CN102245777B

CN102245777B - 杆状病毒载体

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Publication number: CN102245777B
Application number: CN200980144325.4A
Authority: CN
Inventors: P·罗伊; R·J·诺德
Original assignee: London School of Hygiene and Tropical Medicine
Current assignee: London School of Hygiene and Tropical Medicine
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2009-11-11
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2029-11-11
Also published as: CL2011001056A1; GB0820631D0; CO6420360A2; US20110281261A1; RU2014145441A; ES2616855T3; ZA201203945B; CL2015000113A1; EP2358883B1; JP2012508004A; MX340956B; ZA201103286B; PH12014501252A1; UA106733C2; US20160090575A1; RU2011114814A; KR20110089420A; AU2009315471A1; CA2740714A1; WO2010055292A3

Abstract

本发明涉及用于将基因插入到杆状病毒序列的基因座中的转移载体。所述转移载体包括表达框，该表达框包括与基因可操作地连接的真核启动子，和双向选择框。本发明还涉及使用该转移载体及衍生的杆粒和杆状病毒的方法。

Description

杆状病毒载体

本发明涉及用于将基因插入到杆状病毒序列的基因座中的转移载体。本发明还涉及使用转移载体和衍生的杆粒和杆状病毒的方法。

已经将杆状病毒表达系统用于在真核细胞中表达数以千计的蛋白质用于结构和生物化学研究(14)。除了表达单个重组蛋白的能力之外，杆状病毒系统也已用于共同表达形成复合物的多种蛋白(15-22)。这一点是重要的，因为基因组范围内的相互作用的筛选揭示了活细胞的多种关键功能是由多亚基蛋白复合物完成的(23)。已经使用了两种主要的策略利用杆状病毒系统实现蛋白质的共表达。使用各自表达一种重组蛋白的两种或者多种病毒共感染细胞是目前为止最常见的方法(19，24，25)。然而，这些研究中蛋白质复合物的产率通常变化很大并且由两种不同的杆状病毒共感染相同的细胞不满足泊松分布(poissondistribution)(26)。因此，尽管共感染方法在技术上简单，但在实践中其仅限于相对简单的复合物的回收，用于不需要大量纯化蛋白的应用。

对于例如结构研究和需要多种蛋白质的大规模的疫苗试验的应用而言，以及对于由多个亚基形成的更加复杂的复合物而言，使用了共表达来自插入到多角体蛋白或者P10位置的多个类似表达框中的的蛋白质的可选方法(15-18，22，27)。该方法的优点在于在培养物中的每一个被重组病毒感染的细胞都以可再生的方式表达形成蛋白质复合物所需要的蛋白质。将共感染和单独杆状病毒方法进行比较时，单独杆状病毒方法证明具有显著更高的重组复合物产率(28)。然而，使用单独的重组病毒表达多种蛋白质并不是没有缺点。尽管棒状的杆状病毒看起来似乎对于其基因组中的插入相当有耐受力，但基因是通过同源重组转移到病毒，同时转移载体的尺寸必须容易在大肠杆菌中操作。因此，对于能插入到转移载体中的基因的数目有限制。在实践中，这意味着不大可能表达来自单个座位上的多于4种的蛋白质。除此之外，杆状病毒含有表达蛋白质的序列，该蛋白质促进同源重组(29-32)。因此，含有大量重复序列的病毒容易发生重排和重组(21，33，34)。

通过在杆粒的chiA/cathepsin基因座插入loxP位点，修改了单独杆状病毒共表达的方法，所述的杆粒已经在多角体蛋白基因座上含有Tn7的靶点(20)。这使得通过在大肠杆菌中的重组在这些基因座的每一个中插入多个表达框。正如假定这个系统依赖于经过修饰以表达不同基因的表达框的重复复制所预料的那样，有证据显示插入到该系统中在某种程度上在遗传上不稳定(21)。

最近的杆状病毒研究受益于ET重组系统的使用，该重组系统使得能够选择性地敲除病毒的基因(35-49)。然而，还未检验这种技术改造和促进在p10和多角体蛋白之外的基因座上表达蛋白的潜力。

本发明涉及从单个的杆状病毒基因组中有效地表达多种重组蛋白质(即杆状病毒蛋白质)的方法。该方法使得能够使用ET重组系统在病毒基因组内的不同基因座上有效地插入单个的蛋白质表达框。除此之外，该方法使得能表达具有多个亚基的复合物。

已经完善地建立了使用杆状病毒作为表达系统来表达单个的蛋白质。该表达系统的基本方法学自从其首次产生以来变化很小。到133kb时杆状病毒的dsDNA太大无法直接操作。因此将编码外来蛋白质的基因在大肠杆菌中克隆到含有来自AcMNPV昆虫病毒的表达框的载体中，随后将其与病毒DNA一起引入到昆虫细胞中，在昆虫细胞中病毒和细胞的蛋白质介导同源重组，导致表达外源蛋白质的感染性(相对于昆虫细胞)病毒的产生。在这一主旨下，已经产生了一些变化，包括如果发生重组仅仅复制的病毒基因组(1，2)，和在大肠杆菌中使用杆粒进行重组从而加快重组病毒的选择，所述的杆粒基于转位子Tn7(3)的使用。通过使用以上简述的杆状病毒表达系统，还实现了多蛋白复合体在昆虫细胞中的表达。最初使用各自表达单一蛋白质的多种病毒共感染易感细胞和在表达之后纯化的蛋白质复合物。然而，这充其量也没有效力并且重复性不足以用于扩大规模。作为选择，生产了将多个表达单元整合但是与单个的病毒基因座重组的载体(4-6)。这些载体的优点在于它们在每一个受感染的细胞中生产全部的重组蛋白亚基，并导致显著更高的重组蛋白复合物的产率。除此之外，由于仅有一种病毒表达所有的蛋白，感染的结果更加具有可重复性。这些载体的缺点是双重的。首先，该载体含有重复的序列，并且所述的杆状病毒表达促进同源组合、表达的蛋白质，尤其是来自含有三个或者四个表达单元的蛋白质，并且所述的蛋白质通过大量的病毒传代(其在工业规模中对于杆状病毒蛋白质表达是必要的)并不总是在遗传上非常稳定。第二，实践中对于可以在大肠杆菌中容易保持和操作的插入物的大小有限制，限制了可以从这些载体中表达的蛋白质的数目。为了生产多种蛋白质，提出的另一种方法是在杆状病毒的一个基因座上插入外来蛋白质，随后选择表达该蛋白的病毒，并使用该病毒基因组在第二个基因座上重组，从而表达其他的蛋白质(7)。然而，由于在此方法中涉及的高水平的技术技能和时间的量(第一个座位16天以及各个随后的座位各25天)，这种方法基本未曾使用。最近的开发旨在修饰基于BAC的Tn7转位子，以便在杆状病毒的第二个基因座中插入LoxP位点，从而使得能在大肠杆菌中的该座位上插入额外的基因(8)。然而，本方法仍然存在下述问题，即在细菌载体中来自启动子的复制的重复序列意味着对于多个病毒传代而言，该构建物在遗传上不稳定，并且转移载体会迅速地达到在大肠杆菌中操作的最大实际尺寸。

本发明的方法克服了现有方法中固有的至少一些问题，例如遗传不稳定性，以及对多轮重组的需要。

根据第一个方面，本发明提供了用于将基因插入到杆状病毒序列的基因座中的转移载体，该转移载体包括：

表达框，所述表达框包括与基因可操作地连接的真核启动子；

双向选择框，该双向选择框包括：

(i)编码第一个选择标记的可表达序列；和

(ii)编码第二个选择标记的可表达序列；和

位于表达和双向选择框侧翼的序列，其中所述的序列大体上对应于杆状病毒序列中基因座的序列。

本发明的转移载体可以用于将基因有效地插入到杆状病毒序列的基因座中，并选择包含该基因的杆状病毒序列。特别地，已经发现，与使用单个选择标记相比，通过使用双向选择框，阳性克隆(即含有所插入的基因的杆状病毒序列)的鉴定获得了大幅度增加。这与使用单个的选择标记相比，具有显著优势。仅有少量的杆状病毒被转化，所以标记仅仅以很低的水平表达。例如，如果该标记具有抗生素抗性，则只能使用非常低水平的抗生素。这导致了对细菌变体的选择，该细菌变体对于所使用的抗生素具有抗性。因此，一些在平板上生长的细菌可以不含有修饰。使用两种阳性选择方法克服该假阳性的选择。

本发明的转移载体可以是任意适用的载体，只要其能够通过同源重组与杆状病毒序列重组，从而将基因插入到杆状病毒的序列中。适用的转移载体对于本领域技术人员而言是熟知的。所述的转移载体的关键特征在下文中进一步地讨论。

插入到杆状病毒序列中的基因可以是任意的异源基因(即非杆状病毒基因)。优选的是该异源基因编码蛋白质复合物的亚基。所述异源基因可以编码病毒蛋白、受体的组分或者分子伴侣复合物。尤其优选的是，该异源基因编码病毒蛋白，该病毒蛋白与其他的病毒蛋白一起可以形成病毒样颗粒(VLP)。

基因插入到杆状病毒序列处的基因座可以是任意适用的基因座，该基因座允许所插入的基因的表达，并且不阻碍杆状病毒序列复制的能力。此外，所使用的座位不应该影响杆状病毒感染细胞的能力，即复制或者从细胞传播到细胞的能力。该座位包括多角体蛋白和p10座位。此外，本发明人鉴定的其他适用的座位包括ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56。

所述的杆状病毒序列可以是能够在昆虫细胞及原核细胞如大肠杆菌中复制的任何适用的杆状病毒。特别地，可以使用含有BAC复制子的任何病毒性杆状病毒基因组。适用的杆状病毒序列包括AcMNPV杆粒。

术语“表达框”指基因表达所需的元件的组合。因此，表达框包括适合的启动子，从而使得所编码的基因在真核细胞细胞(即昆虫细胞)中表达，以及位于基因序列侧翼的适合的聚腺苷酸化信号序列。用于在真核细胞中表达基因的表达框对于本领域的技术人员而言是熟知的。特别优选的启动子包括杆状病毒晚期启动子(例如p35)或者病毒性极晚期启动子(例如多角体蛋白和p10启动子)。适合的聚腺苷酸化信号序列包括色氨酸羟化酶(Tph)聚腺苷酸化序列，或者来自杆状病毒基因的聚腺苷酸化序列。

所述的表达框可以包含不止一个基因(例如2、3或者4个基因)，这导致不止一个基因的表达。然而，通常优选的是所述表达框包括单个的基因。

已经发现所述的双向选择框提高了已成功接受基因的克隆的鉴定和分离。所述的双向选择框包含2个不同的选择标记。所述的框还包含在细菌细胞中表达标记所需的任意元件，如一个或多个细菌启动子。选择已接受基因的序列的步骤包括选择包括两个选择标记的序列。这一选择步骤在细菌细胞，如大肠杆菌中进行。所述的选择标记可以是使得细胞含有要选择的框的任何标记。例如，所述的标记可以是可视的，例如导致细胞或者菌落出现颜色或者颜色变化的标记。可选地，该标记可以赋予例如对抗生素的抗性。两个选择标记可以是同样类型的标记，例如耐受两种不同的抗生素，或者不同类型的标记，例如抗生素抗性和可视的标记。第一个选择标记优选地为可视的标记，例如LacZalpha片段，该标记使得表达LacZalpha片段的细胞在IPTG和X-gal的存在下显示蓝色。第二个选择标记优选地是任意的赋予抗生素抗性的标记，例如对氯霉素、四环素、嘌呤霉素、氨苄西林、青霉素、阿泊拉霉素、卡那霉素或者腐草霉素产生抗性。特别优选的是，第二种标记赋予对腐草霉素的抗性。

在优选的实施方案中，所述的双向选择框的侧翼为LoxP重组序列。在Cre重组酶的存在下，LoxP重组序列的联合在一起，导致内含子的缺失。因此，当将任意附加的基因插入到杆状病毒序列中时，可以将所述的双向选择框除去，从而使得可以使用同样的选择标记。优选地，对所述的LoxP位点进行修饰从而确保在位点之间仅发生单轮重组。适用的经修饰的LoxP位点对于本领域的技术人员而言是已知的，例如经修饰的Lox66和Lox71位点。

在表达框和双向选择框侧翼的序列基本上对应于基因座的序列，使得在转移载体和杆状病毒序列之间能发生同源重组。每个侧翼序列的长度优选地至少20bp，更优选地至少30bp，以及甚至更优选地至少50bp，并且具有允许与基因座的序列发生特异性重组的序列。

根据第二个方面，本发明提供了生产重组杆粒的方法，该方法包括：

将杆粒和根据本发明第一个方面的转移载体结合在一起从而允许同源重组发生；和

选择包含双向选择框的重组杆粒。

重组杆粒可以使用标准技术进行选择，所述的技术取决于所述双向选择框。

用于生产重组杆粒的方法可以额外地包括检测杆粒或者其表达产物中基因的存在。根据具体的基因可以使用合适的筛选方法。

除此之外，如果选择框侧翼是LoxP重组序列，则所述的方法优选地包括在LoxP位点之间诱导重组，例如，通过将杆粒暴露于Cre重组酶，从而将双向选择框除去。所述的Cre重组酶优选地由可诱导启动子，例如阿拉伯糖启动子控制。除去双向选择框的优点在于，可以将另外的转移载体与该杆粒进行重组，其中所述的另外的转移载体包含相同的双向选择框。可以使用与下述第一轮重组中相同的技术选择用于进一步重组的杆粒。

一般地说，生产重组杆粒的方法在原核细胞中进行，由于基于原核细胞的系统的操作更容易，也更快。优选的是，所述的基于原核细胞的系统是有助于同源重组的，该系统包括λred重组系统(lambdaredrecombinationsystem)，其描述于第EP-A-1291420号欧洲专利申请中。优选地，生产重组杆粒的方法在大肠杆菌中进行。尤其优选的是，使用大肠杆菌细胞系EL350进行该方法，大肠杆菌细胞系EL350具有在温度调节的λPL启动子的控制下，表达exo、bet和gam的整合的λ原噬菌体，以及在阿拉伯糖可诱导启动子的控制下的Cre重组酶。

生产重组杆粒的方法可以重复多次，所以该杆粒可以含有多个异源基因，即1、2、3、4、5、6、7、8个或者更多的异源基因。通过努力将不同的启动子用于表达各个插入的基因，并且由于各个基因插入在不同的基因座上，因此有可能减少或者避免在杆粒中有重复的序列，从而确保杆粒具有好的遗传稳定性。进一步优选的是，至少有一个必需基因位于各个插入的异源基因之间。此种排列确保了如果在任意的插入的序列之间发生同源重组，则必需基因将缺失，从而产生无活性的杆粒。

根据第三个方面，本发明提供了根据本发明的第二个方面的方法得到的重组杆粒。所述的杆粒包括插入的基因，并且也可以包括LoxP序列的剩余部分。这些剩余部分可以用作鉴定杆粒的标记。所述的杆粒优选地含有至少6、7、8或9个异源基因。

根据第四个方面，本发明还提供了生产重组杆状病毒的方法，该方法包括培养含有重组杆粒的真核细胞，所述的重组杆粒通过根据本发明的第二个方面的方法得到，从而生产杆状病毒。

优选地，所述的真核细胞是昆虫细胞，更优选地得自昆虫草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)或者粉纹夜蛾(Trichoplusiani)，例如(Sf21、Sf9或者TN5B-1-4)昆虫细胞。可以使用标准技术分离杆状病毒，并可以检测所插入的异源基因的表达。

根据第五个方面，本发明还提供了由根据本发明第四个方面的方法得到的重组杆状病毒。

根据第六个方面，本发明还提供了表达多种异源蛋白质的重组杆粒或者重组杆状病毒，其中各个蛋白质从所述杆粒或者杆状病毒的单独基因座上表达。进一步优选的是，至少一个必需基因位于各个表达异源蛋白质的基因座之间。此种排列确保了如果在表达异源基因的基因座之间发生同源重组，则非必需基因将缺失，从而产生无活性的杆粒或杆状病毒。优选地，杆粒或者杆状病毒表达至少3种，更优选地至少5种，以及最优选地至少8种蛋白质。所述的蛋白质是异源的，即其不由天然存在的杆状病毒编码。进一步优选的是，所编码的异源蛋白质是蛋白质复合物的亚基，所述的蛋白质复合物如VLP、受体复合物或者分子伴侣复合物。

进一步优选的是，重组杆粒或者杆状病毒的分离的基因座选自ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、odv-e56和p10。参考下表1中的杆状病毒AcMNPV对该基因座的位置进行具体描述。本领域的技术人员能够使用此信息，容易地确定在其他杆状病毒毒株和杆粒中的座位的位置。

表1

对照AcMNPV(保藏编号为NC001623)的参考保藏序列对以上提及的基因座定义如下。

根据第七个方面，本发明还提供了重组杆粒或者重组杆状病毒，其中将编码异源蛋白质的表达框插入到下列基因座的一个或者多个中：ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56。

已经发现这些基因座尤其地允许异源蛋白质的高水平表达，而不干扰所述杆粒或者杆状病毒的必要功能。

优选地，所述的重组杆粒或者重组杆状病毒编码多种蛋白质，各个表达框插入到不同的基因座中。进一步优选的是，所述的重组杆粒或者重组杆状病毒编码至少3种，更优选地至少5种，以及最优选地至少8种蛋白质。进一步优选的是，所编码的异源蛋白质是蛋白质复合物的亚基，所述的蛋白质复合物如VLP、受体复合物或者分子伴侣复合物。

根据第八个方面，本发明还提供了用于将基因插入到杆状病毒序列的基因座中的转移载体，所述的转移载体包括：

表达框，该表达框包括与基因可操作地连接的真核启动子；和

位于表达框侧翼的序列，其中所述的序列基本上对应于杆状病毒序列中的基因座的序列，其中所述的基因座选自：ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56。

如前文中所指出的，已经发现通过在所列举的基因座中插入基因，可以获得基因的高水平表达，而不干扰杆状病毒序列的必要功能。

根据第九个方面，本发明还提供了用于生产重组杆粒的方法，所述的方法包括：

将杆粒和根据本发明第八个方面的转移载体结合在一起，从而允许发生同源重组；和

选择出包含表达框的重组杆粒。

用于生产该重组杆粒和选择该杆粒的方法对于本领域技术人员而言是熟知的。本发明还提供了通过这种方法得到的重组杆粒。

根据第十个方面，本发明还提供了用于生产重组的杆状病毒的方法，该方法包括通过本发明的方法生产重组杆粒，并培养含有该杆粒的真核细胞，从而生产杆状病毒。

用于生产该重组杆状病毒的方法对于本领域技术人员而言是熟知的。本发明还提供了通过该方法得到的重组杆状病毒。

本发明还提供了含有根据本发明任意方面的转移载体、杆粒或者杆状病毒的细胞

本发明还提供生产一种或多种蛋白质的方法，该方法包括在适宜的条件下，培养根据本发明任意的方面的重组杆粒或者杆状病毒。所述的一种或多种蛋白质由一个或多个基因编码并且可以结合形成蛋白复合物，如VLP或者分子伴侣复合物。所述的一种或者多种蛋白质可以使用本领域技术人员所熟知的标准技术进行分离。

现结合附图，仅通过实例的方式描述本发明。

图1显示了从ET克隆中对重组体的改进的选择。A)用于cat和双向重组的DNA的草图。两种构建具有相同的杆状病毒侧翼序列(AcMNPV)、海肾荧光素酶表达框(Pp35-Rluc-Tph)和loxP位点(LoxP)。双向选择标记也具有zeocin抗性基因(ZeoR)和LacZα片段。在氯霉素抗性构建中，用cat基因替代ZeoR和LacZα片段。B)在ET重组之后，阳性细菌菌落的数量。如图所示，用于重组的DNA通过PCR或者限制性酶切进行制备。C)通过采用转移的DNA中的一个引物和杆状病毒DNA中的靶座位侧翼的一个引物的PCR，来确认Rulc表达框的正确插入。正确的PCR产物(标有箭头)仅在正确的整合之后产生。显示了12次独立的重组(1-12)的结果、无模板PCR对照(13)、未修饰的杆粒模板(14)和转移DNA模板(15)。泳道M是DNA分子量标准(markerDNA)。D)在细胞裂解液中感染之后48小时的海肾荧光素酶活性(相对光单位(LU))，该细胞裂解液来自用C的第2代重组杆粒1-12感染的细胞。在未感染的(细胞)和未修饰的杆粒(AcMNPV)感染的细胞等量的裂解液中，背景活性低106倍以上。

图2显示了标记基因的选择性除去。A)显示了将表达框(表达)通过ET重组进入AcMNPVBacmidDNA中的策略，以及通过Cre介导的重组选择性地仅除去标记基因(选择)的草图。B)使用在A中标记有a和b的引物的PCR，泳道1-2：ET重组之后的两种独立的杆粒重组体，泳道3-6：Cre介导的重组以除去细菌的选择标记的四种独立的重组体，泳道7：没有模板，泳道8：未修饰的杆粒DNA模板，泳道9：含有选择标记框的质粒DNA模板，泳道10：DNA分子量标准(marker)。将与预计用于亲代的大小相一致的PCR产物和Cre介导的重组的重组产物分别标记为P和R。C)来自B中的PCR分析的代表性重组体的测序轨迹文件(Sequencingtracefile)，证实了存在包含loxP71和loxP66臂的缺陷loxP，这使得重组体不能进行进一步的Cre介导的重组。D)来自B的亲代和重组杆粒在转染到昆虫细胞中时的海肾荧光素酶活性。海肾荧光素酶活性在重组病毒的传代之后，在感染后48小时进行检测。将未感染的细胞中的背景活性标记为细胞。

图3显示了用于在AcMNPV基因组中表达重组蛋白质的额外位点的鉴定。A)AcMNPV的草图，该图显示了用于蛋白质表达的座位的相对位置。B)显示了用于插入的基因座和对基因座进行任何额外改变的表。C)采用经修饰以便在所指出的每个基因座上包含额外的萤火虫荧光酶表达框的病毒感染后48小时的相对海肾荧光素酶活性。在p35启动子控制下，全部的病毒在p10座位上具有相同的海肾荧光素酶表达框。误差条表明每个座位上五次重复的标准差。D)显示插入在如图所示的每个座位上的多角体蛋白启动子-萤火虫荧光素酶多角体蛋白终止子框的相对表达的标准化的萤火虫荧光素酶活性。误差条表明每个座位上五次重复的标准差。萤火虫荧光素酶使用从同一基因组中表达的海肾荧光素酶对照进行标准化。由于海肾荧光素酶水平低于对照病毒2个log以上，因此将插入在orf11、v-fgf、pe和orf23座位上的萤火虫荧光素酶排除。病毒Ph在多角体蛋白座位上具有萤火虫荧光素酶，在p10座位上具有海肾荧光素酶。病毒Ph^*具有相同的p10海肾荧光素酶插入，但是没有萤火虫荧光素酶插入。

图4显示流感M1从egt和多角体蛋白座位上的表达。左侧的平板显示了用对照杆状病毒(泳道1和4)、egt-M1(泳道2)和YM1-M1(泳道3)感染的细胞中总蛋白的考马斯亮蓝染色的SDSPAGE凝胶。蛋白质分子量标准(泳道M)的大小显示于凝胶的左手侧。右侧的平板显示了使用抗-H7N7抗血清作为探针的相同凝胶的蛋白质印迹(Westernblot)。

图5显示了M1和HA流感的共表达和VLP的形成。A)左侧的平板显示了总蛋白的考马斯亮蓝染色的凝胶；右侧的平板显示了抗-H7N7流感病毒血清作为探针的蛋白质印迹。使用两种表达HA和M1的杆状病毒(泳道1)、仅表达HA的杆状病毒(泳道2)、细胞对照(泳道3)、仅表达M1的杆状病毒(泳道4)感染细胞。B)流感VLP的阴性染色EM图像。C)箭头指向使用金颗粒进行免疫金(HA)标记的流感VLP。

图6显示了共表达4种蛋白质的杆状病毒的生产。A)来自用杆状病毒感染的细胞的细胞裂解液，所述的杆状病毒表达VP2(泳道1)、VP5(泳道2)、VP3(泳道3)和VP7(泳道4)，未感染的细胞(泳道5)，或者表达全部的4种蛋白质(泳道6-10)，并且标出了蛋白质分子量标准(M)的位置和大小(kDa)。B)表达VP5、VP2、VP3、VP7(泳道1-4)以及部分纯化的VLP(泳道5)的细胞的细胞裂解液。C)显示插入的座位和用于表达每种BTV蛋白质的病毒启动子的表格。D)显示纯化的BTVVLP的免疫金阴性染色的EM(对于VP5)。

图7显示了在CCT5的过表达时形成的结晶板。在使用表达CCT5的杆状病毒感染的极晚期的培养基中的四边形蛋白质聚集物。

图8显示了CCT在昆虫细胞中的表达。A)来自感染了杆状病毒的细胞的，由考马斯亮蓝染色的细胞裂解液，所述的杆状病毒表达CCT1-CCT8(分别为泳道1-8)，仅有细胞(泳道9)或者表达7个CCT亚基的杆状病毒(泳道10)。B)使用多克隆的抗小鼠CCT抗血清在相同的凝胶中进行蛋白质印迹。C)显示用于表达各个CCT亚基的不同的基因座，以及启动子的表。

实施例

杆状病毒表达系统已经完善地建立了用于生产大量正确折叠的真核蛋白的潜力，所述的真核蛋白用于酶研究和结构研究。然而，越来越清楚的是，多种(即使不是大部分)蛋白质作为由几种不同的基因的产物所构成的复合物在细胞内有活性。考虑到蛋白质结构的发现速度的加快，对于建立用于快速和可靠生产和纯化蛋白质复合物的表达系统，有着切实的需要。对于需要多个蛋白质亚基同时表达、真核折叠和加工的更大复合物而言尤其是这样。此前，本发明人开发了能够在同一个杆状病毒基因组中表达2、3、4和5种蛋白质的杆状病毒转移载体。本发明人在过去的研究中的主要目标在于生产出能够合成大量的病毒蛋白质复合物的系统，所述的病毒蛋白质复合物含有用于结构研究和酶研究的非等摩尔量的病毒。从使用这些系统的经验中观察到的现象之一是表达多个基因的单个杆状病毒在形成所期待的蛋白质复合物方面，比使用多种表达单个基因的杆状病毒共感染昆虫细胞更为有效。在本研究中，发明人使用了新技术来开发这一观察现象用于生产重组杆状病毒，所述的重组杆状病毒表达用于生物上相关的哺乳动物蛋白质复合物的多种蛋白。

尤其地，本发明人适应并改进了新型的细菌染色体加工技术，从而快速和有效地生产同时表达多种蛋白质的重组杆状病毒。所开发的新系统与传统方法相比效率高30倍，并使得能在杆状病毒基因组内的任意座位上常规插入基因。这些研究使得在杆状病毒基因组内鉴定7个新的基因座，从而使得能够以高水平表达重组蛋白质。此外，本发明人证明了可以进行多轮重组，从而产生病毒基因组，所述的病毒基因组从分开的单个基因插入中表达复合物中多种蛋白质。例如，本发明人表达了流感A(H7亚型)和蓝舌病毒(血清型1)的VLP蛋白质复合物，以及8亚基的哺乳动物分子伴侣复合物CCT(TCP)，这是癌症研究的焦点。

材料和方法

通过使用λred重组，在大肠杆菌中实现了多座位的单基因插入。本发明包括之前尚未用于多蛋白表达的杆状病毒座位的应用，以及选择标记的掺入，所述的选择标记可以从杆状病毒基因组中除去并随后重复使用。不像其他的系统，重组蛋白质基因的侧翼没有重复序列，提高了其遗传稳定性。

转移载体包括靶向同源重组的AcMNPV区域、表达框(AcMNPV启动子、多接头、聚腺苷酸化信号)和细菌选择框。所使用的AcMNPV启动子来自病毒晚期(如p35)或者极晚期(如多角体蛋白、p10)基因。所述的细菌选择框由突变的LoxP位点-细菌选择标记-突变的LoxP位点组成。突变的LoxP位点为LoxP66和LoxP71变体上的变体(9)。用于每个选择标记的LoxP位点设计为使得重组时，该标记缺失，从而破坏保留的LoxP位点。每个选择标记具有不同的LoxP突变臂，从而在插入到同一个杆状病毒中的不同的选择标记基因之间不发生重组。

用于重组蛋白质的多基因座表达的系统的选择

原始的研究计划涉及使用昆虫细胞内的同源重组，或者大肠杆菌中ET重组的替代方法，从而允许在杆状病毒基因组内的不同座位上，有效地插入重组蛋白的表达框。我们的初步数据显示，在除了所产生的重组蛋白之外没有阳性选择的座位(p10)上，转移载体的线性化导致重组频率显著增大(高达～30％)。在研究项目的开始，考虑了两种系统(ET重组和昆虫细胞重组)的重复性和用于在特定位点完成重组基因的插入和检查产生的蛋白质的表达所花费的时间。在每轮表达所用的时间而言，ET重组系统更快，这主要是由于制备杆状病毒基因组所需要的时间减少，所述的杆状病毒基因组用于在杆状病毒的第二个基因座上插入基因。除此之外，有可能设计能不依赖于转基因表达而确认基因插入的方法，并且因此在昆虫细胞中生长病毒从而检查表达的需求与基于整个昆虫细胞的系统相比不太重要。其次，尽管有可能在杆状病毒中共引入具有插入基因的标记，但该标记的数目是有限的，并且每个标记仅能使用一次。由于本项目的目标之一在于表达小鼠的CCT(TCP1)复合物(8个亚基)，因此采用ET重组方法用于早期的研究重点，因此此系统更快并且更能够容纳多种基因插入。

实施例1

允许有效选择ET重组的试剂的开发

使用ET方法的最初实验令人失望。进行了这样的实验，将报告基因(荧光素酶)插入到细菌的人工染色体中，并且通过与荧光素酶报告基因一起整合的氯霉素抗性基因进行选择，所述的染色体携带全长的AcMNPV基因组(杆粒)。尽管回收了氯霉素耐受的细菌菌落，但随后的分析显示它们不含由荧光素酶报告基因正确修饰的杆粒。当报告基因变为GFP时，得到了类似的结果，该报告基因被设计为在复制中的AcMNPV存在时仅仅在昆虫细胞中被表达。然而，当将GFP构建用于在大肠杆菌内的重组而没有氯霉素选择时，并为了整个转化的大肠杆菌群体制备杆粒DNA，随后将该DNA转染到昆虫细胞(Sf21)中时产生少数荧光焦点。这些数据表明，问题不在于重组自身，而是在于含有插入的细菌的重组之后选择。为了克服这些问题，本发明人设计了新的选择框，所述的选择框包含基于侧翼具有经修饰的LoxP位点(图1A)的LacZα片段和Zeocin抗性基因的双向标记系统。使用此系统时，在选择平板中加入足够的Zeocin从而减少而非排除背景菌落的生长，并且在IPTG和X-gal的存在下，根据蓝色的菌落表型选择重组体。为了使用氯霉素(cat)和双向选择系统评估回收重组体的相对效率，本发明人进行了实验，在该实验中，采用30ng(～12.5fmol)的基于氯霉素的选择框或者双向选择框(图1B)对含有未修饰的杆粒的重组感受态大肠杆菌进行电穿孔。由于用于掺入外来蛋白质编码序列的理想系统不涉及所插入基因的重复PCR，本发明人还比较了经PCR扩增后的DNA和经过限制性酶释放、凝胶纯化的DNA之间的重组效率，所述的经PCR扩增后的DNA是ET重组的例行程序。将PCR的引物设计为PCR产物的末端与限制性酶释放的片段的末端相对应。

与仅进行氯霉素选择相比，当DNA片段重组通过PCR产生时，双向选择导致阳性菌落的数量增加20倍，并且当质粒DNA通过限制性酶切释放时阳性菌落的数量增加30倍(图1B)。这些差异具有显著性(t检验，p＝0.03)。对于氯霉素选择而言，通过PCR和通过限制性酶切产生的DNA回收的菌落的数量没有差异。然而对于双向选择来说，限制性酶释放的DNA的菌落的平均数比PCR扩增的DNA高4倍(t-检验，p＝0.05)。为了证实来自新双向选择的重组体的真实性，代表着含有插入的表达构建物的经修改的杆粒，对从阳性菌落中纯化的杆粒DNA进行PCR。将一种引物设计为Zeocin抗性标记内的序列，另一种引物靶向仅存在于正确插入位点侧翼的杆粒DNA中，而不存在于转移DNA中的序列。因此PCR产物仅在用于重组的线性DNA和杆粒之间发生重组时产生。使用本方法测试了12个不同的杆粒DNA样品(图1C，泳道1-12)，对于正确靶向重组的PCR产物检验而言其全部都是阳性的。与此相比，单独的杆粒DNA或者含有用于重组的DNA片段的质粒DNA都不能作为生产PCR产物的模板起作用(图1C，分别为泳道14和15)。为了进一步地证实重组导致了获得感染性的重组杆状病毒，将相同的12个PCR阳性的杆粒克隆转染到Sf21细胞中，并传代2次，随后在感染后48小时测试由每个重组体感染的细胞中的海肾荧光素酶活性。由12种重组病毒中的每个感染的细胞具有高于背景106倍的海肾荧光素酶活性(图1D)。根据这些数据，本发明人进一步使用该双向选择用于进一步的研究。

实施例2

Cre介导的选择标记去除使得能在同一双向选择中进行多轮重组

为了使用单个座位的插入表达具有多个不同亚基的蛋白质复合物，设计了双向标记系统，使得该选择框的侧翼为修饰的LoxP位点。这些位点包括将Cre介导的重组限制于单轮(1)的lox66和lox71突变位点，以及将减少与野生型loxP位点的同源性的间隔区中的突变位点。因此，将经修饰的杆粒与Cre重组酶一起孵育导致双向选择标记的去除，以及lox重组位点的灭活，但留下杆状病毒表达框(图2A)。为了证实此策略能够成功地用于构建杆粒DNA中的多个插入，使用Cre重组以便从已经插入海肾荧光素酶报告基因的杆粒中除去双向标记。使用EL350细胞系在大肠杆菌中进行了重组(2)，所述的细胞系具有整合的λ原噬菌体和Cre重组酶，所述的原噬菌体在温度调控的启动子λPL的控制下表达exo、bet和gam，Cre重组酶在阿拉伯糖可诱导的启动子的控制下。含有三种经修饰以便掺入海肾荧光素酶双向选择插入(图1)的杆粒的EL350细胞用阿拉伯糖诱导，然后铺在含有卡那霉素(以便选择杆粒)和X-gal(以便筛选已经通过Cre介导的重组丢失选择标记的菌落)的平板上。杆粒DNA从四个推定存在的重组体中纯化，并且Cre介导的重组通过PCR确认，所述的PCR使用位于选择标记侧翼的引物(图2B)。所有四种重组体的PCR产物的大小均与从成功的Cre重组中预期的一致。这进一步地通过对经过4个重组体的经修饰的loxP位点进行测序加以确认(图2C)。所述的重组体含有有缺陷的loxP位点，该loxP位点掺入了loxP71和loxP66突变，并且不能进行更多轮的重组。为了进一步确认Cre介导的杆粒重组体在昆虫细胞中保持有活力，将杆粒DNA转染到昆虫细胞中，并与前述一样在两次传代之后测试荧光素酶的活性。所有的重组体具有和Cre重组之前的亲代杆粒相的海肾荧光素酶活性(图2D)。

实施例3

杆状病毒基因组中适用于高水平地表达异源蛋白质的基因座的鉴定

尽管在杆状病毒表达系统中已经进行了广泛的蛋白质表达工作，但大多数表达集中在替代多角体蛋白或者p10基因从而表达重组蛋白质上。描述用于表达重组蛋白质的可选的座位的文献相对很少。为了测试是否可以在不同的杆状病毒基因座上有效地使用选择，在已经含有海肾荧光素酶基因的杆粒中的一个进行第二轮重组。在这些实验中，将相同的多角体蛋白启动子-萤火虫荧光素酶-多角体蛋白终止子独立地插入到总计13个不同的基因座上(ctx、orf11、egt、orf23、v-fgf、39k、orf51、gp37、iap2、chiA、pe、odv-e18和odv-e56)，产生海肾和萤火虫荧光酶的双重表达杆状病毒(图3A)。通过确定哪些杆状病毒基因对于病毒在组织培养基中的生长是不必要的，以及杆状病毒基因在特定的座位上的排列是否有助于额外表达框的插入，来选择座位作为在这些实验中插入的位点。尽管如此，在一些座位上进行了一些额外的改变，尤其是导致特定的杆状病毒基因的敲除的改变(图3B)。将重组病毒在Sf21昆虫细胞中传代两次，并且在第三代，在感染后48小时时收获细胞，裂解并分析萤火虫和海肾荧光酶的活性。海肾荧光酶活性用于病毒复制和蛋白质表达的标记，由于所有的重组体在p10座位上，具有相同的由p35启动子驱动的海肾荧光酶框。将在各个新的座位上萤火虫荧光素酶的表达与在多角体蛋白座位上携带萤火虫荧光素酶基因的病毒，以及同样的海肾荧光素酶参照基因的表达进行对比。在13个测试的座位中，9个具有海肾荧光素酶活性，该活性高于背景至少10⁵倍，并且这些座位当中的8个(ctx、egt、orf51、gp37、iap2、chiA、odv-e18和odv-e56)具有的海肾荧光素酶活性与仅有亲代的海肾荧光素酶，以及多角体蛋白座位的萤火虫荧光素酶对照测定的活性相同或者更高(图3C)。将四个位点(orf11、v-fgf、pe和orf23)从进一步分析中排除，这些位点引起病毒提供的海肾荧光素酶活性在背景活性的10倍以内。对于剩余的病毒而言，将海肾荧光素酶的活性用作参照，从而将萤火虫荧光素酶的活性正常化，并获得在每个座位上相对表达萤火虫荧光素酶的测量值(图3D)。7个座位(ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56)具有比背景至少高10⁶倍的萤火虫荧光素酶活性，并且该活性类似于当同样的基因在多角体蛋白座位上表达时的活性(图3D)。两种病毒(chiA和odv-e18)具有高水平的海肾荧光素酶，但是相对较少的萤火虫荧光素酶表达。

本研究揭示了在杆状病毒基因组内的几个基因座高水平表达外源蛋白质上是可能的，并且鉴定了除了具有良好表达的多角体蛋白和p10之外的七个座位(ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e57)。在这些位点中，39k、orf51和gp37是插入基因的编码区域侧翼的DNA中的位点，并且不直接地打断蛋白质表达。与此相比，预计插入在ctx、egt、iap2和odv-e56中的各个插入物用于防止从这些基因中表达相应的蛋白质。这些基因的前三个此前已描述为对于病毒在细胞培养基的生长为非必需的(3-6)。还报道了ODV-E56蛋白的截尾(7)。

在不能得到萤火虫荧光素酶报告基因的良好表达的座位中，四个(orf11、v-fgf、pe和orf23)也导致存在于所有重组体中的海肾荧光素酶标记蛋白质的表达降低。由于本研究的焦点在于鉴定适用于极晚期启动子表达构建物插入的位点，并未研究此降低的表达的确切原因。这种降低的表达的可能性包括对病毒复制或者转录的位点特异性作用，以及侧翼基因的必要启动子或者增强子元件的破坏。由于不同的原因，萤火虫荧光素酶在chiA和odv-e18插入病毒中的低水平表达是预料不到的。其他的报道中记载了将重组蛋白质表达框插入到chiA座位中(8，9)。可能的是，在我们的实验中在这个座位上萤火虫荧光素酶基因表达水平的下降是由于插入侧翼对基因的影响。对于odv-e18而言，使用同样的突变病毒的报道表明该蛋白对于芽生型病毒的生产，以及从细胞到细胞的移动而言是必不可少的(10，11)。这些研究基于其中在odv-e18的编码序列中和上游的侧翼基因中有缺失的突变体。在实验中，当通过编码序列中的ATG突变为GAT，随后在基因中的该点上插入萤火虫荧光素酶框使odv-e18失活时，可能恢复感染性的病毒。在第三代海肾荧光素酶的表达等同于亲代的病毒，这表明该突变病毒的复制能力没有受损。然而，与没有发生该突变的病毒相比，考虑到萤火虫荧光素酶的水平降低～log2，因此不可能排除这种可能性，即在其中修复突变的小群体病毒补充了表达报告基因的第二个群体。

实施例4

使用多座位杆状病毒表达的蛋白质复合物的表达

实施例3集中在使用报告基因定量地评估不同杆状病毒座位用于表达重组蛋白的潜力。为了确定是否有可能表达和回收重组蛋白复合物，使用不同数目的蛋白质亚单位靶向三种特定的复合物。通过病毒M1和HA蛋白质(2种蛋白质复合物)的共表达，制备了流感(A/seal/Mass/1/80)H7亚型的病毒样颗粒，并且通过VP2、VP3、VP5和VP7(4种蛋白质复合物)的共表达，制备了蓝舌病毒(BTV)血清型1。除此之外，本发明人将准备用于进一步的功能和结构研究的小鼠CCT分子伴侣复合物的全部8个亚单位的表达作为目标。

流感AVLP

对于这些实验，全部的流感基因来自衍生自H7N7(A/seal/Mass/1/80)分离物的SC35M小鼠适应株，该基因得自位于德国马尔堡的PhilippsUniversity的研究者。

为了测试所述的多座位表达系统是否能够生产具有两种蛋白质的蛋白质复合物，在多角体蛋白启动子控制下首先将流感AM1蛋白质的编码序列插入到egt座位中。为了进行比较，将同样的基因插入到靶向多角体蛋白座位的传统的杆状病毒表达载体(pAc-YM1)中。在重组之后，两种所得到的杆状病毒均表达M1蛋白质。当使用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE进行检测时，egt和多角体蛋白座位上的蛋白质的表达水平都显著地高于杆状病毒感染的细胞中任何其他的病毒或者细胞蛋白质(图4)。

为了产生表达M1和HA的双重病毒，通过Cre重组从表达M1的杆粒中去除细菌选择框，并将来自相同流感病毒株(A/seal/Mass/1/80)的HA基因通过第二轮的ET重组插入到p10座位上。如上所述，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析确认从所得的病毒中共表达M1和HA(图5A)。除此之外，将流感的VLP从受感染细胞的培养基中分离，通过密度梯度超速离心进行纯化，并通过阴性染色EM分析进行可视化(图5B)。为了确保所看到的VLP确实是流感病毒，使用对于流感HA特异性的抗体对颗粒进行免疫金标记(图5C)。

综上所述，这些数据对于所述的多座位方法能成功地用于重组蛋白表达，以及其能在实践中通过两轮的双向选择标记系统的插入生产此种重组病毒而言是很好的证据。其他人广泛地测试了FluVLP，并显示了在小鼠和雪貂中具有免疫原性。这种构建VLP的方法的优势在于，其有可能具有携带已经预先整合并准备表达的M1的杆状病毒基因组。因此，为了制备VLP，仅仅需要进行一轮重组，从而将生产疫苗所需的，任何flu亚型出现的HA基因加入。对于基于VLP的流感疫苗而言，这将简化必要的克隆，并潜在地加快制备新型的VLP的速度。

RTV1VLP

不像流感的VLP可以通过仅两种蛋白质的表达形成，BTVVLP需要四种结构蛋白质(VP2、VP3、VP5和VP7)的协同表达。为了进一步地证明新的用于重组的系统的有用性，生产了单独地表达每种蛋白，以及表达所有四种BTV结构蛋白质的组合的病毒(图6)。新系统的优点之一在于可以由同一套的转移载体制备表达单种蛋白质和多种蛋白质的病毒。这便于生产表达单种蛋白质的对照病毒，将其用于在完整的复合物中共表达的蛋白质位置的标记。对于BTVVLP，使用流感实例中不同系列的座位(图6C)。除此之外，将新系统与Zhao等人所描述的敲除了orf1629的杆粒组合(12)从而允许多角体蛋白座位上的传统转移载体来表达该复合物的亚基之一。VLP的形成通过在阴性染色EM下的颗粒形态，结合外部的衣壳蛋白质之一(VP5)的免疫金标记来确认(图6D)。

小鼠CCT

本发明的应用不限于病毒样颗粒的形成。实际上由于多种细胞蛋白以具有不止一个亚基的复合物存在于细胞中，因此这些复合物的有效形成在一系列的领域中均有应用。为了证明该系统对其他研究的有用性，选择了分子伴侣复合物CCT。该复合物对癌症研究具有重要意义，具有8个亚基表示蛋白质表达的显著挑战。实际上没有本发明的载体和方法，不可能在杆状病毒系统中表达此复合物。构建了上述实施例3中鉴定的8个转移载体，其各自地表达小鼠CCT的一个亚基，并各自靶向不同的座位。将这些用于产生表达各个单独的亚基，以及表达亚基的组合的重组病毒。对于亚基之一(CCT5)，当该蛋白在细胞中过表达时，观察到不常见的表型。在细胞内部观察到针状晶体并且在感染的晚期当细胞破裂时，在培养基中观察到结晶物质的四边形平板(图7)。产生了此蛋白质的纯化方案，并且在本项目的CCT部分中，将该方案连同初始的结晶条件和经感染的细胞物质一起提供给了合作者。

尽管一些其他CCT亚基的表达在感染晚期的细胞中导致可见的聚集，但均没有导致具有这样规则外形的聚集物。

全部的8种CCT亚基都具有高水平表达(图8)并与提高用于小鼠CCT的多克隆抗血清交叉反应。在内源的昆虫细胞CCT亚基之一和所述多克隆抗体之间，有一些交叉反应(图8B，泳道9)。然而，该内源信号仅与3个亚基(CCT1、CCT5和CCT6)共定位，所述的3个亚基在受感染的细胞中积累到高水平，并因此清楚地可以检测到。所有其他的亚基的迁移表现为分子量轻微不同的蛋白质，并因此可以根据迁移与昆虫细胞的蛋白质区分。

结论

对于所有的三种蛋白质复合物而言，当单独表达或者在其他蛋白质的存在下表达时，同一种重组蛋白的积累具有明显差异。在几乎所有的情况下，当在同一病毒中表达多种蛋白质时，蛋白质表达的水平下降。这达到了预期的某种程度。用于转录、RNA加工、翻译和蛋白折叠所需要的蛋白相竞争预测两种高度表达的杆状病毒基因在一起时比分开时表达更低。然而，出人意料的是BTVVLP和CCT的实例中不同基因座之间蛋白质表达的减少是不同的。例如BTV、VP2、VP5、VP3和VP7，当其单独进行表达时，均导致显著的和类似的蛋白质的积累。然而，当合并于表达全部四种蛋白质的单个杆状病毒中时，VP2和VP3与VP5和VP7相比积累到更低的水平(图6A)。该效果不能通过基因组整合的位置效应来解释，因为在单倍体和四倍体病毒中，所述的基因从同一基因座上表达。一种可能的解释是，该效果是由于对于不同的基因使用不同的启动子。VP5和VP7均在p10启动子的控制下表达，以及VP2和VP3在多角体蛋白质启动子的控制下表达。这与文献中的报道一致，在该文献中p10基因的缺失导致了在多角体座位13上表达增加。因此多角体蛋白质启动子在两个p10启动子的存在下的复制预示选择性地减少从多角体蛋白质启动子驱动下的基因的表达。然而，这对于在CCT复合物中观察到的效果而言不能成为完整的解释。CCT5和CCT2均从p10启动子上表达，并且当其单独表达的时候均产生水平高度稳定的重组蛋白(图8A和B，泳道2和5)。然而，当在同一病毒中合并时，CCT5的表达与CCT2相比，大体上是降低的(图8A和B，泳道10)。从这些数据中，在p10座位上的其他顺式作用序列可能有助于CCT2和BTVVP5的增强的相对表达，这两种基因均插入于这一座位上。当插入在同一位点上时，流感HA的相对不明显的表达可能与此蛋白在ER上的转换更加相关，而不是转录的影响。CCT2和VP5均在细胞质中积累。

本发明人提高了当使ET重组系统应用于杆状病毒时ET重组系统的效率，这种应用达到使其能够用于重组蛋白的表达框的常规插入的程度。进一步地，他们鉴定了七个基因座(ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56)，这七个基因座能用于蛋白质的高水平表达，并且用三个实例证明了可以使用该系统装配多蛋白质复合物(流感A和BTVVLP，以及CCT复合物)。

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Claims

1.一种用于将基因插入到杆状病毒序列的基因座中的转移载体，所述转移载体包括：

表达框，所述表达框包括可操作地连接到基因的真核启动子；

双向选择框，所述的双向选择框的各个侧翼为LoxP重组序列，由此使得通过同源重组除去所述的双向选择框，其中所述的LoxP重组序列被修饰以确保仅能发生一轮的重组，并且进一步地，所述双向选择框包括：

(i)编码第一个选择标记的可表达序列；和

(ii)编码第二个选择标记的可表达序列；和

位于所述表达框和双向选择框侧翼的序列，其中所述的序列对应于杆状病毒序列中的基因座的序列，由此使得在转移载体和杆状病毒之间发生同源重组，以使表达框和双向选择框均被转移至杆状病毒的基因座中。

2.权利要求1所述的转移载体，其中，所述第一个选择标记是可视的标记。

3.权利要求2所述的转移载体，其中，所述第一个标记是LacZalpha片段。

4.权利要求1所述的转移载体，其中，所述第二个选择标记赋予对抗生素的抗性。

5.权利要求4所述的转移载体，其中，抗生素抗性基因赋予对腐草霉素的抗性。

6.前述任一项权利要求所述的转移载体，其中，位于表达框和双向选择框侧翼的序列对应于下列任一基因座的序列：ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、odv-e56和p10。

7.一种用于生产重组杆粒的方法，所述方法包括：

将杆粒和根据权利要求1至6中任一项所述的转移载体放到一起，从而使其发生同源重组；和

选择包含表达框和双向选择框的重组杆粒。

8.权利要求7所述的方法，其中，所述转移载体是权利要求1中所定义的转移载体，所述方法还包括引起LoxP序列之间重组，从而从杆粒中去除选择框。

9.一种用于生产重组杆状病毒的方法，所述方法包括通过权利要求7或者权利要求8的方法生产重组杆粒，并培养含有所述杆粒的真核细胞，从而生产杆状病毒。

10.一种通过权利要求7的方法得到的重组杆粒。

11.一种通过用于生产重组杆状病毒的方法得到的重组杆状病毒，所述方法包括通过权利要求7所述的方法生产重组杆粒，并培养含有所述杆粒的真核细胞，从而生产杆状病毒。

12.根据权利要求10所述的重组杆粒，所述的重组杆粒表达多种蛋白质，其中，每种蛋白质由杆粒的分开的基因座表达。

13.根据权利要求11所述的重组杆状病毒，所述的重组杆状病毒表达多种蛋白质，其中，每种蛋白质由杆状病毒的分开的基因座表达。

14.权利要求12所述的重组杆粒或者权利要求13所述的重组杆状病毒，其中，所述多种蛋白质相互作用以形成蛋白质复合物。

15.权利要求14所述的重组杆粒或者重组杆状病毒，其中，所述蛋白质复合物是病毒样颗粒。

16.权利要求12所述的重组杆粒或者权利要求13所述的重组杆状病毒，其中，所述分开的基因座选自ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56。

17.一种细胞，所述细胞含有根据权利要求1至6中任一项所述的转移载体、根据权利要求10、12、14至16中任一项所述的杆粒、或者根据权利要求11、13至16中任一项所述的杆状病毒。

18.一种用于生产一种或者多种蛋白质的方法，所述方法包括在适宜的条件下，培养根据权利要求10、12、14至16中任一项所述的重组杆粒或者根据权利要求11、13至16中任一项所述的杆状病毒。