ES2616855T3 - Vectores baculovirales - Google Patents

Abstract

Un vector de transferencia para insertar un gen en un locus genético de una secuencia de baculovirus que comprende: un casete de expresión que comprende un promotor eucariota unido operativamente al gen; un casete de selección bipartita flanqueado por secuencias de recombinación LoxP donde dichas secuencias LoxP están modificadas para asegurar que únicamente puede producirse una única ronda de recombinación que comprende: (i) una secuencia expresable que codifica un primer marcador seleccionable; y (i) una secuencia expresable que codifica un segundo marcador seleccionable; y secuencias que flanquean los casetes de expresión y de selección bipartita, donde las secuencias corresponden sustancialmente a secuencias del locus genético en la secuencia de baculovirus, permitiendo de este modo la recombinación homóloga entre el vector de transferencia y el baculovirus.

Description

DESCRIPCION

Vectores baculovirales

5 La presente invencion se refiere a un vector de transferencia para insertar un gen en un locus genetico de una secuencia de baculovirus. La presente invencion se refiere tambien a procedimientos de uso del vector de transferencia y bacmidos y baculovirus derivados.

El sistema de expresion de baculovirus se ha usado para expresar muchos miles de protefnas en celulas eucariotas 10 para estudios estructurales y bioqufmicos (14). Ademas de su capacidad para expresar protefnas recombinantes individuales, el sistema de baculovirus se ha usado tambien para co-expresar protefnas multiples que forman complejos (15-22). Esto es importante, puesto que las pantallas de interaccion de amplio genoma estan revelando que muchas funciones crfticas de las celulas vivas son realizadas por complejos de protefnas de subunidades multiples (23). Se han usado dos estrategias principales para lograr la co-expresion de protefnas usando el sistema 15 de baculovirus. La co-infeccion de celulas con dos o mas virus, cada uno de los cuales expresa una protefna recombinante, es con diferencia el enfoque mas comun (19,24,25). Sin embargo, a menudo el rendimiento de los complejos de protefnas de estos estudios es muy variable y la co-infeccion de las mismas celulas por dos baculovirus diferentes no sigue la distribucion de Poisson (26). Por lo tanto, aunque el enfoque de co-infeccion es tecnicamente directo, esta practicamente limitado a la recuperacion de complejos relativamente simples para 20 aplicaciones que no requieren grandes cantidades de protefnas purificadas.

Para aplicaciones tales como estudios estructurales y grandes estudios de vacunas donde se requiere mas protefna, y para complejos mas complicados formados a partir de muchas subunidades, se ha usado el enfoque alternativo de la co-expresion de protefnas de casetes de expresion multiples similares insertados en los loci de polihedrina o P10 25 (15-18,22,27). Este enfoque tiene la ventaja de que cualquier celula en el cultivo que sea infectada con el virus recombinante, expresa todas las protefnas requeridas para la formacion del complejo de protefnas de manera reproducible. Cuando los enfoques de co-infeccion y baculovirus individual se han comparado, este ultimo ha demostrado un rendimiento significativamente mejor del complejo recombinante (28). Sin embargo, la expresion de protefnas multiples usando un virus recombinante individual no carece de inconvenientes. Aunque el baculovirus con 30 forma de bacilo parece ser bastante tolerante a las inserciones en su genoma, los genes son transferidos al virus por recombinacion homologa, y el vector de transferencia debe ser de un tamano que sea facilmente manipulado en E. coli. Por lo tanto, existe un lfmite para el numero de genes que pueden insertarse en un vector de transferencia. En la practica, esto significa que es raramente posible expresar mas de cuatro protefnas de un solo locus. Ademas, los baculovirus contienen secuencias y expresan protefnas que promueven la recombinacion homologa (29-32). Por lo 35 tanto, los virus que contienen grandes cantidades de secuencia repetida, son propensos a transposicion y recombinacion (21,33,34).

El enfoque de co-expresion de baculovirus individual se ha modificado por la insercion de un sitio loxP en el locus chiA/catepsina de un bacmido que contiene ya la diana Tn7 en el locus de polihedrina (20). Esto permite la 40 insercion de multiples casetes de expresion en cada uno de estos loci usando recombinacion en E. coli. Como podrfa esperarse, dado que este sistema se basa en la duplicacion iterativa de un casete de expresion que ha sido modificado para que exprese diferentes genes, existe evidencia de que las inserciones en este sistema son geneticamente algo inestables (21).

45 Recientemente, la investigacion de los baculovirus se ha beneficiado del uso del sistema de recombinacion ET que ha permitido la inactivacion genica selectiva de genes virales (35-49). Sin embargo, no se ha examinado el potencial de esta tecnica para disenar y facilitar la expresion de protefnas en loci geneticos diferentes de P10 y polihedrina.

La presente invencion se refiere a un procedimiento para la expresion eficiente de multiples protefnas recombinantes 50 (es decir, protefnas no baculovirales) de un genoma de baculovirus individual. El procedimiento permite que casetes de expresion de protefnas individuales se inserten eficientemente en diferentes loci dentro del genoma vfrico, usando el sistema de recombinacion ET. Ademas, el procedimiento permite la expresion de complejos con numerosas subunidades.

55 La expresion de protefnas individuales usando baculovirus como un sistema de expresion, esta bien establecida. La metodologfa basica del sistema de expresion ha cambiado muy poco desde su primera produccion. A 133 kb, el genoma del dsDNA del baculovirus es demasiado grande para ser manipulado directamente. Por lo tanto, los genes que codifican protefnas extranas se clonan, en E. coli, en vectores que contienen un casete de expresion del virus de

insecto AcMNPV, y este se introduce entonces con ADN vfrico en celulas de insecto, donde protefnas vincas y celulares median la recombinacion homologa que da como resultado la produccion de un virus infeccioso (con respecto a las celulas de insecto) que expresa la proteina extrana. Ya se han generado algunas variaciones sobre este tema, incluyendo genomas viricos que se replican solo si ocurre recombinacion (1,2), y realizando una 5 recombinacion en E. coli con un bacmido en base al uso del transposon Tn7 (3) que acelera la seleccion del virus recombinante. La expresion de complejos de multiples protefnas en celulas de insecto, se ha logrado tambien usando el sistema de expresion de baculovirus como se ha analizado de forma breve anteriormente. Inicialmente, se usaron multiples virus que expresaban cada uno una proteina individual para co-infectar celulas susceptibles, y el complejo de protefnas se purifico despues de la expresion. Sin embargo, esto es en el mejor de los casos ineficiente 10 y no lo suficientemente reproducible para ser factible para una extension a escala. Como una alternativa, se produjeron vectores que incorporaban multiples unidades de expresion pero que se recombinaban con un locus genetico de virus individual (4-6). De forma similar, el documento WO2007/104979 describe un vector de transferencia que comprende un gen que se expresara aguas abajo de un promotor de expresion, sin embargo, tal vector no proporciona un medio por el cual puedan identificarse recombinantes positivos. Ademas, estos vectores 15 tuvieron la ventaja de que produjeron todas las subunidades de proteina recombinantes en cada celula infectada, y dieron como resultado rendimientos significativamente mayores del complejo de protefnas recombinantes. Ademas, debido a que solo un virus individual expresa todas las protefnas, los resultados de las infecciones fueron mucho mas reproducibles. La desventaja de estos vectores es doble. Primero, debido a que los vectores contienen secuencias repetidas y el baculovirus expresa protefnas que promueven la recombinacion homologa, la expresion, 20 en particular de construcciones que contienen tres o cuatro unidades de expresion, no siempre es muy estable geneticamente a traves de grandes numeros de pases viricos (que son necesarios durante el aumento a escala industrial para la expresion de protefnas de baculovirus). En segundo lugar, existe un lfmite practico con respecto al tamano de la insercion que puede facilmente mantenerse y manipularse en E. coli, lo que limita el numero de protefnas que pueden expresarse a partir de estos vectores. Otro enfoque que se ha propuesto para la produccion 25 de multiples protefnas, es la insercion de una o mas protefnas extranas en un locus genetico en baculovirus,

despues la seleccion de un virus que exprese esa proteina, y el uso de este genoma vfrico para recombinar en un

segundo locus genetico con el fin de expresar otras protefnas (7). Sin embargo, debido al alto grado de aptitud tecnica y a la cantidad de tiempo implicada en este enfoque (16 dfas para el primer locus y 25 dfas para cada locus posterior), este enfoque no se ha usado practicamente nunca. Un desarrollo reciente fue modificar el sistema del

30 transposon Tn7 basado en BAC para insertar un sitio LoxP en un segundo locus genetico en baculovirus, para

permitir tambien la insercion de genes adicionales en este locus en E. coli (8). Sin embargo, este procedimiento padece aun los problemas de las secuencias de repeticion de la duplicacion de promotores en los vectores bacterianos, lo que significa que la construccion es geneticamente inestable para pases viricos multiples, y los vectores de transferencia alcanzaran rapidamente el tamano practico maximo para manipulacion en E. coli.

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El procedimiento de la presente invencion supera al menos algunos de los problemas inherentes en los procedimientos anteriores, tales como la inestabilidad genetica y el requisito de rondas multiples de recombinacion.

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invencion proporciona un vector de transferencia para insertar un gen 40 en un locus genetico de una secuencia de baculovirus que comprende:

un casete de expresion que comprende un promotor eucariota unido operativamente al gen;

un casete de seleccion bipartita flanqueado por secuencias de recombinacion LoxP donde dichas secuencias LoxP estan modificadas para asegurar que unicamente puede producirse una unica ronda de recombinacion que comprende:

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i. una secuencia expresable que codifica un primer marcador seleccionable; y

ii. una secuencia expresable que codifica un segundo marcador seleccionable; y

secuencias que flanquean los casetes de expresion y de seleccion bipartita, donde las secuencias corresponden 50 sustancialmente a secuencias del locus genetico en la secuencia de baculovirus, permitiendo de este modo la recombinacion homologa entre el vector de transferencia y el baculovirus.

El vector de transferencia de la presente invencion puede usarse para insertar eficientemente un gen en un locus genetico de una secuencia de baculovirus, y para seleccionar las secuencias de baculovirus que comprenden el gen. 55 En particular, se ha encontrado que, mediante el uso de un casete de seleccion bipartita, se obtuvo un aumento sustancial en la identificacion de clones positivos (es decir, secuencias de baculovirus que contenfan el gen insertado), en comparacion con la seleccion usando un marcador de seleccion individual. Esto proporciona una ventaja significativa sobre el uso de un marcador de seleccion individual. Unicamente un pequeno numero de baculovirus se transforman y, por lo tanto, el marcador solo se expresa a niveles muy bajos. Por ejemplo, cuando el

marcador es resistente a antibioticos, solo pueden usarse niveles muy bajos de antibiotico. Esto da como resultado la seleccion de variantes bacterianas que son resistentes al antibiotico usado. Por lo tanto, algunas bacterias que crecen en las placas pueden no contener la modificacion. El uso de dos procedimientos de seleccion positiva supera la posibilidad de dichas selecciones de falsos positivos.

5

El vector de transferencia de la presente invencion puede ser cualquier vector adecuado, siempre que sea capaz de recombinarse con una secuencia de baculovirus a traves de recombinacion homologa para insertar un gen en la secuencia de baculovirus. Los vectores de transferencia adecuados se conocen bien por los expertos en la tecnica. A continuacion, se analizan caracterfsticas clave del vector de transferencia.

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El gen a insertar en la secuencia de baculovirus puede ser cualquier gen heterologo (es decir, gen no baculoviral). Se prefiere que el gen heterologo codifique una subunidad de un complejo de protefnas. El gen heterologo puede codificar una protefna vfrica, un componente de un receptor o un complejo de chaperonas. Se prefiere particularmente que el gen heterologo codifique para una protefna vfrica que, junto con otras protefnas vfricas, 15 puedan formar una partfcula pseudovfrica (VLP).

El locus genetico en el que el gen se inserta en la secuencia de baculovirus, puede ser cualquier locus adecuado que permita la expresion del gen insertado, y ademas, no impida la capacidad de replicacion de la secuencia de baculovirus. Ademas, el locus usado no debe afectar a la capacidad del baculovirus para infectar celulas, es decir, 20 que se replique o se propague de celula a celula. Dichos loci incluyen los loci de polihedrina y P10. Otros loci adecuados identificados por los presentes inventores incluyen ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 y odv-e56.

La secuencia de baculovirus puede ser cualquier secuencia de baculovirus adecuada que pueda replicarse en una celula de insecto y una celula procariota tal como E. coli. En particular, puede usarse cualquier genoma de 25 baculovirus vfrico que contenga un replicon BAC. Las secuencias de baculovirus adecuadas incluyen el bacmido AcMNPV.

El termino "casete de expresion" se refiere a la combinacion de elementos requeridos para la expresion del gen. Por consiguiente, el casete de expresion comprende un promotor adecuado que permite la expresion del gen codificado 30 en celulas eucariotas (es decir, celulas de insecto), y una secuencia de senal de poliadenilacion adecuada que flanquea la secuencia del gen. Los casetes de expresion para la expresion de genes en celulas eucariotas se conocen bien por los expertos en la tecnica. Los promotores particularmente preferidos incluyen los promotores tardfos vfricos de baculovirus (por ejemplo, p35), o los promotores muy tardfos vfricos (por ejemplo, los promotores de polihedrina y p10). Las secuencias de senal de poliadenilacion adecuadas incluyen la secuencia de 35 poliadenilacion de triptofano hidroxilasa (Tph), o secuencias de poliadenilacion de genes de baculovirus.

El casete de expresion puede comprender mas de un gen (por ejemplo, 2, 3 o 4 genes) que da como resultado la expresion de mas de un gen. Sin embargo, en general, se prefiere que el casete de expresion comprenda un unico gen.

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Se ha encontrado que el casete de seleccion bipartita mejora la identificacion y el aislamiento de clones que han recibido con exito el gen. El casete de seleccion bipartita comprende 2 marcadores seleccionables diferentes. El casete comprende tambien cualquier elemento requerido para la expresion de los marcadores en una celula bacteriana, tal como uno o mas promotores bacterianos. La etapa de seleccion de secuencias que han recibido el 45 gen comprende la seleccion de secuencias que comprenden ambos marcadores seleccionables. Esta etapa de seleccion se realiza en celulas bacterianas, por ejemplo, E. coli. Los marcadores seleccionables pueden ser cualquier marcador que permita que las celulas que comprenden el casete sean seleccionadas. Por ejemplo, los marcadores pueden ser visibles, tales como un marcador que cause la apariencia o el cambio de color en una celula o colonia. Como alternativa, el marcador puede conferir resistencia, por ejemplo, a un antibiotico. Los dos 50 marcadores seleccionables pueden ser el mismo tipo de marcador, por ejemplo, con resistencia a dos antibioticos diferentes, o diferentes tipos de marcador, por ejemplo, con resistencia a antibioticos y un marcador visual. El primer marcador seleccionable es preferiblemente un marcador visual, tal como el fragmento LacZalfa, que permite que celulas que expresan el fragmento LacZalfa parezcan de color azul en presencia de IPTG o X-gal. El segundo marcador seleccionable es preferiblemente cualquier marcador que confiera resistencia a antibioticos, tal como 55 resistencia a cloranfenicol, tetraciclina, puromicina, ampicilina, penicilina, apramicina, kanamicina o fleomicina. Se prefiere particularmente que el segundo marcador confiera resistencia a fleomicina.

Segun se menciona, el casete de seleccion bipartita esta flanqueado por secuencias de recombinacion LoxP. Las secuencias de recombinacion LoxP se combinan entre sf en presencia de Cre recombinasa, dando como resultado

la delecion de la secuencia intermedia. Por consiguiente, el casete de seleccion bipartita puede eliminarse, permitiendo que los mismos marcadores seleccionables sean usados cuando se inserta algun gen adicional en la secuencia de baculovirus. Preferiblemente, los sitios LoxP se modifican para garantizar que solo pueda producirse una unica ronda de recombinacion entre los sitios. Los sitios LoxP modificados adecuados se conocen por los 5 expertos en la tecnica, por ejemplo, los sitios modificados Lox66 y Lox71.

Las secuencias que flanquean los casetes de expresion y de seleccion bipartita, corresponden sustancialmente a secuencias del locus genetico que permiten que ocurra una recombinacion homologa entre el vector de transferencia y la secuencia de baculovirus. Cada secuencia de flanqueo es preferiblemente de al menos 20 pb de longitud, mas 10 preferiblemente de al menos 30 pb de longitud, e incluso mas preferiblemente de al menos 50 pb de longitud, y tiene una secuencia que permite una recombinacion especffica con una secuencia del locus genetico.

De acuerdo con un segundo aspecto, la presente invencion proporciona un procedimiento para producir un bacmido recombinante que comprende:

15 poner juntos un bacmido y el vector de transferencia de acuerdo con el primer aspecto de la presente invencion para permitir la recombinacion homologa; y

seleccionar un bacmido recombinante que comprenda el casete de seleccion bipartita.

El bacmido recombinante puede seleccionarse usando tecnicas estandar, dependiendo del casete de seleccion 20 bipartita.

El procedimiento para producir un bacmido recombinante puede comprender ademas detectar la presencia del gen en el bacmido o su producto de expresion. Pueden usarse tecnicas de seleccion adecuadas, dependiendo del gen especffico.

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Ademas, dado que el casete de seleccion es flanqueado por secuencias de recombinacion LoxP, el procedimiento comprende ademas preferiblemente inducir la recombinacion entre los sitios LoxP, por ejemplo, exponiendo el bacmido a Cre recombinasa, para eliminar el casete de seleccion bipartita. La Cre recombinasa esta preferiblemente bajo el control de un promotor inducible, tal como el promotor de arabinosa. La ventaja de eliminar el casete de 30 seleccion bipartita, es que un vector de transferencia adicional puede recombinarse con el bacmido, donde el vector de transferencia adicional contiene al mismo casete de seleccion bipartita. La seleccion del bacmido recombinado adicional puede realizarse usando las mismas tecnicas que se usan despues de la primera ronda de recombinacion.

En general, el procedimiento para producir un bacmido recombinante se realiza en una celula procariota, ya que un 35 sistema basado en celulas procariotas es mas facil y mas rapido de manipular. Se prefiere que el sistema basado en celulas procariotas conduzca a la recombinacion homologa. Dichos sistemas incluyen el sistema de recombinacion lambda red, que se describe en la solicitud de patente Europea EP-A-1291420. Preferiblemente, el procedimiento para producir el bacmido recombinante se realiza en E. coli. Se prefiere particularmente que el procedimiento se realice usando la lfnea celular de E. coli EL350 que tiene un profago lambda integrado que expresa exo, 40 bet y gam bajo el control del promotor lambdaPL regulado por la temperatura, y Cre recombinasa bajo el control de un promotor inducible por arabinosa.

El procedimiento para producir el bacmido recombinante puede repetirse varias veces, de manera que el bacmido puede contener muchos genes heterologos, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o mas genes heterologos. Mediante la 45 tentativa de usar diferentes promotores para la expresion de cada gen insertado, y puesto que cada gen se inserta en un locus genetico diferente, es posible reducir o evitar el tener secuencias repetidas en el bacmido y garantizar de esta manera que el bacmido tenga buena estabilidad genetica. Se prefiere ademas que al menos un gen esencial este situado entre cada gen heterologo insertado. Tal disposicion garantiza que, si se produce una recombinacion homologa entre cualquiera de las secuencias insertadas, un gen esencial sera eliminado, dando como resultado un 50 bacmido no viable.

De acuerdo con un tercer aspecto, la presente invencion proporciona un bacmido recombinante obtenido por el procedimiento de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion. El bacmido comprende el gen insertado y, como se indica en el presente documento, puede comprender tambien remanentes de las secuencias LoxP. Estos 55 remanentes pueden usarse como marcadores para identificar los bacmidos. El bacmido comprende preferiblemente al menos 6, 7, 8 o 9 genes heterologos.

De acuerdo con un cuarto aspecto, la presente invencion proporciona tambien un procedimiento para producir un baculovirus recombinante que comprende cultivar una celula eucariota que contiene el bacmido recombinante

obtenido por el procedimiento de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion, en condiciones de manera que se produzca un baculovirus.

Preferiblemente, las celulas eucariotas son celulas de insecto, mas preferiblemente derivadas de los insectos 5 Spodoptera frugiperda o Trichoplusia ni, por ejemplo, las celulas de insecto (Sf21, Sf9 o TN 5B-1-4). El baculovirus puede aislarse usando tecnicas estandar, y puede ponerse a prueba la expresion del gen heterologo insertado.

De acuerdo con un quinto aspecto, la presente invencion proporciona un baculovirus recombinante obtenido por el procedimiento de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invencion.

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De acuerdo con un sexto aspecto, la presente invencion proporciona tambien un bacmido recombinante o un baculovirus recombinante que expresa una pluralidad de protefnas heterologas, donde cada protefna se expresa a partir de un locus genetico separado del bacmido o baculovirus. Se prefiere adicionalmente que al menos un gen esencial este situado entre cada locus genetico que exprese una protefna heterologa. Tal disposicion garantiza que 15 si se produce una recombinacion homologa entre loci geneticos que expresan un gen heterologo, un gen esencial es eliminado, dando como resultado un bacmido o baculovirus no viable. Preferiblemente, el bacmido o baculovirus expresa al menos 3, mas preferiblemente al menos 5, y mucho mas preferiblemente al menos 8 protefnas. Las protefnas son heterologas, es decir, no estan codificadas por baculovirus de origen natural. Se prefiere ademas que las protefnas heterologas codificadas sean subunidades de un complejo de protefnas, tales como una VLP, un 20 complejo de receptores o un complejo de chaperonas.

Se prefiere adicionalmente que los loci geneticos separados del bacmido o baculovirus recombinante se seleccionen de entre ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2, odv-e56 y p10. La posicion de dichos loci se describe especfficamente con referencia al baculovirus AcMNPV en la Tabla 1 que se indica a continuacion. Un experto en la tecnica puede 25 determinar facilmente la ubicacion de los loci en otras cepas de baculovirus y bacmidos usando esta informacion. Tabla 1 Los loci geneticos a los que se ha hecho referencia anteriormente, se definen a continuacion con referencia a la secuencia de acceso de referencia para AcMNPV (numero de acceso NC001623).

Locus

ifmites

ctx

2028-2296

egt

11310-13091

39k

29196-30070

orf51

43154-44337

gp37c

52192-52327

iap2

60983-61823

p35

116282-117460

p10

118767-119135

odv-e56

128947-130166

30 Como se indica en el presente documento, tambien se puede obtener un bacmido recombinante o baculovirus recombinante, donde un casete de expresion que codifica una protefna heterologa se inserta en uno o mas de los siguientes loci geneticos: ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 y odv-e56.

Se ha encontrado que estos loci geneticos permiten especfficamente la expresion de alto nivel de la protefna 35 heterologa, sin que se interrumpan las funciones esenciales del bacmido o el baculovirus.

Preferiblemente, el bacmido recombinante o el baculovirus recombinante codifica para una pluralidad de protefnas, estando cada casete de expresion insertado en un locus genetico diferente. Se prefiere ademas que el bacmido recombinante o el baculovirus recombinante codifique al menos 3, mas preferiblemente al menos 5, y mucho mas 40 preferiblemente al menos 8 protefnas. Se prefiere ademas que las protefnas heterologas codificadas sean subunidades de un complejo de protefnas, tales como una VLP, un complejo de receptores o un complejo de chaperonas.

Se indica en el presente documento un vector de transferencia para insertar un gen en un locus genetico de una secuencia de baculovirus que comprende:

un casete de expresion que comprende un promotor eucariota unido operativamente al gen; y secuencias que flaquean el casete de expresion, donde las secuencias corresponden sustancialmente a las 5 secuencias del locus genetico dentro de la secuencia de baculovirus, donde el locus genetico se selecciona de entre: ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 y odv-e56.

Como se ha indicado anteriormente, se ha encontrado que insertando el gen en los loci geneticos mencionados, puede obtenerse una expresion de alto nivel del gen sin que se interrumpan las funciones esenciales de la 10 secuencia de baculovirus.

Como se indica en el presente documento, este procedimiento que usa los loci anteriores para producir un bacmido recombinante, comprende:

poner juntos dicho bacmido y el vector de transferencia para permitir una recombinacion homologa; y 15 seleccionar un bacmido recombinante que comprenda el casete de expresion.

Los procedimientos para producir tal bacmido recombinante y seleccionar tal bacmido, se conocen bien por los expertos en la tecnica. La presente invencion tambien proporciona un bacmido recombinante obtenido mediante este procedimiento.

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Tambien se indica en el presente documento un procedimiento que usa los loci anteriores para producir un baculovirus recombinante que comprende producir dicho bacmido recombinante y cultivar una celula eucariota que contiene el bacmido, de manera que se produzca un baculovirus.

25 Los procedimientos para producir tal baculovirus recombinante se conocen bien por los expertos en la tecnica. La presente invencion tambien proporciona un baculovirus recombinante obtenido mediante este procedimiento.

La presente invencion tambien proporciona una celula que contiene un vector de transferencia, un bacmido, o un baculovirus de acuerdo con cualquier aspecto de la presente invencion.

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La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para producir una o mas protefnas que comprende cultivar el bacmido o baculovirus recombinante de acuerdo con cualquier aspecto de la presente invencion en las condiciones adecuadas. La una o mas protefnas se codifican por el uno o mas genes, y pueden combinarse para formar un complejo de protefnas, tal como una VLP o un complejo de chaperonas. La una o mas protefnas pueden 35 aislarse usando tecnicas estandar bien conocidas por los expertos en la tecnica.

La presente invencion se describe ahora a modo de ejemplo unicamente con referencia a las siguientes figuras.

La figura 1 muestra una seleccion mejorada de recombinantes de la clonacion ET. A) Dibujo del ADN usado 40 para las recombinaciones cat y bipartita. Ambas construcciones tuvieron las mismas secuencias de flanqueo

del baculovirus (AcMNPV), el casete de expresion de luciferasa de Renilla (Pp35-Rluc-Tph) y sitios loxP (LoxP). El marcador seleccionable bipartita tuvo tambien el gen de resistencia a zeocina (ZeoR) y el fragmento LacZa. En la construccion resistente a cloranfenicol, este se reemplazo por el gen cat. B) Numero de colonias bacterianas positivas tras la recombinacion ET. El ADN usado para la recombinacion se produjo 45 mediante PCR o digestion con enzimas de restriccion, segun se indique. C) La insercion correcta del casete

de expresion Rluc se confirmo por PCR usando un cebador en el ADN transferido, y uno flanqueando el locus diana en el ADN del baculovirus. El producto de PCR correcto (indicado con una flecha) solo se producira despues de la integracion correcta. Se muestran los resultados para 12 recombinantes independientes (1-12), sin control de PCR del molde (13), molde de bacmido no modificado (14) y molde de ADN de transferencia 50 (15). El campo M es el ADN marcador. D) Actividad de luciferasa de Renilla (unidades luminosas relativas) 48

horas post-infeccion, en el lisado de celulas de celulas infectadas con el pase 2 de los bacmidos recombinantes 1-12 de C. La actividad de fondo en los lisados equivalentes de celulas no infectadas y celulas infectadas con bacmido no modificado (AcMNPV), era mas de 106 veces menor.

55 La figura 2 muestra la eliminacion selectiva de los genes marcadores. A) Dibujo que muestra la estrategia

para la recombinacion ET de un casete de expresion (expresion) en el ADN del bacmido AcMNPV, y la eliminacion selectiva de solo los genes marcadores (seleccion) por recombinacion mediada por Cre. B) PCR usando cebadores marcados como a y b en A, campos 1-2: dos recombinantes de bacmido independientes despues de la recombinacion ET, campos 3-6: cuatro recombinantes independientes despues de la

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recombinacion mediada por Cre para eliminar los marcadores seleccionables bacterianos, campo 7: sin molde, campo 8: molde de ADN de bacmido no modificado, campo 9: molde de ADN de plasmido que contiene el casete marcador seleccionable, campo 10: marcador de ADN. Los productos de PCR que corresponden a los tamanos predichos para los productos precursor y recombinante de la recombinacion mediada por Cre, estan marcados como P y R, respectivamente. C) Secuenciacion del archivo de rastreo de un recombinante representativo del analisis por PCR en B, que confirma la presencia de un loxP defectuoso que incorpora los brazos loxP71 y loxP66 que hacen que el recombinante sea incapaz de experimentar una recombinacion mediada por Cre adicional (secuencias mostradas en las SEQ ID NOS: 1 y 2). D) Actividad de luciferasa de Renilla de los bacmidos recombinante y precursor de B, al transfectarse en celulas de insecto. La actividad de luciferasa de Renilla se ensayo 48 horas post-infeccion despues del pase del virus recombinante. La actividad de fondo de las celulas no infectadas se marca como Celulas.

La figura 3 muestra la identificacion de sitios adicionales para la expresion de protefnas recombinantes en el genoma de AcMNPV. A) Dibujo de AcMNPV que muestra las posiciones relativas de los loci usados para la expresion de protefnas. B) Tabla que muestra los loci usados para la insercion y cualquier cambio adicional hecho al locus. C) Actividad de luciferasa relativa de Renilla 48 horas post-infeccion con un virus modificado que contiene un casete de expresion de luciferasa de luciernaga adicional en cada locus indicado. Todos los virus tenfan el mismo casete de expresion de luciferasa de Renilla en el locus p10 bajo el control del promotor p35. Las barras de error indican la desviacion estandar de cinco replicas para cada locus. D) Actividad de luciferasa normalizada de luciernaga, que muestra la expresion relativa de un casete de terminador de promotor de polihedrina-polihedrina de luciferasa de luciernaga insertado en cada locus, segun se indica. Las barras de error indican la desviacion estandar de 5 replicas para cada locus. La luciferasa de luciernaga se normalizo usando el control de luciferasa de Renilla expresado del mismo genoma. Se excluyeron las inserciones de luciferasa de luciernaga en los loci orf11, v-fgf, pe y orf23, debido a los niveles de luciferasa de Renilla de mas de 2 logaritmos menor que el virus control. La Ph del virus tiene luciferasa de luciernaga en el locus de polihedrina, y luciferasa de Renilla en el locus p10. La Ph* del virus tiene la misma insercion de luciferasa de Renilla p10, pero ninguna insercion de luciferasa de luciernaga.

La figura 4 muestra la expresion de M1 de influenza los loci de polihedrina y egt. El panel izquierdo muestra gel de SDS-PAGE con tincion de Coomassie de la protefna total de celulas infectadas con baculovirus de control (campos 1 y 4), egt-M1 (campo 2) e YM1-M1 (campo 3). El tamano de los marcadores de protefna (campo M) se indica en el lado izquierdo del gel. El panel derecho muestra el analisis Western blot de gel duplicado sondeado con antisuero anti-H7N7.

La figura 5 muestra la co-expresion de M1 y HA de influenza y la formacion de VLP. A) El panel izquierdo muestra el gel con tincion de Coomassie de la protefna total; el panel derecho muestra el analisis Western blot de gel duplicado sondeado con suero de virus de la influenza anti-H7N7. Las celulas se infectaron con baculovirus doble que expresaba HA y M1 (campo 1), baculovirus que expresaba solo HA (campo 2), celulas control (campo 3) y baculovirus que expresaba solo M1 (campo 4). B) Imagenes de EM de tincion negativa de VLP de la influenza. C) VLP de la influenza marcadas con inmuno-oro (HA) con partfculas de oro indicadas con una flecha.

La figura 6 muestra la produccion de baculovirus que co-expresan 4 protefnas. A) Lisado celular de celulas infectadas con baculovirus que expresa VP2 (campo 1), VP5 (campo 2), VP3 (campo 3) y VP7 (campo 4), celulas no infectadas (campo 5) o las 4 protefnas (campos 6 a 10), posicion de las protefnas marcadoras (M) y tamano en kDa, segun se indica. B) Lisado celular para celulas que expresan VP5, VP2, VP3, VP7 (campos 1-4) y VLP parcialmente purificadas (campo 5). C) Tabla que muestra el locus de insercion y el promotor vfrico usado para la expresion de cada protefna del BTV. D) EM con tincion negativa de inmuno-oro (para VP5) que muestra VLP del BTV purificadas.

La figura 7 muestra placas cristalinas formadas en la sobreexpresion de CCT5. Se muestran agregados de protefna cuadrilaterales en medio de cultivo de infecciones muy tardfas con baculovirus que expresa CCT5.

La figura 8 muestra la expresion de CCT en celulas de insecto. A) Lisado celular tenido con Coomassie de celulas infectadas con baculovirus que expresa CCT1-CCT8 (campos 1-8, respectivamente), solo celulas (campo 9), o baculovirus que co-expresa 7 subunidades de CCT (campo 10). B) Western blot de gel duplicado usando antisuero de CCT anti-raton policlonal. C) Cuadros que muestran diferentes loci geneticos y promotores usados para expresar cada una de las subunidades de CCT.

Ejemplos

El sistema de expresion de baculovirus tiene un potencial ya establecido para la produccion de grandes cantidades de protefnas eucariotas correctamente plegadas para estudios enzimaticos y estructurales. Sin embargo, cada vez 5 esta mas claro que muchas protefnas, si no la mayorfa de ellas, son activas dentro de las celulas como complejos constituidos por los productos de varios genes distintos. Dada la aceleracion al ritmo del descubrimiento de la estructura de las protefnas, existe la necesidad real de establecer sistemas para la produccion y purificacion rapida y fiable de complejos de protefnas. Esto es particularmente cierto para los complejos mas grandes que requieren la expresion simultanea y el plegamiento y procesamiento eucariotas de muchas subunidades de protefna. 10 Previamente, los inventores han desarrollado vectores de transferencia de baculovirus capaces de expresar 2, 3, 4 y 5 protefnas del mismo genoma de baculovirus. El proposito principal de los inventores en los estudios previos fue producir un sistema capaz de sintetizar grandes cantidades de complejos de protefnas vfricas que contuviesen cantidades no equimolares de protefnas codificadas por virus para estudios estructurales y enzimaticos. Una de las observaciones de la experiencia con estos sistemas es que los baculovirus individuales que expresan multiples 15 genes, son mucho mas eficientes en la formacion de los complejos de protefna deseados, que la co-infeccion de celulas de insecto con multiples baculovirus que expresan genes individuales. En el presente estudio, los inventores han usado nuevas tecnologfas para aprovechar esta observacion para la produccion de baculovirus recombinantes que expresen multiples protefnas para complejos de protefnas de mamffero biologicamente relevantes.

20 En particular, los inventores han adaptado y mejorado nuevas tecnologfas de diseno de cromosomas bacterianos para la produccion rapida y eficiente de baculovirus recombinantes que expresan simultaneamente multiples protefnas. Los nuevos sistemas desarrollados son 30 veces mas eficientes que los procesos convencionales, y permiten la insercion de rutina de genes en cualquier locus dentro del genoma del baculovirus. Estos estudios han permitido la identificacion de 7 nuevos loci geneticos dentro del genoma del baculovirus que permiten la expresion 25 de alto nivel de protefnas recombinantes. Ademas, los inventores han demostrado que pueden realizarse multiples rondas iterativas de recombinacion que permiten la generacion de genomas de virus que expresan multiples protefnas en un complejo de inserciones de genes individuales separados. Como ejemplos, los inventores han expresado complejos de protefnas de VLP para los virus de la influenza A (subtipo H7) y la fiebre catarral (serotipo 1), asf como el CCT del complejo de chaperonas de mamffero de 8 subunidades (TCP), que es un punto central para 30 estudios del cancer.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Se logran inserciones de genes individuales de locus multiples en E. coli usando recombinacion lambda red. La 35 invencion incluye el uso de loci de baculovirus que no se han usado previamente para la expresion de protefnas multiples, y la incorporacion de marcadores seleccionables que pueden ser eliminados del genoma del baculovirus y reutilizarse posteriormente. A diferencia de otros sistemas, los genes de protefnas recombinantes no estan flanqueados por secuencias de repeticion, mejorando su estabilidad genetica.

40 Los vectores de transferencia contienen una region de AcMNPV para la recombinacion homologa diana, un casete de expresion (promotor de AcMNPV, polienlazador, senal de poliadenilacion) y un casete de seleccion bacteriano. El promotor de AcMNPV usado es de los genes vfricos tardfos (por ejemplo, p35) o muy tardfos (por ejemplo, polihedrina, p10). El casete de seleccion bacteriano consiste en el sitio LoxP mutante - marcador seleccionable bacteriano - sitio Lox P mutante. Los sitios Lox P mutantes son variantes en las variantes LoxP66 y LoxP71 (9). Los 45 sitios LoxP para cada marcador seleccionable se disenan de tal forma que en la recombinacion, el marcador es eliminado, destruyendo el sitio LoxP que queda. Cada marcador seleccionable tiene diferentes brazos mutantes de LoxP, de manera que no se producira la recombinacion entre diferentes genes marcadores seleccionables insertados en el mismo baculovirus.

50 Eleccion del sistema usado para la expresion de locus multiples de protefnas recombinantes.

El plan de investigacion original implico el uso de recombinacion homologa en celulas de insecto, o el procedimiento alternativo de recombinacion ET en E. coli, para permitir la insercion eficiente de casetes de expresion para protefnas recombinantes en diferentes loci dentro del genoma de baculovirus. Los datos preliminares de los 55 inventores habfan sugerido que la linealizacion del vector de transferencia dio como resultado un aumento significativo de la frecuencia de recombinacion (hasta ~30 %) en un locus (p10) que no tuvo seleccion positiva diferente de la protefna recombinante producida. Al inicio del proyecto de investigacion, se consideraron los dos sistemas (recombinacion ET y recombinacion en celulas de insecto) con respecto a su reproducibilidad y el tiempo transcurrido para completar la insercion de un gen recombinante en un locus particular y verificar la expresion de la

protefna resultante. En cuando al tiempo transcurrido para cada ronda de expresion, el sistema de recombinacion ET fue mas rapido, principalmente debido al tiempo reducido necesario para preparar el genoma del baculovirus para la insercion de genes en un segundo locus genetico en el baculovirus. Ademas, fue posible disenar un procedimiento que permitiera la confirmacion de las inserciones geneticas independientemente de la expresion del transgen, y por 5 lo tanto, la necesidad de desarrollar el virus en celulas de insecto para verificar que la expresion fue menos crftica que para el sistema basado enteramente en celulas de insecto. En segundo lugar, aunque es posible co-introducir un marcador con genes insertados en el sistema de baculovirus, el numero de dichos marcadores es limitado y cada uno puede usarse solo una vez. Puesto que uno de los objetivos del proyecto era expresar el complejo de CCT de raton (TCP1) (8 subunidades), se adopto el enfoque de recombinacion ET como la prioridad de investigacion en una 10 fase temprana, ya que este sistema fue mas rapido y mas capaz de acomodar inserciones geneticas multiples.

EJEMPLO 1

Desarrollo de reactivos que permiten la seleccion eficiente de recombinantes ET.

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Los experimentos iniciales usando el procedimiento ET fueron decepcionantes. Se realizaron experimentos en los que se inserto un gen indicador (luciferasa) en un cromosoma artificial bacteriano que llevaba el genoma de AcMNPV completo (bacmido), y se selecciono un gen de resistencia a cloranfenicol que se integro conjuntamente con el indicador de luciferasa. Aunque se recuperaron colonias bacterianas resistentes a cloranfenicol, el analisis 20 posterior revelo que no contenfan el bacmido modificado correctamente con el indicador de luciferasa. Se obtuvieron resultados similares cuando el indicador, que fue disenado para expresarse solo en celulas de insecto en presencia de AcMNPV replicante, se cambio por GFP. Sin embargo, cuando la construccion de GFP se uso para la recombinacion en E. coli, sin seleccion con cloranfenicol, y se preparo ADN del bacmido para la poblacion transformada entera de E. coli, entonces este ADN dio como resultado algunos foci fluorescentes cuando se 25 transfecto en celulas de insecto (Sf21). Estos datos sugirieron que el problema no estaba en la propia recombinacion, sino en la seleccion post-recombinacion de las bacterias que contenfan la insercion. Para superar estos problemas, los inventores disenaron un nuevo casete de seleccion que incorporo un sistema marcador bipartita basado en el fragmento LacZa y el gen de resistencia a zeocina flanqueado por sitios de recombinacion LoxP modificados (figura 1A). Mediante el uso de este sistema, se anadio suficiente zeocina a las placas de 30 seleccion para reducir, pero no para eliminar, el crecimiento de la colonia de fondo, y se seleccionaron los recombinantes en base al fenotipo de colonias azules en presencia de IPTG y X-gal. Para evaluar la eficiencia relativa de la recuperacion de recombinantes usando los sistemas de seleccion de cloranfenicol (cat) y bipartita, los inventores realizaron un experimento donde E. coli competente por recombinacion que contenfa bacmido no modificado se electroporaron con 30 ng (~12,5 fmoles) del casete de seleccion bipartita o basado en cloranfenicol 35 (figura 1B). Dado que un sistema ideal para la incorporacion de secuencias que codifican para protefnas extranas no implicara un analisis por PCR repetido del gen insertado, los inventores tambien compararon la eficiencia de la recombinacion entre el ADN amplificado por PCR, es decir, la rutina para la recombinacion ET, y ADN purificado en gel y liberado por enzimas de restriccion. Se disenaron cebadores de PCR de tal forma que los extremos de los productos de PCR correspondieran a los extremos de los fragmentos liberados por las enzimas de restriccion.

40

La seleccion bipartita dio como resultado un aumento de 20 veces el numero de colonias positivas en comparacion con la seleccion con solo cloranfenicol, cuando el fragmento de ADN que se recombina se genero por PCR, y un aumento de 30 veces cuando se libero por la digestion por enzimas de restriccion del ADN plasmfdico (figura 1B). Estas diferencias fueron significativas (prueba de t, p = 0,03). Para la seleccion con cloranfenicol, no hubo diferencia 45 entre el numero de colonias recuperadas por PCR y el ADN generado por enzimas de restriccion. Sin embargo, para la seleccion bipartita, el numero medio de colonias fue cuatro veces mayor para el ADN liberado por enzimas de restriccion, en comparacion con el ADN amplificado por PCR (prueba de t, p = 0,05). Para confirmar que los recombinantes de la nueva seleccion bipartita eran genuinos, representando al bacmido modificado que contenfa la construccion de expresion insertada, se realizo una PCR en el ADN de bacmido purificado de colonias positivas. Se 50 diseno un cebador para una secuencia dentro del marcador de resistencia a zeocina y un cebador dirigido hacia una secuencia presente solo en el ADN de bacmido que flanqueaba el sitio de insercion correcto y no en el ADN de transferencia. Por lo tanto, el producto de PCR solo se producira donde la recombinacion haya ocurrido entre el ADN lineal usado para la recombinacion y el bacmido. Se ensayaron 12 muestras de ADN de bacmido separadas usando este procedimiento (figura 1C, campos 1-12), y todas fueron positivas para el diagnostico del producto de PCR para 55 la recombinacion correctamente dirigida. Por el contrario, ni el ADN de bacmido solo, ni el ADN plasmfdico que contenfa el fragmento de ADN usado para la recombinacion, fueron capaces de actuar como molde para generar el producto de PCR (figura 1C, campos 14 y 15, respectivamente). Para confirmar ademas que la recombinacion habfa dado como resultado la recuperacion de baculovirus recombinantes infecciosos, los mismos 12 clones de bacmido positivos para PCR se transfectaron en celulas Sf21 y se pasaron dos veces, despues se ensayo la actividad de

luciferasa de Renilla en celulas infectadas con cada uno de los recombinantes 48 horas posteriores a la infeccion. Las celulas infectadas con cada uno de los 12 virus recombinantes tuvieron actividades de luciferasa de Renilla que estuvieron 106 veces por encima del fondo (figura 1D). En base a estos datos, los inventores procedieron a usar la seleccion bipartita para investigaciones adicionales.

5

EJEMPLO 2

La eliminacion mediada por Cre del marcador seleccionable permite multiples rondas de recombinacion con la misma seleccion bipartita.

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Para expresar complejos de protefna con multiples subunidades diferentes usando inserciones de locus individuales, el sistema de marcador bipartita se diseno de tal forma que el casete de seleccion fuese flanqueado por sitios LoxP modificados. Estos sitios incorporan tanto las mutaciones lox66 como lox71, que limitan la recombinacion mediada por Cre a una unica ronda (1), y una mutacion en el espaciador que reduce la homologfa a sitios loxP de tipo 15 silvestre. Por lo tanto, la incubacion del bacmido modificado con Cre recombinasa da como resultado la eliminacion del marcador seleccionable bipartita y la inactivacion del sitio de recombinacion lox, pero deja atras el casete de expresion de baculovirus (figura 2A). Para confirmar que esta estrategia puede usarse con exito para disenar multiples inserciones en el ADN de bacmido, se uso la recombinacion con Cre para eliminar el marcador bipartita del bacmido en el que se habfa insertado el indicador de luciferasa de Renilla. Se consiguio la recombinacion en 20 E. coli usando la lfnea celular EL350 (2), que tiene tanto un profago lambda integrado que expresa exo, bet, y gam bajo el control del promotor 4PL regulado por la temperatura, como Cre recombinasa, bajo el control de un promotor inducible por arabinosa. Las celulas EL350 que contenfan tres de los bacmidos modificados para incorporar la insercion de seleccion luciferasa de Renilla-bipartita (figuras 1A-1D), se indujeron con arabinosa y despues se extendieron en placas que contenfan kanamicina, para seleccionar el bacmido, y X-gal, para seleccionar para 25 colonias que habfan perdido el marcador seleccionable por recombinacion mediada por Cre. Se purifico el ADN de bacmido de cuatro recombinantes putativos, y se confirmo la recombinacion mediada por Cre por PCR, usando cebadores que flanqueaban los marcadores seleccionables (figura 2B). Los cuatro recombinantes tenfan productos de PCR consistentes con el tamano esperado de la recombinacion exitosa por Cre. Esto se confirmo adicionalmente por la secuenciacion a traves del sitio loxP modificado de los 4 recombinantes (figura 2C). Los recombinantes 30 contenfan un sitio loxP inhabilitado que incorporaba las mutaciones loxP71 y loxP66, y no era competente para rondas adicionales de recombinacion. Para confirmar ademas que los recombinantes de bacmido mediados por Cre continuaban siendo viables en celulas de insecto, el ADN de bacmido se transfecto en celulas de insecto, y la actividad de luciferasa se ensayo despues de dos pases, como anteriormente. Todos los recombinantes tenfan una actividad de luciferasa de Renilla que era equivalente a los bacmidos precursores antes de la recombinacion por Cre 35 (figura 2D).

EJEMPLO 3

Identificacion de loci geneticos en el genoma de baculovirus adecuados para la expresion de alto nivel de 40 protefnas heterologas.

A pesar del extenso trabajo de la expresion de protefnas que se ha realizado en el sistema de expresion de baculovirus, la mayor parte de la expresion se ha centrado en el reemplazo de los genes de polihedrina o p10 para expresar protefnas recombinantes. Relativamente poca bibliograffa describe el uso de loci alternativos para la 45 expresion de protefnas recombinantes. Para ensayar si la seleccion puede usarse eficientemente en diferentes loci geneticos de baculovirus, se realizo una segunda ronda de recombinacion en uno de los bacmidos que contenfan ya el gen de luciferasa de Renilla. En estos experimentos, el mismo terminador de promotor de polihedrina-luciferasa de luciernaga-polihedrina, se inserto independientemente en un total de 13 loci geneticos diferentes (ctx, orf11, egt, orf23, v-fgf, 39k, orf51, gp37, iap2, chiA, pe, odv-e18 y odv-e56), generando baculovirus de doble expresion para 50 protefnas de luciferasa de Renilla y de luciernaga (figura 3A). Se seleccionaron loci como sitios para la insercion en estos experimentos, determinando que genes de baculovirus no son esenciales para el crecimiento del virus en cultivo tisular, y si la disposicion de los genes de baculovirus en loci particulares favorecfa la insercion de un casete de expresion adicional. Sin embargo, se hicieron algunos cambios adicionales en algunos loci, en particular cambios que dieron como resultado la inactivacion genica de genes de baculovirus particulares (figura 3B). Se pasaron dos 55 veces virus recombinantes en celulas de insecto Sf21, y en el tercer pase, se cosecharon celulas 48 horas posteriores a la infeccion, se lisaron y se ensayaron para determinar la actividad de luciferasa de Renilla y de luciernaga. Se uso la actividad de luciferasa de Renilla como un marcador para la replicacion vfrica y la expresion de protefnas, ya que todos los recombinantes tenfan el mismo promotor p35 dirigido por el casete de luciferasa de Renilla en el locus p10. La expresion de la luciferasa de luciernaga en cada nuevo locus se comparo con un virus

que llevaba el gen de luciferasa de luciernaga en el locus de polihedrina y el mismo gen de referenda de luciferasa de Renilla. De los 13 loci ensayados, 9 teman actividades de luciferasa de Renilla que estaban al menos 105 veces por encima del fondo, y de estos, 8 (ctx, egt, orf51, gp37, iap2, chiA, odv-e18 y odv-e56) teman actividad de luciferasa de Renilla que estaba en o por encima de la actividad medida solo para la luciferasa de Renilla precursora, 5 y controles de luciferasa de luciernaga del locus de polihedrina (figura 3C). Los cuatro loci (orf11, v-fgf, pe y orf23) que dieron como resultado un virus que dio actividad de luciferasa de Renilla que estaba dentro de 10 veces la actividad de fondo, se excluyeron del analisis adicional. Para los virus restantes, la actividad de luciferasa de Renilla se uso como una referencia para normalizar la actividad de luciferasa de luciernaga y obtener una medida de la expresion relativa de la luciferasa de luciernaga de cada locus (figura 3D). 7 loci (ctx, egt, 39k, orf51, gp37, 10 iap2 y odv-e56) teman una actividad de luciferasa de luciernaga que era al menos 106 veces mayor que el fondo, y similar a cuando el mismo gen se expreso a partir del locus de polihedrina (figura 3D). Dos virus (chiA y odv-e18) teman altos niveles de luciferasa de Renilla, pero una expresion relativamente deficiente de luciferasa de luciernaga.

Este estudio revela que es posible la expresion de alto nivel de protemas extranas de varios loci geneticos dentro del 15 genoma de baculovirus, e identifica siete loci (ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 y odv-e56), ademas de polihedrina y p10, que dan buena expresion. De estos sitios, 39k, orf51 y gp37 son inserciones en el ADN que flanquea la region codificante del gen, y no interrumpen directamente la expresion de las protemas. Por el contrario, se espera que las inserciones en cada uno de ctx, egt, iap2 y odv-e56 impidan la expresion de las protemas correspondientes de estos genes. Los primeros tres de estos genes se han descrito previamente como no esenciales para el crecimiento del 20 virus en cultivo celular (3-6). Se ha indicado tambien el truncamiento de la protema ODV-E56 (7).

De los loci que no dieron buena expresion del indicador de luciferasa de luciernaga, cuatro (orf11, v-fgf, pe y orf23) tambien dieron como resultado una expresion reducida de la protema del marcador de luciferasa de Renilla que estaba presente en todos los recombinantes. Puesto que el punto central del estudio era identificar sitios que fueran 25 adecuados para la insercion de construcciones de expresion de promotor muy tardm, no se investigo la razon precisa de esta expresion reducida. Las posibilidades incluyen efectos espedficos del locus sobre la replicacion o transcripcion del virus, y la alteracion de elementos esenciales del promotor o potenciador para los genes flanqueantes. La expresion de bajo nivel de la luciferasa de luciernaga en los virus de insercion chiA y odv-e18, fue inesperada por diferentes razones. Otros informes han registrado la insercion de casetes de expresion de protemas 30 recombinantes en el locus chiA (8,9). Es posible que el nivel de expresion reducido observado con el gen de luciferasa de luciernaga en este locus en estos experimentos se deba a los efectos sobre los genes que flanquean la insercion. Para odv-e18, los informes recientes que usan el mismo virus mutante han sugerido que esta protema es esencial para la produccion de virus gemados y el movimiento de celula a celula (10,11). Estos estudios se basaron en mutantes en los que hubo una delecion dentro de la secuencia codificante de odv-e18 y el gen flanqueante aguas 35 arriba. En los experimentos, cuando se inactivo odv-e18 por la mutacion de ATG de la secuencia codificante en GAT seguida de la insercion del casete de luciferasa de luciernaga en este punto en el gen, fue posible recuperar virus infecciosos. La expresion de la luciferasa de Renilla sobre el tercer pase equivalente a la expresion en el virus precursor, sugiere que no hubo alteracion de la capacidad de este virus mutante para replicarse. Sin embargo, dada la reduccion de ~2 logaritmos en los niveles de la luciferasa de luciernaga en comparacion con el virus sin esta 40 mutacion, no es posible excluir la posibilidad de que una pequena poblacion del virus en la que la mutacion se reparo, estuviese complementando una segunda poblacion que expresaba el gen indicador.

EJEMPLO4

45 Expresion de complejos de protemas usando expresion de baculovirus de multiples locus

El ejemplo 3 se centro en el uso de genes indicadores para evaluar cuantitativamente el potencial de diferentes loci de baculovirus para expresar una protema recombinante. Para establecer si es posible expresar y recuperar complejos de protemas recombinantes, tres complejos espedficos fueron dirigidos con diferentes numeros de 50 subunidades de protema. Se produjeron partmulas pseudovmcas para el subtipo H7 de la influenza (A/foca/Mass/1/80) por co-expresion de las protemas vmicas M1 y HA (complejo de 2 protemas), y para el serotipo 1 del virus de la fiebre catarral (BTV) por co-expresion de VP2, VP3, VP5 y VP7 (complejo de 4 protemas). Ademas, los inventores dirigieron la expresion de las 8 subunidades del complejo de chaperonas de CCT de raton que se usara para otros estudios funcionales y estructurales.

55

VLP de influenza A

Para estos experimentos, todos los genes de la influenza eran de la cepa adaptada de raton SC35M derivada del aislado H7N7 (A/foca/Mass/1/80), obtenida de investigadores en la Universidad Phillips-Marburgo, Alemania.

Para ensayar si el sistema de expresion de locus multiples era capaz de producir complejos de protefnas con dos protefnas, la secuencia codificante para la protefna M1 de influenza A se inserto inicialmente en locus egt bajo el control del promotor de polihedrina. Para la comparacion, se inserto el mismo gen en un vector de expresion de 5 baculovirus convencional (pAc-YM1) que se dirigfa al locus de polihedrina. Despues de la recombinacion, ambos baculovirus resultantes expresaron la protefna M1. Los niveles de expresion de la protefna de los loci de polihedrina y egt eran significativamente mayores que para cualquier otra protefna vfrica o celular en celulas infectadas por baculovirus cuando se evaluaron por SDS-PAGE, tenidas con azul de Coomassie (figuras 4A y 4B).

10 Para generar un virus doble que expresaba tanto M1 como HA, el casete de seleccion bacteriano se elimino del bacmido que expresaba M1 por recombinacion por Cre, y el gen HA de la misma cepa de influenza (A/foca/Mass/1/80) se inserto en el locus p10 en una segunda ronda de recombinacion ET. La co-expresion de M1 y HA del virus resultante se confirmo por SDS-PAGE y analisis Western blot como anteriormente (figura 5A). Ademas, se aislaron VLP de influenza del medio de cultivo de las celulas infectadas, se purificaron por ultracentrifugacion de 15 gradiente de densidad y se visualizaron por analisis de EM de tincion negativa (figura 5B). Para garantizar que las VLP visualizadas eran por supuesto de la influenza, las partfculas se marcaron por inmuno-oro usando anticuerpos especfficos para HA de la influenza (figura 5C).

Considerados en conjunto, estos datos eran buena evidencia de que podia usarse con exito el enfoque de locus 20 multiples para la expresion de protefnas recombinantes, y que era practico producir tal virus recombinante a traves de dos rondas de insercion del sistema de marcador seleccionable bipartita. Las VLP de la gripe se han ensayado ampliamente por otros, y se ha mostrado que son inmunogenas en ratones y hurones. Este procedimiento para construir las VLP tiene la ventaja de que es posible tener el genoma de baculovirus con M1 ya pre-integrada y lista para la expresion. Por lo tanto, para hacer VLP, solo deberfa ser necesario realizar una unica ronda de 25 recombinacion para anadir el gen hA de cualquier subtipo de la gripe emergente que se requiera para la produccion de la vacuna. Para vacunas de la gripe basadas en VLP, esto simplificara la clonacion necesaria y aumentara potencialmente la velocidad con la que pueden obtenerse nuevos tipos de VLP.

VLP del BTV1

30

A diferencia de la influenza, cuando pueden formarse VLP por la expresion de solo dos protefnas, las VLP del BTV requieren la expresion coordinada de cuatro protefnas estructurales (VP2, VP3, VP5 y VP7). Para demostrar adicionalmente la utilidad del nuevo sistema para recombinacion, se produjeron virus que expresaban cada protefna individualmente y la combinacion de las cuatro protefnas estructurales del BTV (figuras 6A-6C). Una de las ventajas 35 del nuevo sistema, es que los virus que expresan protefnas individuales y protefnas multiples, pueden hacerse a partir del mismo conjunto de vectores de transferencia. Esto facilita la produccion de virus control que expresan protefnas individuales que actuan como marcadores para la posicion de las protefnas co-expresadas en el complejo completo. Para las VLP del BTV se uso un conjunto diferente de loci de los usados en el ejemplo de la influenza (figura 6C). Ademas, el nuevo sistema se combino con el bacmido inactivado geneticamente orf1629 descrito por 40 Zhao et al., (12), para permitir el uso de un vector de transferencia convencional en el locus de polihedrina que expresa una de las subunidades del complejo. La formacion de VLP se confirmo por la morfologfa de las partfculas bajo EM de tincion negativa, combinada con la marcacion con inmuno-oro para una de las protefnas de la capside exterior (VP5) (figura 6D).

45 CCT de raton

La aplicacion de la presente invencion no se limita a la formacion de partfculas pseudovfricas. De hecho, dado que muchas protefnas celulares estan presentes en las celulas como complejos con mas de una subunidad, la formacion eficiente de estos complejos tiene aplicacion en una gama de campos. Para demostrar la utilidad del sistema para 50 otros estudios, se eligio el complejo de chaperonas CCT. Este complejo tiene implicaciones en la investigacion del cancer, y con 8 subunidades, representa un desaffo significativo para la expresion de protefnas. Por supuesto, no habrfa sido posible expresar este complejo en el sistema de baculovirus sin los vectores y procedimientos de la presente invencion. Se construyeron ocho vectores de transferencia, expresando cada uno una de las subunidades para el CCT de raton, y dirigido cada uno a un locus diferente, identificado en el ejemplo 3 anterior. Estos se usaron 55 para generar virus recombinantes que expresaban cada subunidad en solitario y combinaciones de subunidades. Para una de las subunidades (CCT25), se observo un fenotipo inusual cuando la protefna se sobreexpreso en las celulas. Se observaron agujas cristalinas en el interior de las celulas y, despues de la infeccion, cuando las celulas se habfan disuelto, se observaron placas cuadrilaterales de material cristalino en el medio de cultivo (figura 7). Se genero un esquema de purificacion para esta protefna, y este se suministro con condiciones de cristalizacion

preliminares y material de celulas infectadas para el colaborador para la parte de CCT del proyecto.

Aunque la expresion de algunas de las otras subunidades de CCT dio como resultado agregados visibles en las celulas despues en la infeccion, ninguna dio como resultado agregados con dicha apariencia regular.

5

Las 8 subunidades de CCT tuvieron expresion de alto nivel (figura 8A), y reaccionaron de forma cruzada con un antisuero policlonal producido para CCT de raton. Hubo cierta reaccion cruzada entre una de las subunidades de CCT de celulas de insecto endogenas y el anticuerpo policlonal (figura 8B, campo 9). Sin embargo, esta senal endogena solo se co-localizo con 3 subunidades (CCT1, CCT5 y CCT6), que se acumularon a alto nivel en las 10 celulas infectadas y de esta manera fueron claramente detectables. Las demas subunidades migraron como protefnas de masa molecular ligeramente diferente y, por lo tanto, pudieron distinguirse de las protefnas de las celulas de insecto basandose en la migracion.

CONCLUSIONES

15

Para los tres complejos de protefna, hubo claras diferencias en la acumulacion de la misma protefna recombinante cuando se expreso en solitario o en presencia de otras protefnas. En casi todos los casos, hubo una reduccion en el nivel de expresion de protefnas cuando las multiples protefnas se expresaron a partir del mismo virus. Esto era de esperar hasta un cierto punto. La competencia por protefnas requeridas para transcripcion, el procesamiento del 20 ARN, la traduccion y el plegamiento de las protefnas pronosticara que dos genes de baculovirus altamente expresados tendran menor expresion juntos que por separado. Sin embargo, lo que fue sorprendente tanto para los ejemplos de VLP del BTV como de cCt, fue que la reduccion en la expresion de las protefnas fue variable entre los diferentes loci geneticos. Por ejemplo con el BTV, VP2, VP5, VP3 y VP7 dieron como resultado una acumulacion significativa y similar de protefnas cuando se expresaron como tales. Sin embargo, al combinarse en un baculovirus 25 individual que expresaba las cuatro protefnas, VP2 y VP3 se acumularon a menores niveles que VP5 y VP7 (figura 6A). Este efecto no puede explicarse por el efecto de la posicion de la integracion genomica, puesto que tanto en virus individuales como cuadruples, los genes se expresaron a partir de los mimos loci geneticos. Una explicacion posible serfa que el efecto se debio a los diferentes promotores que se usaron para los diferentes genes. Tanto VP5 como VP7 se expresaron bajo el control del promotor de p10, y VP2 y VP3 estaban bajo el control del promotor de 30 polihedrina. Esto sera consistente con un informe en la bibliograffa, donde la delecion del gen p10 dio como resultado el aumento de expresion del locus 13 de polihedrina. Por lo tanto, se pronosticara que la duplicacion del promotor de polihedrina en presencia de dos promotores de p10, reduce selectivamente la expresion de los genes dirigidos por el promotor de polihedrina. Sin embargo, esta no puede ser una explicacion completa para el efecto observado en el caso del complejo de CCT. Tanto CCT5 como CCT2 se expresaron a partir del promotor de p10, y 35 dieron altos niveles de estado estable de protefna recombinante cuando se expresaron en solitario (figura 8A y figura 8B, campos 2 y 5). Sin embargo, cuando se combinaron en el mismo virus, la expresion de CCT5 se redujo sustancialmente en comparacion con CCT2 (figura 8A y figura 8B, campo 10). A partir de estos datos, otras secuencias que actuan en la posicion cis presentes en el locus p10 pueden estar contribuyendo a la expresion relativa mejorada de CCT2 y VP5 del BTV, que se insertaron en este locus. La expresion aparente relativamente 40 baja de hA de la influenza al insertarse en el mismo sitio, puede estar mas relacionada con el cambio de esta protefna en el ER, en lugar de los efectos de la transcripcion. Tanto CCT2 como VP5 se acumulan en el citoplasma.

Los inventores han mejorado la eficiencia del sistema de recombinacion ET como se aplica a baculovirus, hasta el punto de que puede usarse para la insercion de rutina de casetes de expresion para protefnas recombinantes. 45 Ademas, se han identificado siete loci geneticos (ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 y odv-e56) que pueden usarse para la expresion de alto nivel de protefnas, y demostraron que pueden ensamblarse complejos de multiples protefnas usando este sistema, usando tres ejemplos (influenza A, VLP del BTV y complejo de CCT).

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   I. Un vector de transferencia para insertar un gen en un locus genetico de una secuencia de baculovirus que comprende:

   5 un casete de expresion que comprende un promotor eucariota unido operativamente al gen;

   un casete de seleccion bipartita flanqueado por secuencias de recombinacion LoxP donde dichas secuencias LoxP estan modificadas para asegurar que unicamente puede producirse una unica ronda de recombinacion que comprende:

   (i) una secuencia expresable que codifica un primer marcador seleccionable; y 10 (i) una secuencia expresable que codifica un segundo marcador seleccionable; y

   secuencias que flanquean los casetes de expresion y de seleccion bipartita, donde las secuencias corresponden sustancialmente a secuencias del locus genetico en la secuencia de baculovirus, permitiendo de este modo la recombinacion homologa entre el vector de transferencia y el baculovirus.

   15 2. El vector de transferencia de la reivindicacion 1, donde el primer marcador seleccionable es un

   marcador visual.

   3 El vector de transferencia de la reivindicacion 2, donde el primer marcador es el fragmento LacZalfa.

   20 4. El vector de transferencia de la reivindicacion 1, donde el segundo marcador seleccionable confiere

   resistencia a un antibiotico.
2. 5. El vector de transferencia de la reivindicacion 4, donde el gen resistente a antibioticos confiere resistencia a fleomicina.

   25
3. 6. El vector de transferencia de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las secuencias que flanquean los casetes de expresion y de seleccion bipartita corresponden sustancialmente a secuencias de uno cualquiera de los siguientes loci geneticos: ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2, odv-e56 y p10.

   30 7. Un procedimiento para producir un bacmido recombinante que comprende:

   a. poner juntos un bacmido y el vector de transferencia de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para permitir una recombinacion homologa; y

   b. seleccionar un bacmido recombinante que comprende el casete de expresion y el casete de seleccion bipartita.

   35 8. El procedimiento de la reivindicacion 7 que comprende adicionalmente hacer que la recombinacion

   entre las secuencias LoxP eliminen el casete de seleccion del bacmido.
4. 9. Un procedimiento para producir un baculovirus recombinante que comprende producir un bacmido recombinante mediante el procedimiento de la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8, y cultivar una celula eucariota

   40 que contenga el bacmido de manera que se produzca un baculovirus.
5. 10. Un bacmido recombinante que comprende el casete de expresion y el casete de seleccion bipartita flanqueado por las secuencias de recombinacion LoxP modificadas como se caracteriza en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

   45

   II. Un baculovirus recombinante que comprende el casete de expresion y el casete de seleccion bipartita flanqueado por las secuencias de recombinacion LoxP modificadas como se caracteriza en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

   50 12. Un bacmido recombinante de acuerdo con la reivindicacion 10 que expresa una pluralidad de

   protefnas, donde cada protefna se expresa a partir de un locus genetico separado del bacmido.
6. 13. Un baculovirus recombinante de acuerdo con la reivindicacion 11 que expresa una pluralidad de protefnas, donde cada protefna se expresa a partir de un locus genetico separado del baculovirus.

   55
7. 14. El bacmido recombinante de la reivindicacion 12 o el baculovirus recombinante de la reivindicacion 13, donde la pluralidad de protefnas interactua para formar un complejo de protefnas.
8. 15. El bacmido recombinante o el baculovirus recombinante de la reivindicacion 14, donde el complejo de

   protefnas es una partfcula pseudovfrica.
9. 16. El bacmido recombinante de la reivindicacion 12 o el baculovirus recombinante de la reivindicacion 13, donde los loci geneticos separados se seleccionan de entre ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2, y odv-e56.

   5
10. 17. Una celula que contiene un vector de transferencia de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un bacmido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10, 12, 14 a 16, o un baculovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 13 a 16.

    10 18. Un procedimiento para producir una o mas protefnas que comprende cultivar el bacmido recombinante

    de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10, 12, 14 a 16, o un baculovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 13 a 16 en las condiciones adecuadas.