JP2003516743A - 複製不能アデノウイルスの製造のための方法および組成物 - Google Patents

複製不能アデノウイルスの製造のための方法および組成物

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シヤマク ラスティ，
リチャード ダブリュー． ペルーソ，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、複製能力のないウイルスの産生のための細胞株の補足に関わり、この細胞株は、複製能力のあるウイルスを有意に減少させるか、または排除する。細胞株の補足を作製または使用するための方法もまた、核酸分子、ポリヌクレオチド、および細胞株を作製するためのベクターとして提供される。特に、本発明は、複製不能アデノウイルス（Ａｄ）の産生のために細胞株を補足することに関わり、これは複製可能Ａｄ（ＲＣＡ）の存在を有意に減少または除去し、そして、例えば遺伝子治療のようなヒト患者の処置に使用し得る、感染性複製不能アデノウイルス粒子の大規模な産生のために役立つ。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、複製不能ウイルス生成のための補完細胞株に関する。この細胞株は
、複製可能ウイルスの存在を有意に減少させるかまたは排除する。特に本発明は
、複製不能アデノウイルス（Ａｄ）生成のための補完細胞株に関する。この細胞
株は、複製可能Ａｄ（ＲＣＡ）の存在を有意に減少させるかまたは排除させ、そ
してヒト患者の処置（例えば、遺伝子治療）に用いられ得る感染性の複製不能ア
デノウイルス粒子のラージスケールでの生成に役立ち得る。本発明は、目的の外
来配列を含む感染性の組換え複製不能ウイルス粒子（特に、複製不能アデノウイ
ルス粒子）のラージスケールでの生成方法に関することに加えて、感染性の複製
不能ウイルス粒子（特に複製不能アデノウイルス粒子）のストック（複製可能ウ
イルス粒子（特にＲＣＡ）を含まないストック）に関する。本発明はさらに、核
酸補完エレメント、真核細胞株をトランスフェクトしてＲＣＡの存在を有意に減
少させるためにこのような核酸を含む組換えベクター、およびその方法に関する
。さらに本発明は、感染性の複製不能ウイルス粒子（特に、複製不能アデノウイ
ルス粒子）のストック中の複製可能ウイルス粒子（特にＲＣＡ）の存在を検出す
るためのアッセイに関する。このアッセイは、リアルタイムの定量ＰＣＲアッセ
イを用い、１０９個以上の複製不能ウイルス粒子あたり１個の複製可能ウイルス
粒子を検出する感度レベルを有する。本発明はさらに、感染性の複製不能ウイル
ス粒子のストック中の複製可能ウイルス粒子（特にＲＣＡ）の存在を検出する方
法に関し、この方法には、このようなアッセイの使用、およびこのアッセイを実
施するために必要な構成要素を供給するキットを含まれる。
【０００２】 （関連分野） 種々の疾患状態における治療のストラテジーとして、細胞の機能不全を緩和ま
たは排除させるため、および細胞死を防ぐための非特異的な測定、欠損している
タンパク質または機能障害を有するタンパク質の置換、変異を有する遺伝子を置
換するための機能性核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の細胞への導入、および細胞機能を
変化させるための新規の遺伝子構築物の導入が挙げられる。組換えＤＮＡ技術の
進歩は、これらのそれぞれの治療上の可能性に大きな影響を与えた。そして核酸
の転移は有望なモダリティーであると思われる。
【０００３】 ウイルスベクターは、真核細胞での外来遺伝子の発現を可能にし、それによっ
て、動物細胞に特有の翻訳後修飾を必要とし得るタンパク質の産生を可能にする
。ウイルス由来の遺伝子療法用ベクターは、その疾患誘発能を排除させるために
種々の修飾を必要とする。しかし、以下の能力がなお保持される：１）作製時の
ウイルスストックの調製のために制御された条件下で複製する能力；および２）
感染し、そして所望の治療遺伝子を疾患細胞に送達する能力。ウイルスベクター
の疾患誘発能の排除は、通常、ウイルスゲノムから遺伝エレメントのサブセット
を欠損させて、患者内での自立したウイルス複製を防ぐことにより達成される。
これらのベクターを作製するために、これらは通常、ウイルスゲノムから欠損さ
れた遺伝エレメントのサブセットを発現することにより、複製不能ウイルスを補
完するよう設計されたプロデューサー細胞（またはパッケージング細胞）内で増
殖させる。多くの動物ウイルスがウイルスベクターとして用いられ、例としてア
デノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイスル、ヘルペ
スウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、およびピコルナウイルスが
挙げられる。
【０００４】 アデノウイルス（Ａｄ）の以下の性質が、アデノウイルスを遺伝子転移または
免疫化のための魅力的なツールにする：（１）アデノウイルスゲノムの構造が、
十分に特徴付けられている；（２）ウイルスＤＮＡの大部分が、外来配列により
置換され得る；（３）組換え改変体が比較的安定である；（４）組換えウイルス
が高力価で増殖し得る；（５）アデノウイルスに関連するヒト悪性腫瘍が知られ
ていない；および（６）ワクチンとしての野生型弱毒アデノウイルスの使用が安
全である。
【０００５】 一般的に、このような複製不能なＡｄベクターは、目的の遺伝子を必須ウイル
ス配列（例えば、Ｅ１座で見出されるような配列）と置換して挿入するか、また
はその間に挿入することにより構築される（Ｂｅｒｋｎｅｒ、ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９（１９９８）；Ｇｒａｈａｍら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：１０９−１２８、編集：
Ｍｕｒｃｙ、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９９１））。この
必須ウイルス遺伝子の欠損または挿入による不活性化は、Ａｄの複製する能力の
不能（複製不能なＡｄの用語の由来）を引き起こす。このようなベクターを細胞
培養物中で増殖させるために、欠損されたエレメント（例えば、Ｅ１欠損ベクタ
ーの場合はＥ１タンパク質）を提供されなければならない。
【０００６】 多くのＡｄサブタイプのヌクレオチド配列の解明は、これらのゲノム生物体の
正確な特徴付けを可能にした。５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ５）のヌクレオチ
ド配列は、登録番号Ｍ７３２６０の下にＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。単
純化した用語でいうアデノウイルスゲノムは、以下を含む：（１）それぞれの末
端（５’および３’）のウイルス複製に必須の２つの逆方向の末端反復（ＩＴＲ
）；（２）Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ領域（両方とも複製に不可欠な領域）を含む初期
領域１（Ｅ１）、および全長ウイルスＤＮＡのパッケージングに必須であり、そ
してウイルスカプシドの構成要素を形成するポリペプチドＩＸ（ｐＩＸ）；（３
）Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４領域（Ｅ３は複製に不要な領域）（Ａｃｓａｄｉら、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３：１６５−１８０（１９９５）に総説される）；およ
び主にビリオンタンパク質をコードし、そしてすべて複製に不要である後期領域
Ｌ１〜Ｌ５（Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ、編集：Ｈａｒｏｌｄ Ｇｉｎ
ｓｂｅｒｇ、１９８４、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）。
【０００７】 ヒトＡｄ血清型２および５は、インビトロとインビボの両方で種々の細胞型に
遺伝子を効果的に導入するベクターとして用いられてきた（Ｔｒａｐｎｅｌｌら
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：６１７−６２５（１
９９４）；およびＡｃｓａｄｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３：１６５−１８０
（１９９５）に総説される）。Ａｄ組換え体の生成時には種々の因子が考慮に取
り入れられる必要があり、例えばいくつかの組換え体での損傷した増殖特性であ
る（Ｉｍｌｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２６３−２６８（１９９５）；Ｍ
ａｓｓｉｅら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．１３：６０２−６０８（１９９５）；お
よＳｃｈａａｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３９２０−３９２３（１９９５））
。これらの特性は、高力価（１０１１ｐｆｕ／ｍｌより大きい力価）を有する良
質の組換えウイルスストックのスクリーニング、増殖、および産生を複雑にする
。このような遺伝子治療のためのＡｄベクターの性質に関連する重要な記載は、
嚢胞性線維症遺伝子治療の臨床試験に関連して総説される（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ
ｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：２７−３４（１９９３）；Ｚａｂ
ｎｅｒら、Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｂｏｕｃｈｅｒら、
Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：６１５−６３９（１９９４）；Ｍｉｔｔｅｒ
ｅｄｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：７１７−７２９（１９９４）；
およびＷｉｌｍｏｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：３０１−３１８
（１９９６））。組換えＡｄベクターにおいて目的の遺伝子の挿入が可能な部位
として、Ｅ１領域、Ｅ４領域、Ｅ１およびＥ３領域（すなわち、Ｅ１／Ｅ３欠損
Ａｄ組換え体）、Ｅ１およびＥ４領域、またはＥ４の末端と３’ＩＴＲ配列の先
頭との間の領域が挙げられる。
【０００８】 上記で暗示されるように、Ｅ３欠損組換え体は、複製可能である。しかし、Ｅ
１欠損および／またはＥ４欠損組換え体は、複製することができず、そして欠損
した遺伝子産物は、２９３（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：
５９−７２（１９７７）；Ｌｏｃｈｍｕｌｌｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ．５：１４８５−１４９１（１９９４）または９１１（Ｆａｌｌａｕｘら、Ｈ
ｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：２１５−２２２（１９９６））のようなＥ１補
完細胞株、およびＷ１６２（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｄ．、およびＫｅｔｎｅｒ、Ｇ
．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：５３８３−５３８
６（１９８３））のようなＥ４補完細胞株、もしくはＩＧＲＰ２（Ｙｅｈ、Ｐ．
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５５９−５６５（１９９６））のようなＥ１／Ｅ４
補完細胞株によりイントランスで提供される。２９３細胞は、１９７０年代に共
通のヒトＡｄ５ ＤＮＡを用いた二倍体ヒト胎児腎臓細胞の安定なトランスフェ
クションにより構築された。この細胞株は本来、ＡｄのＥ１遺伝子の形質転換能
についての研究の過程で構築された。近年、Ｇｒａｈａｍらは、２９３細胞の染
色体中での細胞性Ａｄ５ ＤＮＡの連結を地図にし、そしてＡｄ５ゲノムの左末
端からヌクレオチド（ｎｔ）４１３７位までの連続するＡｄ５配列の存在を示し
た（Ｌｏｕｉｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３３：４２３−４２９（１９９７））
。第２のＥ１補完細胞株である９１１は、二倍体ヒト胎児網膜芽（ＨＥＲ）細胞
に由来し、そしてヒトＡｄ５ゲノムのｎｔ８０−５７８８を含む（Ｆａｌｌａｕ
ｘら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：２１５−２２２（１９９６）；１９９
７年１月３日に公開されたＷＯ９７／００３２６にも記載される；ＥＣＡＣＣ
Ｎｏ．９５０６２１０１）。
【０００９】 Ｅ１欠損ＡｄベクターのＥ１領域でのおよそ３．０ｋｂの最大限の欠損は、Ｉ
ＴＲ配列、アデノウイルスＤＮＡの左末端（ｎｔ１８８−３５８）のパッケージ
ングシグナル、およびｐＩＸコード領域（ｎｔ３５１１から開始する領域）をイ
ンタクトな状態で残す。非必須Ｅ３遺伝子内の１．９ｋｂ ＸｌａＩフラグメン
ト（７９および８５ｍｕ）の有用な二次的欠損と組み合わせたＥ１欠損は、この
第１世代の組み換え体でのおよそ７ｋｂの外来ＤＮＡ配列の挿入を可能にする。
Ｅ３領域での欠損の拡大はさらに、挿入能力を８ｋｂまで増大させ、ほとんどの
遺伝子治療に対しての大きさの要求を満たす（Ｂｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：８８０２−８８０６（１９９４））。
【００１０】 不運にも、「復帰変異」アデノウイルスとも呼ばれる複製可能アデノウイルス
（ＲＣＡ）が、２９３または９１１細胞でのＥ１−またはＥ１／Ｅ３欠損組換え
体の感染および複製間に自然発生的に現れ得ることが実証された。Ｅ１補完細胞
中で、ＲＣＡは相同組換えのプロセスにより、その細胞中に含まれるＥ１領域（
「補完エレメント」）の獲得を通じて生成される。ＲＣＡは、非常に低い頻度で
形成されるが、Ｅ１ポジティブな復帰変異体は、Ｅ１ネガティブな対照物と比較
して増殖に関する利点を有するようである。新たに生成される複製可能なＡｄは
、ラージスケールの調製物において、最終的に本来の複製欠損Ａｄよりも増殖し
た（Ｌｏｃｈｍｕｌｌｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１４８５−１
４９１（１９９４））。したがって、特に特定の適用において要求される感染性
ウイルス粒子数を考慮する場合、これらの復帰変異体の存在によりヒト遺伝子治
療試験の安全性が危うくなる。
【００１１】 マウス筋肉を用いて行った実験により、２×１０９個のウイルス粒子を使用し
て８０％以上の筋繊維を形質転換し得ることを教えられた。ヒト筋肉は、およそ
２５００倍大きいので、同様の形質転換率を達成するために、およそ１０１２〜
１０１３個のウイルス粒子を使用して１つのヒト筋肉に注射する必要があると解
釈される。ストック中にＥ１＋復帰変異ＲＣＡが１／１０程度の少な粒子数で存
在すると仮定すると、１０１１個の複製可能ウイルス粒子が患者の筋肉組織に注
射される。このような取り組みは、調節作用を満足しないことは明らかである。
【００１２】 Ａｄベクターにおける同種ヌクレオチド配列（補完エレメントにおける同一の
配列と重複しているヌクレオチド配列）の存在は、相同組換えおよびその後のＲ
ＣＡ生成に影響を及ぼす。２９３細胞は、（全てではない場合は）ほとんどの現
在利用可能なＥ１欠損Ａｄベクターと有意に重複する相同性を有する。したがっ
て、２９３細胞は、臨床等級の物質のラージスケールでの生成に適切ではないと
みなされてきた。なぜなら、バッチがしばしば、受容不可能な高レベルの複製可
能アデノウイルス（ＲＣＡ）が組換えを通じて増加することにより汚染されるか
らである（Ｉｍｌｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：７５−８４（１９９４））
。同じ著者が、安定かつ効果的なＥ１補完細胞株を構築するための多数の試験の
失敗を報告したことが強調されるべきであり、したがってこのような努力は取る
にたらない仕事はないと確認されている。
【００１３】 ＲＣＡ生成の問題を解決するための試みで、Ｉｍｌｅｒらは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ
およびｐＩＸを含むＥ１配列を用いて、安定にヒト肺Ａ５４９細胞を形質転換す
ることにより、Ｅ１補完細胞株を生成した（Ｉｍｌｅｒら、１９９６、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．３：７５−８４）。高レベルのＥ１ａ ＲＮＡおよびタンパク質を
発現するＡ５４９Ｅ１補完細胞株が獲得された。しかし、注目すべきは、この著
者は、クローン由来の高レベルのＥ１ｂ ＲＮＡの生成に関わらず分析された、
いずれのＡ５４９クローンにおいてもＥ１ｂタンパク質の発現を検出し得なかっ
た。Ａ５４９クローン（Ｅ１欠損Ａｄベクターを用いた感染に対して陽性と出た
クローン）が形質転換された表現型を示したこと、およびそれに加えて増幅産物
が２９３細胞で獲得されたものよりも有意に少なかったこともまた、その中で報
告されている。さらに、この研究の中でＩｍｌｅｒらにより用いられた構築物は
、Ｅ１領域の３’末端で補完エレメントと欠損アデノウイルスベクターとの間に
およそ７００ｂｐの有意な重複を含んだ。この重複は、相同組み合えの可能性を
有意に増加させ、したがって、Ｅ１＋復帰変異ＲＣＡの生成の可能性を有意に増
大させることが理解される。宿主細胞または組織における外来ヌクレオチド配列
の発現のための欠損Ａｄベクター、および（同じ株での）Ｅ１補完細胞株の構築
のためのベクターの開示もまた、ＩｍｌｅｒらのＷＯ９４／２８１５２に見出さ
れる。しかし、この書類は、補完細胞株による組換え体生成収率の評価、補完細
胞による異なるアデノウイルスの転写物およびタンパク質の発現の評価、および
非常に重要な、目的の外来配列を有する欠損Ａｄのストックの生成を導く生成プ
ロセス時のＲＣＡの存在または非存在の評価を与え損なっている。ＷＯ９４／２
８１５２は、５’ＩＴＲを欠損させることによりＲＣＡ生成の問題を減少させる
ことを主張している（立証のない発表である）ことに注目すべきである。
【００１４】 Ｅ１欠損Ａｄベクター生成時にＲＣＡ形成の危険を減少させるための代替の系
は、Ｍａｓｓｉｅ（ＵＳ５，８９１，６９０）に記載される。この特許は、ヒト
βアクチンプロモーターの制御下で安定に組み込まれた、Ｅ１ａ遺伝子およびＥ
１ｂ遺伝子を含むＡｄ５ Ｅ１領域の一部を含むＥ１補完エレメント、欠損した
５’ＩＴＲ、パッケージング配列、およびＥ１ａプロモーターを有するＥ１補完
細胞株を開示する。Ｍａｓｓｉｅにより記載され、主張される特定の細胞株（Ｂ
ＭＡｄＥ１−２２０−８（ＡＴＣＣ登録番号第ＣＲＬ−１２４０７号と命名され
ている株）はＡｄ５のｎｔ５３２−３５２５を含み、これはＥ１ａ、Ｅ１ｂプロ
モーター、およびＥ１ｂ遺伝子の一部を含む。しかしこの特許で開示されるＥ１
欠損Ａｄは、Ａｄ５ ｎｔ４５５−３３３３の欠損を含み、したがってＥ１補完
エレメントの３’末端で１９２ｂｐの配列重複を保存している。さらに、この細
胞株の補完エレメントは、Ｅ１ｂ遺伝子の３’末端（Ｅ１ｂ ８．３ｋＤａポリ
ペプチドの３’エキソンをコードする）をコードしない。Ｍａｓｓｉｅにより記
載されるＢＭＡｄＥ１−２２０−８細胞および関連する株は、２９３細胞で得ら
れるものと同等のＥ１欠損Ａｄの力価を生じる。しかし、主張する細胞株でのＲ
ＣＡ生成の評価がこの特許では開示されておらず、そしてこの特許に記載される
細胞株でのベクターＤＮＡと補完エレメントとの間の３’の重複の存在は、ＲＣ
Ａの生成がなお可能性を残していることを示す。
【００１５】 「ＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ ＮＯ．９６０２２９４０）と呼ばれるＥ１パッ
ケージング細胞株は、当該分野において記載されている（１９９７年１月３日に
公開されたＷＯ９７／００３２６；Ｆａｌｌａｕｘら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒ．９：１９０９−１９１７（１９９８））。ＷＯ９７／００３２６の公報に
記載されるＰＥＲ．Ｃ６および関連の細胞株は、ヒトホスホグリセレートキナー
ゼプロモーターの制御下で、Ｅ１ａおよびＥ１ｂのコード配列に対応するヒトＡ
ｄ５のｎｔ４５９−３５１０を含むプラスミド構築物を用いて安定にトランスフ
ェクトされた二倍体ＨＥＲ細胞から得られた。この細胞株は、Ａｄ５ Ｅ１ａお
よび２つの大きなＥ１ｂタンパク質を発現するが、このタンパク質をコードする
ｍＲＮＡの第２のエキソンがＡｄ５のｎｔ３５９５−３６０９から転写されるの
で、完全なＥ１ｂ ８．３ｋＤａタンパク質を発現しない。Ｅ１欠損Ａｄベクタ
ーの増殖の間のこの細胞株を用いたＲＣＡ形成の防止は、Ａｄヌクレオチド４５
９−３５１０を欠損する対応のＥ１欠損ベクターの使用を必要とし、そしてこの
ようなベクターは、ＷＯ９７／００３２６出願に開示されている。しかし不運に
も、臨床試験を受ける存在するＥ１欠損Ａｄベクターは、Ｅ１欠損に種々の５’
および３’の境界線を含むので、現在規制承認プロセスを進行中である多くの治
療的なアデノウイルスベースの医薬品のそれぞれに対する安全性および有効性の
研究を再設計および再現することは時間の浪費であり高価である。
【００１６】 ＲＣＡ生成の問題を妥協することは、ＲＣＡについてのラージスケールのｒＡ
ｄウイルス調製物のスクリーニングのための信頼できるアッセイを欠くことであ
る。現在のアッセイは、細胞ベースの生物学的アッセイである（Ｈｅｈｉｒ、Ｋ
．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８４５９−８４６７（１９９６））。このアッセ
イは、１０９ｒＡｄ ｐｆｕあたり１ＲＣＡの検出の限度がある。ｒＡｄについ
ての臨床用量は１０１２−１０１３ベクター粒子の範囲（〜１０１０−１０１１ ｒＡｄ ｐｆｕ）であり、そしてこのレベルで求められる過剰に多量の細胞を完
成するのに６時間を費し、その時間が原因で現在のアッセイは、慣用的な品質管
理（ＱＣ）および製品のリリース試験に役立たない。このアッセイは、ビリオン
粒子に関連する細胞障害性により限定される。非Ｅ１補完細胞（例えば、Ａ５４
９）により許容される最大ＭＯＩは１０ｐｆｕ／細胞であり、したがって、ＲＣ
Ａの存在についての試験に多量の細胞が求められる。細胞数を増加させて、より
高感度のＲＣＡに対する試験を提供することは理論上可能であるが、このアプロ
ーチは非現実的である。このアプローチを用いて治療生成物の１つの推奨用量（
１０１３粒子、およそ２×１０１１ｐｆｕ）を試験することは、１２×１０１０ 細胞（コントロールを含め、およそ１０００（１７５ｃｍ２）のフラスコに対応
する）を必要とする。
【００１７】 Ｅ１欠損ｒＡｄ由来のＲＣＡは、ヘルパー細胞由来のＥ１遺伝子を獲得する。
したがって、ｒＡｄの精製調製物から単離されたウイルスＤＮＡにおけるＥ１コ
ード配列の存在は、調製物におけるＲＣＡの存在の尺度となり得る。ポリメラー
ゼ連鎖反応は、これらの配列を迅速かつ高感度の再現性で検出する能力を有する
。伝統的なゲルベースのＰＣＲ ＲＣＡアッセイを開発する試みを記載した少し
の文献が存在する（Ｚｈａｎｇ、Ｗ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：
４４４−４４７（１９９５）；Ｄｉｏｎ、Ｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．５
６：９９−１０７（１９９６））。これらのそれぞれの報告は、ＰＣＲ分析にお
ける感度の欠乏（Ｅ１標的のおよそ５，０００と５，０００，０００コピーの間
の感度の限度）に苦しんでいる。実際、標的の５０，０００コピーの感度を有す
るプライマー対は、１０９ｐｆｕのＥ１欠損ウイルス中の１ｐｆｕの野生型Ａｄ
ウイルスを検出することが示された（Ｚｈａｎｇら、前出）。
【００１８】 従って、当該分野において現存のアデノウイルスベクターのラージスケールの
産生への革新的なアプローチに対する必要性、およびベクター自体の再設計に指
向する高価で時間を浪費する努力をすることなく、安全、高品質、高力価のアデ
ノウイルスベクターを効果的に産生し得る代替の補完細胞株の作成に対する必要
性が存在する。同様に、当該分野において、高力価のｒＡｄウイルス調製物中の
ＲＣＡを検出するための、迅速で、感度があり、そして再現性のあるアッセイに
対する必要性が存在する。
【００１９】 （発明の要旨） 本発明は、アデノウイルス遺伝子産物をコードおよび発現するが、アデノウイ
ルスベクターとの重複する相同性を含まない安定な補完細胞株を提供する点で、
現在利用可能な補完エレメントおよび細胞株に対する改善を提供する。これらの
補完エレメントおよび細胞株は、ＲＣＡ形成を避けるために適合するベクターの
限定されたサブセットの使用を必要としない点で柔軟性がある。
【００２０】 １つの実施形態において、本発明は、天然に存在するアデノウイルスポリペプ
チドの中の少なくとも５つの連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを
含む、単離された核酸分子を提供する。ここで、ポリヌクレオチドの配列は、天
然に存在しないアデノウイルスヌクレオチド配列である。
【００２１】 別の実施形態において、本発明は、天然に存在するアデノウイルスポリペプチ
ドの少なくとも５つの連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含む、
単離された核酸分子を提供する。ここで、このポリヌクレオチド配列は、天然に
存在するアデノウイルスヌクレオチド配列に対して９７％未満の同一性であるが
、すくなくとも６０％は同一である。
【００２２】 さらに別の実施形態において、本発明は、天然に存在するアデノウイルスポリ
ペプチドの少なくとも５つの連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを
含む、単離された核酸分子を提供する。ここで、このポリヌクレオチドは、天然
に存在するアデノウイルスゲノムとハイブリダイズしない。
【００２３】 本発明の１つの実施形態は、本発明の核酸分子を含む補完エレメント、本発明
の核酸分子を含むベクター、補完細胞株を生成するため本発明のベクターの使用
、および本発明の核酸分子を用いて安定にトランスフェクトされた補完細胞株を
提供する。
【００２４】 なお別の実施形態において、本発明は、以下を包含するアデノウイルスベクタ
ーを生成する系を提供する：（ａ）本発明の補完細胞；および（ｂ）補完エレメ
ントに対して相同ではないが、特定の実施形態において、遺伝子コードの縮退が
なければ細胞中に含まれる補完エレメントの少なくとも一部と相同であるヌクレ
オチド配列を有するアデノウイルスベクター。
【００２５】 本発明の別の目的は、組換えアデノウイルスベクターのＲＣＡフリーのストッ
クを生成する方法を提供することである。
【００２６】 本発明のさらに別の目的において、複製不能ウイルス（特に、複製不能アデノ
ウイルス）の産生ストック中の複製可能ウイルス（特に、ＲＣＡ）の存在を検出
するアッセイが提供される。このアッセイは、以下を含む：（ａ）産生ストック
のサンプルをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に供し、複製不能ウイルスの
ゲノムから欠損されている複製可能ウイルスのゲノムの領域を増幅する工程（し
たがって、このような複製可能ウイルスが存在する場合、複製可能ウイルス特異
的な二本鎖のアンプリコンを形成する工程）；（ｂ）ＰＣＲ反応サンプルが、複
製可能ウイルス特異的なアンプリコンに対して相補的であるシグナリングハイブ
リダイゼーションプローブとハイブリダイズするのを可能にする工程（したがっ
て、複製可能ウイルス特異的なアンプリコンまたは上記の複製可能ウイルスのゲ
ノムへのシグナリングハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼーショ
ンについてのみ検出可能であるシグナルを発する工程）；および（ｃ）シグナル
の存在または非存在を検出する工程。本アッセイの他の局面は、産生ストック中
に存在する複製可能ウイルスおよび複製不能ウイルスの相対的な量をリアルタイ
ムで決定することを可能にするコントロールＰＣＲ反応を包含する。
【００２７】 本発明はさらに、複製不能ウイルスの産生ストック中の複製可能ウイルスの存
在を検出する方法に関する。この方法は、上記のアッセイの使用、およびこのア
ッセイを実施するための説明書、ＰＣＲプライマーおよびシグナリングプローブ
を提供するキットを包含する。
【００２８】 本発明の他の局面および利点は、本発明の以下の詳細な説明から容易に明らか
にされる。
【００２９】 （発明の詳細な説明） 本発明は、複製可能ウイルスのない複製不能ウイルスベクターを産生する方法
およびシステム、ならびに本方法において有用な核酸分子、補完エレメント、ベ
クターおよび補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）細胞株を提供する。好ましい
実施形態において、本発明は、ＲＣＡの非存在において複製不能Ａｄを産生する
方法およびシステム、ならびに本方法において有用な核酸分子、補完エレメント
、ベクターおよび補完細胞株を提供する。さらに、本発明は、複製可能ウイルス
粒子の存在について大規模複製不能ウイルス調製物、好ましくは、ｒＡｄ調製物
をスクリーニングするための方法を提供する。好ましいＡｄベクターは、哺乳動
物に遺伝子を送達する際の使用のために特に十分適合される。なぜなら、これら
Ａｄベクター調製物は夾雑するＲＣＡがないからである。さらに、本発明の好ま
しいＡｄ補完細胞株は、接着性培養または懸濁培養における増殖、ならびに当業
者に周知の技術を使用する無血清培地中での増殖に容易に適合されるので、臨床
前の使用および臨床的使用のためのＡｄの産生のために特に十分適合される。本
明細書中に記載された構築物を保有する補完細胞株に適合された無血清培地は、
本発明によって包含される。
【００３０】 本発明は、産生細胞に含まれる補完エレメントとアデノウイルスベクターとの
間の配列相同性についての新規の戦略を通じて、アデノウイルスベクターのＲＣ
Ａのないストック、ならびに種々のウイルスベクターの複製可能ウイルスのない
ストックの大規模産生を達成する。この戦略は、新規核酸分子の作製を可能にす
る遺伝コードにおける縮重に有利である。この核酸分子は、野生型核酸配列に対
応する十分な配列相同性をなお欠く野生型ウイルスタンパク質をコードし、複製
可能ウイルス産生を導く相同組換えを可能にする。
【００３１】 （定義および一般的技術） 他で規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は
、本発明が属する分野における当業者によって共通に理解されるような意味を有
する。他で示されない限り、本発明の実施は、化学、分子生物学、微生物学、組
換えＤＮＡ技術、遺伝学、ウイルス学および免疫学の慣用的技術を使用する。例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００３２】 ポリヌクレオチドを「含む」核酸分子は、その核酸分子がそのポリヌクレオチ
ドだけでなく他のポリヌクレオチドをまた含み得ることを意味する。例えば、イ
ンシュリンをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、インシュリンをコ
ードするために必要なさらなるポリヌクレオチド５’、３’またはこれらの間に
わたるポリヌクレオチド（例えば、発現制御領域、非翻訳領域、イントロン、お
よび／または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を含み得る。
【００３３】 「導入遺伝子」は、哺乳動物細胞に送達または移入されるべき核酸分子である
。導入遺伝子は、マーカー、レポーター、治療的分子として有用な、タンパク質
、ペプチドまたはポリペプチドをコードする。導入遺伝子はまた、タンパク質産
生、診断アッセイ、またはインビトロもしくはインビボでの一過性もしくは安定
な任意の遺伝子移入に有用な、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコ
ードする。あるいは、導入遺伝子は、タンパク質をコードしないが、センス分子
またはアンチセンス分子、リボザイム、あるいは相補的である核酸分子の複製、
転写もしくは翻訳を調節するか、または縮重のための相補ｍＲＮＡを標的化する
ために使用される他の調節核酸分子として使用され得る。
【００３４】 「発現制御配列」は、目的の遺伝子に作動可能に連結されることによって遺伝
子の発現を調節するポリヌクレオチド領域である。
【００３５】 「作動可能に連結された」ポリヌクレオチドは、目的の遺伝子に連続的（すな
わち、ｃｉｓに作用する）である発現制御配列と、ｔｒａｎｓに作用するかまた
は距離をおいて目的の遺伝子を制御するための発現制御配列との両方を含む。発
現制御配列は、以下の配列を含む：適切な転写開始配列、転写終止配列、プロモ
ーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニ
ル化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを
安定化する配列；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに所望の場合、タン
パク質分泌を増強する配列。
【００３６】 「導入遺伝子カセット」は、発現制御配列に作動可能に連結された導入遺伝子
を含む核酸分子である。
【００３７】 「ウイルスゲノム」は、ウイルス粒子の核酸分子骨格である。ウイルスゲノム
は、ヌクレオチドの点変異、欠損または挿入を含み得る。ウイルスゲノムはさら
に、外因性遺伝子を含み得る。「ネイティブ」または「天然に存在する」ウイル
スゲノムは、天然の動物宿主において増殖する野生型ウイルスより単離されたも
のである。「天然に存在する」ウイルスゲノムは研究室内で保存されかつ繁殖さ
れ得るが、例えば、遺伝子操作、突然変異誘発、複数の組織培養継代、または非
ネイティブ動物宿主または卵における複数の継代によって故意に操作されていな
い。
【００３８】 「ウイルス」は、動物細胞に結合し得、そしてこの細胞に（すなわち、ウイル
スに依存して、細胞質または核のいずれかに）ウイルスゲノムを送達し得る、キ
ャプシド化され、そして／またはエンベロープに包まれたウイルスゲノムである
。用語「ウイルス」は、組換えおよび非組換えウイルスの両方を含む。用語「ウ
イルス」はまた、野生型ウイルスおよび変異型ウイルスの両方を含む。好ましい
ウイルスは、本来、哺乳動物細胞に由来するウイルスであり、そしてさらにより
好ましいウイルスは、ヒト起源のウイルスである。
【００３９】 「組換えウイルス」は、野生型ウイルスにとって外来である１以上の遺伝子を
含むウイルスである。組換えウイルスとしては、ヒトＶＥＧＦ遺伝子のような外
来遺伝子を含むウイルス、および他のウイルスゲノムを含むウイルスが挙げられ
るが、これらに限定されない。
【００４０】 「ウイルスベクター」は、１以上の外来遺伝子を含む組換えウイルスである。
ここで、このウイルスベクターは、動物細胞に結合し得、そしてこの外来遺伝子
をこの細胞に送達し得る。
【００４１】 「アデノウイルスゲノム」は、アデノウイルス粒子の核酸分子骨格である。ア
デノウイルスゲノムは、ヌクレオチドの点変異、欠損または挿入を含み得る。ア
デノウイルスゲノムは、外来遺伝子をさらに含み得る。「ネイティブの」または
「天然に存在する」アデノウイルスゲノムは、天然の動物宿主において増殖する
野生型アデノウイルスから単離されたアデノウイルスゲノムである。「天然に存
在する」アデノウイルスゲノムは、実験室中で維持され得、かつ増殖され得るが
、例えば、遺伝子操作、変異誘発、複数の組織培養継代、またはネイティブでな
い動物宿主または卵において複数継代することにより意図的に操作されていない
。
【００４２】 「アデノウイルス」は、動物細胞に結合し得、そしてこの細胞の核にアデノウ
イルスゲノムを送達し得る、キャプシド化されたアデノウイルスゲノムである。
用語「アデノウイルス」は、組換えおよび非組換えアデノウイルスの両方を含む
。用語「アデノウイルス」はまた、野生型および変異型アデノウイルスの両方を
含む。好ましいアデノウイルスは、本来哺乳動物細胞に由来するアデノウイルス
であり、そしてさらにより好ましいアデノウイルスは、ヒト起源のアデノウイル
スである。
【００４３】 「組換えアデノウイルス」は、野生型アデノウイルスにとって外来である１以
上の遺伝子を含むアデノウイルスである。組換えアデノウイルスとしては、ヒト
ＶＥＧＦ遺伝子のような外来遺伝子を含むアデノウイルス、および他のウイルス
ゲノム（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムまたえはその一部分）を
含むアデノウイルス、例えば、本明細書中の他の箇所で記載されるハイブリッド
Ａｄ／ＡＡＶウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】 「アデノウイルスベクター」は、１以上の外来遺伝子を含む組換えアデノウイ
ルスである。ここで、このアデノウイルスベクターは、動物細胞に結合し得、そ
してこの外来遺伝子をこの細胞の核に送達し得る。
【００４５】 「遺伝子座」は、特定の遺伝子が通常存在するウイルスゲノム内の部位である
。例えば、「アデノウイルスＥ１遺伝子座」は、Ｅ１遺伝子がアデノウイルスゲ
ノムに存在する部位である。外来遺伝子または核酸分子が遺伝子座に挿入される
場合、この外来遺伝子または核酸分子は、天然にそこに存在する遺伝子と置き換
わるか、または天然にそこに存在する遺伝子内もしくは隣の部位に挿入され得る
かのいずれかである。
【００４６】 「アデノウイルス補完エレメント」は、形質転換またはトランスフェクション
により適切な細胞に導入される（補完細胞を生成する）場合に、別の場合には複
製不能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）アデノウイルスの
複製を支持し得る核酸分子である。完全タンパク質の補完活性が完全タンパク質
の一部（タンパク質エレメント）により実質的に供給される限り、補完エレメン
トによりコードされるタンパク質がタンパク質フラグメントであり得ることに注
意することは重要である。
【００４７】 「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、以下：５０％ ホル
ムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナトリウ
ム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０
％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡ、を含む溶
液における４２℃で１６時間のインキュベーション、続いて約６５℃、０．１×
ＳＳＣ中での洗浄が意図される。「低ストリンジェンシーの条件」により、以下
：５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエ
ン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハ
ルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子Ｄ
ＮＡ、を含む溶液における４２℃で１６時間のインキュベーション、続いて１×
ＳＳＣ中、好ましくは３×ＳＳＣ中、なおより好ましくは５×ＳＳＣ中で、約６
５℃、好ましくは約４２℃、なおより好ましくは約３７℃での洗浄が意図される
。
【００４８】 参照ポリヌクレオチド（例えば、野生型、ネイティブ、または天然に存在する
アデノウイルスポリヌクレオチド）に対して、例えば、９０％「同一」未満のポ
リヌクレオチドにより、このポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各
１００ヌクレオチドあたり平均して１０以上の点変異を含まなければならないこ
とを除き、参照配列と同一であることが意図される。実際問題として、任意の特
定の核酸分子が、示された参照ヌクレオチド配列に対して、例えば、９５％、９
０％、８０％または７０％同一未満であるか否かは、デフォルトパラメーターを
用いたＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登
録商標），Ｇｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを
用いて従来どおり決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅ
ｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｓ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ
２：４８２−４８９，１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つ
の配列間の相同性の最良セグメントを見出す。一旦、Ｂｅｓｔｆｉｔが２つのヌ
クレオチド配列間の最も適切な整列を決定すると、ヌクレオチド配列を参照ヌク
レオチド配列に変換するために必要な塩基変化の数を計数することは単純な決定
である。
【００４９】 本発明に従って、「ＲＣＡなし」は、ｒＡｄ調製物の約１０９、好ましくは、
約１０１０、１０１１、１０１２、または１０１３ｐｆｕにおいて、複製可能な
アデノウイルス「ＲＣＡ」が約１ｐｆｕ未満であることを意味する。
【００５０】 用語「単数」の（「ａ」または「ａｎ」）実体とは、１以上のその実体をいう
；例えば、「核酸分子（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」
は、１以上の核酸分子を示すことが理解される。このようにして、用語「ａ」（
または「ａｎ」）、「１以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書中で交換
可能に用いられ得る。
【００５１】 （補完細胞株の構築） （標的細胞） 複製不能組み換えアデノウイルス、または他の複製不能ウイルスを複製可能に
するように組み換え操作され得る標的細胞、または宿主細胞は、非限定的に、ヒ
ト二倍体細胞（例えば、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＨＥＲ、ＨＥＬ、ＨＥＫ、Ａ
５４９）およびヒト異数体細胞（例えば、ＨｅＬａ）を含む任意の哺乳動物種か
ら選択され得る。他の哺乳動物種から単離された細胞、例えば、霊長類細胞、げ
っ歯類細胞または生物学的実験において通常用いられる他の細胞がまた有用であ
る。このような霊長類細胞型の中でも二倍体Ｖｅｒｏ、ＣＶ−１およびＦＲｈＬ
細胞である。細胞およびその正倍数体型を提供する哺乳動物種の選択は、本発明
の限定ではなく；哺乳動物細胞の型（すなわち、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞
など）でもない。
【００５２】 １つの好ましい実施形態では、ＷＩ−３８またはＭＲＣ−５細胞を標的細胞と
して用いる。これらの株、および詳細にはＷＩ−３８は、ワクチン産生において
長年用いられてきた。これらは、長期の安全性の記録を有し、このことは、これ
らの細胞株には有害な偶発的因子は存在しないことを示唆する。従って、ＷＩ−
３８またはＭＲＣ−５細胞は、臨床条件で用いられるべき組み換えアデノウイル
スの産生の好ましい選択である。
【００５３】 （アデノウイルス核酸分子および補完エレメント） 適切には、パッケージング細胞が、核酸分子を含む補完エレメントで安定に形
質転換またはトランスフェクトされる。この核酸分子は最低でも、１つ以上の機
能的アデノウイルスタンパク質（存在しないか、または選り抜きの複製欠陥アデ
ノウイルスベクターによって機能的にコードされない）をコードするヌクレオチ
ド配列を保有する。アデノウイルス遺伝子座であるＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲ
Ｆ６がウイルス複製に必須であることが当該分野で公知である。従って、この補
完エレメントは、１つ以上のアデノウイルスタンパク質、好ましくは１つ以上の
必須のアデノウイルスタンパク質、なお好ましくはＥ１遺伝子座によってコード
される１つ以上のタンパク質、そして最も好ましくはＡｄ５ Ｅ１遺伝子座によ
ってコードされる全てのタンパク質（Ａｄ５ ８．３ｋＤａ Ｅ１ｂタンパク質
を含む）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５４】 組み換えＡｄベクターとの相同性を回避し、そしてＲＣＡ生成をもたらす相同
組み換えの確率を同時に減じる手段として、本発明の補完エレメントは、天然に
存在しないアデノウイルスヌクレオチド配列を含む。
【００５５】 従って、１つの実施形態において、本発明は、天然に存在するアデノウイルス
ポリペプチドの少なくとも５連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを
含む単離された核酸分子を提供する。ここで、このポリヌクレオチドの配列は、
天然に存在しないアデノウイルスヌクレオチド配列である。「天然に存在しない
アデノウイルス配列」が意味するのは、ネイティブでないアデノウイルス配列で
あるヌクレオチド配列である。すなわち、これは正確なヌクレオチド配列ではな
く、これは、ネイティブなアデノウイルスゲノムにおける少なくとも５つのアミ
ノ酸をコードするが、遺伝子コードの縮重性によって、同じ５アミノ酸をコード
する。遺伝子コードは、周知であり、天然に存在しないが公知のアデノウイルス
アミノ酸配列をコードする多数のヌクレオチド配列（完全に何千も）を意味する
ことが当業者には慣用的である。このような列挙（リスト）は、コンピューター
で作成されるが、経済的な目的で本明細書には示していない。
【００５６】 この実施形態に従って、ポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が提供さ
れ、このポリヌクレオチドは、ヒトアデノウイルス、トリアデノウイルス、ウシ
アデノウイルス、ネコアデノウイルス、イヌアデノウイルス、マウスまたは他の
げっ歯類アデノウイルス、サカナアデノウイルス、ブタアデノウイルス、ヤギア
デノウイルス、ヒツジアデノウイルス、ウマアデノウイルス、またはサルアデノ
ウイルス由来のポリペプチドを含むがこれらに限定されない任意のアデノウイル
ス由来の天然に存在するポリペプチドの少なくとも５つのアミノ酸をコードする
が、ここで、ポリヌクレオチド配列は天然に存在するアデノウイルスヌクレオチ
ド配列ではない。アデノウイルスのこれらのカテゴリーの各々に由来するヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋを介して獲得され得る。
【００５７】 本発明の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドを含む単離された核酸
分子が提供され、このポリヌクレオチドは、公知のヒトアデノウイルス１〜４６
型のうちの１つに由来する天然に存在するポリペプチドの少なくとも５つのアミ
ノ酸をコードするが、ここで、ポリヌクレオチド配列は、天然に存在するヒトア
デノウイルスヌクレオチド配列ではない。すべてのヒトアデノウイルス１〜４６
型は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（
ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎ
ａｓｓａｓｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９から入手可能であり、そして、ヌク
レオチドおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋを介して獲得され得る。
【００５８】 本発明のより好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドを含む核酸分子が
提供され、このポリヌクレオチドは、天然に存在するＡｄ５またはヒトアデノウ
イルス２型（Ａｄ２）ポリペプチドの少なくとも５つのアミノ酸をコードするが
、ポリヌクレオチド配列は天然に存在するヒトＡｄ５またはＡｄ２ヌクレオチド
配列ではない。Ａｄ２およびＡｄ５の完全なヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎ
ｋから入手可能である（例えば、ヒトアデノウイルス５型配列についてはＧｅｎ
Ｂａｎｋ登録番号Ｍ７３２６０、およびヒトアデノウイルス２型配列については
Ｊ０１９１７を参照のこと）。
【００５９】 上記参照される天然に存在しないポリヌクレオチド配列は、天然に存在するア
デノウイルスポリペプチドのたった５連続したアミノ酸をコードし得る。天然に
存在しないポリヌクレオチド配列は、好ましくは、天然に存在するアデノウイル
スポリペプチドの少なくとも６つ連続するアミノ酸をコードし、より好ましくは
、天然に存在するアデノウイルスポリペプチドの少なくとも７、８、９、１０、
１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２
００、２５０、３００、４００、または５００連続するアミノ酸、および、最も
好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、全アデノウイルスポリペプチドをコード
する。
【００６０】 上記参照される天然に存在するアデノウイルスポリペプチドは、任意のアデノ
ウイルスポリペプチドであり、好ましくは、重要なアデノウイルスポリペプチド
、より好ましくは、Ｅ１、Ｅ２またはＥ４ポリペプチドであり、さらにより好ま
しくは、Ｅ１ポリペプチドであり、そして最も好ましくは、５５ｋＤａ Ｅ１ｂ
ポリペプチド、２１ｋＤａ Ｅ１ｂポリペプチド、および８．３ｋＤａ Ｅ１ｂ
ポリペプチドからなる群から選択されるＡｄ５ Ｅ１ｂポリペプチドである。
【００６１】 上記参照される天然に存在しないポリヌクレオチド配列は、各々対応するネイ
ティブなアデノウイルスヌクレオチド配列と比較して、好ましくは、ネイティブ
なヒトアデノウイルス配列と比較して、そしてよりさらに好ましくは、ネイティ
ブなＡｄ５ヌクレオチド配列と比較して、３ほどの少ないヌクレオチド置換を含
み得、好ましくは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５
、１５０、１７５、２００、２５０、３００、またはそれより多くのヌクレオチ
ド置換を含む。
【００６２】 別の実施形態において、ポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が提供さ
れ、このポリヌクレオチドは、天然に存在するアデノウイルスポリペプチドの少
なくとも５連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むが、このポリ
ヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、天然に存在するアデノウイルス
ゲノムにハイブリダイズしない。好ましくは、このようなポリヌクレオチドは、
ストリンジェントな条件下で、天然に存在するヒトアデノウイルスゲノムにハイ
ブリダイズしない。より好ましくは、このようなポリヌクレオチドは、ストリン
ジェントな条件下で、天然に存在するＡｄ５ゲノムにハイブリダイズしない。好
ましい実施形態は、ポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供し、この
ポリヌクレオチドは、天然に存在するアデノウイルスポリペプチドの少なくとも
５連続するアミノ酸をコードするが、このポリヌクレオチドは、低ストリンジェ
ントな条件下で、天然に存在するアデノウイルスゲノムにハイブリダイズしない
。好ましくは、このようなポリヌクレオチドは、低ストリンジェンシーの条件下
で天然に存在するヒトアデノウイルスゲノムにハイブリダイズしない。より好ま
しくは、このようなポリヌクレオチドは、低ストリンジェンシーの条件下で天然
に存在するＡｄ５ゲノムにハイブリダイズしない。
【００６３】 ２つの一般的なアプローチを使用して、哺乳動物細胞におけるＤＮＡ組換えの
ための配列類似性条件を研究する。１つのアプローチは、２つのポリヌクレオチ
ド間で共有される同一のヌクレオチドの長さの関数として組換えの速度を測定す
る方法である。当業者が容易に理解するように、この状況における配列「同一性
」は、二重鎖ポリヌクレオチドをいい、そして、１つ以上の二重鎖ポリヌクレオ
チドの相補的な単鎖成分間の相互作用を意図する。このアプローチを使用して、
完全な配列同一性の長さが２９５から２００ｂｐに減少する場合、哺乳動物細胞
における２つの密接に適合した配列間の染色体内組換えの速度が急に落ちること
が示されている（Ｌｉｓｋａｙ，Ｒ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１５：１６１−
１６７（１９８７））。あるいは、組換え速度に対するヌクレオチドミスマッチ
の効果が測定され得る。このストラテジーを使用して、８１％同一である２つの
連結した配列間の哺乳動物細胞における染色体内組換えが、完全に近い同一性を
示す配列間の組換えと比較して１０００倍以上減少したこと（Ｗａｌｄｍａｎ，
Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：５３４０
−５３４４（１９８７））および組換えにおける相乗的に大きい減少が、配列同
一性の程度における比較的小さな変化に由来し得ること（Ｌｕｋａｃｓｏｖｉｃ
ｈ，Ｔら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５１：１５５９−１５６８（１９９９））が決
定された。哺乳動物細胞における効率的な染色体外組換えは、約２００ｂｐの同
一のヌクレオチドの長さを必要とすることが示されている（Ｒｕｂｎｉｔｚ，Ｊ
．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２２５３−２２５８（１９８４））。
【００６４】 理論によって拘束されないが、発明者らによって、コード配列の１００ヌクレ
オチドにおいて平等に分散されたたった３塩基対置換が、有意に相同組換えを減
少すると考えられている。従って、本発明の別の局面は、ポリヌクレオチドを含
む単離された核酸分子を提供し、ここで、ポリヌクレオチドの配列は、同じ長さ
の天然に存在するアデノウイルスポリヌクレオチド配列に、少なくとも約６０％
同一であるが、約９７％未満同一である。好ましくは、このポリヌクレオチド配
列は、同じ長さの天然に存在するアデノウイルスポリヌクレオチド配列、好まし
くは、ヒトアデノウイルス、より好ましくは、Ａｄ５に対して、少なくとも約６
０％同一であるが、約９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０
％、８５％、８０％、７５％、７０％または６５％未満同一である。好ましくは
、ポリヌクレオチド配列同一性は、ヌクレオチド配列の翻訳コード能力が変更さ
れないようにコドン内の変性位置のヌクレオチドのサイレント変異の導入を介し
て減少される。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、天然に存在するアデノウ
イルスポリペプチドの少なくとも５、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、
１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、
３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２
５０、または３００連続したアミノ酸である。
【００６５】 必要に応じて、このようなサイレント変異は、ポリヌクレオチドの全長に渡っ
て平等に分散されている。従って、１つの実施形態において、サイレント変異は
、１０連続したコドン毎に少なくとも１つ存在し、好ましくは、少なくとも１つ
のサイレント変異が、９、８、７、６、５、４または３つ連続したコドン毎に存
在する。関連した実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、野生型アデノウ
イルス配列の２００未満連続したヌクレオチド、好ましくは、野生型アデノウイ
ルス配列の１５０、１２５、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２５、２
０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、
７または６連続したヌクレオチドを含む。最も好ましいヌクレオチド配列は、可
能な限り（すなわち、最も完全に変性である）対応する野生型アデノウイルス配
列とほとんど配列同一性を有さないが、野生型アデノウイルスの翻訳コード能力
を保持する。
【００６６】 特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＡｄＥ１タンパク質における
ＲＣＡ欠損を補完し得るポリペプチドをコードすることが好ましい。この実施形
態の好ましい例は、ポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供し、ここ
で、ポリヌクレオチドの配列は、配列番号２０のヌクレオチド１〜１９８、また
は配列番号２０のヌクレオチド２８７〜３０１を含む天然に存在するＡｄ５ポリ
ヌクレオチドに、少なくとも約６０％同一であるが、約９７％未満同一である。
好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２０のヌクレオチド１〜１９８
、または配列番号２０のヌクレオチド２８７〜３０１を含む天然に存在するＡｄ
５ポリヌクレオチドに、少なくとも約６０％同一であるが、約９６％、９５％、
９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％ま
たは６０％未満同一である。好ましくは、ポリヌクレオチド配列同一性は、ヌク
レオチド配列の翻訳コード能力が変更されないようにコドン内の変性位置のヌク
レオチドのサイレント変異の導入を介して減少される。より好ましくは、ポリヌ
クレオチドは、Ａｄ５ Ｅ１ポリペプチドの少なくとも５、好ましくは、少なく
とも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８
、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０
、１７５、２００、２５０、または３００連続したアミノ酸をコードする。
【００６７】 必要に応じて、このようなサイレント変異は、ポリヌクレオチドの全長に渡っ
て平等に分散されている。従って、１つの実施形態において、サイレント変異は
、配列番号２０のヌクレオチド１〜１９８を含むポリヌクレオチドの１０連続し
たコドン毎に少なくとも１つ存在し、好ましくは、少なくとも１つのサイレント
変異が、配列番号２０のヌクレオチド１〜１９８を含むポリヌクレオチドの９、
８、７、６、５、４または３連続したコドン毎に存在する。別の実施形態におい
て、サイレント変異は、配列番号２０のヌクレオチド２８７〜３０１を含むポリ
ヌクレオチドの１、２、３、４、または５つ連続したコドン中に少なくとも１つ
存在する。関連した実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、野生型アデノ
ウイルス配列の２００未満連続したヌクレオチド、好ましくは、野生型アデノウ
イルス配列の１５０、１２５、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２５、
２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８
、７または６連続したヌクレオチドを含む。最も好ましいヌクレオチド配列は、
可能な限り（すなわち、最も完全に変性である）対応する野生型アデノウイルス
配列とほとんど配列同一性を有さないが、野生型アデノウイルス配列の翻訳コー
ド能力を保持する。
【００６８】 別の所望の実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドを含む核酸分子を
提供し、このポリヌクレオチドは、天然に存在するアデノウイルスポリペプチド
の少なくとも５連続するアミノ酸をコードし、ここで、天然に存在するアデノウ
イルスポリペプチドをコードするコドンは、所定の真核生物細胞、好ましくは、
哺乳動物細胞における翻訳について優先的であることが公知であり、より好まし
くは、ヒト細胞における翻訳について優先的であり、そしてなおより好ましくは
、ヒトＷＩ−３８またはＭＲＣ−５細胞における翻訳について優先的であること
が公知である。
【００６９】 所定の種において優先的に翻訳されるコドンを選択するための方法は、当業者
に周知である。例えば、ヒト細胞で優先的に利用されるコドンを選択するために
、配列決定されたヒトＤＮＡについてのコドン使用表が使用される。ヒトコドン
使用のための適切な表を表１として示す。コードされるアミノ酸は、第１の列に
見出され、そして、種における使用の最も高い割合を有するアミノ酸についての
コドンが選択される。例えば、当業者は、ヒトにおけるアミノ酸バリンをコード
するヌクレオチド配列の発現を最適化するために、コドンＧＴＧを利用し、これ
は、ヒト遺伝子における時期の４８％で使用される。
【００７０】 （表１） （Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ｜ｇｂｐｒｉ｜：１７６２５ ＣＤＳ（８７０７
６０３コドン）
【００７１】
【表１】 コーディングＧＣ ５２．７５％、１文字目ＧＣ ５６．１２％、２文字目ＧＣ
４２．３６％、３文字目ＧＣ ５９．７７％ 遺伝コード１：標準。
【００７２】 類似の表が他の種から入手可能であり、そして例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２０００年４月１０日訪問）にて
インターネット上で入手可能である。
【００７３】 特に好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１のヌクレオチド１〜１
９８として示される配列の少なくとも２０個連続するヌクレオチドを含む核酸分
子、好ましくは配列番号１のヌクレオチド１〜１９８として示される配列の少な
くとも３０個、４０個、５０個、もしくは１００個連続するヌクレオチドを含む
核酸分子、より好ましくは配列番号１として示される配列全体を含む核酸分子を
包含する。配列番号１は、完全Ａｄ５ゲノムのヌクレオチドおよそ３３０９から
ヌクレオチドおよそ３６１４に広がる、Ａｄ５のＥ１遺伝子座の領域（ＧｅｎＢ
ａｎｋ登録番号Ｍ７３２６０、配列番号２０として本明細書中に示されるフラグ
メント）に対応し、そしてＥ１ｂ ５５ｋＤタンパク質のＣ末端および８．３ｋ
Ｄ Ｅ１ｂタンパク質の３’エキソンをコードする。補完エレメントの構築が、
実施例１（Ａ）および実施例７に示される。この配列を、図２に示されるように
、コード領域中の可能なすべてのサイレント変異を含むように、改変した。可能
な場合、表１に示されるヒトコドン使用法表中の最も頻繁に使用されるコドンに
対応するように、塩基置換を選択した。
【００７４】 別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１８のヌクレオチド１〜
１９８として示される配列の少なくとも２０個連続するヌクレオチドを含む核酸
分子、好ましくは配列番号１８のヌクレオチド１〜１９８として示される配列の
少なくとも３０個、４０個、５０個、もしくは１００個連続するヌクレオチドを
含む核酸分子、より好ましくは配列番号１８として示される配列全体を含む核酸
分子を包含する。配列番号１８もまた、完全Ａｄ５ゲノムのヌクレオチドおよそ
３３０９からヌクレオチドおよそ３６１４に広がる、Ａｄ５のＥ１遺伝子座の領
域（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ７３２６０、配列番号２０として本明細書中に示
されるフラグメント）に対応する。補完エレメントの構築が、実施例１（Ｃ）お
よび実施例７に示される。この配列を、図２中の下線ヌクレオチド置換により示
されるように、均等に約１５ヌクレオチドの間隔で配置されたサイレント変異を
含むように、改変した。可能な場合、表１に示されるヒトコドン使用法表中の最
も頻繁に使用されるコドンに対応するように、塩基置換を選択した。
【００７５】 本発明のなお別の実施形態において、以下からなる群より選択される配列を含
む核酸分子が、提供される：（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜１９８；（ｂ
）配列番号１のヌクレオチド２９８〜３１２；および配列番号１のヌクレオチド
１〜３１５。
【００７６】 本発明のなお別の実施形態において、以下からなる群より選択される配列を含
む核酸分子が、提供される：（ａ）配列番号１８のヌクレオチド１〜１９８；（
ｂ）配列番号１８のヌクレオチド２９８〜３１２；および配列番号１８のヌクレ
オチド１〜３１５。
【００７７】 本発明のなお別の実施形態において、以下からなる群より選択される配列を含
む核酸分子が、提供される：以下からなる群より選択される配列を含む核酸分子
が、提供される：（ａ）配列番号１９のヌクレオチド２９８〜３１２；および（
ｂ）配列番号１９のヌクレオチド１〜３１５。配列番号１９はまた、完全Ａｄ５
ゲノムのヌクレオチドおよそ３３０９からヌクレオチドおよそ３６１４に広がる
、Ａｄ５のＥ１遺伝子座の領域（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ７３２６０、配列番
号２０として本明細書中に示されるフラグメント）に対応する。補完エレメント
の構築が、実施例１（Ｂ）および実施例７に示される。この配列は、５５ｋＤコ
ード領域中に野生型Ａｄ５配列を有したが、図２中の四角で囲まれたヌクレオチ
ド置換により示されるように、８．３ｋＤコード領域の３’エキソン中に可能な
塩基置換すべてを有する。可能な場合、表１に示されるヒトコドン使用法表中の
最も頻繁に使用されるコドンに対応するように、塩基置換を選択した。
【００７８】 別の実施形態において、本発明は、必須アデノウイルスタンパク質をコードす
る補完エレメントを提供し、この補完エレメントは、本明細書中に記載される核
酸分子を含む。好ましくは、この補完エレメントは、Ａｄ Ｅ１遺伝子座を含み
、より好ましくはヒトＡｄ Ｅ１遺伝子座を含み、なおより好ましくはＡｄ Ｅ
１遺伝子座を含む。
【００７９】 ＲＣＡをもたらす相同組換えを除去または排除するための別の方法は、天然に
存在するアデノウイルスイントロンに代えて１つ以上の異種イントロンで置換す
ることである。このアデノウイルスのゲノム構造（天然に存在するイントロンの
位置を含む）は、周知である（概説について、Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅ
ｓ、Ｈａｒｏｌｄ Ｇｉｎｓｂｅｒｇ編、１９８４、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ
、ＮＹを参照のこと）。本発明のこの実施形態において使用される特定の異種イ
ントロンは、本発明にとって重要であるとはみなされず、従って、限定的ではな
いが、異種イントロンのいくつかの例が、読者の便宜のために下記に提供される
。本発明における使用のためのイントロンとしては、ＳＶ４０後期領域イントロ
ン、ＳＶ４０ Ｔイントロン、ヒトサイトメガロウイルス極初期イントロンＡ、
免疫グロブリンイントロン、および当業者に周知のその他が挙げられる。さらに
、異種イントロンは、１つ以上の異種イントロンおよび／またはネイティブのア
デノウイルスイントロンのハイブリッドであり得る。例えば、種々の介在配列か
らの、５’スプライス部位および３’スプライス部位、ならびに中央枝（ｃｅｎ
ｔｒａｌ ｂｒａｎｃｈ）部位を含む、ハイブリッドイントロンであるか、ある
いは、コンセンサススプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位である
ように操作された、ハイブリッドイントロンである。このようなコンセンサスス
プライス部位は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ ９９／２９８４８（本明細書中にその全
体が参考として援用される）に開示される。従って、本発明の核酸分子および本
発明の補完エレメントは、上記の天然に存在しないコード配列を伴ってかもしく
は伴わずに、異種イントロンおよび／またはスプライス部位をさらに含み得る。
【００８０】 上記のように、Ｅ１タンパク質すべてをコードする補完エレメントが、本発明
の好ましい実施形態である。図１は、実施例１の方法に従って構築された例示的
Ｅ１補完エレメントの一部の模式図を示す。好ましくは、本発明に従うＥ１補完
エレメントは、Ｅ１領域のアデノウイルス配列５’を欠き、いくつかの第１世代
アデノウイルスベクターがＥ１ａプロモーターの一部またはすべてを含むので、
好ましくは、ネイティブのＥ１ａプロモーターを除く。本発明のＥ１補完エレメ
ントは、Ａｄ５ゲノムのヌクレオチドおよそ３，０００〜４，３００の領域、好
ましくはＡｄ５ゲノムのヌクレオチドおよそ３，３００〜３，７００の領域、そ
して最も好ましくはヌクレオチドおよそ３，４００〜３，５００に対応する野生
型Ａｄヌクレオチド配列の、１４個より多く連続するヌクレオチドを好ましくは
含まない。
【００８１】 当業者に理解されるように、このアデノウイルスベクターはまた、代替的コド
ン使用法および／または野生型イントロンを異種イントロンに代える置換を介し
て、有利に改変され得る。本明細書中の他の場所に述べられるように、ベクター
配列の変化は、生成物質（例えば、パッケージング株）中の配列の変化よりも好
ましくない。なぜなら、このベクター自体が治療薬物の一部を形成し、そしてそ
の薬物自体のどの改変も、安全性および効力についての広範な臨床前試験および
臨床試験を必要とするからである。それにも関わらず、アデノウイルスベクター
の改変は有用であり、例えば、アデノウイルスベクターは、ＡＡＶの生成におい
てヘルパーウイルスとして使用され得る。例えば、米国特許第５，８７１，９８
２号（本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【００８２】 （調節エレメントおよびベクター） 補完エレメントは、標的細胞への核酸分子の安定な移入およびその標的細胞に
よるコードタンパク質の発現をもたらす、任意の形態であり得る。最も適切には
、この補完エレメントは、ベクター中に保有される。この補完エレメントは、宿
主細胞染色体中に安定に組み込まれてもよいし、またはエピソーム性の染色体外
エレメントとして存在してもよい（例えば、Ｃａｒａｖｏｌｙｒｉら、Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６９：６６２７〜６６３３（１９９５）を参照のこと）。ベクターとし
ては、遺伝情報を保有および移入し得る任意の構築物が限定せずに挙げられ、例
えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、
ビリオン、レプリコン、およびメッセンジャーＲＮＡが挙げられる。好ましいベ
クターとしては、染色体由来ベクター、エピソーム由来ベクターおよびウイルス
由来ベクターが挙げられ、例えば、細菌プラスミド由来ベクター、バクテリオフ
ァージ由来ベクター、酵母エピソーム由来ベクター、および酵母染色体エレメン
ト由来ベクター；昆虫ウイルス由来ベクター（例えば、バキュロウイルス由来ベ
クター、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）由来ベクター、ポックスウイルス
（例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルス）由来ベクター、ア
デノウイルス由来ベクター、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス
、ウシヘルペスウイルスおよび仮性狂犬病ウイルス）由来ベクター、およびレト
ロウイルス由来ベクター；ならびにこれらの組み合わせに由来するベクター（例
えば、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝エレメントに由来するベクタ
ー（例えば、コスミドおよびファージミド））が挙げられる。一般に、ポリヌク
レオチドを宿主中で維持、増殖または発現するために適切な任意のベクター、あ
るいは宿主中でポリペプチドを発現するために適切な任意のベクターが、この点
に関して発現用に使用され得る。１つの特に適切な実施形態において、この補完
エレメントが、プラスミドベクター中に配置される。
【００８３】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子（例えば、天然に存在するアデノ
ウイルスポリペプチドの少なくとも５個連続するアミノ酸をコードするポリヌク
レオチドを含む核酸分子であって、このポリヌクレオチドの配列は天然に存在す
るアデノウイルスヌクレオチド配列ではない）のいずれかを含むベクターに関し
、そしてこのベクターを含む宿主細胞に関する。このようなベクターおよび宿主
細胞は、例えば、補完エレメントの増幅、補完エレメントの構築、補完ポリペプ
チドの発現、および複製欠損ウイルスの増殖に有用である。
【００８４】 ベクターは、周知技術（例えば、感染、形質導入、トランスフェクション、ト
ランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｔｉｏｎ）、リポフェクション、エレクトロ
ポレーション、マイクロインジェクション、粒子ボンバードメント、および形質
転換）を使用して、宿主細胞中に導入され得る。一般には、プラスミドベクター
は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラ
ンスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、またはエレクト
ロポレーションによって、細胞中に導入される。このベクターがウイルスである
場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパ
ッケージングされ得、その後、宿主細胞中に形質導入され得る。このような方法
は、多くの標準的実験室マニュアル（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））に記載
される。
【００８５】 本発明の核酸分子は、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクタ
ーに連結され得る。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養用のジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺
伝子、またはネオマイシン耐性遺伝子、そしてＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌にお
ける培養用のテトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子も
しくはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。この点に関して、特定の好ましい
実施形態において、このベクターは、特異的発現を提供し、この発現は、誘導性
であってもよいし、そして／または細胞型特異的であってもよい。示されるよう
に、ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。このよう
なベクターの中で特に好ましいのは、操作が容易である環境因子（例えば、温度
および栄養素添加物）により誘導可能であるベクターである。
【００８６】 この核酸分子は、以下の適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきであ
る：例えば、原核生物プロモーター（例えば、ファージλＰＬプロモーターおよ
びＰＲプロモーター、ならびに他のバクテリオファージプロモーター（例えば、
Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ７／ｌａｃプロモーター、ＳＰ６プロ
モーター、ＳＰ０１プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩプロモーター、ｌａ
ｃＺプロモーター、ｇｐｔプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモー
ター、ｏｘｙ−ｐｒｏプロモーター、ｏｍｐ／ｌｐｐプロモーター、ｒｒｎＢプ
ロモーター、およびｔａｃプロモーター）、ならびに真核生物プロモーター（例
えば、メタロチオネイン（例えば、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター）
、α接合因子プロモーター、アクチンプロモーター、熱ショックプロモーター、
組織特異的プロモーター（例えば、リンホカイン誘導性プロモーター、Ｐｉｃｈ
ｉａアルコールオキダーゼプロモーター、アルファウイルスサブゲノム（ｓｕｂ
ｇｅｎｏｍｉｃ）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーター
（イントロンＡを含むかまたは含まない）、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモータ
ー、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレト
ロウイルスＬＴＲ（例えば、ラウス肉腫ウイルス由来）のプロモーター、初期Ｓ
Ｖ４０プロモーターおよび後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲの
プロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来）。他の適切なプロ
モーターが、当業者に公知である。
【００８７】 高等真核生物による本発明の核酸分子の転写は、エンハンサー配列をベクター
に挿入することによって増加され得る。エンハンサーは、シス作用性のＤＮＡエ
レメントであり、通常、約１０〜３００ｂｐであり、これは、所定の宿主細胞型
においてプロモーターの転写活性を増加するために作用する。エンハンサーの例
としては、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の後ろ側にｂｐ１００〜２
７０で位置する）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製
起点の後ろ側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが
挙げられる。
【００８８】 一般的に、発現構築物は、転写領域中に転写のための開始部位および終了部位
、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。この構築物によって発現された成熟
転写物のコード部分は、始めに転写開始ＡＵＧコドンおよび翻訳されるポリペプ
チドのおおよそ末端に位置する終了コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含
む。
【００８９】 本発明の核酸分子の増幅に適した宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例え
ば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ細胞およびＰｉｃｈｉａ細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ
Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、Ｃ
ＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；および植
物細胞が挙げられる。上記宿主細胞に対する適切な培養培地および培養条件が、
当該分野で公知である。
【００９０】 細菌における使用に好ましいベクターの間には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およ
びｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ
、ｐＮＨｌ８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；および
ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩ
Ｔ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの
間には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌおよびｐＳＧ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳ
ＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切なベク
ターは、当業者に容易に明らかである。
【００９１】 一旦所望の核酸分子（補完エレメント）が操作されると、これは、任意の適切
な方法によって標的宿主細胞に移入され得る。このような方法としては、例えば
、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技
術、高速度のＤＮＡコートされたペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト
融合が挙げられる。従って、細胞は、標準的な方法に従って培養され、そして必
要に応じて、耐性遺伝子を発現する細胞を含む細胞を選択するための抗生物質を
含む培地に播種される。選択期間後、耐性コロニーは単離され、拡大され、そし
てコードするアデノウイルスタンパク質の発現に関してスクリーニングされる。
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。あるいは、新規に作製された補完細胞
は、レポーター遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクロシダーゼ遺伝子）
を保有する組換えＥ１欠損アデノウイルスで感染され、そして複製不能アデノウ
イルスの複製を補完する能力に基づいて選択される。
【００９２】 （ＲＣＡを含まないアデノウイルス産生のための系） 本発明は、アデノウイルスベクターと補完プロデューサー細胞株との組合わせ
（集合的に「系」）を提供する。より広範には、本発明は、（ａ）組換え複製不
能アデノウイルスベクター；および（ｂ）複製不能アデノウイルスベクターによ
って発現されない必須の遺伝子産物をコードするが、複製不能アデノウイルスと
の相同組換えができない、補完細胞を含む、アデノウイルス粒子の産生のための
系を含む。
【００９３】 好ましくは、本発明は、プロデューサー補完細胞株を提供し、これは、必須遺
伝子の部分的なフラグメントを含むゲノムを有する複製不能アデノウイルスベク
ターと組み合わされ得るが、これらの遺伝子は発現されない。これらのアデノウ
イルスベクターは、特別な問題を提示する。なぜなら、必要とされる必須の遺伝
子産物を提供するために、標準的な補完細胞株は、ベクターとの有意な重複領域
を必ず含まねばならないからである。従って、本発明の好ましい補完細胞株は、
天然に存在するアデノウイルスポリペプチドの少なくとも５個連続するアミノ酸
をコードする、少なくとも１５ヌクレオチド長のポリヌクレオチドを含み、ここ
で、このアミノ酸をコードするコード領域は、複製不能アデノウイルスベクター
上に含まれる。しかし、遺伝暗号の縮重に起因して、補完細胞株中のポリヌクレ
オチドの配列は、アデノウイルスゲノム中に見出される天然に存在するアデノウ
イルスヌクレオチド配列ではない。好ましくは、補完細胞株は、天然に存在する
アデノウイルスポリペプチドの少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、
２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０
、３００、または３３０アミノ酸をコードする、少なくとも２０、２５、３０、
４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、または１
、０００ヌクレオチド長のポリヌクレオチドを含み、ここで、このアミノ酸の１
つ以上をコードするコード領域は、複製不能アデノウイルスベクター上に含まれ
るが、遺伝暗号の縮重に起因して、補完細胞株中のポリヌクレオチドの配列は、
アデノウイルスゲノム中に見出される天然に存在するアデノウイルスヌクレオチ
ド配列ではない。
【００９４】 好ましくは、補完細胞株中のポリヌクレオチドの配列および複製不能アデノウ
イルスゲノムの配列（例え少なくとも５個同一な連続アミノ酸をコードするとし
ても）、互いに９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６
５％、６０％、５５％または５０％未満同一である。また、好ましくは、少なく
とも５個同一な連続アミノ酸をコードする、補完細胞株中のポリヌクレオチドの
配列および複製不能アデノウイルスゲノムの配列は、ストリンジェントな条件に
おいて互いにハイブリダイズし得ない。より好ましくは、この２つの配列は、低
いストリンジェンシーの条件においてハイブリダイズしない。
【００９５】 本発明の系が、野生型アデノウイルスポリペプチド配列をコードする天然に存
在しないヌクレオチド配列を含む、細胞またはウイルスベクターに制限されない
ことにここで注意することが、重要である。異なるアデノウイルス菌株間で有意
なヌクレオチド配列の多様性が存在する。従って、一致した補完エレメントおよ
びベクターは、遺伝暗号を別にすれば同一である天然に存在するアデノウイルス
配列を含み得る。
【００９６】 １つの好ましい実施形態において、ベクターは、天然に存在するアデノウイル
ス配列のみを有し、そして補完エレメント／補完細胞株との相同性は、非アデノ
ウイルス核酸配列を有するポリヌクレオチドの補完エレメント／補完細胞株への
導入によって減少される（しかし、これにもかかわらず、天然に存在するアデノ
ウイルスポリペプチドのコード領域を提供する）。
【００９７】 別の実施形態において、補完エレメント／補完細胞株は、天然に存在するアデ
ノウイルス配列のみを有し、そして相同性は、非アデノウイルス核酸配列を有す
るポリヌクレオチドのベクターへの導入によって減少される（しかし、これにも
かかわらず、天然に存在するアデノウイルスポリペプチドのコード領域を提供す
る）。あるいは、この実施形態において、非アデノウイルス核酸配列を有するポ
リヌクレオチドは、天然に存在するアデノウイルスポリペプチドが補完細胞株に
よってトランスで提供される場合、このポリペプチドのコード領域を提供する必
要はない。
【００９８】 本明細書中の系のベクターまたは細胞株のいずれかに含まれる非アデノウイル
スヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、本明細書中のいずれかに記載
される任意の非アデノウイルス配列であり得る。同様に、この系は、本明細書中
のいずれかに記載される細胞およびベクターの任意の組み合わせを含み得、これ
は：（ａ）複製不能アデノウイルス粒子を産生するために一緒に使用され得；そ
して（ｂ）遺伝暗号の縮重を別として重複する配列同一性を有する。
【００９９】 本明細書中に記載される任意の系において、補完細胞株または複製不能ベクタ
ーはまた、天然に存在するアデノウイルスイントロンの変わりに異種イントロン
を含み得、ここで、この異種イントロンは、異種コンセンサススプライスドナー
領域およびスプライスアクセプター領域をさらに含み得る。
【０１００】 好ましい実施形態において、本発明の系は：（ａ）Ａｄ５の５５ｋＤａ Ｅ１
ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド（非アデノウイルス配列である少な
くとも５０個連続するヌクレオチド）を含む、補完細胞；および（ｂ）ヌクレオ
チド３３１１とヌクレオチド３６１４との間の野生型Ａｄ５配列の少なくとも５
０個連続するヌクレオチドを含む、アデノウイルスベクターを含む。
【０１０１】 （ａ）配列番号１、配列番号１８、または配列番号１９の配列を有するポリヌ
クレオチドを含む補完細胞株；および（ｂ）ヌクレオチド３３１１とヌクレオチ
ド３６１４との間の野生型Ａｄ５配列の少なくとも５０個連続するヌクレオチド
を含む、アデノウイルスベクターを含む系がまた、好ましい。
【０１０２】 （補完細胞の使用） 本発明の補完細胞は、種々の目的に有用である。最も適切には、この細胞は、
検出可能なＲＣＡの非存在下における、組換え複製不能アデノウイルスベクター
（すなわち、アデノウイルス粒子）の高収量産生に使用される。
【０１０３】 （複製不能Ａｄベクターの複製およびパッケージング） 好ましい実施形態において、本発明は、導入遺伝子を含むＥ１、Ｅ２、および
／またはＥ４が欠損したＡｄベクター（集合的に「複製欠損ｒＡｄ」または「複
製不能ｒＡｄ」）の、アデノウイルス粒子（この粒子は、この導入遺伝子の宿主
細胞への送達に有用である）へのパッケージング方法を提供する。好ましい実施
形態において、複製欠損ｒＡｄベクターは、補完タンパク質（例えば、本発明の
細胞株によって供給されるようなタンパク質）の存在下で複製される場合に、感
染性アデノウイルス粒子を産生およびパッケージングするのに必要な全てのアデ
ノウイルス遺伝子を含む。本発明のこの局面における使用に好ましいベクターは
：（ａ）Ｅ１ａ配列およびＥ１ｂ配列の両方に欠損を含み、そして最も望ましく
は、これらのタンパク質をコードする配列の全てまたはほとんどが欠損されてい
る、第１世代のＡｄベクター；（ｂ）Ｅ１ａ配列、Ｅ１ｂ配列、およびＥ２ａ配
列に欠損を含む、第２世代のＡｄベクター；（ｃ）Ｅ１配列およびＥ４配列に欠
損を含み、そして最も望ましくは、これらのタンパク質をコードする配列の全て
またはほとんどが欠損されている、第３世代のＡｄベクター；ならびに（ｄ）ウ
イルス遺伝子の全てを完全に欠く、第４世代のＡｄベクターである。
【０１０４】 最小限度において、パッケージングされるＥ１欠損ベクターは、導入遺伝子お
よびｐＩＸ遺伝子またはその機能フラグメントを複製およびパッケージングする
のに必要である、アデノウイルス５’シスエレメントおよび３’シスエレメント
を含む。このベクターはさらに、宿主細胞中でのコードされる導入遺伝子産物の
発現を可能にする調節配列を含み、この調節配列は、この導入遺伝子と作動可能
に結合されている。ベクターによって保有される他の遺伝子産物（例えば、ｐＩ
Ｘ遺伝子）と作動可能に結合された調節配列がまた、ベクター中に含まれる。
【０１０５】 従って、組換え複製不能アデノウイルス粒子を産生する方法が提供され、この
方法は、以下の工程：（ａ）本発明の補完細胞株を複製不能アデノウイルスベク
ターで感染またはトランスフェクトする工程；および（ｂ）このアデノウイルス
粒子を精製する工程を包含する。上記方法によって産生された実質的に純粋なア
デノウイルス粒子の調製物を含む組成物がまた、提供される。補完エレメント／
補完細胞株および複製不能アデノウイルスベクターが任意の関連配列を含む必要
は全くないが、本発明の任意の利点は、関連配列を含まない（例えば、Ｅ１座位
において）既存のアデノウイルスベクターが、本発明の使用に適切であることで
ある。従って、特定の好ましい実施形態において、複製不能アデノウイルスベク
ターは、少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むが、このヌクレオチドは
、遺伝暗号の縮重に関して、補完エレメント／補完細胞株中の少なくとも１５個
連続するヌクレオチドに同一である。
【０１０６】 （アデノウイルスエレメント） パッケージングされる複製不能ベクターは、最小限度として、アデノウイルス
のアデノウイルスシス作用性５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（こ
れは、複製起点として作用する）ならびにネイティブな５’パッケージング／エ
ンハンサードメインを含む。直鎖Ａｄゲノムのパッケージングに必要とされる５
’および３’シスエレメントが存在し、そしてさらに、Ｅ１プロモーターに対す
るエンハンサーエレメントを含む。
【０１０７】 ウイルス粒子にパッケージングされるＥ１欠損ベクターは、このベクターがｐ
ＩＸ遺伝子産物を発現するようにさらに操作される。より適切には、このｐＩＸ
遺伝子は、インタクトであり、ネイティブなプロモーターを含みそして全長タン
パク質をコードする。ＢａｂｉｓｓおよびＶａｌｅｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：
５９８−６０５（１９９１）に従って、ネイティブなｐＩＸプロモーターは、Ａ
ｄ５ ヌクレオチド３５２５で始まり、これは、約８６ヌクレオチドがＥ１領域
と重複する（図２を参照のこと）。しかし、所望される場合、ネイティブなｐＩ
Ｘプロモーターは、別の所望のプロモーターによって置換され得る。あるいは、
ｐＩＸの機能フラグメントをコードする配列は、ベクター中での使用のために選
択される。さらに別の代替の実施形態において、ｐＩＸをコードするネイティブ
な配列またはその機能フラグメントは、発現を増強するために改変され得る。例
えば、ネイティブな配列は、例えば、部位指向型変異誘発または別の適切な技術
によって改変され得、選択された宿主細胞中での発現を増強するための最適なコ
ドンを挿入し得る。任意の所定の宿主細胞に対して使用するのに適切なコドンは
、細胞株の種に関するコドン使用頻度表（例えば、表１に示されるようなヒトコ
ドン使用頻度表（前出））の使用によって決定され得る。
【０１０８】 適切な実施形態において、Ｅ１欠損ベクター中のアデノウイルス配列は、５’
および３’シスエレメント、機能的Ｅ２およびＥ４領域、中間遺伝子ＩＸおよび
ＩＸａ、ならびにｌａｔｃ遺伝子Ｌ１〜Ｌ５を含む。しかし、Ｅ１欠損ベクター
は、当業者によって容易に操作され得；必要とされる最小配列が考慮され、そし
てこれらの例示的な実施形態に限定されない。
【０１０９】 ベクターは、導入遺伝子およびｐＩＸをコードする配列が５’ＩＴＲの下流か
つ３’ＩＴＲの上流に配置されるように構築される。この導入遺伝子は、異種ポ
リヌクレオチドであり、これは、目的のポリペプチド、タンパク質、または他の
産物をコードする。この導入遺伝子は、導入遺伝子の転写を可能にする様式で、
調節成分と作動可能に結合される。
【０１１０】 （導入遺伝子） 導入遺伝子の組成物は、得られるアデノウイルスベクターの
用途に依存する。例えば、１つの型の導入遺伝子は、レポーター遺伝子であり、
これは、発現に際して検出可能なシグナルを生じる。このようなレポーター遺伝
子としては、以下をコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定
されない：β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ
、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ)、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、およびルシフェラーゼ。目的の他の導入
遺伝子としては、膜結合タンパク質（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフ
ルエンザ赤血球凝集素タンパク質および当該分野で周知の他の膜結合タンパク質
）（これらに対する高い親和性の抗体が、存在するかまたは従来の手段によって
産生され得る）、および抗原タグドメイン（とりわけ、赤血球凝集素またはＭｙ
ｃ由来）に適切に融合された膜結合タンパク質を含む融合タンパク質が挙げられ
る。
【０１１１】 しかし、望ましくは、導入遺伝子は、生物学および医薬に有用な産物（例えば
、タンパク質、ペプチド、アンチセンス核酸（例えば、ＲＮＡ）、酵素または触
媒ＲＮＡ）をコードする非マーカー配列である。この導入遺伝子は、遺伝子欠損
を矯正または回復するために使用され得、これらの遺伝子欠損としては、正常な
遺伝子が正常レベル未満で発現される欠損、または機能的な遺伝子産物が発現さ
れない欠損が挙げられ得る。
【０１１２】 好ましい型の導入遺伝子配列は、治療タンパク質またはペプチドをコードし、
これは、宿主細胞中で発現される。適切な治療タンパク質またはペプチドとして
は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：顆粒球マクロファージコロニ
ー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロ
ファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ），コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、イン
ターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイ
キン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（
ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８
）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２
）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８
）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、イン
ターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターフェロンω（ＩＦＮω）、インターフェ
ロンτ（ＩＦＮτ）、インターフェロンγ誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、トランスフ
ォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化に際して調節され
、正常Ｔ細胞で発現されそしておそらく分泌される）、マクロファージ炎症タン
パク質（例えば、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ伸
長開始因子（ＬＥＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ増殖因子（
例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ））、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細
胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経発育因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮ
Ｆ）、ニューロトロフィン−２（ＮＴ−２）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−
３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−
５）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮ
ＴＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）およびインスリン。
【０１１３】 本発明はさらに、例えば、タンパク質の組み合わせによってかまたは複数のサ
ブユニットのタンパク質によって引き起こされた遺伝子欠損を矯正または回復す
るために、複数の導入遺伝子の使用を含む。特定の状況下では、異なる導入遺伝
子が、タンパク質の各サブユニットをコードするために、または異なるペプチド
もしくはタンパク質をコードするために、使用され得る。これは、そのタンパク
質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい場合に（例えば、免疫グロ
ブリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）またはジストロフィンタンパク質につ
いて）望ましい。細胞に複数のサブユニットのタンパク質を産生させるために、
細胞を、これらの異なるサブユニットの各々を含む別々の組換えウイルスで感染
させる。あるいは、タンパク質の異なるサブユニットは、同じ導入遺伝子にコー
ドされ得る。この場合、単一の導入遺伝子は、これらのサブユニットの全てをコ
ードするポリヌクレオチドを含み、各サブユニットのＤＮＡは、内部リボソーム
侵入部位（ＩＲＥＳ）によって離される。これは、そのサブユニットの全てをコ
ードするポリヌクレオチドが小さい（例えば、サブユニットの全ておよびＩＲＥ
Ｓをコードするポリヌクレオチドの全長が、約５ｋｂ未満である）場合に、望ま
しい。他の有用な遺伝子産物としては、天然に存在しないポリペプチド（例えば
、挿入、欠損またはアミノ酸置換を含む天然に存在しないアミノ酸配列を有する
、キメラポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチド）が挙げられる。例えば
、操作された単鎖免疫グロブリンは、特定の免疫無防備状態の患者に有用であり
得る。他の型の天然に存在しない遺伝子配列としては、アンチセンス分子および
触媒核酸（例えば、リボザイム）が挙げられ、これらは、遺伝子の過剰発現を減
少するために使用され得る。しかし、選択される導入遺伝子は、研究に望ましい
任意の産物をコードし得る。導入遺伝子配列の選択は、本発明を制限しない。
【０１１４】 （発現制御配列） アデノウイルスベクターについて上記に示した主要なエレ
メント（例えば、アデノウイルス配列および導入遺伝子）に加えて、アデノウイ
ルスベクターまたは、導入遺伝子を含む宿主細胞においてその導入遺伝子の発現
を駆動するために必要とされる、従来の制御エレメントを含む。従って、このベ
クターは、導入遺伝子に連結されそしてそのベクターのウイルス配列間で導入遺
伝子と作動可能に連結して配置される、選択されたプロモーターを含む。適切な
プロモーターは、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターから容易に選択
され得る。これらおよび他の一般的なベクターエレメントの選択は、慣用的であ
り、そして多くのこのような配列が、利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、および本明細書中に引用した参考文献を参照のこと；また、上記のベクタ
ーエレメントの一般的記載を参照のこと。
【０１１５】 構成的プロモーターの例としては、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳ
Ｖ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを含む）、サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（必要に応じて、ＣＭＶエンハンサーを
含む）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８
５））、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−
アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、
およびＥＦ１αプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プ
ロモーターは、外因的に供給された化合物によって調節され、これらには、以下
が挙げられる：亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキ
サメサゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、
Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プ
ロモーター（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：
３３４６−３３５１（１９９６））、テトラサイクリン抑制性系（Ｇｏｓｓｅｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５
１（１９９２））、テトラサイクリン誘導性系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏ
ｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２−５１８（１９９８））、ＲＵ４８
ｐＱＢＩ−ｐｇＫ−Ｅ１．１６誘導性系（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
．１５：２３９−２４３（１９９７）；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：
４３２−４４１（１９９７））およびラパマイシン誘導性系（Ｍａｇａｒｉら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５−２８７２（１９９７））。
【０１１６】 （他のＡｄベクターエレメント） 導入遺伝子および調節配列（例えば、プロ
モーター、ポリＡ配列など）に隣接するＡｄ ＩＴＲを保持するベクターは、こ
れらの成分を宿主細胞に移入する任意の形態にあり得る。このベクターに必要に
応じて存在する異種発現制御エレメントとしては、ＲＮＡ転写物の効率的なポリ
アデニル化に必要とされるシグナルを提供する配列、および機能的なスプライス
ドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロンが挙げられる。本発明に
有用なベクターに使用される一般的なポリアデニル化（ポリＡ）配列は、パポバ
ウイルスＳＶ４０またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子に由来する。このポ
リＡ配列は、一般に、導入遺伝子配列に対して３’側に挿入されてかつ導入遺伝
子配列と作動可能に連結される。本発明に有用なベクターはまた、イントロン（
望ましくは、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に位置する）
を含み、転写後のｍＲＮＡ安定性を促進し得る。１つの可能なイントロン配列は
また、ＳＶ４０に由来し、そしてＳＶ４０Ｔイントロン配列と呼ばれる。これら
および他の一般的なベクターエレメントの選択は、慣用的であり、そして多くの
このような配列が、当該分野で利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
および本明細書中（例えば、３頁１８行目〜３頁２６行目および１６頁１７行目
〜１６頁２７行目）に引用される参考文献を参照のこと。
【０１１７】 （アデノウイルス配列の同時トランスフェクション） 好ましくは、複製欠損
Ａｄベクターは、本発明のその対応する補完細胞株の感染の際のパッケージング
および複製に必要な、全ての機能的なアデノウイルス配列を含む。しかしより好
ましくは、さらに必要とされるアデノウイルス機能を供給する供給するように安
定にトランスフェクトされた本発明の細胞株を使用する。１つの実施形態におい
て、これらの機能は、その必要とされるアデノウイルス機能の発現を指向し得る
１以上の核酸分子での、Ｅ１補完細胞株の同時トランスフェクションによって供
給され得る。当業者に明らかなように、同時トランスフェクションを使用する場
合、ＲＣＡ形成は、Ａｄベクターと同時トランスフェクトプラスミドとの間の重
複する相同性を最小化することによって、減少または排除され得る。これは、コ
ドン使用の改変および／あるいは異種イントロンまたはスプライス部位の使用を
介して、そのＡｄベクター自体の相補核酸分子（これは、ベクターまたは細胞の
いずれかによって供給されない必須のＡｄ機能を供給する）および／あるいは改
変されたコドン使用または異種イントロンまたはスプライス部位のいずれかにお
いて達成され得る。
【０１１８】 例えば、Ｅ１が欠損されそして欠損性のＥ２領域を有するベクターは、必要と
されるＥ２機能（例えば、Ｅ２ａ）を発現する核酸分子（例えば、プラスミド）
で本発明のＥ１補完細胞株を一過的または安定をトランスフェクトすることによ
って、その細胞において相補され得る。別の例として、Ｅ１〜Ｅ４機能を欠くベ
クターは、機能的なＥ２、Ｅ３およびＥ４を発現する核酸分子（例えば、Ｅ４Ｏ
ＲＦ６）で本発明のＥ１補完細胞株を一過的または安定にトランスフェクトする
ことによって、その細胞において相補され得る。これらの核酸分子の構築、なら
びに安定なトランスフェクタント細胞株の単離は、当業者の範囲内である。
【０１１９】 適切には、選択された組換えベクター（上記のような）を、従来の技術（例え
ば、当該分野で公知のトランスフェクション技術（例えば、Ｋｏｚａｒｓｋｙら
、Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１９（５）：４４９−
４５８（１９９３）を参照のこと））を使用して、本発明の細胞株由来のＥ１補
完細胞に導入する。その後、組換えＥ１欠損アデノウイルスを、トランスフェク
ション後に単離および精製する。精製方法は、当業者に周知であり、そして容易
に選択され得る。例えば、ウイルスをプラーク精製に供し得、そして溶解物を密
度勾配遠心に供して精製されたウイルスを獲得し得る。
【０１２０】 （組換えアデノウイルスの増幅） 本発明の補完細胞株（またはその誘導体）
を使用して、組換えＡｄを増幅し得る。適切には、この組換えＡｄは、この方法
の使用の前に細胞細片および他のウイルス性物質から単離および精製されている
。これは、増幅されるｒＡｄが本発明の方法以外の方法によって生成される場合
に、特に望ましい。適切な精製方法（例えば、プラーク精製）は、当業者に周知
である。
【０１２１】 本発明の補完細胞株由来の細胞の培養物または好ましくは懸濁物を、従来の方
法を使用して、ｒＡｄに感染させる。適切な感染多重度（ＭＯＩ）は、容易に選
択され得る。しかし、１細胞あたり約０．１〜約１００プラーク形成単位（ｐｆ
ｕ）、約０．５〜約２０ｐｆｕ／細胞および／または約１〜約５ｐｆｕ／細胞の
範囲のＭＯＩが、望ましい。次いで、細胞を、本発明の細胞株によって発現され
るＡｄタンパク質の存在下で細胞増殖およびｒＡｄの複製を可能にする条件下で
、培養する。適切には、ウイルスを、５、１０または２０継代までの間の連続継
代に供する。しかし、所望の場合、ウイルスを、より少数またはより多数の継代
に供し得る。
【０１２２】 細胞を２〜３回の凍結融解に供し、得られた溶解物を遠心分離に供し細胞細片
を除去し、そして上清を収集する。従来の精製技術（例えば、密度勾配遠心また
はカラムクロマトグラフィー）を使用して、ｒＡｄを濃縮し、そして溶解物中の
細胞タンパク質からｒＡｄを精製する。しかし、有利には、本発明の細胞株の使
用を介する本発明の方法は、従来のプラーク生成技術のＲＣＡを混入する問題を
回避する。ＲＣＡの不在の確認は、以下に詳細に記載する方法によって決定され
る。
【０１２３】 （本発明の方法によって生成された組換えアデノウイルス粒子） 本発明に従って生成された組換えアデノウイルス粒子は、種々の使用に適切で
あり、そしてインビボでの使用に特に適切である。なぜなら、本発明は、無血清
培地中でかつ検出可能なＲＣＡの非存在下で、これらのアデノウイルスが生成さ
れるのを可能にするからである。従って、本発明に従って生成されたアデノウイ
ルスは、ＲＣＡの混入を実質的に含まない。
【０１２４】 １つの実施形態において、Ｅ１欠損ウイルスは、一過的な導入遺伝子発現が治
療的である適用（例えば、癌におけるｐ５３遺伝子移入、癌におけるβ−インタ
ーフェロン遺伝子移入、創傷治癒におけるＰＤＧＦ遺伝子移入、ならびに心臓お
よび肢の血管疾患における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子移入）に適切で
あると考えられた。しかし、このＥ１欠損アデノウイルスは、一過的な導入遺伝
子発現が望ましい場合の使用に限定されない。
【０１２５】 Ｅ１欠損アデノウイルスの適切な用量は、脊椎動物またはヒト患者の処置され
る状態、健康、年齢および体重、ならびに他の関連する要因に依存して、当業者
に容易に決定され得る。しかし、一般に、適切な用量は、約８０ｋｇの体重の成
体ヒトについて、１用量あたり約１０９〜約１０１８個のウイルス粒子、好まし
くは、１用量あたり約１０１０〜約１０１７個、約１０１１〜約１０１６個、約
１０１２〜約１０１５個、約１０１３〜約１０１４個のウイルス粒子の範囲にあ
り得る。さらにより好ましい用量としては、約８０ｋｇの体重の成体ヒトについ
て、１用量あたり約１０９個、約１０１０個、約１０１１個、約１０１２個、約
１０１３個、約１０１４個、約１０１５個、約１０１６個、約１０１７個、およ
び約１０１８個のウイルス粒子が挙げられる。この用量は、約０．００１ｍＬ〜
約１００ｍＬの生理学的に適合性のキャリア中に懸濁され得、そして任意の適切
な手段に送達され得る。適切な送達手段としては、筋内、皮下、静脈内のいずれ
かでの注射によってか；例えば、心臓もしくは肺へのカテーテル注入によってか
；または手術中の局所適用による手段が挙げられるが、これらに限定されない。
用量は、必要または所望の場合に、毎日、毎週、毎月、あるいは他の選択した間
隔で繰り返され得る。
【０１２６】 （増加した感度（１０−１０未満のＲＣＡ／ｒＡｄ ｐｆｕ）でＲＣＡを検出
するための迅速で定量的なＰＣＲベースのアッセイ） 本発明はさらに、複製不能ウイルスの産生ストックにおける複製可能ウイルス
を検出するためのアッセイを提供する。詳細には、本発明は、複製インコンピテ
ントなアデノウイルスの産生ストックにおけるＲＣＡを検出するためのアッセイ
を提供する。本発明はさらに、本発明のアッセイを利用して、複製不能ウイルス
（特に、複製インコンピテントなアデノウイルス）の産生ストックにおける、複
製可能ウイルス（特に、ＲＣＡ）を検出するための方法を提供する。このアッセ
イを行うための必要な指示書および試薬を備えるキットもまた提供する。
【０１２７】 このアッセイは、Ｅ１欠損性の複製インコンピテントのアデノウイルス（例え
ば、本明細書中に記載のような）は、Ｅ１遺伝子座のいくつかまたは全てを欠損
するという事実に基づく。Ｅ１コード遺伝子産物は、本発明の補完細胞株によっ
て提供される。従って、宿主細胞ＤＮＡから十分に精製されたウイルス調製物に
おいて、Ｅ１遺伝子座の存在は、ＲＣＡを示す。好ましい実施形態において、シ
グナル化プローブを使用するＰＣＲベースのアッセイ（このシグナルは、このＰ
ＣＲアッセイ中にリアルタイムで検出可能でありかつ定量可能である）を使用し
て、ウイルス調製物中のＥ１領域の存在を決定する。特定の好ましい実施形態に
おいて、このアッセイは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ技術（米国特許第
５，９２５，５１７号）および／またはＴａｑＭａｎＴＭ技術（米国特許第５，
５３８，８４８号）を利用して、ＰＣＲベースのアッセイ中に生成されるシグナ
ルを測定する。米国特許第５，５３８，８４８号および同第５，９２５，５１７
号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１２８】 一般に、複製不能ウイルスの大スケールの調製物を、ＤＮＡｓｅ処理に供して
宿主細胞ＤＮＡを排除するかまたは最小化し、それらのウイルス粒子を、標準的
な方法によってさらに精製し、それらのウイルス粒子を溶解し、そしてそれらの
ウイルスゲノムをＰＣＲに供する。ＤＮＡウイルスについて、標準的ＰＣＲは、
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴａｑポリメラーゼまたはＰｆｕポリメ
ラーゼ）を利用する。ＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）について、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲを使用する。これは、逆転写酵素での第１の増幅反応、および通常の
ＰＣＲでのその後の増幅反応を含む。これらの技術は、当業者に周知であり、そ
して例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出のような参考文献に見出される。
【０１２９】 ＰＣＲ反応は、アンプリコンの増幅のために使用される標準的な順方向プライ
マーおよび逆方向プライマーに加えて、そのアンプリコンを検出するための少な
くとも１つのシグナル化ハイブリダイゼーションプローブもまた含む。アンプリ
コンに対するシグナル化ハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼーシ
ョンに際して、検出可能なシグナル（好ましくは、蛍光シグナル）が放出され、
これは、このＰＣＲ反応の過程中に、リアルタイムでのアンプリコンの量の測定
を可能にする。
【０１３０】 １つの適切な実施形態は、複製不能ウイルスの産生ストックにおける複製可能
ウイルスの存在を検出するためのアッセイを提供する。これは、このウイルス産
生ストックのサンプルを、その複製可能ウイルスのゲノムの領域を増幅する順方
向プライマーおよび逆方向プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応増幅に供す
る工程であって、このゲノムの領域は、この複製不能ウイルスのゲノムからは欠
損されており、この反応は、この複製可能ウイルスの存在下で、複製可能ウイル
スに特異的な二本鎖アンプリコンを形成するように行い、これは、このサンプル
が、この複製可能ウイルスに特異的なアンプリコンの少なくとも一方の鎖に相補
的な第１のシグナル化ハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズするの
を可能にし、ここで、第１のシグナル化ハイブリダイゼーションプローブとのハ
イブリダイゼーションは、特定の条件下でかまたは特定の検出温度以下で生じ、
これによって、第１のシグナルを放出し、ここで、第１のシグナルは、複製可能
ウイルスに特異的なアンプリコンまたはこの複製可能ウイルスのゲノムへの、こ
のプローブのハイブリダイゼーションに際してのみ検出可能である、工程；およ
びこの第１のシグナルの存在または非存在を検出する工程を包含する。この第１
のシグナルは、ＰＣＲ反応の過程中でリアルタイムで検出可能であり、そしてこ
の第１のシグナルの強度は、このＰＣＲ反応中に生成された複製可能ウイルスに
特異的なアンプリコンの量と相関する。
【０１３１】 この実施形態において、複製不能ウイルスの産生ストックは、好ましくは、複
製インコンピテントなアデノウイルスストックであり、そしてこの複製可能ウイ
ルスに特異的なアンプリコンは、好ましくは、複製インコンピテントなアデノウ
イルスから欠損されている遺伝子産物から増幅される。複製可能ウイルスに特異
的なアンプリコンを増幅するための適切な領域としては、Ｅ１領域、Ｅ２領域ま
たはＥ４領域（例えば、Ｅ４ＯＲＦ６）が挙げられ、これらは、本明細書中に開
示される。好ましくは、この複製可能ウイルスに特異的なアンプリコンは、Ｅ１
領域から増幅される。
【０１３２】 上記の実施形態から当業者が容易に認識するように、本発明の補完細胞株は、
複製不能ウイルス粒子を産生するために必要な遺伝子産物をコードするポリヌク
レオチドを含み、そして、このポリヌクレオチドは（上記で議論したようにＤＮ
Ａｓｅ処理によって十分に分解されない場合）、複製可能ウイルスに特異的なア
ンプリコンを生成するために使用される順方向オリゴヌクレオチドプライマーお
よび逆方向オリゴヌクレオチドプライマーで増幅され得る。従って、本発明の好
ましいアッセイはさらに、宿主細胞ＤＮＡの存在を測定するためのコントロール
反応を提供し、この反応は、このウイルス産生ストックのサンプルを、宿主細胞
ゲノムの領域を増幅する順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応増幅に供する工程であ
って、この反応は、宿主細胞ＤＮＡの存在下で、宿主細胞に特異的な二本鎖アン
プリコンを形成するように行い、これがさらに、このサンプルが、この得られた
宿主細胞特異的二本鎖アンプリコンの少なくとも一方の鎖に相補的な第２のシグ
ナル化ハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズするのを可能にし、こ
こで、このシグナル化ハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンは、特定の条件下でかまたは特定の検出温度以下で生じ、これによって、上
記の第１のシグナルと区別可能な第２のシグナルを放出し、ここで、第２のシグ
ナルは、宿主細胞特異的アンプリコンまたは宿主細胞ＤＮＡへのハイブリダイゼ
ーションに際してのみ検出可能である、工程；および第２のシグナルの存在また
は非存在を検出する工程を包含する。第１のシグナルと同様に、第２のシグナル
は、このＰＣＲ反応中にリアルタイムで検出可能であり、そして第２のシグナル
の強度は、このＰＣＲ反応中に生成された複製可能ウイルスに特異的なアンプリ
コンの量と相関する。この第２のシグナルの存在は、宿主細胞ＤＮＡの存在を示
し、そしてこれによって、この複製可能ウイルスに特異的なアンプリコンが検出
されるこのアッセイを無効にする。
【０１３３】 細胞特異的アンプリコンは、任意の適切な細胞遺伝子から増幅され得る。適切
な細胞遺伝子は、ウイルスゲノムに見られない遺伝子である。細胞特異的アンプ
リコンを増幅するための好ましい遺伝子は、細胞ゲノム中で複数のコピーで存在
する遺伝子であり、これは、従って、より高い感度を可能にする。細胞特異的ア
ンプリコンを増幅するための好ましい遺伝子としては、β−アクチンおよびＧＡ
ＰＤＨが挙げられる。最も好ましいのは、β−アクチン遺伝子から細胞特異的ア
ンプリコンを増幅することである。
【０１３４】 特に好ましい実施形態において、複製可能ウイルスに特異的なアンプリコンお
よび細胞特異的アンプリコンの増幅は、以下に詳細に議論するような多重化と呼
ばれる技術を使用して、同じ反応チューブ中で同時に行われる。多重化は、同じ
ＰＣＲ反応中の２より多い標的配列の分析および増幅を可能にし、そしてシグナ
ル化ハイブリダイゼーションプローブの使用を介して達成され、このシグナルは
、この反応をモニターする検出装置によって識別され得る。適切な検出装置は、
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｕｍ（登録商標）７７００ Ｕｎｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓから入手可能）である。
【０１３５】 本発明の好ましいシグナル化ハイブリダイゼーションプローブは、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ（米国特許第５，９２５，５１７号；およびＴｙａｇ
ｉ，Ｓ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｆ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３
０３−３０８（１９９６）（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中
に援用される）を参照のこと）である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓは
、内部で消光される蛍光団を有するヘアピン形状の分子であり、この蛍光は、そ
れらが標的核酸に結合したときに回復されるように設計される。これらは、この
分子のループ部分が、標的核酸分子（例えば、本発明の複製可能ウイルスに特異
的なアンプリコン）に相補的なプローブ配列である。このステムは、このプロー
ブ配列の末端の相補的アーム配列のアニーリングによって形成される。蛍光部分
は、一方のアームの末端に付着し、そして消光部分が、もう一方のアームの末端
に付着される。ステムは、これらの２つの部分を互いに密接に近位して維持し、
これは、この蛍光団の蛍光がエネルギー転移によって消光されるのを生じる。こ
の消光因子部分は、非蛍光発色団であり、そしてこの蛍光団から熱として受ける
エネルギーを放出するので、このプローブは、発光し得ない。このプローブが標
的分子に衝突した時に、このプローブは、ステムよりも長くかつより安定なハイ
ブリッドを形成し、そしてその強度および長さは、このステムハイブリッドの同
時存在を妨げる。従って、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎは、自発的なコン
フォメーションの再編成を受け、これが、ステムを引き離させ、そして蛍光団と
消光因子を互いに離れさせて、これが、蛍光団の回復を導く。この蛍光は、当業
者に公知の標準的な方法によって検出され得る。
【０１３６】 従って、好ましい実施形態において、本発明の検出アッセイは、以下を利用す
る：第１のシグナル化ハイブリダイゼーションプローブ、および好ましくはさら
に第２のシグナル化ハイブリダイゼーションプローブ（これらは、本明細書中で
第１のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎおよび第２のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｅａｃｏｎとも呼ばれる）：これらの各々は、５’および３’末端を有する、複
製可能ウイルスに特異的なアンプリコンの少なくとも一方の鎖に相補的な一本鎖
ポリヌクレオチドを、その相補的ポリヌクレオチドに隣接するオリゴヌクレオチ
ドアームの対を含み、これらは、その５’末端に共有結合した５’アーム配列お
よびその３’末端に共有結合した３’アーム配列を含む。このオリゴヌクレオチ
ドアームの対は、ステム二重鎖を形成し、この二重鎖は、特定のアッセイ条件下
で特定の検出温度よりも高いが、シグナル化ハイブリダイゼーションプローブと
それぞれのアンプリコン（すなわち、複製可能ウイルスに特異的なアンプリコン
または細胞特異的アンプリコン）の相補的領域との間で形成された二重鎖の融解
温度よりも低い、融解温度を有する；および各プローブ上の、相互作用標識対：
これは、５’アーム配列に結合体化された蛍光分子および３’アーム配列に結合
体化された消光分子を含み、これらは、その５’アームと３’アームとの間のス
テム二重鎖の形成の際に、十分に密接して近位して蛍光分子からのシグナルを消
光し、ここで、この検出温度でのアッセイ条件下およびそれぞれのアンプリコン
の存在下で、このアンプリコンに対するプローブ配列のハイブリダイゼーション
は、このステム二重鎖の形成よりも優先的に生じ、これは、十分に、消光分子か
ら蛍光分子を引き離し、これによって、蛍光シグナルが検出されるのを可能にす
る。
【０１３７】 適切なアッセイ条件および検出温度は、当業者に認識されるように、融解温度
、ヌクレオチド組成、ならびに種々のプライマーおよびプローブの長さに基づい
て決定される。適切な条件のセットの１例を、以下の実施例５に開示する。
【０１３８】 好ましい実施形態において、第１のシグナル化ハイブリダイゼーションプロー
ブおよび第２のシグナル化ハイブリダイゼーションプローブは、それらの５’末
端に付着した別個の蛍光分子を含み、これは、２つの別個の蛍光シグナルが、そ
のシグナル反応チューブにおいて検出されるのを可能にする。
【０１３９】 広範に種々の蛍光分子が、本発明の使用に適切である。適切な分子としては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：６−カルボキシフルオレセイン（
６−ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２，
７、−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ
）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシ
フルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ１１０）、Ｎ，
Ｎ’−ジメチル−２’，７’−ジメチル−６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）
、ＮＥＤ、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボ
キシローダミン（ＲＯＸ）、ＶＩＣ、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−
４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）、［５
−［（３，５−ジフェニル−２Ｈ−ピロール−２−イリデン−κＮ）メチル］−
１Ｈ−ピロール−２−プロパノアト−κＮ１］ジフルオロボレート水素（ＢＯＤ
ＩＰＹ ５３０／５５０）、［Ｎ−［１−［４−［［３−［（２，３−ジヒドロ
−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−４−イル）オキシ］−２−ヒドロキ
シプロピル］アミノ］−４−メチルシクロヘキシル］−１−メチルエチル］−５
−［［５−（４−メトキシフェニル）−２Ｈ−ピロール−２−イリデン−κＮ］
メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパンアミダト−κＮ１
］ジフルオロボラン（ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ）、ジフルオロ［５−５−（２−チ
エニル）−２Ｈ−ピロール−２−イリデン−κＮ］メチル］−１Ｈ−ピロール−
２−プロパノアト−κＮ１］−ホウ酸水素（ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８）、
ジフルオロ［５−［［５−［（１Ｅ）−２−フェニルエテニル］−２Ｈ−ピロー
ル−２−イリデン−κＮ］メチル］−１Ｈ−ピロール−２−プロパノアト−κＮ
１］ホウ酸水素（ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０）、ジフルオロ［５−［［５−
（１Ｈ−ピロール−２−イル）−２Ｈ−ピロール−２−イリデン−κＮ］メチル
］−１Ｈ−ピロール−２−プロパノアト−κＮ１］ホウ酸水素（ＢＯＤＩＰＹ
５７６／５８９）、ジフルオロ［５−［［５−［（１Ｅ，３Ｅ）−４−フェニル
−１，３−ブタジエニル］−２Ｈ−ピロール−２−イリデン−κＮ］メチル］−
１Ｈ−ピロール−２−プロパノアト−κＮ１］ホウ酸水素（ＢＯＤＩＰＹ ５８
１／５９１）、ジフルオロ［６−［［［４−［２−［２−［［５−（２−チエニ
ル）−１Ｈ−ピロール−２−イル−κＮ］メチレン］−２Ｈ−ピロール−５−イ
ル−κＮ］エテニル］フェノキシ］アセチル］アミノ］ヘキサノアト］ホウ酸水
素（ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０）、１，３，６−ピレントリスルホン酸、８
−［２−［［２−［（クロロアセチル）アミノ］エチル］アミノ］−２−オキソ
エトキシ］−，三ナトリウム塩（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ）、Ｎ−［４−［［
４−（ジエチルアミノ）フェニル］［４−（エチルアミノ）−１−ナフタレニル
］メチレン］−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン］−Ｎ−エチルエタ
ンアミニウムモリブデンタングステンリン酸（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ）、２
−［５−［１−［６−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−６
−オキソヘキシル］−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−スルホ−２Ｈ
−インドール−２−イリデン］−１，３−ペンタジエニル］−１−エチル−３，
３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム内塩（Ｃｙ５）、５−［（２−
アミノエチル）アミノ］−１−ナフタレンスルホン酸（Ｅｄａｎｓ）、７−ニト
ロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、２’，７’−ジフルオ
ロフルオレセイン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８）、およびスルホローダ
ミン１０１スルホニルクロリド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）。好ましい傾向分子とし
ては、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）およびＶＩＣが挙げられる
。
【０１４０】 同様に、広範な種々の消光分子が、本発明の使用に適している。特定の消光分
子が、種々の異なる蛍光分子を消光し得ることに注意する。従って、単一消光分
子が選択されて、第１および第２のシグナル伝達プローブに組込まれ得る。適切
な消光分子としては、（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）
スクシンイミジルエステル（ＤＡＢＣＹＬ）、４−（ジメチルアミン）アゾベン
ゼンスルホン酸（ＤＡＢＳＹＬ）、１−ジメトキシトリチルオキシ−３−［Ｏ−
（Ｎ−４’−スルホニル−４−（ジメチルアミノ）−アゾベンゼン）−３−アミ
ノプロピル］−プロピル−２−Ｏ−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ
（ＤＡＢＳＹＬ−ＣＰＧ）、９−（２−（４−カルボキシピペリジン−１−スル
ホニル）−３，６−ジメチル−３，６−ジフェニル）キサンチリウム（ＱＳＹＴ Ｍ ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、およびＴＡＭＲ
Ａ−ＮＨＳ−エステルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】 好ましい消光分子としては、ＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡが挙げられる。
【０１４２】 蛍光分子および消光分子は、当業者に公知の簡単な化学プロトコールによって
既存のプローブへ結合され得る形態で市販され、そしてしばしば、製造者らによ
って供給されている。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブ中にその合成の間
に直接取り込まれ得るヌクレオチドに共有結合した特定の分子が、利用可能であ
る。
【０１４３】 適切な分子標識プローブの構築は、当業者によって十分理解される概念を使用
する。分子標識プローブの領域は、ＰＣＲアニーリング温度よりも７〜１０℃高
い融解温度を有する１５〜３３ヌクレオチド長であるべきである。このプローブ
−標的ハイブリッドの融解温度は、ＧＣパーセントの規則を使用して推測され得
、ここで、約５０またはより少ない塩基のオリゴヌクレオチドに関して、Ｔｍ＝
４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）（ここで、Ｇ＋Ｃは、その鎖の中のＧおよびＣのオ
リゴヌクレオチドの総数であり、そしてＡ＋Ｔは、その鎖の中のＡおよびＴのオ
リゴヌクレオチドの総数である）である。この推定は、アーム配列を添加する前
に、プローブ配列単独に対してなされるべきである。プローブ配列を選択した後
、２つの相補アーム配列が、プローブ配列の各側部に対して１つ添加されるべき
である。幹配列は、標的配列に相補的であるべきではない。この分子標識の幹領
域は、ＧＣ含量が７０〜８０％の５〜７ｂｐ長であるべきである。この幹の長さ
、配列およびＧＣ含量は、融解温度がＰＣＲプライマーのアニーリング温度より
も７〜１０℃高くあるように選択されるべきである。５ｂｐの幹は、５５〜６０
℃で溶解し、６ｂｐの幹は、６０〜６５℃で溶解し、そして７ｂｐの幹は、６５
〜７０℃で溶解する。Ｇヌクレオチドは、消光因子として作用し得るので、Ｇを
直接、蛍光色素に隣接させた分子標識の設計を回避することが、最良である（代
表的に、幹配列の５’末端）。
【０１４４】 分子標識ならびに順方向ＰＣＲプライマーおよび逆方向ＰＣＲプライマーの配
列は、相補性領域（これは、プライマーに結合する分子標識を引き起こし、そし
てバックグラウンドを上昇し得る）がないように設計されるべきである。分子標
識を、標的の二次構造形成が最小である領域に設計することが重要である。これ
は、鋳型が分子標識に対してよりも速く、それ自身に対して優先的にアニーリン
グすることすることを回避するのを助長する。分子標識がアンプリコン中心にか
またはアンプリコン中心付近に結合するように、この分子標識を設計することが
推奨される。上流プライマーの３’末端と分子標識（幹）の５’末端との間の距
離は、６ヌクレオチドよりも大きくあるべきである。
【０１４５】 分子標識は、ＰＣＲ反応に関して、第１のシグナル伝達プローブおよび第２の
シグナル伝達プローブの好ましい選択であると上記されるが、他のシグナル伝達
プローブが使用され得る。例えば、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ（以下により詳細
に記載される）は、第１および／または第２のシグナル伝達プローブの好ましい
選択である。他の適切なシグナル伝達プローブとしては、ＳｃｏｒｐｉｏｎｓＴ Ｍ プライマー（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：
８０４−８０７（１９９９））、ならびに、Ｌｅｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ２７：３４２−３４９（１９９９）；およびＢｒｏｗｎｉｅら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３２３５−３２４１（１９９７
）に記載されるプライマーまたはプローブが挙げられる。分子標識プローブは、
ＴａｑＭａｎＴＭプローブよりも好ましい。なぜなら、分子標識プローブは、よ
り大きなアンプリコンの使用、および反応条件に対してより良い順応性を可能に
するからである。ＴａｑＭａｎプローブは、単一コピー感度のアンプリコン検出
を可能にするが、これは、約１５０ｂｐ未満のアンプリコンに限定される。分子
標識は、（同じレベルの感度および増幅効率を達成しながら）そのサイズの制限
を被らない。
【０１４６】 本発明の検出アッセイにおいて、順方向ＰＣＲプライマーおよび逆方向ＰＣＲ
プライマーは、できるだけ大きな複製可能ウイルス特異的アンプリコンを生成す
るために選択される。最初に、より大きなアンプリコンサイズは、宿主細胞ＤＮ
ＡのＤＮＡｓｅ処理が複製不能ウイルスの精製群中の夾雑細胞ＤＮＡを十分に取
り除く可能性を増加する。なぜなら、細胞ＤＮＡ（これは複製不能なウイルス粒
子の繁殖に必要とされる相補領域のコピーを含み、ゆえに、十分に除去されない
場合は疑陽性を生じる）は、アンプリコンサイズよりも小さなサイズに分解され
る必要のみがあるからである。第２に、より大きな複製可能ウイルス特異的アン
プリコンは、疑陽性結果を得る機会（これは、複製不能ウイルスベクターＤＮＡ
と複製可能ウイルスの生成を導かない補完細胞中の相補領域との間の組換え事象
（例えば、相補領域の主要でない部分のみの組換え）の結果である）を減少する
。組換えが細胞補完ＤＮＡの一部のみを含むウイルスを生成し得るが、なおこれ
らのウイルスが複製適格ではないことは、可能であり、そしてありそうなことで
ある。このアッセイにおいて複製可能ウイルス特異的遺伝子の小さな部分のみを
標的化し、そしてこの小さな領域がこの型の組換え複製不能ウイルスに現れる場
合、疑陽性である複製可能ウイルスとしてスコア付けする。
【０１４７】 一方、分子標識は、その相補標的に結合するためにアンプリコンの反対鎖と競
合しなければならない内部プローブである。従って、より短いアンプリコンを用
いると、分子標識がその標的に対する結合をより効果的に競合することを可能に
し、故に分子標識ＰＣＲ実験の間の良好な結果を引き起こす。当業者は、最適な
結果を生成するために本発明に従うアッセイにおけるより大きなアンプリコンの
利点と、より小さなアンプリコンの利点との平衡をとることが必要であることを
理解する。最適なアンプリコンサイズの選択は、慣用的な実験のみを必要とし、
そしてこれは、当業者の能力の十分範囲内である。
【０１４８】 本発明のアッセイに使用されるアンプリコンの適切なサイズは、約５０塩基対
長〜約２０００塩基対長の範囲である。好ましいアンプリコンは、長さが、約１
００ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５０
０ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１００
０ｂｐ、約１２５０ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１７５０ｂｐまたは約２０００ｂ
ｐである。より好ましいアンプリコンは、長さが約１０００ｂｐ〜約１５００ｂ
ｐである。
【０１４９】 従って、一連の分子標識／漸増するサイズのプライマーセットが設計され、受
容可能な感度を保持する最も大きなサイズのアンプリコンを有するセットが、こ
の検出アッセイにおける使用のために選択される。ＲＣＡの検出の場合、理想の
第１の分子標識／プライマーセットは、補完細胞株に存在するＥ１ａ／Ｅ１ｂコ
ード領域の全体を増幅し、そして感度を維持するセットである。この分子標識／
プライマーの組合わせは、ＰＣＲベースのＲＣＡアッセイにおける疑陽性結果の
起こり得る数を最も低くする。
【０１５０】 特に好ましい実施形態において、ＲＣＡ特異的アンプリコンは、ＲＣＡから増
幅されるか、または順方向オリゴヌクレオチドプライマー：５’−ＧＧＴＴＴＣ
ＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＧＴ−３’（配列番号１２）および逆方向オリゴヌ
クレオチドプライマー：５’−ＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴ
−３’（配列番号１３）を用いて補完宿主細胞ＤＮＡから増幅される。最初のシ
グナル伝達ハイブリダイゼーションプローブ／分子標識は、配列：５’−ＧＣＡ
ＧＣＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＧＡＧＣＧＧＧＣＴＧＣ−３’（配列番号１
４）を有する。配列番号１４の５’末端に共有結合された蛍光分子は、６−カル
ボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）であり、配列番号１４の３’末端に共有結
合された消光因子は、４−（ジメチルアミン）アゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢ
ＳＹＬ）である。好ましい細胞特異的βアクチンアンプリコンは、オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて補完宿主細胞ＤＮＡから増幅され、そしてＳｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５７０から購入された第２のシグナル伝達ハイ
ブリダイゼーションプローブ／分子標識で検出される。
【０１５１】 本発明のＰＣＲアッセイの反応条件は、当業者が容易に理解するように、オリ
ゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの任意の特定のセットに対して最適化
されなければならない従来のＰＣＲ条件および試薬を含む。適切な試薬は、市販
される。分子標識がその相補性標的に効果的に結合する（存在する場合）アニー
リング温度、および、分子標識が幹ループコンフォメーションを採る（分子標識
が標的に結合しない場合）アニーリング温度が、選択されるべきである。
【０１５２】 本発明の１つの特に好ましい検出アッセイは、複製不能ウイルス産生ストック
中に存在する、複製可能ウイルス 対 総ウイルスの相対的な定量を提供する。
適切なアッセイは、１０９個以上の複製不能ウイルス当たり１つの複製可能ウイ
ルスの検出を可能にする。好ましくは、このアッセイは、１０１０個以上の複製
不能ウイルス当たり１つの複製可能ウイルスを検出する。より好ましくは、この
アッセイは、１０１１個、１０１２個またはより多くの複製不能ウイルス当たり
１つの複製可能ウイルスを検出する。最も好ましくは、このアッセイは、１０１ ３ 個以上の複製不能ウイルス当たり１つの複製可能ウイルスを検出する。
【０１５３】 相対的な定量を与えるために、この特に好ましい検出アッセイは、複製不能ウ
イルスのウイルス産生ストック中に存在する総ウイルス量の測定に対する、この
ウイルス産生ストック中の複製可能ウイルス量の測定を提供する。結果は、ウイ
ルス産生ストック中に存在するウイルス粒子の総数に対する、ウイルス産生スト
ック中に存在する複製可能ウイルス粒子の数としてプロットされる。
【０１５４】 従って、上記に提供される検出アッセイを組込むこの特に好ましい実施形態は
さらに、ウイルス産生ストックのサンプルを、複製可能ウイルスおよび複製不能
ウイルスの両方に共通したウイルスゲノムの領域を増幅する順方向オリゴヌクレ
オチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラ
ーゼ連鎖反応増幅に供して、その結果、ウイルス特異的二重鎖アンプリコンを形
成すること；このサンプルがウイルス特異的アンプリコンの少なくとも３分の１
に相補的である第３のシグナル伝達ハイブリダイゼーションプローブとハイブリ
ダイズすることを可能にすること（ここで、この第３のシグナル伝達ハイブリダ
イゼーションプローブを用いたハイブリダイゼーションは、特定の検出温度にお
いてかまたは特定の検出温度より下の特定の条件下で生じ、これによって第３の
シグナルを放出し、そしてここで、この第３のシグナルは、ウイルス特異的アン
プリコンまたはウイルスゲノムに対するハイブリダイゼーションの際のみに検出
可能である）；および、この第３のシグナルの存在または非存在を検出すること
を提供する。
【０１５５】 ウイルス産生ストック中のウイルス特異的アンプリコンの相対的な量は複製可
能ウイルス特異的アンプリコンまたは細胞特異的アンプリコンのいずれかの量よ
りも十分に多いので、この第３のＰＣＲ反応は、上記のＰＣＲ反応とは別々に実
行される。この反応は、上記に詳細に考察される分子標識プローブに類似した分
子標識プローブを用いて実行され得るか、またはＴａｑＭａｎＴＭプローブを用
いて実行され得る（米国特許第５，５３８，８４８に記載される（これは、その
全体が参考として本明細書中に援用される））。ＰＣＲ反応は、５’から３’の
ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて実行され、この第３のシグ
ナル伝達ハイブリダイゼーションプローブは、蛍光分子および直鎖の一本鎖コン
フォメーション中の蛍光分子の蛍光を消光する消光分子を含む。ウイルス特異的
アンプリコンを用いた第３のシグナル伝達ハイブリダイゼーションプローブのハ
イブリダイゼーションの際、核酸ポリメラーゼは、この第３のシグナル伝達ハイ
ブリダイゼーションプローブを消化し、これによって、蛍光分子を消光分子から
分離して、検出を可能にする。
【０１５６】 本実施形態中に意図されるウイルス特異的アンプリコンは、複製不能ウイルス
および複製可能ウイルスの両方に共通したウイルスゲノムの任意の適切な部分か
ら増幅され得る。Ｅ１欠損複製不能アデノウイルスの場合、ウイルス特異的アン
プリコンは、Ｅ１以外の任意のアデノウイルスゲノム領域から増幅され得る。適
切な領域としては、Ｅ４領域、Ｅ２領域、ｐＩＸ領域、およびＬ１〜Ｌ５領域の
いずれかが挙げられるが、これらに限定されない。Ｅ３領域はまた使用され得る
が、これはあまり好ましくない。なぜなら、このＥ３領域は、多くの複製不能ア
デノウイルスから欠損されているからである。ウイルス特異的アンプリコンを増
幅する好ましい領域は、Ｅ４領域である。
【０１５７】 以下の実施例は、本発明のＥ１補完細胞株の産生および検出可能なＲＣＡがな
いＥ１欠損アデノウイルスを産生する際のその使用を例示するために提供される
。これらの実施例は、本発明の範囲を限定しない。特定の試薬および条件が以下
の実施例に概説されるが、本発明の精神および範囲によって含まれるはずである
改変がなされ得ることを、当業者は理解する。
【０１５８】 （実施例） （実施例１） （（Ａ）Ｅ１補完エレメントおよびベクターｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１の構
築） ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１は、Ｅ１欠損アデノウイルスを補完し得るヌクレ
オチド配列を含むシャトルプラスミドである。ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１は、
Ａｄ５ Ｅ１ａおよびＥ１ｂタンパク質（８．３ｋＤａ Ｅ１ｂタンパク質を含
む）の全体をコードする補完エレメントを含む。この補完エレメントが天然に存
在しないヌクレオチド配列をその最３’末端（ヌクレオチド３３０９〜３６０９
の領域）に含むように、この補完エレメント設計する。この領域は、野生型Ｅ１
ｂをコードするが、相同組換えを可能にするＡｄベクター中の対応する野生型配
列と十分な相同性を含まないように、改変する。この方法において、このような
補完エレメントでトランスフェクトし、そしてＥ１欠損Ａｄを複製するために使
用される細胞株は、たとえＡｄベクターがヌクレオチド３３０９〜３６０９に広
がる領域に野生型配列を含んでいても、ＲＣＡを生成するとは予想されない。Ｅ
１配列に対してなされたこの改変を、野生型配列の下にイタリックの塩基として
図２に示し、そしてｎｔ３３０９〜３６１４の野生型配列を置換するために使用
されるヌクレオチド配列を、直下に配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１として
示す。
【０１５９】
【化１】 配列番号１のヌクレオチド１〜２０１は、Ａｄ５ Ｅ１ｂの５５ｋＤａタンパ
ク質をコードする新規配列の最後の６７コドン（終止コドンを含む）である（太
字）。
【０１６０】 ヌクレオチド２０２は、Ａｄ５の２２Ｓ Ｅ１ｂ ＲＮＡに対するスプライス
ドナーである（下線）。ヌクレオチド１〜２０１によってコードされるポリペプ
チドを配列番号２と称する。
【０１６１】 配列番号１のヌクレオチド２０３〜２９６は、改変ＳＶ４０後期領域イントロ
ンである。
【０１６２】 ヌクレオチド２９７は、Ａｄ５の２２Ｓ Ｅ１ｂ ＲＮＡに対するスプライス
アクセプターである（下線）。
【０１６３】 配列番号１のヌクレオチド２９８〜３１５は、Ａｄ５ Ｅ１ｂの８．３ｋＤａ
タンパク質をコードする新規配列の最後の６コドン（終止コドンを含む）である
（太字）。ヌクレオチド２９８〜３１５によってコードされるポリペプチドを、
配列番号３と称する。
【０１６４】 Ａｄ５の全Ｅ１座位を含むプラスミドｐＳＬ１１８０−Ｅ１は、ペンシルベニ
ア大学のＪ．Ｗｉｌｓｏｎ博士により好意により提供された。図２の３３０９と
３３２７との間に示されるサイレントな変異を、最初にポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）の使用を介して変異を含む核酸フラグメントを作製することによってｐ
ＳＬ１１８０−Ｅ１に導入し、２つのオリゴヌクレオチドプライマーセットを、
以下に示す：
【０１６５】
【化２】 。
【０１６６】 約１ｋｂの生じるＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩおよびＢｓｒＧＩを用いて消化し
、そしてｐＳＬ１１８０−Ｅ１のＢｇｌＩＩ−ＢｓｒＧＩの部位に戻してクロー
ン化した。これによって、「ｐＳＬ１１８０−Ｅ１−ＢｇｌＩＩ」と称するプラ
スミドを得る。６個の別々の合成オリゴヌクレオチド（図２に示されるさらなる
サイレントな変異およびＳＶ４０イントロンを含む）を、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０
：４６４６（１９９６）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載
される方法によって、アニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼ ＩのＫｌｅｎｏｗ
フラグメントを用いて充填し、そして連結した。これらの６つのヌクレオチドは
、以下である：
【０１６７】
【化３】 。
【０１６８】 連結されたオリゴヌクレオチドを、ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩを用いて消化し
、そしてｐＳＬ１１８０−Ｅ１−ＢｇｌＩＩのＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩ部位に
連結して、「ｐＳＬ１１８０−Ｅ１−ＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ」と称されるプラス
ミドを作製した。ｐＳＬ１１８０−Ｅ１−ＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩを、ＢｓｔＢＩ
（Ｋｌｅｎｏｗ充填された）およびＳｐｅＩを用いて消化し、配列番号１に示さ
れる改変配列を含む改変Ｅ１補完エレメントを単離する。このフラグメントを、
ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−ｄｌ（ｐＱＢＩ−ｐｇｋ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．由来）のＡｐａＩ（Ｋｌｅｎｏｗ充填された）およ
びＸｂａＩ部位に連結し、改変Ｅ１フラグメントに対してＰＧＫプロモーターを
作動可能に結合するｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１を作製する。このｐＱＢＩ−ｐ
ｇｋ−Ｅ１．１プラスミドを配列決定して、導入された改変の存在を検証する。
【０１６９】 （（Ｂ）Ｅ１補完エレメントおよびベクターｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２の構
築） ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２は、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターを補完し得
るヌクレオチド配列を含む別のシャトルプラスミドである。ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−
Ｅ１．２はまた、Ａｄ５ Ｅ１ａおよびＥ１ｂタンパク質（８．３ｋＤａ Ｅ１
ｂタンパク質を含む）の全体をコードする補完エレメントを含む。この補完エレ
メントが天然に存在しないヌクレオチド配列をその最３’末端（ヌクレオチド３
５１０〜３６０９の領域）に含むように、補完エレメントを設計する。この方法
において、このような補完エレメントでトランスフェクトされ、そしてＥ１欠損
Ａｄを複製するために使用される細胞株は、たとえＡｄベクターがヌクレオチド
３５１０〜３６０９に広がる領域に野生型配列を含んでいても、ＲＣＡを生成す
るとは予想されない。ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２においてＥ１配列に対してな
されたこの改変を、図２に四角で囲んだヌクレオチド置換として図式で示し、そ
してｎｔ３３０９〜３６１４の野生型配列を置換するために使用されるヌクレオ
チド配列を、直下に配列番号１９として示す。
【０１７０】
【化４】 配列番号１９のヌクレオチド１〜２０１は、Ａｄ５ Ｅ１ｂの５５ｋＤａタン
パク質をコードする天然に存在する配列の最後の６７コドン（終止コドンを含む
）である（二重下線）。配列番号１９のヌクレオチド１〜２０１によってコード
されるポリペプチドを、配列番号２として示す。
【０１７１】 配列番号１９のヌクレオチド２０２は、Ａｄ５の２２Ｓ Ｅ１ｂ ＲＮＡに対
するスプライスドナーである（一重下線）。
【０１７２】 配列番号１９のヌクレオチド２０３〜２９６は、改変ＳＶ４０後期領域イント
ロンである。
【０１７３】 配列番号１９のヌクレオチド２９７は、Ａｄ５の２２Ｓ Ｅ１ｂ ＲＮＡに対
するスプライスアクセプターである（一重下線）。
【０１７４】 配列番号１９のヌクレオチド２９８〜３１５は、Ａｄ５ Ｅ１ｂの８．３ｋＤ
ａタンパク質をコードする新規配列の最後の６コドン（終止コドンを含む）であ
る（太字）。配列番号１９のヌクレオチド２９８〜３１５によってコードされる
ポリペプチドを、配列番号３と称する。
【０１７５】 プラスミドｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２を、（Ａ）に使用した標準技術と類似
した技術を用いて開始プラスミドｐＳＬ１１８０−Ｅ１から調製する。このｐＱ
ＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２プラスミドを配列決定して、導入された改変の存在を検
証する。
【０１７６】 （（Ｃ）Ｅ１補完エレメントおよびベクターｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３の構
築） ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３は、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターを補完し得
るヌクレオチド配列を含むシャトルプラスミドである。ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１
．３は、Ｅ１ａおよびＥ１ｂタンパク質（８．３ｋＤａ Ｅ１ｂタンパク質を含
む）の全体をコードする補完エレメントを含む。この補完エレメントが天然に存
在しないヌクレオチド配列をその最３’末端（ヌクレオチド３３０９〜３６０９
の領域）に含むように、この補完エレメントを設計する。この領域は、この領域
が比較的少ないヌクレオチド置換（図２に下線で示される）（これは、１５ヌク
レオチド毎に約１つの置換で間隔が空いている）を含む以外、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ
−Ｅ１．１と同様に改変される。ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３においてＥ１配列
に対してなされたこの改変を、図２に図式で示し、そしてｎｔ３３０９〜３６１
４の野生型配列を置換するために使用されるヌクレオチド配列を、直下に配列番
号１８として示す。
【０１７７】
【化５】 配列番号１８のヌクレオチド１〜２０１は、Ａｄ５ Ｅ１ｂの５５ｋＤａタン
パク質をコードする新規配列の最後の６７コドン（終止コドンを含む）である（
太字）。配列番号１８のヌクレオチド１〜２０１によってコードされるポリヌク
レオチドを、配列番号２として示す。
【０１７８】 ヌクレオチド２０２は、Ａｄ５の２２Ｓ Ｅ１ｂ ＲＮＡに対するスプライス
ドナーである（下線）。
【０１７９】 配列番号１のヌクレオチド２０３〜２９６は、改変ＳＶ４０後期領域イントロ
ンである。
【０１８０】 ヌクレオチド２９７は、Ａｄ５の２２Ｓ Ｅ１ｂ ＲＮＡに対するスプライス
アクセプターである（下線）。
【０１８１】 配列番号１のヌクレオチド２９８〜３１５は、Ａｄ５ Ｅ１ｂの８．３ｋＤａ
タンパク質をコードする新規配列の最後の６コドン（終止コドンを含む）である
（太字）。ヌクレオチド２９８〜３１５によってコードされるポリペプチドを、
配列番号３として示す。
【０１８２】 プラスミドｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３を、実施例１（Ａ）に使用した標準技
術と類似した技術を用いて開始プラスミドｐＳＬ１１８０−Ｅ１から調製する。
このｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３プラスミドを配列決定して、導入された改変の
存在を検証する。
【０１８３】 （実施例２） （Ｅ１発現のためのｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．
２、およびｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３プラスミドの機能的試験） 実施例７に記載されるように生成された、プラスミドｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１
．１、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２、およびｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３が、Ｅ
１欠損アデノウイルス複製を補完し得るか否かを決定するために、製造業者の指
示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手可能）を使用してプラ
スミドＤＮＡを用いて、６ウェルプレート中のＨｅＬａ細胞の単層を、一過的に
トランスフェクトした。次いで、そのＥ１領域に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）
発現カセットを含むＥ１欠損組換えアデノウイルスを細胞に添加した（０．１ｐ
ｆｕ／細胞）。翌日、吸着していないウイルス粒子を除去するために、単層を広
範に洗浄した。トランスフェクション／感染の４８時間後に細胞を収集し、抽出
物を作製し、そして、粗製のＨｅＬａ細胞抽出物の連続希釈液を用いて、２９３
細胞（標準的なＥ１−補完細胞株）感染することによってによって、Ｅ１欠損ア
デノウイルスの存在を検出した。感染の２４時間後、２９３細胞をＧＦＰの発現
について調査し、ＧＦＰは、一過的にトランスフェクトされたプラスミド構築物
が機能的なＥ１遺伝子産物を発現する場合に限り、ＨｅＬａ細胞中で産生された
ウイルスによって合成される。このアッセイにおけるＥ１欠損Ａｄ複製の程度は
、２９３細胞を発現するＧＦＰの数に直接的に比例する。これは、補完プラスミ
ドｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２、およびｐＱＢＩ
−ｐｇｋ−Ｅ１．３、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−ｄｌ（ネガティブコントロール）でト
ランスフェクトされた細胞と、ポジティブコントロールとしてのプラスミド含有
野生型Ａｄ５ Ｅ１との間で直接的に比較され得る。
【０１８４】 ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１で一過的にトランスフェクトした細胞は、約７×
１０６の最初に一過的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞から約２×１０５の
形質導入単位を生じた；ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２で一過的にトランスフェク
トした細胞は、約７×１０６の最初に一過的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細
胞から約２×１０４の形質導入単位を生じた；およびｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．
３で一過的にトランスフェクトした細胞は、約７×１０５の最初に一過的にトラ
ンスフェクトしたＨｅＬａ細胞から約９×１０３の形質導入単位を生じた。この
結果は、３つのプラスミドの各々が、期待されたようにＥ１欠損アデノウイルス
を補完することを示す。最も大きい数の沈黙ヌクレオチド置換を有するプラスミ
ド（すなわち、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１）は、Ｅ１欠損アデノウイルスベク
ターを補完する際に最も効率的であるようである。
【０１８５】 （実施例３） （安定したＥ１補完細胞株の生成） 標的細胞株ＷＩ−３８およびＭＲＣ−５をプラスミドｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１
．１でトランスフェクトし、以下のように持続性の安定してトランスフェクトさ
れたＥ１補完細胞株を樹立した。細胞を６ｃｍのシャーレで増殖し、そして標準
的な手順を使用して１０μｇのｐＱＢＩ−ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１および１
μｇのｐＩＲＥＳ１ｎｅｏで同時トランスフェクトした（Ｗａｎｇら、１９９５
）。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクトした細胞を新しい培
地中で１：２０に分割した。培養プレートへの細胞の付着後、標準的な手順に従
って、ＷＩ−３８およびＭＲＣ−５細胞について以前に試験した最も最適な選択
濃度まで、Ｇ４１８を添加した。かなり大きいコロニーが形成されるまで、Ｇ４
１８を３〜４日毎に増殖培地中に補充した。十分に形成されたコロニーを選択し
、膨張し、そして特徴付けた。
【０１８６】 各細胞クローンをウエスタンブロット分析を使用してＥ１遺伝子産物の発現に
ついて調査した。別々に、各クローンを、上記のようにＥ１欠損Ａｄ組換え体の
増殖を補助するためのその能力について試験した。この機能的なウイルス補完ア
ッセイを２４ウェルプレート中で行ない、それらの有効性についてのすぐ後に細
胞クローンを試験した。最も高い力価のＥ１欠損アデノウイルスを生成するクロ
ーンをさらに特徴付けた。この特徴付けは、導入遺伝子コーピー数の推定を獲得
するための染色体ＤＮＡのサザンブロッティングおよび挿入されたＤＮＡの性質
を特徴付けるための詳細な制限分析（例えば、コンカテマー、多重インサートな
ど）を含む。
【０１８７】 存在する場合、Ｅ１補完細胞株におけるＥ１欠損Ａｄの継代によって産生され
たＲＣＡのレベルを決定するために、標準的なＲＣＡアッセイを記載されるよう
に行なった（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６，７０：８４５９）。手短に言うと、Ｅ
１欠損アデノウイルスの調製物を使用して非補完細胞（Ａ５４９細胞）を感染し
た。感染した細胞を約１４日間培養した。ＣＰＥの非存在下で、抽出物を感染し
た細胞から調製し、そして新鮮な細胞に継代した。細胞の培養をさらに１４日間
続けた。これらの培養物におけるアデノウイルスの増殖についての証拠は、視覚
的な検査、ウイルスプラークを探すこと、または培養物におけるより一般的なウ
イルス誘導性ＣＰＥによって評価される。この型の生物学的増幅アッセイは、Ｅ
１欠損Ａｄの約１０１０ｐｆｕにおいて約１〜３ｐｆｕのＲＣＡの感受性を有す
る。
【０１８８】 （実施例４） （複製不能アデノウイルスの産生ストックのＤＮａｓｅ処理および精製） 複製不能アデノウイルスの産生ストックを、実施例３において記載されるよう
に、Ｅ１補完細胞株において生成した。細胞を標準的なウイルス学的手順を使用
して感染させ、そして、この感染を最大の細胞変性効果まで進めた。次いで、感
染した細胞を２〜３回の凍結解凍に供し、そして、得られた溶解物を遠心分離し
て細胞残渣を除去し、そして、アデノウイルス粒子を含む上清を回収した。ウイ
ルス粒子を標準的な方法（例えば、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィーまたは
密度勾配遠心分離）によってさらに精製した。産生ストックの遠心分離を補完細
胞株に対するアッセイに関するプラークアッセイによって推定し、そして、約１
０１３ｐｆｕに等しい産生ストックのサンプルを採取して、複製コンピテントウ
イルスについてアッセイした。産生ストックの残りをさらなる処方のために凍結
する。このサンプルを約２ｍＭ Ｍｇ＋＋に調整し、そして、約５０〜約５００
０ユニット／ｍｌのＤＮＡｓｅＩを添加して、キャプシドに包まれていない、混
入細胞性ＤＮＡを分解する。ＤＮＡｓｅ消化を、約３７℃で約１〜２４時間か、
または、以下で議論されるＰＣＲ検出アッセイにおいて混入細胞性ＤＮＡがもは
や増幅可能でなくなるまでインキュベートした。ＤＮＡｓｅ消化後、試験される
サンプル中のウイルス粒子を、例えば、温和な界面活性剤を使用して溶解した。
【０１８９】 （実施例５） （複製不能アデノウイルスの産生ストックにおける複製アデノウイルスを検出
するためのＰＣＲアッセイ） 複製不能アデノウイルスの産生ストックを、実施例４に記載されるように調製
された、ウイルスＤＮＡのサンプル上の３つのパラメーターを測定することによ
って、複製成分の存在についてアッセイした。このサンプルは、１０１３コピー
を超えるアデノウイルスＤＮＡを含むと推定される。少量のアリコート（約１０ ５ コピーのＡｄ ＤＮＡを含む）を取り出して、合計のアデノウイルスＤＮＡコ
ピーを正確に測定する。ＤＮＡサンプルを、正方向プライマー５’−ＡＴＧＡＣ
ＡＣＧＣＡＴＡＣＴＣＧＧＡＧＣＴ−３’（配列番号１５）および逆方向プライ
マー５’−ＧＣＣＧＣＣＡＴＧＣＡＡＣＡＡ−３’（配列番号１６）を使用して
ＰＣＲ増幅した。これらのプライマーは、Ａｄ５完全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ
登録番号Ｍ７３２６０）のヌクレオチド３４８８４からヌクレオチド３４９９５
のＡｄ５ Ｅ４領域まで伸長するＡｄ５ Ｅ４領域の６７ｂｐフラグメントを増
幅するように設計されている。ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲ反応をＰＥ／Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＰＣＲ試薬（部品番号４０２８２３
）を使用して、そして製造業者のプロトコルに従って行なった。ＴａｑＭａｎＴ Ｍ プローブをＡｄ５ Ｅ４遺伝子について特異的となるように設計し、製造業者
の指示に従って、反応液に添加した。このプローブは、配列５’−ＴＧＣＴＡＡ
ＣＣＡＧＣＧＴＡＧＣＣＣＣＧＡＴＧＴ−３’（配列番号１７）を有し、そして
、５’末端上の蛍光分子ＶＩＣおよび３’末端上の消光分子６−カルボキシテト
ラメチルホダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識した。ＰＣＲ反応が蛍光のリアルタイム
測定を可能にするサーモサイクラー（例えば、ＰＥ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓから入手可能なＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）中で実行される。この反応は、一定期間
、蛍光強度の増加についてモニターされ、そして、結果は、標準曲線に相関する
。得られた結果を５０μｌ ＰＣＲサンプル中に存在するウイルスＤＮＡコピー
の数として表した。
【０１９０】 残りのウイルスＤＮＡサンプルを１ウェルあたり１マイクログラムで９６ウェ
ルプレートのウェル中に分配した。このアッセイの９６ウェルプレートフォーマ
ットは、大きいバッチサイズに役立つ。１０１１コピーのアデノウイルスゲノム
は、約４ミリグラムのＤＮＡであり、これは、９６ウェルプレートのたった４ウ
ェルのみを必要とするが、１０１３コピーは、容易に収容されるのに約４プレー
トを必要とする。Ｅ１およびβ−アクチン遺伝子の両方の増幅および検出は、同
時に多数の技術を使用して各ウェル中で行なわれる。各９６ウェルプレート上の
３つのさらなるウェルを１〜２コピーのＥ１含有ＤＮＡおよび１〜２コピーのア
クチン含有ＤＮＡを用いてスパイクした。これらのコントロールは、標的ＤＮＡ
が検出可能な低コピー数で試験ウェルのうちの１つに存在するか否かを保証する
。
【０１９１】 ＰＣＲおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ検出を標準的な試薬および方
法を使用して行なった。これらは、例えば、ＳｅｎｔｉｎｅｌＴＭ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ ＫｉｔおよびＳ
ｅｎｔｉｎｅｌＴＭ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ β−アクチン検出キ
ット、共にＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能（それぞれ、カタログ番号６００
５００、および２００５７０、マニュアルは、オンラインで入手可能（ｈｔｔｐ
：／／ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｍａｎｕａｌｓ／ｉｎｄｅｘ．
ｓｈｔｍ））（２０００年４月７日訪問）を提供する指導マニュアルにおいて見
出され得る。Ｅ１補完エレメントについてのＰＣＲプライマーは、正方向オリゴ
ヌクレオチドプライマー５’−ＧＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＧＴ−
３’（配列番号１２）および逆方向オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＡＣ
ＡＴＣＡＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴ−３’（配列番号１３）であり、これ
らは、完全なＡｄ５ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ７３２６０）のＥ１ａ領
域のおよそヌクレオチド８８６からＳＶ４０由来の異種イントロン内（すなわち
、配列番号１、配列番号１８、および配列番号１９のおよそヌクレオチド２６２
からおよそヌクレオチド２８３）まで伸長するＡｄ５ Ｅ１補完エレメントの領
域を増幅する。鋳型として実施例１Ａに記載されるように生成された３つの補完
エレメントのいずれかを使用して、これらのプライマーを用いるＰＣＲ増幅は、
約２．６ｋｇのアンプリコンを生成する。あるいは、正方向および逆方向プライ
マーの両方は、Ｅ１領域のヒトアデノウイルス配列に適切に由来し得る。Ｅ１
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブは、配列
【０１９２】
【化６】 を有する。配列番号１２の５’末端に共有結合する蛍光分子はＶＩＣであり、そ
して配列番号１２の３’末端に共有結合された消光因子は、４−（ジメチルアミ
ン）アゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢＳＹＬ）である。Ｅ１ｂ遺伝子に対して相
補的なＥ１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブが下線部であり、そし
てこの領域は、完全なＡｄ５ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ７３２６０）の
およそヌクレオチド２０２６からおよそヌクレオチド２０４５まで伸長するＡｄ
５遺伝子の領域にハイブリダイズする。相補的な配列の非存在下におけるハーピ
ン由来の５’および３’アームの部分を太字で示す。Ｅ１検出のためのＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎは、５’アームに共有結合したＶＩＣおよび３’アー
ムに共有結合された消光分子ＤＡＢＣＹＬを含む。β−アクチンの検出のための
ＰＣＲプライマーＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｅａｃｏｎをＳｔｒａｔａｇｅｎｅよ
り購入し、そして製造業者の指示に従って使用した。β−アクチンプローブは、
５’アームに共有結合した蛍光分子６−カルボキシフルオロセイン（６−ＦＡＭ
）および３’アームに共有結合した消光分子ＤＡＢＣＹＬを含む。
【０１９３】 増幅および検出反応を、いくつかの異なった波長（例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳ
Ｍ ７７００ユニット）で蛍光発光の同時検出および測定を可能にするサーモサ
イクラーを使用して、９６ウェルプレートフォーマット中で実行した。この反応
は、９５℃で２分の変性工程で開始し、約４０サイクルの増幅が後に続く。各工
程は、９５℃で３０秒の変性工程、約５０〜６０℃で１分間のアニーリング工程
、および７２℃で３０秒の伸長工程を有する。サーモサイクラーを設定して、各
サイクルのアニーリング／伸長工程間の蛍光を検出および報告する。結果を増幅
プロットとして示し、これは、ＰＣＲ反応中で完了したサイクル数の関数として
蛍光分子の各々の強度を測定する。
【０１９４】 Ｅ１ ＤＮＡについて検出された任意のシグナルが、最終ＤＮＡ調製物中に存
在し得る非常に少量の細胞性ＤＮＡではなく、実際にＲＣＡ由来であることを保
証するために、全体のＤＮＡサンプル中のこれらのＤＮＡ配列の各々を同時増幅
および測定することが必須である。例えば、５０μｇのウイルスＤＮＡを９６ウ
ェルプレートの５０ウェル中で上記のように試験し、そして、Ｅ１ ＤＮＡにつ
いてのシグナルをウェルの１つで検出した。シグナルが細胞性ＤＮＡではなくウ
イルス由来であることを確かめることが不可避である。これは、同じ５０μｇ（
５０ウェル）のウイルスＤＮＡ中の細胞性遺伝子、この場合はβ−アクチン、を
測定することによって達成される。
【０１９５】 ＴａｑＭａｎ Ｅ４ ＰＣＲ反応およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ増
幅／検出反応において回収されたデータを組み合わせて、１０１３複製不能アデ
ノウイルスゲノムあたりに存在する複製コンピテントなアデノウイルスの数を決
定する。このアッセイを使用するＲＣＡの存在についての基準は、βアクチンＤ
ＮＡについてのシグナル（すべてのキャプシド形成されていないＤＮＡがサンプ
ルから取り出された指標として）および標的化されたＥ１ ＤＮＡ配列のいずれ
の検出レベルも欠いている。β−アクチンおよびＥ１ ＤＮＡの両方がアッセイ
で検出される場合、アッセイは有効でなく、そしてこの分析は、複製不能アデノ
ウイルスの産生ストックの新しいサンプルに関して行なわれる必要があり、この
サンプルは、実施例４に記載されるように、さらなるＤＮＡｓｅ消化に供される
。
【０１９６】 （実施例６） （複製不能アデノウイルスの産生ストックから採取されたサンプル中のウイル
スＤＮＡについて濃縮するためのハイブリッド選択） 細胞性ＤＮＡの存在が、アッセイにおける問題を提示する場合、ハイブリッド
選択アプローチを使用して、サンプルのウイルスＤＮＡを濃縮する。ＲＣＡ由来
のＤＮＡゲノムの存在についてウイルスＤＮＡの調製物を濃縮するために、ゲノ
ムをハイブリッド選択を使用するために選択した（Ｊａｇｕｓ，Ｒ．Ｍｅｔｈ．
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５６７−５７２（１９８７））。Ｅ１遺伝子およびβ
−アクチン遺伝子を含む細菌プラスミドを膜フィルターに固定した。これらのフ
ィルターを使用して、実施例４に記載されるように調製された最終精製ウイルス
ＤＮＡゲノムサンプルをハイブリダイズした。細胞性ＤＮＡおよびＲＣＡ由来の
ＤＮＡは、フィルター上のプラスミド中のＥ１ ＤＮＡにハイブリダイズするが
、ウイルスの大多数由来のＤＮＡ（Ｅ１欠損ｒＡｄ）はハイブリダイズせず、ハ
イブリダイゼーション後に洗い落とされる。ハイブリダイズした細胞性ＤＮＡお
よびＲＣＡ由来のＤＮＡは、加熱によってフィルターから溶離され、溶離したＤ
ＮＡを回収してエタノール沈殿する。この細胞性遺伝子ハイブリッド−選択は、
偽陽性結果（すなわち、ウイルスＤＮＡではなく細胞性ＤＮＡに由来するＥ１に
ついてのシグナル）を獲得する可能性を減少する。フィルター上に固定された少
量の配列の混入を避けるために、プラスミドにクローン化されたＥ１ ＤＮＡの
フラグメントは、ＰＣＲアッセイにおいて使用されるアンプリコンよりも小さい
。従って、それは、ＰＣＲプライマーのための結合部位を含まず、それゆえ増幅
されない。
【０１９７】 （実施例７） （Ｅ１補完エレメントおよびベクターｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１、ｐＱＢＩ
−ｐｇｋ−Ｅ１．２、およびｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３の構築） 実施例１に記載されるように、シャトルプラスミドｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．
１、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２、およびｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３を以下の
方法によって構築した。
【０１９８】 （（ａ）ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２の生成） 図２に示されるように、ＳＶ４０イントロンの５’部分（すなわち、配列番号
１、配列番号１８、または配列番号１９のヌクレオチド２０２〜２４３）を以下
のようにプラスミドｐＳＬ１１８０−Ｅ１に導入した。Ｅ１遺伝子の一部および
ＳＶ４０イントロンの一部を含む核酸フラグメントをｐＳＬ１１８０−Ｅ１を鋳
型として使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を介して生成し、そし
て２つのオリゴヌクレオチドプライマーを以下に開示する：
【０１９９】
【化７】 ＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧ１をｐＳＬ１１８０−Ｅ１のＢａｍＨＩ−ＢｓｒＧ
Ｉ部位へクローン化した。得られたプラスミドをｐＳＬ１１８０−Ｅ１−Ｂａｍ
ＨＩ（＃９９）と命名した。次いで、プラスミドｐＳＬ１１８０−Ｅ１−Ｂａｍ
ＨＩをＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、Ｅ１遺伝子の上流部分の約２．３ｋｂを
除いた。Ｅ１フラグメントの始めに位置する上流ＳａｌＩ部位を除去するために
、残りのプラスミドを再び連結して、ｐＳＬ１１８０−Ｅ１−ＢａｍＨＩ−ｄｌ
（＃１０４）を得た。
【０２００】 ＢａｍＨＩ部位の下流のＳＶ４０イントロンの一部および沈黙突然変異を有す
る８ｋＤ Ｅ１ｂタンパク質の最後の６コドン（終止コドンを含む）（すなわち
、配列番号１９のヌクレオチド２４４〜３１５）を以下のようにｐＳＬ１１８０
−Ｅ１−ＢａｍＨＩ−ｄｌに導入した。以下の相補的なオリゴヌクレオチドをア
ニールした：
【０２０１】
【化８】 これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、５’末端のＢａｍＨＩ突出末
端および３’末端のＳａｌＩ突出末端を生じた。ｐＳＬ１１８０−Ｅ１−Ｂａｍ
ＨＩ−ｄｌ（＃１０４）をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩによって消化し、そして、
アニールしたオリゴヌクレオチドと連結してｐＳＬ１１８０−Ｅ１−ＢａｍＨＩ
−ｄｌ−ＳａｌＩ（＃１０６）を作製した。配列分析は、配列が正確であったこ
とを示した。
【０２０２】 次いで、プラスミドｐＳＬ１１８０−Ｅ１−ＢａｍＨＩ−ｄｌ−ＳａｌＩ（＃
１０６）をＨｉｎｄＩＩＩで消化して、そしてｐＳＬ１１８０−Ｅ１由来の約２
．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと連結して、全Ｅ１フラグメントを再構
築した。この操作は、ｐＳＬ１１８０−Ｅ１−ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ（＃１０９
）を生じた。
【０２０３】 プラスミドｐＱＢＩ−ｐｇｋ−ｄｌは、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ（Ｑｕａｎｔｕｍ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）に由来し、ＰｓｔＩ
を用いる消化およびセルフライゲーションによって、Ａｄ ＴＰＬ、ＧＦＰ、お
よびＮｅｏ遺伝子を取り出し、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−ｄｌ（＃１０７）を得た。
【０２０４】 プラスミドｐＱＢＩ−ｐｇｋ−ｄｌ（＃１０７）をＢｇｌＩＩによって消化し
、Ｋｌｅｎｏｗを用いる充填反応が続き、次いで、ＸｈｏＩで消化してｐｇｋプ
ロモーターを含む約５７０ｂｐのフラグメントを得た。次いで、このフラグメン
トをＳｐｅＩで消化したｐＳＬ１１８０−Ｅ１−ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ（＃１０
９）に連結し、Ｋｌｅｎｏｗで充填し、次いでＸｈｏＩで消化し、ｐＱＢＩ−ｐ
ｇｋ−Ｅ１．２−ｄｌｐＡ（＃１１６）を作製した。
【０２０５】 次いで、プラスミドｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２−ｄｌｐＡ（＃１１６）をＢ
ｓｒＧＩおよびＳａｌＩによって消化し、上記のようにＰＣＲ増幅されたＥ１遺
伝子の一部、ＳＶ４０イントロン、および沈黙突然変異を有する８ｋＤのＥ１ｂ
タンパク質の最後の６コドン（終止コドンを含む）を含む約１３７７ｂｐのフラ
グメントを獲得した。ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２−ｄｌｐＡ（＃１１６）の第
２のサンプルをＢｓｔＢＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗを用いる充填反応に供し、次
いで、ＢｓｒＧＩで消化し、約５４５９ｂｐのプラスミド骨格フラグメントを得
た。プラスミドｐＱＢＩ−ｐｇｋ−ｄｌ（＃１０７）をＸｈｏＩおよびＰｖｕＩ
Ｉで消化して、ＢＧＨポリアデニル化配列を獲得した。これらの３つのフラグメ
ントを連結して、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２（＃１２１）（Ｅ１．２の最終構
築物）を作製した。図２に示されるＢｇｌＩＩ部位の前の約１９ヌクレオチドか
ら伸長し、そして図２に示される配列の末端まで伸長するｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ
１．２の領域を配列番号１９として本明細書中に記載する。
【０２０６】 （（ｂ）ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−１．１の生成） 配列番号１のおよそヌクレオチド２０からおよそヌクレオチド２４３まで伸長
する沈黙突然変異を取り込む核酸分子を３つの重複する組の相補的なヌクレオチ
ドをアニーリングすることによって作製した。オリゴヌクレオチド対は以下のよ
うである：
【０２０７】
【化９】 アニールした核酸分子を、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミド
ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２（＃１２１）に連結し、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．
１−オリゴ（＃１２２）を作製した。
【０２０８】 図２の最初の１８ヌクレオチド（すなわち、配列番号１のヌクレオチド１〜１
８）に示される沈黙突然変異を、鋳型としてのｐＳＬ１１８０−Ｅ１および以下
に示される２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）の使用を介して突然変異を含む核酸フラグメント生成することによ
って、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１−オリゴ（＃１２２）に導入した：
【０２０９】
【化１０】 約１ｋｂの得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＢｓｒＧＩで消化して、そ
してｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１−オリゴ（＃１２２）のＢｇｌＩＩＩ−Ｂｓｒ
ＧＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドをｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１
（＃１２３）（Ｅ１．１の最終構築物）と命名した。図２に示されるＢｇｌＩＩ
部位の前の約１９ヌクレオチドから伸長して、そして図２に示される配列の末端
まで伸張するｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１の領域を、配列番号１として本明細書
中に記載する。
【０２１０】 （（ｃ）ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３の生成） 図２の最初の１８ヌクレオチド（すなわち、配列番号１８のヌクレオチド１
５）に示される単一の下線部の沈黙突然変異を、鋳型としてのｐＳＬ１１８０−
Ｅ１および以下に示される２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を介して突然変異を含む核酸フラグメント生
成することによって、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１−オリゴ（＃１２２）に導入
した：
【０２１１】
【化１１】 約１ｋｂの得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＢｓｒＧＩで消化して、そ
してｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．１−オリゴ（＃１２２）のＢｇｌＩＩＩ−Ｂｓｒ
ＧＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドをｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３
（＃１２５）と命名した。
【０２１２】 配列番号１８のおよそヌクレオチド２０からおよそヌクレオチド２７８まで伸
長する沈黙突然変異を取り込む核酸分子を、相補的なヌクレオチドの４つの重複
する組をアニーリングすることによって作製した。 オリゴヌクレオチドプライマー対は以下のようである：
【０２１３】
【化１２】 アニールした核酸分子を、ＢｇｌＩＩおよびＡｐａＩで消化したｐＱＢＩ−ｐ
ｇｋ−Ｅ１．３（＃１２５）に連結し、ｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３（＃１２７
）（Ｅ１．３の最終構築物）を作製した。図２に示されるＢｇｌＩＩの前の約１
９ヌクレオチドから伸長し、そして図２に示される配列の末端まで伸長するｐＱ
ＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３の領域を配列番号１８として本明細書中に記載する。
【０２１４】 Ｅ１構築物の３つ全ての型は、ＰＣＲ増幅およびオリゴ修飾領域を検証するた
めに配列決定される。
【０２１５】 この明細書中に引用されるすべての刊行物は、本明細書中に参考として援用さ
れる。本発明は、特定の好ましい実施形態に参照して記載されるが、本発明の精
神から逸脱することなく改変が行なわれ得ることが理解される。このような改変
は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、実施例１の方法により作製される、改変されたＥ１補完エレメントの
概略図である。第１列目（Ｗｔ Ａｄ５）は、野生型（ｗｔ）の５型アデノウイ
ルス（Ａｄ５）のＤＮＡにおけるＥ１領域の位置を示す。第２列目（Ｗｔ Ｅ１
領域）は野生型Ｅ１およｐＩＸ遺伝子の拡大であり、Ｅ１ａおよｐＩＸタンパク
質それぞれの翻訳開始および終止に対応するｎｔ数を示す。第３列目は、第２列
目の野生型Ｅ１に合わせて並べた、改変されたＥ１補完エレメントの概略図であ
る。異種構成性プロモーター（例えば、ＰＧＫ）は「ｐｍ」と示され、そしてポ
リアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンまたはＳＶ４０由来のもの）
は「ｐＡ」と示される。補完エレメント中のＥ１ｂコード配列の３’末端にある
ｎｔ３３１１と３６０９との間の黒塗りの領域は、ベクターのＥ１配列と補完細
胞株のＥ１配列との間の相同組換えを防ぐために設計された静的な変異を表す。
第４列目は、実施例のようなヒトβ−インターフェロンを発現するＥ１欠損Ａｄ
５ベクターの概略を示す。この概略図から見られ得るように、癌に罹患したヒト
患者における安全性試験が現在行なわれているこのベクターは、Ｅ１ｂ遺伝子の
３’部分から長い伸長配列を含む。
【図２】 図２は、実施例１および実施例７に従い構築された補完エレメントのｎｔ３３
０９−３６１４由来のヌクレオチド配列を示す。野生型Ａｄ５ ＤＮＡ配列は三
塩基コドンで示す。アミノ酸の一文字表記は、各野生型コドンの最初のｎｔのす
ぐ上に示される。実施例１（Ａ）および実施例７に基く補完エレメントｐＱＢＩ
−ｐｇｋ−Ｅ１．１に導入される静的なヌクレオチド置換は、野生型Ａｄ５配列
の置き換えられるヌクレオチドのすぐ下に、イタリック文字で示される（この補
完エレメントは、下線を引いたものおよび文字を囲んだものを含む、野生型配列
の下に示すすべての置換を含む）。実施例１（Ｂ）および実施例７に基く補完エ
レメントｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．２に導入される静的なヌクレオチド置換は、
野生型Ａｄ５ヌクレオチドから得た配列において置き換えられるヌクレオチドの
すぐ下に、四角で囲まれたイタリック文字で示される。実施例１（Ｃ）および実
施例７に基く補完エレメントｐＱＢＩ−ｐｇｋ−Ｅ１．３に導入される静的なヌ
クレオチド置換は、野生型Ａｄ５ヌクレオチドから得た配列において置き帰られ
るヌクレオチドのすぐ下に、下線を引いたイタリック文字で示される。野生型Ｅ
１ｂイントロンの境界線は下向きの矢印で示される。ＳＤと印をつけられた矢印
はスプライスドナー部位であり、そしてＳＡと印をつけられた矢印はスプライス
アクセプター部位である。イントロン内の太文字はｐＩＸプロモーター内のＴＡ
ＴＡ ｂｏｘを表す。実施例１および実施例７に示されるように、イントロンの
下のイタリック文字の配列は、３つの補完エレメントそれぞれにおいて野生型Ｅ
１ｂイントロンを置き換えるために用いられるＳＶ４０後期領域イントロンの配
列である。アスタリスクは、５５−かまたは８．３ｋＤａのＥ１ｂタンパク質の
いずれかの翻訳終止コドンを表す。ＢｇｌＩＩは野生型Ａｄ５の制限酵素部位を
表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｌ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/569 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ペルーソ， リチャード ダブリュー． アメリカ合衆国 ニュージャージー 08052， メープル シェイド， アダム ス ドライブ １ ビー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA32 CA04 CA09 DA02 EA02 EA04 GA11 HA08 HA09 HA11 4B063 QA01 QA08 QA17 QQ10 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR50 QR62 QR66 QR79 QS03 QS25 QS36 QX02 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93X AA95X AA95Y AB01 AC20 BA16 BA30 CA44

Claims (74)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 天然に存在するアデノウイルスポリペプチドの少なくとも５
    つの連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分
    子であって、ここで、該ポリヌクレオチドの配列は、天然に存在するアデノウイ
    ルスヌクレオチド配列ではない、核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記アデノウイルスポリペプチドが、アデノウイルス複製に
    必須である、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、Ｅ１ポリペプチドの少なくとも５
    つの連続するアミノ酸をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、約８．３ｋＤａのＥ１ｂポリペプ
    チドの少なくとも５つの末端アミノ酸をコードする、請求項３に記載の核酸分子
    。
  5. 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドの前記配列が、以下： （ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜１９８ （ｂ）配列番号１のヌクレオチド２９８〜３１２ （ｃ）配列番号１のヌクレオチド１〜３１５ （ｄ）配列番号１８のヌクレオチド１〜１９８ （ｅ）配列番号１８のヌクレオチド２９８〜３１２ （ｆ）配列番号１８のヌクレオチド１〜３１５ （ｇ）配列番号１９のヌクレオチド２９８〜３１２；および （ｈ）配列番号１９のヌクレオチド１〜３１５。 からなる群から選択される、請求項３に記載の核酸分子
  6. 【請求項６】 前記ポリヌクレオチド（ａ）の配列である、請求項５に記載
    の核酸分子。
  7. 【請求項７】 前記ポリヌクレオチド（ｂ）の配列である、請求項５に記載
    の核酸分子。
  8. 【請求項８】 前記ポリヌクレオチド（ｃ）の配列である、請求項５に記載
    の核酸分子。
  9. 【請求項９】 前記ポリヌクレオチド（ｄ）の配列である、請求項５に記載
    の核酸分子。
  10. 【請求項１０】 前記ポリヌクレオチド（ｅ）の配列である、請求項５に記
    載の核酸分子。
  11. 【請求項１１】 前記ポリヌクレオチド（ｆ）の配列である、請求項５に記
    載の核酸分子。
  12. 【請求項１２】 前記ポリヌクレオチド（ｇ）の配列である、請求項５に記
    載の核酸分子。
  13. 【請求項１３】 前記ポリヌクレオチド（ｈ）の配列である、請求項５に記
    載の核酸分子。
  14. 【請求項１４】 前記ポリヌクレオチドの配列が、天然に存在するアデノウ
    イルスヌクレオチド配列と９７％未満であるが、約６０％を超えて同一である、
    請求項１に記載の核酸分子。
  15. 【請求項１５】 前記ポリヌクレオチドの配列が、天然に存在するＡｄ５ヌ
    クレオチド配列と９０％未満同一である、請求項１５に記載の核酸分子。
  16. 【請求項１６】 前記ポリヌクレオチドの配列が、配列番号２０のヌクレオ
    チド１〜１９８と９７％未満であるが、約６０％を越えて同一である、請求項１
    ４に記載の核酸分子。
  17. 【請求項１７】 前記ポリヌクレオチドの配列が、配列番号２０のヌクレオ
    チド２８７〜３０１と９７％未満であるが、約６０％を越えて同一である、請求
    項１４に記載の核酸分子。
  18. 【請求項１８】 前記ポリヌクレオチドの配列が、配列番号２０のヌクレオ
    チド１〜１９８と９０％未満同一である、請求項１６に記載の核酸分子。
  19. 【請求項１９】 前記ポリヌクレオチドの配列が、配列番号２０のヌクレオ
    チド２８７〜３０１と９０％未満同一である、請求項１７に記載の核酸分子。
  20. 【請求項２０】 前記ポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で天
    然に存在するアデノウイルスポリヌクレオチドとハイブリダイズしない、請求項
    １に記載の核酸分子。
  21. 【請求項２１】 前記天然に存在するアデノウイルスポリヌクレオチドが配
    列番号２０である、請求項２０に記載の核酸分子。
  22. 【請求項２２】 請求項１に記載の核酸分子を含む、補完エレメント。
  23. 【請求項２３】 プロモーターをさらに含む、請求項２２に記載の補完エレ
    メント。
  24. 【請求項２４】 前記核酸分子が、アデノウイルスのＥ１遺伝子座の全ての
    タンパク質コード領域を含む、請求項２２に記載の補完エレメント。
  25. 【請求項２５】 Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、およびＥ４タンパク質
    からなる群から選択される必須アデノウイルスタンパク質をコードする、請求項
    １に記載の核酸分子を含む、補完エレメント。
  26. 【請求項２６】 請求項２２に記載の補完エレメントを含む、複製不能アデ
    ノウイルスの複製を補完し得る細胞。
  27. 【請求項２７】 請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  28. 【請求項２８】 請求項２７に記載のベクターを用いて、細胞を、安定に形
    質転換する工程またはトランスフェクトする工程を包含する、宿主細胞を作製す
    る方法。
  29. 【請求項２９】 アデノウイルスベクターを産生する系であり、ここで： 請求項２６に記載の細胞；および 複製不能アデノウイルスベクターを含む、系。
  30. 【請求項３０】 複製不能ウイルスの産生ストックにおける複製可能ウイル
    スの存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイは： （ａ）該複製不能ウイルスのゲノムから欠損される複製可能ウイルスのゲノム
    の領域を増幅する、順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌ
    クレオチドプライマーを使用して、該産生ストックのサンプルを、ポリメラーゼ
    連鎖反応増幅に供し、その結果、該複製可能ウイルスの存在下で、複製可能なウ
    イルス特異的二本鎖アンプリコンが形成される、工程； （ｂ）前記サンプルを、該複製可能ウイルス特異的アンプリコンの少なくとも
    １つの鎖に相補的な、第１シグナルハイブリダイゼーションプローブとハイブリ
    ダイズさせる工程であって、ここで、該第１シグナルハイブリダイゼーションプ
    ローブとのハイブリダイゼーションは、特定の条件下、特定の検出温度、または
    特定の検出温度以下で生じ、それによって第１シグナルを放出する過程であり、
    ここで、該第１シグナルは、該複製可能ウイルス特異的二重鎖アンプリコンまた
    は該複製可能ウイルスのゲノムに対する該第１シグナルハイブリダイゼーション
    プローブのハイブリダイゼーションの際にのみ検出される、工程；および （ｃ）該第１シグナルの存在または非存在を検出する、工程 を包含する、アッセイ。
  31. 【請求項３１】 請求項３０に記載のアッセイであって、前記第１シグナル
    ハイブリダイゼーションプローブが以下： （ａ）５’末端および３’末端を有する、前記複製可能なウイルス特異的アン
    プリコンの少なくとも１つの鎖に相補的な単鎖ポリヌクレオチド； （ｂ）該相補的なポリヌクレオチドに隣接する、該５’末端に共有結合する５
    ’アーム配列および該３’末端に共有結合する３’アーム配列からなるオリゴヌ
    クレオチドアーム配列対であって、該オリゴヌクレオチドアーム配列対は幹二重
    鎖を形成し、該幹二重鎖は前記アッセイ条件下で前記検出温度より高いが、該第
    １シグナルハイブリダイゼーションプローブと該複製可能ウイルス特異的アンプ
    リコンの相補性領域との間で形成された二重鎖の融解温度よりも低い融解温度を
    有する、オリゴヌクレオチドアーム配列対；ならびに （ｃ）該５’アーム配列に結合する第１蛍光分子および、該５’アーム配列と
    該３’アーム配列の間の幹二重鎖の形成の際に、該第１蛍光分子からシグナルを
    消光するのに十分に近い近位にある該３’アーム配列に結合する、第１消光分子
    を含む第１相互作用標識対であり、ここで、該アッセイ条件下、前記検出温度で
    、および該複製可能なウイルス特異的アンプリコンの存在において、該複製可能
    ウイルス特異的アンプリコンに対する該プローブ配列のハイブリダイゼーション
    は、該幹二重鎖の該形成に優先して、該第１消光分子から該蛍光分子が十分に分
    離し、それにより第１蛍光分子シグナルの検出を可能にする、第１相互作用標識
    対、 を含む、アッセイ。
  32. 【請求項３２】 前記第１蛍光分子が、６−カルボキシフルオレセイン（６
    −ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２，７
    −ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、
    ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフル
    オレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ１１０）、Ｎ，Ｎ’
    −ジエチル−２’，７’−ジメチル−６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ
    ＥＤ、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ
    ローダミン（ＲＯＸ）、およびＶＩＣからなる群から選択される、請求項３１に
    記載のアッセイ。
  33. 【請求項３３】 前記蛍光分子が６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡ
    Ｍ）である、請求項３２に記載のアッセイ。
  34. 【請求項３４】 前記第１消光分子が、（４−（４’−ジメチルアミノフェ
    ニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエステル（ＤＡＢＣＹＬ）、４−（ジメ
    チルアミン）アゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢＳＹＬ）、１−ジメトキシトリチ
    ルオキシ−３−［Ｏ−（Ｎ−４’−スルホニル−４−（ジメチルアミノ）−アゾ
    ベンゼン）−３−アミノプロピル］−プロピル−２−Ｏ−スクシノイル−長鎖ア
    ルキルアミノ−ＣＰＧ（ＤＡＢＳＹＬ−ＣＰＧ）、９−（２−（４−カルボキシ
    ピペリジン−１−スルホニル）−３，６−ジメチル−３，６−ジフェニル）キサ
    ンチリウム（ＱＳＹＴＭ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲ
    Ａ）、およびＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ−エステルからなる群から選択される、請求項
    ３１に記載のアッセイ。
  35. 【請求項３５】 前記第１蛍光分子が、６−カルボキシフルオレセイン（６
    −ＦＡＭ）であり、そして前記第１消光因子が（４−４’−ジメチルアミノフェ
    ニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエステル（ＤＡＢＣＹＬ）である、請求
    項３１に記載のアッセイ。
  36. 【請求項３６】 前記複製可能なウイルス特異的アンプリコンが、少なくと
    も１５０塩基対を含む、請求項３０に記載のアッセイ。
  37. 【請求項３７】 前記複製可能なウイルス特異的アンプリコンが、少なくと
    も１０００塩基対を含む、請求項３６に記載のアッセイ。
  38. 【請求項３８】 前記複製可能なウイルス特異的アンプリコンが、少なくと
    も１５００塩基対を含む、請求項３７に記載のアッセイ。
  39. 【請求項３９】 複製可能なウイルスを、１×１０９個の複製不能ウイルス
    粒子当たり１つの複製可能なウイルス粒子の感度で検出する、請求項３０に記載
    のアッセイ。
  40. 【請求項４０】 複製可能なウイルスを、１×１０１１個の複製不能ウイル
    ス粒子当たり１つの複製可能なウイルス粒子の感度で検出する、請求項３９に記
    載のアッセイ。
  41. 【請求項４１】 複製可能なウイルスを、１×１０１３個の複製不能ウイル
    ス粒子当たり１つの複製可能なウイルス粒子の感度で検出する、請求項４０に記
    載のアッセイ。
  42. 【請求項４２】 前記複製可能なウイルスが複製可能なアデノウイルスであ
    り、そして前記複製不能ウイルスが複製不能なアデノウイルスである、請求項３
    ０に記載のアッセイ。
  43. 【請求項４３】 前記複製不能なアデノウイルスがＥ１領域に欠損を含み、
    そして前記複製可能なウイルス特異的アンプリコンが該複製可能なアデノウイル
    スの該Ｅ１領域から増幅される、請求項４２に記載のアッセイ。
  44. 【請求項４４】 前記複製可能なウイルス特異的アンプリコンがアデノウイ
    ルスＥ１領域を含む、請求項４３に記載のアッセイ。
  45. 【請求項４５】 請求項３０に記載のアッセイであって、ここで （ａ）前記産生ストックのサンプルを、宿主細胞ゲノムの領域を増幅する順方
    向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを
    使用するポリメラーゼ連鎖反応増幅に供し、それにより、宿主細胞ＤＮＡの存在
    において、宿主細胞特異的二重鎖アンプリコンが形成される、工程； （ｂ）前記サンプルを、少なくとも該宿主細胞特異的二重鎖アンプリコンの一
    方の鎖に相補的な第２シグナルハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイ
    ズさせる工程であって、ここで、該シグナルハイブリダイゼーションプローブと
    のハイブリダイゼーションは、特定の条件下、特定の検出温度以下で起こり、そ
    れによって前記第１シグナルから識別可能な第２シグナルを放出し、ここで、該
    第２シグナルは、該宿主細胞特異的アンプリコンに対するハイブリダイゼーショ
    ンの際に、または該宿主細胞ＤＮＡ上でのみ検出される工程；ならびに （ｃ）該第２シグナルの存在または非存在を検出する工程 をさらに包含する、アッセイ。
  46. 【請求項４６】 請求項４５に記載のアッセイであり、ここで前記第２シグ
    ナルハイブリダイゼーションプローブは： （ａ）５’末端および３’末端を有する、前記宿主細胞特異的アンプリコンの
    少なくとも一方の鎖に相補的な単鎖ポリヌクレオチド； （ｂ）該相補的なポリヌクレオチドに隣接し、該５’末端に共有結合する５’
    アーム配列および該３’末端に共有結合する３’アーム配列からなるオリゴヌク
    レオチドアーム配列対であって、該オリゴヌクレオチドアーム配列対は、長さ約
    ３〜２５ヌクレオチドの幹二重鎖を形成し、該幹二重鎖は、前記アッセイ条件下
    で前記検出温度より高いが、該第２シグナルハイブリダイゼーションプローブと
    該宿主細胞特異的アンプリコンの相補性領域との間で形成された二重鎖の融解温
    度よりも低い融解温度を有する、オリゴヌクレオチドアーム配列対；ならびに （ｃ）該５’アーム配列に結合する第２蛍光分子であって、ここで、該第２蛍
    光分子のシグナルは前記第１蛍光分子のシグナルとは異なる、第２蛍光分子、お
    よび該５’アーム配列と該３’アーム配列との間の幹二重鎖形成の際に、該第２
    蛍光分子からの該シグナルを消光するのに十分に近い近位にある該３’アーム配
    列に結合する、第２消光分子を含む第２相互作用標識対であって、ここで、該ア
    ッセイ条件下、前記検出温度で、および該宿主細胞特異的アンプリコンの存在下
    において、該宿主細胞特異的アンプリコンに対する該プローブ配列のハイブリダ
    イゼーションは、該幹二重鎖の該形成に優先して、該第２消光分子から該蛍光分
    子が十分に分離し、それにより第２蛍光分子シグナルの検出を可能にする、第２
    相互作用標識対、 を含む、アッセイ。
  47. 【請求項４７】 前記ポリメラーゼ鎖反応増幅が１回の反応で同時に実行さ
    れる、請求項４６に記載のアッセイ。
  48. 【請求項４８】 前記第２蛍光分子が、６−カルボキシフルオレセイン（６
    −ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２，７
    ，−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）
    、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフ
    ルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ１１０）、Ｎ，Ｎ
    ’−ジエチル−２’，７’−ジメチル−６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、
    ＮＥＤ、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキ
    シローダミン（ＲＯＸ）、およびＶＩＣからなる群から選択される、請求項４６
    に記載のアッセイ。
  49. 【請求項４９】 前記第２蛍光分子が、ＶＩＣである、請求項４８に記載の
    アッセイ。
  50. 【請求項５０】 前記第２消光因子が、（４−（４’−ジメチルアミノフェ
    ニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエステル（ＤＡＢＣＹＬ）、４−（ジメ
    チルアミン）アゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢＳＹＬ）、１−ジメトキシトリチ
    ルオキシ−３−［Ｏ−（Ｎ−４’−スルホニル−４−（ジメチルアミノ）−アゾ
    ベンゼン）−３−アミノプロピル］−プロピル−２−Ｏ−スクシノイル−長鎖ア
    ルキルアミノ−ＣＰＧ（ＤＡＢＳＹＬ−ＣＰＧ）、９−（２−（４−カルボキシ
    ピペリジン−１−スルホニル）−３，６−ジメチル−３，６−ジフェニル）キサ
    ンチリウム（ＱＳＹＴＭ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲ
    Ａ）、およびＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ−エステルからなる群から選択される、請求項
    ４６に記載のアッセイ。
  51. 【請求項５１】 前記第２蛍光分子がＶＩＣであり、そして前記第２消光因
    子が（４−４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエ
    ステル（ＤＡＢＣＹＬ）である、請求項５０に記載のアッセイ。
  52. 【請求項５２】 前記宿主細胞特異的アンプリコンが、少なくとも１５０塩
    基対を含む、請求項４５に記載のアッセイ。
  53. 【請求項５３】 前記宿主細胞特異的アンプリコンが、少なくとも１０００
    塩基対を含む、請求項５２に記載のアッセイ。
  54. 【請求項５４】 前記宿主細胞特異的アンプリコンが、少なくとも１５００
    塩基対を含む、請求項５３に記載のアッセイ。
  55. 【請求項５５】 前記宿主細胞特異的アンプリコンが、β−アクチンおよび
    ＧＡＰＤＨからなる群から選択される遺伝子を増幅する、請求項４５に記載のア
    ッセイ。
  56. 【請求項５６】 前記宿主細胞特異的アンプリコンが、β−アクチン遺伝子
    を増幅する、請求項５５に記載のアッセイ。
  57. 【請求項５７】 請求項４５に記載のアッセイであって： （ａ）前記産物ストックのサンプルを、複製可能ウイルスと複製不能ウイルス
    の両方に共通の領域を増幅する順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方
    向オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応増幅に供し、
    それにより、ウイルス特異的二重鎖アンプリコンが形成される、工程； （ｂ）前記サンプルを、該ウイルス特異的アンプリコンの少なくとも一方の鎖
    に相補的な第３シグナルハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズさせ
    る工程であって、ここで、該第３シグナルハイブリダイゼーションプローブとの
    ハイブリダイゼーションは、特定の条件下、特定の検出温度以下で起こり、それ
    によって第３シグナルを放出し、ここで、該第３シグナルは、該ウイルス特異的
    アンプリコンに対するハイブリダイゼーションの際、または該ウイルスゲノム上
    でのみ検出される工程；ならびに （ｃ）該第３シグナルの存在または非存在を検出する工程、 をさらに包含する、アッセイ。
  58. 【請求項５８】 前記ポリメラーゼ連鎖反応増幅が５’から３’ヌクレアー
    ゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使用して実行され；ここで前記第３シグナル
    ハイブリダイゼーションプローブは、蛍光分子および、直線状の、単鎖コンフォ
    メーションにおいて該蛍光分子の蛍光を消光する、消光分子を含み；そしてここ
    で、前記ウイルス特異的アンプリコンと該第３シグナルハイブリダイゼーション
    プローブとのハイブリダイゼーションの際、該核酸ポリメラーゼが該第３シグナ
    ルハイブリダイゼーションプローブを消化し、それにより、該蛍光分子が該消光
    分子から分離し、検出可能になる、請求項５７に記載のアッセイ。
  59. 【請求項５９】 前記ウイルス特異的アンプリコン反応物の増幅が、該複製
    可能ウイルス特異的アンプリコンおよび前記細胞特異的アンプリコンの増幅反応
    とは、別々に実行される、請求項５８に記載のアッセイ。
  60. 【請求項６０】 前記ウイルス特異的アンプリコンおよび前記複製可能なウ
    イルス特異的アンプリコンの相対レベルの検出が、リアルタイムに、前記アッセ
    イの経過にわたって測定され；それにより、前記産生ウイルスストック中の複製
    可能なウイルスおよび複製不能ウイルスの相対量の測定が可能になる、請求項５
    ８に記載のアッセイ。
  61. 【請求項６１】 複製可能なウイルスを、１×１０９個の複製不能ウイルス
    粒子当たり１つの複製可能なウイルス粒子の感度で検出する、請求項６０に記載
    のアッセイ。
  62. 【請求項６２】 複製可能なウイルスを、１×１０１１個の複製不能ウイル
    ス粒子当たり１つの複製可能なウイルス粒子の感度で検出する、請求項６１に記
    載のアッセイ。
  63. 【請求項６３】 複製可能なウイルスを、１×１０１３個の複製不能ウイル
    ス粒子当たり１つの複製可能なウイルス粒子の感度で検出する、請求項６２に記
    載のアッセイ。
  64. 【請求項６４】 前記第２シグナルの、標準的な条件下での検出が、前記サ
    ンプルの過剰の細胞ＤＮＡの存在を示し、それにより前記アッセイを無効にする
    、請求項５８に記載のアッセイ。
  65. 【請求項６５】 複製不能ウイルスの産生ストック中の複製可能ウイルスの
    存在を検出する方法であって、該方法は、請求項３０に記載のアッセイにおいて
    該ウイルス産生ストックの１以上のサンプルを試験する工程を包含する、方法。
  66. 【請求項６６】 複製不能ウイルスの産生ストック中の複製可能ウイルスの
    存在を検出する方法であって、該方法は、請求項４５に記載のアッセイにおいて
    該ウイルス産生ストックの１以上のサンプルを試験する工程を包含する、方法。
  67. 【請求項６７】 複製不能ウイルスの産生ストック中の複製可能ウイルスの
    存在を検出する方法であって、該方法は、請求項５７に記載のアッセイにおいて
    該ウイルス産生ストックの１以上のサンプルを試験する工程を包含する、方法。
  68. 【請求項６８】 複製不能ウイルスの産生ストック中の複製可能ウイルスの
    存在を試験するための診断キットであって、該診断キットは： （ａ）請求項３０に記載のアッセイをどのように実行するかを指示するマニュ
    アル； （ｂ）前記複製可能ウイルスのゲノムの領域に特異的であり、前記複製不能ウ
    イルスのゲノムから欠損される順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方
    向オリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで該オリゴヌクレオチドプライ
    マーは、特定の条件下で、複製可能ウイルス特異的アンプリコンの増幅を促進す
    る順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライ
    マー；ならびに （ｃ）該複製可能ウイルス特異的アンプリコンの少なくとも一方の鎖に相補的
    な第１シグナルハイブリダイゼーションプローブ、 を含む、診断キット。
  69. 【請求項６９】 請求項６８に記載のキットであり、該キットは： （ａ）宿主細胞遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび
    逆方向オリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで該オリゴヌクレオチドプ
    ライマーは、特定の条件下で、宿主細胞特異的アンプリコンの増幅を促進する、
    順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライマ
    ー；ならびに （ｂ）該宿主細胞特異的アンプリコンの少なくとも一方の鎖に相補的な第２シ
    グナルハイブリダイゼーションプローブであって、ここで該第２シグナルハイブ
    リダイゼーションプローブのシグナルは、前記第１シグナルハイブリダイゼーシ
    ョンプローブから区別可能である、第２シグナルハイブリダイゼーションプロー
    ブ、 をさらに含む、キット。
  70. 【請求項７０】 請求項６９に記載のキットであり、該キットは： （ａ）複製可能ウイルスと複製不能ウイルスの両方に共通であるウイルスゲノ
    ム領域を増幅し、そして特定の条件下でウイルス特異的アンプリコンの増幅を促
    進する、順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチド
    プライマー；ならびに （ｂ）該ウイルス特異的アンプリコンの少なくとも一方の鎖に相補的な、第３
    シグナルハイブリダイゼーションプローブ、 をさらに含む、キット。
  71. 【請求項７１】 前記ポリヌクレオチドが異種イントロンを含む、請求項２
    １に記載の核酸分子。
  72. 【請求項７２】 前記異種イントロンがＳＶ４０後期領域イントロンである
    、請求項７１に記載の核酸分子。
  73. 【請求項７３】 前記アデノウイルスＥ１遺伝子座が、Ｅ１ｂ領域中に異種
    イントロンをさらに含む、請求項２４に記載の補完エレメント。
  74. 【請求項７４】 前記異種イントロンがＳＶ４０後期領域イントロンである
    、請求項７３に記載の補完エレメント。
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