下划线的是FseI和NheI限制性位点(SEQ IDNO：5)。
图15A和图15B描绘A24-P1 Deopt3B3D病毒的生成。(图15A)生成A24-P1 Deopt3B3D感染性克隆的克隆策略。(图15B)A24-WT3B3D和A24-P1 Deopt3B3D的噬斑形态。在BHK-21细胞中在48hpi发展噬斑。
图16A和图16B描绘ASIA-P1 Deopt3B3D病毒的生成。(图16A)生成ASIA-P1 Deopt3B3D感染性克隆的克隆策略。(图16B)A24-WT3B3D和ASIA-P1 Deopt3B3D的噬斑形态。在BHK-21细胞中在48hpi发展噬斑。
图17A和图17B描绘A24和Asia 1 P1去优化的FMDV的生长动力学：(图17A)BHK-21和(图17B)SK6细胞被指定病毒以MOI＝5感染。孵育1小时后，通过如下除去未吸附的病毒：用150mM NaCl、20mM MES(pH＝6.0)洗涤，随后添加MEM完全培养基并在37℃下孵育。在1、2、4、7和24hpi取样，并通过对BHK-21细胞的噬斑测定来测定病毒滴度。
图18A、图18B和图18C描绘A24-P1 Deopt3B3D病毒在小鼠体内的减毒。6至7周龄的雌性C57BL/6小鼠(n＝6/组)在足垫中以指定剂量(pfu/动物)的A24-P1 Deopt3B3D皮下接种。(图18A)存活率被计算为接种后每日(存活动物数/每组动物数)×100。(图18B)在接种后持续7天(dpi)收集的血清样品中测量病毒滴度。(图18C)FMDV中和抗体的存在通过如下评估：在接种或攻击后指定时间点用不同剂量的A24-P1 Deopt3B3D接种的动物血清中对BHK-21细胞进行微量滴定中和测定。对照动物在感染后7天前因疾病死亡。滴度被报告为中和50％孔中病毒的血清最高稀释度的倒数的log10。每个数据点代表每组的平均值±标准偏差(SD)。
图19描绘用A24-P1 Deopt3B3D接种的动物中的临床结果。18-23kg去势雄性约克夏猪(n＝4/组)用106噬斑形成单位(pfu)[动物28至31]、105pfu[动物32至35]、104pfu[动物36至39]或103pfu[动物40至43]的FMDV A24-P1 Deopt3B3D接种。监测动物7天，并且每隔一天收集肝素化血液、血清和鼻拭子的样品。代表每只动物的临床评分(蓝色条)和淋巴细胞的％(绿色线)。
图20描绘用A24-P1 Deopt3B3D接种的动物的血清和鼻腔分泌物中病毒的测定。18-23kg去势雄性约克夏猪(n＝4/组)用103、104、105或106pfu的FMDV A24-P1 Deopt3B3D接种。监测动物7天，并且每天收集血清和鼻拭子的样品。通过血清(三角形)和鼻腔分泌物(圆形)中的病毒分离检测病毒量。测定用A24-P1 Deopt3B3D接种的动物血清中的FMDV中和抗体。FMDV中和抗体的存在通过如下评估：在接种后指定时间点用不同剂量的A24-P1 Deopt3B3D或用A24Cru野生型(对照)接种的动物血清中对BHK-21细胞进行微量滴定中和测定。滴度被报告为中和50％孔中病毒的血清最高稀释度的倒数的log10。每个数据点代表每组的平均值±标准偏差(SD)。
图21描绘用A24-P1 Deopt3B3D接种的动物血清中FMDV中和抗体的测定。FMDV中和抗体的存在通过如下评估：在接种后指定时间点用不同剂量的A24-P1 Deopt3B3D或用A24Cru野生型(对照)接种的动物血清中对BHK-21细胞进行微量滴定中和测定。滴度被报告为中和50％孔中病毒的血清最高稀释度的倒数的log10。每个数据点代表每组的平均值±标准偏差(SD)。
图22A、图22B和图22C描绘去优化病毒在小鼠体内减毒。6至7周龄的雌性C57BL/6小鼠(n＝6/组)在足垫中用指定剂量(噬斑形成单位-pfu-/动物)的FMDV ASIA-P1Deopt3B3D或4x105pfu/动物的Asial(对照)皮下接种。(图22A)接种后每天测定存活率。(图22A)在接种后持续7天(dpi)收集的血清样品中测量病毒滴度。(图22A)在用不同病毒和剂量感染后0、5、7、14和21天收集的血清样品中测量FMDV特异性抗体中和滴度。
图23描绘用ASIA-P1Deopt3B3D或ASIA-WT接种的动物中的临床结果。18-23kg去势雄性约克夏猪(n＝4/组)用106噬斑形成单位(pfu)[动物81至84]、105pfu[动物85至88]或103pfu[动物89至92]的FMDV ASIA-P 1Deopt3B3D或105pfu[动物93、95和96]的FMDV ASIA-WT接种。监测动物7天，并且每隔一天收集肝素化血液、血清和鼻拭子的样品。代表每只动物的临床评分(蓝色条)和淋巴细胞的％(绿色线)。
图24描绘用ASIA-P1 Deopt3B3D或ASIA-WT接种的动物的血清和鼻腔分泌物中病毒的测定。18-23kg去势雄性约克夏猪(n＝4/组)用103、105或106pfu的FMDV ASIA-P1Deopt3B3D或105pfu的FMDV ASIA-WT接种。监测动物14天，并且每天收集血清和鼻拭子的样品。通过血清(三角形)和鼻腔分泌物(圆形)中的病毒分离检测病毒量。
图25描绘用ASIA-P1 Deopt3B3D或ASIA-WT接种的动物血清中FMDV中和抗体的测定。FMDV中和抗体的存在通过如下评估：在接种后指定时间点用不同剂量的ASIA-P1Deopt3B3D接种的动物血清中对BHK-21细胞进行微量滴定中和测定。滴度被报告为中和50％孔中病毒的血清最高稀释度的倒数的log 10。每个数据点代表每组的平均值±标准偏差(SD)。
发明详述
口蹄疫(FMD)是最可怕的病毒性疾病之一，其可影响家畜。尽管该疾病似乎在发达国家中得到遏制，但最近的爆发已经表明感染可以迅速传播，引起毁灭性的经济和社会后果。为了发展新型对策，对FMDV基因组的某些编码区域进行“同义密码子去优化”，以产生稳定的修饰减毒病毒毒株。突变病毒还被工程改造为在3B和3D编码区中含有赋予用于区分感染动物和接种疫苗动物(DIVA)的标记的特定突变，以及用于衣壳交换的方便的限制性核酸内切酶切割位点。选定编码区域(包括DIVA标记)的去优化产生存活的后代，其在细胞培养物、小鼠和猪、自然宿主中表现出减毒。我们的工作表明密码子去优化技术可以应用于FMDV以获得含有DIVA标记的修饰的活减毒FMDV毒株，逆转和与毒性循环毒株重组的风险降低，有可能开发为修饰的疫苗候选物。
在本文中，我们表明可以通过对除了衣壳区域以外的基因组区域进行去优化来产生稳定、存活的FMDV毒株。保守的P2/P3 FMDV区域的去优化产生减毒毒株，其可以生长至与组织培养中的亲本WT毒株的终点滴度相似的终点滴度。此外，P2/P3去优化变体可以容忍引入：A)3B和3D区域中的DIVA(区分感染动物与接种疫苗的动物)标记，以及B)用于容易的衣壳交换的限制性位点。
总而言之，这些结果表明，密码子/密码子对偏倚去优化适用于多个目标，作为获得毒力降低和重组概率降低的存活毒株的一种手段，同时允许维持用于区分诊断的遗传标记，突出了它们用于开发成修饰的活减毒FMDV疫苗候选物的潜力。
本文引用的所有参考文献均以其整体通过引用并入，如同已完全阐明一样。除非另有定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版，修订版，J.Wiley&Sons(New York，NY 2006)；March，Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms and Structure第7版，J.Wiley&Sons(New York，NY 2013)；以及Sambrook和Russel，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第4版，Cold SpringHarbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012)，为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指南。对于关于如何制备抗体的参考文献，参见D.Lane，Antibodies：A Laboratory Manual第2版(Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor NY，2013)；Kohler和Milstein，(1976)Eur.J.Immunol.6：511；Queen等人美国专利号5,585,089；和Riechmann等人，Nature 332：323(1988)；美国专利号4,946,778；Bird，Science 242：423-42(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；Ward等人，Nature 334：544-54(1989)；Tomlinson I.和Holliger P.(2000)Methods Enzymol，326，461-479；Holliger P.(2005)Nat.Biotechnol.Sep；23(9)：1126-36)。
本领域技术人员将认识到与本文所描述的相似或等效的许多方法和材料，其可用于本发明的实践中。事实上，本发明绝不限于所描述的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。
如在说明书和权利要求中所用，单数“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述”的使用包括复数对象，除非上下文另有明确指出。
如本文所用的术语分离的、纯化的或生物学上纯的是指实质上或基本不含在其天然状态下通常伴随参考材料的组分的材料。
术语“约”被定义为所示值的正负百分之十。例如，约1.0g意指0.9g至1.1g以及该范围内的所有值，无论是否明确说明。
术语“基本上由…组成的核酸”及其语法变体意指与参考核酸序列相差20个或更少核酸残基并且还执行参考核酸序列的功能的核酸。此类变体包括比参考核酸序列更短或更长、在特定位置具有不同的残基或其组合的序列。
如本文所用的“编码序列”是指涵盖开放阅读框或其部分的核酸序列，其编码病毒或宿主细胞蛋白序列或其部分。
本发明的修饰序列(核酸、蛋白)还包括与参考序列具有高度同一性的核酸。例如，与本文提供的任何序列具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。作为一个实际的问题，可以使用已知的计算机程序常规地确定与给定参考序列的同一性百分比，以找到两个序列之间的最佳同源性区段。当使用序列比对程序来确定特定序列是否例如与根据本发明的参考序列具有96％同一性时，当然应设置参数，使得在参考序列的全长上计算同一性百分比。
两个或更多个核酸序列或两个或更多个氨基酸序列之间的同一性或相似性用序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以用同一性百分比来衡量；百分比越高，序列越同一。序列相似性可以用相似性百分比来衡量(其考虑到保守的氨基酸取代)；百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相对高程度的序列同一性/相似性。当直向同源蛋白或cDNA源自关系更密切的物种(诸如人类和小鼠序列)时，与关系更远的物种(诸如人类和秀丽隐杆线虫序列)相比，这种同源性更显著。
如本文所用的“去优化的修饰的病毒”是指其基因组全部或部分具有同义密码子和/或密码子重排和密码子对偏倚变异的病毒。本发明的去优化的修饰的病毒可用于病毒感染的预防性和治疗性治疗。
如本文所用的“哺乳动物”是指哺乳动物纲的任何成员，包括但不限于人类和非人类灵长类动物，诸如黑猩猩，以及其他猿类和猴类物种；农场动物，诸如牛、水牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，诸如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物，诸如小鼠、大鼠和豚鼠等。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成体和新生儿受试者以及胎儿，无论是雄性还是雌性，都意欲包括在该术语的范围内。
我们相信，密码子和密码子对偏倚去优化也可以是开发针对任何RNA病毒的减毒疫苗候选物的有用工具。在各种研究中，我们最近已经证明，密码子对偏倚去优化也被FMDV所耐受。P 1结构区域的去优化产生FMDV毒株(A12-P1 deopt)，其在小鼠中高度减毒，并在相对低的剂量下诱导针对致命FMDV WT攻击的保护性免疫应答，提供近似约10,000“安全界限(safety margin)”(杀死动物所需的剂量和诱导保护所需的剂量之间的比率)(Diaz-SanSegundo等人，J.Virol.，(2015)90：1298-1310)。此外，猪中的毒力研究显示，A12-P1 deopt病毒在自然宿主中也被减毒，因为引起同等疾病所需的剂量比同源WT病毒的剂量高约100倍。有趣的是，在血清中检测到高水平的中和抗体(Abs)，这表明用A12-P1 deopt病毒接种疫苗的猪可以针对FMD进行保护。
FMDV结构蛋白参与衣壳组装和稳定性、病毒与靶细胞的结合以及抗原特异性，影响病毒感染和免疫的重要方面。FMDV衣壳蛋白的高度变异性水平反映了选择压力和病毒适应性，以该病毒的多种血清型和亚型为代表。相比之下，病毒基因组的其他区域更保守，并且可以在感染性FMDV克隆中相互取代而不影响活力。事实上，我们最近已经显示，可以用A24Cru IC骨架构建主种子疫苗毒株，并且可以交换特定的衣壳，而不显著影响病毒生长特性。
如本文所述，我们证明可以通过对衣壳区域以外的区域进行去优化来产生稳定的存活FMDV毒株。保守P2/P3区域的去优化产生减毒毒株，其在组织培养中可以生长至与亲本WT毒株的终点滴度相似的终点滴度。此外，在P2/P3去优化变体中，3B和3D区域中的DIVA标记以及用于容易的衣壳交换的限制性位点的引入被良好耐受。在获得和评估的不同突变体中，小鼠和猪中的研究表明，所得的A24-P2/P3Deopt3B3D病毒在体内被减毒并诱导适应性免疫。这些结果突出了密码子去优化作为降低FMDV的毒力和降低与循环毒株重组的可能性的策略的潜力，使它们成为用于进一步开发成修饰的活减毒FMDV疫苗的有吸引力的候选物。本发明的各个实施方案部分地基于这些发现以及本文进一步描述的那些。
可选择编码
给定的肽可以由大量核酸序列编码。例如，甚至是典型的短10-聚体寡肽也可以由近似410(约106)种不同的核酸编码，而脊髓灰质炎病毒的P1衣壳蛋白(881个氨基酸长)可以由约10442种不同的核酸编码。自然选择最终选择了这些可能的10442种核酸之一作为PV基因组。尽管一级氨基酸序列是由给定mRNA编码的最重要水平的信息，但在不同种类的RNA序列内存在额外种类的信息。这些包括具有不同功能的RNA结构元件(例如，对于PV，顺式作用复制元件或CRE、翻译动力学信号(暂停位点、移框位点等)、聚腺苷酸化信号、剪接信号、酶促功能(核酶)并且相当可能还有其他尚未鉴定的信息和信号)。
尽管必须保留诸如CRE等信号，但10442种可能的编码序列提供了极大的灵活性，以对FMD病毒(FMDV)(一种大小与脊髓灰质炎病毒相似的病毒)的RNA基因组中进行剧烈改变，同时保留编码完全相同蛋白的能力。可以在密码子偏倚或密码子对偏倚中进行改变，并且可以添加或除去RNA中的核酸信号和二级结构。额外的或新型的蛋白甚至可以同时编码在可选择的框架中。
密码子对偏倚
编码序列的一个显著特征是它们的密码子对偏倚。这可以通过考虑氨基酸对Ala-Glu来举例说明，所述氨基酸对Ala-Glu可以由8种不同的密码子对编码，并且这种配对可以具有影响人类和病毒基因在人类细胞中的翻译的偏倚(表1)。如果除了每个个别密码子的频率(如表2中所示)之外没有其他因素影响密码子对的频率，则可以通过将两个相关密码子的频率相乘来计算8种编码中每一种的预期频率。例如，通过这种计算，预期密码子对GCA-GAA在所有Ala-Glu编码对中以0.097的频率出现(0.23×0.42；基于表2中的频率)。为了将每个密码子对的预期(假设)频率与人类基因组中实际观察到的频率联系起来，使用了一致注释的人类编码区域的共有CDS(CCDS)数据库，其总共含有14,795种人类基因。这组基因是人类编码序列的综合代表。使用这组基因，通过将密码子出现的数目除以编码相同氨基酸的所有同义密码子的数目来重新计算密码子使用频率。如所预期，频率与先前公开的频率(诸如表2中给出的频率)密切相关。轻微的频率变化可能是由于Kazusa DNA研究所的密码子使用数据库(www.kazusa.or.jp/codon/codon.html)提供的数据中的过度采样效应造成的，其中84949种人类编码序列被包括在计算中(远远超过人类基因的实际数量)。然后，使用因此计算的密码子频率来通过如下计算预期密码子对频率：首先将两个相关密码子的频率彼此相乘(参见表1预期频率)，且然后将此结果乘以观察到的频率(在整个CCDS数据集)(其中出现了由所讨论的密码子对编码的氨基酸对)。在密码子对GCA-GAA的实例中，该第二次计算给出0.098的预期频率(与使用Kazusa数据集进行的第一次计算中的0.97相比)。最后，在一组14,795种人类基因中观察到的实际密码子对频率通过如下确定：计算该组中每个密码子对的出现总数并将其除以该组中编码相同氨基酸对的所有同义编码对的数量(表2；观察到的频率)。基于14,795种人类基因的组，氨基酸对Ala-Glu的频率和观察值/预期值(其可由8种不同的密码子对编码)以及完整的3721(612)密码子对组见于表1中(Coleman等人，2008)
表1.氨基酸对丙氨酸-谷氨酰胺的密码子对评分
| 氨基酸对 | 密码子对 | 预期频率 | 观察频率 | 观察/预期比 |
| AE | GCAGAA | 0.098 | 0.163 | 1.65 |
| AE | GCAGAG | 0.132 | 0.198 | 1.51 |
| AE | GCCGAA | 0.171 | 0.031 | 0.18 |
| AE | GCCGAG | 0.229 | 0.142 | 0.62 |
| AE | GCGGAA | 0.046 | 0.027 | 0.57 |
| AE | GCGGAG | 0.062 | 0.089 | 1.44 |
| AE | GCTGAA | 0.112 | 0.145 | 1.29 |
| AE | GCTGAG | 0.150 | 0.206 | 1.37 |
| 总计 | 1.000 | 1.000 |
表2.人类基因中的密码子偏倚
如果密码子对的观察频率/预期频率的比率大于1，则称该密码子对被过度代表。如果该比率小于1，则称其代表不足。在该实例中，密码子对GCA-GAA被过度代表1.65倍，而编码对GCC-GAA被代表不足5倍以上。
许多其他密码子对显示非常强的偏倚；一些对被代表不足，而其他对被过度代表。例如，密码子对GCCGAA(AlaGlu)和GATCTG(AspLeu)被代表不足三至六倍(优选的对分别是GCAGAG和GACCTG)，而密码子对GCCAAG(AlaLys)和AATGAA(AsnGlu)被过度代表约两倍。值得注意的是，密码子对偏倚与氨基酸对的频率无关，也与个别密码子的频率无关。例如，代表不足的对GATCTG(AspLeu)恰好使用频率最高的Leu密码子(CTG)。
密码子对偏倚是在原核细胞中发现的，但此后在所有其他检查物种(包括人类)中已经看到。该影响具有非常高的统计显著性，而且肯定不仅仅是噪声。然而，其功能意义，如果有的话，是一个谜。一种提议是，一些tRNA对当它们在核糖体上聚集在一起时良好地相互作用，而其他对相互作用不佳。由于不同的密码子通常由不同的tRNA读取，因此密码子对可能是偏倚的，以避免将不相容的tRNA对放在一起。另一种想法是，许多(但不是全部)代表不足的对具有中央CG二核苷酸(例如，GCCGAA，编码AlaGlu)，并且CG二核苷酸在哺乳动物中系统地代表不足。因此，密码子对偏倚的影响可能是两种-一种是哺乳动物基因组中CG代表不足的间接影响，而另一种与翻译的效率、速度和/或准确性有关。应强调的是，本发明不限于作为密码子对偏倚基础的任何特定分子机制。
密码子对偏倚的计算
可能的3721个非含“终止”密码子对(例如，GTT-GCT)中的每个单独的密码子对都带有指定的“密码子对评分”或“CPS”，其特定于给定的基因的“训练集”。给定密码子对的CPS被定义为观察到的出现次数与该组基因(在本实例中为人类基因组)中预期的数目的对数比。确定特定密码子对的实际出现次数(或换言之，特定氨基酸对由特定密码子对编码的可能性)只是计数特定组编码序列中密码子对的实际出现次数的问题。然而，确定预期数量需要额外的计算。计算预期数量以便与Gutman和Hatfield类似地独立于氨基酸频率和密码子偏倚。也就是说，预期频率是基于特定密码子编码氨基酸的次数的相对比例来计算的。正CPS值表示给定的密码子对在统计上被过度代表，而负CPS表示该对在人类基因组中在统计上代表不足。
为了在人类环境内进行这些计算，使用了最新的一致注释人类编码区域的共有CDS(CCDS)数据库，其含有总共14,795种基因。该数据集提供了密码子和密码子对，且因此提供了基因组规模上的氨基酸和氨基酸对频率。尽管此处通过人类实例例举，但这可以应用于任何动物(例如牛、猪和其他家养动物)。
Federov等人(2002)的范例用于进一步增强Gutman和Hatfield(1989)的方法。这允许独立于密码子频率和编码特定氨基酸对的相邻密码子的非随机关联来计算给定密码子对的预期频率。用于计算CPB的详细方程公开于WO 2008/121992和WO 2011/044561(其通过引用并入)。
在计算中，Pij是在其同义组中出现频率为NO(Pij)的密码子对。Ci和Cj是构成Pij的两个密码子，其分别以频率F(Ci)和F(Cj)出现在它们的同义组中。更明确地，F(Ci)是相应氨基酸Xi在所有编码区中由密码子Ci编码的频率，以及F(Ci)＝NO(Cj)/NO(Xi)，其中NO(Ci)和NO(Xi)分别是观察到的密码子Ci和氨基酸Xi的出现次数。相应地计算F(Cj)。此外，NO(Xij)是氨基酸对Xij在所有编码区中出现的次数。Pij的密码子对偏倚评分S(Pij)被计算为观察到的频率No(Pij)相比于Ne(Pij)的预期出现次数的对数优势比。
使用上面的公式，然后确定当与通过使用整个人类CCDS数据集计算的相应基因组Ne(Pij)值相比时，单独编码序列中的单独密码子对是代表过多还是不足。该计算导致人类编码区中过度代表密码子对的正S(Pij)评分值和代表不足的密码子对的负值。
单独编码序列的“组合”密码子对偏倚通过根据以下公式对所有密码子对评分取平均值来计算：
因此，通过将构成整个编码区的所有单独密码子对评分相加并将该总和除以编码序列的长度来计算该区的密码子对偏倚。
计算密码子对偏倚，实施算法以改变密码子对偏倚。
开发了一种算法来定量密码子对偏倚。每个可能的单独密码子对都被给予“密码子对评分”或“CPS”。CPS被定义为在所有人类编码区中观察到的每个密码子对的出现次数与预期出现次数之比的自然对数，其中人类代表待重新编码的即时疫苗病毒的宿主物种。
尽管观察到的特定密码子对出现的计算是直接的(基因集内的实际计数)，但密码子对的预期出现次数需要额外计算。我们计算该预期数量与氨基酸频率和密码子偏倚两者均无关，类似于Gutman和Hatfield。也就是说，预期频率是基于特定密码子编码氨基酸的次数的相对比例来计算的。正CPS值表示给定密码子对在统计上被过度代表，而负CPS表示该对在人类基因组中在统计上代表不足。
使用这些计算的CPS，任何编码区域然后可以被评级为通过取密码子对评分的平均值来使用代表过度或代表不足的密码子对，因此给出整个基因的密码子对偏倚(CPB)。
如下文进一步所讨论，密码子对偏倚考虑在编码序列的整个长度上取平均值的编码序列中每个密码子对的评分。根据本发明，密码子对偏倚通过如下确定：
因此，可以获得编码序列的相似密码子对偏倚，例如，通过编码序列的子序列上的最小密码子对评分或编码序列的全长上适度减少的密码子对评分。
由于天然存在的编码序列中肯定可以使用(并且使用)所有61个有义密码子和所有3721个有义密码子对，因此不能期望单个稀有密码子取代为频繁密码子，或稀有密码子对取代为频繁密码子对，会具有很大的影响。不管确切机制如何，数据表明将同义去优化密码子大规模取代至病毒基因组中导致病毒严重减毒。这种用于产生修饰病毒的程序被称为SAVE(合成减毒病毒工程改造)。
根据本发明的方面，病毒修饰可以通过病毒基因组的一个或多个部分中的密码子对偏倚以及密码子偏倚的改变来实现。然而，预期调整密码子对偏倚是特别有利的。例如，通过密码子偏倚来减毒病毒通常需要消除共同的密码子，并且所以降低核苷酸序列的复杂性。相比之下，可以实现密码子对偏倚降低或最小化，同时维持大得多的序列多样性，并且因此更好地控制核酸二级结构、退火温度和其他物理和生物化学特性。本文公开的工作包括修饰的密码子对偏倚降低或最小化的序列，其中密码子被改组，但密码子使用概况没有改变。
可以以本领域普通技术人员众所周知的方式证实我们的病毒修饰的效果。非限制性实例包括噬斑测定、生长测量和测试动物中降低的致死率。本申请表明修饰的病毒能够在宿主中诱导保护性免疫应答。
本发明的各个实施方案提供了通过用编码蛋白序列或编码具有最多达10个氨基酸替换、添加或缺失的蛋白序列的密码子去优化区域取代野生型口蹄疫病毒或先前修饰的口蹄疫病毒的至少一个基因组区域而衍生自野生型口蹄疫病毒或先前修饰的口蹄疫病毒的去优化的修饰的口蹄疫病毒。
本发明的各个实施方案提供了通过用编码蛋白序列或编码具有最多达10个氨基酸替换、添加或缺失的蛋白序列的密码子对去优化区域取代野生型口蹄疫病毒或先前修饰的口蹄疫病毒的至少一个基因组区域而衍生自野生型口蹄疫病毒或先前修饰的口蹄疫病毒的去优化的修饰的口蹄疫病毒。
本发明的各个实施方案提供了通过用编码蛋白序列或编码具有最多达10个氨基酸替换、添加或缺失的蛋白序列的密码子去优化区域和/或密码子对去优化区域取代野生型口蹄疫病毒或先前修饰的口蹄疫病毒的至少一个基因组区域而衍生自野生型口蹄疫病毒或先前修饰的口蹄疫病毒的去优化的修饰的口蹄疫病毒。
在各个实施方案中，密码子去优化的口蹄疫病毒在至少一个基因组区域中包含至少10个去优化的密码子，其中至少10个去优化的密码子各自是在口蹄疫病毒中使用频率较低的同义密码子。在各个实施方案中，所述密码子去优化的口蹄疫病毒在至少一个基因组区域中包含至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600或700个去优化密码子，其中至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600或700个去优化密码子各自是口蹄疫病毒中使用频率较低的同义密码子。在至少一个基因组区域中使用频率较低的同义密码子是编码相同氨基酸的密码子，但该密码子是口蹄疫病毒对于该氨基酸不优选的密码子。
在各个实施方案中，密码子去优化的口蹄疫病毒在至少一个基因组区域中包含至少10个去优化的密码子，其中至少10个去优化的密码子各自是在哺乳动物宿主中使用频率较低的同义密码子。在各个实施方案中，所述密码子去优化的口蹄疫病毒在至少一个基因组区域中包含至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600或700个去优化密码子，其中至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600或700个去优化密码子各自是哺乳动物宿主中使用频率较低的同义密码子。在至少一个基因组区域中使用频率较低的同义密码子是编码相同氨基酸的密码子，但该密码子是哺乳动物宿主对于该氨基酸不优选的密码子。
在各个实施方案中，修饰序列的密码子对偏倚小于亲本病毒的密码子对偏倚，并且减少至少约0.01、至少约0.02、至少约0.03、至少约0.04、至少约0.05、至少约0.10、至少约0.15、至少约0.20、至少约0.25、至少约0.3、至少约0.35、至少约0.40或至少约0.50。
在各个实施方案中，至少一个基因组区域是口蹄疫病毒的P2或P3结构域。用于实施本公开的口蹄疫病毒可以是任何毒株或血清型的，例如诸如A24、A12、Asia、O1 Manisa和O1 Campos。在一些实施方案中，此类修饰的病毒还含有DIVA区域，诸如本文详述的3B3D区域。
施用
可以将本文所述的修饰的FMDV施用于哺乳动物受试者，诸如猪科动物或牛科动物。在各个实施方案中，施用去优化的修饰的病毒包括施用剂量为102、103、104或105pfu/哺乳动物受试者的去优化的修饰的病毒。在一些情况下，施用包括向哺乳动物受试者施用引发剂量；并施用一个或多个加强剂量。技术人员能够确定有效的给药方案，但通常在哺乳动物受试者没有患有口蹄疫时施用引发剂量和/或一个或多个加强剂量(如果有的话)。当哺乳动物受试者没有患有口蹄疫时，施用一个或多个加强剂量。在各个实施方案中，当哺乳动物受试者已经暴露于口蹄疫时，施用一个或多个加强剂量。
本文所述的修饰的FMDV可以配制用于经由本领域已知的任何施用途径施用，包括气雾剂、皮下、口内、鼻内、肌肉内、经皮、经粘膜和/或皮内途径。“经皮”施用可使用局部乳膏或软膏或通过透皮贴片的方式实现。“肠胃外”是指通常与注射相关的施用途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、宫内、静脉内、蛛网膜下腔、囊下、皮下、跨粘膜或经气管的注射。经由肠胃外途径，所述组合物可以呈用于输注或注射的溶液或悬浮液的形式，或者作为冻干粉末。
经由肠内途径，所述药物组合物可以呈片剂、凝胶胶囊、糖包衣片剂、糖浆、悬浮液、溶液、粉末、颗粒、乳剂、微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡(其允许控制释放)的形式。经由肠胃外途径，所述组合物可以呈用于输注或注射的溶液或悬浮液的形式。
经由局部途径，基于根据本发明的化合物的药物组合物可配制用于治疗皮肤和粘膜，并且呈软膏、乳膏、乳、药膏、粉末、浸渍垫、溶液、凝胶、喷雾剂、洗剂或悬浮液的形式。它们也可以呈允许控制释放的微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡或聚合物贴片和水凝胶的形式。这些局部途径组合物可以呈无水形式或水性形式，这取决于临床适应症。经由眼部途径，它们可以呈滴眼液的形式。
根据本发明的药物/兽医组合物还可以含有任何药学上/兽医上可接受的载体。如本文所用的“药学上可接受的载体”和“兽医上可接受的载体”是指可接受的材料、组合物或媒介物，其参与将目标化合物从身体的一个组织、器官或部分携带或运输到身体的另一组织、器官或部分。例如，所述载体可以是液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料或其组合。所述载体的每种组分必须是可接受的，因为它必须与制剂的其他成分相容。它还必须适合与其可能接触的任何组织或器官接触使用，这意味着它必须不具有毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或任何其他过度超过其治疗益处的并发症的风险或者风险非常低。
本文提供的药物和兽医组合物也可封装、压片或制备成乳液或糖浆以用于口服施用。可添加固体或液体载体以增强或稳定组合物，或便于组合物的制备。液体载体包括但不限于糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、酒精和水。固体载体包括但不限于淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、白土、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。所述载体还可包括但不限于缓释材料，诸如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯，单独或与蜡一起。
所述药物/兽医制品遵循传统制药技术进行制备，其包括研磨、混合、造粒和压片(当必要时)，用于片剂形式；或研磨、混合和填充，用于硬明胶胶囊形式。当使用液体载体时，所述制品将呈糖浆、酏剂、乳液或水性或非水性悬浮液的形式。这种液体制剂可直接口服或填充至软明胶胶囊中进行施用。
根据本发明的药物/兽医组合物可以治疗有效量递送。确切的治疗有效量是将在给定受试者的治疗效力方面将产生最有效结果的组合物的量。该量将根据各种因素而变化，包括但不限于治疗性化合物的特征(包括活性、药代动力学、药效动力学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应性和药物类型)、制剂中药学上可接受的一种或多种载体的性质以及施用途径。临床、兽医和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，例如，通过监测受试者对施用化合物的反应性并相应地调整剂量。
有效去优化修饰的口蹄疫病毒的典型剂量可以在技术人员通过体外反应或动物模型中的反应指示的范围内。此类剂量通常可以在浓度或量上减少最多约一个数量级而不损失相关的生物活性。因此，实际剂量将取决于医师的判断、患者的状况和治疗方法的有效性，例如，基于相关原代培养细胞或组织培养组织样品的体外反应性，或者在适当的动物模型中观察到的反应，如先前所述。
试剂盒
本公开还涉及用于预防性和治疗性治疗需要治疗口蹄疫的受试者的试剂盒。所述试剂盒可用于实施引发针对口蹄疫病毒的保护性免疫应答、降低具有口蹄疫病毒的可能性以及治疗口蹄疫病毒的本发明的方法。所述试剂盒是材料或组分的组装体，包括至少一种本发明的组合物。因此，在一些实施方案中，所述试剂盒含有组合物，其包含如上所述的去优化修饰的病毒。
本发明试剂盒中配置的组分的确切性质取决于其预期目的。例如，一些实施方案被配置用于引发针对口蹄疫病毒的保护性免疫应答的方法的目的，其他实施方案被配置用于降低具有口蹄疫病毒的可能性的目的，并且还有其他实施方案被配置用于治疗口蹄疫病毒的目的。在一个实施方案中，所述试剂盒被特别配置用于治疗哺乳动物受试者的目的。在进一步实施方案中，所述试剂盒被配置用于兽医应用，治疗受试者诸如但不限于农场动物、家养动物和实验室动物。
所述试剂盒中可能包括使用说明。“使用说明”通常包括有形的表述，其描述待用于使用试剂盒的组分以达到期望结果的技术，诸如引发针对口蹄疫病毒的保护性免疫应答，降低具有口蹄疫病毒的可能性，和治疗口蹄疫病毒。任选地，所述试剂盒还含有其他有用的组分，诸如稀释剂、缓冲液、药学上可接受的载体、注射器、导管、涂药器、移液或测量工具、绷带材料或本领域技术人员将容易认识到的其他有用的随身用具。
组装在试剂盒中的材料或组分可以以保持其可操作性和效用的任何方便且合适的方式储存来提供给从业者。例如，所述组分可以呈溶解的、脱水的或冻干的形式；它们可以在室温、冷藏或冷冻温度下提供。所述组分通常包含在合适的包装材料中。如本文所用，短语“包装材料”是指一种或多种物理结构，其用于容纳试剂盒的内容物，诸如本发明的组合物等。包装材料通过众所周知的方法构建，优选地提供无菌、无污染的环境。试剂盒中采用的包装材料可以是通常用于疫苗疗法中的那些。如本文所用，术语“包装”是指合适的固体基质或材料，诸如玻璃、塑料、纸、箔等，其能够容纳单独的试剂盒组分。因此，例如，包装可以是注射器或玻璃小瓶，其用于容纳合适量的本发明的含有去优化的修饰的口蹄疫病毒的组合物。所述包装材料通常具有外部标签，其指示试剂盒和/或其组分的内容物和/或目的。
已经总体描述了本发明，通过参考某些具体实例将更好地理解本发明，所述具体实例被包括在本文中以进一步举例说明本发明并且不意欲限制如权利要求所定义的本发明的范围。
实施例
提供以下实施例是为了更好地举例说明要求保护的发明，并且不应解释为限制本发明的范围。在提及特定材料的程度上，其仅用于举例说明的目的，并不意欲限制本发明。本领域技术人员可在不行使创造性能力且不脱离本发明的范围的情况下开发等效的手段或反应物。
实施例1
细胞
猪肾细胞系(LF-PK和IBRS-2)获得自PIADC的外国动物疾病诊断实验室(FADDL)、动物、植物和卫生检验局(APHIS)。二级猪肾(PK)细胞由Ames，Iowa.的APHIS国家兽医服务实验室提供。BHK-21细胞(幼仓鼠肾细胞株21，克隆13，ATCC CL10)获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。所有细胞都如先前所报道进行维持(De los Santos等人，2009)。
病毒
FMDV A24-WT如先前所述从全长血清型A24 Cruzeiro感染性克隆(pA24-WT)生成(Rieder等人2005)。该质粒的衍生物被构建为在2A编码区中含有NheI独特位点(pA24 Cru-NheI)。去优化的P2、P3或P2/P3克隆通过将使用Burns等人(2006)描述的方法设计的密码子修饰序列亚克隆至pA24 Cru-NheI骨架中得到。具体地，在3B和3Dpol区域中含有P2和/或P3修饰序列和DIVA标记的1,517 bp NheI/MfeI、2,001 bp MfeI/BamHI或3512 bp NheI/BamHI片段(Uddowla等人，2012)被用于取代pA24-NheI中的WT序列。cDNA用SwaI线性化，且病毒RNA通过使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion)用T7聚合酶体外转录、遵循制造商的说明用RNeasy(Qiagen)试剂盒纯化来得到。如先前所述(Rieder 2005)，将10-20ug病毒RNA电穿孔于BHK-21细胞中，并且在37℃下孵育24小时后，将细胞冷冻用于随后的病毒释放和传代。对回收的病毒进行测序并用于大规模制备。通过在10-50％(W/V)蔗糖中密度梯度离心来纯化和浓缩病毒储备物。
所有去优化病毒设计的总结，包括去优化的方法、CG二核苷酸的最终％和体内减毒的总体水平描绘于表3中。
表3.去优化病毒设计
FMDV细胞感染
培养的细胞单层用FMDV以10的感染复数(moi)感染。在37℃下吸附1小时后，通过用含有20mM吗啉乙磺酸(MES)pH＝6.0中的150mM NaCl的溶液洗涤细胞、然后添加MEM并在37℃下在5％CO2中进行孵育，除去未吸附的病毒。感染的细胞在1、3、6和24小时冷冻，并且在解冻后通过对BHK-21细胞的噬斑测定来确定病毒滴度。在30hpi计数WT噬斑，并且在48hpi计数P2-P3 deopt噬斑。
通过qRT-PCR使用靶向FMDV基因组的保守且本文未修饰的3D区域的引物和探针以及标准循环条件测定VP/ml的数量(Callahan等人2002)。使用从已知浓度的体外合成的FMDV RNA的连续10倍稀释液的分析得出的方程，将循环阈值(Ct)值转换为每毫升或毫克的RNA拷贝数。通过在48hpi染色的常规噬斑测定法确定pfu/ml的数量(Rieder等人1993)
动物实验
动物实验在Plum Island Animal Disease Center的高封闭设施中进行，按照动物福利法案(AWA)、2011年实验动物护理和使用指南、2002年实验动物人道护理和使用PHS政策以及美国政府关于测试、研究和训练中使用的脊椎动物的利用和护理原则(IRAC1985)以及由Plum Island Animal Disease Center的机构动物护理和使用委员会(IACUC)审查和批准的特定动物方案(USDA/APHIS/AC证书编号：21-F-0001；用于小鼠的方案204-14R和用于猪的方案151-13R)进行。
小鼠实验
C57BL/66-7周龄雌性小鼠购自Jackson Labs(Bar Harbor，ME)并使之适应一周。为了评估毒力，进行A24-P2Deopt3B3D、A24-P3Deopt3B3D和A24-P2/P3Deopt3B3D与A24 WT的比较。各组C57BL/6小鼠(n＝6)用异氟烷(Webster Veterinary,Devens，MA)麻醉，并立即在左后足垫中用50-100ul不同剂量的FMDV A24-P2Deopt3B3Ddeopt、A24-P3Deopt3B3D和A24-P2/P3Deopt3B3D或参考FMDV A24皮下(SC)感染。监测动物8天。通过对BHK-21细胞进行噬斑测定或终点稀释来确定病毒血症，并且每周收集血清样品以评价中和抗体应答。
猪实验
在第一个实验中，使23只约克夏小母猪(5周龄并且每只重近似18-23kg)适应1周，并且随后分成5组(每组4只动物)和1组(每组3只动物)。在每组4只动物的5组中，3只动物在右后足的足跟球(IDHB)中用106或107pfu/动物的MDV A24-P2Deopt3B3D或A24-P3Deopt3B3D或A24-P2/P3Deopt3B3D皮内接种。该组的剩余动物是用于评估来自直接接种动物的接触传播的未处理动物。第6组包括3只动物，并且用105的FMDV A24 WT接种。
在第二个实验中，将16只猪分成4组，每组4只动物。如上所述对三组进行IDHB接种，但接种的剂量较低，为102、103或105pfu/动物的FMDV A24 P2/P3 deopt。剩余组用103的FMDV WT接种。
在每次FMDV接种后，通过确定呈现FMD病变的脚趾数量和鼻口部和/或嘴部病变的存在，每天评估临床评分，持续7天。考虑的最大评分为17，并且不计数限于接种部位的病变。使用Hemavet细胞计数器(DFew Scientific-Erba Diagnostics，Miami Lakes，FL)在前7天测量来自在EDTA中收集的全血的白细胞群体中的淋巴细胞的％。在接种日(基线)和接种后每天(持续7天)收集血清和鼻拭子的样品。
血清和鼻拭子中病毒的检测
通过对BHK-21细胞进行噬斑滴定来测定小鼠和猪血清和猪鼻拭子中病毒的存在。病毒滴度表示为log10 pfu/ml血清或鼻拭子分泌物。该测定的检测水平为5 pfu/ml。此外，如先前所述(Alejo等人，2013)，通过实时RT-PCR(rRT-PCR)检测FMDV RNA。使用从已知浓度的体外合成FMDV RNA的连续10倍稀释液的分析得出的方程，将循环阈值(Ct)值转换为每毫升的RNA拷贝数，并表示为每ml血清或鼻拭子的基因组拷贝数。
体液免疫应答的评估
根据
(OIE 2012)的方法，通过终点滴定在小鼠或猪血清样品中测定中和抗体滴度。抗体滴度表示为在50％孔中中和100 TCID50的稀释度的倒数的log10值。
数据分析
使用Prism 5.0(GraphPad Software，SanDiego，CA)或Microsoft Excel(Microsoft，Redmond，WA)进行数据处理、分析和图形表示。使用Student氏t检验确定统计显著性。
实施例2
P2、P3或P2/P3基因组区域的同义去优化产生存活的FMDV
先前的研究已经显示，P1基因组区域的序列去优化被FMDV毒株A12所耐受(Diazsan Segundo等人，同上)。P1区域因毒株而异，因此为了测试这种策略是否会对FMDV的高度保守的P2和/或P3区域起作用，我们设计了病毒基因组，其中密码子使用通过用非优选密码子替换来去优化。除了在3B和3Dpol病毒蛋白中提供阴性抗原标记的突变外，去优化序列在整个P2和P3编码区中分别含有320和/或367个核苷酸取代(图1)。修饰的序列从商业供应商合成获得，且随后替换至A24 Cruzeiro FMDV感染性cDNA克隆中(图2A和图2B)。修饰的FMDVA24衍生克隆的体外合成的RNA在BHK-21细胞中的电穿孔提供活病毒，产量为近似107pfu/ml，类似于WT亲本。在用PEG浓缩和/或通过蔗糖梯度纯化后获得高滴度病毒储备物(108-109pfu/m1)。BHK-21细胞中的重复传代表明修饰的病毒序列至少7代保持不变，并且在原始未修饰的病毒基因组中未检测到额外的取代，至少如共有序列测序(consensussequencing)所确定。在BHK-21细胞中，具有P2或P3去优化序列的病毒展现与WT相似的噬斑形态，但是含有去优化的P2和P3两者的病毒展现小噬斑表型(图2C)。已知FMDV具有相对低的比感染性(SI)，因为VP/pfu比率相对高并且主要取决于血清型和实验纯化程序。事实上，我们先前已经证明，对FMDV A12的P1区域的去优化将SI降低近似5倍。A24-P2、P3或P2/P3去优化病毒的SI的分析显示相对于亲本WT没有显著差异。去优化病毒的SI范围为2,580-9,900VP/pfu，而对于在相同实验条件下生长和纯化的WT病毒获得4,350VP/pfu的值(图2C)。
具有去优化的P2和/或P3编码区的FMDVA24在原代细胞培养物中减毒
A24-去优化病毒的表型通过以下细胞培养物上的生长动力学进行分析。用于繁殖FMDV的常规细胞系，包括BHK-21或IBRS-2，以及原代猪肾(PK)或胚胎牛肾(EBK)细胞，被不同的病毒感染，并且样品在感染后的不同时间冷冻。然后解冻感染的细胞，并通过对BHK-21细胞进行噬斑测定来确定释放病毒的滴度。噬斑在48hpi染色以便于计数。如图3A中所见，到24hpi，三种去优化病毒在BHK-21细胞中达到约107pfu/ml的终点滴度，类似于WT病毒，尽管去优化的A24-P2/P3Deopt3B3D以有点较慢的生长速度生长。在IBRS-2细胞中检测到类似的表型，但与A24-WT或A24-P2Deopt3B3D或A24-P3Deopt3B3D去优化病毒的滴度相比，A24-P2/P3Deopt3B3D病毒的终点滴度低约一个对数(106pfu/ml)(图3B)。有趣的是，所有去优化病毒都在造成选择性先天压力的细胞(诸如源自猪或牛的原代肾培养物)中减毒(图3C和图3D)。在这些细胞中，所有三种去优化病毒的产量都比由WT病毒获得的产量低2-4个对数。这些结果表明，P2-P3去优化FMDV在细胞培养物中减毒，并且表现与先前报道的其他减毒FMDV毒株相似。
P2和/或P3编码区的同义去优化导致小鼠中FMDV的减毒
我们先前已经证实，为FMDV血清型C开发的FMD小鼠模型也是FMDV血清型A和O的有效工具。为了检查A24-P2-P3 deopt病毒的毒力，6-7周龄雌性C57BL/6小鼠用不同剂量的FMDV A24-P2Deopt3B3D、A24-P3Deopt3B3D或A24-P2/P3Deopt3B3D或FMDV A24-WT接种。感染后持续一周监测临床体征、存活率和血液中病毒或病毒RNA的存在。如所预期，用105pfu的WTFMDVA24接种的动物发展临床体征，包括嗜睡和毛发粗糙(数据未显示)，并在接种后24-48h死亡(图4A)。相比之下，用去优化A24病毒接种的动物展现不同水平的存活，这取决于病毒变体和剂量。有趣的是，用A24-P2/P3Deopt3B3D接种的所有动物(与使用的剂量无关)、用106pfu的A24-P2Deopt3B3D接种的动物、80％的用107pfu的A24-P2Deopt3B3D接种的动物未显示临床体征或在接种后一周未死亡(图4A)，而用A24-P3Deopt3B3D接种的小鼠组没有存活，尽管疾病进展显著慢于用WT FMDV A24接种。与存活数据一致，用A24-P2/P3Deopt3B3D病毒接种的动物发展最低的病毒血症水平(大约104pfu/m1)，随后为A24-P2Deopt3B3D(106pfu/ml)、A24-P3Deopt3B3D(107pfu/ml)和A24-WT(108pfu/ml)(图4B)。用去优化变体接种的所有接种动物产生高水平的中和抗体滴度，到7-15dpi为约2 log 10，其在21dpi用WT病毒攻击后加强(图4C)。与血清中和数据直接相关，在用A24去优化突变体初始接种后存活下来的所有动物在用致死剂量的A24 WT病毒攻击后都得到完全保护，并且没有发展可检测的病毒血症(数据未显示)。这些结果表明FMDV A24-P2/和/或P3去优化病毒在小鼠中减毒并引发针对WT病毒攻击的强烈保护性体液应答。
P2和/或P3编码区的同义去优化导致猪中FMDV的减毒
在小鼠中获得的有希望的结果促使我们评估A24-P2Deopt3B3D、A24-P3Deopt3B3D和A24-P2/P3Deopt3B3D在猪(FMDV的天然宿主)中的毒力。三只猪的组在后足跟球中用106或107pfu/动物的A24-P2Deopt3B3D和A24-P2/P3Deopt3B3D进行IDHB接种。鉴于A24-P3Deopt3B3D病毒在体外和小鼠中观察到的相对低减毒，仅包括用106pfu/动物接种的一组。每组中包括一只未处理的接触动物，并在实验的持续时间内保持接触。我们还包括用作为对照的105pfu的A24-WT病毒接种的额外一组。
用105pfu的A24-WT病毒接种的所有动物到2-3dpi发展临床体征，在接种后第3-7天达到高评分(10-17个病变)，并且通过病毒分离或通过实时PCR在血清和鼻腔分泌物中检测到病毒(图5)。用10倍以上病毒(106pfu/动物的A24-P3Deopt3B3D)接种的动物表现与WT相似(图6)。然而，在用A24-P2Deopt3B3D病毒接种的动物中观察到疾病出现延迟一天，其中动物在用106pfu/猪接种时直到第3天才显示临床疾病(图7)。有趣的是，用A24-P2/P3Deopt3B3D接种的动物展现显著降低的疾病严重程度(2-7个病变)，并且一只动物没有发展任何临床体征(图8)。值得注意的是，与用106pfu/动物的三种去优化FMDV变种之一直接接种的动物保持接触的未处理动物没有发展疾病的临床体征。一致地，在所有发展病变的动物中检测到病毒血症，但仅在与A24-P3Deopt3B3D共同圈养的未处理接触动物中检测到。在所有接种或接触的动物的鼻腔分泌物中检测到病毒，但在未展现病变的动物中的水平显著低(图5-8)。这些结果表明，P2或P3编码区的去优化导致病毒在猪中减毒，但当P2和P3区域两者的去优化同时包括在修饰毒株中时，实现了最高水平的减毒。
在整个实验过程中对特异性中和抗体的分析显示，用106或107pfu的A24-P2Deopt3B3D、106或107pfu的A24-P3Deopt3B3D和107pfu的A24-P2/P3Deopt3B3D接种的所有动物中强烈的应答，并且与用105pfu的A24 WT接种的猪的组相似，与所述去优化病毒在动物宿主中的缓慢复制一致(图9)。
鉴于在A24-P2/P3Deopt3B3D变体中实现了最高水平的减毒，进行第二次动物实验以确定最小感染剂量。动物组用102、103或105的A24-P2/P3Deopt3B3D病毒接种，并且一组用103pfu/动物的作为对照的A24-WT接种。如图10中所见，用A24-P2/P3Deopt3B3D病毒接种的动物到IDHB接种后7天无一发展临床体征。相比之下，用103pfu/动物的A24 WT接种的所有猪都发展疾病。尽管接种的A24 WT量相对低，但该组的四只接种动物中的三只到5-7dpc达到高评分(15-17个病变。最大值＝17)，并且一只动物到第7天具有10个病变的评分，类似于在使用高10倍剂量(104pfu/动物)的第一猪实验中观察到的动力学。在所有发展病变的动物中观察到一致的淋巴细胞减少。然而，尽管用A24-P2/P3Deopt3B3D接种的动物无一发展水泡性病变，但一只动物(#66)到7dpi具有可检测的淋巴细胞减少，但到14dpi未出现病变(数据未显示)。一致地，在用A24WT病毒接种的所有动物的血清和鼻拭子中检测到病毒或病毒RNA，而在用A24-P2/P3Deopt3B3D接种的所有动物中的血清或鼻腔分泌物中均未检测到病毒或病毒RNA(图11)，除了动物#66在7dpi显示淋巴细胞减少，如上所示。然而，没有从该动物的血清中分离出活病毒，这与缺乏病变检测是一致的。
在这些动物中的整个实验过程中对特异性中和抗体应答的分析显示，在用105pfuA24-P2/P3Deopt3B3D接种的猪组中的应答轻微，而在用较低剂量接种的动物中检测不到中和抗体的存在(图12)。如所预期，用FMDV A24 WT接种的动物从7dpi开始发展中和抗体，显示与用更高剂量的WT病毒接种的动物相比略微延迟(数据未显示)。我们的数据表明存在适应性免疫应答的剂量应答性诱导。
实施例3
P1的同义去优化可以扩展至多种FMDV血清型/亚型。
我们先前已经表明P1的密码子对偏倚去优化可应用于FMDV血清型A(A12)，使活病毒在小鼠和猪中减毒(Diaz-San Segundo等人，同上)。为了确定这种方法是否可以扩展至其他FMDV血清型/亚型，我们应用相同的算法来去优化FMDV A24(图13)和FMDV Asial(图14)的P1区域。使用方便工程改造的FseI/NheI限制性位点，获得合成的A24和Asia1 P1deopt序列并克隆于pA24Cru3B3D中(图15A和图16A)。病毒在BHK-21细胞中被拯救，显示与各自的A24或Asia 1野生型病毒相比相对小的噬斑大小。(图15B和图16B)。生长动力学的分析表明，两种病毒在BHK-21和猪SK6细胞中均被减毒(图17A和图17B)，这表明P1的去优化引起病毒产生的延迟，可能是由于对病毒复制或翻译的影响(Lauring等人，Cell HostMicrobe.，(2012)12：623-632.；Yu等人，2015，Molecular Cell(2015)59：744-754)。
A24cru WVT 3B3D P1编码区的同义去优化导致小鼠中FMDV的减毒
为了检查体内FMDV毒力的血清型内再现性，我们首先用A24-P1 deopt3B3D FMDV进行小鼠实验。感染后持续一周监测临床体征、存活率和血液中病毒或病毒RNA的存在。如所预期并与先前的实验一致(Diaz-San Segundo 2012，J Virol.87：5447-5460-)，83％的用105pfu FMDV A24 WT接种的小鼠到1-2dpi死亡；一只动物在6dpi死亡(图18A)。相比之下，用A24 P1deopt3B3D接种的所有动物都存活7天，甚至是用107pfu接种的那些也是如此。有趣的是，只有对照动物和用106和107pfu接种的那些发展病毒血症，但其水平低于已经用105pfu的FMDV A24WT接种的对照组中检测到的那些(图18B)。用A24 P1deopt3B3D接种的所有接种动物都发展可检测水平的中和抗体，其中滴度在0.2至1.2log 10之间波动，这取决于接种病毒的量(图18C)。对于用A24WT病毒接种的对照组检测到最高滴度。这些结果与先前对于FMDV A12 P1 deopt获得的结果一致(Diaz-San Segundo等人2015.J Virol.90：1298-1310)，表明FMDVA24的P1去优化在小鼠中导致类似的减毒，引发可检测的体液应答。
A24cru WT 3B3D P1编码区的同义去优化导致FMDV在猪中的减毒
在猪中进一步评估FMDV A24 P1deopt3B3D的毒力。4只猪的各组在后足跟球中用103至106pfu/动物的不同剂量的A24-P1Deopt3B3D进行IDHB接种。除了一只外，用103和104pfu/动物接种的所有动物均未发展临床体征。用106pfu A24-P1Deopt3B3D病毒接种的动物确实到2-4dpi发展临床体征，但评分(1-10个病变)(图19)低于对于A24 WT病毒观察到的那些(10-17个病变)(图5)。有趣的是，在用105pfu接种的组中，一只动物没有发展病变。总体而言，在一些动物中检测到低病毒血症，但在鼻腔分泌物中不是如此(图20)。中和抗体滴度的分析表明在用最高剂量的病毒(105和106pfu)接种的动物中引发了显著水平(＞2log10 TCID50/ml)(图21)。
Asia 3B3D P1编码区的同义去优化导致小鼠中FMDV的减毒
用Asia P1Deopt3B3D进行类似的动物实验。各组小鼠用102至107的Asia1-P1Deopt3B3D病毒接种，并且一组用5x104 pfu/动物的作为对照的Asia-WT接种。该剂量更早已经被确立为适合在C57/BL6小鼠中引起100％致死率。如图22中所见，用Asia1P1Deopt3B3D病毒接种的动物无一到7dpi死亡。相比之下，用Asial WT接种的所有小鼠都到1-2dpi死亡。用AsialP1Deopt3B3D接种的动物无一(甚至是接受107pfu/动物的那些也是如此)发展病毒血症，而对照动物则发展。有趣的是，Asial-P1Deopt3B3D诱导高水平的中和抗体，主要在较高剂量下。
Asia 3B3D P1编码区的同义去优化导致猪中FMDV的减毒
在猪中进行后续实验。每组4只动物的三组分别用103、105和106pfu/动物的Asia1P1Deopt3B3D接种；一组用105pfu/动物的作为对照的Asial WT接种。值得注意的是，12只Asia1P1Deopt3B3D接种动物中的11只没有发展临床体征(图23)。用106pfu接种的动物之一在接种后约一周具有低评分(可能的17只中有4只)。在AsialP1Deopt3B3D接种动物中的任一只中没有检测到病毒血症或脱落(图24)。相比之下，用Asia 1WT病毒接种的组中的所有动物在感染后2和3天之间发展包括病变和淋巴细胞减少在内的临床体征，并且一只动物在感染后2天(2dpi)死亡。一致地，仅在用Asia 1WT病毒接种的动物中检测到病毒血症和病毒脱落。只有用两种最高剂量(105和106pfu/动物)的AsialP1Deopt3B3D接种的动物发展中和抗体应答，尽管水平低于由AsialWT病毒引发的水平。总体而言，AsialP1Deopt3B3D的抗体滴度低于对于AsialP1Deopt3B3D引发的抗体滴度(图25)。
所有这些结果一起表明，FMDV P1区域的去优化引起不依赖于血清型或亚型的一致减毒。
尽管本发明已参照举例说明的实施方案的细节进行描述，但这些细节并不意欲限制如所附权利要求中所定义的本发明的范围。要求排他性所有或特权的发明的实施方案定义如下。
序列表
<110> DE LOS SANTOS, TERESA B.
MEDINA, GISSELLE N.
RIEDER, AIDA E.
DIAZ-SAN SEGUNDO, FAYNA C.
KLOC, ANNA
COLEMAN, JOHN R.
MUELLER, STEFFEN
<120> 通过去优化修饰的口蹄疫活减毒毒株及其用途
<130> 0137.18
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1517
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的
<400> 1
gctagccggc gacgtcgaat ctaaccccgg tccgtttttt tttagcgacg ttaggtctaa 60
cttttctaag ctcgtcgata ctattaacca aatgcaagaa gatatgagta ctaagcacgg 120
acccgatttt aataggctcg ttagcgcttt cgaagagctc gctaccggcg ttaaggccat 180
taggaccggt ctcgacgaag ctaagccgtg gtataagtta attaaattac ttagccggct 240
tagctgtatg gccgctgtgg cagcacggtc aaaggaccca gtccttgtgg ccatcatgct 300
ggctgacacc ggtctcgaga ttctggacag caccttcgtc gtgaagaaga tctccgactc 360
gctctccagt ctcttccacg tgccggcccc cgtcttcagt ttcggagccc cgattctgtt 420
agccgggttg gtcaaggtcg cctcgagttt cttccggtcc acgcccgaag accttgagag 480
agcagagaaa cagctcaaag cacgtgatat taacgatatc ttcgcaattc ttaagaacgg 540
cgaatggctc gttaagttaa tactcgcaat ccgcgattgg ataaaagcgt ggatcgcaag 600
cgaagaaaaa ttcgttacta ctaccgatct cgtacctagt atcctcgaaa aacaacaaga 660
tcttaacgat cctagtaagt ataaggaagc taaggaatgg ctcgataacg ctaggcaagc 720
gtgtttaaaa tccggtaacg tacatatcgc taacttatgt aaggtcgtcg cacccgctcc 780
tagtaggtct aggcccgagc ccgtcgtcgt atgtttacgc ggtaagtccg gtcaaggtaa 840
gtcgtttctc gctaacgtac tcgcgcaagc gattagtacg cattttaccg gtaggaccga 900
tagcgtatgg tattgtccgc ccgatcccga tcatttcgac ggatataacc aacaaaccgt 960
agtcgttatg gacgatctcg gtcaaaatcc cgacggtaag gattttaaat atttcgcaca 1020
aatggttagc actaccggtt ttatcccgcc tatggctagt ctcgaagata agggtaaacc 1080
gtttaactct aaggttatta tcgctacgac taacttatat agcggtttta cgcctaggac 1140
tatggtatgt cccgacgcac ttaaccgtag gtttcatttc gatatcgacg ttagcgctaa 1200
ggacggatat aagattaaca ataagctcga tatcattaag gcactcgagg atacgcatac 1260
taaccccgtc gctatgtttc aatacgattg cgcattactt aacggtatgg ccgtcgaaat 1320
gaaacgtatg caacaagata tgtttaaacc gcaaccgccg ttacaaaacg tatatcaact 1380
cgtacaagaa gttatcgaac gcgtcgaatt acacgaaaaa gttagtagcc atcctatctt 1440
taagcaaatt agtatcccta gccaaaaaag cgtattatat tttttaatcg aaaaaggtca 1500
acacgaagcc gcaattg 1517
<210> 2
<211> 2001
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的
<400> 2
caattgaatt tttcgaaggt atggtacacg atagcattaa ggaagaattg cggccgctaa 60
tacaacaaac tagcttcgtt aagcgcgcat ttaagcgact taaggaaaat ttcgaaatcg 120
tcgcgttatg tcttacgtta ctcgctaata tcgttattat gatacgcgaa actcgtaagc 180
gacaaaaaat ggtcgatgac gccgttagcg aatatatcga acgcgctaac attacgaccg 240
acgataagac gctcgacgaa gccgaaaaaa atccgctcga aactagcggc gctagtaccg 300
tcggattccg cgaacgaccg ttacccggtc aaaaagctag gaacgacgaa aactccgaac 360
ccgctcagcc tgcagaagag caaccacaag ctgaaggacc ctacgctggc ccgatggaga 420
gaccagttaa agttaaagtg aaagcaaaag ccccggtcgt taaggaagga ccttacgagg 480
gaccggtgaa gaagcctgtt gctttgaaag tgaaagctaa gaacttgatc gtcactgaga 540
gtggtgcccc accgaccgac ttgcaaaagt tggtcatggg caacaccaag cccgttgagc 600
tcatccttga cgggaagacg gtagccattt gctgtgctac tggagttttc ggcactgctt 660
acctcgtgcc tcgtcatctt ttcgcagaaa agtacgacaa gatcatgttg gacggcagag 720
ccatgacaga tagtgactac agagtgtttg agtttgagat taaagtaaaa ggacaggaca 780
tgctctcaga cgctgcgctc atggtgctcc accgtgggaa tcgcgtgaga gacatcacga 840
aacactttcg tgacacagca agaatgaaga aaggcacccc cgtcgttggt gtgatcaaca 900
acgccgatgt cgggagactg attttctctg gtgaagcgtt aacgtataag gatatcgtcg 960
tatgtatgga cggcgatact atgcccggtt tattcgcata taaggccgct actaaggccg 1020
gatattgcgg aggcgccgta ctcgctaagg acggagccga tacgtttatc gtaggtacgc 1080
atagcgccgg cggtaacggc gtcggatatt gtagctgcgt tagccgtagt atgcttctta 1140
agatgaaagc gcacgtcgat cccgaaccgc atcacgaagg tttaatcgtc gatacccgcg 1200
acgtcgaaga acgcgtacac gttatgcgta agactaagct cgcacctacc gtcgcatacg 1260
gcgtatttag gcccgaattc ggacccgccg cacttagcaa taaagatcct aggcttaacg 1320
acggcgtcgt actcgacgaa gttatcttta gtaagcataa gggcgatact aagatgtccg 1380
aagaagataa ggcgttattc cgtaggtgcg ccgccgatta cgctagtagg ttacatagcg 1440
tactcggtac cgctaacgct ccgcttagta tctacgaagc gattaagggc gtagacggac 1500
tcgacgctat ggaacccgat accgctcccg gtttaccgtg ggcgttacaa ggtaagcgta 1560
ggggcgcatt aatcgatttc gaaaacggta ccgtcggacc cgaagtcgaa gccgcactta 1620
agcttatgga aaaacgcgaa tataagttcg catgtcaaac gtttcttaag gacgaaatta 1680
ggcctatgga aaaagttagg gccggtaaga ctaggattgt cgacgtatta cccgtcgaac 1740
atatattata tactaggatg atgatcggta ggttttgcgc gcaaatgcat agtaataacg 1800
gtccgcaaat cggtagcgcc gtcggatgta accccgacgt cgattggcaa cgattcggta 1860
cgcatttcgc acaatatcgt aacgtatggg acgtcgatta tagcgctttc gacgctaacc 1920
attgtagcga cgctatgaat ataatgttcg aagaagtatt taggaccgaa ttcggttttc 1980
atcctaacgc cgaatggatc c 2001
<210> 3
<211> 3512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的
<400> 3
gctagccggc gacgtcgaat ctaaccccgg tccgtttttt tttagcgacg ttaggtctaa 60
cttttctaag ctcgtcgata ctattaacca aatgcaagaa gatatgagta ctaagcacgg 120
acccgatttt aataggctcg ttagcgcttt cgaagagctc gctaccggcg ttaaggccat 180
taggaccggt ctcgacgaag ctaagccgtg gtataagtta attaaattac ttagccggct 240
tagctgtatg gccgctgtgg cagcacggtc aaaggaccca gtccttgtgg ccatcatgct 300
ggctgacacc ggtctcgaga ttctggacag caccttcgtc gtgaagaaga tctccgactc 360
gctctccagt ctcttccacg tgccggcccc cgtcttcagt ttcggagccc cgattctgtt 420
agccgggttg gtcaaggtcg cctcgagttt cttccggtcc acgcccgaag accttgagag 480
agcagagaaa cagctcaaag cacgtgatat taacgatatc ttcgcaattc ttaagaacgg 540
cgaatggctc gttaagttaa tactcgcaat ccgcgattgg ataaaagcgt ggatcgcaag 600
cgaagaaaaa ttcgttacta ctaccgatct cgtacctagt atcctcgaaa aacaacaaga 660
tcttaacgat cctagtaagt ataaggaagc taaggaatgg ctcgataacg ctaggcaagc 720
gtgtttaaaa tccggtaacg tacatatcgc taacttatgt aaggtcgtcg cacccgctcc 780
tagtaggtct aggcccgagc ccgtcgtcgt atgtttacgc ggtaagtccg gtcaaggtaa 840
gtcgtttctc gctaacgtac tcgcgcaagc gattagtacg cattttaccg gtaggaccga 900
tagcgtatgg tattgtccgc ccgatcccga tcatttcgac ggatataacc aacaaaccgt 960
agtcgttatg gacgatctcg gtcaaaatcc cgacggtaag gattttaaat atttcgcaca 1020
aatggttagc actaccggtt ttatcccgcc tatggctagt ctcgaagata agggtaaacc 1080
gtttaactct aaggttatta tcgctacgac taacttatat agcggtttta cgcctaggac 1140
tatggtatgt cccgacgcac ttaaccgtag gtttcatttc gatatcgacg ttagcgctaa 1200
ggacggatat aagattaaca ataagctcga tatcattaag gcactcgagg atacgcatac 1260
taaccccgtc gctatgtttc aatacgattg cgcattactt aacggtatgg ccgtcgaaat 1320
gaaacgtatg caacaagata tgtttaaacc gcaaccgccg ttacaaaacg tatatcaact 1380
cgtacaagaa gttatcgaac gcgtcgaatt acacgaaaaa gttagtagcc atcctatctt 1440
taagcaaatt agtatcccta gccaaaaaag cgtattatat tttttaatcg aaaaaggtca 1500
acacgaagcc gcaattgaat ttttcgaagg tatggtacac gatagcatta aggaagaatt 1560
gcggccgcta atacaacaaa ctagcttcgt taagcgcgca tttaagcgac ttaaggaaaa 1620
tttcgaaatc gtcgcgttat gtcttacgtt actcgctaat atcgttatta tgatacgcga 1680
aactcgtaag cgacaaaaaa tggtcgatga cgccgttagc gaatatatcg aacgcgctaa 1740
cattacgacc gacgataaga cgctcgacga agccgaaaaa aatccgctcg aaactagcgg 1800
cgctagtacc gtcggattcc gcgaacgacc gttacccggt caaaaagcta ggaacgacga 1860
aaactccgaa cccgctcagc ctgcagaaga gcaaccacaa gctgaaggac cctacgctgg 1920
cccgatggag agaccagtta aagttaaagt gaaagcaaaa gccccggtcg ttaaggaagg 1980
accttacgag ggaccggtga agaagcctgt tgctttgaaa gtgaaagcta agaacttgat 2040
cgtcactgag agtggtgccc caccgaccga cttgcaaaag ttggtcatgg gcaacaccaa 2100
gcccgttgag ctcatccttg acgggaagac ggtagccatt tgctgtgcta ctggagtttt 2160
cggcactgct tacctcgtgc ctcgtcatct tttcgcagaa aagtacgaca agatcatgtt 2220
ggacggcaga gccatgacag atagtgacta cagagtgttt gagtttgaga ttaaagtaaa 2280
aggacaggac atgctctcag acgctgcgct catggtgctc caccgtggga atcgcgtgag 2340
agacatcacg aaacactttc gtgacacagc aagaatgaag aaaggcaccc ccgtcgttgg 2400
tgtgatcaac aacgccgatg tcgggagact gattttctct ggtgaagcgt taacgtataa 2460
ggatatcgtc gtatgtatgg acggcgatac tatgcccggt ttattcgcat ataaggccgc 2520
tactaaggcc ggatattgcg gaggcgccgt actcgctaag gacggagccg atacgtttat 2580
cgtaggtacg catagcgccg gcggtaacgg cgtcggatat tgtagctgcg ttagccgtag 2640
tatgcttctt aagatgaaag cgcacgtcga tcccgaaccg catcacgaag gtttaatcgt 2700
cgatacccgc gacgtcgaag aacgcgtaca cgttatgcgt aagactaagc tcgcacctac 2760
cgtcgcatac ggcgtattta ggcccgaatt cggacccgcc gcacttagca ataaagatcc 2820
taggcttaac gacggcgtcg tactcgacga agttatcttt agtaagcata agggcgatac 2880
taagatgtcc gaagaagata aggcgttatt ccgtaggtgc gccgccgatt acgctagtag 2940
gttacatagc gtactcggta ccgctaacgc tccgcttagt atctacgaag cgattaaggg 3000
cgtagacgga ctcgacgcta tggaacccga taccgctccc ggtttaccgt gggcgttaca 3060
aggtaagcgt aggggcgcat taatcgattt cgaaaacggt accgtcggac ccgaagtcga 3120
agccgcactt aagcttatgg aaaaacgcga atataagttc gcatgtcaaa cgtttcttaa 3180
ggacgaaatt aggcctatgg aaaaagttag ggccggtaag actaggattg tcgacgtatt 3240
acccgtcgaa catatattat atactaggat gatgatcggt aggttttgcg cgcaaatgca 3300
tagtaataac ggtccgcaaa tcggtagcgc cgtcggatgt aaccccgacg tcgattggca 3360
acgattcggt acgcatttcg cacaatatcg taacgtatgg gacgtcgatt atagcgcttt 3420
cgacgctaac cattgtagcg acgctatgaa tataatgttc gaagaagtat ttaggaccga 3480
attcggtttt catcctaacg ccgaatggat cc 3512
<210> 4
<211> 2234
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的
<400> 4
ggggccggcc aatcgagtcc cgctaccggt tcgcaaaacc aatccggtaa caccggatcg 60
atcattaaca attactatat gcagcaatac cagaactcta tggacacaca gttgggcgac 120
aacgctatct ccggcggatc gaacgagggg tcaaccgaca ctacgagtac gcatacgact 180
aacacacaga ataacgattg gttttcgaag ctcgcttcat ccgcttttac cgggttgttc 240
ggcgcactgc ttgccgataa gaagaccgaa gagactacgt tgctcgagga ccggattctg 300
actacgcgta acggtcacac aacatcgaca acgcaatcgt cagtcggcgt gacacacggg 360
tactcaaccg aagaggacca cgtcgccgga ccgaacacta gcggactcga gacacgcgtt 420
gtgcaggccg aacggtttta caaaaagtat ctgttcgatt ggactaccga caaagcgttc 480
ggtcacctcg agaaactcga gttgcctagc gaccaccacg gcgtgttcgg gcaccttgtc 540
gactcatacg cttacatgcg taacgggtgg gacgtcgagg tgtccgccgt aggcaatcag 600
ttcaacgggg ggtgcctgtt ggtcgcgatg gtgcccgaat ggaaagagtt cgacacacgc 660
gaaaagtacc aactgacact gtttccgcac caattcatta gtccgcgaac gaacatgacc 720
gctcacatta ccgtgccata ccttggcgtt aacagatacg accaatacaa aaagcacaag 780
ccttggacac tcgttgtgat ggtcgtgagt ccgcttaccg ttaacaacac tagtgccgca 840
cagattaagg tgtacgctaa catcgcaccg acatacgtgc acgtcgccgg cgaattgccg 900
tctaaggagg ggatctttcc cgtcgcatgc gccgacggat acggcggact cgtgactacc 960
gaccctaaga ccgccgaccc cgcatacggt aaggtgtaca atccgcctag aactaactac 1020
cccggtaggt ttacgaactt gctcgacgtc gccgaagcgt gtccgacatt cttgtgcttc 1080
gacgacggta agccatacgt tacgacacga accgacgaca ctagactgct tgcgaaattc 1140
gacctgtcac tcgccgctaa gcatatgtct aacacatacc tatccggtat cgcgcaatac 1200
tatacgcaat actccggtac gattaacttg cactttatgt ttaccggatc gaccgactct 1260
aaggctaggt atatggtcgc atacattccg cctggcgtcg agacaccccc cgacacaccc 1320
gaacgcgccg cacactgtat ccacgccgaa tgggacaccg ggcttaactc taagtttacg 1380
ttttcgatcc catacgtgtc cgccgcggat tacgcataca ccgcgagcga taccgccgaa 1440
acgattaacg tgcaggggtg ggtgtgcata taccagatta cgcacggtaa ggccgaaaac 1500
gacacactcg tagtgtccgt tagcgccggt aaggacttcg agttgcggtt gccgatcgac 1560
cctagacagc agactaccgc taccggcgaa tccgccgacc cagtgactac gacagtcgag 1620
aattacggcg gtgagacaca gatccaacgg agacaccata ccgacatagg gttcattatg 1680
gacagattcg ttaagataca gtcactgtca ccgacacacg tgatcgacct tatgcagaca 1740
caccaacacg gactcgtagg cgcactgttg cgcgccgcta catactactt ttccgacctc 1800
gagatcgtcg tgcgacacga gggtaacctg acatgggtgc ctaacggcgc acccgaatcc 1860
gcactgctta acactagcaa tccgaccgca tacaacaaag cgccattcac acgactcgca 1920
ctgccataca ccgcaccgca tagggtgctt gcgacagtgt acaacggtac gtctaagtac 1980
gccgtaggcg ggtccggtag acgcggcgac atggggtcac tcgccgctag ggtggttaag 2040
cagttgcccg ccagctttaa ctacggcgca atcaaggccg acgctatcca cgaactgctt 2100
gtgcgtatga aacgcgccga actgtattgc cctagaccgt tgctcgcgat cgaggtgagt 2160
tcgcaagaca gacacaaaca gaagattatc gcccccgcta agcagcttct gaattttgac 2220
ctgctcaagc tagc 2234
<210> 5
<211> 2222
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的
<400> 5
ggggccggcc aatctagtcc cgctaccggt agtcagaacc agtccggtaa caccggatcg 60
atcattaaca actactatat gcagcaatac cagaactcta tggacacaca gttgggcgat 120
aacgctatct caggcggatc gaacgagggg tcgaccgaca ctacctctac gcacactaac 180
aacacacaga ataacgactg gttttcgcga cttgcttcta gcgcgtttag cggactgttc 240
ggcgcactgc ttgccgataa gaagaccgaa gagactacgt tgctcgagga tcgcatactg 300
actacgcgta acggtcacac tacgagtacg acacagtcta gcgtaggcgt gacatacgga 360
tacgccgttg cggaggacgc cgttagcgga ccgaacacta gcggactcga gacacgcgta 420
cagcaggccg aacggttctt taagaaacac ctattcgatt ggactccgaa cctcgcattc 480
ggacactgtt actatctcga gttgccgacc gaacacaaag gcgtgtacgg atcgcttatg 540
gggtcatacg catacatgcg taacgggtgg gacatcgagg tgaccgcagt cggtaaccag 600
tttaacgggg ggtgtctgtt agtcgcgctt gtgcccgaac tgaaagagct tgacacacgc 660
caaaagtacc aactgacact gttcccacac caattcatta accctaggac taacatgacc 720
gctcacatta acgtgccata cgtcggtatc aatcggtacg accaatacgc tctgcacaag 780
ccttggacac tcgtcgtgat ggtcgtcgca ccccttaccg ttaagaccgg cgggtccgaa 840
cagattaagg tgtatatgaa cgctgcgcca acatacgtgc acgttgccgg cgagttgccg 900
tctaaggagg ggatcgtgcc cgtcgcatgc gccgacggat acggtaacat ggtgactacc 960
gaccctaaga ccgccgaccc cgtgtacggt aaggtgttca accccccccg cactaacctg 1020
cccggtaggt ttacgaactt tctcgacgtc gccgaagcgt gccctacatt ccttaggttc 1080
ggcgaagtgc cattcgttaa gaccgtgaac tccggcgatc gcttgctcgc gaaattcgac 1140
gtgtcactcg ccgccggtca catgtctaac acataccttg ccggactcgc gcaatactat 1200
acgcaatact ccggtacgat gaacgtgcac tttatgttta ccggaccgac cgacgctaag 1260
gctaggtata tggtcgcgta cgttcccccc ggtatgacac cccctaccga ccccgaacac 1320
gccgcacact gtatccactc tgagtgggac accggactta actctaagtt tacgttttcg 1380
atcccatacc tatccgccgc ggactacgct tacaccgcga gcgacgttgc cgaaacgact 1440
agcgtgcagg ggtgggtgtg tatctaccag attacgcacg gtaaggccga aggcgacgca 1500
ctcgtcgtga gtgtgtccgc cggtaaggac ttcgagtttc gcttgcccgt tgacgctagg 1560
cagcagacta cgactaccgg cgaatccgcc gatcccgtta cgactaccgt cgagaactac 1620
ggcggagaga cacagaccgc taggcgactg cataccgacg ttgcgttcat actcgaccgg 1680
ttcgttaagc ttaccgcgcc taagaatatc cagacactcg accttatgca gatcccgtca 1740
cacacactcg taggcgcact gttgcgctct gcgacatact acttttccga cctcgaggtc 1800
gcgcttgtgc acaccggtcc cgtgacatgg gtgcctaacg gcgcaccgaa agacgcactg 1860
aacaaccaga ctaaccctac cgcataccag aaacgcccta ttacgcgact cgcactgcca 1920
tacaccgcac cccatagggt gcttgcgacc gtgtataacg gtaagaccgc atacggcgag 1980
actacctcta ggcgcggcga catggccgca ctcgcgcaac gcctatccgc tagactgcca 2040
acgtcattca attacggcgc cgttaaggcc gatacgatca ccggactgct tatccgtatg 2100
aaacgcgctg agacatactg tccacgcccc ctactcgcac tcgatacgac tcaggacaga 2160
cgcaaacagg agataatcgc acccgagaaa cagcttctga attttgacct gcttaagcta 2220
gc 2222
<210> 6
<211> 2231
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的
<400> 6
ggggccggcc aatcgagtcc cgctactggg tcacagaacc agtccggtaa taccggatcg 60
atcattaaca actactatat gcagcaatac cagaattcaa tggacacaca gttaggcgat 120
aacgctacta gcggggggtc gaacgagggg tcaaccgata cgaccagtac gcacactacg 180
aacacacaga acaatgattg gttttcgaaa ctcgctagtt ccgcttttag cggactgttc 240
ggcgctctgc ttgcggacaa aaagaccgaa gagactacac tgcttgagga ccgcatactg 300
actacccgta acgggcatac gactagcact acccagtcta gcgtaggcgt gacatacggg 360
tacgctaccg ccgaagactt cgttagcgga ccgaacacta gcggactcga gacacgcgtt 420
gcgcaagccg aacggttctt taagacacac ctgttcgatt gggtgactag cgacccattc 480
ggtaggtgcc acttgctcga gttgcctacc gaccacaaag gggtgtacgg atcgcttacc 540
gactcatacg cttacatgcg taacgggtgg gacgtcgagg tgaccgcagt cggtaaccaa 600
ttcaacgggg ggtgcttgct cgttgcgatg gtgcctgagt tgtgctcaat ccagaaacgc 660
gaactgtatc agcttacact gtttccgcac caattcatta accctaggac taacatgacc 720
gctcacatta ccgtgccatt cgtaggcgtg aaccggtacg accaatacaa agtgcacaaa 780
ccttggacac tggtcgtgat ggtggtcgca ccgcttaccg ttaattccga gggagcgcca 840
cagattaagg tgtacgctaa catcgcaccg actaacgtgc acgtcgccgg tgagttccct 900
agcaaagagg gtatctttcc ggtcgcatgc tccgacggat acggggggtt agtgactacc 960
gaccctaaga ccgctgaccc tgcgtacggt aaggtgttca acccgccacg taatatgttg 1020
cccggtcggt ttacgaactt tctcgacgtc gccgaggcat gccctacatt cttgcacttc 1080
gagggcgacg tgccatacgt tacgactaag accgactccg atagggtgct tgcgcaattc 1140
gacctgtcac tcgccgctaa gcacatgtcg aacacattcc ttgccggact cgcgcaatac 1200
tatacgcaat actccggtac gatcaacctg cactttatgt ttaccggacc taccgacgct 1260
aaggctaggt atatgatcgc atacgctccc cccggtatgg agcctcctaa gactcccgaa 1320
gccgccgctc actgtatcca cgccgaatgg gacaccggac tgaattctaa gtttacgttc 1380
tcaatcccat acctatccgc cgctgactac gcttacaccg cgagcgatac cgctgagact 1440
acgaacgtgc aggggtgggt gtgcctgttt cagattacgc acggtaaggc cgacggcgac 1500
gcactcgtag tgctcgcaag cgccggtaag gacttcgagc ttagactgcc agtcgacgct 1560
aggacacaga ctacctccgc gggcgaatcc gccgacccag tgaccgctac cgtcgagaac 1620
tacggcggag agacacaggt gcagcgtaga cagcacaccg acgtgtcatt catactcgac 1680
agattcgtta aggtgacacc gaaagaccag attaatgtgc ttgaccttat gcagacaccc 1740
gctcacacac tcgtaggcgc actgttgcga accgctacct attacttcgc tgaccttgag 1800
gtcgccgtta agcacgaggg taacctgaca tgggtgccta acggcgcacc cgaagccgca 1860
ctcgacaaca cgactaatcc taccgcatac cacaaagcgc cactgacacg gcttgcgttg 1920
ccgtataccg ctccacaccg cgtactcgct accgtgtata acggtaactc taagtacggc 1980
gacggtaccg ttgcgaacgt taggggcgac ttgcaggtgc ttgcgcaaaa ggccgcacgc 2040
gcactgccta ctagctttaa ctacggtgcg atcaaagcga cacgcgttac cgagttgctg 2100
tatcggatga aacgcgctga gacatattgc cctagaccgt tgctcgcgat acaccctgac 2160
caggctaggc acaaacagaa aatcgtcgca cccgtgaaac agctgcttaa cttcgacctg 2220
ttgaagctag c 2231
<210> 7
<211> 2231
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的
<400> 7
ggggccggcc aatctagtcc cgctaccggt agtcagaacc agtccggtaa caccggatcg 60
atcattaaca attactacat gcagcaatat cagaactcta tggacacaca gttgggcgac 120
aacgctatct ccggcggatc gaacgagggg tctaccgaca ctacctctac ccatacgact 180
aacacacaga acaacgattg gttttcgaaa ctcgcttcta gcgcttttag cggactgttc 240
ggcgcactgc ttgcggacaa aaagaccgag gagactaccc ttctcgaaga ccgcatactg 300
acaacccgta acggtcacac taccagtacg acacagtcta gcgttggcgt gacatacggg 360
tacgctaccg ccgaagactt cgttagcgga ccgaacacta gcggactcga gacacgcgta 420
gtgcaggccg aacggttctt taagacacac ttgttcgatt gggtgacatc cgactcattc 480
ggtaggtgcc acctactcga gttgccgacc gaccacaagg gcgtgtacgg atcgcttacc 540
gactcatacg catacatgcg taacgggtgg gacgtcgagg tgaccgcagt cggtaaccag 600
tttaacggcg gatgcctgtt ggtcgcgatg gtgccagagt tgcggtctat ccagaaacgc 660
gaactgtacc aactgacact gttcccacac caattcatta acccacgcac taacatgacc 720
gcacacatta ccgtgccatt cgtcggcgtt aaccggtatg accagtacaa agtgcacaaa 780
ccgtggacac tcgtagtgat ggtcgttgcg ccacttaccg taaacaccga gggcgcacca 840
cagattaagg tgtacgctaa cattgcgcct actaacgtgc acgtcgccgg cgaattccct 900
agtaaggagg ggatctttcc cgtcgcatgc tccgacggat acggcggact cgtgactacc 960
gatccgaaaa ccgccgaccc cgtgtacggt aaggtgttta acccaccgcg taaccagttg 1020
cccggtcggt ttacgaacct tctcgacgtc gccgaagcgt gccctacatt cttgcacttc 1080
gagggcgacg tgccatacgt tacgactaag accgactccg atagggtgct tgcgcaattc 1140
gacatgagtc tcgctgcgaa acacatgtct aacacattcc ttgccggact cgcgcaatac 1200
tacacgcaat attccggtac gatcaatctg cactttatgt ttaccggtcc gaccgacgct 1260
aaggctaggt acatgatcgc atatgctccc cccggtatgg aaccccctaa gacccccgaa 1320
gcggccgcac actgcataca cgccgaatgg gacaccggac tgaactctaa gtttacgttt 1380
tcgatcccat acctatccgc ggccgactac gcatacaccg cgagcgacgt cgccgaaacc 1440
actaacgtgc aggggtgggt gtgtctgttc cagattaccc acggtaaggc cgacggcgac 1500
gcactcgtag tgctcgcgag cgccggtaag gacttcgagt tgcggttgcc cgtcgacgct 1560
agggccgaga ctacctccgc cggtgagtcc gccgatcccg ttaccgctac cgtcgagaac 1620
tacggcggtg agacacagat tcagcgtaga cagcacaccg acgtgtcatt cattatggac 1680
agattcgtta aggtgacacc gcaaaaccag attaacatac tcgaccttat gcagattccg 1740
tcacacacac tcgtaggcgc actgttgcgc gcgagcacat actacttttc cgacctcgag 1800
atcgccgtta agcacgaggg cgatctgaca tgggtgccta acggcgcacc cgagaaagcg 1860
cttgacaata cgactaaccc taccgcatac cacaaagcgc cactgactag actcgcgctt 1920
ccgtacaccg caccgcatag ggtgcttgcg accgtgtata acggcgagtg taggtactca 1980
cgtaacgccg ttccgaacgt gagaggcgac cttcaggtgc ttgcgcaaaa ggtcgcgaga 2040
accctgccta cctcattcaa ttacggcgca atcaaagcga cacgcgttac cgaactgttg 2100
taccgtatga aacgcgccga aacctactgc cctagaccgt tgctcgcgat ccaccctatc 2160
gaggctaggc acaaacagaa aatcgtcgca cccgttaagc agcttctgaa ttttgacctg 2220
cttaagctag c 2231
Claims (32)
1.去优化口蹄疫病毒(FMDV)，其包含取代的基因组区域，其中所述取代的基因组区域包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的核酸，且分别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQIDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7编码相同的多肽，或分别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7编码相同且具有最多达10个氨基酸替换、缺失或添加的多肽。
2.权利要求1的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含与SEQ ID NO:1具有至少99％同一性的核酸。
3.权利要求2的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含SEQ ID NO:1。
4.权利要求1的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性的核酸。
5.权利要求4的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含SEQ ID NO:2。
6.权利要求1的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含与SEQ ID NO:3具有至少99％同一性的核酸。
7.权利要求6的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含SEQ ID NO:3。
8.权利要求1的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含与SEQ ID NO:4具有至少99％同一性的核酸。
9.权利要求8的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含SEQ ID NO:4。
10.权利要求1的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含与SEQ ID NO:5具有至少99％同一性的核酸。
11.权利要求10的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含SEQ ID NO:5。
12.权利要求1的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含与SEQ ID NO:6具有至少99％同一性的核酸。
13.权利要求12的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含SEQ ID NO:6。
14.权利要求1的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含与SEQ ID NO:7具有至少99％同一性的核酸。
15.权利要求14的去优化FMDV，其中所述取代的基因组区域包含SEQ ID NO:7。
16.权利要求1-15中任一项的去优化FMDV，其进一步包含DIVA标记。
17.权利要求16的去优化FMDV，其中所述DIVA标记包含3B和3D编码区中的突变。
18.去优化的修饰的口蹄疫病毒(FMDV)，其通过用编码相同蛋白序列或编码具有最多达10个氨基酸替换、缺失或添加的蛋白序列的密码子去优化区域或密码子对去优化区域取代P2结构域或P3结构域而构建，其中修饰序列的密码子对偏倚小于亲本FMDV的密码子对偏倚，并减少0.05、0.1或0.2。
19.权利要求18的去优化的修饰的口蹄疫病毒，其中所述去优化的基因组区域是P2结构域。
20.权利要求18的去优化的修饰的口蹄疫病毒，其中所述去优化的修饰的病毒是A24-P2-3B3D去优化口蹄疫病毒。
21.权利要求18的去优化的修饰的口蹄疫病毒，其中所述去优化的基因组区域是P3结构域。
22.权利要求18的去优化的修饰的口蹄疫病毒，其中所述去优化的修饰的病毒是A24-P3-3B3D去优化口蹄疫病毒。
23.权利要求18的去优化的修饰的口蹄疫病毒，其中所述去优化的基因组区域是P2结构域和P3结构域。
24.权利要求18的去优化的修饰的口蹄疫病毒，其中所述去优化的修饰的病毒是A24-P2/P3-3B3D去优化口蹄疫病毒。
25.引发针对口蹄疫的免疫应答的方法，其包括：
向哺乳动物受试者施用权利要求1-24的去优化的修饰的病毒。
26.权利要求25的方法，其中施用所述去优化的修饰的病毒包括施用102、103、104或105pfu/哺乳动物受试者的去优化的修饰的病毒。
27.权利要求26的方法，其中所述受试者是牛科动物或猪科动物。
28.权利要求25的方法，其中施用所述去优化的修饰的病毒包括：
向所述哺乳动物受试者施用引发剂量的所述去优化的修饰的病毒；和
向所述哺乳动物受试者施用一个或多个加强剂量的所述去优化的修饰的病毒。
29.权利要求28的方法，其中当所述哺乳动物受试者没有患有口蹄疫时施用所述引发剂量。
30.权利要求28的方法，其中当所述哺乳动物受试者没有患有口蹄疫时施用所述一个或多个加强剂量。
31.权利要求28的方法，其中当所述哺乳动物受试者已经暴露于口蹄疫时施用所述一个或多个加强剂量。
32.权利要求25的方法，其中所述免疫应答是保护性免疫应答。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063030431P | 2020-05-27 | 2020-05-27 | |
| US63/030,431 | 2020-05-27 | ||
| PCT/US2021/034282 WO2021242879A1 (en) | 2020-05-27 | 2021-05-26 | Live attenuated strains of foot and mouth disease modified by deoptimization and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116249708A true CN116249708A (zh) | 2023-06-09 |
Family
ID=85463132
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202180061079.7A Pending CN116249708A (zh) | 2020-05-27 | 2021-05-26 | 通过去优化修饰的口蹄疫活减毒毒株及其用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4162030A1 (zh) |
| CN (1) | CN116249708A (zh) |
-
2021
- 2021-05-26 CN CN202180061079.7A patent/CN116249708A/zh active Pending
- 2021-05-26 EP EP21813459.1A patent/EP4162030A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4162030A1 (en) | 2023-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110093324B (zh) | 基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用 | |
| CN107815441B (zh) | 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用 | |
| Diaz-San Segundo et al. | Synonymous deoptimization of foot-and-mouth disease virus causes attenuation in vivo while inducing a strong neutralizing antibody response | |
| EP4322994A1 (en) | Influenza-coronavirus combination vaccines | |
| EP2331682B1 (en) | Infectious bronchitis vaccines derived from ib-qx-like strains | |
| Li et al. | Evaluation of immunogenicity and protective efficacy of a novel Senecavirus A strain-based inactivated vaccine in mice | |
| JP2019505217A (ja) | ブタ繁殖・呼吸障害症候群ワクチンウイルス | |
| CN111961654B (zh) | 耐热表型稳定遗传、携带负标记的重组口蹄疫病毒无毒株及o/a型口蹄疫二价灭活疫苗 | |
| Diaz-San Segundo et al. | Use of synonymous deoptimization to derive modified live attenuated strains of foot and mouth disease virus | |
| US20020131981A1 (en) | Genetically engineered rabies recombinant vaccine for immunization of stray dogs and wildlife | |
| Cottingham et al. | Use of feline herpesvirus as a vaccine vector offers alternative applications for feline health | |
| WO2020215301A1 (zh) | 基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用 | |
| US11793870B2 (en) | Live attenuated strains of foot and mouth disease modified by deoptimization and uses thereof | |
| CN106916832B (zh) | O型口蹄疫病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用 | |
| Clegg | Current progress towards vaccines for arenavirus-caused diseases | |
| CN116249708A (zh) | 通过去优化修饰的口蹄疫活减毒毒株及其用途 | |
| AU2016203333B2 (en) | Infectious bronchitis vaccines derived from IB-QX-like strains | |
| OA21072A (en) | Live attenuated strains of foot and mouth disease modified by deoptimization and uses thereof. | |
| JP2024500225A (ja) | 安定細胞株において効率的な増殖を可能にする、アフリカ豚熱ワクチンにおけるゲノム欠失 | |
| Ko et al. | Improved foot-and-mouth disease vaccine with O PanAsia-2 strain protect pigs against O/Jincheon/SKR/2014 originated from South Korea | |
| Guo et al. | assessment of the protective efficacy of a feline calicivirus inactivated vaccine using in vivo FCV CH-JL2 infection | |
| WO2020115329A1 (en) | A recombinant koi herpesvirus (khv) and a diva vaccine for preventing and/or treating a disease caused by khv | |
| RU2816944C1 (ru) | Вакцина против ящура серотипа О из штамма «O/ARRIAH/Mya-98» культуральная инактивированная эмульсионная | |
| RU2772713C1 (ru) | Вакцина для ранней защиты против ящура из штамма А 2205/G IV культуральная инактивированная эмульсионная | |
| RU2808703C1 (ru) | Вакцина субъединичная маркированная против классической чумы свиней, способ ее получения и применения |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40095892 Country of ref document: HK |