KR101913790B1 - 모기에서 복제 불가능한 약독화된 재조합 알파바이러스 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 모기 세포에서 복제 불가능하고 모기 벡터에 의한 전염이 불가능한 약독화된 재조합 알파바이러스를 개시한다. 이들 약독화된 알파바이러스는 서부 말 뇌염 바이러스 (Western Equine Encephalitis Virus), 동부 말 뇌염 바이러스 (Eastern Equine Encephalitis Virus), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 (Venezuelan Equine Encephalitis virus), 치쿠구니야 바이러스 (Chikungunya virus)를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한, 이러한 알파바이러스와 이들의 면역원성 조성물로의 그들의 용도를 개시한다.

Description

모기에서 복제 불가능한 약독화된 재조합 알파바이러스 및 그의 용도 {Attenuated Recombinant Alphaviruses Incapable of Replicating in Mosquitoes and Uses Thereof}
본 발명은 알파바이러스의 분자 생물학, 바이러스학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 모기 감염 불능성을 갖는 약독화된 재조합 알파바이러스를 제공하며, 이러한 알파바이러스를 생성시키는 방법 및 면역원성 (immunogenic) 조성물에서의 이들 약독화된 알파바이러스의 용도를 밝힌다.
토가바이러스과 (Togaviridae family)에서 알파바이러스 유전자는 다수의 중요한 사람 및 동물 병원균 (pathogens)을 포함한다. 이들 바이러스는 남극 지역을 제외하고 모든 대륙에 널리 분포되어 있고, 중요한 공중 건강 위협체를 대표한다 (18, 39). 자연 상태 하에서, 대부분의 알파바이러스는 모기에 의해 전달되고, 여기서 이들은 벡터의 생물학적 기능에 거의 효과를 미치지 않는 지속적인 장 수명 감염의 원인이 된다. 그들의 혈액 섭취 동안 모기에 의해 감염된 척추동물에서, 알파 바이러스는 새로운 모기 감염의 전제조건인 고-역가 (high-titer) 바이러스 감염 및 이의 자연에서의 순환으로 특징지어지는 급성 감염을 일으킨다.
베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV))는 알파바이러스 유전자의 가장 강력한 병원성 멤버의 하나이다. 이것은 남부, 중부 및 북부 아메리카에서 계속적으로 순환하며, 사람, 말 및 기타 가축과 관련된 산발성 유행 (sporadic epidemics)과 가축 유행병 (epizootics)을 일으킨다. 아류형 (subtype) IC VEEV와 관련한 베네수엘라 및 콜롬비아 (1995)에서 가장 최근의 주된 발병 동안, 약 100,000명의 사람에게서 발병되었고, 300명 이상에서 치명적인 뇌염 케이스가 조사되었다 (37). VEEV 가축 유행병 동안, 뇌염에 기인한 말의 죽음은 83%에 이를 수 있으며, 전체 치사율이 사람에서 낮은 반면 (<1%), 정신혼란 (disorientation), 운동실조증 (ataxia), 우울증 (mental depression)을 포함하는 정신적 질환이 감염된 개체의 최대 14%까지, 특히 아이들에서 검출될 수 있다 (21). VEEV에 의한 사람 질환은 한기 (chills), 심한 두통, 근육통 (myalgia), 졸림 (somnolence), 및 인두염 (pharyngitis)을 갖는 열병으로 특징지어진다. 어린 및 늙은 개체들은 심각한 림프 고갈 (lymphoid depletion), 그에 이어지는 뇌염 (encephalitis)을 갖는 망내피계 (reticuloendothelial) 감염으로 발전한다. CNS 감염의 결과는 뉴런 세포를 죽음에 이르게 하는 급성 수막뇌염 (0meningoencephalitis)이다 (9). 신경적인 신호는 병의 개시 4 내지 10일 내에 나타나고, 발작 (seizures), 경도 마비 (paresis), 행동 변화 및 혼수상태 (coma)를 포함한다.
VEEV 유행병의 연속적인 위협에도 불구하고, 이 바이러스에 대한 안전하고 효과적인 백신이 디자인되지 않고 있다. VEEV의 약독화된 TC-83 균주는 기니아 픽 (guinea pig) 심장 세포에서 VEEV의 고도로 맹독인 트린대드 동키 (Trinidad donkey, TRD) 균주의 일련의 계대 (passage)에 의해 40년 이상 전에 개발되었다 (4). 마침내 TC-83만이 여전히 실험실 근무자 및 군인들을 위해 시판될 수 있는 백신이다. 8,000명 이상의 사람들에 백신 접종되었으며 (2,4,34), 누적 데이터는 전체 백신의 거의 40%가 열, 계통적 병 및 기타 역효과를 포함하는 천연 VEEV의 전형적 일부 증상을 갖는 질환으로 발전하는 것을 분명하게 보여준다 (2). 이 TC-83 균주는 보편적으로 대뇌 (i.c) 접종 및 피하 (s.c) 접종 후 성체 마우스들은 아니지만 새로 태어난 마우스들을 죽이고 (31), 따라서 바이러스성 발병에서 돌연변이의 추가적 약독화 및 효과의 연구를 위한 우수한 출발 물질이다.
VEEV 게놈은 세포성 mRNA의 구조와 유사하고, 포지티브한 극성의 단일-나선 RNA 분자로서, 거의 12-kb-길이이다. 상기 게놈 RNA는 5' 메틸구아닐레이트 캡 및 3' 폴리아데닐레이트 테일 모두를 포함하고(24), 뉴클레오캡시드로부터 게놈 RNA의 방출 후 즉시 숙주 세포 조직에 의해 바이러스성 단백질의 번역을 허용하는 특징을 포함한다. 게놈의 5'-2/3는 바이러스성 게놈의 복제 및 서브게놈 RNA의 전사를 위해 요구된 복제성 효소 복합체의 바이러스성 구성요소를 포함하는 비구조적 단백질 (nsPs)로 번역된다. 서브게놈 RNA는 게놈의 3'세번째에 대응한다. 이것은 서브게놈 프로모터로부터 합성되고 바이러스성 구조 단백질로 번역된다. VEEV 균주 TC-83의 약독화된 표현형 (phenotype)은 균주 TRD 게놈에서 두 개의 돌연변이의 결과이며, 이들 중 하나는 E2 당단백질의 위치 120에서 아미노산을 교체하였고, 두 번째는 5'UTR에서 nt 3을 변화시킨다 (11, 23, 24, 43). 따라서, 알파바이러스의 매우 높은 돌연변이율 때문에, TC-83에서 병원성 표현형으로 전환 (reversion)은 적절한 선택적 조건, 예를 들면, 생체 내 바이러스 계대가 일어나는 경우에서 큰 문제가 된다. 게다가, VEEV TC-83은 모기 세포에서 복제 및 모기 감염이어서 백신화가 가능하고 (32), 따라서 모기에 의한 전달이 여전히 가능하다.
이상적으로, 보유 숙주 중에서의 순환은 유독성을 증가시키는 경우를 포함하는 예측할 수 없는 변화로 이르게 할 수 있기 때문에 살아있는 아르보바이러스 (arbovirus) 백신 균주는 절지동물 벡터에 의해 전달되지 않아야 한다. 특히 전환이 일어날 수 있는 소수의 약독화된 돌연변이에 의존하는 야생형 바이러스로부터 생성된 약독화된 균주 또는 이들이 벡터-산출 순환 (vector-borne circulation)을 진행하였다면 예상치 못한 방식으로 진화할 수도 있는 유전적으로 변형된 균주에 대해서는 더욱 그러하다. 이전의 위험 (former risk)은 1971년 루이지애나, 텍사스로 제한된 동물유행병/유행병 밖의 지역에서 수집된 모기 중에 VEEV TC-83 백신 균주의 검출에 의해 강조되었다 (32).
알파바이러스에 대한 감염성 cDNA의 개발은 바이러스성 게놈을 광범위하게 변형하는 것에 의해 이들의 약화를 분석할 수 있는 기회, 야생형 (wt) 병원성 표현형으로 전환을 최소화하거나 제외할 수 있는 접근법을 열었다. 게다가, 이러한 알파바이러스의 게놈은, 곤충이 아닌 척추동물 기원의 세포에서만 기능하는 RNA 요소를 포함하도록 조작될 수 있다. 따라서, 이러한 광범위한 돌연변이는 모기 벡터에 의한 유전적으로 변형된 바이러스의 전염을 예방할 수 있다.
사람 및 동물 병원성으로서 중요성, 생물학적 무기로서 잠재성 및 약독화된 알파바이러스의 적용에 따른 문제에도 불구하고, 종래 기술은 척추동물 세포에서만 복제할 수 있는 알파바이러스의 약독화된 균주를 생성시키는 방법에는 부족하다. 본 발명은 종래 기술에서 오랜 기간 동안 요구하고 열망한 것을 충족시킨다.
본 발명의 일 실시예에서는 약독화된 재조합 알파바이러스를 생성시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 서브게놈 RNA의 천연 5' UTR 대신 비구조적 단백질 4(nsP4) 코딩 서열의 말단과 알파바이러스의 서브게놈 RNA 코딩 서열의 개시 AUG 사이에 엔세팔로미엘로카디티스 (encephalomyelocarditis) 바이러스 (EMCV IRES)의 내부 리보좀 엔트리 사이트를 클로닝하는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 관련 실시예에서, 상기 논의된 방법에 의해 생성된 약독화된 재조합 알파바이러스가 제공된다.
본 발명의 또 다른 관련 실시예에서, 약독화된 재조합 알파바이러스를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 및 이 벡터를 포함하고 발현하는 숙주 세포가 제공된다. 본 발명의 또 다른 관련 실시예에서, 약학적 조성물이 제공된다. 본 조성물은 상기 논의된 약독화된 재조합 알파바이러스와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 발명의 관련된 실시예에서, 면역 조성물이 제공된다. 본 면역 조성물은 상기 설명된 약독화된 재조합 알파바이러스를 포함한다.
본 발명의 또 다른 관련 실시예에서, 알파바이러스에의 노출에 따른 감염으로부터 대상물을 보호하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 여기 설명된 약독화된 재조합 알파바이러스를 포함하는 면역원성 조성물의 면역적인 유효량을 투여하여 알파바이러스에의 노출에 따른 감염으로부터 개체를 보호하는 단계를 포함한다.
본 발명은 알파바이러스의 약독화된 균주를 개발하기 위한 새로운 전략에 관한 것이다. 이들 약독화된 알파바이러스는 척추동물 세포에서만 복제할 수 있다. 이 표현형은 바이러스성 구조 단백질의 번역 및 궁극적으로 엔세팔로미엘로카디티스 바이러스 (encephalomyelocarditis virus (EMCV IRES))의 내부 리보좀 엔트리 사이트에 의존하는 바이러스성 복제를 제공하는 것으로 얻어진다. 이러한 재조합 바이러스는 생명력이 있으며, 새로이 태어난 마우스들에서 고도로 약독화된 표현형, VEEV 감염에 대한 유도된 보호 면역성을 보여준다. 또한, 포르말린-비활성화된 백신은 비싸며 비효과적이다. 또한, 이들 백신은 또한 다수의 반복적인 백신 접종을 요구한다. 게다가, VEEV 감염에 대한 유일하게 유용한 살아있는 약독화된 백신은 반응성이 크고 (reactogenic) 백신 접종된 말에서 혈액 섭취 동안 모기를 감염시킨다. 여기서 논의된 상기 약독화된 알파바이러스는 약독화된 표현형이 비가역적이기 때문에 현재 유용한 백신보다 현저한 이점을 제공한다. 게다가, 유전공학적 알파바이러스는 모기 세포에서 복제할 수 없으며, 모기에서 복제를 할 수 없음에 따라서 자연계에서 순환될 수 없는 새로운 살아있는 재조합 바이러스를 생성시키기 위한 새로운 접근을 제안한다.
신드비스 (Sindbis) 및 기타 알파바이러스 (12, 25, 36)의 감염 cDNA 클론의 개발은 바이러스 생물학 및 발병학의 다른 측면에서 연구 목표인 가역 유전 실험(reverse genetics experiments)에 대한 것뿐만 아니라 새로운 재조합 백신의 개발에 대한 기회를 열어 놓았다. 조직 배양 또는 치킨 배아 (29)를 통과시키는 것에 의한 바이러스의 약독화 (attenuation)는 일반적으로 바이러스성 게놈의 구조적 및 비구조적 유전자에서 및 시스-작용 유전인자 (cis-acting elements)에서 소수의 점 돌연변이의 축적으로부터 얻어진다. 예를 들면, VEEV TC-83 백신 균주는 그의 약독화를 위하여 오로지 2점 돌연변이에만 의존하고, 높은 정도의 반응성 (reactogenicity) (34)은 아마도 이 약독화 메카니즘의 불안정성을 반영한다. 이것은 백신 접종된 개체에서 바이러스 복제 동안 야생형 (wt) 병원성 표현형에 대한 가능한 전환에 대한 문제를 제기한다. 돌연변이의 수는 화학적 돌연변이 생성 (28)에 의해 추가적으로 증가될 수 있지만, 이 과정은 또한 도입된 변화를 비가역적으로 만들지 않는다. RNA+바이러스의 감염 cDNA 클론으로 유전 조작은 바이러스성 게놈의 보다 강력한 변형에 대한 큰 가능성을 열어놓으며, 야생형 (wt) 게놈 서열 (5,6,10,19)로 전환하는 것을 불가능하게 만드는 광범위한 결실 또는 변이체의 면역성 (immunogenicity)을 강화하는 추가적 유전 물질을 도입하는 기회를 제공한다.
유전적으로 변경된 아르보바이러스는 모기 벡터에 의해 매개된 자연적 순환으로 도입되고, 모기에서 오래 기간 복제 동안 또는 척추동물 숙주에서 바이러스 혈증의 (viremia) 발전 동안 추가적 진화를 보여준다는 큰 문제가 또한 있다. 한 예는 VEEV TC-83의 사용이며, 이것은 모기를 감염시키기에 충분한 말에서의 비레미아의 레벨을 생성할 수 있다. 1971년 텍사스 유행병 동안 루이지에나 (32)에서 수집된 자연적으로 감염된 모기로부터 TC-83의 분리는 약독화된 알파바이러스 전염의 위험을 강조하였다. 따라서, 살아있는 백신 균주의 새로운 생성을 디자인하는데, 척추동물의 세포에서만 복제할 수 있을 뿐만 아니라 고도로 약독화된 아르보바이러스를 만드는 것은 신중하다. 이것은 세포-특이 RNA 요소를 바이러스성 게놈으로 클로닝하는 것으로 성취될 수 있다. 크리켓 파라리시스 바이러스 (cricket paralysis virus) IRES (20)과 대비적으로, EMCV-특이 요소는 절지동물 세포에서 매우 불충분하게 기능할 것으로 기대되었다.
본 발명에서, EMCV IRES은 바이러스성 구조 유전자 IRES-종속의 번역을 위해 VEEV TC-83 게놈으로 클로닝되었다. 게놈 중 하나는 기능적 서브게놈 프로모터를 포함하고 서브게놈 RNA의 5'UTR에서 IRES를 포함하였다. 이 바이러스는 살아있지만, 서브게놈 RNA를 생성하는 이것의 능력은 추가적인 진화를 촉진하며, 이것은 구조적 단백질의 표준, 캡-종속 번역에 IRES 결실 및 전환을 초래하였다. 상기 후반의 결실은 이것이 모기 세포에서 복제를 가능하게 한다. 서브게놈 프로모터에서 다중 돌연변이로의 두 번째 변이체는 캡-종속 번역으로 전환하는 것에 대한 그의 불가능성이라는 측면에서 안정하다. 이러한 전환은 13 돌연변이에 의해 비활성화된 서브게놈 프로모터의 복구뿐만 아니라 IRES 결실을 요구하기 때문에, 이들 다중 돌연변이의 직접 복귀는 아마도 무시할 만한 위험성을 나타낸다. 그러나, 본 변이체는 nsP2 유전자에서 추가적인, 적응 돌연변이를 축적하는 것으로 보다 효과적으로 복제하는 표현형으로 진화하는 흥미로운 방식으로 발전하였다. 이들 돌연변이는 바이러스성 RNA 복제의 수준, 바이러스성 구조 단백질의 합성, 또는 세포에서 이들의 구획화 (compartmentalization)를 눈에 띄게 변화시키지 않는다. 검출된 돌연변이는 또한 게놈 패키징의 효능을 증가시킬 수 있는 추가적인 신호를 창출하지 않는다. 따라서, 이들 기능성의 메카니즘은 결정되도록 남는다. 그러나 공개된 데이터를 축적하는 것은 RNA+바이러스의 게놈 패키징이 복제 복합체에 의해 주로 결정되고, 게놈은 입자 형성 (22, 30)을 위한 구조적 단백질에 기능적 nsPs로 존재될 필요가 있다는 것이 추측되었다. 본 발명에서 작업 가설 (working hypothesis)은 nsP2의 헬리카제 도메인 (helicase domain)이 뉴클레오캡시드 (nucleocapsids)로 이것의 패키징을 위한 바이러스성 게놈의 프리젠테이션과 관련될 수 있고, 따라서 동정된 돌연변이는 이 과정의 효율성에 긍정적인 효과를 가질 수 있게 한다는 것이다.
본 발명의 목적은 절지동물 벡터에서 복제불가능하고, 안정하고, 보다 약독화된 표현형을 보여주는 VEEV 변이체를 개발하는 것임을 명확히 해야 한다. IFN-알파/베타-충분 및 IFN 시그널링-결핍 BHK-21 세포 모두에서 디자인된 VEEV/mutSG/IRES/1 변이체의 느린 성장, 조직 배양에서 IFN-알파/베타의 높은 레벨을 유도하는 그의 능력, 대뇌 (i.c) 접종 후에도 새로이 태어난 마우스들을 죽이는 그의 크게 감소된 능력, 및 모기 세포에서 그의 복제 불가능성은 이들 변이체가 이러한 요구조건에 부합한다는 것을 제안한다. 그의 면역성은 다른 동물 모델에서 더 조사될 것이다. 게다가 다른 뇌염유전성 (encephalogenic) 알파바이러스는 유사한 EMCV IRES-기초된 전략을 이용하여 약독화될 수 있고, 이것은 최근에 개발된 다른 접근들 (1, 13-15, 31)과 조합되어 적용될 수 있다.
요약하면, 본 발명의 목적은 약독화된 알파바이러스의 개발과, VEEV, EEEV 및 WEEV을 포함하는 뇌염유전성 알파바이러스 및 사람 및 가축에게서 질병을 일으키는 치쿤구니야 (Chikungunya) 바이러스와 같은 기타 알파바이러스에 대한 새로운 타입의 백신으로서 이들의 적용에 관한 것이다. 이러한 알파바이러스의 복제는 EMCV IRES에 의존되며, 이것은 모기 세포 또는 모기 벡터에서 이들의 복제를 불가능하게 한다. 보다 중요하게, 이 표현형은 광범위한 변형이 바이러스성 게놈으로 도입되기 때문에 비가역적이다. 따라서, 이들 새로운 변이체는 자연 모기 벡터에 의한 이들의 전염 가능성에 대한 문제없이 백신접종을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 약독화된 재조합 알파바이러스를 생성시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 천연 5' UTR 대신 비구조적 단백질 (nsP4) 코딩 서열 말단과 알파바이러스의 서브게놈 RNA 코딩 서열의 개시 AUG 사이의 엔세팔로미엘로카디티스 바이러스 (EMCV IRES)의 내부 리보좀 엔트리 사이트를 클로닝하는 단계를 포함한다. 본 방법은 서브게놈 RNA에서 클러스터된 점 돌연변이 및 천연 5' UTR의 결실에 의해 알파바이러스의 서브게놈 프로모터를 비활성화하는 단계를 더 포함한다. 또한, 서브게놈 프로모터의 비활성화는 비구조적 단백질 4의 카르복시 터미널을 변형시키지 않을 것이다. 추가적으로 상기 방법은 바이러스 복제, 방출 및 바이러스 역가를 증가시키는데 효과적인 비구조적 단백질 2(nsP2)에서 적응 돌연변이를 도입하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 비구조적 단백질 2에서 적응 돌연변이의 한 예는 Y370→C, K371→Q, P349→T, D418→A, K423-T 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 또한, 알파바이러스의 한 예는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 서부 말 뇌염 바이러스 또는 치쿤구니야 바이러스 (WEEV)을 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 논의된 방법으로 생성된 약독화된 재조합 알파바이러스에 관한 것이다. 이러한 알파바이러스는 모기에서 복제가 불가능하고, 모기 벡터에 의한 전염이 불가능하고, IFN 알파/베타의 고 레벨 유도, IFN 알파/베타 세포에서 느린 성장, IFN 시그널링-결핍 BHK-21 세포에서의 느린 성장 또는 이들의 조합이 가능할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 논의된 약독화된 재조합 알파바이러스를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하고 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 벡터를 구축하고 이들을 세포에서 발현하는 것은 잘 알려져 있으며, 이 분야의 표준 기술이다. 따라서, 이 분야의 당업자들은 이 분야에서 입수할 수 있는 통상적인 실험과 지식에 기초하여 이러한 벡터를 구축할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 논의된 약독화된 재조합 알파바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 여기의 약독화된 재조합 알파바이러스를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 논의된 면역원성 조성물의 면역적으로 유효량을 투여하여 알파바이러스에 노출에 따른 감염으로부터 대상물을 보호하는 단계를 포함하는, 알파바이러스에의 노출에 따른 감염으로부터 대상물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 상기한 방법으로 수혜를 받는 대상물은 사람 또는 가축일 수 있다.
본 발명은 또한 엔세팔로미엘로카디티스 바이러스의 내부 리보좀 엔트리 사이트와 외피 당단백 유전자의 캡시드 유전자 다운스트림을 상기 캡시드 유전자로 3'UTR의 서브게놈 영역 직전 업스트림의 3' 말단에서 클로닝하는 단계를 포함하고, 여기서, IRES-종속 방식으로 번역된 캡시드 단백질 유전자를 제외하고는 상기 캡시드는 캡-독립 방식으로 발현되고, 상기 외피 단백질 유전자는 캡-종속 방식으로 번역되는 것인 모기 감염이 불가능한 약독화된 재조합 알파바이러스의 생성 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 부정관사 ("a") 또는 ("an")은 하나 이상을 의미한다. 청구항에서 사용되는 바와 같이, "포함하는 (comprising)"이라는 단어와 조합되어 사용되는 경우, 부정관사 ("a") 또는 ("an") 는 하나 또는 하나보다 큰 것을 의미한다. 본 명세서 사용되는 "또 다른 (another)" 또는 "기타 (other)"은 동일 또는 다른 청구항의 부재 (element) 또는 그의 구성들 (components)의 적어도 둘 또는 그 이상을 의미한다.
본 발명에서 설명된 조성물은 이 분야의 임의의 표준 방법, 예를 들면, 피하 내, 정맥 내, 비경구적으로, 복막 내, 피부 내, 근육 내, 국부적, 또는 비강에 의해 계통적으로 또는 국소적으로 독립적으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 설명된 조성물의 투여 제형물은 투여 방법에 적합하고, 이 분야의 당업자 개개인에게 잘 알려진 통상적으로 비-독성이며, 생리학적으로 또는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 비히클을 포함할 수 있다.
본 발명에서 설명된 조성물은 치료적 효과를 성취하거나, 유지하거나 또는 개선하기 위하여 한번 이상 독립적으로 투여될 수 있다. 투여량을 결정하는 것이나 조성물의 적합한 투여가 단일 투여량 또는 다중 투여량인지는 이 분야의 기술자에게 잘 알려진 것이다. 적합한 투여량은 대상물의 건강, 알파바이러스에 의한 면역 반응 및/또는 예방의 유도, 투여 방식 및 사용된 제형에 의존한다.
본 발명에 의하면, 모기 세포에서 복제가 불가능하고, 모기 벡터에 의한 전염이 불가능한 약독화된 재조합 알파바이러스를 제공하며, 이를 이용하여 서부 말 뇌염 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 치쿠구니야 바이러스 등의 예방을 위한 면역원성 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 내지 1d는 BHK-21 세포에서 EMCV IRES-암호화하고, VEET TC-83-유래된 재조합 바이러스의 복제를 보여준다. 도 1a는 디자인된 바이러스성 게놈, 감염 센터 분석에서의 인 비트로-합성된 RNA의 감염성, 인 비트로-합성된 RNA 1mg을 BHK-21 세포로의 24시간 후반 트랜스펙션에서의 바이러스 역가, 및 48시간 후반 트랜스펙션에서 BHK-21 세포에서 나타난 바이러스들에 의해 형성된 플라그의 크기를 개략적으로 나타낸 것이다. 화살표는 기능성 서브게놈 프로모터를 지시한다. 채워진 상자는 EMCV IRES를 나타낸다. 도 1b는 VEEV TC-83 게놈의 서브게놈 프로모터-함유 단편 및 VEEV/mutSG/IRES의 대응 단편의 정렬을 보여준다. 프로모터의 위치는 빈 상자로 나타내었다. VEEV TC-83 게놈에서 서브게놈 RNA의 출발과 EMCV IRES의 시작은 화살표로 나타내어진다. VEEV/mutSG/IRES 게놈으로 도입된 돌연변이는 소문자로 보여진다. 도 1c는 24시간 후반 트랜스펙션에서 수확된, 바이러스에 의한 BHK-21 세포에서 형성된 플라그를 보여준다. 도 1d는 인 비트로-합성된 RNA의 1mg을 BHK-21 세포로 트랜스펙션한 후의 바이러스의 복제를 보여준다.
도 2a 내지 2c는 플라그-정제된 VEEV/mutSG/IRES 변이체에서 발견된 돌연변이를 보여주며, 이것은 BHK-21 세포에서 보다 효과적인 복제 및 VEEV TC-83 및 VEEV/mutSG/IRES 복제에서 정의된 적응 (adaptive) 돌연변이의 효과를 보여준다. 도 2a는 VEEV TC-83의 공개된 서열과 비교된 플라그 분리체의 게놈에서 발견된 돌연변이의 리스트를 보여준다 (24). 도 2b는 하나 또는 둘 모두의 동정된 돌연변이 및 감염 센터 분석에서 인 비트로-합성된 바이러스성 RNA의 감염성을 갖는 VEEV TC-83 및 VEEV/mutSG/IRES 게놈의 개략적인 도면이다. 기능적 서브게놈 프로모터는 화살표로 나타내며, EMCV IRES는 채워진 상자로 나타낸다. 도 2c는 인 비트로-합성된 바이러스성 게놈의 1mg의 트랜스펙션 후 BHK-21 세포에서 디자인된 바이러스의 복제를 보여준다.
도 3a 내지 3b는 큰-플라그 표현형을 보여주는 VEEV/mutSG/IRES 변이체의 nsP2 단백질에서 동정된 돌연변이를 보여준다. 도 3a는 인 비트로-합성된 RNA (Orig.)의 24시간 후반 트랜스펙션에서 수확된 바이러스 스톡으로부터 플라그-정제된 분리체의 게놈에서, 그리고 베로 세포 (Vero cells; Pass.)에서 세 번 추가적으로 계대된 (passage)된 스톡으로부터의 분리체의 게놈에서, 동정된 돌연변이의 리스트를 보여준다. 도 3b는 VEEV nsP2에서 정의된 돌연변이의 위치를 보여준다. 알파바이러스 nsP2 (38, 39)에서 현재 알려진 기능성 도메인의 위치가 나타나 있다.
도 4a 내지 4b는 인 비트로-합성된 재조합 바이러스성 RNA로 트랜스펙션된 BHK-21 세포에서 단백질 및 RNA 합성의 분석을 보여준다. 세포들은 나타난 RNA의 4mg으로 전기 천공되었고 (electroporated), 35-mm 접시에 놓여졌다. 도 4a에서, 4.5시간 후반 트랜스펙션에서, 웰 (well) 내의 배지를 10% FBS, ActD (1 mg/ml) 및 [3H]우리딘 (20 mCi/ml)이 첨가된 aMEM 1ml로 교체하였다. 37℃에서 4시간 배양 후, RNA를 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고 분석하였다. 바이러스성 게놈 및 서브게놈 RNA의 위치는 각각 G 및 SG로 나타내었다. VEEV/IRES-특이 서브게놈 RNA은 다른 서브게놈 RNA-생성 바이러스가 하는 것보다 더 확산된 밴드를 형성하며, 이것은 겔 중에서 이것이 리보좀 28S RNA로 함께 이동했기 때문이다. 도 4b에서, 12시간 후반 트랜스펙션에서, 단백질은 [35S]메티오닌으로 대사적으로 라벨화되고, 소듐 도데실 설페이트-10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석되었다. 분자량 마커(kDa)의 위치는 겔의 왼쪽 면에 나타난다. 바이러스성 구조 단백질의 위치: C, E1 및 p62 (E2의 전구체)는 겔의 오른쪽 면에서 보여진다. 별표는 IRES-암호화 바이러스의 복제에 의해 유도된 세포 단백질 (열-쇼크 단백질)의 위치를 나타낸다.
도 5a 내지 5c는 C7IO세포에서, 재조합 EMCV IRES-함유 VEEV 변이체의 passaging을 보여준다. 도 5a는 바이러스성 게놈의 개략적인 도면이다. 화살표는 기능적 서브게놈 프로모터의 위치를 보여준다. 채워진 상자는 EMCV IRES의 위치를 나타낸다. 도 5b는 C710세포에서 passaging 한 후 재조합 바이러스의 역가를 보여준다. 35-mm 접시에서 세포들은 인 비트로-합성된 RNA(P1)으로 BHK-21 세포의 24시간 후반 트랜스펙션에서 또는 C710세포의 48시간 후반 감염에서 수확된 바이러스 샘플 40ml로 감염시켰다. 파선은 검출의 한계를 나타낸다. 도 5c는 C710세포에서 효과적인 복제를 보여주는 플라그-정제된 VEEV/IRES 변이체에서 동정된 IRES-함유 서열의 결실을 보여준다. 나머지 EMCV IRES-특이 서열은 소문자로 나타낸다.
도 6은 NIH 3T3 세포에서 VEEV/mutSG/IRES/1 및 VEEV TC-83의 복제를 보여준다. 세포들은 10 PFU/세포의 MOI에서 감염시켰다. 배지를 지시된 시점에서 교체하고, 바이러스 역가를 BHK-21 세포에서 플라그 분석에 의해 측정하였다. 동일한 샘플들을 생물학적 분석에서 IFN-a/b 방출을 측정하기 위해 사용하였다. 방출된 IFN-a/b의 농도는 ml당 국제 단위 (IU)로 나타내어진다.
도 7은 VEEV TC-83 및 VEEV/mutSG/IRES/1 바이러스로 감염된 마우스들의 생존을 보여준다. 6일령 NIH 스위스 마우스들을 지시된 바이러스의 대략 106 PEU로 대뇌 (i.c) 접종시켰다. 동물을 2개월 동안 모니터링하였다. 이들 실험 어디에서도 후반-감염 9일 후에 발생된 죽음은 없었다.
도 8은 성체 마우스들의 백신접종 (vaccination) 및 챌린지 (challenge)에 따른 생존을 보여준다. 5 내지 6주령 암컷 NIH 스위스 마우스들을 VEEV 균주 TC-83 또는 재조합 바이러스를 가지고 약 106 PFU의 투여량으로 피하 (s.c) 면역시켰다. 면역 후 3주, 마우스들을 VEEV 균주 3908의 대략 104 PFU로 피하 (s.c) 챌린지시키고, 죽음을 기록하였다.
도 9는 모기 감염이 불가능한 약독화된 재조합 알파바이러스를 생성시키는 개략적인 방법을 나타낸다.
다음의 실시예는 본 발명의 다양한 구현예를 설명하기 위한 목적을 위해 제공되며 본 발명이 이 방식으로 제한된다는 것을 의미하는 것은 아니다. 이 분야의 당업자들은 본 발명이 상기 목적을 수행하고, 언급된 결과와 이점, 뿐만 아니라 이들 목적을 얻기 위해 적합하다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 이 안에서의 변화 및 청구항의 범위로 규정된 본 발명의 요지 내에서 포함되는 다른 사용이 이 분야의 당업자들에게 생길 것이다.
실시예 1: 세포 배양
BHK-21 세포는 폴 올리보 (Paul Olivo (Washington University, St. Louis, Mo))로부터 제공받았고, 베로 (Vero) 세포는 찰스 라이스 (Charles Rice (Rockefeller University, NY, NY))로부터 제공받았다. NH 3T3 세포는 아메리칸 타입 티슈 컬쳐 콜렉션 (Manassas, VA)으로부터 받았다. 이들 세포주를 10% 우태아 혈청 (FBS) 및 비타민이 첨가된 알파 최소 필수 영양배지 (aMEM)에서 37℃로 유지시켰다. 모기 C710세포를 헤리 헝 (Henry Huang (Washington Univ., St. Louis, MO))으로부터 입수하고, 10% 열-비활성화된 FBS 및 10% 트립토스 포스페이트 브로쓰 (tryptose phosphate broth, TPB)가 첨가된 DMEM에서 증식시켰다.
실시예 2: 플라스미드 구축
표준 재조합 DNA 기술을 모든 플라스미드 구축을 위해 사용하였다. 맵과 서열은 요청을 하여 저자로부터 입수하였다. SP6 RNA 폴리머라제 프로모터의 제어하에 있는, VEEV TC-83 게놈을 갖는 오리지널 플라스미드 (pVEEV TC-83)는 여러 곳에 개시되어 있다(33). pVEEV/IRES는 EMCV 폴리프로테인의 처음 4개의 코돈을 갖는 EMCV IRES를 포함하였다. 이 서열을 5'UTR의 말단과 개시 AUG 사이의 VEEV 서브게놈 RNA-코딩 서열에 클로닝시켰다. pVEEV/mutSG/IRES는 VEEV TC-83 게놈을 암호화하였다. 그 게놈 안에서 서브게놈 프로모터는 클러스터된 점 돌연변이에 의해 비활성되지만, 이것은 nsP4의 카르복시 터미널의 아미노산 서열을 변형시키지 않았다(도 1A 및 1B). 이 바이러스성 게놈은 서브게놈 RNA의 5'UTR이 결실되었다. 따라서, VEEV TC-83 비구조적 및 구조적 단백질은 동일한 게놈 RNA로부터 합성될 것으로 예상하였다. 선택된 변이체의 관심 있는 단편을 PCR 증폭시키고, 오리지널 게놈에서 상응하는 단편을 교체함으로써, pVEEV/mutSG/IRES-암호화된 nsP2에서 적응 돌연변이를 유도시켰다. 동일한 PCR-기초된 기술을 VEEV/mutSG/IRES 게놈의 3'UTR에서 Sphl 사이트로 다른 단편을 복제하는 합성을 위해 사용하였다. 클로닝된 모든 단편을 구제된 바이러스로 추가 실험하기 전에 서열화하였다.
실시예 3: RNA 전사
CsCI 경도로 플라스미드를 원심분리하여 정제하고, 이를 MIuI 절단으로(digestion) 선형화하였다. 캡 유사체 (Biolabls, 뉴 잉글랜드)의 존재 하에서 RNA를 SP6 RNA 폴리머라제 (Ambion)로 합성시켰다. 전사의 수율과 완성도를 비-변성 조건하에서 겔 전기영동으로 분석하였다. RNA 농도를 플루오르켐 영상기 (FluorChem imager (Alpha Innotech))에서 측정하고, 전사 반응을 추가적인 정제 없이 전기 천공 (electroporation)을 위해 사용하였다.
실시예 4: RNA 트랜스펙션
BHK-21 세포의 전기천공은 이전에 설명되어진 조건하에서 수행하였다 (27). 바이러스를 구제하기 위하여, 1mg의 인 비트로-합성된 바이러스성 게놈 RNA를 세포 (27)로 전기 천공하고, 이어서 이들을 100-mm 접시에 놓고 세포병리학상의 효과가 관찰될 때까지 배양하였다. 바이러스 역가는 BHK-21 세포에서 표준 플라그 분석을 사용하여 측정하였다 (26).
RNA 감염성을 평가하기 위해, 전기 천공된 BHK-21 세포의 10배 희석물을 서브컨플루언트 (subconfluent), 나이브 세포 (naive cells)를 포함하는 6-웰 코스타(Costar) 플레이트에 놓았다. 5% CO2 인큐베이터 안에서 37℃로 1시간 배양한 후, 세포를 3% FBS가 첨가된 0.5% 초-순수 (Ultra-Pure) 아가로스를 함유하는 MEM 2㎖로 덮어씌웠다. 플라그를 37℃에서 2일간 배양한 후에 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 감염성을 트랜스펙션된 RNA의 mg 당 플라그-형성 유닛 (PFU)으로 결정하였다.
실시예 5: 바이러스성 게놈의 서열화
큰 플라그를 바이러스성 스톡의 역가화 (titering) 동안 무작위로 선택하였다 (neutral red 로의 염색 없이). 바이러스를 아가로스 플러그 (plugs)로부터 MEM으로 추출하고, 후자 배지의 일정량을 35-mm 접시 안에 있는 BHK-21 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. 프로파운드 (profound) CPE의 개발 후에, 바이러스 스톡은 추가적인 특성화를 위해 수확하였고, RNA를 제조업자 (Invitrogen)의 지시에 따라서, 트리졸 (TRizol) 시약에 의해 감염된 세포로부터 분리하였다. 약 1000nt-길이의 오버랩핑 단편을 표준 RT-TCR 기술을 사용하여 합성하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고 서열화하였다. 5'UTR의 서열화는 여러 곳에서 설명되고 있는 바와 같이 퍼스트초이스 (FirstChoice) RLM-RACE 키트 (Ambion)를 사용하여 수행하였다(16).
실시예 6: 바이러스성 복제 분석
전기 천공된 세포의 1/5을 35-mm 접시에 놓았다. 도면에 나타낸 시간에서, 배지를 교체하고, 바이러스 역가를 BHK-21 세포에서의 플라그 분석으로 측정하였다. 선택적으로, BHK-21, NIH3T3 또는 C7IO세포를 35-mm 접시에 놓고, 도면에 나타낸 MOI에서 감염시켰다. 배지를 신선한 배지로 교체하고, 수확된 샘플의 바이러스 역가를 BHK-21 세포에서의 플라그 분석에 의해 결정하였다.
실시예 7: 단백질 합성의 분석
상기 4mg의 RNA을 BHK-21 세포로 전기 천공하고, 전기 천공된 세포의 1/5를 6-웰 코스타 플레이트에 놓았다. 12시간 후반 트랜스펙션에서, 메티오닌이 부족하고, 0.1% FBS 및 20 mCi/ml의 [35S]메티오닌이 첨가된 0.8㎖의 DMEM 배지에서 30분 동안 배양함으로써 단백질을 대사적으로 라벨화시켰다. 배양 후, 이들을 모아 배지로 옮기고, 원심분리하여 펠렛화시키고, 100㎕의 표준 단백질 로딩 버퍼에서 용해시켰다. 단백질의 동량을 소듐 도데실 설페이트 (SDS)-10% 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩시켰다. 전기영동 후에, 겔을 건조시키고, 방사선사진촬영을 하였다.
실시예 8: RNA 분석
바이러스-특이적 RNA의 합성을 분석하기 위해, 세포를 4mg의 in vitro-합성된 바이러스성 RNA로 전기 천공하였고, 세포의 1/5를 35-mm 접시로 옮겼다. 4.5시간 후반 트랜스펙션 후에, 웰 내의 배지를 10% FBS, ActD (1 μg/ml) 및 [3H]우리딘(20 mCi/ml)이 첨가된 aMEM 1㎖로 교체하였다. 37℃에서 배양 4시간 후에, 전체 세포성 RNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 트리졸 (Trizol, Invitrogen)에 의해 분리하고, 이어서 디메틸 설폭사이드 내의 글리옥살 (glyoxal)로 변성시키고, 이전에 설명된 조건을 사용하여 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다(7). 겔을 2,5-디페닐옥사졸 (PPO)로 침지시키고, 건조시키고, 방사선 사진촬영을 하였다.
실시예 9: IFN -알파/베타 분석
배지안의 IFN-알파/베타의 농도를 이전에 설명된 생물학적 분석법으로 측정하였다 (41). 보다 구체적으로, 96-웰 플레이트에서 5x104세포/웰의 농도로 L929 세포를 100㎖의 완전 배지에 놓고, 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 감염된 NIH 3T3 세포로부터 수확한 배지 샘플에 UV 광선을 1시간 동안 처리하고, 연속적으로 L929 세포로 웰 내에서 직접 2배 단계로 희석하였다. 37℃에서 24시간 동안 배양 후에, 소수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus (VSV))의 2x105 PFU를 갖는 배지의 추가 100ml를 웰에 첨가하고, 36 내지 40시간 동안 계속적으로 배양하였다. 이어서, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 종말점을 VSV-유도된 CPE에서 얻어진 세포의 50%를 보호하는 데 필요한 IFNa/b의 농도로서 결정하였다. 결과의 표준화를 위한 IFN-a/b 기준을 ATCC로부터 구매하였고, 방출된 바이러스의 역가는 BHK-21 세포 상의 플라그 분석에 의해 결정하였다.
실시예 10: 모기에서 바이러스 복제의 평가
생체 내 모기의 복제 역량을 평가하기 위하여, 1 ㎕ 부피 중 대략 105 PFU를 사용하여 애데스 애집티 (Aedes aegypti) (갈베스톤에서 기원하는 콜로니, 텍사스) 모기의 흉부내 (intrathoracic) 접종을 사용하였다. 흉부 내 접종은 구강 노출 대안으로 선택되었으며, 이것은 거의 모든 쿨리신 (culicine) 모기가 임의의 알파바이러스에 의한 흉부 내 감염이 매우 용이하기 때문이다. 반면에 구강 용이성은 매우 가변적이고 매우 덜 민감하다 (42). 유리 피펫을 사용하여 접종한 후, 모기를 10일 동안 27℃에서 배양시키고, 이어서 20% FBS 및 펀기존 (Fungizone)이 첨가된 MEM 1ml로 개별적으로 적정하였다. 각각의 적정된 모기의 100 ㎕ 부피를 24 웰 플레이트 상의 베로 (Vero) 세포 단층에 첨가하고, 감염을 검출하기 위하여 세포병리학상 효과를 위해 5일 동안 관찰하였다. 분석 대조군은 TC-83 모 바이러스 및 IRES 돌연변이체 모두를 포함하였다.
실시예 11: 전염성이 강한 VEEV 로 면역화 및 챌린지
6일령 NIH 스위스 마우스들에게 VEEV TC-83 균주 또는 디자인된 돌연변이체를 PBS 20μl의 전체 부피 중에 대략 106 PFU의 투여량으로 대뇌 (i.c) 접종하였다. 감염 후, 8 내지 10마리 동물 각각 무리를 어떠한 조작 없이 2개월 동안 방치하였다. 21일 동안, 마우스들에서 병의 징조 (구겨진 털, 우울증, 식욕부진 및/또는 마비) 및/또는 죽음을 매일 관찰하였다.
8주령 암컷 NIH 스위스 마우스들에게 VEEV TC-83 또는 재조합 바이러스를 사용하여 대략 106 PFU/마우스의 투여량으로 피하 (s.c.) 백신접종하고, 이어서 4주 후에는 고도로 악화된 VEEV 균주 3908의 약 104 PFU를 피하에 챌린지 (challenge) 하였다. 21일 동안, 마우스들의 병의 징조 (구겨진 털, 우울증, 식욕부진 및/또는 마비) 및/또는 죽음을 매일 2번씩 관찰하였다.
실시예 12: 재조합 VEEV TC -83- 기초된 바이러스
본 발명은 모기 기원 세포가 아닌 척추동물 세포에서 효과적으로 복제할 수 있는 알파바이러스를 개발하는 것이었다. 따라서, 이러한 바이러스의 복제는 척추동물에서만 기능하고, 곤충세포에서는 안 하는 단백질 또는 RNA 서열에 의존해야 했다. 이것을 성취하기 위해, 본 발명은 EMCV IRES에 의존적인 알파바이러스 구조 단백질의 발현 방법을 디자인한 것이다. 디자인된 IRES는 VEEV TC-83 구조 유전자의 최상의 효율적인 번역을 얻기 위해 폴리 (C) 서열을 함유하지 않지만, EMCV 폴리프로테인의 처음 4개의 코돈들을 보유하였다. 후반 실험에서, 이들 추가적 아미노산이 바이러스 복제에서 부정적인 효과를 가지지 않지만, 바이러스성 구조 단백질의 번역에 있어서 긍정적인 효과를 갖는 것을 확인하였다 (데이터 미제시).
플라스미드 구조체 중 하나인, VEEV/IRES는 IRES 서열을 본연의 5'UTR의 서브게놈 RNA 다운스트림으로 복제되었다 (도 1A). 따라서, 이 게놈은 서브게놈 RNA를 합성할 수 있다고 기대되었다. 또 다른 재조합 VEEV/mutSG/IRES에서, 서브게놈 프로모터를 13개의 동의 (synonymous) 점 돌연변이에 의해 비활성화시켰고(도 1A 및 1 B), 이것은 활성 SG RNA 프로모터로의 전환을 방지한다고 기대되었다. VEEV 구조 단백질의 합성을 촉진하기 위하여, IRES 서열을 26S 5'UTR를 교체하기 위해 클로닝하였다.
VEEV/IRES, VEEV/mutSG/IRES 및 비변형된, 야생형 (wt) VEEV TC-83의 게놈 RNA를 인 비트로 합성하고, BHK-21 세포로 트랜스펙션하였다. 감염 센터 분석에서, VEEV/IRES RNA는 TC-83의 RNA와 동일한 감염성을 보여주었고, TC-83의 플라그와 유사한 균일한 크기의 플라그를 발전시켰다 (도 1A 및 1C). 이것은 디자인된 바이러스의 생산적인 복제에 대해 추가적인 적응 돌연변이가 요구되지 않는 다는 것을 의미한다. VEEV/IRES는 109 PFU/ml를 초과하는 역가로 복제되었지만, 이들 최종 역가 및 바이러스 복제율은 VEEV TC-83의 그것보다 현저하게 낮아졌다 (도 1D). 서브게놈 프로모터가 부족한 또 다른 재조합 바이러스성 게놈, VEEV/mutSG/IRES으로 트랜스펙션된 BHK-21 세포는 매우 비효과적으로 감염성 바이러스를 생산하였다 (도 1D), 감염 센터 분석에서, 이 구축물은 주로 핀포인트 (pinpoint) 플라그를 발전시켰으며, 이들의 수는 평가하기 어려웠다. 놀랍게, 이 바이러스는 연속 계대 (serial passage)에 의해 추가적인 진화를 보여주었으며, 보다 큰 플라그를 생성하는 변이체로 빠르게 발전하였다 (도 1C 및 데이터 미도시). 도 1D에서 보여진 성장 커브는 소 및 대 플라그-형성 바이러스의 방출을 보여준다.
따라서, 이들 실험의 결과는 적어도 VEEV/IRES 게놈이라는 맥락에서, EMCV IRES가 VEEV 복제에 대해 충분한 레벨로 구조 단백질을 생성할 수 있다는 것을 보여주었다. 변이된 서브게놈 프로모터를 갖는 구축물인 VEEV/mutSG/IRES은 보다 효과적인 복제를 위해 진화할 수 있는 결함성-인-복제 바이러스 (defective-in-replication virus)를 생성하였다.
실시예 13: VEEV / mutSG /IRES에서 적응 돌연변이의 분석
VEEV/mutSG/IRES의 큰 플라그를 생성하는 표현형으로의 진화는 바이러스성 게놈에서 추가적인 돌연변이의 축적으로 인한 것으로 추측되었다. 야생형 (wt) 게놈 서열로의 전환은 다수 도입된 점 돌연변이에 기인하여 불가능한 일이었고, 따라서 적응 돌연변이의 위치는 예측하는 것이 어려웠다. 돌연변이를 동정하기 위하여, 24시간 후반 전기천공에서 수확된 VEEV/mutSG/IRES 샘플의 5개의 플라그를 무작위로 선택하고, 두 개의 플라그-정제된 변이체의 전체 게놈 (3' 및 5' UTR을 포함)을 서열화하였다. 동정된 돌연변이 리스트를 도 2A에 나타내었다. 이들 대다수는 아주 밀접하고 (synonymous), 알려진 시스-작용 RNA 요소에 존재하지 않았다. 따라서, 바이러스 복제상에서 이들의 효과는 매우 예상 밖이었다. 그러나, 두 플라그 분리체들의 게놈은 nsP2 단백질에서, Y370→C로의 동일한 돌연변이를 포함하였고, 게놈 중 하나는 옆의 암호화된 아미노산이 K371→Q로 변하였다.
바이러스 복제에서 돌연변이의 효과를 테스트하기 위하여, Y370→C 및 Y37O→C 과 K371→Q 둘 모두를 오리지널 VEEV/mutSG/IRES 구축물로 클로닝하였고 (도 2B), RNA 감염성, 바이러스 복제율, 플라그 크기를 오리지널 VEEV/mutSG/IRES 및 다른 구축물의 그것과 비교하였다. 동일한 돌연변이들 또한 모 바이러스의 복제에 대한 이들의 효과를 테스트하기 위하여 VEEV TC-83 게놈으로 클로닝하였다. VEEV/mutSG/IRES/1 및 VEEV/mutSG/IRES/2에서 돌연변이의 하나 또는 둘 모두를 갖는 IRES-암호화 게놈 RNA는 감염 센터 분석에서 VEEV TC-83 RNA와 동일한 감염성을 보여주었고, 구제된 바이러스는 VEEV TC-83의 그것과 유사한 균일한 플라그 크기를 형성하였다 (데이터 미도시). 이들은 성장률에서 강한 증가를 보여주었지만 (도 2C 및 1D), 두 번째 돌연변이의 효과는 미진하였다. 따라서, 상기 데이터들은 nsP2에서 Y370→C 돌연변이는 바이러스 복제에서 강한 긍정적인 효과를 가지며, 두 번째 돌연변이는 뛰어난 효과가 없었음을 의미한다. VEEV TC-83 게놈으로 도입되는 경우, 동일한 돌연변이는 바이러스의 복제율 또는 최종 역가에서 눈에 띄는 효과를 가지지 않았으며 (도 2C), 이것은 복제 강화가 VEEV/mutSG/IRES 변이체에 특이적임을 예측할 수 있었다.
동정된 아미노산 변화 (Y370→C 및 K371→Q)는 서브게놈 프로모터-결핍, IRES-함유하는 바이러스의 효과적인 복제를 이끌 수 있는 가능한 돌연변이의 일부분만을 나타낼 뿐이다. 따라서, parallel experiment을 통해 샘플로부터 분리된 다른 세 개의 플라그 클론에서 nt 2161-2959를 서열화하였고, 이를 인 비트로-합성된 RNA 및 베로 (Vero) 세포에서 추가적인 3 계대 (passage) 후 바이러스 스톡으로부터 분리된 5 플라그-정제 변이체의 24시간 후반 RNA 트랜스펙션에서 수확하였다. 이러한 passaging 은 가장 효과적으로 복제하는 바이러스를 선택할 수 있었다. 동정된 돌연변이의 리스트를 도 3A에 나타내었다. 서열화는 RT-PCR-유래 DNA 단편으로부터 직접적으로 수행하였으며, 따라서 나타낸 돌연변이는 플라그-유래 바이러스 집단에서 일치된 서열을 보여주었고, PCR-유래된 것에서는 아니었다 (도 3B).
모든 분리체들은 서열화된 단편에서 돌연변이를 포함하고 있었으며, 이는 nsP2의 RNA 헬리카제 도메인의 카르복시 터미널 단편에 대응하였다. 또한 모든 변경된 아미노산은 아미노산 348-424 사이에 위치하였다. 게다가, 전기천공 후 생성된 오리지널 바이러스 스톡 및 계대된 풀 (pool) 모두에서, 대부분의 공통 돌연변이는 Y370→C였다. 이것은 그것이 복제에서 가장 두드러진 효과의 하나를 아마도 갖는다는 것을 나타내며, 따라서 이 특정 돌연변이인 VEEV/mutSG/IRES/1를 갖는 상기 설명된 변이체를 다음 실험에 사용하였다.
실시예 14: 바이러스 복제에서 nsP2 Y 370 →C 돌연변이의 효과
nsP2-관련된 RNA 헬리카제의 카르복시 터미널 단편에서 적응 돌연변이의 동정은 놀라웠으며, VEEV/mutSG/IRES 복제의 증가에 대한 어떠한 명백한 설명을 제시하지 못하였다. 이 돌연변이는 RNA 복제 또는 바이러스성 구조 단백질 번역 또는 바이러스성 입자 형성 또는 복제 콤플렉스 구분화 등등에서 자극적인 효과를 갖는 것을 가능하게 할 수 있다. 그러나, 가장 기대된 효과는 바이러스성 RNA 합성의 증가였다. 따라서, BHK-21 세포를 다른 VEEV 변이체의 인 비트로 합성 게놈으로 트랜스펙션하였고, 4.5시간 후반 전기 천공을 시작으로 4시간 동안 ActD의 존재 하에서 새로이 합성된 바이러스성 RNA를 [3H]우리딘으로 대사적으로 라벨화시켰고, 상기 RNA를 아가로스 겔에서 전기영동하는 것으로 분석하였다(도 4A).
기대된 바와 같이, VEEV/IRES는 서브게놈 RNA를 합성할 수 있으며, 이것은 서브게놈 RNA 5'UTR의 3' 말단에서 도입된 IRES가 서브게놈 프로모터 활동을 방해하지 않았다는 것을 나타낸 것이다. nsP2에서 적응 돌연변이를 갖는 VEEV/mutSG/IRES 및 그의 변이체는 검출 가능하지 않은 SG RNA를 생성하였다. 따라서, 이들 게놈의 프로모터 서열로 도입된 13개의 돌연변이는 서브게놈 RNA의 전사를 완전히 파괴하였다. 놀랍게, nsP2에서의 적응 돌연변이는 오리지널적으로 디자인된 (originally designed) VEEV/mutSG/IRES 게놈에서 한 만큼 효과적으로 RNA 게놈 복제, 및 복제된 VEEV/mutSG/lRES/1 및 VEEV/mutSG/IRES/2 게놈 RNAs에서 눈에 띄는 효과를 가지지 않았다. 게다가, 모든 변이체의 게놈 RNA 복제는 VEEV TC-83의 그것과 매우 유사하였다. 이들 돌연변이의 효과는 오리지널 VEEV TC-83 RNA와 마찬가지로 검출되지 않았다 (VEEV/1 및 VEEV/2에 대응하는 레인 참조). 이 발견은 적응 (adaption)이 RNA 복제의 증가를 초래하지 않는다는 것을 뒷받침해주었다.
바이러스성 구조 단백질의 합성을 12시간 후반 전기천공에서 평가하였다 (도 4B). 그 시간까지, VEEV/IRES- 및 VEEV/mutSG/IRES- 특이적 캡시드 및 유사한 다른 구조 단백질은 VEEV TC-83 RNA로 트랜스펙션된 세포에서보다 약 2배 덜 효과적으로 합성되었다. 이 알맞은 작은 차이는 12시간 후반 트랜스펙션에서 수확된 샘플 중에서 검출된 VEEV/IRES 및 VEEV/mutSG/IRES 바이러스 각각의 4 및 7 크기 이상으로 낮은 감염 역가 (VEEV TC-83의 역가와 비교하여)를 설명하지 못한다. 게다가, 오리지널 VEEV/mutSG/IRES 게놈을 함유하는 BHK-21 세포 대 nsP2에서 적응 돌연변이를 갖는 VEEV/mutSG/l RES/1 및 VEEV/mutSG/IRES/2에서 바이러스성 단백질 합성 사이에서의 차이가 본 실험 및 다른 실험에서 검출되지 않았다. IRES-함유 바이러스로 감염된 세포에서 라벨화된 단백질의 패턴의 두드러진 특징은 두 개의 추가 밴드의 존재였고, 이것은 열-쇼크 단백질 Hsp90 및 Hsp72로서 질량 스펙트로미터로 동정되었다. 이들 유도의 생물학적 중요성은 아직 명확하지 않지만, IRES로부터 발현된 구조 단백질을 갖는 세포에서 스트레스 진전을 이끄는 바이러스성 구조 단백질 접힘의 일부 변칙 (abnormalities)으로부터 초래되었다고 추측하였다.
추가 실험에서, VEEV TC-83, VEEV/mutSG/IRES 및 VEEV/mutSG/IRES/1로 감염된 세포에서 바이러스성 당단백의 세포 속 분포를 평가하였고, 세포 표면 상에 이들 단백질의 존재를 VEEV-특이 항체로 염색하는 것에 의해 분석하였다. 당단백의 분포에서 눈에 띄는 차이가 동정되지 않았다. 바이러스성 게놈에서 추가적인 패키징 시그널의 형성을 적응 돌연변이가 일으킬 수 있다는 가능성이 조사되었으며, 돌연변이-함유 단편 (VEEV 게놈의 nt 2533-2950에 대응)을 VEEV/mutSG/IRES 게놈의 3' UTR로 클로닝하고, 재조합 인 비트로 합성된 RNA를 감염 센터 분석에서 테스트하였다. 플라그의 크기 또는 바이러스 역가에서 오리지널 VEEV/mutSG/IRES의 그것과 비교하여 증가가 검출되지 않았다.
또 다른 변이체에서, 서브게놈 프로모터와 VEEV 캡시드-코딩 서열을 서브게놈 RNA로부터 추가 캡시드 발현이 바이러스 복제의 효능을 증가시키는지 아닌지를 테스트하기 위해 VEEV/mutSG/IRES 게놈의 3'UTR로 클로닝하였다. 이 변형은 또한 바이러스 역가상에서 어떠한 긍정적인 효과를 가지지 않았다. 마지막으로, VEEV/mutSG/IRES가 감염성 바이러스 대신 게놈 없는 서브바이러스성 입자를 생성시키는지 여부를 분석하였다. 그러한 경우는 관찰되지 않았다. 즉, VEEV/mutSG/IRES RNA로 트랜스펙션되고 [35S]메티오닌으로 대사적 표지된 세포들은 수크로즈 농도 구배 (gradient) (데이타 미도시)에서 초원심분리에 의해 검출된 수 있는 서브바이러스성 입자를 생성하지 않았다는 것이 관찰되었다. 따라서, 상기-설명된 복합적인 분석은 오리지널 VEEV/mutSG/IRES의 매우 비효율적인 복제에 대해 또는 IRES-함유 바이러스의 복제에 있어서 VEEV nsP2에서 검출된 돌연변이의 긍정적인 효과에 대해 명확한 기전적인 설명을 하지 못하였다. 그러나, 본 발명의 주된 목적은 VEEV 변이체의 개발이고, 이것의 복제는 EMCV IRES 기능에 의존하고, VEEV/IRES 및 VEEV/mutSG/IRES/1 모두는 이 목적에 부합하는 것으로 나타났다.
실시예 15: 모기 세포 및 모기에서 IRES-의존 VEEV 변이체의 복제
알파바이러스 복제에 대해 축적된 데이터는 분명하게 이들의 유전적 불안정성과 높은 진화율을 보여주고, 임의의 비상동성 유전자의 결실을 초래한다. 특히 이러한 결과는 특히 이들이 바이러스 복제에 대해 부정적인 효과를 가지는 경우에 나타난다 (17, 40). 따라서, 본 발명의 중요한 문제의 하나는 디자인된 EMCV IRES 삽입이 안정화되고 모기 세포에서의 복제를 불가능하게 하는 바이러스를 제공할지 여부이다. 이것을 테스트하기 위해, C710모기 세포를 인 비트로-합성된 RNA의 BHK-21 세포로 24시간 후반 전기 천공에서 수확된 VEEV/IRES 및 VEEV/mutSG/IRES 바이러스로 감염시켰다. RNA 트랜스펙션 후 방출된 변이체의 전체 라이브러리가 모기 세포에서 복제할 수 있는지를 테스트하기 위하여, nsP2에 적응 돌연변이 Y370→C를 갖는 상기 설명된 VEEV/mutSG/lRES/1 대신 VEEV/mutSG/IRES를 사용하였다.
첫 번째 계대 (passage)시, C710세포의 48시간 후반 감염에서, VEEV/IRES의 역가는 1.5x1010 PFU/ml에 접근하였고, 두 번째 계대 후 수확된 유사한 역가가 스톡 (stock)에서 검출되었다 (도 5A 및 5B). 반면, VEEV/mutSG/IRES의 역가는 첫 번째 계대 후 150 PFU/ml였고 (이것은 모기 세포에서 생성된 초기의 바이러스보다 오히려 감염에 사용된 잔류 바이러스를 반영한 것 같다), 다음의 두 번째 계대 후에는 검출 한계 아래였다 (도 5A 및 5B). 추가의 실험에서, nsP2에서 적응 돌연변이를 포함한 플라그-정제된 변이체의 VEEV/mutSG/IRES는 C710세포 내에서 계대되었다. 감염성 바이러스가 두 개의 블라인드 계대 후에 전혀 회수되지 않았다.
*또 다른 실험에서, 애.애집티 ( Ae . aegypti ) 모기를 VEEV TC-83 및 VEEV/mutSG/l RES/1 변이체의 약 105 PFU로 흉부 내 접종하였다. IRES 돌연변이체로 접종된 17마리의 모기 어느 것도 애.애집티에서 검출될 수 있게 복제하지 않았고, 반면, TC-83 모 균주로 접종된 17마리 모기 중 17 마리는 106 PFU/모기 이상의 평균 역가를 갖는 모두 CPE 분석에서 검출 가능한 레벨로 복제하였다. 따라서, IRES-함유 VEEV 변이체 VEEV/mutSG/IRES/1는 인 비트로 및 인 비보 모두에서 모기 세포에서 복제 불가능하였다.
모기 세포에서 계대 후 VEEV/IRES (서브게놈 RNA 변이체를 생성할 수 있는)의 높은 역가를 설명하기 위해, 두 개의 개별적인 플라그를 무작위로 선택하였고, 게놈의 IRES-함유 단편을 서열화하였다. 양쪽의 분리체에서, IRES 서열은 바이러스성 게놈 중에 더 이상 존재하지 않았고, 오리지널 IRES의 오직 13 및 15개의 잔류 뉴클레오티드만이 발견되었다 (도 5C). 따라서, 모기 세포에서 VEEV/IRES 변이체의 계대는 IRES-네가티브 변이체의 축적을 이끌었고, VEEV/mutSG/IRES (서브게놈 프로모터가 부족함)은 모기 세포에서 효과적으로 복제 가능한 돌연변이체를 발전시키지 않았다.
실시예 16: VEEV / mutSG /IRES/1 변이체는 약독화된 표현형을 보여줌
본 발명은 모기 기원 세포 (및 대응적으로 모기 벡터에서)에서 복제 불가능하지만, 모 (parental) VEEV TC-83보다 척추 동물에서 더 약독화된 표현형을 보여주는 VEEV 변이체의 개발을 목적으로 하였다. VEEV/mutSG/IRES/1 변이체의 보다 느린 복제율은 이 바이러스가 본연의 IFN- a/b 생성 및 시그널링을 갖는 척추동물 세포에서 복제할 수 없다는 문제를 야기하였다. 그러나, 본 발명은 그러지 않았다. 도 6에서 보여진 실험의 결과는 VEEV/mutSG/l RES/1가 IFN-알파/베타 분비 및 시그널링의 결함이 없는 NIH 3T3 세포에서 109 PFU/ml이상의 역가로 복제함 보여준다. 그의 복제는 보다 효과적인 IFN-a/b 유도를 유발하지만 (도 6), 명백하게 IFN 방출은 이미 확립된 바이러스 복제를 방해하지 않았다. BHK-21 세포에서 보여지는 바와 같이 (도 2C), VEEV/mutSG/l RES/1의 복제는 VEEV TC-83의 복제보다 덜 효과적이었으며, 이것은 IRES-의존 돌연변이체가 생체 내에서 약독화된다는 것으로 추측되었다. 게다가, 6일령 마우스들을 약 106 PFU로 대뇌 (i.c) 접종한 후, 86%가 생존하였으며, 뇌염의 신호로 발전하지 않았으며, 반면, 마우스들의 92%가 VEEV 균주 TC-83의 동일 투여량으로 죽었다. 상기 데이터를 종합하면, 유전적으로 변형된 IRES-의존 VEEV가 모 (parental) VEEV TC-83보다 더 약독화되었다는 것을 나타내었다.
그럼에도 불구하고, VEEV/mutSG/IRES/1 변이체는 신생 마우스 및 성체 마우스 모두에서 면역성이 남아있었다. VEEV/mutSG/IRES/1로 접종되어 생존한 12마리의 6일령 마우스 중에서, 10마리가 투여된 5주 후 야생형 VEEV 균주 3908을 104 PFU로 s.c. 챌린지 생존되었으며, 반면, 12 마리 샴 (PBS)-감염된 마우스들은 동일한 방식으로 챌린지되었으며, 어느 것도 생존하지 않았다 (도 7). VEEV/mutSG/l RES/1은 또한 성체 마우스들에서 또한 면역원성을 가졌으며, 약 106 PFU로 s.c. 면역된 것은 VEEV 균주 3908의 104 PFU(~104 LD50)로 s.c. 챌린지 3주 후에 대해 80%의 마우스들을 보호하였다 (도 8). 항체 역가 (PRNT80)를 중성화하는 것은 챌린지 직전에 이들 마우스들 전체에서 1:20보다 작게 미검출되었으며, 이는 1회 백신접종 후 불완전한 보호가 생체 내 IRES-함유 바이러스 복제를 낮추는 결과를 가져온다는 점을 뒷받침해주었다. 따라서, 그것의 높은 레벨의 약독화는 높은 정도의 안전성을 제공하지만, 반복적인 백신접종이 아마도 요구될 것이다.
실시예 17: 모기 감염의 결여를 유지하지만 약독화를 감소시키는 발현 전략
본 발명의 별도의 실시예에서, 모기 감염성의 결여를 유지하지만 약독화를 감소시키기 위한 신규한 발현 전략을 디자인하였다. 이 전략은 외피 막 당단백 유전자의 IRES 다운스트림과 함께 3' UTR 업스트림 직전 서브게놈 영역의 3'말단에 캡시드 유전자를 위치시키는 것을 포함하였다 (도 9). 따라서, 외피 단백질 유전자는 캡-의존 방식으로, 캡시드 단백질은 IRES-의존 방식으로 번역되어, 서브게놈 메시지를 형성하였다. BHK 및 베라 세포에서 이 새로운 IRES 돌연변이체의 복제는 효과적이지만, C710 모기 세포에서 검출되지는 않았다. 20 애데스앱지티 (Aedes aegypti) 성체 암컷 모기의 흉부 내 접종 (intrathoracic inoculation)은 복제의 증거를 얻지 못하였다. 이 IRES 버전 2가 마우스들을 백신접종하기 위해 사용되는 경우, 10 마리 모두는 정상 TC-83에 의해 유도된 것보다 약 2배 낮은 평균 역가를 가지고 혈청 변환되었고 (seroconverted), 10마리 마우스들 모두는 치명적인 피하 챌린지로부터 IRES 버전 2에 의해 보호되었다. 따라서, 새로운 IRES 발현 전략은 모기-무능 표현형을 유지하면서 덜 약독화되었다.
TC-83 IRES 돌연변이체의 면역성 및 효능
백신 균주 혈청 변환된 단편 평균 중성 Ab 역가 ±SD 치명적인 VEEV 챌린지에 대해 보호된 단편
IRES 버젼 1 1/10 <20 8/10
IRES 버젼 2 10/10 224±260 10/10
TC-83 5/5 576±143 5/5
샴 (Sham) 0/5 <20 0/5
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본 명세서에서 언급한 모든 특허 또는 문헌은 본 발명이 속하는 분야에서 당업자의 수준을 나타낸 것이다. 또한, 이들 특허 및 문헌은 각각의 개개의 문헌이 특별히 및 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 나타낸다면 동일한 양으로 본 명세서 참조로서 포함된다.
<110> The Board of Regents of the University of Texas System <120> Attenuated Recombinant Alphaviruses Incapable of Replicating in Mosquitoes and Uses Thereof <130> ip-2010-0001-1 <140> 10-2016-7029024 <141> 2016-10-18 <150> PCT/US2009/000458 <151> 2009-01-23 <150> US 61/062,229 <151> 2008-01-24 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Fragment of the VEEV TC-83 containing subgenomic promoter <400> 1 ccccuauaac ucucuacggc uaaccugaau ggacuacg 38 <210> 2 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA fragment of VEEV/mutSG/IRES <400> 2 ccccgauuac guuguaugga ugauaaucua gaaacguu 38 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein fragment of VEEV/mutSG/IRES <400> 3 Pro Ile Thr Leu Tyr Gly 1 5

Claims (22)

  1. (i) 막 당 단백질 유전자 말단에 도입된 엔세팔로미엘로카디티스 바이러스(encephalomyelocarditis virus, EMCV) 로부터 유래된 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)의 다운스트림에 위치하고, 알파 바이러스의 서브게놈 프로모터의 3' UTR 의 업스트림인 서브게놈 영역의 3' 말단에 위치하는 캡시드 유전자; 및
    (ii) 알파 바이러스의 비활성화된 서브게놈 프로모터; 를 포함하는 알파 바이러스 핵산 서열을 포함하는, 모기 및 모기 세포에서 복제가 불가능한 약독화된 알파바이러스이며,
    상기 알파바이러스는 약독화된 알파 바이러스이며, 상기 캡시드 유전자는 EMCV IRES-의존적 방식으로 번역되고, 상기 막 당 단백질 유전자는 캡-의존적 방식으로 번역되는 것인, 모기 및 모기 세포에서 복제가 불가능한 약독화된 알파바이러스.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 비구조적 단백질 4(nsP4) 암호화 서열 및 알파바이러스 핵산의 서브게놈 RNA 암호화 서열의 개시 AUG 사이의 서브게놈 RNA의 5' UTR 이 결실된 것인, 약독화된 알파 바이러스.
  4. 제1항에 있어서, 상기 서브게놈 프로모터는 서브게놈 RNA의 5' UTR 에 위치한 알파바이러스 핵산 내의 클러스터된 점 돌연변이에 의해서 비활성화 된 것인, 약독화된 알파 바이러스.
  5. 제4항에 있어서, 상기 서브게놈 프로모터의 돌연변이는 nsP4 의 카르복시 말단의 아미노산 서열을 변형시키지 않는 것인, 약독화된 알파 바이러스.
  6. 제1항에 있어서, 상기 알파바이러스는 치쿤구니야 바이러스 (Chikungunya virus), 동부 말 뇌염 바이러스 (Eastern Equine Encephalitis Virus), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (Venezuelan Equine Encephalitis virus) 및 서부 말 뇌염 바이러스 (Western Equine Encephalitis virus)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 약독화된 알파 바이러스.
  7. 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 약독화된 알파 바이러스를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  8. 제7항의 벡터를 포함하고 발현하는 숙주세포.
  9. 제1항의 약독화된 알파 바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 알파바이러스에 의해 유도되는 상태의 치료 또는 완화를 위한 면역 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 알파바이러스에 노출에 의해 초래되는 감염으로부터 개체를 보호하는 방법에 사용하기 위한 것인, 면역 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 알파바이러스에 대한 백신의 제조에 사용하기 위한, 면역 조성물 .
  12. 제10항에 있어서, 상기 개체는 인간, 말 또는 다른 가축인, 면역 조성물.
  13. (i) 치쿤구니야 바이러스의 서브게놈 RNA 암호화 서열의 개시 AUG와 치쿤구니야 바이러스의 비구조적 단백질 4 암호화 서열의 일 말단 사이에 도입된 엔세팔로미엘로카디티스 바이러스 (encephalomyelocarditis virus)의 내부 리보좀 엔트리 사이트 (EMCV-IRES); 및
    (ii) 치쿤구니야 바이러스의 비활성화된 서브게놈 프로모터;
    를 포함하는 살아있는 약독화된 치쿤구니야 바이러스이고, 상기 치쿤구니야 바이러스는 비활성화된 것인 치쿤구니야 바이러스.
  14. 제13항에 있어서, 상기 서브게놈 프로모터는 클러스터된 점 돌연변이에 의해서 불활성화 되고, 상기 클러스터된 점 돌연변이는 서브게놈 RNA의 5' UTR 에 위치하는 것인, 살아있는 약독화된 치쿤구니야 바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 상기 서브게놈 프로모터의 돌연변이는 비-구조적 단백질 4의 카르복시 말단의 아미노산 서열을 변형시키지 않는 것인, 살아있는 약독화된 치쿤구니야 바이러스.
  16. 삭제
  17. 제14항에 있어서, 상기 클러스터된 점 돌연변이는 서열번호 1의 11, 12, 14, 17, 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30 위치에서의 동의 돌연변이 (synonymous mutations)를 포함하는 것인, 살아있는 약독화된 치쿤구니야 바이러스.
  18. 제13항 내지 제15항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 살아있는 약독화된 치쿤구니야 바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 알파바이러스에 의해 유도되는 상태의 치료 또는 완화를 위한 면역 조성물.
  19. 제18항에 따른 면역 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 항-치쿤구니야 바이러스 면역 반응을 유도하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 개체는 말 또는 다른 가축인, 방법.
  21. 제13항 내지 제15항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 살아있는 약독화된 치쿤구니야 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  22. 제21항의 발현 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포.
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