KR20070085254A - 개선된 아데노바이러스 벡터 및 그것의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 개체군의 소수에서 미리-존재하는 면역과 맞서고 그리고 키메라 캡시드를 갖는 아데노바이러스에 기초한 재조합체 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 키메라 캡시드는 적어도 콕사키바이러스 및 아데노바이러스 수용체 (CAR)와 결합하는 인간 아데노바이러스의 노브 도메인을 갖는 섬유 단백질 및 인간 개체군의 낮은 비율에서 미리-존재하는 면역과 맞서는 아데노바이러스 혈청형으로부터의 헥손 단백질을 포함한다.

아데노바이러스, 벡터

Description

개선된 아데노바이러스 벡터 및 그것의 용도 {Improved adenoviral vectors and uses thereof}

본 발명은 백신 조성물 중에 치료학적 핵산을 포함하는 재조합체 키메라 아데노바이러스 벡터를 사용하는 약제 분야, 더욱 특히 치료학적 및 예방학적 치료에 관한 것이다.

재조합체 아데노바이러스 벡터는 유전자 치료 응용 및 백신에 널리 응용된다. 이제까지, 51개의 다른 아데노바이러스 혈청형이 확인되었다. 서브그룹 C 아데노바이러스는 그러한 유전자 치료와 같은 응용을 위해 가장 광범위하게 연구되어 왔고; 특히 혈청형 2 및 5 (Ad2 및 Ad5)가 당업계에서 널리 사용된다. 재조합체 Ad5는 면역화을 포함하는, 다양한 다른 목적으로 사용된다. 중요하게는, Ad5 벡터-기초의 백신이 다양한 동물 모델에서 강력한 그리고 방어적 면역 반응을 도출해 내는 것을 보여왔다. 더욱이, HIV 면역화을 위한 대-규모의 임상적 시도가 Ad5-기초 재조합체를 사용하여 (WO 01/02607; WO 02/22080; Shiver et al. 2002; Letvin et al. 2002; Shiver and Emini. 2004) 진행중이다. 그러나, HIV를 위한 재조합체 Ad5 벡터-기초한 백신 및 다른 병원균의 효용성은 인간 개체군에서 Ad5-특이적 중화 항체 (NAbs) 의 높은 혈청학적 보유율(Seroprevalence)에 의해 상당히 제한될 것이 다. 항-Ad5 면역의 존재는 마이스 및 레서스 원숭이(monkeys)의 연구에서 Ad5-기초한 백신의 면역유전성을 실질적으로 억제하는 것을 보여왔다. 상(phase)-1 임상적 시도에서 초기 데이터는 이러한 문제가 또한 인간에서 발생할 수 있다는 것을 보인다 (Shiver 2004).

이전에 가장 보편적인 인간 아데노바이러스 (Ad5와 같은)로 감염된 개인의 미리(pre)-존재하는 면역의 존재를 회피하기 위한 하나의 믿을만한 전략은, 그러한 미리-존재하는 면역과 맞서지 않는 아데노바이러스 혈청형으로부터의 재조합체 벡터의 개발을 포함한다. 특히 유용한 것으로 확인된 인간 아데노바이러스 벡터는 WO 00/70071, WO 02/40665 및 WO 2004/037294 (또한 Vogels et al. 2003 참조)에서 나타낸 것처럼, 혈청형 11, 26, 34, 35, 48, 49, 및 50을 기초로 한다. 다른 이들은 또한 아데노바이러스 24 (Ad24)는 그것이 희소한 혈청형으로 보이는 것만큼 특히 관심 대상이라는 것을 발견하였다 (WO 2004/083418).

유사한 전략은 원숭이(simian) 아데노바이러스의 사용을 기초로 하는데, 이는 이들이 전형적으로 인간을 감염시키지 않기 때문이다. 이들은 인간 샘플에서 낮은 혈청학적 보유율을 보인다. 그러나 이들은 이들 바이러스가 인간 세포를 인 비트로 (in vitro)에서 감염시킬 수 있다는 것이 보여졌기 때문에, 인간 용으로 응용가능하다 (WO 03/000283; WO 2004/037189).

아데노바이러스 혈청형 35 (Ad 35) 벡터-기초한 백신은 항-Ad5 면역에 의해 상당히 억제되지 않는 유력한 세포 면역 반응을 이끌어 낼 수 있다는 것이 보여졌다 (Barouch et al. 2004; Vogels et al. 2003). 유사하게는, 침팬지 아데노바이러 스는 항-Ad5 면역에 의해 최소한으로 영향받는 면역 반응을 이끌어낸다는 것이 보여졌다 (Farina et al. 2001; Pinto et al. 2003). 최근에는, 중화 항체 (NAbs) 및 CD8⁺ T 림프구 반응 둘 다 항-Ad5 면역에 기여하고, 반면에 Ad5-특이적 NAbs는 주요한 역할을 하는 것으로 보인다는 것이 입증되었다 (Sumida et al.). 비록 이러한 발전은 굉장히 유용한 접근인 것처럼 보이지만, 또한 마이스에서 Ad35-벡터에 기초한 백신이 미리-존재하는 Ad5-면역이 없는 연구에서 Ad5 벡터-기초한 백신보다 덜 면역성이라고 입증되었다 (Barouch et al. 2004).

명백히, 숙주에서 미리-존재하는 면역성과 맞서지(encounter) 않지만, 여전히 벡터에 의해 운반되는 핵산에 삽입된 이종성 핵산에 의해 코드화된 단백질에 대해 면역원성이고 그리고 강한 면역 반응을 유도할 수 있는 대안적인 아데노바이러스 벡터가 당해 분야에서 필요하다.

발명의 요약

개선된 유전자 운반, 면역화, 및 유전자 치료를 위한, 새롭게 개발된 재조합체 아데노바이러스 벡터가 여기에 개시되어 있다. 하나의 바람직한 구현예에서 벡터는, 여기서 적어도 Ad35 섬유(fiber) 노브가 콕사키 바이러스(Coxsakievirus) 및 아데노바이러스 수용체 (CAR)와 결합하는 혈청형의 섬유 노브에 의해 치환된 아데노바이러스 혈청형 35 (Ad35)에 기초하는 재조합체 아데노바이러스이다. 더욱 바람직하기는 이러한 혈청형은 Ad5 섬유 노브 (노브만 치환된 Ad35k5라고 지칭되는 벡터, 또는 노브, 쉐프트 (shaft) 및 테일의 일부가 치환된 Ad35f5라고 지칭되는 벡터를 초래하는)이다. 섬유의 쉐프트 및 테일은 운반 백본 혈청형 즉, Ad35일 수 있고, 본 발명은 또한 쉐프트 도메인이 섬유 노브 혈청형과 동일한 혈청형인 벡터에 관한 것이다. Ad35f5에서 백본 혈청형으로부터 남겨진 테일 영역의 일부는 안정한 벡터의 생산을 위해 캡시드의 잔존하는 부분과의 적당한 상호작용을 보장한다. 본 발명의 벡터는 관심의 치료학적 핵산, 바람직하기는 면역화 목적에 응용가능한 핵산을 포함한다.

본 발명은 인간 개체군 대부분에서의 미리-존재하는 낮은 면역성과 만나는 반면에, 벡터에 의해 포함되는 핵산에 의해 암호화되는 항원에 대한 강한 면역 반응을 여전히 유도할 수 있는, 재조합체 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 이것은 Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49, Ad50, 또는 원숭이 아데노바이러스와 같은 아데노바이러스 혈청형에 기초한, 키메라 캡시드를 지니는 재조합체 벡터를 생산함에 의해 달성된다. 키메라 캡시드는 백본 벡터와 다른 인간 아데노바이러스 혈청형으로부터 섬유 단백질에 부분적으로 기초하고, 그리고 가장 바람직한 구현예에서 CAR 수용체와 결합하는 (그들의 노브 도메인을 통해) 섬유 단백질을 포함한다. 우선적으로 CAR과 결합하는 수많은 다른 아데노바이러스들이, 서브그룹 A, C, D, E, 및 F로부터의 인간 아데노바이러스, 및 또한 CAR과 결합하는 양 아데노바이러스와 같이, 섬유 노브를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 그들의 섬유 노브 도메인에 사용되는 바람직한 아데노바이러스 혈청형은 서브그룹 C, 더욱 바람직하기는 Ad2 및 Ad5로부터의 인간 아데노바이러스이다.

다른 구현예에서 본 발명에 따라 생산된 바이러스는 서브그룹 C 아데노바이러스, 바람직하기는 Ad5에 기초한 재조합체 아데노바이러스이고, 그것은 E1 영역의 기능적 결실에 의한 복제-결함이 만들어져있고 그리고 여기서 바이러스성 캡시드에서 헥손 단백질은 하나 이상의 과변이영역(HVR's)이 희소한 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도되는 HVR's에 의해 치환된 키메라 단백질이다. 그러한 희소한 혈청형은 인간 개체군의 대부분의 개인에서 NAbs와 맞서지 않는다. HVR's를 제공하기 위해 사용되는 바람직한 혈청형은 Ad35 및 Ad48이다. 바람직하기는, 재조합체 바이러스는 예방학적 또는 치료학적 목적을 위해 숙주로 운반되는 관심의 이종성 핵산을 포함한다.

상세한 설명

상기 논한 것처럼, Ad5-기초한 재조합체 벡터는 야생형 바이러스로 1차 감염에 기인한 인간 개인들의 대부분에 존재하는 중화 항체 (NAbs)의 존재에 의해 그들의 사용이 방해를 받는다. 비록 바이러스 외피 (coat)에 존재하는 다른 캡시드 단백질이 숙주에서 항체를 유발하지만, Ad5-특이적 NAbs의 1차 표적이 Ad5 헥손 단백질이라는 것이 입증되어 왔다 (Sumida et al. 2005). 이것은 미리-존재하는 NAbs에 의해 더이상 보여질 수 없도록 헥손 단백질을 변화시킴에 의해, 이미 Ad5에 대항하는 NAbs를 갖거나, 또는 Ad5에 기초한 이전의 백신으로 이미 면역화되었거나, 또는 프라임/부스트 면역화 요법(regime)에서 Ad5에 기초한 벡터로 프라임된, 인간에 유익할 수 있는, 개선된 아데노바이러스 벡터가 생산될 수 있다는 사고를 이끌어냈다. 그러나, 헥손 단백질의 변경은 쉬운 작업이 아닌 것임이 판명되었다. 완전한 헥손 변화는 일반적으로 동일한 Ad 서브그룹 내의 아데노바이러스들 사이에서만 가능하고 그리고 생존 가능성이 불량한 바이러스를 생성하였다 (Youil et al. 2002; Gall et al. 1998; Roy et al. 1998). 만약 이것이 제한이라면, Ad5에 기초한 벡터는 다른 서브그룹 C 아데노바이러스들로부터 헥손 단백질을 포함해야만 할 것이다. 그러나, 이들 대부분이, 만약 전체는 아니라면, 그 혈청형들이 희소한 것으로 여겨지지 않는 의미에서 효용성이 없다. 인간 개체군의 대부분의 개인은 한번쯤은 서브그룹 C로부터 혈청형과 맞섰다. 이미 존재하는 NAbs와 맞서지 않아야만 하는 혈청형으로부터의 헥손을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 그 희소한 혈청형들은 서브그룹 B (Ad11, Ad34, Ad35, Ad50) 및 D (Ad24, Ad26, Ad28 및 Ad49)에서 우세하게 발견된다.

본 발명의 발명자들은 이제 최초로, 헥손의 특이적 부분을 (재-)정의함에 의해 그리고 보존적 (conservative) 접근 및 이용가능한 구조 및 서열 데이터를 사용함에 의해, 특정 영역이 확인되고 교환되어서 생존 가능하고 충분히 높은 역가로 생산될 수 있는 생산성 재조합체 바이러스를 생성할 수 있다는 것을 보였다. 그들의 헥손 단백질 또는 그 관련된 부분들을 제공하기 위해 사용되는 바람직한 혈청형 은 Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 및 Ad50이고, 이들 혈청형 미리-존재하는 낮은 면역성과 맞서는 것으로 알려져 있다 (WO 00/70071 참조). 더욱 바람직한 것은 Ad11, Ad26, Ad35 및 Ad48이고, Ad48이 가장 바람직한 혈청형이다. 또한 비-인간 아데노바이러스가 이 점에서 흥미롭다. 하나의 바람직한 예는 침팬지 아데노바이러스 Pan9이다.

확인된 영역은 또한 헥손 과변이영역(HVR's)으로 알려진, 7 표면 루프 (loop)이다. 아데노바이러스 혈청형 중에서 헥손 변이성은 이들 7 루프에 집중된다 (Crawford-Miksza and Schnurr. 1996). 본 발명이 실시예에서 요약한 것처럼 Ad48의 HVR's의 사용에 한정되지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 이것은 다소 넓은 정의에서 (표 Ⅱ 참조) 및 더욱 제한적이고, 더욱 축소적인 정의 (표 Ⅳ 참조)에서 Ad5, Ad11, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 및 Ad50에서 HVR's의 확인에 의해 추가로 뒷받침된다. Ad48은 또한 미리-존재하는 낮은 면역성과 맞서고 그리고 또한 희소한 혈청형의 장점 (낮은 이미-존재하는 면역성)을 갖는 Ad5 (강한 면역원성, 생산하기 용이함, 등)에 의해 예시되는, 서브그룹 C 아데노바이러스의 알려진 장점으로부터 이점을 얻는 키메라 아데노바이러스를 만드는 데 유용한, 모든 다른 혈청형의 예로서 역할한다. 명백하게는, 만약 당업자가 Ad35와 같이, 다른 혈청형 백본을 사용하는 것이 바람직한 프라임/부스트 면역화 요법의 사용을 의도한다면, 프라이밍 벡터에 대항하여 상승된 NAbs와 만나지 않은 벡터로 부스트하는 것이 유리할 것이다. 따라서, Ad11, Ad24, Ad26, Ad35, Ad48, Ad49 및 Ad50, 등과 다른 희소한 혈청형 (상기 기술한 어떠한 희소한 혈청형)의 HVR's과의 조합은 또한 본 발명의 일부이다. 그러한 벡터의 비-제한적 예는 혈청형들 사이에서 교환된 적어도 1, 더욱 바람직하기는 6, 가장 바람직하기는 7 HVR's을 갖는, Ad5HVR48, Ad5HVR35, Ad35HVR11, Ad35HVR48, Ad11HVR35, 및 Ad11HVR48이다. 따라서, 바람직하기는 희소한 혈청형으로부터 적어도 하나의 HVR이 취해지고 그리고 백본 혈청형의 헥손으로 삽입된다. 본 발명의 발명자들에 의해, Ad5로부터의 전체 7 HVR's을 Ad48로부터의 상응하는 HVR's에 의해 치환하는 것은 Ad5 결여 (empty) 바이러스로 면역화된 마이스에서 미리-존재하는 면역성과 거의 맞서지 않는 생존 가능하고 생산성 벡터를 도출한다는 것이 보여졌다. 그러나, 만약 첫 번째 HVR (바이러스 게놈에서 왼쪽 ITR에서 오른쪽 ITR로 보여지는)만 치환된다면, 어떠한 효과도 보이지 않았다. 이것은 하나의 치환이 충분하지 않을 수 있다는 것을 의미하지는 않는다. 그것은 한 영역이 다른 것보다 더 면역원성이라고 생각되고, 그리고 확인된 7 영역 중 어느 것이 가장 많이 기여하는지 그리고 HVR's 중 어느 것이 특정 셋팅에서 또는 특정 응용을 위해 치환될 필요가 없는지에 대한 것은 조사사항으로 남겨진다. 아마도 특정 개인은 다른 개인과 비교해서 다른 HVR's에 대항하여 다른 면역 반응을 상승시킬 것이다. 더욱이, 벡터를 포함하는 키메라 헥손은 숙주에서 적당한 NAb 활성만이 존재하는 셋팅에서 유익함을 증명할 수 있다. 제공된 실시예에 따라서 상승된 이미-존재하는 면역성은, Ad5 결여 벡터의 10¹⁰ vp의 2 연속된 용량 때문에 매우 높다. 그럼에도 불구하고, 헥손 단백질 내에 모든 HVR's는 이것이 숙주 내에서 존재하는 미리-존재하는 NAbs에 의해 검출되지 않는 벡터를 산출하는 최상의 기회를 제공할 때, 치환된다.

개선된 아데노 바이러스를 개발하기 위해서, 첫 번째로 Ad5-특이적 중화항체 (NAb) 에피토프가 맵핑되었다(mapped). Ad5 혈청학적 보유율 및 역가는 인간 개체군 (대략 미국에서 50% 및 개발도상국 일부에서 90%)에서 매우 높은 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 여기에 개시한 것처럼, 기능적으로 중요한 Ad5-특이적 NAbs는 거의 오로지 헥손 단백질에 대해 대항하는 것으로 확인되었다 (Sumida et al. 2005 또한 참조). 대조적으로, 섬유 단백질에 대항하는 Ad5-특이적 항체는 관련된 천연의 존재하는 환경, 즉, 인간에서 발견된 항-Ad5 NAbs 역가에 관한 환경하에서, Ad5 백신 면역원성을 상당히 억제하지는 않는다. Ad5와는 대조적으로, Ad35 및 Ad11 혈청학적 보유율 및 역가는 세계의 수많은 다른 나라의 인간 개체군에서 매우 낮은 것으로 확인되었다.

본 발명은 Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 및 Ad50와 같은 희소한 (또는 적어도 좀처럼 중화되지 않는) Ad 혈청형의 헥손 및 바람직하기는 서브그룹 A, C, D, E, 및 F로부터의 대부분의 인간 아데노바이러스 혈청형 및 양 아데노바이러스와 같이, CAR 수용체와 상호작용하는 혈청형으로부터의 섬유 노브 도메인을 지니는 (운반하는) 신규한 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 백본 벡터로서 사용되고 그리고 따라서 NAbs가 인간 개체군에서 좀처럼 발견되지 않는 그들 자신의 헥손 단백질을 지니는 바람직한 혈청형은 Ad11 및 Ad35이다. 백본 벡터로서 그리고 그것의 섬유를 위해 사용되는 바람직한 혈청형은 Ad5이다. 당해분야에서 면역 반응에서 주요한 역할을 하는 세포는 수지상 세포이고, 이는 이들이 그들의 표면상에서 면역원성 펩티드를 효율적으로 제시할 수 있는 세포여서, 그러한 펩티드에 대항하는 강한 면역 반응을 도출하기 때문이라는 것이 잘 인식되어 있다. 당해분야에서 바람직했던 벡터들은 그들의 수지상 세포를 매우 효율적으로 감염시키는 능력 때문에, 아데노바이러스 서브그룹 B로부터의 벡터들, 또는 효율적인 방법으로 수지상 세포를 인식하고 감염시키는 아데노바이러스로부터의 섬유 단백질을 지니는 벡터들이고, 예를 들어 WO 02/24730 및 WO 00/70071을 참조하라. 이들 벡터는 아마도 수용체로써 CD46을 사용한다. 놀랍게도, 여기에 나타낸 것처럼, 이제 본 발명의 발명자들에 의해 CAR를 통해 상호작용하는 것으로 알려진 아데노바이러스 벡터, 즉 Ad5의 적어도 하나의 섬유 노브를 지니는 벡터는, 낮은 수준의 이미-존재하는 면역과 맞서는 벡터 상에 클론될 때, 면역 반응을 개선시킨다는 것이 이제 확인되었다. 이것은 매우 예기치 않은 수지상 세포를 통한 바람직한 면역 반응 경로를 고려하는 것이다.

당업자들에 의해 (서열 비교 및 수용체 상호작용에 대한 일반적인 지식을 통해) 나머지 섬유 단백질로부터 쉽게 구별될 수 있는 도메인인, 노브 도메인은 아데노바이러스 벡터와 결합하는 특이적 세포 수용체의 인식에 우세하게 관련될 도메인이라는 점이 이해되어야 한다. Ad5 섬유 노브가 세포의 표면상에서 CAR과 상호작용하고 그리고 펜톤 염기 및 세포내 인테그린에 의해 추가로 촉진되는 바이러스 입장 (entry) 전에 효율적인 바이러스 부착을 중재하고 (Bergelson et al. 1997; Bewley et al. 1999; Roelvink et al. 1998 and 1999; Wickham et al. 1993), 반면에 Ad11 및 Ad35와 같은 B그룹 바이러스는 CD46을 통해 상호작용한다 (Gagger et al. 2003)는 것이 이미 보여졌다. 본 발명은 적어도 수용체-결합 도메인 (노브 도메인에 의해 정의된)이 교환되는 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 따라서 후자 벡터들은 백본 벡터로부터의 쉐프트 및/또는 테일의 부분과 같은 섬유 도메인을 여전히 포함할 수 있다. 안정한 재조합체 벡터를 생성하는, 다른 캡시드 단백질과의 적절한 안정한 상호작용을 보장하는 백본 벡터 영역의 테일 영역의 적어도 일부를 포함하는 것이 사실상 바람직하다.

본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터는 키메라 섬유가 없이 Ad5 또는 Ad35에만 기초한 벡터들보다 백신 및 유전자 치료에 더욱 효율적이다. 키메라 Ad5-Ad35 섬유를 지니는 키메라 아데노바이러스들은 당해분야에서 공지되어 있다. 적어도 노브 도메인이 Ad35로부터 유래된 키메라 섬유를 지니는 Ad5 벡터가 개시되어 있다 (WO 00/31285, WO 00/52186; WO 02/24730; Shayakhmetov et al. 2003; Rea et al. 2001). Smith et al. (2003)은 테일 및 쉐프트는 Ad35로부터 유래되고, 노브 도메인은 Ad5로부터 유래되는 키메라 섬유를 개시했다. 이들 인용된 참고문헌에서의 모든 벡터는 Ad5를 기초로 하고, 이것은 벡터들이 바이러스 벡터 캡시드 내에서 Ad5 헥손의 존재때문에 이미-존재하는 면역과 여전히 맞설 것이라는 사실을 암시한다. Ophorst et al. (2004)에 의해 제공된 데이터는 이 현상을 확인하였다. 재조합체 복제-결함 Ad35 벡터 및 그들의 제조방법이 또한 당해분야에서 공지되어 있지만 (WO 00/70071; WO 02/40665), Ganesh et al. (2003)은 Ad35의 섬유 노브가 Ad5의 그것에 의해 치환된 섬유를 포함하는 Ad35-기초한 벡터의 사용을 개시했다. 그러나, 벡터는 마커 유전자 (그린 형광 단백질, GFP)를 지녔고 그리고 명백하게 낮은 형질도입 효율을 나타냈다. 결론적으로, Ganesh et al.은 그들의 사용과 관련된 장점은 별론으로 하고, 적어도 Ad35의 노브가 Ad5의 노브에 의해 치환된 벡터에 기초한 백신을 개시하거나 또는 제안하지 않는다. Ganesh et al.은 또한 완전한 Ad5 섬유를 가진 Ad35에 기초한 벡터를 개시한다. 이 벡터는 키메라 섬유가 아니라 전체 Ad5 섬유를 포함해서, 여기에 개시된 벡터들과는 다르다는 것이 주지되어야만 한다. Ganesh et al.은 낮은 형질도입 효율이 부분적 섬유 교환에서 확인되었다고 경고한다. 본 발명에 따른 벡터는 우수한 형질도입 효율을 갖고, 반면에 키메라 섬유는 잔여의 캡시드에서 안정한 고정을 보장한다. 당업자는 면역화 목적을 위하여, 매우 효율적으로 수지상 세포를 감염시키는 것으로 알려진 혈청형 (예를 들어 Ad11, Ad34 및 Ad35인, 서브그룹 B의 세포들과 같은)의 섬유 노브를 주로 CAR을 통해 세포를 감염시키는 혈청형으로부터의 섬유 노브로 치환할 동기를 갖지 않을 것이다.

아데노바이러스 벡터에 대한 숙주세포로부터의 중화 활성이 주로 헥손 단백질에 대한 NAbs에 기인하므로, 아데노바이러스 벡터는 또한 Ad5로 예시되는 상당히 중화된 혈청형에 기초할 것이고, 여기서 상기 헥손은 Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 및 Ad50과 같은 거의 중화되지 않은 혈청형의 헥손에 대하여 교환(swap)된다. 그러한 벡터의 예는 Ad5h35 (Ad5 헥손 대신에 Ad35로부터 헥손 단백질을 포함하는 Ad5-기초한 벡터)로서 언급된다. 당업자는 여기에 개시된 정보를 기초로 하고 그리고 당해분야에서 이용가능한 지식을 기초로 하여 다른 가능한 조합을 상상하거나 만들 수 있다. 전체 헥손을 교환하는 것은 어렵다고 증명되었음이 명백하다 (Gall et al. 1998; Youil et al. 2002). 키메라 헥손 단백질을 구성하는 하나의 새로운 그리고 유용한 방식이 실시예에서 개시되었다. 다른 혈청형으로부터 헥손 단백질을 사용하는 키메라 캡시드를 포함하는 벡터를 클로닝하는 다른 방식이 WO 00/03029의 실시예 8에 개시되었다.

본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터, 즉, 일반적으로 높은 면역 반응을 도출하는 아데노바이러스의 노브 도메인을 지니는 인간 개체군에서의 일반적으로 미리-존재하는 활성과 맞서는 혈청형 (Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 및 Ad50, 뿐만 아니라 특정 원숭이 아데노바이러스)에 기초한 벡터들은, 아데노바이러스가 전세계적 개체군의 높은 백분율로 미리-존재하는 면역성에 의해 검출되지 않는 헥손 단백질을 지니기 때문에, 미리-존재하는 중화 활성을 피하는 아데노바이러스 뿐만 아니라 일반적으로 높은 면역 반응을 유도해내는 아데노바이러스 둘 다를 넘는 개선을 나타낸다. 바꾸어 말하면 그리고 여기에 예시한 것처럼, Ad35fib5 및 Ad35k5 둘 다 Ad5 및 Ad35 두 벡터를 넘는 개선을 나타낸다.

인간 개체군에서 항-Ad5 면역이 높은 수준으로 주어지면, Ad5 벡터는 적어도 마이스 및 원숭이에서 행해진 실험에 기초하여, 항-벡터 면역에 의해 실질적으로 억제될 수 있다. 인간 개체군에서 항-Ad35 면역이 낮은 수준으로 주어지면, Ad35 및 Ad35-관련 벡터는 이 점에 있어서 Ad5 벡터 이상의 실질적 장점을 갖게 된다. 바꿔 말하면, Ad35, Ad35fib5 및 Ad35k5 벡터는 항-벡터 면역에 의하여 상당히 억제되지 않는다. 그러나, Ad35 벡터-기초한 백신들은 항원 삽입에 대한 항체의 관점에서 Ad5 벡터-기초한 백신보다 덜 항원적이다.

중요하게는, 이제 처음으로 본 발명자의 발명자들에 의해, 다른, 그러나 매우 면역원성 벡터의 적어도 하나의 (이종성) 노브 도메인을 지니는 저-중화된 벡터가 그것의 나이브 섬유를 갖는 백본 벡터보다 면역 반응을 유발하는데 훨씬 강력하다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 그러한 벡터들은 이제 이용가능한 아데노바이러스 벡터보다 기술적이고 실용적인 진보를 나타낸다. 당업자는 동일한 원칙에 기초한 다른 아데노바이러스를 클로닝하기 위해 여기에서 함께 제공된 지식을 이용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명은 또한 면역원성 인간 아데노바이러스의 섬유의 노브 도메인을 지니는 재조합체 원숭이 아데노바이러스에 관한 것이다. 재조합체 원숭이 아데노바이러스를 제외하더라도, 재조합체 소 및 개 아데노바이러스와 같은 다른 비-인간 아데노바이러스는 본 발명에 포함된다. 또한 다른 면역원성 아데노바이러스의 적어도 하나의 노브 도메인을 지니는 백본 벡터로서 채용될 수 있는 다른 저-중화된 인간 아데노바이러스에 관한 것이다. 다른 조합이 수없이 많지만, 적어도 아데노바이러스의 헥손 단백질이 높은 수준의 미리-존재하는 면역성과 맞서지 않아야하고, 반면에 적어도 노브 도메인이 CAR 수용체의 인식을 전달하고, 그것에 의해 벡터가 투여된 숙주에서 높은 면역 반응을 보장하는 정도로 제한된다. 당업자는 미리-존재하는 면역성을 결정하고, 유도된 면역 반응의 수준을 결정하기 위해 그리고 본 발명에 의해 개요된 재조합체 (키메라) 벡터를 얻기 위한 전략을 위해, 당해분야에서의 일반적인 지식을 이용하여 상기 기술된 특징들을 특징지을 수 있을 것이다.

Ad35k5 백신 벡터의 유력한 면역원성은 Ad5 섬유 단백질의 기능적으로 관련된 역할을 제안한다. Ad5 섬유 노브는 높은-친화성의 수용체 CAR과의 결합을 결정하고 그리고 또한 핵으로 바이러스 입자의 효율적인 세포내 트래피킹 (trafficking)에서 중요한 역할을 한다. 비록, 정확한 메커니즘은 아직 결정되지 않았지만, Ad35k5 벡터의 증가된 면역원성은 Ad5 섬유 노브의 공지된 생물학적 기능을 반영할 것이다. 재조합체 Ad35k5 벡터는 여기에서 나타낸 대로, 주로 재조합체 Ad35 벡터의 중화 프로파일을 나타내고 저/중간 수준의 항-Ad5 면역을 효과적으로 피했다. 이들 관찰은 Ad5-특이적 NAbs가 주로 Ad5 헥손 단백질에 대한 것임을 입증하는 이전의 연구와 일치한다. 이 모델은 또한 Ad35 섬유 단백질을 포함하는 Ad5 벡터가 항-Ad5 면역을 우회할 수 없었던 관찰(Ophorst et al. 2004)을 뒷받침한다. 그러나, 항-Ad5 면역의 높은 수준은 사실, 여기에 나타낸 것처럼, Ad35k5 벡터의 면역원성을 감소시킬 수 있었는데, 이는 낮은 역가 그러나 Ad5 섬유 단백질에 대한 명백하게 검출 가능한 NAbs를 반영한다. 항-Ad5 면역에 의한 Ad35k5 면역원성의 감소는 단지 부분적이었고 그리고 특히 높은 Ad5-특이적 NAb 역가에서만 검출 가능했다는 것이 주지되어야 한다.

Ad35k5 벡터들의 다른 제한은, 전형적으로 Ad35 벡터로 관찰된 것보다 대략 10배 더 높은, 그들의 상대적으로 높은 vp/pfu 비율일 수 있다. 비록 이것이 아직 조사되고 그리고 확인될 필요가 있지만, 이러한 관찰은 바이러스 통합성 (integrity) 및 안정성은 키메라 섬유 단백질을 포함에 의해 이루어질 수 있다는 것을 제시한다.

여기에 개요된 것처럼, Ad5, Ad35k5, 및 Ad35 벡터들의 면역원성을 비교하는 레서스 원숭이 연구는 마이스에서 얻어진 결과를 확증하였다. 마이스는 최적의 Ad35 수용체 CD46가 부족하기 때문에, 이것은 상대적인 것이고, 그리고 따라서 Ad35 벡터의 면역원성이 과소 평가될 수 있다. 레서스 원숭이에서, Ad5 벡터는, 기대되는 것처럼 동종성 부스트 면역화를 효과적으로 방지하는, 벡터-특이적 NAbs의 빠르고 높은 역가를 도출했다. 대조적으로, 두 Ad35 및 Ad35k5 벡터는, 동종성 벡터들의 재-투여가 뒤따르는 이들 반응의 부스팅을 촉진하는 Ad5 벡터와 비교하여, 더 낮은 벡터-특이전 NAb 역가를 이끌어냈다. Ad35k5 벡터가 주어진 원숭이에서 관찰된 강한(robust) 면역 반응은 이들 벡터가 강한 반응을 프라임하고 그리고 효과적으로 부스트될 수 있다는 사실을 반영했다고 추측된다.

본 발명은 캡시드 키메라 재조합체 Ad 벡터들이 다른 Ad 혈청형의 유익한 면역학적 및 혈청학적 성질을 조합하기 위해 구성될 수 있다는 것을 입증한다. 키메라 Ad 벡터들의 발생은 면역화 및 유전자 치료 둘 다를 위한 개선된 제 2-세대 Ad 벡터를 도출하는 신규한 전략을 나타낸다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 CAR-결합 아데노바이러스 혈청형으로부터 적어도 하나의 노브 도메인을 포함하는 키메라 섬유 단백질을 포함하는 복제-결함 재조합체 아데노바이러스 혈청형 35 (Ad35)벡터에 관한 것으로, 여기서 상기 재조합체 벡터는 추가로 관심의 치료학적 핵산을 포함한다. 치료학적 핵산은 포유류, 바람직하기는 인간의 진단상의, 치료학적 및/또는 예방학적 치료에서 유용한, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은 치료학적 단백질성 물질을 코드화하는 핵산으로서 정의된다. 치료학적 단백질의 예는 종양 면역화에서 면역 반응을 도출하는 단백질이다. 다른 예들은, 유전성 장애의 치료에 유용한, 유전자 치료에서 사용되는 것들과 같은, 단백질들이다. 바람직한 치료학적 단백질은 박테리아, 기생충, 또는 바이러스와 같은 감염성 존재로부터 유도되고 또는 기초로 하고 또는 (직접적으로) 클로닝되는 단백질이다. 아데노바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), SIV, 에볼라 바이러스, 광견병 바이러스, 단순포진 바이러스 (HSV), C형 간염 바이러스 (HCV), 등과 같은 바이러스에 대한 면역화 목적에 매우 응용될 수 있다. 아데노바이러스성 핵산에서 코드화될 수 있는 HIV-유도된 항원의 예는 nef, gag, pol 및 env이다. HSV 항원의 예는 항원 9D이다. 말라리아를 유발하는 것들과 같은 기생충으로부터의 치료학적 단백질이 또한 본 발명의 벡터에서 사용될 수 있다. 이들 벡터에 클로닝될 수 있는 특히 바람직한 단백질은 포자소체 (circumsporozoite, CS) 단백질 및 LSA-I와 같은 열대열 원충 (Plasmodium Falciparum)으로부터의 것들이다. 다른 바람직한 단백질은 마이코박테리아 균주로부터의 단백질, 특히 결핵균 ( Mycobacterium tuberculosis)과 같은, 결핵을 유발하는 것들일 수 있다. 이들 박테리아로부터의 바람직한 항원은, 본 발명의 벡터에서 또한 사용될 수 있는 10.4, 85A, 85B 및 85C 항원이다. 인 비트로 연구에서 마커로서 사용된 단백질들은 전형적으로 치료학적 단백질로는 보이지 않고, 따라서 GFP, 루시페라아제, 또는 CAT는 치료학적인 것으로 여겨지지 않는다.

항원을 발현하기 위해 사용될 수 있는 바람직한 프로모터 및 폴리 (A) 서열은 당해분야에서 잘 공지되어 있고 그리고 CMV, Ad2 MLP, SV40, 등을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 적절한 전사 종결 서열은 예를 들어 SV40 또는 BGH로부터 유도될 수 있다. 항원의 코딩 서열은 포유류, 바람직하기는 인간에서의 최적 발현을 위해 코돈-최적화(codon-optimisation)될 수 있다. 코돈-최적화 방법은 당해분야에서 잘 공지되어 있다.

본 발명은 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 및 50으로 이루어진 군에서 선택된 복제-결함 재조합체 아데노바이러스에 관한 것으로, 상기 아데노바이러스는 CAR-결합 아데노바이러스 혈청형으로부터의 적어도 하나의 노브 도메인 (knob domain)을 포함하는 키메라 섬유 단백질을 포함하고, 그리고 상기 재조합체 벡터는 추가로 관심의 치료학적 또는 항원성 단백질을 코드하는 이종성 핵산을 포함한다. 바람직한 혈청형은 서브그룹 B 혈청형, 더욱 바람직하기는 혈청형 11, 34 및 35이고, 가장 바람직하기는 혈청형 35 (Ad35)이다. 본 발명은 이들 혈청형에 관한 것인데, 이는 이들이 전세계의 건강한 개인에서 취해진 혈청 시료의 중화하는 미리-존재하는 면역과 상당히 낮은 백분율로 맞서기 때문이다. 여기에서 사용된 키메라 섬유 단백질은 적어도 두 개의 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터의 부분들을 포함하는 섬유를 이르며, 여기서 상기 노브 도메인은 CAR에 결합하는 아데노바이러스로부터 유래된다. 섬유 단백질의 테일 도메인은 백본 벡터의 것과 같은 것이 바람직한데, 이것이 벡터의 캡시드와 적절한 상호작용을 통해 벡터의 안정성을 더하기 때문이다. 바람직한 구현예에서, CAR과 결합하는 노브 도메인은 서브그룹 C의 아데노바이러스 혈청형의 섬유, 더욱 바람직하기는 혈청형 Ad5로부터 유래된다.

여기에서 사용된 관심의 치료학적 단백질은 유전자 치료와 같은 포유류 치료학적 치료에서 유용한 단백질에 관한 것이다. 여기에서 사용된 관심의 항원성 단백질은 면역 반응이 숙주 내, 또는 숙주 세포내에서의 발현 시에 유발되는 관심의 단백질에 관한 것이다. 이러한 면역 반응은 다른 종류의 면역화 셋팅을 요구한다: 하나의 예는 관심의 항원성 단백질에 대한 면역 반응이 단백질을 발현하는 종양 세포의 제거를 더하는 종양 면역화이고, 반면에 다른 바람직한 응용은 바이러스, 박테리아, 효모, 또는 기생충과 같은 병원균에 의한 숙주의 감염을 방지하거나 또는 상당히 억제하기 위한 면역화와 같은 예방학적 치료에서이다. 따라서, 바람직하기는 상기 관심의 항원성 단백질은 바이러스, 박테리아, 기생충, 또는 효모로부터의 단백질을 포함한다. 본 발명에 따른 재조합체 아데노바이러스의 사용은 또한 이미 발생된 감염의 치료 과정에서 관심의 항원성 단백질에 대한 면역 반응을 유발시키는데 사용되고, 따라서 복제, 패키징 (packaging), 등을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 바꾸어 말하면, 벡터들은 또한 이미-감염된 숙주로부터 그 다음으로의 바이러스의 확산을 방지하기 위해 사용될 수 있다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합체 아데노바이러스는 이종성 프로모터의 조절하에 있는 이종성 핵산을 포함한다.

본 발명의 바람직한 양상에서, 상기 항원성 단백질은 바이러스로부터 단백질을 포함하고, 여기서 상기 바이러스는 레트로바이러스, HSV 또는 에볼라 바이러스이지만, 만약 항원성 단백질이 레트로바이러스의 것이라, 상기 바이러스는 원숭이 또는 인간 면역 결핍 레트로바이러스이고, 상기 이종성 핵산은 바람직하게는 gag, pol, env 및 nef로 이루어진 면역결핍 바이러스 단백질의 그룹을 코드화하는 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 관심의 항원성 단백질은 말라리아-유발 기생충으로부터 유래되고, 여기서 상기 단백질은 바람직하기는 말라리아 원충 (Plasmodium) 종, 더욱 바람직하기는 열대열 원충으로부터의 포자소체 단백질, 또는 간 특이적 항원 (LSA-I, LSA-3), 또는 그들의 면역원성 부분이다.

본 발명은 이종성 핵산 및 키메라 섬유를 포함하는 신규한 복제-결함 재조합체 아데노바이러스에 관한 것이고, 상기 아데노바이러스는 약제로서의 사용을 위해, 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 및 50으로 이루어진 군에서 선택된다.

더욱이 본 발명은 말라리아-, 에볼라-, HSV-, HCV-, 또는 HIV 감염의 예방적 또는 치료학적 치료를 위한 약제의 제조에, 본 발명에 따른 재조합체 아데노바이러스 벡터의 사용에 관한 것이다.

하나의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 Ad5의 섬유로부터의 노브 도메인을 포함하고, 도 2B에서 밑줄쳐진 아미노산 서열, 및 Ad5와 다른 혈청형으로부터의 헥손 단백질을 갖는 키메라 복제-결함 재조합체 아데노바이러스에 관한 것으로, 추가로 상기 헥손 단백질은 저-중화된 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래되는 것이 바람직하다. 저-중화된 혈청형은 건강한 개인으로부터의 시료에서 소수에서 NAbs의 형태의 미리-존재하는 중화 활성과 맞서는 혈청형들이다. 하나의 특이적 구현예에서, 본 발명은 Ad35 헥손 및 키메라 섬유 단백질을 포함하는 키메라 복제-결함 재조합체 Ad35 벡터에 관한 것이고, 상기 키메라 섬유 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는다.

헥손 HVR 교환( swaps )

우세한 (dominant) Ad5-특이적 NAbs는 주로 Ad5 헥손 단백질에 대한 것이기 때문에, 헥손에서 표적화된 변이적 교환을 포함하는 신규한 재조합체 Ad5 벡터가 우세한 Ad5 헥손-특이적 NAbs를 피할 수 있다는 것이 타당하다. 이것은 새로한 생각이 아니고 그리고 당해분야에서 다수의 시도가 그러한 '스텔스 (stealth)' 아데노바이러스 벡터를 생산하기 위해 행해졌다. 그러나, 이들 중 어느 것도 하기에 개요된 것처럼, 성공적인 것으로 입증되지는 않았다.

다른 혈청형으로부터의 헥손 단백질 중에서 아미노산 변이성의 99% 이상은 Crawford-Miksza 및 Schnurr (196)에 의해 확인된 것처럼, 헥손의 노출된 표면 상에 위치한 7 상대적으로 짧은 과변이성 영역들 (HVR's)로 집중되는 것처럼 보인다. 이들 저자들은 15개의 다른 아데노바이러스의 헥손 단백질 (Ad1, Ad2, Ad5, Ad6, Ad8, Ad9, Ad12, Ad15, Ad16, Ad31, Ad40, Ad41, Ad48, BAV3 및 MAVI) 들을 비교했다. 7 HVR's는 루프 1 및 2 (또한 11 및 12로 언급된다)에서 250 가변성 잔기 중에서 확인되었고, 여기서 HVR1-HVR6은 루프 1에서 그리고 HVR7은 루프 2에서 존재한다. Crystal 및 그의 동료들 (WO 98/40509; US 6,127,525; US 6,153,435 참조)은 백본 벡터 (Ad5)의 전체 루프 1 및 2를 Crawford-Miksza et al. (1996)의 발견에 기초한 Ad2의 루프 1 및 2 (Gall et al. 1998)로 치환하였다. 또한 루프 2만 치환된 벡터가 만들어졌다. 생존성 바이러스가 생산되었다. Ad2 및 Ad5는 둘 다 서브그룹 C 아데노 바이러스이고 그리고 교차-중화는 두 루프의 치환 후에도 여전히 존재하는데, 이것은 적어도 교환이 동일한 서브그룹내에서 일어나지 않을 때, 그러한 교환이 야생형 아데노바이러스 헥손 단백질에 대한 중화 항체에 의해 인식될 수 있는 감소된 가능성 또는 불가능성을 갖을 벡터를 초래하지 않을 것을 가리킨다. 그러한 벡터를 얻기 위한 시도에도 불구하고, 그들은 또한 Ad5의 루프의 교환 그리고 Ad7의 루프로의 치환을 시도하였다. 이들 시도는 실패했고, 어떠한 생존성 바이러스도 생산되지 않았는데 이것은, 하나의 서브그룹에서 다른 하나로의 교환은 적어도 Crawford-Miksza에 의한 HVR's의 확인에 기초하여서는, 불가능했던 것을 나타낸다. 물론, 입수가능성 바이러스성 게놈 구조에 대한 지식으로, 필요한 유전적 변이는 전체 재조합체 (키메라) 바이러스를 코드화해야 하는 플라스미드/코스미드를 초래하는, 일반적인 분자 생물학 기술에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 불명확한 이유로, 그러나 대부분은 캡시드 제형에서 복합 헥손 구조 그것의 역할의 다소 비판적인 양상으로 인하여, 생존성 바이러스들은 헥손-코딩 영역이 변경될 때 얻어지지 않았다 (Rux et al. 2003). Gall et al. (1998)은 전체 헥손을 교환하는 대신에 외부 루프만을 교환하는 것을 제안하였다. 또한 펜톤과 같은 다른 캡시드 단백질이 Ad5-Ad2 교환에서의 실패를 설명하기 위한 분명한 중화 에피토프를 가질 것이라고 기재되어 있었다.

본 발명의 발명자들은 또한 Crawford-Miksza and Schnurr (1996)에 의해 안내되고, 그리고 추가로 Rux 및 Burnett (2000)에 의해 개요된 것처럼, Ad5 HVR's 대신에 Ad35 또는 Ad48의 HVR's를 포함하는 키메라 헥손 단백질을 지니는 Ad5에 기초하는 키메라 아데노바이러스의 생성을 시도하였다. 이러한 시도는 실패하였다. 이것은 역시, 다른 서브그룹으로부터의 헥손 부분들이 교환된, 재조합체 바이러스의 어떠한 생산도 보일 수 없었던, Crystal et al.의 발견 (윗 부분 참조)과 일치하였다.

이러한 문제와 맞서 싸우기 위해, Rux et al. (2003)은 이전에 발견된 Ad2와 Ad5 헥손 구조의 차이를 해결하기 위한 Ad2와 Ad5 헥손 구조로 이루어진 새로운 고-해상도 결정학적 정제(refinements)를 보였다. 이것은 헥손 단백질 내에서, 7 대신에 9 HVR's를 가르키는, 영역들의 새로운 정의를 이끌어내었다. Rux et al. (2003)은 또한 신규한 아데노바이러스-기초한 벡터의 고안시에 침범되지 않아야 하는 헥손 단백질의 부분을 확인하였다.

본 발명의 발명자들은 또한, Rux et al. (2003) 에 의해 제공된 정의에 기초하여, 교환된 HVR's를 갖는 키메라 헥손 단백질을 포함하는 키메라 아데노바이러스의 생성을 시도하였다. 그러나, 다시, 어떠한 생존성 바이러스도 생산될 수 없었다. 명백하게, 헥손 HVR's에 관한 당해분야에서 제공된 정의에 기초하여서는, 백본 벡터 및 다른 혈청형 사이, 적어도 다른 서브그룹들의 아데노바이러스 혈청형 사이에서 교환된 하나 이상의 HVR's를 갖는 재조합체 아데노바이러스를 생산할 수는 없었다.

본 발명의 발명자들은 이제, Crawford-Miksza and Schnurr (1996)에 의해 확인된 7 HVR's와 다르고 그리고 또한 Rux et al. (2003)에 의해 확인된 9 HVR's와 다른, 인간 아데노바이러스 내의 7 HVR's를 확인하였다. 본 발명에 따른 넓은 정의는 표 Ⅱ에서 나타나 있고, 반면에 훨씬 더 한정적인 정의는 표 Ⅳ에 제공된다. 이들 HVR's의 치환은 생존성 바이러스의 생산만을 초래한다. 본 발명자들이 알고 있는 한, 키메라 헥손 단백질을 포함하고 전체 루프가 교환되지 않지만 별개의 HVR's이 교환된 키메라 아데노바이러스를 생성시킬 수 있는 것은 이것이 처음이다. 또한 이것은 헥손들이 두 개의 다른 서브그룹으로부터의 아데노바이러스 혈청형으로부터의 부분들을 포함하는 키메라 헥손 단백질을 포함하는 재조합체 아데노바이러스를 얻는 최초의 성공적인 시도로 평가되었다. HVR's의 재-정의에 대한 기초적 개념은 접합(junction) 점들로서 보존된 아미노산을 사용하는 것이었다. 그럼에도 불구하고 N-, 및/또는 C-말단에 대한 하나 또는 두 개 또는 아마도 심지어 세개의 아미노산을 쉬프트함에 의해 생존성 벡터가 산출될 수 있었다는 점이 배제될 수는 없다. 그러나, 당해분야에서 이전에 제공된 정의는, 키메라 헥손을 가진 생존성 벡터를 제공하기에 충분하지 않았다. 그럼에도 불구하고 여기에서 제공된 정의는, 미세한(slight) 쉬프트가 또한 양호한 결과를 제공할 수 있는 것처럼, 너무 엄밀히 취해져서는 안된다 (표 Ⅳ와 비교하여 표 Ⅱ를 참조하라). 바람직하기는, 확인된 HVR 서열 (SEQ ID NO: 17-79 및 88-150으로서 나타낸)은 혈청형들 사이에서 교환된 영역들이다.

하나 이상의 HVR's를 포함하고, Ad35 (서브그룹 B) 또는 Ad48 (서브그룹 D)로부터 교환된, Ad5-기초한 벡터들은, 실시예에서 개시된 것처럼 구성되었다. 명백하게는, 하나 이상의 HVR's가 교환될 수 있다. NAbs가 HVR's의 어느 것에 대한 것 같으므로, 백본 벡터의 야생형 HVR's 대신에 희소한 혈청형으로부터의 모든 HVR's은 아니더라도, 대부분을 가지는 것이 바람직하다. 반면에, 그러한 대량 교환은 생존성 벡터를 생산함에 있어서 더 큰 어려움을 발생시킬 것이다. 여기서, 백본 벡터 (Ad5로 예시되는) 내의 모든 7개의 확인된 HVR's은 희소한 혈청형 (Ad48로 예시되는)의 7개의 상응하는 HVR's로 치환될 수 있다는 점이 이제 개시된다. 이것은 또한 표 Ⅳ의 HVR* 정의에 기초한 교환이 또한 생존성 바이러스를 초래할 것이라는 것을 제시한다.

HVR's들 사이의 스페이서 영역들은 바람직하게는 단백질의 적절한 폴딩을 확보하기 위해 백본 혈청형의 것으로 남아있다. 비록 다른-, Ad2와 같은 서브그룹 C로부터의 일반적으로 사용되고 그리고 널리 응용되는 혈청형이 또한 사용될 수 있으나, 바람직한 백본은 Ad5이다. HVR's가 교환될 때, 바람직하기는 적어도 하나, 더욱 바람직하기는 2, 더욱더 바람직하기는 3, 더욱더 바람직하기는 4, 더욱더 바람직하기는 5, 더욱더 바람직하기는 6 및 가장 바람직하기는 7 HVR's가 교환된다.

여기에서 개시된 대로 생성된 Ad5HVR35 및 Ad5HVR48 벡터는 항-Ad5 면역의 존재 하에서 재조합체 Ad5 벡터보다 실질적으로 더 면역원성인데, 이는 Ad5-감염된 개인에서 주로 Ad5의 헥손 단백질에 대한 NAbs가 더이상 Ad35 및 Ad48의 헥손의 HVR's을 통해 중화할 수 없기 때문이다. 이러한 특징은 Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49, Ad50로부터 선택될 수 있는 모든 공지의 희소한 혈청형으로부터 취해진 모든 HVR's에서 사실이다.

하기에 나타낸 것처럼, Ad5의 7 HVR's 대신에 Ad48의 모든 7 HVR's를 포함하는 Ad5HVR48 (1-7) 바이러스는, Ad5 바이러스의 미리-주입에 의해 유도된 미리-존재하는 면역성에 의해 방해받지 않는 바이러스를 초래한다. 이제 이것은 수많은 셋팅, 예를 들어 프라이밍 벡터와 부스팅 벡터 사이의 수용체 인식이 동일하게 남아 있을 것이 요구되는, 프라임-부스트 요법(regimens)에서 Ad5-기초한 벡터를 사용하는 것을 가능하게 한다. 다른 응용은 치료 전에 야생형 Ad5 감염과 맞섰던 개인에서 Ad5-기초한 벡터로 면역화 또는 치료학적 응용일 것이다.

여기에서 개시한 대로 HVR's의 정의에 기초하여, 백본 벡터와 다른 아데노바이러스 혈청형 사이에 수많은 조합이 이제 실행가능하다. 그 지식은 모든 공지의 인간 및 비-인간 아데노바이러스의 헥손들로 추정될 수 있다. 프라임-부스트 요법이 요구될 때마다 (Ad5-기초한 벡터가 요구되는 셋팅에서만 아니라), 여기에서 제공된 지식은 스텔스 용량, 즉 이미 응용된 바이러스에서 존재하는 헥손 HVR's에 대한 미리-존재하는 면역성의 우회를 갖는, 벡터를 구성하기 위해 응용될 수 있다. 여기에서 개시된 키메라 HVR 벡터는 추가로 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 변경될 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 예를 들어, 섬유는 특이적 표적화 능력 (예를 들어, 서브그룹 C에 기초한 벡터에 위치된, 서브그룹 B 바이러스로부터의 섬유 노브는 평활근 세포, 제1 섬유아세포, 수지상 세포, 등으로 표적할 수 있다)을 산출하도록 변경될 수 있다. 그러한 벡터의 예는 예를 들어 Ad48로부터의 HVR's 및 적어도 예를 들어 Ad35로부터 섬유 노브 (수용체 인식의 주 된 결정기)를 포함하는 Ad5 기초한 벡터일 것이다. 그러한 벡터는 모두, 그들의 HVR's에 대해 키메라인 헥손을 포함하는 아데노바이러스 벡터에 관한 본 발명의 범위 내의 것이다.

당업자는 이제 여기에서 제공된 지식으로, 다른 아데노바이러스로부터의 HVR's에 의해 치환되는 하나 이상의 HVR's을 갖는, 생존성 재조합체 복제 결함 아데노바이러스를 구성하고 그리고 생성할 수 있다. 더욱이, 여기서 제공된 HVR's의 서열은, 이제 이들 서열을 제거할 수 있게 하고 그리고 관심의 세포 (인 비보 및 인 비트로)로 아데노바이러스를 표적하기 위한 표적화 리간드, 인 비트로에서 추적(tracking) 아데노바이러스를 위한 방사성 결합 부위, 및 특정 B-세포 에피토프 (Worgall et al. 2005에 의해 기술된 바와 같이)와 같은, 다른 물질을 도입하기 위해 헥손 내에서 이들 위치를 사용할 수 있게 한다.

본 발명은 첫 번째 서브그룹으로부터의 혈청형에 기초한 재조합체 복제-결함 아데노바이러스의 배치(batch)에 관한 것으로, 상기 아데노바이러스는 키메라 헥손 단백질을 포함하고 상기 헥손 단백질은 상기 첫 번째 서브그룹의 혈청형으로부터의 서열 및 두 번째 서브그룹의 혈청형으로부터의 적어도 하나의 과변이영역 (HVR) 서열을 포함하고, 여기서 상기 첫 번째 및 두 번째 서브그룹은 동일하지 않다. 바람직하기는, 상기 첫 번째 서브그룹은 서브그룹 A, C, D, E, 또는 F이다. 상기 두 번째 서브그룹이 서브그룹 B 또는 D인 본 발명에 따른 배치가 또한 바람직하다. 가장 바람직하기는 상기 첫 번째 서브그룹이 서브그룹 C이고, 그리고 상기 서브그룹 C로부터의 혈청형이 Ad5이고, 그리고 상기 서브그룹 B 또는 D로부터의 혈청형은 Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49, 및 Ad50으로 이루어진 군에서 선택되는 배치이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 헥손 단백질은 상기 두 번째 서브그룹의 혈청형으로부터의 첫 번째 6 HVR 서열 (HVR1-HVR6), 또는 전체의 7 HVR 서열 (HVR1-HVR7)을 포함한다.

다른 바람직한 구현예에서, 상기 헥손 단백질은 HVR 서열들 사이에서 백본 바이러스의 아미노산 서열을 보유한다. 따라서, 여기에서 정의된 바와 같은, 하나 이상의 HVR 서열들은 결실되거나, 변이되거나, 링커에 의해 치환되거나 또는 다른 혈청형으로부터의 HVR 서열에 의해 치환될 수 있고, 매우 바람직하기는, HVR's를 연결하는 서열은 유지되고 그리고 변하지 않는다. 이것은 비-HVR 서열에 의해 제공된 그들의 헥손-백본 구조로 인하여 안정한 바이러스들을 생산할 수 있게 한다. 따라서 HVR 서열들 사이의 상기 서열들이 상기 첫 번째 서브그룹으로부터의 혈청형으로부터 유래되는 것이 바람직하다.

매우 바람직한 구현예에서, 본 발명은 첫 번째 서브그룹이 서브그룹 C이고, 상기 두 번째 서브그룹의 혈청형에서 적어도 하나의 HVR 서열은 SEQ ID NO: 24-79 및 SEQ ID NO: 95-150으로부터 선택되는 것인 본 발명에 따른 아데바이러스의 배치를 제공한다. 더욱더 바람직한 구현예에서, HVR1 서열은 SEQ ID NO: 17, 24, 31, 38, 45, 52, 59, 66, 및 73에서 선택되고, 상기 HVR2 서열은 SEQ ID NO: 18, 25, 32, 39, 46, 53, 60, 67, 및 74에서 선택되고, 상기 HVR3 서열은 SEQ ID NO: 19, 26, 33, 40, 47, 54, 61, 68, 및 75에서 선택되고, 상기 HVR4 서열은 SEQ ID NO: 20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69, 및 76에서 선택되고, 상기 HVR5 서열은 SEQ ID NO: 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 및 77에서 선택되고, 상기 HVR6 서열은 SEQ ID NO: 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71, 및 78에서 선택되고, 상기 HVR7 서열은 SEQ ID NO: 23, 30, 37, 44, 51, 58, 65, 72, 및 79에서 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, HVR1 서열 (HVR1*)은 SEQ ID NO: 88, 95, 102, 109, 116, 123, 130, 137, 및 144에서 선택되고, 상기 HVR2 (HVR2*) 서열은 SEQ ID NO: 89, 96, 103, 110, 117, 124, 131, 138, 및 145에서 선택되고, 상기 HVR3 (HVR3*) 서열은 SEQ ID NO: 90, 97, 104, 111, 118, 125, 132, 139, 및 146에서 선택되고, 상기 HVR4 (HVR4*) 서열은 SEQ ID NO: 91, 98, 105, 112, 119, 126, 133, 140, 및 147에서 선택되고, 상기 HVR5 (HVR5*) 서열은 SEQ ID NO: 92, 99, 106, 113, 120, 127, 134, 141, 및 148에서 선택되고, 상기 HVR6 (HVR6*) 서열은 SEQ ID NO: 93, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 142, 및 149에서 선택되고, 상기 HVR7 (HVR7*) 서열은 SEQ ID NO: 94, 101, 108, 115, 122, 129, 136, 143, 및 150에서 선택된다. 더욱 바람직하기는 표 Ⅱ에서의 HVR1 서열 또는 표 Ⅳ에서의 HVR1 서열에 의해 나타내어진 바와 같이, HVR1 서열은 백본 벡터로부터 결실된다. HVR1 영역을 결실하는 이유는, 아데노바이러스 헥손 단백질의 결정학적 구조에 따라서, HVR1의 플랭킹 (flanking) 서열들은 매우 인접해 있기 때문이며, 이것은 이들 플랭킹 서열들은 결실을 제외하고는, 구조의 손실 없이 직접적으로 연결될 수 있다는 것을 나타낸다. 다른 바람직한 구현예에서, 표 Ⅱ에서의 HVR2 서열 또는 표 Ⅳ에서의 HVR2 서열에 의해 나타내어진 HVR2 서열은 짧은 링커에 의해, 더욱 바람직하기는 2-아미노산 링커에 의해, 가장 바람직하기는 QG 링커에 의해 치환된다. 또한 HVR2 플랭킹 서열들은 결정학적 구조에 따라 인접한다. 그러나, 그들이 HVR1에서 보여지는 것보다 약간 더 떨어져 있으므로, 작은 가교 링커, 바람직하기는, 1, 2, 3, 또는 4 아미노산, 더욱 바람직하기는 2 아미노산의 링커를 포함하는 것이 바람직하다. 헥손으로부터의 HVR's 제거는 HVR's에 의해 제시되는 면역원성 결정기에 대한 NAbs에 의한 공격을 방지하는 이상적인 해결책이 될 수 있을 것이다. 그러나, 결정학적 구조의 관점에서, 캡시드 포메이션에서 그것의 전체적 구조 및 따라서 가능하게는 그것의 기능 및 역할의 파괴 없이 헥손 단백질으로부터 HVR3-7을 제거하는 것이 실행가능한 것으로 보이지 않는다.

비록 Ad24의 헥손이 또한 그것의 HVR's에 바람직하지만, 이러한 특이적 "희소한" 혈청형의 헥손 단백질의 서열은 출원 당시의 본 발명자들에게 알려져 있지 않았다. 그럼에도 불구하고, 여기에서 제공된 교시로, 당업자는 이제 바람직한 혈청형 Ad24를 포함하는, 어떠한 아데노바이러스 헥손 단백질 내에서 HVR's를 결정할 수 있다. Ad24의 HVR's의 어느 것의 사용은 또한 본 발명의 일부이다.

본 발명은 또한, 헥손이 추가로 서브그룹 A, C, D, E, 또는 F로부터의 아데노바이러스로부터의 서열을 포함하는 키메라 헥손 단백질의 구조에서 서브그룹 B로부터의 인간 아데노바이러스 혈청형의 헥손의 적어도 하나의 HVR 서열을 코드화하는 단리된 핵산의 사용에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은, 헥손이 추가로 서브그룹 A, B, C, E, 또는 F의 아데노바이러스로부터의 서열을 포함하는 키메라 헥손 단백질의 구조에서 서브그룹 D로부터의 인간 아데노바이러스 혈청형의 헥손의 적어도 하나의 HVR 서열을 코드화하는 단리된 핵산의 사용에 관한 것이다. 바람직하기는, 적어도 하나의 HVR 서열이 SEQ ID NO: 24-79 및 95-150으로부터 선택된다.

표 Ⅲ은 본 발명의 다양한 구현예를 요약한다. 상기 표는 혈청형 X의 펜톤 및 헥손 단백질을 포함하는 백본 아데노바이러스에 기초한 키메라 복제 결함 아데노바이러스로에 관한 것으로, 여기서 헥손 단백질에서 n HVR's는 혈청형 Y의 것이고, 추가로 혈청형 F의 테일과 쉐프트 및 혈청형 K의 노브를 포함하고, 여기서:

- X는 인간 아데노바이러스 1-51, 원숭이-, 개-, 양-, 돼지-, 및 소 혈청형으로 이루어진 군에서 선택되는 아데노바이러스 혈청형이고;

- Y는 인간 아데노바이러스 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 및 50으로 이루어진 군에서 선택되는 아데노바이러스 혈청형이고, 여기서 X 및 Y는 동일하거나 또는 다를 수 있고, 그리고 n은 0 내지 7의 HVR's의 수를 나타내고, 단 X≠Y라면, n=1-7이고;

- F는 인간 아데노바이러스 1-51, 원숭이-, 개-, 양-, 돼지-, 및 소 혈청형으로 이루어진 군에서 선택되는 아데노바이러스 혈청형이고, 여기서 F, X 및 Y는 동일하거나 또는 다를 수 있고; 그리고

- K는 세포 수용체로서 CAR을 주로 사용하는 아데노바이러스 혈청형이고, 여기서 K, F, X 및 Y는 동일하거나 또는 다를 수 있다.

백본 아데노바이러스 벡터는 인간에서의 사용에 응용가능한 모든 아데노바이러스 (그것이 통상의, 비-패키징, 세포에서 복제하지 않도록 재조합체로 만들어진)일 수 있다. 6 서브그룹 A, B, C, D, E, 및 F 내에서 공지된 어떠한 인간 아데노바이러스 (혈청형 1-51), 뿐만 아니라 공지된 원숭이-, 개-, 소-, 양-, 및 돼지- 아데노바이러스는, 그것이 복제-결함이고 그리고 인간 치료에 응용가능한, 백본 벡터로서 사용될 수 있다. 백본 벡터는 E1 영역의 적어도 하나의 기능적 부분의 결실에 의해, 바람직하기는 전체 기능적 E1 영역의 결실에 의해, 복제-결함이다. 비록 백본 벡터는 전형적으로 다른 초기 및 후기 영역을 포함하지만, 당업자는 다른 수단, 예를 들어 헬퍼 (helper) 바이러스로 보충을 통해 또는 그것이 그것의 게놈에 안정하게 통합된 요구되는 핵산을 포함하도록 형질 전환된 패키징 세포를 갖는 것에 의해, 특정 요구되는 아데노바이러스 단백질을 보충하기 위한 당해분야에서 제공된 가능성을 잘 숙지하고 있다. 전형적으로 본 발명의 바이러스는 E1 영역 또는 E3 영역, 또는 둘 다에 클론될 수 있는 관심의 이종성 핵산을 위한 공간을 제공하기 위해 E1 결실, 그리고 바람직하기는 또한 E3 결실된 아데노바이러스 게놈을 포함한다. E2, E4과 같이 남아 있는 영역, ITR's 및 후기(late) 영역은, 비록 이들이 패키징 세포에서 생산 동안에 별도로 보충될 수 있더라도, 일반적으로 존재한다. 벡터는 바람직하기는 WO 03/104467에서 개시된 것처럼, 패키징 세포주 (line)에 존재하는 E1B-55K 단백질과 양립 가능한 E4orf6 영역 (가능하게는 다른 혈청형으로부터)을 포함한다. 이것은, 재조합 벡터가 그러한 세포내에 존재하는 Ad5의 E1B-55K와 양립가능하지 않은 원래의 E4orf6 영역을 가질 때, PER.C6^® 세포 또는 293 세포와 같은 공지된 패키징 시스템상에서의 생산을 가능하게 하기 위해 행해진다.

백본 혈청형은 상기에서 'X'로 나타내어졌다. 더욱이, 백본 바이러스는 그것이 인간 Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49, Ad50 (혈청형 'Y'로 표시되는)으로부터 선택된 하나 이상의 아데노바이러스 혈청형으로부터의 HVR's를 포함하도록 조작(engineered)될 수 있다. 명백하게는, X가 Y 혈청형 중 하나 일 때, HVR's는, 이들 혈청형이 "희귀한" 것으로 여겨지고 그리고 인간 개체군에서 대부분의 개인에서 단지 낮은 미리-존재하는 면역성과 맞서므로, 설계될 필요는 없다. 따라서, X가 Y 혈청형 중 하나 일 때, 교환된 HVR's의 수 ('n'에 의해 표시되는 숫자)는 0일 수 있지만, 또한 1-7일 수 있고, 반면에 X가 Y 혈청형 중 하나가 아닐 때, 적어도 하나의 HVR's는 Y 혈청형으로부터 유래되고, Y 혈청형으로부터의 더 많은 HVR's를 갖는 것이 더욱 바람직하고, 그리고 Y 혈청형으로부터의 상응하는 영역에 대해 교환된 모든 7 HVR's를 갖는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 백본 바이러스는 백본 바이러스와 동일한 혈청형의 펜톤 단백질을 포함한다. 백본 바이러스는 헥손이 키메라 (교환된 또는 치환된 하나 이상의 HVR's를 갖는)인 의미로 및/또는 섬유 단백질이 키메라인 의미로 및/또는 섬유 단백질이 백본 바이러스와 다른 혈청형으로부터 유래된 의미로 '키메라'이다. X=Y=F=K, 예를 들어 재조합체 Ad48 벡터가 Ad48이 CAR과 결합하므로, 존재 가능하다. 그러나, 그러한 벡터는, n=0일 때, 상기 기술한 것과 같은 의미로 '키메라'는 아니다. 비-키메라 재조합체 Ad11, Ad34, Ad35 및 Ad50은, 섬유 노브가 항상, 이들 B-서브 그룹 바이러스는 결합하지 않는 CAR과 우선적으로 결합하는 혈청형으로부터 항상 유래되어야 하므로 상기 주어진 정의의 범위 내가 아니다.

섬유는 'F'로서 표시되는 혈청형으로부터 유래되는데, 혈청형 F로부터의 테일을 포함하고, 혈청형 F로부터의 쉐프트를 포함하고 그리고 'k'로서 표시되는 혈청형 유래의 노브를 포함한다. 명백하게는 K가 F와 동일한 혈청형일 때, 섬유 단백질은 키메라가 아니다. K는 우선적으로 CAR 수용체와 상호작용하는 혈청형이고 그리고 K는 X와 동일하거나 또는 다른 혈청형 일수 있다. 명백하게는, 서브그룹 B로부터의 혈청형과 같은, 특정 인간 혈청형은 우선적으로 CAR과 상호작용하지 않지만, 바람직하기는 CD46과 같은 다른 세포 수용체와 상호작용한다. 그래서 K가 X와 동일 할 때, X는 서브그룹 B 아데노바이러스 중 하나가 아니다. 또한, K가 F와 다른 혈청형일 때 (그리고 따라서 섬유는 키메라일 때), 캡시드 내의 펜톤과 상호작용하는 테일의 적어도 일부가 혈청형 X에서의 것이어서, 그것이 적절하고 안정한 캡시드 형성을 초래할 것이다. 공지된 아데노바이러스의 캡시드 단백질-코드화 유전자의 대부분이 이제 당해분야에서 입수가능하므로, 그것은 모든 공지된 및 발견되어질 아데노 바이러스를 위한 테일, 쉐프트 및 노브 영역을 확인하는 것은 당업자의 기술 범위 내이다.

본 발명에 따른 키메라 복제-결함 아데노바이러스의 예는 다음과 같으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다:

도 1(A)는 미국, 아이티, 보츠와나, 잠비아 및 남아프리카에서의 시료에서 Ad5, Ad11 및 Ad35의 혈청학적 유병율의 백분율을 나타내고; (B)는 미국에서의 시료 및 아프리카에서의 시료에서 Ad5, Ad11 및 Ad35에 대한 중화 항체 역가 (titer)를 나타낸다. 도 1C는 이들 시료에서 Ad5, Ad5f35, Ad5f35p35, Ad35f5 및 Ad35에 대한 중화 항체 역가를 나타낸다.

도 2(A)는 Ad35k5 섬유 단백질을 코드화하는 핵산 서열 (SEQ ID NO: 1; Ad5 섬유 노브를 코드화하는 부분이 밑줄쳐있음)을 나타내고; (B)는 Ad35k5 섬유 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 2; Ad5 섬유 노브를 나타내는 부분이 밑줄쳐있음)을 나타내고; (C)는 Ad35f5 섬유 단백질을 코드화하는 핵산 서열 (SEQ ID NO: 4; 남아있는 Ad35 섬유 단편을 코드화하는 부분이 밑줄쳐있고, 반면에 BsiWI 코팅 부위는 소형 대문자 (small caps)로 나타내었다)을 나타내고; (D)는 Ad35f5 섬유 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 5; Ad35 섬유 단편을 나타내는 부분이 밑줄쳐있음)을 나타내고; (E)는 Ad35k26 섬유 단백질을 코드화하는 핵산 서열 (SEQ ID NO: 80; Ad26 섬유 노브를 코드화하는 부분이 밑줄쳐있음)을 나타내고; (F)는 Ad35k26 섬유 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 81; Ad26 섬유 노브를 나타내는 부분이 밑줄쳐있음)을 나타내고; (G)는 Ad35k49 섬유 단백질을 코드화하는 핵산 서열 (SEQ ID NO: 82; Ad49 섬유 노브를 코드화하는 부분이 밑줄쳐있음)을 나타내고; (H)는 Ad35k49 섬유 단백질을 코드화하는 핵산 서열 (SEQ ID NO: 83; Ad49 섬유 노브를 나타내는 부분이 밑줄쳐있음)을 나타낸다.

도 3은 나이브(naive) 마이스에 SIV gag-코드화 유전자를 지닌 Ad5, Ad35fib5.BSU, Ad35.BSU 및 Ad35 벡터의 주입시에 SIV gag에 대해 유도된 T 세포 반응을, 빈(empty) 벡터 (Ad5.결여 및 Ad35.결여)가 주입된 마이스와 비교하여 나타낸다. y-축은 SFC/10⁶ 비장림프구 (splenocytes)를 나타낸다.

도 4는 10⁹ vp (A) 및 10⁸ vp (B)의, 또는 각각의 벡터의 10¹⁰vp로 면역화하기 전에 10¹⁰vp Ad5-결여의 1회 (C) 또는 2회 (D) 주입으로 미리-면역화된, 나이브 마이스에서 SIV Gag를 발현하는 Ad5, Ad35k5, 및 Ad35 벡터의 면역원성을 나타낸다. 모든 경우에서, Gag-특이적 CD8⁺ T 림프구 반응은 하기의 면역화의 다중 시점에서 D^b/AL11 4량체 결합 분석에 의해 평가되었다.

도 5는 마이스에서 Ad35k5 벡터에 의해 도출되는 항-벡터 면역을 보인다. (A) 나이브 C57/BL6 마이스는 0주에 10⁹ vp Ad35k5-Gag로 프라임(prime)되었고 4주에 10⁹ vp Ad5-Gag 또는 Ad35-Gag로 부스트(boost)되었다. (B) 10⁹ vp Ad5-Gag, Ad35k5-Gag, 또는 Ad35-Gag가 주입된 마이스로부터의 혈청 시료는 Ad5 및 Ad35 루시페라아제-기초한 바이러스 중화 분석에서 평가되었다.

도 6은 마이스에서 HIV-I Env를 발현하는 Ad5, Ad35k5, 및 Ad35 벡터의 면역원성을 보인다. 나이브 Balb/c 마이스들은 10⁸ vp Ad5-Env, Ad35k5-Env, 또는 Ad35-Env로 면역화되었다. (A) Env-특이적 세포성 면역 반응은 모아진 펩티드 및 M110 에피토프 펩티드-특이적 IFN-γELISPOT 분석에 의해 평가되었다. (B) Env-특이적 체액성 면역 반응은 ELISA에 의해 평가되었다.

도 7은 0주에 10¹¹ vp Ad5-Gag(A, B), Ad35-Gag (C, D), Ad35k5-Gag (E, F)로 프라임된 레서스 원숭이에서 Ad5, Ad35k5, 및 Ad35 벡터의 면역원성을 나타낸다. 12주에, 모든 원숭이들은 동종성 부스트 면역화를 받았다. Env- 및 Gag-특이적 세포성 면역 반응은 하기의 면역화 (A, C, E)에서 다중 시점에서 모아진 펩티드 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 평가되었다. 벡터-특이적 NAb 역가는 Ad5 및 Ad35 바이러스 중화 분석 (B, D, F)에 의해 평가되었다.

도 8은 도 7에서 기술된 연구에서 원숭이들에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 림프구 반응을 나타낸다. 모아진 펩티드 IFN-γ ELISPOT 분석은 하기의 면역화에서 16주에 원숭이로부터 CD8-감손된 (depleted) 및 CD4-감손된 PBMCs를 사용하여 수행되었다. 원숭이들은 0주 및 12주에 10¹¹ vp (A) Ad5-Gag, (B) Ad35-Gag, 또는 (C) Ad35k5-Gag를 받았다.

도 9는 (A) 10⁹ vp, (B) 10⁸ vp, 또는 (C) 10⁷ vp를 받은 나이브 마이스에서 Ad5-Gag, Ad5HVR48(1)-Gag 및 Ad5HVR48(1-7) 벡터의 면역원성을 나타낸다. Gag-특이적 CD8⁺ T 림프구 반응은 하기의 면역화에서 다중 시점에서 D^b/AL11 4량체 결합 분석에 의해 평가되었다.

도 10은 (A) 10⁹ vp, (B) 10⁸ vp, 또는 (C) 10⁷ vp를 받고, 면역화되기 8 및 4 주 전에 10¹⁰ vp Ad5-결여의 2회 주입으로 미리-면역화된 마이스에서 Ad5-Gag, Ad5HVR48(1)-Gag 및 Ad5HVR48 (1-7) 벡터를 나타낸다.

도 11은 Ad48 (Ad5HVR48 (1-7))로부터 상응하는 7 HVR's을 위한 7 HVR's의 병합 (밑줄침)을 가진, Ad5-기초한 헥손 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 12)을 나타낸다.

도 12는 Ad35 (Ad5HVR35 (1-7))로부터의 상응하는 7 HVR's을 위한 7 HVR's의 병합(밑줄침)을 가진, Ad5-기초한 헥손 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 13)을 나타낸다.

도 13은 Ad11 (Ad5HVR11 (1-7))로부터의 상응하는 7 HVR's을 위한 7 HVR's의 병합(밑줄침)을 가진, Ad5-기초한 헥손 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 14)을 나타낸다.

도 14는 Ad26 (Ad5HVR26 (1-7))로부터의 상응하는 7 HVR's을 위한 7 HVR's의 병합(밑줄침)을 가진, Ad5-기초한 헥손 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 15)을 나타낸다.

도 15는 Pan9 아데노바이러스 (Ad5HVRPan9 (1-7))로부터의 상응하는 7 HVR's을 위한 7 HVR's의 병합 (밑줄침)을 가진, Ad5-기초한 헥손 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 16)을 나타낸다.

도 16은 백그라운드 세팅 (감염 없음, 그래프 1°& 2˚Ab)에서 Ad35k5 (두 개의 배치: #4, #5), Ad35k26 (두 개의 배치: #3 두 번, #28) 및 Ad35k49 (세 개의 배치: #4, #5, #9)로 감염 후, 세포내 gag-염색을 나타낸다.

도 17은 표 Ⅳ에 정의된 것처럼 HVR1 서열이 결실되고, 표 Ⅳ에 따른 HVR2 서열이 QG 링커로 치환되고 그리고 표 Ⅳ의 정의에 따른 HVR3-HVR7이 Ad5 및 Ad48사이로 치환된, Ad5HVR48 (1-7)* (SEQ ID NO:84)에서 헥손 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 18은 도 17에서와 같이, 이제 Ad5HVR35 (1-7)* (SEQ ID NO:85)에 관한 것이다.

도 19는 도 17에서와 같이, 이제 Ad5HVR26 (1-7)* (SEQ ID NO:86)에 관한 것이다.

도 20은 도 17에서와 같이, 이제 Ad5HVR49 (1-7)* (SEQ ID NO:86)에 관한 것이다.

도 21은 Ad5-결여로 이중 미리-면역화 후에 뒤이어, 0일에 Ad35-Gag로 프라이밍 그리고 28일에 지시된 바와 같은 다른 3개의 벡터로 부스트한 후에, CD8⁺ T-림프구 반응을 나타내는 그래프이다.

실시예 1. Ad5 , Ad35 , 및 Ad11 에 대한 국제적 혈청항적 보유율 및 NAb 역가

Ad-특이적 중화 항체 (NAb) 반응은 Sprangers et al. (2003)에 의해 기술된 것처럼 일반적으로 루시페라제-기초한 바이러스 중화 분석에 의해 평가되었다. 간략히, A549 인간 폐 암종 세포는 96-웰 플레이트에서 웰 당 I×IO⁴의 밀도에서 플레 이트되었고 그리고 200μl 반응 부피로 혈청의 2-배 연속 희석된 500의 감염 다중도(moi)로, E1-결실된, 복제-부전 (incompetent) Ad-루시페라제 리포터 구조물로 감염되었다. 다음으로 24시간 배양 후, 세포내에서 루시페라제 활성을 Steady-Glo Luciferase Reagent System (Promega)를 사용하여 측정하였다. 90% 중화 역가는 루시페라아제 활성을 90% 중화한 최대 혈청 희석으로서 정의되었다.

WO 00/70071에 개시된 연구에 더하여, 실험은 개발도상국에서 혈청학적 보유율 및 Ad5 및 대안의 Ad 혈청형에 대한 NAb 역가를 평가하기 위해 수행되었다. Sprangers et al. (2003)으로부터의 루시페라아제-기초한 바이러스 중화 분석은 미국 (N=19), 아이티 (N=67), 보츠와나 (N=57), 잠비아 (N=29), 및 남아프리카 (N=59)에서의 건강한 성인으로부터 얻어진 혈청 시료를 사용함에 의해 응용되었다. 도 ⅠA에서 나타낸 것처럼, 미국에서 Ad5 혈청학적 보유율은 상대적으로 낮은 중앙 (median) 역가를 갖는 50%였다. 대조적으로, 아이티에서 혈청학적 보유율은 82%, 보츠나와에서 93%, 잠비아에서 93%, 그리고 남아프리카에서는 88%였다. 더욱이, 이들 시료에서 중앙 Ad5-특이적 NAb 역가는 미국에서 발견된 중앙 역가보다 10-배 더 높았다 (도 ⅠB). 이들 데이터는 이전의 연구물 (Kostense et al. 2004; Vogels et al.)을 확장시키고 그리고 Ad5-특이적 NAbs가 거의 보편적이고 그리고 개발 도상국에서도 높은 역가를 나타낸다는 것을 입증한다. 대조적으로, Ad11 및 Ad35 혈청학적 보유율 및 역가는 이들 인간 개체군에서 상당히 낮았다.

실시예 2. Ad5 -특이적 중화 항체의 면역 우세적 표적

이전 실시예에서 개요된 시료들은 추가로 미국 및 사하라 사막 이남부 아프 리카 두 곳에서 Ad5-특이적 NAbs의 우세적인 항원성 표적을 결정하기 위해 이용되었다. Ad5 및 Ad35 사이의 검출 가능한 NAb 교차-반응성의 부족이 주어지고, 표적으로써 루시페라아제를 발현하는 캡시드 키메라 Ad5/Ad35 바이러스가 바이러스 중화 분석에서 사용되었다. 이들 벡터는, 바이러스 입자와 야생-형 성장 키네틱을 가진 본래대로의 바이러스 입자에 관해서 (Havenga et al. 2002; Rea et al. 2001) Ad5 및 Ad35 헥손, 펜톤, 및 섬유 단백질의 다양한 조합으로 이루어져 있다. 이러한 연구에 사용된 키메라 벡터는 Ad5f35 (Ad35 섬유 노브, -쉐프트 및 Ad35-Ad5 키메라 테일을 포함하는 Ad5), Ad5f35p35 (Ad35 섬유 및 -쉐프트, Ad35-Ad5 키메라 테일 및 펜톤을 포함하는 Ad5), 및 Ad35f5 (Ad5 섬유 노브, -쉐프트 및 Ad5-Ad35 키메라 테일을 포함하는 Ad35)를 포함했다.

도 1C에 나타낸 것처럼, 비교가능한 NAb 역가는 모두 Ad5에 기초한; Ad5, Ad5f35, 및 Ad5f35p35에 대하여 관찰되었다. Ad5f35p35 벡터의 캡시드는 Ad5 헥손 그러나 Ad35로부터 유도된 섬유 및 Ad35로부터 유도된 펜톤을 포함하기 때문에, 이들 데이터는 대부분의 Ad5-특이적 NAb 활성이 Ad5 헥손에 대한 것임을 제시한다. 더 낮지만 명백히 검출 가능한 역가 또한 재조합체 Ad35f5 (여기에서 또한 Ad35fib5로 언급됨)에 대하여 측정되었는데, 이는 Ad5 섬유-특이적 NAbs는 이들 시료에서 헥손-특이적 Nabs보다 5- 내지 10-배 더 낮은 역가에서 나타낸다는 것을 입증하는 것이다. 이들 바이러스를 사용하여 어떠한 Ad5 펜톤-특이적 MAbs도 측정되지 않았으나, Ad5f35 및 Ad5f35p35에 대해 유사한 NAb 역가는 펜톤-특이적 NAbs가 이러한 중화에서 비교적 사소한 역할을 한다는 것을 제시하였다.

실시예3 . Ad35f5 및 Ad35k5 의 발생

재조합체 Ad35-기초한 백신은 항-Ad5 면역의 존재 하에서 면역원성이다. 그러나, 재조합체 Ad35 백신은 항-Ad5 면역의 부재하에서 재조합체 Ad5 백신보다 본질적으로 덜 면역원성이다 (Barouch et al. 2004). 이러한 문제는 이제 적어도 Ad35 섬유 노브가 Ad5 섬유 노브로 치환된 캡시드 키메라 재조합체 Ad35 벡터 (노브 치환에 대하여는 Ad35k5로 그리고 대부분의 섬유 치환에 대하여는 Ad35f5로 언급되는)를 구성함에 의해 극복되었다.

재조합체 Ad35k5 벡터는 Ad35 섬유 단백질-코드화 유전자를 Ad5 섬유 노브 (아미노산 133-314)에 연결된 Ad35 섬유 테일 및 쉐프트 (아미노산 1-132)로 이루어진 키메라 섬유 단백질-코드화 유전자로 치환함에 의해 생산되었다. Ad5 섬유-특이적 항체는 재조합체 Ad5 백신 면역원성을 둔화 (blunt)시키지 않는다. Ad35 섬유 노브는 CAR과 상호작용하지 않는데, 이는 그것이 서브그룹 B 아데노바이러스이지만 (Roelvink et al. 1998) 대신에 그것의 수용체로써 CD46을 이용하기 때문이다 (Gagger et al. 2003). 다른 섬유 단백질은 이들 바이러스를 다른 세포내 트래피킹 경로로 향하게 한다. 이전의 연구는 Ad5 섬유 노브는, 핵으로 바이러스 게놈의 효과적인 전좌를 이끄는, 초기 엔도좀으로부터 사이토졸으로의 빠른 바이러스 이탈을 촉진하는데 반하여, Ad11 및 Ad35를 포함하는 아과 B 아데노바이러스로부터의 섬유 노브는, 후기 엔도좀에서의 바이러스 입자의 보류 및 세포 표면으로 되돌아가는 큰 분획 (fraction)의 재순환을 이끈다 (Shayakhmetov et al. 2003).

Ad35k5 벡터를 코드화하는 재조합체 핵산의 클로닝은 다음과 같았다. Ad5 섬 유 노브를 코드화하는 영역이 PCR에 의해 합성되었고 그리고 Ad35 섬유 노브를 코드화하는 상응하는 영역을 치환하기 위해 BsiWI-Nhel 단편으로서 pBR.Ad35.PacI-rITR.dE3 플라스미드 (=pBR .Ad35 .PRnΔE3, WO 2004/001032)으로 클로닝되었다. pWE.Ad35.pIX-EcorV (WO 2004/001032) 코스미드 및 SIVmac239Gag 유전자를 포함하는 아답터 플라스미드 pAdApt35-SIBGag와 함께 돌연변이체 pBR.Ad35k5.PacI-rITR.dE3 플라스미드는 그리고 나서 PER.C6/55k 세포로 공-트랜스펙션되었고 (WO 00/70071 및 WO 02/40665 참조), 그리고 이중 동종성 재조합은 재조합체 Ad35k5-SIVGag 벡터를 산출하였다. 이 벡터는 플라크-정제되었고, 서열화되었고, 확장되었고, 그리고 당업자에게 알려진 일반적인 정제 방법론에 따라서, CsC1 구배 원심 분리로 정제되었다. 키메라 섬유의 뉴클레오티드 서열은 도 2A에 나타내었고 (SEQ ID NO: 1), 아미노산 서열은 도 2B에 나타내었다 (SEQ ID NO: 2).

Ad35f5 벡터는 전형적으로 WO 00/70071에서 Ad35fib16으로 개요된 것처럼, 그리고 WO 00/03029에서 개요된 것처럼 Ad5fibXX 키메라로 만들어졌고; 여기서 Ad5 섬유 쉐프트에 연결된 Ad5 섬유의 부분적 테일을 코드화하는 PCT 생산물 및 Ad5 섬유 노브는 Ad35 섬유 테일의 잔여부 상에 위치되었다. 클로닝 절차는 또한 E3 결실된 백본 벡터를 사용하고 그리고 제한/클로닝 부위로서 BsiWI 및 Nhel을 사용하여 수행되었다. 벡터에 대한 세부 사항은 WO 03/104467 및 WO 2004/001032를 참조하라.

구체적으로, 하기의 절차들은 pBr/Ad35 .PacI-rITRfib5를 구성하기 위해 수행되었다: PCR은 플라스미드 pBr/Ad35 .PacI-rITRNotI (= pBr/Ad35.PRn, WO 2004/001032 참조) 상에서 BamHI 및 BsiWI 부위를 포함하는 프라이머 DF35-1: 5'-CAC TCA CCA CCT CCA ATT CC-3' (SEQ ID NO: 6) 및 DE35-2: 5'- CGG GAT CCC GTA CGG GTA GAC AGG GTT GAA GG-3' (SEQ ID NO: 7)로 수행되었다. 이 PCR은 섬유 35 테일 영역에서 출발하고, 두 BsiWI 부위 및 BamHI 부위가 도입됨에 의해, 대략 650 bp의 DNA 단편을 생성하였다. 다음으로, PCR은 플라스미드 pBr/Ad35.PRn 상에서 BamHI 및 NheI 부위를 포함하는 프라이머 DF35-3: 5'- CGG GAT CCG CTA GCT GAA ATA AAG TTT AAG TGT TTT TAT TTA AAA TCA C-3' (SEQ ID NO: 8) 및 DE35-4: 5'-CCA GTT GCA TTG CTT GGT TGG- 3' (SEQ ID NO: 9)로 수행되었다. 이 PCR은, 섬유 35의 정지 코돈 후에서 시작하여 E4 영역으로, 대략 1400 bp의 DNA 단편을 생성했다. pBr/Ad35.PRn은 MIuI 및 NdeI로 소화되어, Ad35 백본으로부터 2850 bp DNA 단편이 제거되었다 (따라서 섬유 35 영역의 대부분을 제거). DF35-1 + DF35-2로부터의 PCR 단편은 MIuI 및 BamHI로 소화되었고 그리고 DF35-3 + DF35-4로부터의 PCR 단편은 BamHI 및 Ndel로 소화되었다. 두 PCR 단편들은 절단된 pBr/Ad35PRn 플라스미드로 결찰되어, pBr/Ad35PRndFIB 구조물을 생성하였다. 그 후, 새롭게 도입된 BsiWI 및 NheI 부위는, Ad35 백본으로 Ad5 섬유 서열을 도입하기 위해 사용되어, 주형으로써 Ad5 DNA 상에서 프라이머 35F5-5-F: 5'-CGG GAA CGT ACG ACA CGG AAA CCG GTC CTC C-3' (SEQ ID NO: 10) 및 35F5-R: 5'-CGG CTA GCT AGC TTA TTC TTG GGC AAT GTA TGA AA-3' (SEQ ID NO: 11)을 생성하였다. 그 후, E3 영역은 de pBr/Ad35PRNdE3 구조물에 대해 수행된 것처럼 결실되었다.

당업자는 분자 클로닝 및 아데노바이러스 생산에 관한 일반 공지의 지식을 응용함에 의해, 이들 클론을 생성시킬 수 있고, 단편을 삽입할 수 있고, PCR 생산물을 생성시킬 수 있고 그리고 특정 단편들을 결실시킬 수 있고 그리고 결국 패키징 세포주에서 바이러스를 생산할 수 있을 것이다. 더욱이, 인 비보 및 인 비트로에서 사용될 수 있는 아데노바이러스 배치를 얻기 위한 생산 및 정제 방법은 또한 당해분야에서 잘 알려져 있다.

여기에서 논의된 모든 벡터들은 일반적인 CsC1 정제 방법을 사용하여 얻어졌고 그리고 PER.C6/55K 패키징 세포주 상에서 적어도 5 계대 이상 안정함이 확인되었다 (데이터는 나타내지 않음). Ad35k5 벡터들의 성장 속도 및 산출은 모 Ad35 벡터들과 필적할 만했다 (데이터는 나타내지 않음). 그러나, 플라크-형성 유니트(pfu)에 대한 바이러스 입자(vp)의 비율은 대략적으로, Ad35 벡터 (10-100)와 비교하여 Ad35k5 벡터 (100-1000)에 대해 10-배 높았다.

또한 벡터가 여전히 그들의 천연적인- 또는 치환된 섬유 노브 (CAR과 결합하는 Ad5 섬유 및 CD46과 결합하는 AD35 섬유)를 통해 그들 개개의 수용체를 인식할 수 있는지에 대해 조사되었다. 이들 특이적 상호작용은 여전히 원 Ad5 및 Ad35 기초한 벡터 뿐만 아니라 키메라 벡터로 확립되었다 (데이터는 나타내지 않음).

동일한 전략에 따라, 키메라 복제-결함 Ad35-기초한 바이러스가 Ad26 또는 Ad49의 노브를 포함하게 만들어졌다. 이들 바이러스는 Ad35k26 및 Ad35k49로 명칭되었고 그리고 백본 벡터의 캡시드 내에 존재하는 헥손 단백질과 조합하여, 여기에서 Ad35에 의해 예시되는 또한 희소한 혈청형인, 희소한 혈청형 Ad26 및 Ad49의 섬유 노브의 CAR-결합 능력을 사용한다. 각각의 Ad35k26 및 Ad35k49 키메라 섬유를 나타내는 핵산 및 아미노산 서열이 도 2E-2H로써 주어진다.

Ad35k5, Ad35k26 및 Ad35k49 바이러스는 인 비트로에서 트랜스유전자 발현을 제공하기 위한 그들의 능력과 비교되었다. 모든 벡터는 SIVGag 트랜스 유전자를 지녔다. 7.5×10⁴ A54 9 세포들은 마스터 바이러스 종자 스탁 바이러스 (바이러스의 농도는 알려지지 않음)로 2ml 부피로 2 시간 동안 감염시켰다. 세포들은 그 후 세척되었고 그리고 48시간 동안 배양되었다. Gag 염색 (staining)은 유동 세포 계수에 의한 분석이 뒤따르는 2F12 항-p27 단일 항체를 사용하여 세포내 염색에 의해 평가되었다. 이 실험의 한계는 특정 수의 바이러스 입자가 사용되지 않아서, Ad35k49가 다른 것보다 더 높은 역가로 증식하는지 또는 그것이 더 높은 특이적 활성을 갖는 것인지에 대해 명확하게 결론지을 수 없다. 어쨌든, 이 벡터들은 다른 벡터들보다, 복제/성장에 있어서 또는 발현 수준에 있어서도 확실한 이점을 갖는 것으로 보인다. 도 16은 Ad35k49의 3개의 대표적인 배치는 Ad35k5 및 Ad35k26의 대표적인 배치와 비교하여 상당히 더 높은 세포내 발현을 보였다는 것을 나타낸다. 재조합체 아데노바이러스 벡터 Ad35k49는 본 발명의 바람직한 구현예이다.

패키징 세포 상에서 아데노바이러스 벡터의 우수한 생산을 위해, 패키징 세포의 게놈에서 그것의 유전자의 안정한 통합에 의해 일반적으로 이용가능한, E1B-55k 단백질은, 바이러스 벡터의 E4 영역에 의해 생산된 E4orf6 단백질과 양립가능해야만 한다는 것이 당해분야에서 인식된다. Ad35의 E4orf6 단백질이 293 세포 및 PER.C6^® 세포와 같은 공지된 패키징 세포에서 일반적으로 이용가능한 E1B-55K 단백 질과 양립가능하지 않다는 것은 이미 확인되었다 (WO 03/104467; WO 2004/001032; WO 2004/018627; WO 95/34671 참조). 게놈에 통합된 Ad35로부터 E1B-55K를 가진 새로운 세포주를 사용하여 우회하기 위해, 그래서 PER.C6 세포에 의해 제공된 것처럼, 수립된 생산 플랫폼(platform)을 사용할 수 있도록 하기 위해, Ad35 백본의 E4orf6 영역이 Ad5로부터의 E4orf6 영역으로 치환된 추가 구조물이, WO 03/104467에서 구체적으로 기술된 것과 같이 만들어졌다. E4orf6 영역의 치환은 모든 Ad35-기초한 벡터에 응용되었지만, 여기에 기재된 면역원성 연구 및 표적화 연구에서, 추가로 사용되지는 않았다.

실시예 4. Ad5 및 Ad35 와 비교한 재조합체 Ad35f5 및 Ad35k5 의 면역원성

벡터의 면역원성은 Ad5-SIVGag 및 Ad35-SIVGag와 키메라 섬유를 지니는 벡터와의 비교에 의해 평가되었다.

나이브(Naive) 마이스 (N=5/그룹)들을 10¹⁰vp Ad5-SIVGag, Ad35-SIVGag, Ad35.BSU.SIVGag 및 Ad35fib5 .BSU. SIVGgag로 근육 내에서 면역화하였다. 용어 BSU는 아데노바이러스 게놈 핵산에서, Ad35-기초한 재조합체 바이러스의 생산 동안에 pIX 유전자의 적절한 발현을 보증하는, 내인성 pIX 프로모터의 사용에 관한 것이다. BSU 구조물에 관한 구체적인 사항은 WO 2004/001032를 참조하라. 대조구 마이스 (N=3/그룹)은 Ad5 및 Ad35 결여 벡터로 면역되었다. 28일 후에, 혈액 시료가 채취되고 그리고 면역 반응이 하기에서 기술되는 SIV gag ELIspot 분석을 사용하여 결정되었다.

도 3은 이들 실험의 결과를 나타내고 그리고 모든 벡터들이 결여 벡터와 비교하여 SIV gag 단백질에 대한 적절한 T 세포 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타내고, 이는 그 삽입이 마이스에서의 주입시에 면역원성 단백질을 제공하는 것을 나타낸다.

나이브 마이스의 다른 세트 (N=8/그룹)는 Ad5-Gag, Ad35-Gag, 및 Ad35k5-Gag 벡터 (모두 SIV gag 단백질을 코드화하는)의 10⁹vp 또는 10⁸vp로 면역되었다. 백신-유도 CD8⁺ T 림프구 반응은 하기의 방법을 사용하는 D^b/AL11 4량체 결합 분석에 의해 평가되었다: 우세한 (dominant) SIVmac239 Gag AL1I 에피토프 펩티드 (AAVKNWMTQTL; SEQ ID NO: 3; Barouch et al. 2004) 주위에 폴드된 4량체 H-2D^d 복합체가 제조되었고 그리고 마이스로부터 P18-특이적 CD8⁺ T 림프구를 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여 염색하기 위해 이용되었다. 마우스 혈액이 40 U/ml 헤파린을 포함하는 RPMI 1640에서 모아졌다. 적혈구 세포의 세포용해 (lysis)에 뒤이어, PE-라벨된 D^d/P18 4량체의 0.1㎍과 함께 APC-라벨된 항-CD8알파 mAb (Ly-2; Caltag, Burlingame, Ca, USA)는 P18-특이적 CD8⁺ T 림프구를 염색하기 위해 이용되었다. 세포들은 2% FBS 함유하는 PBS에서 세척되고 그리고 1.5% 파라포름알데히드를 함유하는 0.5ml PBS에서 고정되었다. 시료들은 FACS Calibur (Becton Dickinson) 상에서 2-색 유동 세포 계수에 의해 분석되었다. 게이트된 CD8⁺ T 림프구는 D^d/P18 4량체로 염색에 대해 검사되었다. 나이브 마이스로부터 CD8⁺ T 림프구는 음성적 대조구로서 이용되었고 그리고 <0.1% 4량체 염색을 나타내었다.

도 4에 나타낸 것처럼, 모든 3개의 백신은 10⁹ vp (A) 의 고 용량에서 동등하게 면역원성이었다. 중요하게는, 10⁸ vp (B)의 더 낮은 용량에서, 재조합체 Ad35k5-Gag에 의해 도출되는 면역 반응은 재조합체 Ad35-Gag (p<0.01, 다수의 비교를 책임지기 위해 Bonferroni 조정 (adjustments)으로 변이의 분석을 사용하여 14일 동안에 마이스의 그룹 중에서 평균 4량체 반응과 비교하여) 에 의해 도출되는 반응보다 상당히 더 강력했고 크기 (magnitude)로 Ad5-Gag (p=ns)에 의해 도출되는 반응에 거의 필적했다. 이것은 이전의 관찰과 일치하는 것이다 (Barouch et al. 2004; Lemckert et al. 2005). 이들 데이터는 서브그룹 C 아데노바이러스 (예를 들어, Ad5)의 노브 도메인을 지니도록 Ad35 벡터를 조작하는 것은 벡터에 삽입된 항원에 대한 그것의 면역원성의 실질적 향상을 제공한다는 것을 입증한다.

이들 실험은 항-Ad5 면역의 부재에서 수행되었고, 그리고 여기서 Ad5 및Ad35k5는 필적할만한 면역 반응을 일으켰고, 이들이 Ad35 벡터보다 상당히 더 높았다는 것이 보여진다. Ad35k5 벡터가, Ad5의 헥손 단백질에 대한 중화 활성을 갖는 개인에서 면역 반응을 일으킴에 있어서 더 높은 효율을 더하는, Ad35 헥손을 지닌다는 것을 주의하는 것이 중요하다. 따라서, Ad35k5 벡터는 항-Ad5 면역의 존재 하에서 두 Ad5- 및 Ad35-기초한 벡터보다 훨씬 더 효과적이다; Ad5는 그것의 본래의 헥손 단백질 때문에 이들 조건 하에서 덜 면역원성이고, 그리고 Ad35는 그것의 본 래의 섬유 노브 도메인 때문에 일반적으로 덜 면역원성이다.

섬유 단백질에 대한 중화 항체가 감염시에 일어날 수 있다는 것은 배제될 수 없다. 그러나, 중화 활성이 최소인 천연 조건 하에서, 숙주의 면역 반응의 주요 부가 헥손 단백질에 대항할 것이라고 여겨진다. 재조합체 벡터가 모 벡터로 예비-면역화와 비교되는 실험들은 자연 의태적 상황 (인간) 하에서 수행되어야 하고, 여기서 야생형 바이러스는 천연 숙주를 한 번 또는 두 번 감염시켜, 중화 항체의 자연발생적 수준을 유도한다는 것을 유의하는 것이 중요하다. 마이스에서 실험 셋팅에서 당업자는 다양한 주입 및 높은 역가 투여에 의해 급도의 면역 반응을 일으킬 수 있다. 천연 상태를 의태하는 실험은 섬유 단백질에 대한 중화 항체가 투여된 아데노바이러스 벡터의 중화에 중요한 것인지 아닌지를 나타낸다. 이들은 또한 섬유의 쉐프트 영역 (부분이 전형적으로 또한 중화 활성에 이용가능한)의 존재의 중요성을 밝혀낸다.

본 발명자들은 적어도 CAR를 통해 숙주 세포를 인식하고 감염시키는 아데노바이러스 (예를 들어, Ad2, Ad5, 등)로부터의 노브를 포함하고, 그리고 추가로 적어도 중화된 혈청형 (예를 들어, Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 및 Ad50)으로부터 캡시드의 주된 면역원성 결정기 (즉, 헥손 단백질)를 포함하는 벡터들은, 그들이 인간 개체군에서 낮은 벡터 미리-존재하는 면역성의 알려지지 않은 장점, 높은 항원성 삽입 면역 반응, 재현가능한 생산, 효율적인 형질도입 및 우수한 안정성을 조합하기 때문에, 훌륭한 면역화 벡터들이 분명하다고 생각한다.

실시예 5. 미리-존재하는 면역성을 갖는 마이스에서 Ad5 , Ad35k5 및 Ad35 의 면역원성

다음으로, 이들 벡터의 면역원성에 대한 항-Ad5 면역의 영향이 평가되었다. C57/BL6 마이스 (N=4/그룹)의 그룹이 항-Ad5 면역의 낮은/중등 수준을 생성시키기 위해 백신화 4주 전에 10¹⁰ vp Ad5-결여로 한 번 예비-면역되었다. 이들 마이스에서 Ad5-특이적 중화 항체 (NAb) 역가는 64-128이었다 (Barouch et al. 2004; Lemckert et al. 2005; Sprangers et al. 2003). 도 4C에서 나타낸 것처럼, 10⁸ vp Ad5-Gag에 의해 유도되는 4량체⁺ CD8⁺ T 림프구 반응은 이들 마이스에서 기본적으로 제거되었다. 반대로, 10⁸ vp Ad35-Gag 및 Ad35k5-Gag 반응들은 항-Ad5 면역의 이러한 수준에 의해 실질적으로 영향받지 않았다. 중요하게는, Ad35k5-Gag는 이들 마이스에서 면역화 후 14일에 Ad5-Gag (p<0.001) 및 Ad35-Gag (p<0.05) 둘 다보다 더욱 면역원성임을 증명하였다.

Ad35k-Gag의 항-Ad5 면역의 저/중간 수준을 피하기 위한 능력은 Ad5-특이적 Nabs가 주로 Ad5 헥손 단백질에 대한 것이라는 이전의 연구물 (상기 참조, Sumida et al. 2005)과 일치한다. 그러나, 이러한 이전의 연구에서 Ad5 섬유 단백질에 대한 NAbs의 낮은 수준이 또한 검출되었다. 따라서 이 실험은 높은 수준의 항-Ad5 면역을 갖는 마이스에서 반복되었다. 마이스는 백신화 8주 및 4주 전에 10¹⁰ vp Ad5-결여로 두 번 예비-면역되었다. 이들 마이스에서 Ad5-특이적 NAb 역가는, 사하라 사막 이남부 아프리카에서의 개인에서 발견된 가장 높은 역가 (Kostense et al. 2004; Sumida et al. 2005)에 필적가능한 8,192-16,384였다 (Barouch et al. 2004; Lemckert et al. 2005; Sprangers et al. 2003). 도 4D에서 나타낸 것처럼, Ad35k5-Gag에 의해 유도되는 4량체⁺ CD8⁺ T 림프구 반응은 이들 마이스에서 부분적으로 감소되었고 그리고 Ad35-Gag에 의해 유도된 반응(p=ns)에 필적했다. 따라서, 항-Ad5 면역의 높은 수준은 Ad35k5 벡터의 면역원성을 부분적으로 억제하였다.

추가로 구체적으로 키메라 Ad35k5-Gag 벡터에 의해 유도되는 벡터-특이적 면역을 평가하기 위해, 이종성 프라임-부스트 연구 및 바이러스 중화 분석이 수행되었다. 나이브 C57/BL6 마이스 (N=4/그룹)의 그룹은 10⁹ vp Ad35k5-Gag로 0주에 프라임되고 그리고 나서 10⁹ vp Ad5-Gag 또는 Ad35-Gag로 4주에 부스트되었다. 도 5A에서 나타낸 것처럼, Ad35k5-Gag에 의해 유도되는 4량체⁺ CD8⁺ T 림프구 반응은 Ad5-Gag에 의해 효과적으로 부스트되었지만 Ad35-Gag에 의해서는 아니었다. 이들 데이터는 Ad35 및 Ad35k5가 상당한 교차-반응적 항-벡터 면역성을 유도하는 반면에, Ad5 및Ad35k5는 주로 면역학적으로 별개의 것이라는 것을 제시한다. 이들 관찰과 일치되게, Ad35k5-Gag로 한번 면역된 마이스는 Ad35-Gag에 의해 유도된 것들과 필적하는 Ad35-특이적 NAbs를 생성하였으나, Ad5-특이적 NAbs보다 상당히 낮았다 (도 5B). 따라서, Ad35k5 벡터는 Ad5 벡터보다 Ad35 벡터에 더욱 유사한 혈청학적 프로파일을 나타냈다.

이들 결과의 일반화 가능성(generalizability)을 평가하기 위해, 마이스의 다른 염색에서 다른 항원을 발현하는 Ad35k5 벡터 (Env: HIV-1 89.6P Env gp120, 클로닝에 관한 구체사항은 여기에서 및 Vogels et al. 2003 참조)의 면역원성이 평가되었다. 나이브 Balb/c 마이스의 그룹 (N=4/그룹)이 10⁹ vp Ad5-Env, Ad35k5-Env, 또는 Ad35-Env로 근육내로 한 번 면역화되었다. Ad35k5-Env 벡터에 의해 유도되는 세포성 및 체액성 면역 반응은, IFN-γ ELISPOT 분석 (도 6A) 및 Env-특이적 ELISA's (도 6B)에 의해 측정될 때, Ad5-Env 벡터 및 Ad35-Env 벡터에 의해 유도된 것들의 사이의 중간이었다.

ELISA's는 다음과 같이 수행되었다. HIV-Ⅰ Env 또는 SIV Gag에 특이적인 면역화된 마이스로부터의 혈청 항체 역가가 기술된 것처럼 직접적인 ELISA에 의해 측정되었다 (Barouch et al. 2004; Sumida et al. 2005). 재조합체 HIV-ⅠMN Env gp120 또는 PBS중의 SIVmac239 Gag p27 폴리펩티드 (ImmunoDiagnotics)의 1μg/ml의 100 μl/웰로 밤새 코팅된 96-웰 플레이트는, 2시간 동안 2% BSA 및 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS로 블럭되었다. 혈청은 그 후 일력의 희석으로 첨가되었고 그리고 1시간 동안 배양되었다. 플레이트는 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS로 3회 세척되었고 그리고 1시간 동안 퍼옥시다아제-컨쥬게이트된 친화성-정제된 토끼 항-마우스 2차 항체의 1:2000 희석액으로 인큐베이트하였다 (Jackson Laboratories, USA). 플레이트는 3회 세척되었고, 테트라메틸벤지딘으로 현상되었고, 1% HCl로 중지되었고, 그리고 450nm에서 Dynatech MR5000 ELISA 플레이트 리더로 분석되었다.

실시예 6. 레서스 원숭이에서 Ad5 , Ad35k5 및 Ad35 벡터의 면역원성

마이스에서 면역원성 연구를 확증하기 위해, 레서스 원숭이에서 이들 벡터의 면역원성을 평가하기 위한 파일럿 연구가 수행되었다. 9마리의 Mamu -A*01-음성 레서스 원숭이 (N=3/그룹)가 SIV Gag 및 HIV-I Env를 발현하는 10¹¹ vp Ad5, Ad35 또는 Ad35k5 벡터로 근육내로 면역되었다. 원숭이들은 0 주에 프라임되었고 그리고 12주에 동종성 부스트 면역화를 받았다. 도 7은 이들 동물에서 항원- 및 벡터-특이적 면역 반응을 묘사한다. Gag- 및 Env- 특이적 세포내 면역 반응은 모아진 펩티드 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 정량화되었고, 그리고 벡터-특이적 NAb 역가는 면역화에 따른 다중 시점에서 루시페라아제-기초한 바이러스 중화 분석에 의해 결정되었다. 중화 분석은 상기 기술한 것처럼 수행되었다.

Ad5 벡터는, 기대와 같이, 1차 면역화에 따라 고빈도 (frequency) ELISPOT 반응을 유도하지만 (12주에 538 SFC/10⁶ PBMC의 평균 Gag+Env 반응), 이들 반응은 동종성 부스트 면역화 (16주에서 608 SFC/10⁶ PBMC의 평균 Gag+Env 반응)에 따라(후) 실질적으로 증가되지 않았는데, 아마도 이들 동물에서 Ad5-특이적 NAbs의 높은 역가의 빠른 발생을 반영하는 것이다 (도 7B). 대조적으로, Ad35 벡터는 초기 면역화에 따른 (12주에서 평균 248 SFC/10⁶ PBMC) Ad5 벡터에 의해 유도된 것보다 대략 2-배 더 낮은 항원-특이적 ELISPOT 반응을 유도했다. 흥미롭게도, 이들 반응은 동종성 부스트 면역화 (16주에서 평균 876 SFC/10⁶ PBMC; 도 7C)에 따라서 상당히 증가했는데, 이들 동물에서 초기에 생성된 벡터-특이적 NAbs의 더 낮은 역가와 일치한다 (도 7D). 이들 데이터는 Ad35 벡터가 레서스 원숭이에서 Ad5 벡터와 비교하여 더 낮은 항원-특이적 면역 반응뿐 아니라 더 낮은 벡터-특이적 면역 반응을 도출했다는 것을 제시한다.

Ad35k5 벡터는 하기의 1차 면역에 따라서 Ad5 벡터에 의해 유도된 것들과 필적하는 항원-특이적 ELISPOT 반응을 도출하였다 (12주에 평균 578 SFC/10⁶ PBMC; 도 7E). 중요하게는, 이들 반응은, 동종성 부스트 면역화에 따라서 상당히 증가시켰는데 (16주에 평균 1736 SFC/10⁶ PBMC), 아마도 이들 원숭이에서 초기에 생성된 상대적으로 저 벡터-특이적 NAbs를 반영하는 것이다 (도 7F). 사실, 부스트 면역화에 따라서, Ad35k5 벡터는 Ad5 및 Ad35 벡터보다 2-3배 더 높은 Gag- 및 Env-특이적 ELISPOT 반응을 도출하였다. 더욱이, Ad35k5 벡터는, Cd8-감손된 (depleted) 및 CD4-감손된 PBMCs를 사용한 ELISPOT 분석에 의해 결정될 때, 면역화에 따라(후) 에 16주에 유력한 분획된 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 림프구 반응을 유도하였다 (도 8A, B, C: 각각 Ad5, Ad35, Ad35k5).

실시예 7. 키메라 헥손 단백질을 함유하는 재조합체 Ad5 벡터의 생성

Crawford-Miksza and Schnurr (1996)에 따른 Ad2의, Rux and Burnett (2000)에 따른 Ad5의, Rux et al. (2003)에 따른 Ad5의 그리고 본 발명의 따른 Ad5의, HVR's가 표 Ⅰ에 묘사되어 있다. 표 Ⅱ는 인간 아데노바이러스 Ad5, Ad11, Ad26, Ad35, 및 Ad48, 및 본 발명의 HVR 정의에 따른 침팬지 아데노바이러스 68 (Pan9)의 7 HVR 서열들을 제공한다. 각각의 헥손 서열 내에서 특이적 위치가 또한 묘사되어 있다.

하나 이상의 HVR's를 포함하고, Ad35 (서브그룹 B) 또는 Ad48 (서브그룹 D)로부터 교환된, Ad5-기초한 벡터가 구성되었다.

본 발명의 더욱 "최소한의 (minimalistic)" 구현예는, 상기 기술한 아데노바이러스 혈청형의 HVR's가 다소 단축된 형식 (shortened fashion)으로 정의되어 있다. 이들 HVR's는 표 Ⅳ에서 HVR(1-7)＊로서 별표로 표현되어 있다. 재조합체 벡터들에서 최소한의 정의를 사용하여, HVR1＊은 백본으로부터 결실되고, HVR2＊는 짧은 2-아미노산 스페이서 (QG)로 치환되고, 반면에 HVR3＊, HVR4＊, HVR5＊, HVR6＊, 및 HVR7＊은 다른 혈청형들로부터의 그들 각각의 더 짧은 (＊) 대응부분에 의해 치환된다. 가장 명백히, HVR7은 더욱 좁게 재-정의된다는 것이다 (표 Ⅱ 및 표 Ⅳ 비교).

바람직한 서열을 포함하는 부분적 헥손 유전자는 GeneArt (독일)에 의해 합성되었고 그리고 완전한 Ad5 헥손 유전자를 포함하는 셔틀 플라스미드 (shuttle plasmid)로 Apal-Hpal 단편으로서 클론되었다. 그리고 나서 더 큰 Ascl-Ascl 단편이 이 셔틀 플라스미드로부터 삭제되었고 그리고 Ad5 코스미드 pWE .Ad5 .Af1Ⅱ-rITR. dE3 (E3 영역의 결실을 지니고 그리고 코스미드 pWE .Ad5 .Af1Ⅱ-rITR에 기초한, WO 02/40665 참조)에서 상응하는 AscI-AscI 단편을 치환하기 위해 이용되었다. 그리고나서 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)의 아답터 플라스미드 pAdApt-Gag (원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV)의 gag 단백질을 코드화하는)와 함께 돌연변이 Ad5 코스미드는 PER.C6/55k 세포내로 공-트랜스펙션되고 (PER.C6^® 세포에서 Ad35로부터의 55K E1B 유전자를 갖는, WO 02/40665), 그리고 동종성 재조합은 재조합체 Ad5HVR35(1)-Gag, 재조합체 Ad5HVR48 (1)-Gag 및 재조합체 Ad5HVR48(1-7)-Gag 바이러스를 산출하고, 여기서 '1'은 HVR1만의 치환을 나타내고 그리고 '1-7'은 모든 개별의 7 HVR's의 치환은 나타낸다. 이들 벡터는 플라크-정제되었고, 서열화되었고, 확장되었고, 그리고 당업계에 알려진 일반적인 방법론에 따라 CsC1 구배 원심분리에 의해 정제되었다. Ad5HVR48(1-7)에서 헥손의 서열은 도 11에서 주어졌다.

상기 기술한 3 바이러스 외에도, 하기의 재조합체 벡터가 또한 만들어진다: Ad5HVR35 (1-6), Ad5HVR35 (1-7) (도 12), Ad5HVR11 (1-6), Ad5HVR11 (1-7) (도 13), Ad5HVR26 (1-6), Ad5HVR26 (1-7) (도 14), Ad5HVRPan9 (1-6) 및 Ad5HVRPan9 (1-7) (도 15). '1-6'은 모 벡터의 HVR7을 남겨두고, HVR1-HVR6의 치환을 나타낸다. 명백하게, 다수의 이용가능한 모 벡터 (Ad2 및 Ad5와 같은) 및 다수의 공지된 희소한 혈청형에 기초하여, 더욱 다양한 조합이 본 발명의 교시를 이용하여 생성 가능하다. '스텔스(stealth)'-같은 벡터를 생산하기 위해 HVR's를 제공하기 위해 사용될 수 있는 다른 희소한 인간 아데노바이러스 혈청형은 Ad24, Ad34, Ad49 및 Ad50이다.

실시예 8. 나이브 마이스 및 항- Ad5 면역을 갖는 마이스에서 Ad5 , Ad5HVR48(1) 및 Ad5HVR48 (1-7)의 면역원성

상기 개요된 것처럼, 생존성 재조합체 Ad5-Gag, Ad5HVR48(1)-Gag 및 Ad5HVR48 (1-7)-Gag 바이러스는 패키징 세포 상에서 생산되었다. Ad5HVR48(1)-Gag의 산출은 재조합체 Ad5-Gag 바이러스와 필적가능하지만, Ad5HVR48(1-7)-Gag 바이러스의 성장 속도, 산출 및 vp/pfu 비율은 Ad5-Gag 바이러스보다 대략 2-배 더 낮았다. Gag 발현은 첫 번째로 각 벡터의 10⁹ 또는 10¹⁰ vp로 감염된 A549 세포 상에서 확인되었다. HPLC 데이터는, 비록 Ad5HVR48(1-7)-Gag로부터의 발현이 Ad5-Gag로부터 보다 다소 더욱 낮더라도, 세포내 Gag 발현이 충분했고 그리고 다른 벡터들 (데이터는 나타내지 않음) 사이에서도 필적가능하다는 것을 나타낸다. 이것은 다소 더 느린 성장-속도에 관한 것일 수 있다.

바이러스의 면역원성은 나이브 C57/BL6 마이스 (그룹당 마이스 4마리)를 각 벡터의 10⁹, 10⁸ 및 10⁷ vp로 면역화함에 의해 첫째로 조사되었다. 백신-유도된 CD8⁺ T 림프구 반응은, 상기 기술한 것처럼, 2주 동안 D^b/AL11 4량체 결합 분석에 의해 평가되었다. 결과는 도 9에서 나타내었다. 명백하게는 성장 속도 및 트랜스유전자 발현에서 작은 차이점에도 불구하고, 모든 3 벡터는, 이들 나이브 마이스에서 필적할만한 면역 반응을 초래했다.

이어서, C57/BL6 마이스는 Ad5 기초 벡터에 대해 미리-존재하는 면역을 산출하기 위해 관심의 바이러스로 면역화(Ad5 Nab 역가 8, 192-16. 384)하기 전, 각각 8 및 4 주에, 10¹⁰ vp Ad5-결여 2회 주입으로 미리-면역되었다. 그리고 나서 (첫 번째 미리-면역화로부터 8주에) 마이스는 재조합체 Ad5-Gag, Ad5HVR48(1)-Gag 및 Ad5HVR48 (1-7)-Gag의 10⁹, 10⁸ 및 10⁷ vp로 상기와 같이 면역되었다. 다시, 백신-유도된 CD8⁺ T 림프구 반응은 상기 기술한 것처럼 2주 동안 D^b/AL11 4량체 결합 분석에 의해 평가되었다. 결과는 도 10에 나타내었다. ELISPOT 결과는 4량체 분석을 반영하고 그리고 유사한 결과를 제공했다 (데이터는 나타내지 않음).

기대한 대로, Ad5-Gag 벡터는 면역 반응이 거의 감지되지 않는 이들 미리-면역된 마이스에서 미리-존재하는 면역성과 맞섰다. Ad5HVR48(1)-Gag 바이러스는 또한 항-Ad5 면역의 높은 수준을 우회하는 것에 실패했는데, 이는 미리-존재하는 면역이 적어도 HVR1에만 제한되지는 않는다는 것을 제시한다. 중요하게는, Ad5HVR48(1-7)-Gag 바이러스의 면역원성은 Ad5-유도된 미리-존재하는 면역에 의해 영향을 받지 않는데 이는, Ad5의 7 헥손 HVR's (여기에서 확인된 것처럼)을 돌연 변이시키고 그리고 그들을 희소한 혈청형 (Ad48에 의해 예시되는)의 상응하는 HVR's으로 치환함에 의해, 야생형 단백질에 대한 미리-존재하는 면역성에 의해 방해받지 않는 벡터를 초래한다는 것을 가르킨다. 유사한 결과는, 미리-존재하는 면역의 높은 수준의 상황을 나타내는 (도 21), 결여 Ad5 벡터로 2번 프라임된 마이스 실험에서 얻어졌다. 이 실험은 그룹 당 4 C57/BL6 마이스로 행해졌다. 마이스의 그룹은 항-Ad5 면역을 유도하기 위해 10¹⁰ vp Ad5-결여 2회 주입으로 미리-면역되었다. Ad5-결여로 미리-면역된 마이스는 8,192-16,384의 Ad5 MAb 역가를 가졌다. 그리고 나서 마이스는 10⁹ vp Ad35-Gag로 근육 내로 0일에 프라임되었고 그리고 나서 10⁹ vp Ad5-Gag, 10⁹ vp Ad35-Gag, 또는 10⁹ vp Ad5HVR48 (1-7)-Gag로 28일에 부스트되었다. 모든 주입은 50μl의 부피를 이용하였다. X-축에서 화살표는 면역화를 나타낸다. 혈액 시료는 백신-유도된 CD8+ T 림프구 반응의 양을 평가하기 위해 Db/AL11 4량체 염색 분석에서 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56일에 얻어졌다. 56일에, IFN-γ ELISPOT 분석이 또한 수행되었고 필적가능한 결과를 보였다 (데이터는 나타내지 않음). Ad5-Gag는 아마도 미리-존재하는 항-Ad5 면역 때문에 부스트에 실패하였다. 또한 Ad35-Gag도 부스트에 실패하였는데, 이는 아마도 프라이밍 면역화에 의해 유도된 항-Ad35 면역성 때문일 것이다. Ad5HVR48(1-7)은, 이 벡터가 신규한 '혈청형'과 같이 기능하는 것을 확증시키는, 반응을 효과적으로 부스트하였다. 따라서 Ad5HVR48 (1-7)는 Ad5가 실패하는 셋팅에서, 그리고 이종성 벡터 (Ad35와 같은)가 프라임 벡터로서 사용되는 셋팅에서 효과적인 부스팅 벡터로서 역할할 수 있다고 결론지어졌다. 소개된 이전의 연구와 조합하여, 본 발명자들은 Ad5HVR48(1-7)로 표현되는 벡터는 Ad5가 실패하는 미리-존재하는 항-Ad5 면역의 셋팅에서 효과적인 프라이밍 벡터이고 그리고 효과적인 부스팅 벡터라고 전반적으로 결론짓는다.

이들 결과는 이제, 수용체 인식 (주로 섬유 및 펜톤 단백질에 의해 야기되는)이 변하지 않는 채 남아있는 채, 프라임-부스트 셋팅에서 Ad5-기초한 벡터를 사용할 수 있게 한다.

표 Ⅰ. 인간 아데노바이러스 Ad2 (Crawford-Miksza and Schnurr 1996에 따 른), Ad5 (Rux and Burnett 2000에 따른); Rux et al. 2003) 및 Ad5 (본 발명의 따른)의 헥손 단백질 내에서 과-변이영역 정의. Rux and Burnett (2000)의 Ad5의 HVR 정의는 Ad2 서열에 기초한 Crawford-Miksza 정의와 정확히 일치한다. 이들 HVR 정의는 Rux and Burnett (2000) 정의 (HVR1: 137-181, 등)에서 초기 메티오닌 잔기의 부재로 인해, 이 표에서 1 위치로 모두 바뀌었다는 것을 주의하라.

표 Ⅱ.

표 Ⅱ. 계속

표 Ⅲ. 벡터 내에서 다른 성분의 확인을 포함하는, 본 발명에 따른 키메라 복제-결함 아데노바이러스.

키메라 아데노바이러스 벡터의 부분	특징
백본 혈청형 X (패키지 세포에 의해 보충되지 않고 그리고 섬유 및 헥손 단백질을 배제하고, 펜톤 단백질을 포함하는 벡터의 요소들)	여기서 X는 인간 치료에 응용가능한 아데노바이러스로 이루어진 군 (인간 아데노바이러스 혈청형 1-51, 침팬지-, 소- 및 개 아데노바이러스를 포함하는)에서 선택된다.
헥손 HVR(n) Y	여기서 Y는 인간 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 및 50 (여기서 n=0-7이고, 만약 X≠Y이면, n=1-7이다)으로 이루어지는 군에서 선택된다.
테일 T 및 쉐프트 S를 포함하는, 섬유 델타 노브 F	여기서 F는 혈청형 1-51, 침팬지, ...로 이루어지는 군에서 선택되고, 만약 F≠X라면, 적어도 펜톤과 상호작용하는 F의 T의 부분은 X이다.
노브 K	여기서 K는 1차적으로 감염을 위해 세포상 CAR 수용체를 사용하는 아데노바이러스 혈청형 (서브그룹 A, C, D, E 및 F로부터의 인간 아데노바이러스 혈청형)으로 이루어진 군에서 선택되고 그리고 K는 X이거나 또는 다를 수 있다.

표 Ⅳ.

표 Ⅳ. 계속

참조문헌

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tctcctaact gtagactaaa tgcagagaaa gatgctaaac tcactttggt cttaacaaaa 480 tgtggcagtc aaatacttgc tacagtttca gttttggctg ttaaaggcag tttggctcca 540 atatctggaa cagttcaaag tgctcatctt attataagat ttgacgaaaa tggagtgcta 600 ctaaacaatt ccttcctgga cccagaatat tggaacttta gaaatggaga tcttactgaa 660 ggcacagcct atacaaacgc tgttggattt atgcctaacc tatcagctta tccaaaatct 720 cacggtaaaa ctgccaaaag taacattgtc agtcaagttt acttaaacgg agacaaaact 780 aaacctgtaa cactaaccat tacactaaac ggtacacagg aaacaggaga cacaactcca 840 agtgcatact ctatgtcatt ttcatgggac tggtctggcc acaactacat taatgaaata 900 tttgccacat cctcttacac tttttcatac attgcccaag aataagctag c 951 <210> 2 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human adenovirus chimeric Ad35-Ad5 fiber protein <400> 2 Met Thr Lys Arg Val Arg Leu Ser Asp Ser Phe Asn Pro Val Tyr Pro 1 5 10 15 Tyr Glu Asp Glu Ser Thr Ser Gln His Pro Phe Ile Asn Pro Gly Phe 20 25 30 Ile Ser Pro Asn Gly Phe Thr Gln Ser Pro Asp Gly Val Leu Thr Leu 35 40 45 Lys Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly Gly Ser Leu Gln Leu Lys 50 55 60 Val Gly Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Thr Asp Gly Thr Leu Gln Glu 65 70 75 80 Asn Ile Arg Ala Thr Ala Pro Ile Thr Lys Asn Asn His Ser Val Glu 85 90 95 Leu Ser Ile Gly Asn Gly Leu Glu Thr Gln Asn Asn Lys Leu Cys Ala 100 105 110 Lys Leu Gly Asn Gly Leu Lys Phe Asn Asn Gly Asp Ile Cys Ile Lys 115 120 125 Asp Ser Ile Asn Thr Leu Trp Thr Thr Pro Ala Pro Ser Pro Asn Cys 130 135 140 Arg Leu Asn Ala Glu Lys Asp Ala Lys Leu Thr Leu Val Leu Thr Lys 145 150 155 160 Cys Gly Ser Gln Ile Leu Ala Thr Val Ser Val Leu Ala Val Lys Gly 165 170 175 Ser Leu Ala Pro Ile Ser Gly Thr Val Gln Ser Ala His Leu Ile Ile 180 185 190 Arg Phe Asp Glu Asn Gly Val Leu Leu Asn Asn Ser Phe Leu Asp Pro 195 200 205 Glu Tyr Trp Asn Phe Arg Asn Gly Asp Leu Thr Glu Gly Thr Ala Tyr 210 215 220 Thr Asn Ala Val Gly Phe Met Pro Asn Leu Ser Ala Tyr Pro Lys Ser 225 230 235 240 His Gly Lys Thr Ala Lys Ser Asn Ile Val Ser Gln Val Tyr Leu Asn 245 250 255 Gly Asp Lys Thr Lys Pro Val Thr Leu Thr Ile Thr Leu 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Adenovirus serotype 11 <400> 43 Gly Thr Glu Asp Thr Ser 1 5 <210> 44 <211> 33 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 11 <400> 44 Asp Gly Ile Gly Val Pro Thr Thr Ser Tyr Lys Ser Ile Val Pro Asn 1 5 10 15 Gly Asp Asn Ala Pro Asn Trp Lys Glu Pro Glu Val Asn Gly Thr Ser 20 25 30 Glu <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 26 <400> 45 Glu Thr Lys Glu Lys Gln Gly Thr Thr Gly Gly Val Gln Gln Glu Lys 1 5 10 15 Asp Val <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 26 <400> 46 Thr Asp Glu Thr Ala Glu Asn Gly Lys Lys Asp Ile 1 5 10 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 26 <400> 47 Gln Glu Asn Glu Ala Phe Tyr Gly 1 5 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 26 <400> 48 Ala Lys Phe Lys Pro Val Asn Glu Gly Glu Gln Pro Lys 1 5 10 <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 26 <400> 49 Asp Val Pro Gly Gly Ser Pro Pro Ala Gly Gly Ser Gly Glu Glu Tyr 1 5 10 15 Lys <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 26 <400> 50 Gly Thr Ser Asp Asn 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tgtaattatc actattgcat ttaatcagga aactgaaaat 840 ggatgtgctt attctataac atttaccttc acttggcaaa aagactattc tgcccaacag 900 tttgatgtta catcttttac cttctcatat cttacccaag agaacaaaga caaagactaa 960 <210> 81 <211> 319 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric Ad35k26 fiber protein <400> 81 Met Thr Lys Arg Val Arg Leu Ser Asp Ser Phe Asn Pro Val Tyr Pro 1 5 10 15 Tyr Glu Asp Glu Ser Thr Ser Gln His Pro Phe Ile Asn Pro Gly Phe 20 25 30 Ile Ser Pro Asn Gly Phe Thr Gln Ser Pro Asp Gly Val Leu Thr Leu 35 40 45 Lys Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly Gly Ser Leu Gln Leu Lys 50 55 60 Val Gly Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Thr Asp Gly Thr Leu Gln Glu 65 70 75 80 Asn Ile Arg Ala Thr Ala Pro Ile Thr Lys Asn Asn His Ser Val Glu 85 90 95 Leu Ser Ile Gly Asn Gly Leu Glu Thr Gln Asn Asn Lys Leu Cys Ala 100 105 110 Lys Leu Gly Asn Gly Leu Lys Phe Asn Asn Gly Asp Ile Cys Ile Lys 115 120 125 Asp Ser Ile Asn Thr Leu Trp Thr Thr Pro Asp Thr Ser Pro Asn Cys 130 135 140 Lys Met Ser Thr Glu Lys Asp Ser Lys Leu Thr 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aacacccctt tataaaccca gggtttattt ccccaaatgg cttcacacaa 120 agcccagacg gagttcttac tttaaaatgt ttaaccccac taacaaccac aggcggatct 180 ctacagctaa aagtgggagg gggacttaca gtggatgaca ctgatggtac cttacaagaa 240 aacatacgtg ctacagcacc cattactaaa aataatcact ctgtagaact atccattgga 300 aatggattag aaactcaaaa caataaacta tgtgccaaat tgggaaatgg gttaaaattt 360 aacaacggtg acatttgtat aaaggatagt attaacaccc tttggacaac tccagaccca 420 tctccaaact gcaaagtttc agaagagaag gattccaagc ttactctagt tttaacaaag 480 tgcggaagtc agattctggc cagtgtatca ttgcttgttg ttaaagggaa gtttgccaat 540 attaacaata aaacaaaccc aggcgaggac tataaaaaat tttcagttaa attattgttt 600 gatgccaatg gtaaattatt gacaggatca agcctagatg gaaattattg gaattataaa 660 aacaaggata gtgtgattgg gtctccttat gaaaatgccg ttccttttat gcctaattcc 720 acagcttatc ctaaaatcat caataatgga acagctaatc ctgaagataa aaaaagtgca 780 gccaaaaaaa ctattgtcac taatgtgtac ctagggggag atgcagctaa acccgtggct 840 accactatta gtttcaacaa agaaactgaa tctaattgtg tttattctat aacctttgac 900 tttgcttgga acaaaactta caaaaatgtt ccatttgatt catcttcgct aacattttca 960 tatattgccc aagatgccga agacaaaaac gaataa 996 <210> 83 <211> 916 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric Ad5HVR35(1-7)* chimeric hexon protein <400> 83 Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ser 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Glu Thr Tyr Phe Ser Leu Asn Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Ala Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Thr 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Pro Cys Glu Trp Asp Thr His Val Phe Gly Gln Ala Pro 130 135 140 Tyr Ser Gly Ile Asn Ile Thr Lys Glu Gly Ile Gln Ile Gly Gln Gly 145 150 155 160 Lys Tyr Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro 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PRT <213> Adenovirus serotype pan9 <400> 124 Thr Asp Thr Asp Asp Gln Pro 1 5 <210> 125 <211> 3 <212> PRT <213> Adenovirus serotype pan9 <400> 125 Asp Ile Thr 1 <210> 126 <211> 8 <212> PRT <213> Adenovirus serotype pan9 <400> 126 Lys Thr Gly Thr Gly Thr Thr Lys 1 5 <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Adenovirus serotype pan9 <400> 127 Asn Arg Ser Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ala 1 5 10 <210> 128 <211> 3 <212> PRT <213> Adenovirus serotype pan9 <400> 128 Thr Asp Asp 1 <210> 129 <211> 13 <212> PRT <213> Adenovirus serotype pan9 <400> 129 Asn Gly Thr Asp Gln Thr Thr Trp Thr Lys Asp Asp Ser 1 5 10 <210> 130 <211> 24 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 34 <400> 130 Asp Lys Gly Val Thr Ser Thr Gly Leu Val Asp Asp Gly Asn Thr Asp 1 5 10 15 Asp Gly Glu Glu Ala Lys Lys Ala 20 <210> 131 <211> 10 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 34 <400> 131 Leu Glu Val Ser Thr Glu Gly Pro Lys Pro 1 5 10 <210> 132 <211> 3 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 34 <400> 132 Asp Leu Asp 1 <210> 133 <211> 11 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 34 <400> 133 Lys Pro Lys Glu Asp Asp Gly Thr Asn Asn Ile 1 5 10 <210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 34 <400> 134 Leu Arg Ser Gln Arg Ser Glu Leu Lys 1 5 <210> 135 <211> 3 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 34 <400> 135 Val Ser Asp 1 <210> 136 <211> 11 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 34 <400> 136 Asn Gly Asp Gln Ser Thr Trp Thr Asn Val Asp 1 5 10 <210> 137 <211> 11 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 49 <400> 137 Ala Lys Glu Asn Asn Gly Gln Gly Glu Ala Lys 1 5 10 <210> 138 <211> 13 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 49 <400> 138 Ile Asp Glu Asn Lys Glu Glu Asp Glu Glu Gly Arg Glu 1 5 10 <210> 139 <211> 3 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 49 <400> 139 Asn Thr Glu 1 <210> 140 <211> 10 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 49 <400> 140 Lys Thr Gly Glu Asn Gly Lys Pro Thr Glu 1 5 10 <210> 141 <211> 12 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 49 <400> 141 Leu Arg Gln Asn Asp Thr Gly Gly Asn Asn Asn Gln 1 5 10 <210> 142 <211> 3 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 49 <400> 142 Thr Ser Asp 1 <210> 143 <211> 16 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 49 <400> 143 Asp Thr Thr Val Ala Gly Thr Asn Asp Lys Trp Lys Val Asn Ala Lys 1 5 10 15 <210> 144 <211> 14 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 50 <400> 144 Asn Lys Gly Asp Glu Glu Asp Gly Glu Asp Asp Gln Gln Ala 1 5 10 <210> 145 <211> 11 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 50 <400> 145 Leu Glu Val Pro Ser Glu Gly Gly Pro Lys Pro 1 5 10 <210> 146 <211> 3 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 50 <400> 146 Asp Thr Asp 1 <210> 147 <211> 8 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 50 <400> 147 Lys Lys Glu Glu Glu Gly Lys Val 1 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 50 <400> 148 Leu Arg Ser Gln Met Thr Gly Leu Lys 1 5 <210> 149 <211> 3 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 50 <400> 149 Ala Ser Asp 1 <210> 150 <211> 12 <212> PRT <213> Adenovirus serotype 50 <400> 150 Asn Gly Asp Glu Thr Thr Thr Trp Lys Asp Leu Glu 1 5 10

Claims (34)

1. 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 및 50으로 이루어진 군에서 선택된 복제-결함 재조합체 아데노바이러스로, 상기 아데노바이러스는 CAR-결합 아데노바이러스 혈청형으로부터의 적어도 노브 도메인(knob domain)을 포함하는 키메라 섬유 단백질을 포함하고, 상기 재조합체 벡터는 추가로 관심의 치료학적 또는 항원성 단백질을 코드하는 이종성 핵산을 포함하는 재조합체 아데노바이러스.
2. 제 1항에 있어서, 상기 노브 도메인은 서브그룹 C의 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래하는 것인 재조합체 아데노바이러스.
3. 제 2항에 있어서, 상기 서브그룹 C 혈청형은 Ad5인 것인 재조합체 아데노바이러스.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심의 이종성 핵산은 이종성 프로모터의 조절하에 있는 것인 재조합체 아데노바이러스.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심의 항원성 단백질은 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 이스트로부터 유래된 단백질을 포함하는 것인 재조합체 아데노바이러스.
6. 제 5항에 있어서, 상기 항원성 단백질은 바이러스로부터 유래된 단백질을 포함하고, 상기 바이러스는 레트로바이러스, HSV 또는 에볼라 바이러스인 것인 재조합체 아데노바이러스.
7. 제 6항에 있어서, 상기 바이러스는 원숭이 또는 인간 면역결핍 레트로바이러스인 것인 재조합체 아데노바이러스.
8. 제 7항에 있어서, 상기 이종성 핵산은 gag, pol, env 및 nef로 이루어진 면역결핍 바이러스 단백질의 군을 코드화하는 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 것인 재조합체 아데노바이러스.
9. 제 5항에 있어서, 상기 관심의 항원성 단백질은 기생충으로부터 유래되고, 상기 기생충은 말라리아-유발 기생충인 것인 재조합체 아데노바이러스.
10. 제 9항에 있어서, 상기 단백질은 말라리아 원충( Plasmodium ) 종 유래의 포자소체(circumsporozoite) 단백질, 또는 그것의 면역원성 부분인 것인 재조합체 아데노바이러스.
11. 제 10항에 있어서, 상기 말라리아 원충 종은 열대열 원충( Plasmodium Falciparum)인 것인 재조합체 아데노바이러스.
12. 약제 용의 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 재조합체 아데노바이러스.
13. 말라리아-, 에볼라-, HSV- 또는 HIV 감염의 예방적 또는 치료학적 치료를 위한 약제의 제조에서 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 재조합체 아데노바이러스 벡터의 용도.
14. Ad5의 섬유로부터의 노브 도메인을 포함하고, 도 2B에서 밑줄 친 아미노산 서열 및 Ad5와 다른 혈청형으로부터의 헥손 단백질을 갖는, 키메라 복제-결함 재조합체 아데노바이러스.
15. 제 14항에 있어서, 상기 헥손 단백질은 저-중화된 아데노바이러스 혈청형으로부터 유래되는 것인 키메라 재조합체 아데노바이러스.
16. Ad35 헥손 및 키메라 섬유 단백질을 포함하는 키메라 복제-결함 재조합체 Ad35 벡터로, 상기 키메라 섬유 단백질을 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 것인 벡터.
17. 첫 번째 하위군의 혈청형에 기초한 재조합체 복제-결함 아데노바이러스의 배치로, 상기 아데노바이러스는 키메라 헥손 단백질을 포함하고, 상기 헥손 단백질은 상기 첫 번째 서브그룹의 혈청형으로부터의 서열 및 두 번째 서브그룹의 혈청형으로부터의 하나 이상의 과변이영역(hyper varaible region, HVR)을 포함하고, 상기 첫 번째 및 두 번째 서브그룹은 동일하지 않은 것인 배치.
18. 제 17항에 있어서, 상기 첫 번째 서브그룹은 서브그룹 A, C, D, E, 또는 F인 것인 배치.
19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 두 번째 서브그룹은 서브그룹 B 또는 D인 것인 배치.
20. 제 18항에 있어서, 상기 첫 번째 서브그룹은 서브그룹 C이고, 상기 서브그룹 C로부터의 혈청형은 Ad5인 것인 배치.
21. 제 19항에 있어서, 서브그룹 B 또는 D로부터의 상기 혈청형은 Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 및 Ad50으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 배치.
22. 제 17항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 헥손 단백질은 상기 두 번째 서브그룹의 혈청형으로부터의 첫 번째 6 HVR 서열 (HVR1-HVR6), 또는 전체의 7 HVR 서열 (HVR1-HVR7)을 포함하는 것인 배치.
23. 제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HVR 서열 사이의 서열은 상기 첫 번째 서브그룹의 혈청형으로부터 유래된 것인 배치.
24. 제 18항에 있어서, 상기 첫 번째 서브그룹은 서브그룹 C이고 그리고 상기 두 번째 서브그룹의 혈청형으로부터 하나 이상의 HVR 서열은 SEQ ID NO:24-79인 것인 배치.
25. 제 24항에 있어서, 상기 HVR1 서열은 SEQ ID NO:17, 24, 31, 38, 45, 52, 59, 66, 및 73에서 선택되고, 상기 HVR2 서열은 SEQ ID NO:18, 25, 32, 39, 46, 53, 60, 67, 및 74에서 선택되고, 상기 HVR3 서열은 SEQ ID NO:19, 26, 33, 40, 47, 54, 61, 68, 및 75에서 선택되고, 상기 HVR4 서열은 SEQ ID NO:20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69, 및 76에서 선택되고, 상기 HVR5 서열은 SEQ ID NO:21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 및 77에서 선택되고, 상기 HVR6 서열은 SEQ ID NO:22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71, 및 78에서 선택되고, 상기 HVR7 서열은 SEQ ID NO:23, 30, 37, 44, 51, 58, 65, 72, 및 79에서 선택되는 것인 배치.
26. 제 18항에 있어서, 상기 첫 번째 서브그룹은 서브그룹 C이고, 상기 두 번째 서브그룹의 혈청형으로부터의 상기 하나 이상의 HVR서열은 SEQ ID NO:95-150에서 선택되는 것인 배치.
27. 제 26항에 있어서, 상기 HVR1 서열은 SEQ ID NO:88, 95, 102, 109, 116, 123, 130, 137, 및 144에서 선택되고, 상기 HVR2 서열은 SEQ ID NO:89, 96, 103, 110, 117, 124, 131, 138, 및 145에서 선택되고, 상기 HVR3 서열은 SEQ ID NO:90, 97, 104, 111, 118, 125, 132, 139, 및 146에서 선택되고, 상기 HVR4 서열은 SEQ ID NO:91, 98, 105, 112, 119, 126, 133, 140, 및 147에서 선택되고, 상기 HVR5 서열은 SEQ ID NO:92, 99, 106, 113, 120, 127, 134, 141, 및 148에서 선택되고, 상기 HVR6 서열은 SEQ ID NO:93, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 142, 및 149에서 선택되고, 상기 HVR7 서열은 SEQ ID NO:94, 101, 108, 115, 122, 129, 136, 143, 및 150에서 선택되는 것인 배치.
28. 제 17항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HVR1 서열이 결실되는 것인 배치.
29. 제 17항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HVR2 서열이 링커(linker), 바람직하기는 2-아미노산 링커, 더욱 바람직하기는 아미노산 QG에 의해 치환되는 것인 배치.
30. 키메라 헥손 단백질의 구조에서 서브그룹 B로부터 인간 아데노바이러스 혈청 형의 헥손의 하나 이상의 HVR 서열을 코드화하고, 여기서 헥손은 추가로 서브그룹 A, C, D, E, 또는 F의 아데노바이러스로부터의 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산의 용도.
31. 키메라 헥손 단백질의 구조에서 서브그룹 D로부터의 인간 아데노바이러스 혈청형의 헥손의 하나 이상의 HVR 서열을 코드화하고, 여기서 헥손은 서브그룹 A, B, C, E, 또는 F의 아데노바이러스로부터의 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산의 용도.
32. 제 30항 또는 제 31항에 있어서, 상기 하나 이상의 HVR 서열은 SEQ ID NO:24-79 및 95-150에서 선택되는 것인 용도.
33. 혈청형 X의 펜톤 및 헥손 단백질을 포함하는 백본 아데노바이러스에 기초한 키메라 복제 결함 아데노바이러스로, 헥손 단백질에서 n HVR's는 혈청형 Y에서와 같고, 추가로 혈청형 F의 테일과 쉐프트(shaft) 및 혈청형 K의 노브를 포함하고, 여기서:

    - X는 인간 아데노바이러스 1-51, 원숭이-, 개-, 양-, 돼지-, 및 소 혈청형으로 이루어진 군에서 선택되는 아데노바이러스 혈청형이고;

    - Y는 인간 아데노바이러스 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 및 50으로 이루어진 군에서 선택되는 아데노바이러스 혈청형이고, 여기서 X 및 Y는 동일하거나 또는 다 를 수 있고, 그리고 n은 0 내지 7의 HVR's의 수를 나타내고, 단, X≠Y라면, n=1-7이고;

    - F는 인간 아데노바이러스 1-51, 원숭이-, 개-, 양-, 돼지-, 및 소 혈청형으로 이루어진 군에서 선택되는 아데노바이러스 혈청형이고, 여기서 F, X 및 Y는 동일하거나 또는 다를 수 있고; 그리고

    - K는 세포 수용체로서 CAR을 주로 사용하는 아데노바이러스 혈청형이고, 여기서 K, F, X 및 Y는 동일하거나 또는 다를 수 있는 것인 키메라 복제 결함 아데노 바이러스.
34. 제 33항에 있어서, 상기 펜톤 단백질과 상호작용하는 섬유 단백질의 테일의 최소한의 일부는 만일 F가 X가 아닌 경우에, 혈청형 X에서의 것인 키메라 복제 결함 아데노바이러스.

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