MXPA01001727A

MXPA01001727A - Formulaciones de adenovirus para terapia genetica.

Info

Publication number: MXPA01001727A
Application number: MXPA01001727A
Authority: MX
Inventors: Shian-Jiun Shih
Original assignee: Aventis Pharm Prod Inc
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-13
Publication date: 2001-11-27
Also published as: WO2000009675A9; EP1109896A4; AU748523B2; WO2000009675A1; AU5485899A; JP2003528029A; EP1109896A1; CA2340682A1

Abstract

La presente invencion se refiere a una formulacion que permite la preservacion de particulas virales y vectores de virales, que es inyectable directamente en un organismo; se refiere mas particularmente a una formulacion para la preservacion de un vector de adenovirus recombinante que intensifica optimamente el titulo del vector o estabiliza el - vector a temperatura ambiente o en refrigeracion, o ambas; la invencion se refiere a composiciones que comprenden un vector de adenovirus recombinante y una concentracion de albumina de suero humano (HSA) efectiva para estabilizar el vector de adenovirus a una temperatura arriba del punto de congelacion del agua, o para intensificar un titulo del vector de adenovirus comparativamente con un titulo en ausencia de HSA, o ambos, en un regulador de pH acuoso.

Description

FORMULACIONES DE ADENOVIRUS PARA TERAPIA GENICA Esta solicitud reclama el beneficio de ia solicitud provisional copendiente 60/096,600, la cual fue presentada en agosto 14, 1998, cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una formulación para la preservación de partículas virales y vectores virales, la cual es directamente inyectable en un organismo. Se refiere más particularmente a una formulación para un vector de adenovirus recombinante que intensifica óptimamente el título del vector, o estabiliza el vector a la temperatura de refrigeración o a temperatura ambiente, o ambas. La invención se refiere a composiciones que comprenden un vector de adenovirus recombinante y una concentración de albúmina de suero humano (HSA) eficaz para estabilizar el vector de adenovirus a una temperatura arriba del punto de congelación del agua, o para intensificar un título del vector de adenovirus comparativamente con un título en ausencia de HSA, o ambos, en un regulador de pH acuoso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En terapia celular y génica, así como también en transfusión sanguínea o transpiante de médula ósea, uno de los problemas principales encontrados es el de la preservación del material biológico. Es por lo tanto importante ser capaz de preservar el material biológico, bajo buenas condiciones de viabilidad, durante un período suficientemente largo compatible con la producción a escala industrial y el almacenamiento, y también para hacer posible llevar a cabo ciertas pruebas. El método de preservación que se usa más comúnmente consiste en congelar el material. Sin embargo, durante la congelación y el deshielo del material biológico, puede ocurrir pérdida de viabilidad y/o de carácter infeccioso. La albúmina de suero humano es una proteína monomérica no glucosilada de 585 aminoácidos, con un peso molecular de 66 kD. Su estructura globular es mantenida por 17 puentes disulfuro, los cuales crean una serie secuencial de 9 bucles dobles (Brown, J. R., 1977). "Albumin structure, function and uses", Rosenoer, V. M. ef al. (eds.), Pergamon Press, Oxford, pp. 27-51). Los genes que codifican para HSA son conocidos por ser altamente polimórficos, y más de 30 variantes genéticas aparentemente diferentes han sido identificadas mediante análisis electroforético bajo condiciones variadas (Weitkamp, L. R. et al., 1973. Ann. Hum. Genet., 37:219-226). El gen de HSA comprende 15 exones y 14 intrones que comprenden 16,961 nucleótidos, desde el sitio de "bloqueo" supuesto hasta el primer sitio de adición de poli(A). La albúmina humana es sintetizada en los hepatocitos del hígado, y secretada entonces en la sangre periférica. Esta síntesis conduce, en primera estancia, a un precursor, prepro-HSA, el cual contiene una secuencia de señal de 18 aminoácidos que dirigen al polipéptido incipiente en la vía secretoria. La HSA es la proteína sanguínea más abundante, con una concentración de aproximadamente 40 gramos por litro de suero. Por lo tanto, existen aproximadamente 160 gramos de albúmina circulante en el cuerpo humano en cualquier momento. La función más importante de la HSA es mantener la osmolaridad normal de la sangre. Tiene también una capacidad de unión excepcional para varias sustancias, y desempeña una función en el transporte endógeno de moléculas hidrofóbicas tales como esteroides y sales biliares, y en el transporte de diferentes sustancias terapéuticas, las cuales pueden ser así transportadas hacia sus sitios de acción respectivos. Además, la HSA ha sido implicada recientemente en la degradación de las prostaglandinas. Se mostró previamente que la HSA estabiliza soluciones de proteínas, incluyendo antígenos de proteína, y pequeñas moléculas orgánicas tales como hemina (Paige, A. G. et al., 1995. Pharmaceutical Res., 12:1883- 1888; Chang, A. C. y R. K. Gupta, J., 1996. Pharm. Sci., 85:129-132; Niemeijer, N. R., et al., 1996. Ann. Allergy Asthma immunol., 76:535-540; y Cannon, J. B. et al., 1995, PDA: J. Pharm. Sci. & Tech., 49:77-82). La HSA se puede purificar a partir de fuentes de materiales de suero humano, o se puede obtener mediante ingeniería genética ya sea mediante fermentación de células recombinantes (bacterias, levaduras o células de mamífero), o mediante expresión en animales transgénicos, particularmente a partir de tejidos mamarios. La HSA se ha usado también para preservar materiales biológicos por congelación (W097/33975). Sin embargo, este uso no ha sido descrito para preservación y almacenamiento de adenovirus a temperatura ambiente. La preservación de adenovirus para uso clínico se ha vuelto un tópico significativo, ya que las pruebas clínicas han progresado hacia la fase II y, finalmente, la aprobación regulatoria. Actualmente, las formulaciones de adenovirus tales como la formulación 1 (ejemplo 1 , véase más adelante) requieren ser almacenadas a -70°C para permanecer estables. El requisito para mantener las preparaciones de vectores virales a estas temperaturas necesita la adquisición de congeladores que mantengan temperaturas de -70°C. Otra complicación surge durante el envío de los vectores desde el sitio de fabricación hasta la clínica. Hasta la presente invención, había poca esperanza e incluso menos expectativa de que los vectores de adenovirus pudieran formularse para almacenamiento estable, con preservación de carácter infeccioso, a temperaturas de congelador estándar (-20°C), refrigerador (4°C) o temperatura ambiente (20°C).

Como se demuestra en los ejemplos citados más adelante, la presente invención destaca y supera estas deficiencias en la técnica, e inesperadamente provee, por primera vez, formulaciones que proveen estabilidad a largo plazo de vectores de adenovirus a temperaturas mayores que las que se han alcanzado hasta la fecha. La cita de cualquier referencia en la presente no debe considerarse como un reconocimiento de que dicha referencia está disponible como "técnica anterior" a la presente solicitud.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee ventajosamente una formulación para la preservación y/o el almacenamiento de un vector de virus recombinante, particularmente y de preferencia un vector de adenovirus, que intensifica óptimamente el título del vector o estabiliza el vector a la temperatura del refrigerador o temperatura ambiente, o ambas. De esta manera, en una primera modalidad, la invención provee una composición que comprende un vector de adenovirus recombinante y una concentración de albúmina de suero efectiva para estabilizar al vector de adenovirus a una temperatura mayor que el punto de congelación del agua, o para intensificar un título del vector de adenovirus comparativamente con un título en ausencia de albúmina de suero, o ambos, en un regulador de pH acuoso a un pH efectivo para estabilizar al vector de adenovirus. En una modalidad específica, la albúmina de suero es albúmina de suero humano (HSA). En una modalidad específica, la concentración de HSA es de alrededor de 0.01 % a aproximadamente 25% (en p/v). De preferencia, la concentración de HSA es de alrededor de 0.1 % a aproximadamente 15%. Más preferiblemente, la concentración de HSA es de alrededor de 1 % a aproximadamente 10%. Muy preferiblemente, la concentración de HSA es de aproximadamente 5%. La HSA se puede purificar a partir de fuentes naturales o, más preferiblemente, se pude obtener mediante ingeniería genética. La ventaja de dicha formulación estriba en el hecho de que la solución está disponible para administración inmediatamente después de su remoción de la temperatura de almacenamiento, sin que sea necesaria manipulación adicional alguna. Entonces se hace posible llevar a cabo la remoción de las condiciones de almacenamiento directamente en la clínica, reduciendo de esta manera el tiempo entre el almacenamiento y el uso, lo cual también hace posible permanecer constantemente en una formulación estéril y, por lo tanto, reducir hasta un mínimo los riesgos de contaminación externa. En otra modalidad de la invención, el pH de la composición es mayor que o igual a 5.0 y menor que o igual a 9.0. De preferencia, el pH es mayor de 7.5. De esta manera, el pH puede ser de 7.6, 7.7, 7.8 ó 7.9. Más preferiblemente, el pH es mayor de 8.0, por ejemplo, 8.1 , 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8 u 8.9: En una modalidad específica, el pH es de 8.2. En otra modalidad específica, el pH es de 8.4. De preferencia, cuando el pH de una composición de la invención es mayor de 8.0, la concentración de HSA es de 1 % a 10%; más preferiblemente, 5%. En una modalidad específica, cuando el pH es de 8.2, la concentración de HSA es de 5%. En otra modalidad específica, cuando el pH es de 8.4, la concentración de HSA es de 5%. El regulador de pH acuoso de la invención comprende un regulador de pH fisiológico tai como, pero de ninguna manera limitado a, regulador de pH de fosfato, regulador de pH Tris-HCl, regulador de pH Hepes, y similares. Un regulador de pH adecuado para su uso de conformidad con la invención es farmacéuticamente aceptable, es decir, compatible con el suministro in vivo. En una modalidad ejemplificada más adelante, el regulador de pH es un regulador de pH Tris-HCl. El regulador de pH se ajusta a un pH que estabiliza a los vectores de adenovirus. Un reguiador de pH acuoso para su uso en la invención comprende sales, por ejemplo, cloruro de calcio (CaCl2), cloruro de magnesio (MgCI2) y cloruro de sodio (NaCI). Por ejemplo, el regulador de pH puede contener MgCI2 a aproximadamente 2.0 mM y NaC! a 150 mM. En una modalidad específica, el regulador de pH acuoso contiene una concentración fisiológica de sales. Además, una composición o formulación de la invención puede contener componentes adicionales además de HSA para estabilizar mejor al adenovirus recombinante. Ejemplos de dichos componentes incluyen, pero no están limitados a, carbohidratos y azúcares tales como dextrosa, sacarosa, glucosa, y similares, por ejemplo, a una concentración de 5%; medio para polioles de cadena larga tales como glicerol, polietilenglicol, y similares, por ejemplo, a concentraciones de 10%; otras proteínas; aminoácidos; ácidos nucleicos; agentes quelatadores; inhibidores de proteólisis; conservadores; y otros componentes. De preferencia, cualquier constituyente de una composición de la invención es farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de la invención son particularmente adecuadas para la formulación de un adenovirus recombinante para terapia génica. De esta manera, en una modalidad preferida, el adenovirus recombinante expresa una proteína heteróloga. Ejemplos de proteínas heterólogas incluyen, pero de ninguna manera están limitados a, proteínas supresoras de tumores tales como p53; genes suicidas tales como timidina cinasa de virus de herpes simple (HSV-tk); factores de crecimiento tales como factor ácido de crecimiento de fibroblastos (FGF); factores angiogénicos tales como FGF o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); factores tróficos tales como factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico 3 (NT-3), NT-4, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) y factor neurotrófico ciliar (CNTF); etc. Una lista más completa de proteínas heterólogas para expresión en un vector formuladas de conformidad con la presente invención se puede encontrar más adelante. En una modalidad específica, la proteína heteróloga es p53. En otra modalidad específica, la proteína heteróloga es HSV-TK. Naturalmente, la presente invención provee además un método para preparar una formulación de vector de adenovirus recombinante que comprende preparar una mezcla de un adenovirus recombinante y una concentración de HSA efectiva para estabilizar al vector de adenovirus a una temperatura arriba del punto de congelación del agua, o para intensificar un título del vector de adenovirus comparativamente con un título en ausencia de HSA, o ambos, en un regulador de pH acuoso. En una modalidad, la temperatura es mayor que o igual a 4°C y menor de 37°C. En otra modalidad, la temperatura es mayor que o igual a 20°C. De preferencia, cuando la temperatura es mayor de 4°C, y particularmente cuando la temperatura es mayor de 20°C, la concentración de HSA es de 5%, el pH de la mezcla es mayor de 8.0, o ambos. En un aspecto adicional, la presente invención provee un método para estabilizar un vector de adenovirus a aproximadamente 20°C, mediante la preparación de una mezcla del vector de adenovirus en una composición acuosa de solución salina de Dulbecco regulada en su pH con fosfato, glicerol de aproximadamente 5% a 15%, CaCI2 de aproximadamente 0.25 a 2.0 mM y MgCI2 de aproximadamente 0.1 a 1.0 mM. En una modalidad específica, la concentración de glicerol es de 10%, la concentración de CaCI2 es de aproximadamente 1.0 mM, y la concentración de MgCI2 es de aproximadamente 0.5 mM. La presente invención se explicará en detalle en los dibujos y la descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Prueba en placa: almacenamiento de 4 formulaciones a +4°C. Figura 2. Prueba en placa: almacenamiento de 4 formulaciones a +20°C. Figura 3. Prueba de bioactividad: bioactividad para 4 formulaciones a +4°C. Figura 4. Prueba de bioactividad: bioactividad para 4 formulaciones a +20°C. Figura 5. Efecto de HSA y sacarosa sobre títulos virales a -20°C. Figura 6. Efecto del regulador de pH, sales y/o cationes sobre los títulos virales a +20-10°C. Figura 7. Efecto de HSA sobre el título viral a +2-10°C. Figura 8. Actividad de AdCMVp53 almacenado en la formulación 4 a varios valores de pH durante 1 semana. Figura 9. Comparación de HSA y BSA en formulaciones virales. Figura 10. Estabilidad del virus a 37°C durante 1 semana en diferentes formulaciones. 11. Estabilidad de AV1.0HSVTK almacenada en la formulación 19 a -70°C, -20°C, +4°C, y +20°C durante 1.5, 3.5 y 8.5 meses.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee ventajosamente un nuevo tipo de medio que hace posible preservar vectores virales, particularmente vectores de adenovirus, usando una formulación que intensifica óptimamente el título del vector del virus recombinante, o estabiliza el vector a la temperatura del refrigerador o temperatura ambiente, o ambas. En ejemplos específicos citados más adelante, se pusieron a prueba varias formulaciones para determinar su capacidad para estabilizar preparaciones de vector de adenovirus durante hasta 8.5 meses, respecto a un control almacenado a -70°C. Se encontró que una formulación que comprendía Tris-HCl a 10 mM, pH 8.2, HSA a 5%, sacarosa a 5%, MgCI2 a 2.0 mM y NaCI a 150 mM era muy estable, y preservaba - o incluso intensificaba - el carácter infeccioso del vector hasta por 6 meses a temperaturas relativamente altas (4°C y 20°C). Otros experimentos establecieron que un pH óptimo para la estabilidad del vector de adenovirus era mayor de 8.0. Se encontró además que la presencia de HSA en la solución incrementaba el título viral (medido en una prueba en placa). Además, una segunda formulación que comprendía Tris-HCl a 10 mM, pH 8.4, HSA a 5%, sacarosa a 5%, MgCI2 a 2.0 mM y NaCI a 150 mM, se puso a prueba para determinar su capacidad para estabilizar preparaciones de vector de adenovirus durante por lo menos 8.5 meses, respecto a un control almacenado a -70°C. Se encontró que esta formulación de Tris-HCI a 10 mM, pH 8.4, HSA a 5%, sacarosa a 5%, MgCI2 a 2.0 mM y NaCI a 150 mM, era también muy estable, preservando la integridad y el carácter infeccioso (título) de la partícula viral durante por lo menos 8.5 meses a +4°C, y preservando la integridad de la partícula viral durante por lo menos 8.5 meses a +20°C. De esta manera, las variables críticas para una formulación usada para preservar vectores de adenovirus eran la HSA y el pH; se encontró también que la sacarosa intensifica la estabilidad. La ventaja de dicha formulación estriba en el hecho de que la solución está disponible para administración inmediatamente después de retirarla de la temperatura de almacenamiento, sin que sea necesaria manipulación alguna adicional. Se hace posible entonces llevar a cabo la remoción de dicha formulación de las condiciones de almacenamiento directamente en la clínica, reduciendo de esta manera el tiempo entre el almacenamiento y el uso, lo cual hace también posible permanecer constantemente en una formulación estéril, y por lo tanto reducir hasta un mínimo los riesgos de contaminación externa. Esta formulación carece de agentes tóxicos y se puede administrar directamente a un organismo. Se puede usar para preservar varias preparaciones virales tales como partículas virales y vectores virales. Como se indicó anteriormente, la invención provee una formulación para la preservación y/o el almacenamiento de virus, la cual comprende una concentración de HSA efectiva para estabilizar un vector de adenovirus a una temperatura arriba del punto de congelación del agua, o para intensificar un título del vector de adenovirus comparativamente con un título en ausencia de HSA, o ambos, en un regulador de pH acuoso. De preferencia, la invención provee una composición que comprende un vector de adenovirus recombinante y una concentración de HSA efectiva para estabilizar al vector de adenovirus a una temperatura arriba del punto de congelación del agua, o para intensificar un título del vector de adenovirus comparativamente con un título en ausencia de HSA, o ambos, en un regulador de pH acuoso. Además, como se mencionó anteriormente, el pH de la composición es mayor que o igual a 5.0, y menor que o igual a 9.0, y de preferencia, el pH es mayor de 7.5. En una modalidad específica, el pH es de 8.2 y la concentración de HSA es de 5%. En una segunda modalidad específica, el pH es de 8.4 y la concentración de HSA es de 5%. Los diferentes aspectos de la invención se describirán en mayor detalle en las siguientes secciones, dirigidas a medios y formulaciones adecuados para preservar partículas virales y vectores virales. Esta organización en varias secciones tiene el propósito de facilitar el entendimiento de la invención, y de ninguna manera se pretende que sea limitativa de la misma.

Definiciones Los siguientes términos definidos se usan a lo largo de la presente especificación, y deben ser útiles en el entendimiento del alcance y la práctica de la presente invención. En una modalidad específica, el término "aproximadamente" o "de alrededor de" significa dentro de 20%, de preferencia dentro de 10%, y más preferiblemente dentro de 5% de un valor o escala determinado. El término "que corresponde a" se usa en la presente para referirse a secuencias similares u homologas, si la posición exacta es idéntica o diferente de la molécula con la cual la similitud u homología se mide. Una alineación de secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico puede incluir espacios. De esta manera, el término "que corresponde a" se refiere a la similitud de secuencias, y no a la numeración de los residuos de aminoácidos o bases de nucleótidos. Una "formulación" se refiere a un medio acuoso o en solución para la preservación de partículas virales y vectores virales, el cual es directamente inyectable en un organismo. Se refiere más particularmente a una formulación para un vector de adenovirus recombinante que intensifica óptimamente el título del vector, o estabiliza al vector a la temperatura del refrigerador o temperatura ambiente, o ambas. Se refiere también a composiciones que comprenden un vector de adenovirus recombinante y una concentración de HSA efectiva para estabilizar al vector de adenovirus a una 5 temperatura arriba del punto de congelación del agua, o para intensificar un título del vector de adenovirus comparativamente con un título en ausencia de HSA, o ambos, en un regulador de pH acuoso. El regulador de pH acuoso incluirá sales o azúcares, o ambos, a una concentración aproximadamente isotónica. Un "gen" se refiere a un ensamble de nucleótidos que codifica para un polipéptido, e incluye ADNc y ácidos nucleicos de ADN genómico. "Albúmina de suero humano" o "HSA", se refiere a una proteína monomérica no glucosilada de 585 aminoácidos, con un peso molecular de 66 kilodaltons. Su estructura globular es mantenida por 17 puentes disulfuro, los cuales crean una serie secuencial de 9 bucles dobles (Brown, J. R., 1977). "Albumin structure function and uses", Rosenoer, V. M. et al (eds.), Pergamon Press, Oxford, pp. 27-51 ). Los genes que codifican para HSA son conocidos por ser altamente polimórficos, y se han identificado más de 30 variantes genéticas aparentemente diferentes mediante análisis electroforético bajo condiciones variadas (Weitkamp, L. R. et al., 1973. Ann. Hum. Genet., 37:219-226). El gen de HSA comprende 15 exones y 14 intrones que comprenden 16,961 nucleótidos, desde el sitio "de bloqueo" supuesto hasta el primer sitio de adición de poli(A). La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares, a concentraciones particulares, y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen típicamente una reacción alérgica o adversa similar, tal como malestar gástrico, fiebre, vértigo y similares, cuando 6 son administradas a un humano o animal no humano. De preferencia, como se usa en la presente, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o incluido en la Farmacopea de E.U.A. u otra Farmacopea generalmente reconocida, para su uso en humanos o animales no humanos. Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha sufrido manipulación biológica molecular, es decir, mediante ingeniería genética. Un "sujeto" es un humano o animal no humano el cual puede recibir un vector formulado en una composición de la invención. Un "vector" es cualquier medio para la transferencia de un ácido nucleico en una célula hospedera. Un vector puede ser un replicón al cual otro segmento de ADN puede ser unido para producir la replicación del segmento unido. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, capaz de replicarse bajo su propio control. El término "vector" como se usa en la presente, se refiere específicamente a medios virales para la introducción del ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Vectores virales incluyen retrovirus, virus adenoasociados, viruela, baculovirus, vaccinia, herpes simple, vectores de Epstein-Barr y adenovirus, como se describe en mayor detalle más adelante. El ácido nucleico contiene una región de codificación para un gen de interés. En un vector de expresión, la región de codificación está asociada operablemente con secuencias de control de la expresión, por ejemplo, un promotor. Un vector puede contener también una o más regiones reguladoras, y/o marcadores seleccionables útiles para seleccionar, medir y monitorear resultados de la transferencia de ácido nucleico (transferencia a qué tejidos, duración de la expresión, etc.).

Albúmina de suero humano La HSA usada dentro de la estructura de la presente invención, pueden ser de origen natural (HSA purificada) o de origen recombinante v(rHSA). Aunque la presente invención se describe principalmente en el contexto de la albúmina de suero humano, se ha encontrado más adelante que la albúmina de suero de otras especies es igualmente afectiva. De esta manera, debe considerarse que el término HSA abarca cualquier albúmina de suero, tal como albúmina de suero de bovino (BSA) y albúmina de suero de murino (MSA). Naturalmente, para el suministro de una formulación in vivo para terapia génica, se prefiere usar una albúmina de suero autóloga. De esta manera, para terapia génica humana, es deseable y se prefiere albúmina de suero humano. Se usa ventajosamente una HSA natural o recombinante que satisfaga ciertos criterios de calidad (por ejemplo, homogeneidad, pureza y estabilidad). De esta manera, la Farmacopea establece un número de parámetros para las soluciones de albúmina en plasma, a saber, un valor de pH, un contenido de proteína, un contenido de agregados y de polímeros, un contenido de fosfatasa alcalina y una cierta composición de proteínas. Impone, además, una cierta absorbencia y el cumplimiento de una prueba de esterilidad, con una prueba para pirógenos y para toxicidad (véase "Albumini humai solutio", Farmacopea europea (1984), 255). El uso de una albúmina que corresponda a estos criterios, aunque no esencial, se prefiere particularmente. En forma ventajosa, las composiciones de conformidad con la invención comprenden una albúmina de plasma humano purificada o una albúmina humana recombinante, de preferencia producida en un hospedero eucariótico. Además, el término HSA comprende, para el propósito de la invención, cualquier variante natural de albúmina humana, que resulte del polimorfismo de esta proteína. También es posible usar un equivalente de HSA, es decir, cualquier derivado de HSA que conserve las propiedades de la HSA. Estos derivados pueden ser especialmente fragmentos amino-(N-) terminales de HSA.

Purificación de HSA natural Se produce generalmente HSA natural mediante purificación de material biológico de origen humano. En particular, se obtiene mediante técnicas convencionales por fraccionamiento de plasma obtenido de donaciones de sangre (Cohn et al., 1946, J. Am. Chem. Soc, 68:459 pp.), o mediante extracción a partir de la placenta humana, de conformidad con la técnica descrita por J. Liautraud et al. (1973, Decimotercera Conferencia Internacional de IABS, Budapest; "A Purification of proteíns. Development of biological standard", Karger (ed.), Bale, 27:107 pp.). De preferencia, la albúmina purificada usada dentro de la estructura de la presente invención, es una albúmina de plasma. Más particularmente, se puede usar una albúmina de plasma comercial.

Producción de HSA recombinante El desarrollo de técnicas de ingeniería genética y de nuevas técnicas de extracción y purificación, ha abierto la posibilidad de obtener, a un costo menor, productos mejorados de mayor pureza, de mayor estabilidad y sin el riesgo de contaminación (por ejemplo, por hepatitis B, hepatitis C, VIH o priones infecciosos). Dada la importancia de la HSA comercializada, la posibilidad de producir esta proteína mediante una vía recombinante ha sido estudiada ampliamente. De esta manera, se han estudiado numerosos sistemas de expresión para la preparación de la HSA recombinante.

Fermentación de HSA Más particularmente, con respecto a las bacterias hospederas, se pueden aplicar técnicas de ingeniería genética en una bacteria, por ejemplo, en Escherichia coli, como organismo hospedero. Las patentes europeas EP 236 210, EP 200 590 o EP 198 745 describen procedimientos para la producción de HSA en E. coli, usando diferentes vectores de expresión, diferentes promotores de transcripción, y diferentes señales secretorias. Subsecuentemente, también se llevó a cabo la secreción de HSA en Bacillus subtilis (Saunders et al., 1987. J. Bacteriol., 169:2917). Con respecto a los hospederos eucarióticos, se han desarrollado procedimientos para la producción de HSA usando levaduras como organismo hospedero. De esta manera, ha sido posible demostrar la producción de HSA bajo el control del promotor chelatin en Saccharomyces cerevisiae (Etcheverry et al., 1986. Bio/Technology, 4:726). La producción de HSA también se ha mencionado en levaduras durante la fabricación de cerveza, usando un procedimiento de post- fermentación (EP 201 239). Más recientemente, la solicitud de patente EP 361 991 describe un sistema particularmente eficiente que usa a la levadura Kluyveromyces como organismo hospedero, transformada con vectores derivados del plásmido pKD1. Niveles particularmente altos de HSA secretada en el medio de cultivo, se pudieron obtener con este sistema. Finalmente, la producción de HSA recombinante también se ha descrito en Pichia pastoris (EP 344 450). Además, también se ha descrito la purificación de HSA (EP 319 067). Varias patentes y publicaciones científicas describen métodos para la expresión de un gen heterólogo, particularmente de HSA, en un animal transgénico, óptimamente en la glándula mamaria de un mamífero rumiante. Dicha tecnología se usa para producir una proteína heteróloga en la leche del mamífero. Ejemplos de producción de albúmina de suero humano en animales transgénicos incluyen la patente de E.U.A. No. 5,780,009, expedida en julio 14, 1998 a Karatzas et al., enfocada a dirigir la transferencia de genes en la glándula mamaria de rumiantes. La patente de E.U.A. No. 4,873,316, expedida en octubre 10, 1989 a Meade et al., dirigida al aislamiento de proteínas recombinantes exógenas de la leche de mamíferos transgénicos, provee un sistema de expresión que comprende el promotor de caseína en mamíferos, el cual cuando es incorporado transgénicamente en un mamífero, permite que la hembra de esa especie de mamífero produzca la proteína recombinante deseada en o junto con su leche. Una construcción preferida para la expresión transgénica de HSA se describe en la patente de E.U.A. No. 5,648,243, expedida en julio 15, 1997 a Hurwitz et al., dirigida a una construcción de expresión de albúmina de suero humano, cita cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Como se describe en esta patente, la expresión eficiente de HSA se logra cuando la secuencia de la albúmina de suero humano comprende por lo menos un intrón, pero no todos los intrones, en el gen que ocurre naturalmente que codifica para la proteína HSA. De preferencia, las construcciones de ADN comprenden una secuencia reguladora 5' que dirige la expresión y secreción de la proteína HSA en la leche de un animal transgénico. Estas patentes se refieren a otras referencias de la literatura científica y de patentes para expresión transgénica, particularmente de HSA. Cada una de ellas se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. En una modalidad específica de la invención, la HSA recombinante de la invención es Recombumin™ (Centeon). Recombumin™ es una albúmina humana recombinante derivada de levaduras, la cual es estructuralmente idéntica a la albúmina humana derivada del plasma. Recombumin™ se produce usando una secuencia guía híbrida de secreción conjugada con un ADNc que codifica para albúmina de suero humano. La secuencia de ADNc se describe en EP 0 073 646, y la secuencia guía se describe en la patente de E.U.A. No. 5,302,697. La secuencia guía es clonada en un cassette de expresión en un vector de desintegración el cual se describe en la patente de E.U.A. No. 5,637,504. La célula de levadura hospedera usada para obtener la Recombumin™ incluye varias mutaciones, 0 tales como alteraciones génicas del gen de aspartil proteasa de levadura (WO 95/23857) y alteraciones génicas del gen 150 de proteína de choque térmico (US 5,783,423).

Formulaciones de HSA ¡5 Las formulaciones de conformidad con la invención se pueden preparar de varias formas. Los diferentes componentes se pueden mezclar entre sí, y entonces se añade el vector o partícula viral a la mezcla. También es posible mezclar uno o varios de los componentes con el vector o partícula 0 viral, y añadir entonces los componentes restantes. De preferencia, se prepara una formulación que comprenda todos lo componentes, a la cual se añade entonces el vector o partícula viral. La preparación de la formulación y la adición de las partículas virales o vectores virales, se lleva a cabo bajo condiciones estériles. Las proporciones respectivas de los componentes de los medios de conformidad con la invención, pueden ser adaptadas por los expertos en la técnica de acuerdo a la partícula viral o vector viral considerado. Como se ilustra en los ejemplos, aunque se prefieren ciertas escalas de concentración, las proporciones pueden ser modificadas. La formulación de conformidad con la invención fue descubierta en relación con la preservación de vectores de adenovirus. Sin embargo, esta formulación puede ser muy útil para la preservación de otros vectores virales.

Partículas y vectores virales Las partículas virales y los vectores virales más particularmente relevantes para la presente invención, son aquellos que se pueden usar en terapia génica. Un gran número de virus puede tener su genoma modificado, por un lado, de modo que pierde su capacidad para multiplicarse mientras retiene su carácter infeccioso y, por otro lado, para insertar en su genoma una secuencia de ácido nucleico de interés terapéutico la cual será expresada en las células infectadas. Entre estos virus, se pueden mencionar más particularmente los adenovirus, los virus adenoasociados (AAVs), los retrovirus, los virus de herpes, y similares.

La presente formulación para el almacenamiento de una partícula o vector viral a una temperatura relativamente alta, fue desarrollada específicamente para el almacenamiento de un vector de adenovirus. Sin embargo, la invención contempla que la formulación de HSA, particularmente con escala de pH preferida, puede también estabilizar o intensificar el carácter infeccioso, o ambos, de otros vectores.

Vectores de adenovirus En una modalidad preferida, el vector es un vector de adenovirus. Los adenovirus son virus de ADN eucariótico los cuales pueden ,ser modificados para suministrar eficientemente un ácido nucleico de la invención a una variedad de tipos de células. Existen varios serotipos de adenovirus. De estos serotipos, se da preferencia, dentro del alcance de la presente invención, al uso de adenovirus de humano de tipo 2 o tipo 5 (Ad 2 o Ad 5) o adenovirus de origen animal (véase W094/26914). Dichos adenovirus de origen animal, los cuales se pueden usar dentro del alcance de la presente invención, incluyen adenovirus de origen canino, bovino, murino (ejemplo: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81 ), ovino, porcino, de aves y de simios (ejemplo: SAV). De preferencia, el adenovirus de origen animal es un adenovirus de canino, más preferiblemente un adenovirus CAV2 (por ejemplo, la cepa Manhattan o A26/61 ) (ATCC VR-800) De preferencia, los vectores adenovirales de replicación defectuosa de la invención comprenden los ITRs, una secuencia de encapsidación y el ácido nucleico de interés. Aún más preferiblemente, por lo menos la región E1 del vector adenoviral es no funcional. La deleción en la región E1 se extiende de preferencia de los nucieótidos 455 a 3329 en la secuencia del adenovirus Ad5 (fragmento Pvull-Bglll) o 382 a 3446 (fragmento Hinfll-Sau3A). Otras regiones pueden ser también ser modificadas, en particular la región E3 (WO95//02697), la región E2 (W094/28938), la región E4 (WO94/28152, WO94/12649 y WO95/02697), o en cualquiera de los genes tardíos L1-L5. En una modalidad preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en la región E1 (Ad 1.0). Ejemplos de adenovirus con E1 eliminada, se describen en EP 185 573, cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia. En otra modalidad preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en las regiones E1 y E4 (Ad 3.0). Ejemplos de adenovirus con E1/E4 eliminadas, se describen en los documentos WO95/02697 y WO96/22378, cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia. En todavía otra modalidad preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en la región E1 en la cual se insertan la región E4 y la secuencia de ácido nucleico (véase FR94 13355, cuyos contenidos se incorporan en ia presente como referencia). Los adenovirus recombinantes de repiicación defectuosa de la invención se pueden preparar mediante cualquier técnica conocida por los expertos en ia materia (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particular, se pueden preparar mediante recombinación homologa entre un adenovirus y un plásmido el cual posee, entre otras cosas, la secuencia de ADN de interés. La recombinación homologa se efectúa consecutiva a la cotransfección de dicho adenovirus y plásmido en una línea de células apropiada. De preferencia, la línea de células que se utiliza debe (i) ser transformable por los elementos, y (ii) contener las secuencias que sean capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus de replicación defectuosa, de preferencia en forma integrada, para evitar los riesgos de recombinación. Ejemplos de líneas de células que se pueden usar son la línea 293 de células de riñon embrionario humano (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), la cual contiene la porción izquierda del genoma del adenovirus Ad5 (12%) integrado en su genoma, y líneas de células que sean capaces de complementar las funciones de E1 y E4, como se describe en las solicitudes WO94/26914 y WO95/02697. Adenovirus recombinantes son recuperados y purificados usando técnicas estándar de biología molecular, las cuales son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Otros vectores Otros vectores virales Los virus adenoasociados (AAV) son virus de ADN de tamaño relativamente pequeño, los cuales se pueden integrar, en forma estable y especifica de sitio, en el genoma de las células que infectan. Son capaces de infectar a un amplio espectro de células sin inducir efectos sobre el crecimiento, morfología o diferenciación celular, y no parecen estar involucrados en patologías humanas. El genoma de AAV ha sido clonado, secuenciado y caracterizado. Abarca aproximadamente 4700 bases y contiene una región de repetición terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, la cual sirve como un origen de replicación para el virus. El resto del genoma está divido en dos regiones esenciales las cuales poseen las funciones de encapsidación: la parte izquierda del genoma, la cual contiene el gen rep involucrado en la replicación viral y expresión de los genes virales; y la parte derecha del genoma, la cual contiene el gen cap que codifica para las proteínas de la cápside del virus. Se ha descrito el uso de vectores derivados de los AAVs para la transferencia de genes in vitro e in vivo (véase WO91/18088; WO93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941 y EP 488 428). Estas publicaciones describen varias construcciones derivadas de AAV en las cuales los genes rep y/o cap son eliminados y reemplazados por un gen de interés, y el uso de estas construcciones para transferir dicho gen de interés in vitro (en células cultivadas) o in vivo (directamente en un organismo). Los AAVs recombinantes de replicación defectuosa de conformidad con la invención se pueden preparar cotransfectando un plásmido que contenga la secuencia de ácido nucleico de interés flanqueada por dos regiones de repetición terminal invertida (ITR) de AAV, y un plásmido que posea los genes de encapsidación de AAV (genes rep y cap), en una línea de células que es infectada con un virus auxiliar humano (por ejemplo, un adenovirus). Los recombinantes de AAV que son producidos, son entonces purificados mediante técnicas estándar. En otra modalidad, el gen puede ser introducido en un vector retroviral, por ejemplo, como se describe en Anderson et al., patente de E.U.A. No. 5,399,346; Mann ef al., 1983. Cell 33:153; Temin ef al., patente de E.U.A. No. 4,650,764; Temin ef al., patente de E.U.A. No. 4,980,289; Markowitz ef al., 1988, J. Virol. 62:1120: Termin et al., patente de E.U.A. No. 5,124,263; EP 453242, EP178220; Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689; publicación de patente internacional No. WO95/07358, publicada en marzo 16 1995 por Dougherty ef al., y Kuo et al., 1993, Blood 82:845. Los retrovirus son virus de integración que infectan a células en división. El genoma de los retrovirus incluye dos LTRs, una secuencia de encapsidación y tres regiones de codificación (gag, pol y env). En vectores retrovirales recombinantes, los genes gag, pol y env son generalmente eliminados, totalmente o en parte, y reemplazados con una secuencia de ácido nucleico heterólogo de interés. Estos vectores se pueden construir a partir de diferentes tipos de retrovirus tales como VIH, MoMuLV ("virus de leucemia Moloney de murinos"), MSV ("virus de sarcoma Moloney de murinos"), HaSV ("virus de sarcoma de Harvey"); SNV ("virus de necrosis del bazo"); RSV ("virus del sarcoma de Rous") y virus de Friend. Vectores retrovirales defectuosos se describen en WO95/02697.

Regiones reguladoras La expresión de un polipéptido de un vector de la invención, puede ser controlada por cualquier región reguladora, es decir, elemento promotor/intensificador conocido en la técnica, pero estos elementos reguladores deben ser funcionales en el tejido del hospedero, tal como un tumor objetivo, seleccionado para expresión. Las regiones reguladoras pueden comprender una región de promotor para transcripción funcional en la célula hospedera, así como también una región situada 3' del gen de interés, y la cual especifica una señal para término de la transcripción y una señal de poliadenilación. Todos estos elementos constituyen un cassette de expresión. Los promotores que se pueden usar en la presente invención incluyen promotores constitutivos y promotores regulados (inducibles). El promotor puede ser naturalmente responsable de la expresión del ácido nucleico. Puede ser también de una fuente heteróloga. En particular, puede estar constituido de secuencias de promotor de genes eucarióticos o virales. Por ejemplo, puede ser de secuencias de promotor derivadas del genoma de la célula la cual se desea infectar. Asimismo, puede ser de secuencias de promotor derivadas del genoma de un virus, incluyendo el adenovirus usado. A este respecto se puede mencionar, por ejemplo, los promotores de los genes EIA, MLP, CMV y RSV, y similares. Además, el promotor puede ser modificado mediante la adición de secuencias reguladoras o de activación o secuencias que permitan una expresión predominante o específica de tejidos (promotores de GFAP y de enolasa, y similares). Además, cuando el ácido nucleico no contiene secuencias de promotor, puede ser insertado, tal como en el genoma del virus hacia el extremo 3' de dicha secuencia. Algunos promotores útiles para la práctica de esta invención son promotores ubicuos (por ejemplo, HPRT, vimentina, actina, tubulina), promotores de filamentos intermedios(por ejemplo desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP), promotores de genes terapéuticos (por ejemplo, tipo MDR, CFTR, factor VIII), promotores específicos de tejidos (por ejemplo, promotor de actina en células de músculo liso), promotores que son activados preferentemente en células en división, promotores que responden a un estímulo (por ejemplo, receptor de hormona esteroide, receptor de ácido retinoico), moduladores de la transcripción regulados por tetraciclina, promotores inmediatos-tempranos de citomegalovirus, de LTR retrovirales, de metalotioneína, SV-40, Ela y MLP. Moduladores de la transcripción regulados por tetraciclina y promotores de CMV, se describen en WO 96/01313, US 5,168,062 y 5,385,839, cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia. De esta manera, los promotores que se pueden usar para el control de la expresión génica incluyen, pero no están limitados a, el promotor de citomegalovirus (CMV), la región de promotor temprana de SV40 (Benoist y Chambón, 1981 , Nature 290:304-310), el promotor contenido en ia repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina cinasa de herpes (Wagner et al., 1981 , Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 269:39-42), vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de b-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); o el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94; elementos de promotor de levaduras u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor PGK (fosfoglicerol cinasa), promotor de fosfatasa alcalina; y las regiones de control de la transcripción en animales, las cuales exhiben carácter específico de tejidos y han sido utilizadas en animales transgénicos; región de control del gen I de elastasa, la cual es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al; Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); región de control del gen de insulina, la cual es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), región de control del gen de inmunoglobulina, la cual es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control de virus tumorales mamarios de ratones, la cual es activa en células testiculares, de mama, linfoides y cebadas (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), región de control del gen de albúmina, la cual es activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1 :268-276), región de control del gen de alfa-fotoproteína, la cual es activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58), región de control del gen de alfa-1 -antitripsina, la cual es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1 :161-171), región de control del gen de beta-globina, la cual es activa en células mieloides (Mogran et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94), región de control del gen de proteína básica de mielina, la cual es activa en oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712), región de control del gen 2 de la cadena ligera de miosina, la cual es activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286), y región de control del gen de hormona liberadora de gonadotropina, la cual es activa en el hipotálamo (Masón et al., 1986, Science 234:1372-1378).

Genes terapéuticos Ejemplos de proteínas heterólogas expresadas por vectores incluyen, pero no están limitados a, proteínas supresoras de tumores tales como p53; genes suicidas tales como timidina cinasa de virus de herpes simple (HSV-tk); factores de crecimiento tales como factor ácido de crecimiento de fibroblastos (FGF); factores angiogénicos tales como factor FGF o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); factores tróficos tales como factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico 3 (NT-3), NT-4, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) y factor neurotrófico ciliar (CNTF); etc. En una modalidad específica, la proteína heteróloga es p53. En una segunda modalidad específica, la proteína heteróloga es HSV-TK. Naturalmente, la presente invención provee además un método para preparar una formulación de adenovirus recombinante que comprende preparar una mezcla de un adenovirus recombinante y una concentración de HSA efectiva para estabilizar al vector de adenovirus a una temperatura arriba del punto de congelación del agua, o para intensificar un título del vector de adenovirus comparativamente con un título en ausencia de HSA, o ambos, en un regulador de pH acuoso. En una modalidad, la temperatura es mayor que o igual a 4°C y menor de 37°C. En otra modalidad, la temperatura es mayor que o igual a 20°C. De preferencia, cuando la temperatura es mayor de 4°C, y particularmente cuando la temperatura es mayor de 20°C, la concentración de HSA es de 5%, el pH de la mezcla es mayor de 8.0, o ambos. En un aspecto más, la presente invención provee un método para estabilizar un vector de adenovirus, a aproximadamente 20°C, mediante la preparación de una mezcla del vector de adenovirus en una composición acuosa de solución salina de Dulbecco regulada en su pH con fosfato, glicerol de aproximadamente 5% a 15%, CaCI2 de aproximadamente 0.25 a 2.0 mM y - MgCI2 de aproximadamente 0.1 a 1.0 mM. En una modalidad específica, la concentración de glicerol es de 10%, la concentración de CaCI2 es de aproximadamente 1.0 mM y la concentración de MgCI2 es de aproximadamente 0.5 mM.

El uso de una formulación de conformidad con la invención hace posible preservar partículas virales y vectores virales, y administrarla directamente en un sujeto, sin un paso de centrifugación o lavado, con una buena viabilidad y/o sin afectar su capacidad para infectar a una célula susceptible del organismo. Para este fin, la presente invención se refiere también a preparaciones que contienen la formulación de preservación de conformidad con la invención, y partículas virales o vectores virales, así como también a un procedimiento para el almacenamiento de las partículas virales o vectores virales. Las partículas virales o los vectores virales pueden ser empacados directamente en la formulación de conformidad con la invención. Con respecto a los virus, estos son purificados previamente como se describe en la presente (por ejemplo, mediante centrifugación en un gradiente de cloruro de cesio, cromatografía de columna, purificación en placa, y similares). Pueden ser empacados al régimen de 104 a 1015 partículas por ml, de preferencia de 105 a 1010, o más preferiblemente, 109-1013. Las partículas virales o los vectores virales pueden ser empacados entonces en la formulación de conformidad con la invención, en un contenedor apropiado. El contenedor puede ser una ampolleta, un tubo, especialmente un criotubo, una bolsa, un recipiente, un matraz, y similares. El contenedor es esterilizado previamente, y las operaciones de empaque se llevan a cabo bajo condiciones estériles. Un medio o formulación de conformidad con la invención permite el almacenamiento y la preservación de partículas virales o vectores virales bajo condiciones que preservan buena viabilidad. La formulación de conformidad con la invención puede permitir, en particular, el almacenamiento de las partículas o los vectores a una temperatura mayor arriba del punto de congelación del agua. En una modalidad preferida, los medios de conformidad con la invención pueden permitir el almacenamiento de vectores de adenovirus recombinante a una temperatura arriba del punto de congelación del agua, o intensificar un título del vector de adenovirus comparativamente con un título en ausencia de HSA, o ambos, en un regulador de pH acuoso.

Composiciones farmacéuticas Para su uso de conformidad con la presente invención, los vectores, en forma de un vector de virus o partícula viral, se combinan de preferencia con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables para una formulación inyectable. El término "vehículo" se refiere a un diluyente adyuvante, excipiente o vehículo con el cual el compuesto es administrado. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles tales como agua y aceites, incluyendo los que se originan de petróleo, así como de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares. Agua, soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, se utilizan de preferencia como vehículos, particularmente para soluciones inyectables. Vehículos farmacéuticos aceptables se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Estos pueden ser en particular soluciones salinas estériles isotónicas (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, y similares, o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, especialmente composiciones deshidratadas por congelación después de la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, y permiten la constitución de soluciones inyectables. Las preparaciones inyectables estériles preferidas pueden ser una solución o suspensión en un solvente o diluyente no tóxico parenteralmente aceptable. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son solución salina, solución salina regulada en su pH, solución salina isotónica (por ejemplo, fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, o mezclas de dichas sales), solución de Ringer, dextrosa, agua, agua estéril, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. 1 ,3-butanodiol y aceites fijados estériles, se utilizan convenientemente como solventes o medios de suspensión. Cualquier aceite fijado se puede utilizar, incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Aceite grasos tales como ácido oleico pueden encontrar uso en la preparación de soluciones inyectables. La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se usa en la presente para indicar una cantidad suficiente para reducir en por lo menos aproximadamente 15 por ciento, de preferencia en por lo menos 50 por ciento, más preferiblemente en por lo menos 90 por ciento, y muy preferiblemente para prevenir un déficit clínicamente significativo en la actividad, función y respuesta del sujeto. En forma alternativa, una cantidad terapéuticamente efectiva es suficiente para causar una mejora en una condición clínicamente significativa en el sujeto.

Administración de las composiciones De conformidad con la invención, la composición de la invención puede ser introducida parenteralmente o transmucosamente, por ejemplo, oralmente, nasalmente o rectamente, o transdérmicamente. De preferencia, la administración es parenteral, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, e incluye también pero no está limitada a, administración intraarteriolar, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventicular e intracraneal. Para terapia génica de un cáncer, la administración de la composición se puede llevar a cabo también mediante inyección en un tumor o en tejidos alrededor del tumor. La vía de administración preferida a un tumor es mediante inyección directa en el tumor. Se puede obtener una imagen del tumor usando cualquiera de las técnicas disponibles en la materia, tales como formación de imágenes por resonancia magnética o tomografía asistida por computadora, y la composición terapéutica se puede administrar, por ejemplo, mediante inyección estereotáctica. En forma alternativa, si un tumor objetivo se caracteriza por un antígeno en particular, un vector de la invención puede ser dirigido al antígeno como se describió anteriormente, y administrado sistémicamente o subsistémicamente, según sea apropiado, por ejemplo, intravenosamente, ¡ntraarterioralmente, intraperitonealmente, intraventricularmente, etc. Las dosis del virus usadas para la administración se pueden adaptar como una función de varios parámetros, y en particular como una función del sitio de administración considerado, el número de inyecciones, el gen que será expresado, o alternativamente la duración deseada del tratamiento. En general, los adenovirus recombinantes de conformidad con la invención se formulan y se administran en forma de dosis entre 104 y 1010 pfu, y de preferencia de 105 a 1011. El término pfu (unidad de formación en placa) corresponde al carácter infeccioso de una solución viral, y se determina infectando un cultivo de células apropiado y midiendo, generalmente dentro de 15 días, el número de placas de células infectadas. Para adenovirus p53 y adenovirus HSV-TK, típicamente se hace el conteo del número de placas en el día 7. Para otros virus, la evaluación se hace en los días 12 a 14. La técnica para determinar el título de la pfu de una solución viral está bien documentada en la literatura. De esta manera, las composiciones de la invención pueden ser suministradas mediante administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, pulmonar o subcutánea. En forma alternativa, las composiciones formuladas apropiadamente, pueden ser administradas mediante administración nasal u oral. Se puede asegurar un suministro constante de las partículas virales o los vectores virales proveyendo una dosis terapéuticamente efectiva (es decir, una dosis efectiva para inducir cambios metabólicos en un sujeto) a los intervalos necesarios, por ejemplo, diariamente, semanalmente, mensualmente, etc. Estos parámetros dependerán de la severidad de la condición de enfermedad que está siendo tratada, otras acciones tales como modificación de la dieta que son ¡mplementadas, el peso, edad y sexo del sujeto, y otros criterios, los cuales pueden ser determinados fácilmente de conformidad con una buena práctica médica estándar por los expertos en la técnica. Un sujeto en quien la administración de una partícula viral o vector viral dentro del alcance de la invención se lleva a cabo, es de preferencia un humano, pero también puede ser cualquier animal. De esta manera, como puede ser apreciado fácilmente por los expertos en la técnica, los métodos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente adecuados para administración a cualquier animal, particularmente un mamífero que incluye, pero de ninguna manera está limitado a, animales domésticos tales como felinos o caninos, animales de granja tales como, pero no limitados a, bovinos, equinos, caprinos, ovinos y porcinos, animales silvestres (ya sea en estado silvestre o en un parque zoológico), animales de investigación tales como ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, cerdos, perros, gatos, etc., y especies de aves tales como pollos, pavos, aves canoras, etc., es decir, para uso médico veterinario. La presente invención puede ser mejor entendida con relación a los siguientes ejemplos no limitativos, los cuales se proveen como ejemplos de la invención.

EJEMPLOS Biología molecular general De conformidad con la presente invención, se pueden utilizar técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y de ADN recombinante dentro del alcance de la técnica. Dichas técnicas se explican en detalle en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (cita referida en la presente como "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridazation [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription and Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press (1986)]; B. Perbal, A. Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

EJEMPLO 1 Prueba de estabilidad de formulaciones de adenovirus a temperaturas arriba del punto de congelación Inicialmente, las preparaciones de adenovirus fueron almacenadas a -70°C en soluciones de glicerol reguladas en su pH para proveer la mejor estabilidad a largo plazo. Puesto que un almacenamiento a -70°C puede no estar disponible en la instalación clínica, se requiere una formulación que preserve al virus a -20°C o temperaturas mayores. Este ejemplo resume los datos de seis meses para cuatro formulaciones puestas a prueba a cinco temperaturas de almacenamiento. Este estudio se diseñó para determinar una formulación óptima de vector de adenovirus para lograr una estabilidad de por lo menos un (1 ) año cuando se almacenara congelada a -20°C, o como un líquido a temperaturas de almacenamiento de +4°C o +20°C. Un control positivo consistió del virus almacenado en solución salina de Dulbecco regulada en su pH con fosfato (DPBS), glicerol a 10%, CaCI2 a 1.0 mM y MgCI2 a 0.5 mM a -70°C. Muestras de prueba para las cuatro formulaciones se hicieron pasar a través de una columna Sephadex G25 para intercambio de regulador de pH. Muestras de virus por triplicado y controles positivos se pusieron a prueba a intervalos de un mes durante 3 meses consecutivos, y entonces cada mes y cada quince días. El título viral en unidades de formación en placa (pfu) se determinó mediante prueba en placa usando células 293. Se usó un método de CLAR analítico para determinar mediciones de partículas virales/ml mediante el área máxima de una densidad óptica (OD) a 260 nm. Las partículas virales se determinaron mediante mediciones de UV hechas en formulaciones que no contenían HSA. La prueba de bioactividad se usó como una prueba adicional para actividad viral en puntos de tiempo seleccionados.

Métodos Preparación de la muestra de virus Un adenovirus de tipo 5 que comprendía el gen p53 bajo el control del promotor de citomegalovirus, Ad5CMVp53 (como se describe en la solicitud de patente internacional US95/04898), en DPBS + glicerol a 10%, filtrado a 0.2 µm en recipientes de 10 ml, se usó en estos experimentos. El título del virus se estimó como 1.38 x 1011 pfu/ml y 3.44 x 1012 partículas/ml. En el primer día del estudio, trece recipientes de Ad5CMVp53 fueron descongelados a temperatura ambiente y agrupados. Se hicieron mediciones de OD a 260 nm en el material reunido para determinar las partículas originales/ml. Treinta ml del material agrupado se hicieron correr entonces a través de una columna Sephadex G25 (200 ml; Pharmacia, número de catálogo 17-0033-01 , lote 241586) para intercambio de regulador de pH en cada una de las formulaciones. El intercambio de regulador de pH se llevó a cabo para poner el virus en las formulaciones apropiadas para la realización de las pruebas. Cuatro formulaciones fueron puestas a prueba y se definen en el cuadro 1.

CUADRO 1 Formulaciones de prueba Formulación 1 : DPBS, glicerol a 10%, CaCI2 a 1.0 mM y MgCI2 a 0.5 mM Formulación 2: DPBS, HSA a 5%, sacarosa a 5%, CaCI2 a 1.0 mM y MgCI2 a 0.5 mM Formulación 3: Tris-HCl a 10 mM, pH 7.5, HSA a 5%, sacarosa a 5%, MgCI2 a 2.0 mM, NaCI a 150 mM Formulación 4: Tris-HCl a 10 mM, pH 8.2, HSA a 5%, sacarosa a 5%, MgCI2 a 2.0 mM, NaCI a 150 mM Únicamente HSA a 0.5% estaba presente en las formulaciones 2, 3 y 4 al momento del intercambio de regulador de pH. Se llevaron a cabo mediciones de OD después del intercambio de regulador de pH a 260 nm para determinar la dilución de partículas que ocurría durante el procedimiento de intercambio. La dilución de partículas se reportó con por ciento de rendimiento. Después de que concluyeron el intercambio de regulador de pH y las mediciones de OD, se añadió HSA a las formulaciones apropiadas. La dilución de las muestras mediante intercambio de regulador de pH y adición de HSA se calculó mediante la siguiente ecuación (dilución en la columna) X (% de rendimiento) X (dilución de HSA). Todas las muestras fueron diluidas hasta una dilución final de 3.2 veces a partir de la concentración original. Después de la dilución final, todas las muestras fueron almacenadas durante la noche a +4°C, y se distribuyeron en alícuotas y se pusieron a prueba al siguiente día. Las cuatro muestras de formulación del virus fueron distribuidas en alícuotas en recipientes ámbar de vidrio marcados (Kimble #203), 0.42 ml cada una y almacenadas a las temperaturas apropiadas, -20°C (congelador VWR Scientific), -4°C (cámara LabLine Ambi HiLo), +4°C (caja deli de dos puertas VWR Scientific modelo GDM-49), +20°C y +37°C (Queue Systems, Inc., incubadora Cell Star modelo No. QWJ8000ABA). Las muestras para almacenamiento a -20°C fueron congeladas hasta -40°C en un congelador de velocidad controlada antes de su almacenamiento a -20°C. Las temperaturas de -4°C, +20°C y +37°C se usaron como temperaturas elevadas con las cuales se determinó la estabilidad "acelerada" de las formulaciones de virus a -20°C.

Preparación de la muestra de control positivo El volumen restante de la concentración de virus original, después de que las muestras de prueba habían sido retiradas para intercambio de regulador de pH, fue diluido 3.2 veces para igualar la dilución de las muestras de prueba descritas anteriormente. El control fue diluido en DPBS, glicerol a 10%, CaCI2 a 1.0 mM y MgCI2 a 0.5 mM para simular la presente formulación de Ad5CMVp53. El virus control fue distribuido en alícuotas, 0.42 ml por crio-recipiente (Nalgene No. 5000-0020, lote 072381), y almacenado a -70°C (BioFreezer, Forma Scientific modelo No. 8328).

Análisis de la formulación Las cuatro formulaciones fueron analizadas después de 0, 1 , 2, 3, 4, 5 y 6 meses de almacenamiento a diferentes temperaturas con respecto a varios parámetros como se describe en el cuadro 2.

CUADRO 2 Resumen del análisis de formulación de 6 meses Sin embargo, todas las temperaturas no fueron puestas a prueba en cada punto de tiempo debido a resultados previos que indicaban que no se requería análisis adicional.

Análisis de prueba en placa El título viral fue determinado mediante la prueba en placa en células 293, células de riñon embrionario humano transformadas con ADN de Ad5 humano compartido (región E1 complementaria). En puntos de tiempo designados, se pusieron a prueba muestras de prueba por triplicado y controles positivos por triplicado para unidades de formación en placa. Dos días antes de la realización de las pruebas, se sembraron células 293 (ATCC®, No. de catálogo CRL 1573) en placas para cultivo de tejidos de 6 cm. En el día de la realización de las pruebas, las muestras de virus y el control positivo fueron diluidos en serie en MEM + HEPES a 0.5%. Dos o más diluciones que se esperaba produjeran placas contables, se usaron para infectar a las células 293. Tres placas de 6 cm confluentes de células 293 fueron infectadas con 0.5 ml de cada muestra de virus y dilución de control positivo. Las placas fueron incubadas a 37°C, CO2 a 5.0% y 95% de humedad relativa durante 2 horas con oscilación cada 15 minutos. Después de la incubación, las muestras fueron aspiradas, y las placas fueron cubiertas con agarosa SeaKem a 0.5%, MEM y FBS a 7.5%. Las placas fueron incubadas entonces a 37°C, CO2 a 5.0% y 95% de humedad relativa. Después de 5 días de incubación, las placas fueron teñidas con rojo neutro a 0.1 % en MEM durante la noche a 37°C. Al siguiente día, el colorante fue aspirado y se hizo el conteo de placas. El título de cada dilución se determinó en unidades de formación en placa por ml (pfu/ml) mediante la siguiente ecuación: [(conteo promedio X dilución)/volumen]. Se determinó el título de la pfu/ml de una muestra promediando la pfu/ml de las diluciones. Se determinaron promedios de muestra por triplicado para cada punto de tiempo. Los resultados fueron graficados en EXCEL de Microsoft para análisis posterior. 4 Análisis de CLAR Se hicieron comparaciones del área máxima de CLAR para determinar la concentración del virus en términos de partículas virales entre muestras y controles positivos. Cada control positivo y muestra por triplicado fueron puestos a prueba en un sistema de CLAR analítico Waters con programa Millennium. Por poco tiempo, 100 µl de la muestra de prueba y control positivo fueron inyectados en una columna Resource Q de 1 ml de 6.4x30 mm (Pharmacia, No. de catálogo 17-1177-01), usando una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. Las muestras fueron almacenadas de 2 a 8°C en el muestreador automático Waters durante la corrida completa. El gradiente de la corrida consistió de línea A: regulador de pH A (Tris a 50 mM, pH 7.5), línea B: regulador de pH B (Tris a 50 mM + NaCI a 1 M, pH 7.5), línea C: regulador de pH C (NaOH a 0.5 N, solución de limpieza usada para limpiar la columna después de cada corrida del virus), y línea D: regulador de pH D (agua). El adenovirus intacto es eluido entre 18 a 22 minutos después del inicio de la corrida. El área máxima de cada valor máximo individual eluido en el gradiente completo es reportada mediante el programa Millennium. Únicamente el valor máximo de adenovirus que es eluido como un valor máximo individual en la escala de 18 a 22 minutos, se usó como una indicación de la concentración de partículas virales. El área máxima para el valor máximo del virus es integrado y reportado mediante el programa Millennium. Los datos fueron graficados y analizados en EXCEL de Microsoft.

Densidad óptica mediante análisis de UV Se determinaron las concentraciones de partículas virales por ml para las muestras de la formulación I y el control positivo que no contenían HSA. Las formulaciones que contenían HSA no fueron puestas a prueba para partículas medíante OD debido a que HSA a 5% interfería con la lectura (datos no mostrados). Por poco tiempo, 50 µl de SDS a 1% y 50 µl de la muestra fueron incubados durante 20 minutos a temperatura ambiente, y diluidos entonces 1:10 con agua desionizada. Las muestras fueron leídas a 260 nm y 280 nm. La relación de 260/280 se calculó para determinar la pureza. El coeficiente de extinción de OD26o de 1=1012 partículas/ml, se usó para calcular las partículas virales/ml de la muestra de prueba y el control positivo. Los datos fueron graficados y analizados en EXCEL del Microsoft.

Análisis de prueba de bioactividad La expresión del transgen p53 se determinó mediante la inhibición de la proliferación de células Saos-LM2, una línea de células tumorales humanas derivadas de una metástasis pulmonar a partir de sarcoma osteogénico. En esta prueba, 3 x 103 células Saos-LM2/cavidad fueron sembradas en placas de título 96 cavidades en DMEM de alto contenido de glucosa (HG) + FBS a 10% inactivado con calor (Hl) 3 días antes de la infección, con las muestras de virus diluidas hasta varias multiplicidades de infección (10, 20, 40, 80 y 160 MOI) en DMEM-HG + FBS-HI a 10%. Las células infectadas fueron incubadas a 37°C durante 4 días, y teñidas entonces con azul alamar, un indicador de crecimiento celular, e incubadas durante 8 horas. Las placas con azul alamar fueron leídas entonces a 570 nm y 595 nm para determina la OD. La densidad óptica se calculó usando la siguiente ecuación: OD=Absorbancia570nm-Absorbancia595n - La inhibición de la proliferación se gráfico como un porcentaje de reducción de azul alamar en EXCEL de Microsoft para análisis posterior Análisis estadístico Se hicieron los cálculos de desviaciones estándar y media para muestra por triplicado.

Resultados Resultados de las pruebas en placa Los resultados de las pruebas en placa para estabilidad de adenovirus a 4°C y 20°C se muestran en las figuras 1 y 2. A -20°C, todas las formulaciones puestas a prueba fueron estables durante 6 meses (datos no mostrados). A 4°C y 20°C, la formulación 4 demostró estabilidad incrementada en todos los puntos de tiempo (figuras 1 y 2). En forma sorprendente, a - °C, la formulación 4 demostró la misma actividad de pfu como las otras formulaciones (datos no mostrados). A 37°C, todas las formulaciones fueron inestables (datos no mostrados).

El almacenamiento a +4°C permitió la determinación de las diferencias de estabilidad entre las formulaciones. La formulación 1 dio mejores resultados que las formulaciones 2 y 3 después de 1 mes de almacenamiento a +4°C; sin embargo, disminuyó significativamente en pfu/ml en más de 1 log en el mes 3 (figura 1). La formulación 1 no dio resultados tan buenos como la formulación 4 cuando se almacenó a +4°C en todos los puntos de tiempo puestos a prueba (figura 1). Las formulaciones 2 y 3 mostraron un decremento inicial en el título consecutivo a 1 mes de almacenamiento a +4°C (figura 1 ). A +4°C, la formulación 1 permaneció esencialmente sin cambios hasta 3 meses, y mostró pérdida de actividad partiendo en los 4.5 meses (figura 1 ). El almacenamiento a +20°C permitió también la determinación de las diferencias de estabilidad entre las formulaciones. Las formulaciones 1 y 4 mostraron la mejor retención de la actividad viral a +20°C durante 6 meses (figura 2). La formulación 4 mostró la disminución más baja durante 6 meses (cuadro 3), que cual es únicamente de 0.33 logs.

CUADRO 3 Nota: 1 Log= se calcula mediante (Log T=6 pfu/ml)-(Log T=0 pfu/ml). Resultado A (-) = pérdida, resultado a(+) = ganancia. Nota 2: Las muestras almacenadas a -4°C y +37°C perdieron más de 4 logs de actividades a T=1 mes, y fueron descontinuadas en el esquema de prueba.

La formulación 1 parece ser la segunda mejor formulación, ya que sólo disminuyó en 2 logs. Los puntos de datos "demasiados numerosos para contar" (TNTC) en la figura 2, indicaron que los títulos reales deben ser mayores que los valores reportados. Partiendo en el mes 1 , las formulaciones 2 y 3 mostraron una reducción en el título cuando fueron almacenadas a +20°C (figura 2), lo cual fue apoyado por las pruebas de bioactividad y por CLAR. Las formulaciones 2 y 3 fueron menos favorables para estabilidad a largo plazo que las formulaciones 1 y 4.

El almacenamiento a -4°C y a +37°C durante un mes mostró una pérdida drástica de actividad para las cuatro formulaciones (datos no mostrados). La actividad disminuida de las muestras almacenadas a -4°C y a +37°C, fue apoyada por los resultados de CLAR y análisis de OD. Todas las muestras almacenadas a -4°C fueron líquidas, no congeladas. Esto pudo haberse debido a las grandes cantidades de excipientes en las formulaciones que evitan el congelamiento completo a -4°C. Por lo tanto, las muestras almacenadas a -4°C pudieron haber estado en una fase de transición entre líquido y sólido, en donde los cristales de hierro pudieron haber causado daños. Además, las muestras almacenadas a -4°C no pudieron usarse para cálculos de vida en almacenamiento acelerado para almacenamiento en congelación a -20°C debido a que no fueron congeladas. Las muestras almacenadas a -4°C y a +37°C fueron descontinuadas en el mes 1. En resumen, los datos del título viral en el mes 6 indicaron que la formulación 4 representa una formulación viral que se prefiere para preservar la estabilidad y actividad viral (carácter infeccioso), especialmente a +20°C.

Resultados de CLAR El área máxima de CLAR permite la cuantificación de las partículas virales. Se ha determinado que la variación de ia prueba de CLAR es de ±3%. Debido a las pequeñas desviaciones estándar en las áreas máximas de CLAR, cualquier variación pequeña entre los puntos de tiempo puede ser estadísticamente significativa. Se gráfico el área máxima de CLAR mediante temperatura sobre tiempo para las cuatro formulaciones, y se correlación bien con los resultados de pfu/ml descritos anteriormente. En el tiempo 0, las cuatro formulaciones tienen partículas virales similares/ml. Aunque los valores del área máxima mostraron una variación estadísticamente significativa, la diferencia entre las formulaciones en el punto de tiempo 0 fue menor de 7%. Este bajo porcentaje de variación indica que no ocurrió una gran variación en la distribución en alícuotas y diluciones entre las cuatro formulaciones. A -20°C, las cuatro formulaciones permanecieron relativamente sin cambios con el tiempo (datos no mostrados). A +4°C, las cuatro formulaciones excepto la formulación 4 mostraron pérdida significativa en las partículas virales de 1 a 6 meses. La formulación 4 mantuvo la concentración de partículas virales hasta 4.5 meses, cuando su área máxima se redujo en forma similar hasta el nivel de las formulaciones 1 , 2 y 3 (datos no mostrados). A +20°C, únicamente las formulaciones 2 y 3 mostraron una pérdida consistente de partículas virales de 1 a 6 meses, mientras que las formulaciones 1 y 4 mantuvieron la mayor parte de sus partículas virales (datos no mostrados). En forma similar a los datos de prueba en placa, para las formulaciones almacenadas a -4°C y a +37°C, las cuatro formulaciones mostraron una disminución drástica en el área máxima de CLAR en el mes 1 (datos no mostrados). 5 En resumen, los resultados de CLAR mostraron una tendencia similar en estabilidad que los resultados de prueba en placa para cada formulación. Las cuatro formulaciones mostraron decrementos significativos en el título viral junto con decrementos significativos de partículas virales después de tan sólo un mes cuando fueron almacenadas a -4°C o +37°C.

Resultados de la prueba de bioactívidad Las formulaciones fueron graf?cadas mediante temperaturas sobre tiempo, a un MOI de 20. Los resultados se reportaron como porcentaje de inhibición del crecimiento celular. La muerte celular incrementada causada por la infección viral causó un incremento en la inhibición del crecimiento celular, determinado por una reducción de azul alamar en células infectadas, comparativamente con células no infectadas. Los datos de bioactividad apoyan también los resultados de estabilidad obtenidos a partir de las pruebas de CLAR y de pfu. La formulación 4 a +4°C durante 6 meses retuvo más de 50% de inhibición del crecimiento celular, la cual es la especificación clínica para este producto. A -20°C, todas las formulaciones dieron resultados similares (datos no mostrados). La formulación 1 dio malos resultados a los 2 meses, pero no a los 3 y 6 meses, indicando que los datos a los 2 meses fueron anómalos (datos no mostrados). A +4°C, las formulaciones 1 , 2 y 3 no dieron resultados tan buenos con respecto a preservar la bioactividad como la formulación 4 durante los meses 2 y 3 (figura 3). Los datos demostraron que la formulación 4 retuvo una bioactividad similar al control positivo en los meses 2 y 3, y pérdida de actividad en el mes 6. Estos datos se correlacionan bien con la prueba en placa y los resultados de CLAR presentados anteriormente. A +20°C, como en los resultados de prueba en placa, las formulaciones 1 y 4 retuvieron una bioactividad similar al control positivo hasta el tercer mes, y comenzaron a mostrar pérdida de actividad a los 6 meses (figura 4). La formulación 4 dio aun la mejor bioactividad entre las cuatro formulaciones. Las formulaciones 2 y 3 no dieron buenos resultados después de 2 ó 3 meses de almacenamiento (figura 4).

Discusión Los resultados de este estudio indicaron que las cuatro formulaciones analizadas no disminuyeron significativamente el título viral (pfu/ml) durante un período de 3 meses cuando fueron almacenadas a -20°C. Los datos de bíoactividad apoyan esta conclusión. Las cuatro formulaciones demostraron ser estables a -20°C durante 6 meses. Las formulaciones 1 , 2 y 3 diminuyeron el título viral en más de 2 logs cuando fueron almacenadas a +4°C, y en más de 53% cuando fueron medidas mediante el área máxima de CLAR. A un almacenamiento a +4°C, la formulación 4 fue la más estable durante el período de almacenamiento de 3 meses, según lo demuestran la prueba en placa y las mediciones del área máxima de CLAR de partículas/ml cuando fueron reducidas en sólo 14.8%.

Estas conclusiones fueron apoyadas por los resultados de la prueba de bioactividad. De esta manera, la formulación 4 demostró ser más estable a +4°C durante 3 meses. El título viral para las formulaciones 1 y 4 permaneció estable, dentro de la variación de prueba, durante 3 meses cuando fue almacenado a +20°C, pero el título de la formulación 1 disminuyó en 2 logs, y el título de la formulación 4 disminuyó en 0.3 logs entre 3 a 6 meses. La medición de las partículas virales mediante área máxima de CLAR mostró una reducción de apenas 11.1% para la formulación 1 , y de 23.8% para la formulación 4 alrededor del mes 3, pero de 15% para la formulación 1 y de 8% para la formulación 4 a los 6 meses. Los virus almacenados en las formulaciones 2 y 3 fueron reducidos significativamente en el título viral en más de 2 logs en el mes 3. El número de partículas virales por mililitro, medido mediante CLAR, disminuyó en más de 30%. La disminución de bioactividad se correlacionó con estas conclusiones. De esta manera, la formulación 4 demostró ser más estable a +20°C durante 6 meses. Las cuatro formulaciones fueron inestables cuando fueron almacenadas a -4°C, dando como resultado una reducción en el título viral que fue mayor de 4 logs en el primer mes, y una pérdida de partículas mayor de 71% cuando fue medido mediante área máxima de CLAR. Además, el almacenamiento de las cuatro formulaciones a 37°C durante 1 mes, dio como resultado un título viral disminuido que fue mayor de 5 logs, y una pérdida de más de 85% de las partículas cuando fue medido mediante área máxima de CLAR. De esta manera, ninguna de las formulaciones analizadas demostró ser estable a -4°C o +37°C. De conformidad con este estudio, la formulación 4, regulador de pH Tris a 10 mM, pH 8.2, HSA a 5%, sacarosa a 5%, MgCI2 a 2 mM y NaCI a 150 mM, fue la más favorable para almacenamiento viral a largo plazo. Los resultados de la prueba en placa, área máxima de CLAR, medición de partículas/ml y prueba de bioactividad, se correlacionaron bien entre sí y sugirieron que la formulación 4 retuvo actividad viral durante 6 meses cuando fue almacenada a -20°C y +20°C. Estos datos sugieren también que la formulación original de DPBS, glicerol a 10%, CaCI2 a 1.0 mM y MgCI2 a 0.5 mM (formulación 1), retuvo la mayor parte de su actividad durante 3 meses a -20°C y +20°C. Con el tiempo, la formulación 1 dio como resultado una disminución en el título viral y partículas/ml cuando fue almacenada a +4°C. La formulación 4 comenzó a mostrar pérdida de actividad y de partículas virales, después de 3 meses.

EJEMPLO 2 Selección de formulaciones para preservar títulos virales a -20°C Estos experimentos permiten seleccionar varias formulaciones para determinar su capacidad para preservar la actividad viral, medida mediante prueba en placa, cuando fueron almacenadas a -20°C. Estos experimentos permitieron poner a prueba varios reguladores de pH y excipientes en cuanto a sus efectos sobre el título viral a -20°C. Con respecto al tipo de regulador de pH, concentración de saies, presencia de cationes divalentes y tiempo a -20°C (1 día contra 9 días), no se observaron diferencias en el título viral mediante la prueba en placa. Sin embargo, la adición de sacarosa y/o albúmina de suero humano (HSA) demostró un incremento inesperado en el carácter infeccioso del virus, comparativamente con el control.

Métodos Preparación de formulaciones de muestra de virus Para estos experimentos, se usó un adenovirus tipo 5 que contiene el gen p53 bajo el control del promotor de citomegalovirus (CMV), Ad5CMVp53. Este material fue diluido en varias formulaciones de prueba, congelado, descongelado y analizado mediante prueba en placa. El virus de abastecimiento fue diluido 100 veces en varias formulaciones de prueba, las cuales se dan en el cuadro 4. Los componentes del regulador de pH fueron solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) a 10 mM, pH 7.2, o solución salina regulada en su pH con Tris a 10 mM, pH 7.5. Otros excipientes del regulador de pH incluyeron NaCI a 50 mM, 150 mM o 300 mM, cationes divalentes (CaCI2 a 1 mM y MgCI2 a 0.5 mM), sacarosa a 5% y HSA a 1 %, 5% o 10%. Las muestras fueron distribuidas en alícuotas y congeladas en recipientes usando el congelador de velocidad controlada, y transferidas a un congelador a -20°C para almacenamiento, como se describe en el ejemplo 1. En el día 1 y 9 días después de la congelación, las muestras fueron descongeladas y puestas a prueba para actividad viral mediante la prueba en placa estándar.

CUADRO 4 Formulaciones de prueba Preparación de muestras de virus control El Ad5CMVp53 usado en las preparaciones de la formulación de prueba anterior fue diluido en el regulador de pH estándar (DPBS, MgCI2 a 0.5 mM, CaCI2 a 1 mM y glicerol a 10%, pH 7.2), y tratado en forma idéntica a las muestras de prueba como se describió anteriormente.

Prueba en placa Se llevó a cabo la prueba en placa viral como se describió en el ejemplo 1. Se promediaron ios conteos en placa por duplicado para cada dilución. Los cálculos para pfu/ml incluyen la dilución de 100 veces en reguladores de pH de prueba, y se hicieron como se describió en el ejemplo 1.

Estadística Los datos fueron transferidos al programa Systat versión 5 para análisis estadístico. Se llevaron a cabo pruebas t y de regresión lineal para determinar las diferencias entre los grupos, usando un valor alfa de p=0.05.

Resultados y discusión Efectos del regulador de pH, concentración de sales y cationes divalentes sobre el título viral a -20°C Se analizaron las formulaciones 1 a 12 para determinar los efectos de la adición del regulador de pH, concentración de sales y/o cationes divalentes sobre los títulos virales. Los resultados de las pruebas en placa después del primer día y nueve días de almacenamiento a -20°C, para las formulaciones 1 a 12, se muestran en el cuadro 5. Las muestras del congelador libre de escarcha se usaron para la prueba del día 1.

CUADRO 5 Resultados de la prueba en placa Es evidente a partir de los datos que no se observan grandes diferencias. De hecho, la confianza de variación general (CV = (desviación estándar/promedio) x 100%) para cada día, que se obtiene combinando todas las formulaciones, es casi igual a las de las réplicas dentro de un experimento para resultados de variación intra-prueba. Se llevó a cabo un análisis de regresión múltiple para título viral (pfu/ml) con respecto a regulador de pH, concentración de sales, presencia de cationes divalentes y días 1 contra 9 de exposición a -20°C, pero no se encontraron diferencias significativas (datos no mostrados). Con respecto a los reguladores de pH PBS y Tris, no se encontraron diferencias (p = 0.784). No hubo relación alguna para el efecto de la concentración de sales, a partir de 50 mM a 150 mM (p = 0.322), y la presencia de cationes divalentes no tuvo efecto alguno (p = 0.801). Además, la duración del tiempo de almacenamiento a -20°C, días 1 contra 9, también no mostró diferencia alguna (p = 0.643).

Efecto de HSA v sacarosa a -20°C Se analizaron las formulaciones 13 a 18 para determinar los efectos de la adición de HSA y sacarosa a PBS sobre el título viral. Los resultados de la prueba en placa en el día 9 se muestran en el cuadro 6. Los efectos combinados de HSA y sacarosa sobre el título viral se muestran en la figura 5.

CUADRO 6 Efecto de HSA y sacarosa sobre los títulos virales a -20°C Hubo un incremento en el título viral con la adición de HSA sola y con HSA + sacarosa. Cuando la formulación de HSA + sacarosa se comparó con el control, se observó una diferencia significativa (p = 0.04). Se observó también una diferencia significativa para todas las muestras con HSA, comparativamente con el control (p = 0.004). Los mejores efectos en este experimento de puntos de datos individuales se observaron con HSA a 5% y con sacarosa a 5% o 0%. Se observaron también buenos resultados para sacarosa a 5% y HSA a 1%.

EJEMPLO 3 Selección de la formulación para almacenamiento a +2-10°C Para estudios clínicos futuros, será preferible almacenar los virus a temperaturas de -20°C y mayores. Estos experimentos son una continuación de los experimentos del ejemplo 2, y están diseñados para seleccionar un número de formulaciones para almacenamiento a +2-10°C. Como se describe en el ejemplo 1 , y según se determina dentro de este ejemplo, las formulaciones con HSA preservaron toda la actividad viral cuando fueron almacenadas a +2-10°C, mientras que las que carecían de la misma, perdieron cantidades variables de actividad. Los experimentos descritos en este ejemplo permitieron poner a prueba varios reguladores de pH y excipientes para determinar sus efectos sobre el título viral cuando fueron almacenados a +2-10°C.

Métodos Preparación de formulaciones de muestra de virus Se usaron en este estudio el virus de abastecimiento Ad5CMVp53 y las diluciones y formulaciones descritas en el ejemplo 2. Las formulaciones se dan en el cuadro 4. Las muestras de formulación preparadas para este estudio se mantuvieron a +2-10°C en un refrigerador. Después de 14 días, las muestras fueron retiradas y puestas a prueba para actividad viral mediante la prueba en placa estándar. Se llevó a cabo la prueba en placa viral, y los títulos virales se calcularon como se describió anteriormente en el ejemplo 1.

Estadística Para este experimento, los valores de placas de únicamente una dilución (3.3 x 10"8) se usaron para análisis, ya que los conteos en placa fueron reducidos, y únicamente esta dilución produjo consistentemente cifras de placas en la escala deseada. Los datos fueron transferidos al programa Systat versión 5 para análisis estadístico. Se llevaron a cabo pruebas t y de regresión lineal para determinar las diferencias entre los grupos, usando un valor alfa de p=0.05.

Resultados v discusión Efectos del almacenamiento a +2-10°C Los resultados de la prueba en placa después de 14 días de almacenamiento a +2-10°C se muestran en la figura 6. Los valores en la figura 6 se tomaron de una dilución de prueba individual para cada muestra. No se muestran barras de errores, ya que no hubo réplicas para cada condición. Como se muestra en la figura 6, hubieron distintos grupos de actividad viral. Los títulos virales de las formulaciones 1 a 10 fueron principalmente consistentes, mientras que las formulaciones 11 y 12 (que contenían regulador de pH Tris con NaCI a 300 mM) fueron considerablemente menores. Las formulaciones 13-18, que contenían HSA, mostraron actividad viral incrementada comparativamente con aquellas sin HSA.

Efectos de HSA Los efectos de HSA se pueden ver más claramente en la figura 7. El grupo "sin proteína" comprendía un tamaño de muestra de n=8 formulaciones, y el grupo de HSA comprendía un tamaño de muestra de n=6 formulaciones. No se incluyeron en esta comparación las formulaciones con concentración de sales de 300 mM. La barra de errores es igual a 1 desviación estándar.

Como se demostró anteriormente, la adición de HSA aumentó significativamente (p<0.001) el número de placas observadas en la prueba. Se desconoce la razón de esto. Parece ser un incremento real en el carácter infeccioso del virus, puesto que se observa también con una prueba basada en citometría de flujo para determinar la expresión de la proteína viral. Tres formulaciones (14, 16, 18) puestas a prueba aumentaron las concentraciones de HSA: 1 %, 5% y 10%. Estos tres resultados están dentro de la variación intra-prueba, de modo que la concentración óptima de HSA varía sobre una amplia escala.

Efectos de los cationes divalentes Se analizaron muestras con NaCl menor de 300 mM y sin HSA añadida para determinar el efecto de los cationes divalentes sobre el título viral después de almacenamiento a +2-10°C durante 14 días. Aunque existen pocas réplicas, cuando las muestras con cationes divalentes se compararon con muestras sin cationes, se observó una diferencia no significativa. Para el número limitado de muestras puestas a prueba a +2-10°C(n=4 cada grupo), la adición de cationes divalentes pareció dar como resultado una pérdida de actividad viral (p=0.09; datos no mostrados). Este es un hallazgo inesperado, ya que muchas fuentes de la literatura señalan el uso de cationes divalentes en formulaciones de adenovirus (Huyghe et al., Human Gene Therapy 6: 1403-1416, 1995).

Comparación a -20°C de muestras de formulación de referencia Los resultados del ejemplo 2, en los cuales muestras de formulación idénticas fueron almacenadas a -20°C durante un tiempo similar, se pueden utilizar para esta comparación. Estos se comparan en el cuadro 7. En general, las muestras sin HSA (formulaciones 1 a 12) mostraron pérdida de títulos virales cuando fueron almacenadas a +4°C, comparativamente con un almacenamiento a -20°C. En contraste, las formulaciones con HSA (13-18) no mostraron pérdida de actividad viral a +4°C. Además, las muestras de formulación que contenían cationes divalentes (1 , 3, 5, 7, 9) mostraron títulos virales reducidos después de almacenamiento a +4°C(27% de las mantenidas a -20°C), que aquellas sin cationes (2, 4, 6, 8, 10) (66% de las almacenadas a -20°C).

CUADRO 7 Comparación de las formulaciones 1 a 18 a -20°C y +40°C Cuando las formulaciones de adenovirus fueron almacenadas a +2°C-10°C durante 14 días, la elección del regulador de pH (Tris o PBS) no tuvo efecto alguno sobre los títulos virales, aunque las altas concentraciones de NaCI (300 mM) afectaron adversamente el título viral.

EJEMPLO 4 Selección de la formulación de Ad5CMVp53: estudio del pH Los ejemplos anteriores con formulaciones de Ad5CMVp53 se llevaron a cabo a pH fisiológico, excepto la formulación 4 mostrada en el ejemplo 1. Los experimentos dentro de este ejemplo se llevaron a cabo como un estudio a corto plazo para examinar los efectos del pH sobre la actividad viral sobre una amplia escala a -40°C, +20°C y +37°C. La adición de otros excipientes se analizó también para efectos protectores contra extremos de pH. Para soluciones salinas reguladas en su pH a los extremos en pH 5.0 y pH 9.0, no hubo una pérdida significativa de la actividad viral. La estabilidad viral se incrementó a valores de pH entre 6 y 8, con estabilidad óptima alrededor de pH 8.2. En presencia de HSA + sacarosa, este efecto fue negado. Además, como se observó anteriormente, la presencia de HSA + sacarosa pareció incrementar el carácter infeccioso de! virus en la prueba en placa.

Métodos Preparación de la muestra de virus En estos experimentos se usó Ad5CMVp53, como se describió en los ejemplos del 1 al 3 anteriores. Este material de abastecimiento del virus se diluyó en formulaciones con pH diferentes, se trataron para diferentes condiciones de almacenamiento, y se probaron para encontrar títulos virales mediante pruebas de placa como se describió en el ejemplo 1.

Preparación de la muestra de virus de control El mismo material de abastecimiento del virus de partida se usó en la preparación de la muestra de virus anterior, con la excepción de que este material se almacenó en PBS + glicerol a -70°C y se descongeló el día de la prueba.

Preparación de la formulación En el primer experimento, un número de soluciones Tris a 10 mM con regulación de pH con las mismas concentraciones de sal (NaCI a 150 mM) y de catión bivalente (MgCI2 a 2 mM) se preparó y ajustó a valores de pH específicos, que varían de pH 5.0 a pH 9.0. Se realizó otro juego que contenía HSA a 5% y sacarosa a 5%, además de regulador de pH. Para un experimento, se diluyeron virus en diversas formulaciones, y se congelaron a -^40°C en un congelador de velocidad controlada (el período de almacenamiento a — 40°C varía de 5 a 30 minutos). Entonces se derritieron e incubaron en un baño de agua a 37°C durante 1 hora antes de la determinación de la actividad mediante la prueba en placa. En un segundo experimento, el virus se diluyó en la formulación 4 (véase cuadro 1 ), y el pH ( se ajustó a los valores específicos de pH, que varían de pH 6.6 a pH 8.8. Estas formulaciones de virus entonces se almacenaron a temperatura ambiente (20°C) o a 37°C durante 1 semana antes de la determinación de actividad mediante la prueba en placa. Las pruebas en placa viral se realizaron como se describió en el ejemplo 1.

Estadística Los datos de la prueba en placa de cada una de las dos diluciones y dos replicas se combinaron. Las desviaciones estándares, medias y CV se calcularon. Se realizó una prueba de Student-t usando Excel 5.0.

Resultados y análisis En el primer experimento, dos réplicas de cada pH, que varían de pH 5.0 a pH 9.0 se evaluaron en la prueba en placa, siguiendo un almacenamiento de corto plazo a -40°C y una incubación de 1 hora a 37°C. Un segundo juego de formulaciones con HSA + sacarosa añadida también se probó en este experimento. La desviación estándar de la media se promedió a partir de dos diluciones de dos replicas. En el primer grupo sin HSA + sacarosa, los extremos superior e inferior de pH dieron como resultado títulos vírales reducidos. Las muestras de formulación con pH de 5.0 y pH de 9.0 disminuyeron de manera importante de la media del grupo control; control, pH 6.0, pH 7.0 y pH 8.0 (p<0.001 y p=0.008, respectivamente) (no se muestran los datos). Cuando HSA + sacarosa estuvieron presentes en los diversos niveles de pH, no se observaron efectos de pH (no se muestran los datos). Además, la media del grupo con HSA + sacarosa significativamente incrementó en comparación con la media del grupo de control sin aquellos excipientes de (p<0.001). De esta manera, la presencia de HSA + sacarosa protegió los títulos virales de los extremos de pH y aparentemente mejoró la capacidad de infección del virus en las pruebas como se observó en los estudios previos (ejemplos del 1 al 3). Por lo tanto, para ias formulaciones de sal con regulación de pH, ei margen de pH óptimo para Ad5CMVp53 es pH 6.0-pH 8.0. La adición de HSA + sacarosa es capaz de proteger a los virus de los valores de pH sobre y debajo de este margen. En un segundo experimento, se prepararon virus en la formulación 4 en cada valor de pH específico, que variaban de un pH de 6.6 a un pH 8.8, se almacenaron durante 1 semana a temperatura ambiente o 37°C, y se probaron en la prueba en placa. Los resultados se muestran en la figura 8. En general, las formulaciones con pH de 8.0 a 8.6 mantuvieron el nivel más alto de actividad posterior al almacenamiento a temperatura ambiente durante 1 semana, con la muestra de virus a pH 8.2 reteniendo la mayor actividad (figura 8). La designación de datos "demasiados para contar" (tntc) indica que el conteo en la placa para estas muestras estuvo por encima de los limites superiores de conteo. Por lo tanto, un valor de 300 placas, que es el límite para el conteo, se asignó a estas muestras "tntc" y se usaron para calcular el título indicado en la figura 8. El título real es ligeramente mayor que este valor asignado. Posterior al almacenamiento a 37°C durante 1 semana, la formulación 4 con un valor de pH 8.8, pH 8.4 y pH 8.6 dio como resultado una mejor conservación de la estabilidad del virus (figura 8). En conjunto, los datos de estabilidad obtenidos a partir del estudio de pH a corto plazo a temperatura ambiente y a 37°C indican que la formulación 4, con un valor de pH ajustado, que varía de pH 8.0 a pH 8.6 es la formulación con mayor preferencia para conservar la actividad del virus (capacidad de infección).

EJEMPLO 5 La albúmina de suero de bovino y albúmina humana recombinante proveen efecto similar a HSA natural El objetivo de los estudios de este ejemplo fue determinar si la albúmina de otras fuentes pueden proveer la misma mejora en estabilidad y de título viral observado con la HSA del ejemplo 2. Estos estudios también se realizaron para investigar la posibilidad de que otros componentes en la HSA comercial (acetiltriptófano a 0.02 M y caprilato de sodio a 0.02 M; de Miles, Inc.) contribuyen a la mejora en estabilidad y de título en las formulaciones virales basadas en HSA. En estos estudios la albúmina de suero de bovino (BSA, material con grado de reactivo, forma en polvo) y la albúmina humana recombinante (rHA) se probaron en diferentes estudios bajo condiciones diferentes. La albúmina humana recombinante es Recombumin™ 25 que se produce en un sistema de expresión de levaduras por Centeon y se describió en párrafos anteriores.

Métodos Preparación de la muestra de virus Ad5CMVp53, como se usó en otros ejemplos, también se usó para estos experimentos. Para ambos estudios, BSA y Recombumin™, los materiales de abastecimiento del virus se diluyeron 1 :100 en formulaciones de prueba, se almacenaron bajo diversas temperaturas durante diferentes períodos, y se probaron para obtener la titulación viral (capacidad de infección) usando la prueba en placa que se describió en el ejemplo 1.

Preparación de formulación En el estudio de BSA, se prepararon tres formulaciones virales; formulación de control: DPBS + glicerol a 10% + MgCI2 a 0.5 mM + CaCI2 a 1.0 mM; formulación de HSA: DPBS + HSA a 5% + MgCI2 a 0.5 mM + CaCI2 a 1.0 mM; y formulación de BSA: DPBS + BSA a 5% + MgCI2 a 0.5 mM + Cacl2 a 1.0 mM. El BSA usado en este estudio fue un material con grado de reactivo y en forma de polvo. El material de abastecimiento del virus se diluyó 1 :100 en cada formulación y se dividió en dos recipientes cada uno. Un recipiente se almacenó a temperatura ambiente (20°C) durante 2 horas y el otro recipiente se congelo a -40°C en un congelador de velocidad controlada, posteriormente se descongeló y se almacenó a +37°C durante 2 horas. La prueba en placa viral se realizó como se describió en el ejemplo 1.

En el estudio de Recombumin™ se prepararon tres formulaciones; formulación de control: DPBS + glicerol a 10%; formulación de HSA: tris a 10 mM +HSA a 5% (p/v) + sacarosa a 5% + NaCI a 150 mM + MgCI2 a 2.0mM, pH 8.2; y formulación de Recombumin™: Tris a 10mM + Recombumin™ a 5% (p/v) + sacarosa a 5% + NaCI a 150mM + MgCI2 a 2.0mM, pH 8.2. El material de abastecimiento del virus se diluyó 1 :100 en cada formulación y se dividió en tres recipientes, y se almacenó a 37°C durante 7 días. La prueba en placa viral se realizó como se describió en el ejemplo 1.

Resultados y análisis Los resultados de estudio de BSA mostraron que la formulación de BSA mejoró el título viral como se observó para la formulación de HSA, al compararlo con el título viral de la formulación de Control (Figura 9). Además, se observaron resultados similares cuando se usó albúmina de suero de murino en la formulación de almacenamiento en lugar de BSA o HSA (no se muestran los datos). Los datos también indicaron que las formulaciones de HSA, BSA y control aparentemente tuvieron un efecto protector en el virus sometido a congelación-derretimiento y hasta 2 horas de almacenamiento a +37°C (Figura 9). Los resultados del estudio de Recombumin™ demostraron que las formulaciones de Recombumin™ y HSA proveen efectos protectores similares en el título viral para los virus almacenados a +37°C durante una semana (figura 10). Este efecto protector no se observó con la formulación de control en donde se observó un decremento de 4 logs en el título viral (figura 10) . Los resultados de este ejemplo demuestran que las formulaciones que contienen albúmina de otras fuentes (bovina y humana recombinantes) pueden proveer la misma mejora de titulación viral y estabilidad que la observada con la formulación de HSA natural. Estos estudios también indican que los otros componentes en el HSA comercial (acetiltriptófano a 0.02M y caprilato de sodio a 0.02M) no contribuyen a una mejor estabilidad y título en las formulaciones virales con base en HSA.

EJEMPLO 6 Estabilidad a largo plazo de adenovirus en una formulación de HSA/sacarosa a -70oC-20°C, +4°C v +20°C Los resultados de los ejemplos del 1 al 5 presentados anteriormente indican que una formulación líquida que contiene albúmina de suero humana (HSA) provee una estabilización superior para los vectores adenovirales en comparación con aquéllos que contienen otros excipientes. El objetivo de este ejemplo fue determinar la estabilidad de vectores adenovirales en una formulación de: Tris-HCl a 10mM + HSA a 5% + sacarosa a 5% + NaCI2 a 150mM, pH 8.4 al almacenarse a diversas temperaturas hasta 8.5 meses. Un vector adenoviral que comprende el gen de timidina cinasa del virus de herpes simple (AV1.0HSVTK) se usó en este ejemplo. Este ejemplo resume la eficacia de una formulación que comprende Tris-HCl a 10mM + HSA a 5% + sacarosa a 5% + NaCI a 150mM + MgCI2 a 2mM, pH 8.4 (Formulación 19) para conservar los vectores adenovirales en las cuatro temperaturas de almacenamiento durante 0 (2 días), 1.5, 3.5 y 8.5 meses. Este estudio se diseñó para determinar una formulación óptima de un vector de adenovirus para lograr por lo menos una estabilidad de un año al almacenarlo congelado a -20°C o como líquido con temperaturas de almacenamiento de +4°C o +20°C.

Métodos Preparación de la muestra de virus Un adenovirus tipo 5 que comprende el gen HSV-TK bajo el control del promotor de citomegalovirus, AV1.0HSVTK (como se describe en la solicitud de patente francesa No. FR93/13772) en DPBS + glicerol a 10%, filtrado a 0.2 µm, se usó en estos experimentos. El título del virus se estimó en 1.6 x 1012 partículas/ml. En el primer días de estudio, 22 recipientes de AV1.0HSVTK, cada uno comprendiendo aproximadamente de 200 a 250 µl/recipiente para un total de 4.5 ml, se descongelaron a temperatura ambiente y se agruparon. Mediciones de OD se tomaron a 260 nm en el material agrupado para determinar las partículas originales/mi. Los materiales de abastecimiento agrupados del virus AV1.0HSVTK se hicieron correr a través de una columna Resource Q (preparada con 8ml de Source Q15; Pharmacia, número de catálogo 17-0947-01 , lote 11/21/97 para intercambio de regulador de pH y reformularse en Tris-HCl a 10mM + HSA a 5% + sacarosa a 5% + NaCI a 150mM + MgCI2 a 2mM, pH 8.4 (Formulación 19). Todas las soluciones usadas en este procedimiento de intercambio de regulador de pH se desgasificaron mediante un desgasificador en línea y la solución de virus se purgó con argón antes del llenado. El material fue distribuido en alícuotas en criorecipientes de polipropileno y se inundaron con argón para retirar el oxígeno del espacio superior de los recipientes. Las muestras entonces se colocaron a -20°C (congelador VWR Scientific), +4°C (caja deli de 2 puertas VWR Scientific modelo GDM-49), a temperatura ambiente (+20°C) y -70°C (grupo control). Se realizaron pruebas en recipientes por triplicado para obtener la integridad de partícula mediante CLAR y la actividad mediante una prueba en placa en puntos específicos de tiempo de hasta 8.5 meses. Después de la dilución y llenado final, todas las muestras se almacenaron en cada temperatura deseada durante 2 días y posteriormente se probaron en el punto de tiempo T=0 para dar información de línea de base. Las muestras para almacenamiento a -20°C se congelaron a -40°C en un congelador de velocidad controlada antes del almacenamiento a -20°C. La temperatura de +20°C se usó como una temperatura elevada con la cual se determinó la estabilidad "acelerada" de la formulación de virus para la temperatura de +4°C. Se realizaron pruebas a controles positivos y muestras de virus por triplicado en intervalos de 0 (2 días), 1.5, 3.5 y 8.5 meses a -20°C, +4°C y +20°C con respecto a la integridad de partícula viral y la capacidad de infección viral. El título viral en las unidades de formación en placas (pfu) se determinó mediante una prueba en placa usando células 293. Un método analítico de CLAR se uso para determinar las mediciones de partícula viral/ml por área pico de una densidad óptica (OD) a 260nm.

Preparación de virus de control positivo El virus de control se diluyó en Tris-HCl a 10 mM, HSA a 5%, sacarosa a 5%, NaCI a 150 mM, MgCI2 a 2 mM, pH 8.4 (formulación 19) para imitar la formulación de muestra de prueba y fue distribuido en alícuotas, 0.4 ml por criorecipiente (Nalgene No. 5000-0020, lote 072381 ), y se almacenó a -70°C (BioFreezer, Forma Scientific, modelo No. 8328). Se realizaron pruebas por triplicado a muestras de virus y controles positivos en intervalos de 0 (2 días), 1.5, 3.5, y 8.5 meses a -70°C con respecto a la integridad de partícula viral y capacidad de infección viral. El título viral en las unidades de formación en placa (pfu) se determinó mediante una prueba en placa usando células 293. Un método de CLAR analítico se usó para determinar las mediciones de partícula viral/ml por área pico de una densidad óptica (OD) a 260 nm.

Análisis de prueba en placa El título viral se determinó mediante la prueba en placa en células 293, células de riñon embrionario humano transformadas con ADN de ad5 humano compartido (región E1 complemento). En puntos de tiempo designados, las muestras de prueba por triplicado y controles positivos por triplicado se probaron para obtener las unidades de formación en placa como se describió anteriormente en el ejemplo 1.

Análisis por CLAR Se realizaron comparaciones de área de pico de CLAR para determinar la concentración del virus en función de partículas virales entre muestras y controles positivos. Cada muestra por triplicado y control positivo se evaluó en un sistema CLAR analítico de Waters con un programa de cómputo Millennium como se describió anteriormente en el ejemplo 1.

Resultados y análisis Resultados de prueba en placa Los resultados de las pruebas en placa para obtener la estabilidad de AV1.OHSVTK de adenovirus a -70°C, -20°C,+4°C, y +20°C se muestran en la fig. 11. La actividad viral de AV1.OHSVTK se midió después de 0 (2 días), 1.5, 3.5, y 8.5 meses de almacenamiento usando pruebas de formación en placa como se describió en el ejemplo 1. Ambas muestras con temperatura de almacenamiento a +4°C y -20°C mantuvieron actividades virales similares en comparación con el control positivo a -70°C en todos los puntos de tiempo probados (figura 11 ). Los resultados mostraron una caída importante (p=0.02) de aproximadamente 2 logs para la condición de temperatura ambiente. Todas las condiciones de almacenamiento diferentes conservaron la actividad viral en una cantidad dentro del límite de error de la prueba (±0.5 logs) Resultados de CLAR. El área pico de CLAR provee la cuantificación de partículas virales. La variación de la prueba de CLAR se determinó ser ±3%. Debido a ias desviaciones estándares pequeñas en las áreas pico de CLAR, cualquier variación pequeña entre los puntos temporales puede ser importante estadísticamente. Se realizo una gráfica del área pico de CLAR por temperatura con el tiempo para las cuatro temperaturas de almacenamiento. El análisis por CLAR de la integridad de partículas se realizó después dei almacenamiento de las muestras de prueba y control para 0 (2 días), 1.5, 3.5, y 8.5 meses. Los resultados demostraron que todas las condiciones de almacenamiento a -20°C, +4°C, y +20aC conservaron las partículas virales, así como la condición a -70°C con el paso de 8.5 meses (no se muestran los datos). En resumen, los resultados de CLAR mostraron una tendencia similar en estabilidad como los resultados de prueba en placa para cada temperatura de almacenamiento. La formulación 19 conservó el título adenoviral para por lo menos 8.5 meses al almacenarla a -70°C, -20° C, +4°C y +20°C. De manera interesante, el resultado de CLAR no sugirió una pérdida de actividad en la condición a temperatura ambiente en el punto temporal de 8.5 meses como se demostró mediante los resultados de prueba en placa (figura 11). Los resultados de este estudio claramente demostraron que la formulación 19 (Tris- HCL a 10 mM, pH 8.4, HSA a 5%, sacarosa a 5%, MgCI2 a 2.0 mM y NaCI a 150 M) es efectiva para conservar de manera estable la actividad viral y la integridad de partículas en las cuatro temperaturas de almacenamiento analizadas en un período de 8.5 meses. La prueba en placa (figura 11) y datos de CLAR apoyaron esta conclusión. Los resultados de ambas pruebas de integridad de partículas y titulación de actividad muestran que la actividad viral se conserva hasta por lo menos 8.5 meses bajo condiciones de congelación (-20°C) y refrigeradas (+4°C). Sin embargo, la actividad viral, mas no la integridad de partícula, se redujo cuando se realizó el almacenamiento en la formulación 19 a temperatura ambiente. Por lo tanto, la formulación 19 que comprende allbúmina de suero humano a 5% y sacarosa a 5% con un pH 8.4 conserva y estabiliza de manera eficiente la integridad de partícula adenoviral y la actividad viral durante un período de por lo menos 8.5 meses en condiciones de refrigeración. La presente invención no debe limitarse en alcance por las modalidades especificas descritas en la presente. De hecho, diversas modificaciones de la invención, además de aquellas descritas en la presente, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción realizada y las figuras anexas. Tales modificaciones tienen la intención de encontrarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Adicionalmente, debe comprenderse que todos los tamaños base o tamaños de aminoácidos, y todos lo pesos moleculares o valores de masa molecular, dados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximadas y se proveen para descripción. Varias publicaciones están citadas en la presente, la descripciones de las cuales están incorporadas para referencia por completo.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una composición que comprende un vector de adenovirus recombinante y una concentración de albúmina de suero humano (HSA) efectiva para estabilizar el vector de adenovirus a una temperatura arriba del punto de congelación del agua, o para intensificar un título del vector de adenovirus comparativamente con un título en ausencia de HSA, o ambos, en un regulador de pH acuoso. 2 - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la concentración de HSA es de alrededor de 0.01% a aproximadamente 25% en p/v. 3.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la concentración de HSA es de alrededor de 0.1% a aproximadamente 15%. 4.- La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la concentración de HSA es de alrededor de 1 % a aproximadamente 10%. 5.- La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la concentración de HSA es de aproximadamente 5%. 6.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el pH es mayor que o igual a 5.0 y menor que o igual a 9.0. 7.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el pH es mayor de 7.5. 8.- La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el pH es mayor de 8.0. 9.- La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el pH es de 8.2. 10.- La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el pH es 8.4. 11.- La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el pH es mayor de 8.0. 12.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el pH es de 8.2. 13.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el pH es de 8.4. 14.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el regulador de pH es un regulador de pH Tris-HCl. 15.- La composición de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque el regulador de pH es un regulador de pH Tris-HCl. 16.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el regulador de pH es un regulador de pH Tris-HCl. 17.- La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque el regulador de pH es un regulador de pH Tris-HCl. 18.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende sacarosa a aproximadamente 5%, MgCI2 a aproximadamente 2.0 mM y NaCI a aproximadamente 150 mM. 19.- La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque comprende sacarosa a aproximadamente 5%, MgCI2 a aproximadamente 2.0 mM y NaCI a aproximadamente 150 mM. 20.- La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque comprende sacarosa a aproximadamente 5%, MgCI2 a aproximadamente 2.0 mM y NaCI a 150 mM. 21.- La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque comprende sacarosa a aproximadamente 5%, MgCl2 a aproximadamente 2.0 mM y NaCI a 150 mM. 22.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el adenovirus recombinante expresa una proteína heteróloga. 23.- La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque la proteína heteróloga es p53. 24.- La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque la proteína heteróloga es HSV-TK. 25.- Un método para preparar una formulación estabilizada de adenovirus recombinante, caracterizado porque comprende suspender un adenovirus recombinante en un regulador de pH acuoso que comprende una concentración de albúmina de suero humano (HSA) efectiva para estabilizar el reactor de adenovirus a una temperatura arriba del punto de congelación del agua, o intensificar un título del vector de adenovirus comparativamente con un título en ausencia de HSA. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la temperatura es mayor que o igual a 4CC y menor de 37°C. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la temperatura es mayor que o igual a 20°C. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque la concentración de HSA es de 5%. 29.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el pH de la mezcla es mayor de 8.0. 30.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el pH de la mezcla es de 8.2. 31.- El , método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el pH de la mezcla es de 8.4. 32.- Un método para estabilizar un vector de adenovirus a aproximadamente 20°C, caracterizado porque comprende preparar una mezcla del vector de adenovirus en una composición acuosa de solución salina de Dulbecco regulada en su pH con fosfato, glicerol de aproximadamente 5% a 15%, CaCI2 de aproximadamente 0.25 a 2.0 mM y MgCI de aproximadamente 0.1 a 1.0 mM. 33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la concentración de glicerol es de aproximadamente 10%, la concentración de CaCI2 es de aproximadamente 1.0 mM y la concentración de MgCI2 es de aproximadamente 0.5 mM.