JP2018531612A - 万能性細胞のゲノム改変 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
本出願は、2015年11月4日に出願された米国仮特許出願第62/251,032号;2016年5月16日に出願された米国仮特許出願第62/337,258号;および2016年7月25日に出願された米国仮特許出願第62/366,503号に基づく優先権を主張するものであり、これらの開示はそれら全体が参照によって本明細書に援用される。
別に規定していない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同様の意味を有する。本発明のために、以下の用語を以下で規定する。
本明細書において同義的に使用される、ゲノム編集(genome editing)、またはゲノム編集(genomic editing)、または遺伝子編集は、標的細胞のゲノムにおいてDNAが挿入、欠失、および/または置換される、遺伝子工学の一種である。標的ゲノム編集(targeted genome editing)(「標的ゲノム編集(targeted genomic editing)」または「標的遺伝子編集」と置き換え可能)は、ゲノム内の予め選択された部位においての挿入、欠失、および/または置換を可能にする。標的編集の間に挿入部位において内在配列が欠失された場合、影響を受けた配列を含む内在性遺伝子は、配列の欠失によりノックアウトまたはノックダウンされ得る。従って、標的編集は内在性遺伝子発現を妨害する目的にも使用され得る。挿入部位における内在配列の欠失を伴うまたは伴わない、1または複数の外来配列の挿入を含むプロセスを指す「標的組込み」という用語も、本明細書で同様に使用される。比較において、ランダムに組み込まれた遺伝子は、位置効果およびサイレンシングを受けることで、その発現を不確かで予測不可能なものにする。例えば、セントロメアおよびサブテロメア領域は、導入遺伝子サイレンシングを特に受け易い。相互的に、新たに組み込まれた遺伝子は、周囲の内在性遺伝子およびクロマチンに影響を与えることで、細胞の挙動を変化させる、または細胞形質転換を援助する場合がある。従って、セーフ・ハーバー遺伝子座、またはゲノム内セーフ・ハーバー(GSH)等の予め選択された遺伝子座に外来性DNAを挿入することが、安全性、効率、コピー数制御、および信頼できる遺伝子応答制御にとって重要となる。
本発明は、1または複数の所望の部位に1または複数の標的編集を含むゲノム改変iPSCを入手し維持する方法を提供するものであり、ここで、前記標的編集は、各々の選択された編集部位において、増殖後のゲノム改変iPSCまたはiPSC由来非万能性細胞においてインタクト且つ機能的なままである。前記標的編集は、ゲノムiPSC(genome iPSC)に、選択された部位における、挿入、欠失、および/または置換、すなわち、標的組込みおよび/または挿入/欠失を導入する。
本発明のさらなる態様は、奇形腫形成によるゲノム改変iPSCのインビボ分化法を提供し、前記方法において、ゲノム改変iPSCからインビボで派生した分化細胞は、所望の部位に標的組込みおよび/または標的挿入/欠失を包含するインタクト且つ機能的な標的編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム改変iPSCからインビボで派生した分化細胞は、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRもしくはRUNX1、またはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、1または複数の所望の部位に組み込まれた、1または複数の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム改変iPSCからインビボで派生した分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、または、幹細胞および/もしくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/もしくは生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、1または複数の誘導性自殺遺伝子を含む、奇形腫を介してゲノム改変iPSCからインビボで派生した分化細胞は、免疫応答の制御および仲介と関連した内在性遺伝子に1または複数の挿入/欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記挿入/欠失は、1または複数の内在性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入/欠失は、1または複数の内在性T細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入/欠失は、1または複数の内在性MHCクラスI抑制遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入/欠失は、主要組織適合遺伝子複合体と関連した1または複数の内在性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、前記挿入/欠失は、B2M遺伝子、PD1遺伝子、TAP1遺伝子、TAP2遺伝子、タパシン遺伝子、TCR遺伝子を含むがこれらに限定はされない、1または複数の内在性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に1または複数の外来性ポリヌクレオチドを含むゲノム改変iPSCは、B2M(β−2−ミクログロブリン)をコードする遺伝子に標的編集をさらに含む。
a. iCD34−Cは、ROCK阻害剤、bFGF、VEGF、SCF、IL6、IL11、IGF、およびEPOからなる群から選択される1または複数の増殖因子およびサイトカイン、並びに所望により、Wnt経路活性化因子を含み;TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず;
b. iMPP−Aは、BMP活性化因子、ROCK阻害剤、並びにTPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、Flt3LおよびIL11からなる群から選択される1または複数の増殖因子およびサイトカインを含み;
c. iTC−A2は、ROCK阻害剤;SCF、Flt3L、TPO、およびIL7からなる群から選択される1または複数の増殖因子およびサイトカイン;並びに所望により、BMP活性化因子を含み;
d. iTC−B2は、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される1または複数の増殖因子およびサイトカインを含み;前記組成物はVEGF、bFGF、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの一つまたは複数を含まず;
e. iNK−A2は、ROCK阻害剤、並びにSCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される1または複数の増殖因子およびサイトカイン;並びに所望により、BMP活性化因子を含み、
f. iNK−B2は、SCF、Flt3L、IL7およびIL15からなる群から選択される1または複数の増殖因子およびサイトカインを含む。
上記に鑑みて、本発明は、組込み部位における内在性配列の欠失を伴うまたは伴わない、選択された部位における誘導万能性幹細胞(iPSC)のゲノムへの1または複数の外来性ポリヌクレオチドの標的組込みのためのコンストラクトを提供する。一実施形態では、前記コンストラクトは、1または複数の目的タンパク質を発現する1または複数の外来性ポリヌクレオチドに機能的に連結された少なくとも1つの外来性プロモーターを含む。一実施形態では、前記コンストラクトは、標的組込み用のベクターによってiPSCに導入される。別の実施形態では、前記コンストラクトが標的組込み用のベクターによって非万能性細胞に導入され、その後、前記非万能性細胞が再プログラム化を受けて、ゲノム改変iPSCが得られる。いずれのアプローチによっても、前記コンストラクトは組み込まれたままであり、前記外来性ポリヌクレオチドは、再プログラム化またはベクター導入から得られたiPSCにおいて、後に増殖されたiPSCにおいて、前記iPSCに由来する分化細胞において、およびそれに由来する脱分化細胞において、機能的である。
本発明は、遺伝子改変iPSCおよび/または開示される方法および組成物を用いて前記iPSCから派生した免疫細胞の単離された集団または亜集団を含む組成物を提供し、前記免疫細胞は、遺伝子改変されており、細胞に基づいた養子療法に好適である。一実施形態では、前記遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来HSC細胞を含む。一実施形態では、前記遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、HSC細胞由来のiPSCを含む。一実施形態では、前記遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来のプロT細胞またはT細胞を含む。一実施形態では、前記遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、iPSC由来のproNK細胞またはNK細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記iPSC由来遺伝子改変免疫細胞は、治療能の向上のためにエキソビボでさらに調節される。一実施形態では、iPSCから派生した遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ナイーブT細胞、幹細胞メモリーT細胞、および/またはセントラルメモリーT細胞の数または割合が増加している。一実施形態では、iPSCから派生した遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、I型NKT細胞の数または割合が増加している。別の実施形態では、iPSCから派生した遺伝子改変免疫細胞の単離された集団または亜集団は、獲得NK細胞の数または割合が増加している。いくつかの実施形態では、iPSC由来の遺伝子改変されたCD34細胞、HSC細胞、T細胞、またはNK細胞の単離された集団または亜集団は、同種他家由来である。いくつかの他の実施形態では、iPSC由来の遺伝子改変されたCD34細胞、HSC細胞、T細胞、またはNK細胞の単離された集団または亜集団は、自己由来である。
様々なセーフ・ハーバー遺伝子座の組込み戦略と組み合わせて、種々のプロモーターの制御下の自殺系を効率的に選択および試験するために、出願人の登録商標のあるhiPSCプラットフォームを用いた。前記hiPSCプラットフォームは、単一細胞の継代と、ハイスループットな96ウェルプレートを基盤としたフローサイトメトリーソーティングとを可能にし、単一または複数の遺伝子調節によるクローナルなhiPSCの誘導を可能にする。
培養物の培養密度が75%〜90%に達したら、hiPSCを単一細胞として定期的に継代した。単一細胞解離のため、hiPSCを、PBS(メディアテック社(Mediatech))で1回洗浄し、Accutase(ミリポア社)で37℃で3〜5分間処理し、その後、ピペッティングにより確実に単一細胞解離させた。この単一細胞懸濁液を次に、通常の培地と等量で混合し、225×gで4分間遠心し、FMM中に再懸濁し、Matrigelで被覆された表面上に播種した。継代は通常1:6〜1:8とし、Matrigelで37℃で2〜4時間事前に被覆された組織培養プレートに移し、2〜3日毎にFMMを与えた。細胞培養物は37℃、5%CO2に設定された加湿恒温器内で維持した。
ZFNを介したゲノム編集において、2×106個のiPSCに、2.5ugのZFN−L(FTV893;配列番号:2および4)、2.5ugのZFN−R(FTV894;配列番号:3および5)並びに5ugのAAVS1 誘導性カスパーゼ9ドナーコンストラクト(FTV895、FTV930、FTV921、FTV931、FTV932、FTV952またはFTV953;誘導性カスパーゼ9配列番号:7および8)プラスミドDNAの混合物をトランスフェクトした。CRISPRを介したゲノム編集においては、2×106個のiPSCに、5ugのROSA26−gRNA/カスパーゼ9(FTV922;配列番号6)および5ugのROSA26 誘導性カスパーゼ9ドナーコンストラクト(FTV955またはFTV956)の混合物をトランスフェクトした。トランスフェクションはNeon Transfection System(ライフテクノロジーズ社)(パラメーターは1500V、10ms、3パルスを使用)を用いて行った。前記プラスミドが人工プロモーターにより駆動されるGFPおよび/またはRFP発現カセットを含む場合、トランスフェクション後の2日目または3日目に、フローサイトメトリーを用いてトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション後の4日目に、ピューロマイシンを、最初の7日間は0.1ug/mlの濃度で、7日後に0.2ug/mlの濃度で、培地に加えて、標的細胞を選択した。ピューロマイシンによるセレクション中、10日目に、細胞を新鮮matrigel被覆ウェル上に継代した。ピューロマイシンによるセレクションの16日目から、生存細胞をGFP+iPS細胞の割合についてフローサイトメトリーで分析した。
ZFNを介してAAVS1 EF1αまたはCAGプロモーター駆動型誘導性カスパーゼ9−2A−GFPによって標的とされたiPSCについて、ピューロマイシンによるセレクションの20日後のGFP+SSEA4+TRA181+iPSCのバルク選別(bulk sort)およびクローナル選別(clonal sort)を行った。単一細胞に解離された標的iPSCのプールを、最適性能のために新鮮なものとされた、ハンクス平衡塩類溶液(メディアテック社)、4%ウシ胎児血清(インビトロジェン社)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン(メディアテック社)および10mM HEPES(メディアテック社)を含有する冷却染色バッファー中に再懸濁した。SSEA4−PE、TRA181−Alexa Fluor−647(BDバイオサイエンス社)を含む、結合型一次抗体を、この細胞液に加えて、氷上で15分間インキュベートした。抗体は全て、106個の細胞当たり、100μLの染色バッファー中、7μLで使用した。細胞液を染色バッファーで1回洗浄し、225gで4分間遠心沈殿させ、10μMチアゾビビン(Thiazovivn)を含有する染色バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーソーティングのために氷上で維持した。フローサイトメトリーソーティングはFACS Aria II(BDバイオサイエンス社)で行った。バルク選別では、GFP+SSEA4+TRA181+細胞をゲーティングし、7mlのFMMで満たされた15ml標準チューブ内に選別した。クローナル選別では、選別された細胞を、3イベント/ウェルの濃度で、100μMノズルを用いて96ウェルプレートに直接排出した。各ウェルには、5μg/mLフィブロネクチンおよび1×ペニシリン/ストレプトマイシン(メディアテック社)を添加した200μLのFMMを事前に充填し、5×Matrigelで一晩事前に被覆した。5×Matrigelの事前被覆は、一定分量のMatrigelを5mLのDMEM/F12に加え、次に4℃で一晩インキュベートして適切に再懸濁させ、そして50μL/ウェルで96ウェルプレートに添加し、その後37℃で一晩インキュベートすることを含む。この5×Matrigelは各ウェルへの培地添加の直前に吸引される。選別完了後、96ウェルプレートを225gで1〜2分間遠心し、その後インキュベートする。プレートを7日間静置した。7日目、150μLの培地を各ウェルから除去し、100μLのFMMと置き換えた。選別後の10日目に、ウェルに追加の100μLのFMMを再度加える。コロニー形成が早くも2日目に認められ、ほとんどのコロニーが選別後の7日目〜10日目の間に増殖した。最初の継代では、ウェルをPBSで洗浄し、30μLのAccutaseで、37℃でおよそ10分間剥離させた。Accutase処理延長の必要性は、長期間培養液中で未処理状態であったコロニーが詰まっていることを表す。細胞が剥離しているように見えたら、200μLのFMMを各ウェルに加え、数回ピペッティングしてコロニーをばらばらにする。剥離されたコロニーを、5×Matrigelで事前被覆された96ウェルプレートの別のウェルに移し、次いで、225gで2分間遠心し、その後インキュベーションする。この1:1継代は初期コロニーを増殖前に横に広げるために行われる。後の継代は、75〜90%コンフルエント後に、3〜5分間のAccutase処理、および1×Matrigelで事前被覆されたより大きなウェル内のFMM中での1:4〜1:8増殖により、定期的に行った。それぞれのクローナル細胞株を、GFP蛍光レベルおよびTRA1−81発現レベルについて分析した。100%近くがGFP+およびTRA1−81+であるクローナル株を、さらなるPCRスクリーニングおよび解析のために選択した。フローサイトメトリー解析はGuava EasyCyte 8 HT(ミリポア社)で行い、Flowjo(フロージョー社(FlowJo, LLC))を用いて解析した。
二量体化化学誘導物質(CID;AP1903)を、メドケムエクスプレス社(Medchemexpress)(ニュージャージー州マンモスジャンクション)から購入した。CID暴露の24時間後、細胞を回収し、7−アミノアクチノマイシンD(7−AAD)で、製造業者の取扱説明書(BDバイオサイエンス社)に従って染色した。7−AAD陽性細胞の割合を、フローサイトメトリー(Guava、EMDミリポア社、マサチューセッツ州ビルリカ)によって死細胞として定量化し、flowjoソフトウェアで解析した。
指向性単層三胚葉分化では、hiPSCを、分化開始の前日に、Matrigel被覆ウェル上のFMM中に播種した(例えば、内胚葉については2×105細胞/ウェル、外胚葉については5×104細胞/ウェル、中胚葉については1×104および5×104細胞/ウェル)。各胚葉分化について4つのレプリケートウェルを設けた。内胚葉分化では、FMM培地を内胚葉誘導培地(RPMI−1640、アスコルビン酸(50μg/ml)、モノチオグリセロール(450μM)、1×グルタミン、Knockout血清代替物(0.20%)、アクチビンA(100ng/ml)、CHIR99021(バイオビジョン社(Biovision))(3μM)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン)と置換した。2日後、培地(RPMI−1640、アスコルビン酸(50μg/ml)、モノチオグリセロール(450μM)、1×グルタミン、Knockout血清代替物(0.50%)、bFGF(5ng/ml)、アクチビンA(100ng/ml)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン)と置換した。3日目に、1つのウェルを固定し、Sox17について染色した(R&Dシステムズ社)。3日目に、1つのウェルをクリスタルバイオレットで染色した。2つの他のウェルは、AP1903で48時間処理し、次いで新鮮な分化培地で洗浄および補充し、5日間培養を継続した後、クリスタルバイオレットで染色した。中胚葉分化では、培地を、ITS、10ng/ml bFGF、20μMフォルスコリンおよび3μM CHIR99021を添加したDMEM/F12(メディアテック社)で置換した。培地を一日おきに交換し、4日目に1つのウェルを固定し、αSMAについて染色した(シグマ社)。4日目に、1つのウェルをクリスタルバイオレットで染色した。2つの他のウェルは、AP1903で48時間処理し、次いで新鮮な分化培地で洗浄および補充し、5日間培養を継続した後、クリスタルバイオレットで染色した。外胚葉分化では、FMM培地を、神経誘導培地(1×B27培地添加物(ライフテクノロジーズ社)、1×N2培地添加物(ライフテクノロジーズ社)、10μM SB431542および100nM LDN−193189を添加したDMEM/F12(メディアテック社))と置換した。培地を一日おきに交換し、7日目に1つのウェルを固定し、ネスチンについて染色した(アブカム社)。7日目に、1つのウェルをクリスタルバイオレットで染色した。2つの他のウェルは、AP1903で48時間処理し、次いで新鮮な分化培地で洗浄および補充し、5日間培養を継続した後、クリスタルバイオレットで染色した。
100mLの脱イオン水中に0.5gのクリスタルバイオレット染色液(シグマ社)を溶解させることにより、0.5%クリスタルバイオレット溶液を調製した。濾過し、室温で保存する。染色について、細胞をPBSで2回洗浄する。4%パラホルムアルデヒドを含有するPBSで置換し、15分間室温に置く。PBSで2回リンスする。0.1%クリスタルバイオレット(10%エタノール中で調製)で室温で15分間染色する。CVを捨てる。細胞を洗浄ビンからの脱イオン水で、水が暗色にならなくなるまで、穏やかに洗浄する。脱イオン水を取り除き、染色された細胞を乾燥させ、その後撮影した。
マウスは全て出願人の施設に収容された。マウスに関する実験プロトコルは全て、出願人の施設内動物管理使用委員会に承認されたものである。本研究で使用されたマウスは全て、7〜10週齢の雌NSGマウス(NOD/SCID/γnull、ジャクソン研究所)であった。奇形腫アッセイでは、50%のFMM培地および50%のMatrigel中の1〜2×106iPSCからなる200μlを、背外側領域の皮下に導入した。各マウスには、両側に2種の細胞注射を与え、誘導性カスパーゼ9を組み込まれたiPSCを左側に注射し、未改変親iPSC系統を右側に注射した。指示された時点でインビボ死滅を惹起するため、マウスに、5日間または7日間の腹腔内(i.p.)注射により、AP1903(125μg/マウス)を毎日投与した。マウスの奇形腫形成をモニターし、3週目または表示の通りに体積測定を開始した。奇形腫を表示された時点に採取し、組織学的検査または分子アッセイ用に処理した。AP1903ストックをDMSO中で調製した(25μg/ml)。1回の腹腔内注射用に、5μlの原液を200μlのPBSに加え、その後、水浴中で10分間超音波処理した。組織学的検査では、奇形腫をPBS中に採取し、4%パラホルムアルデヒド中で室温で一晩固定し、その後、加工のために、70%エタノール中で室温で維持した。試料を、切り出しおよびヘマトキシリン・エオシン染色用に、UCSD Histology Core Facilityに提出した。切片を調べ、解釈(interpret)し、ニコン社製DS−Fi1カメラを備えたニコン社製Eclipse TS100顕微鏡を用いて撮影した。
AP1903誘導性死滅をインビボで可視化するために、誘導性カスパーゼ9を組み込まれたiPSCおよび未改変親iPSCに、IRESによって連結されたホタルルシフェラーゼ遺伝子およびRFPから構成され、EF1αの制御下で発現される、多シストロン性カセットを含むレンチウイルス(バイオセティア社(Biosettia))を感染させた。感染細胞をRFP+細胞について選別し、上記の通りに注射した。2×106個の誘導性カスパーゼ9導入iPSCをNSGマウスの左側の皮下に注射し、同数の親iPSCを右側に注射した。AP1903腹腔内注射を、表示された日に投与した。iPSC移植の直後(0日目)から、キセノジェン社製(Xenogen)IVISイメージングシステムを用いて、移植および奇形腫体積を毎週モニターした。イメージングでは、マウスにD−ルシフェリン(4mg/マウス、サーモ・フィッシャー社(Thermo Fisher))を腹腔内注射し、10分後の生物発光を記録した。キセノジェン社製Living Imageソフトウェアを用いて解析を行った。
iPSCにおける適切な組込みおよび発現戦略のハイスループット解析を行うために、カスパーゼ−9を介した迅速な細胞死をAP1903等の二量体化の小分子化学誘導物質によって誘導できる、誘導性カスパーゼ9自殺遺伝子プラットフォームを選択した。なお、小分子誘導が最終産物へ向けた各発生段階において有効性を示すために、誘導性カスパーゼ9遺伝子は万能性幹細胞の維持および分化の全ての段階で継続的に発現される必要がある。AAVS1遺伝子座、ROSA26遺伝子座、およびH11遺伝子座を含むがこれらに限定はされない、セーフ・ハーバー遺伝子座に、種々の自殺遺伝子発現カセットを、効率的且つ正確に組込みそして維持するために、1ウェルにつき1個のhiPSCとした。内在性AAVS1またはROSA26、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、伸長因子1α(EF1α)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、ハイブリッドCMVエンハンサー/ニワトリβ−アクチン(CAG)プロモーターおよびユビキチンC(UBC)プロモーターを含む、種々の外来性プロモーターおよび内在性プロモーターの下流に自殺遺伝子発現カセットをそれぞれ含有するいくつかの組込みベクターを試験して、hiPSCおよびhiPSC由来分化細胞の療法における様々な自殺系の活性を系統的に解析し比較した。
先の研究で、AAVS1プロモーター下のピューロマイシンによるセレクションは、セレクション中の生存度および増殖を維持すると強く表現されたため、次は、誘導性カスパーゼ9を含むドナーコンストラクトを、挿入後に誘導性カスパーゼ9遺伝子発現を駆動する内在性AAVS1プロモーター(およびGFP、およびピューロマイシンマーカー遺伝子)を有する、AAVS1遺伝子座を標的とするように設計した(図2A)。hiPSCに、AAVS1遺伝子座に特異的なZFNおよびAAVS1内在性プロモーターの制御下の誘導性カスパーゼ9を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトした。ピューロマイシンによるセレクションをトランスフェクションの3日後に開始し、20日間続けた。その後、ピューロマイシン耐性細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、GFP発現を有することが示された(図2B)。次に、増殖させたピューロマイシン耐性iPSCをAP1903(またはDMSOコントロール)処理に24時間曝した。処理された細胞を回収し、7AADで染色し、フローサイトメトリーで解析した。7AAD陰性細胞(すなわち生細胞)の割合を、各処理に対してプロットした。しかし、AAVS1遺伝子座におけるCasp9の標的挿入および内在性AAVS1プロモーターによる制御されたCasp9発現を有するiPSCでは、全ての処理において、AP1903によって仲介される細胞死は検出されなかった(図2C)。ピューロマイシン耐性プールから得られたゲノムDNAのジャンクションPCRは、この集団における、AAVS1遺伝子座へのドナーベクターの標的挿入を示した(図2D)。従って、内在性AAVS1プロモーターにより制御されるAAVS1セーフ・ハーバー標的化誘導性カスパーゼ9自殺遺伝子は、AAVS1遺伝子座における正確な挿入にもかかわらず、誘導性カスパーゼ9発現を誘起しなかったと思われる。GFP発現強度に基づくと、再度、低レベル発現は誘導性カスパーゼ9介在性細胞死に十分ではないと思われる。
EF1α駆動型誘導性カスパーゼ9を含むドナーコンストラクトを、図2Eに従って、AAVS1遺伝子座を標的とするように設計した。AAVS1遺伝子座に特異的なZFNおよびEF1a駆動型誘導性カスパーゼ9を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトされたhiPSCを、ピューロマイシンによるセレクションに20日間かけ、その後、AP1903処理した。フローサイトメトリー解析を示す図3Aにおけるゲートをかけられた領域は、標的挿入を有するGFP陽性iPSC細胞をハイライトしているが、AP1903細胞死誘導に応答したものはわずかであった。これらのGFP陽性集団を濃縮および維持できるかを確かめるため、TRA181陽性(万能性且つ未分化状態を示すマーカー)且つGFP陽性(誘導性カスパーゼ9発現の指標)のhiPSCを、セレクション後16日目あたりに、バルク選別するか、または96ウェルプレート内で個別選別した(図3B)。GFP陽性のバルク選別されたhiPSCを、ピューロマイシン非含有培地中でさらなる時間維持して、長期にわたる集団特性を確かめた(図3C)。TRA181およびGFPを共に高発現する細胞の割合の、長い期間(例えば、選別後2日目から選別後16日目まで)をかけた減少が観察された。このデータは、EF1aは高レベルの発現を示したが、その発現を維持することができなかったことを示差しており、これは、万能性状態におけるサイレンシングが原因である可能性が最も高い。ロバストなEF1a介在性発現を有する個々のhiPSCが存在し得るかを確かめるため、個々のhiPSC選別細胞をスクリーニングした。単一細胞に選別されたTRA181およびGFP細胞に由来するクローナルなhiPSCの明視野(bright filed)画像により、単一に選別された細胞に由来するhiPSCコロニーの形態が示された(図3D)。AAVS1遺伝子座に標的挿入EF1α駆動型誘導性カスパーゼ9を有するクローナルなhiPSCを、次に、増殖させ、GFP発現について評価した。しかし、全てのコロニーが増殖後に様々な程度でGFP発現を失い、これは、EF1αプロモーターが挿入後の増殖中にhiPSCにおいて発現を維持できなかったことを示唆している(図3E参照、例えば、EF1αクローンC1およびC23)。まとめると、バルク選別および個別選別のレベルにおいて、EF1aは、GFP発現をロバストに維持できず、ひいては誘導性カスパーゼ9発現も維持できなかった。
いくつかの内在性プロモーターは、hiPSCのクローン増殖中に誘導性カスパーゼ9の持続的発現を駆動することが分かったが、測定されたその発現レベルは、AP1903処理に効果的に応答するには低すぎるものであった。種々の外来性プロモーターの制御下にある誘導性カスパーゼ9の発現も、長期のhiPSCクローン増殖の間に失われることが示され、AP1903誘導性細胞死を駆動できなかった。AAVS1遺伝子座に特異的なZFNおよびCAG駆動型誘導性カスパーゼ9を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトされたhiPSCを次に評価した(図2Eおよび表1)。
全ての選択されたCAG−hiPSCクローンを、万能性評価のために解析した。図5Aは、無フィーダー培養で維持されたCAGクローンC38を示す画像であり、個々の細胞が高い核対細胞質比で構成されているhiPSCの均一な培養物を示している。図5Bにおける、万能性マーカーであるNANOGおよびOCT4の蛍光免疫染色は、CAG−hiPSCクローンが万能性であり、且つ分化していないことを示している。また、選択されたCAG−hiPSCクローン(CAG−C5、CAG−C8、CAG−C12、CAG−C38、およびCAG−C40)の万能性状態を示すため、NANOG、OCT4、SOX2、REX1、DPPA2、およびMYCを含む種々の内在性万能性マーカーの発現について、定量的RT−PCRを行った。全てのCAG−hiPSCクローンにおいて、NANOG発現は親iPSCよりも低いことが示されている。TRA181、SSEA3およびCD30マーカー発現についてのフローサイトメトリー解析も行った。次に、選択されたCAGクローンを、胚葉特異的分化へと方向付け、胚葉マーカーについて評価した。図5Dは、選択されたCAGクローンが分化へと方向付けられた後の、外胚葉マーカーであるネスチン;中胚葉マーカーであるαSMA;および内胚葉マーカーであるSOX17の発現を示している。CAG−iPSCクローンの1つであるCAG−C38を、種々の系譜からなる奇形腫を生じる能力について、さらに評価した。図5Eは、注射の6週間後に採取した奇形腫であるが、3つの胚葉(内胚葉、中胚葉または外胚葉)を示している。これらのデータは、CAG−iPSCクローンが万能性および全系譜の非万能性細胞への分化能を保持したことを示している。
20種のCAG−誘導性カスパーゼ9標的化hiPSCクローンを、AP1903(またはDMSOコントロール)で24時間処理し、その後7AADで染色し、フローサイトメトリーでGFPおよび7AAD染色について解析した。全てのクローンが、AP1903処理後に95%超の7AAD染色陽性を示した(図6A)。2つの代表的なクローン(CAG−C5およびCAG−C38)から得られたフローサイトメトリープロットはまた、CAG−iPSCクローンの万能性状態におけるCasp9遺伝子応答を表すことも示された(図6A)。15種のCAG−誘導性カスパーゼ9標的化iPSCクローンを12ウェルプレート内の3連ウェルで培養した。コンフルエント後、1つのウェルはアルカリホスファターゼ染色して写真を撮り、他の2つのウェルはAP1903(10nM)で48時間処理した。処理後のウェルをPBSで洗浄し、残留生細胞を回復させるために新鮮な培地を加えた。8日間回復させたウェルをアルカリホスファターゼ染色し、撮影して、iPSCクローンの生存を記録した。15種のクローンのうち、CAG−C14クローンのみが生存クローンを含有した、すなわち、誘導死を回避した(図6B)。他の14種のクローンは染色を示さなかったが、これはCasp9の誘導発現後に生存した細胞が無かったことを示している。図6Cによって、AP1903(10nM)処理後の10cmディッシュ上のCAG−C5クローン生細胞による被覆率の動態が示された。生細胞は処理の約8分後から死に始め、AP1903処理の12分後にはほぼ全ての生細胞が死滅した。次に、CAG−誘導性カスパーゼ9標的化hiPSCクローンを誘導して三胚葉(内胚葉、中胚葉または外胚葉)からの細胞に分化させて、それぞれをAP1903で48時間処理し、分化培地中で5日間回復させた。処理前および回復後のレプリケートウェルをクリスタルバイオレットで染色したところ、図6Dに示されるような画像となった。CAG−C5クローンから得られた画像を代表として示したが、全ての系譜の細胞がAP1903処理後に死滅したことを示している。最後に、CAG−誘導性カスパーゼ9標的化hiPSCクローンを誘導してCD34+細胞に分化させ、AP1903で48時間処理し、細胞死についてフローサイトメトリー解析した。図6Eに示される7AAD染色の亢進によって、AP1903処理後のCD34+細胞死が示された。エピジェネティックな細胞状態を問わず(すなわち、万能性状態か、外胚葉、内胚葉もしくは中胚葉、またはCD34陽性細胞等の細胞型特異的な状態か)、AAVS1遺伝子座に標的化されたCAGは誘導性カスパーゼ9の発現をロバストに維持することを、データは示している。
誘導性カスパーゼ9の発現および誘導を介した細胞死をインビボで示すための、NSGマウス試験における皮下注射の位置を、図7Aに示した。親hiPSC株およびCAG−C38クローンを、4E6細胞で注射し(0日目)、7〜11日目にAP1903(腹腔内、計200μg)で処理した。34日目に、奇形腫を採取およびイメージングして、サイズを示した(図7B)。CAG−C38採取物のうち、1つの注射部位は腫瘍を含有しておらず、その他は大部分脂肪様細胞からなっていた。また、採取された奇形腫を体積測定した(図7C)。採取された腫瘍の中で、CAG−38 hiPSCを供給源とする奇形腫は、検出されないか、または、それらの親コントロールよりもかなり小さく見えた。採取された奇形腫をヘマトキシリン・エオシン染色した。その染色結果により、親iPSCクローンとCAG−hiPSCクローンとの間の組織像の違いが示される(図7D)。親hiPSC株は多数の三胚葉分化細胞型を示したが、CAG−C38は、おそらくはマウス由来である、大部分が高度に組織化された脂肪様細胞からなっているように見える。次に、親hiPSC株およびCAGクローンを、4E6細胞で注射し、40〜46日目にAP1903(腹腔内、計200μg)で処理した。全ての腫瘍を定期的に体積測定したところ、CAG−iPSCはCasp9遺伝子発現に対しなお応答性であり、選択されたCAG−iPSCクローンのいずれかを注射したマウスでは腫瘍体積の減少が生じた。まとめると、前記データは、インビトロおよびインビボにおける、AAVS1遺伝子座に標的化されたCAGプロモーターのロバストな発現を示している。
他の標的化戦略とセーフ・ハーバー遺伝子座との相乗作用を調べるため、この実験では、iPSCゲノムの異なる内在性遺伝子座を、CAGプロモーターによって駆動される外来遺伝子のヌクレアーゼ非依存的標的挿入の可能性について調べた。コンストラクトは、図9Aに示されるように、CRISPR/カスパーゼ9を有し、ROSA26遺伝子座を標的とするように設計した。hiPSCに、ROSA26遺伝子座に特異的なgRNA/カスパーゼ9−RFPプラスミドおよびCAG駆動型誘導性カスパーゼ9を含むドナーコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、細胞集団を、細胞内のGFP発現についてフローサイトメトリーで解析して、トランスフェクション効率を求めたところ、約80%〜約85%であることが示された(図9B)。ピューロマイシンによるセレクションをトランスフェクションの3日後に開始し、20日間継続した後、ピューロマイシン耐性細胞をGFP発現についてフローサイトメトリーで解析した。GFP発現はiPSC増殖中に維持された(図9B)。下記の表2は、図9Aに示すコンストラクトによる、iPSCの発現レベルおよび機能的応答を要約している。
AP1903処理から生存したクローンのピッキングおよび増殖により、AP1903処理後の生存クローンを見つけるために使用された手順を増進した(図8A)。示されたように、全ての回避クローンは、ジャンクションPCRによって示される正しい標的挿入を有する。配列変異が回避クローンに見られるかどうかを確かめるため、誘導性カスパーゼ9導入遺伝子のPCR増幅を行った後、精製およびゲノム配列決定を行った(図8B)。それらの回避クローンの誘導性カスパーゼ9導入遺伝子の配列は、配列決定された全てのクローンにおいて単一点変異K189Eを示した(図8C)。K189Eが不応性クローンの直接の原因かどうかを確かめるため、誘導性カスパーゼ9変異型を図2Eに従って作製し、トランスフェクションに使用し、得られた標的化iPSC細胞を調べた。図8Eは、CAS−誘導性カスパーゼ9野生型iPSC細胞との比較において、GFPを発現するCAS−誘導性カスパーゼ9変異型iPSC細胞がAP1903処理に応答性でないこと、および、全ての細胞が同一の高レベルGFP発現を伴って処理後に生存したこと、を示している。
上記実施例により、単一の不応性株に由来するインビトロ処理耐性クローンが、全ての試験されたクローンにおいて、誘導性カスパーゼ9に共通の不活性化点変異を含むことが示された。しかしながら、両対立遺伝子誘導性カスパーゼ9挿入を有するhiPSCクローンの選別によって、インビトロおよびインビボにおいて、死滅動態が向上し、耐性率が減少した。従って、単一の誘導性安全システム(single inducible safety system)に対して耐性が生じる可能性を避けるため、独自のセーフ・ハーバー遺伝子座にそれぞれ組み込まれた誘導性カスパーゼ9および単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼを含む、複数の条件自殺遺伝子を含むhiPSCクローンの作製およびセレクションを調査した。インビトロおよびインビボにおいて、二重の安全監視システム(dual safe guard system)を、単一の誘導性カスパーゼ9安全スイッチ(single iCasp9 safety switch)と比較して、移植細胞の安全性および効率的除去を評価した。
CAGプロモーター駆動型誘導性カスパーゼ9クローンにおける、定量PCRに基づいた導入遺伝子(誘導性カスパーゼ9−GFP)コピー数の評価により、少数のクローンが2コピー以上の導入遺伝子を有していることが明らかになった。図10Aに示されているように、コピー数1は単一対立遺伝子誘導性カスパーゼ9組込みを示唆し、コピー数2は両対立遺伝子誘導性カスパーゼ9組込みを示唆し、他方、2を超えるものはランダムインテグレーションの可能性を示唆する。図10Bに示される、単一対立遺伝子誘導性カスパーゼ9標的挿入または両対立遺伝子誘導性カスパーゼ9標的挿入を有する、選別プール培養物またはクローンにおける、誘導性カスパーゼ9−GFPの平均蛍光強度(MFI)は、導入遺伝子発現レベルがコピー数と対応しており、コピー数が多いほどMFIの読み取り値も高くなることを示している。標的化プール細胞およびクローンにおけるAAVS1−導入遺伝子接合部と重なるプライマーを用いた導入遺伝子組込みのPCR分析により、誘導性カスパーゼ9−GFP導入遺伝子のAAVS1遺伝子座への特異的組込みが確認された(図10C)。AAVS1組込み部位に特異的なプライマーを用いて、標的組込みを有する対立遺伝子の数を調べた。バンドが無いのは、両AAVS1対立遺伝子における組込み部位が破壊されていたこと、すなわち両対立遺伝子挿入、を示唆しており、一方、バンドが在るのは、一方または両方の対立遺伝子が破壊されていないことを示唆している(図10D)。図10Cおよび図10Dによって示されるように、CAG−C5クローンおよびCAG−C35クローンは、2コピーの導入遺伝子の両対立遺伝子挿入を有し、一方、CAG−C38クローンは、1つの対立遺伝子の標的位置に挿入された1つのコピーを有する。生細胞イメージングを用いて、10nM AP1903を添加した直後にプレート表面被覆率を評価した。図10Eに示されるように、未選別標的化プール細胞(組込まれた、および、組み込まれていない)は最も小さい誘導性死滅能を有し、一方、誘導性カスパーゼ9−GFPについて選別された標的化プール細胞(標的化されたランダムな組込み、コピー数が一様でない)は、わずかにより良い誘導性死滅能を示した。クローナルなCAG−C38細胞株(単一対立遺伝子標的挿入)およびCAG−C5細胞株(両対立遺伝子標的挿入)は、プール細胞と比較した場合、かなりより高い死滅速度および死滅効率を有する。
皮下位置注射を伴うNSGマウス試験は、図11Aにおいて、CAG−C38クローン、CAG−プール、PGK−プール(PGK−誘導性カスパーゼ9導入遺伝子)、UBC−プール(UBC−誘導性カスパーゼ9導入遺伝子)およびCMV−プール(CMV−誘導性カスパーゼ9導入遺伝子)における誘導性カスパーゼ9の発現および誘導を介したインビボ細胞死を示すことが示された。CAG−C38クローンおよびプールを、3つのNSGマウス群(n=2)に、4E6細胞で0日目に注射し、19〜25日目にAP1903(腹腔内125μg)でマウスを処置した。28日目に、奇形腫を採取およびイメージングして、サイズを示した。AP1903投与前(図11B、上段パネル)およびAP1903投与終了の3日後(図11B、下段パネル)の、3つのNSGマウス群の生物発光画像法により、外来性CAGプロモーターのみが、樹立iPSC由来奇形腫の誘導性カスパーゼ9介在性除去を可能にしたことが示された。この知見は図11C〜図11Gにおいてさらに示された。発光量(光子/秒)は、図11Bにおける奇形腫サイズの知見で確認された、図11Cにおいて平均値およびSDとして示される、表示される細胞型由来の奇形腫中の腫瘍細胞量を示す。表示される細胞型についての、処置前の発光量(平均値±SD)に対する処置後の発光量の比を、図11Dに示した。クローナルなCAG−C38およびCAGプール細胞を注射されたマウスについての両方の結果を、より高い解像度で、図11Eに別にプロットした。28日目の表示される細胞型に由来する奇形腫の末期体積測定値を、図11Fに示した。図11Gは、28日目の、表示される細胞型に由来する奇形腫の画像を示している。CAG−C38クローンまたはCAG−誘導性カスパーゼ9プール細胞を注射された側からは、奇形腫は検出されなかった。まとめると、これらのデータによって、誘導性カスパーゼ9−GFP導入遺伝子の発現を駆動する様々なプロモーターのインビトロ研究が確認され、インビトロおよびインビボにおいて、試験されたものの中でCAGプロモーターが最も有効であることが示された。これらデータはまた、CAG−C38クローンが、誘導性カスパーゼ9−GFPが単一対立遺伝子性であるのにもかかわらず、自殺遺伝子誘導後の奇形腫除去において、CAGプール細胞よりも有効であることを示している。
単一細胞レベルでの高分解度精密改変の性能および有効性を示すために、別々のセーフ・ハーバー遺伝子座に標的化された二重自殺遺伝子による安全監視システムを有するクローンiPSCを作製した。本明細書に記載の標的挿入法を用いて、CAG−C38クローンiPSCにおいて、AAVS1遺伝子座に組み込まれたCAG−誘導性カスパーゼ9に加えて、CAG−sr39TKをH11セーフ・ハーバーに組み込んだ。図13Aに示されるように、PCR分析により、GAPDHをローディングコントロールとして用い、sr39TK、sr39TK−ブラストサイジン(Bsd)接合部または内在性H11配列−導入遺伝子接合部に特異的なプライマーを用いて、H11セーフ・ハーバー遺伝子座へのsr39TKの特異的なゲノム組込みを確認した。H11遺伝子座にsr39TKの標的挿入を有する誘導性カスパーゼ9 iPSCクローン(sr39TKについてクローナルではない)を、最初の2日間の10nM AP1903処理有りまたは無しで、25μg/mLガンシクロビル(GCV)で9日間処理した。AP1903単独での2日間のCAG−C38 誘導性カスパーゼ9クローン(誘導性カスパーゼ9について単一対立遺伝子性)の処理は、ほとんどの細胞の誘導性死滅をもたらしたが、わずかに細胞が残った(図13B(ii))。GCV処理単独での9日間のCAG−C38 誘導性カスパーゼ9クローンの処理は、GCV不応性細胞の増殖をもたらした(図13B(iii))。しかし、AP1903およびGCVの両方による併用処理、全ての不応性細胞が効果的に除去され、このことは、二重の自殺安全監視システムの使用が、いずれかの誘導性自殺遺伝子下で回避した残留細胞を死滅させることにより、誘導性カスパーゼ9自殺遺伝子単独の使用よりも効果的であることを示している。
HLA複合体改変を達成するための、単一細胞遺伝子編集の実行可能性を示すために、野生型カスパーゼ9と比較して非特異的な作用が少なくなるように改変された、カスパーゼ9ニッカーゼを発現するプラスミドにおけるB2M標的化gRNA対をiPSC株にトランスフェクトした。図14Aにより、トランスフェクション前(左パネル)およびトランスフェクション後(中央パネル)のGFP発現およびB2M/HLA−I発現のフローサイトメトリー解析が示された。同じ色素に結合させた、B2M特異的抗体およびHLA−I特異的抗体を用いて、B2MおよびHLA−Iを同時に検出した。B2MおよびHLA−Iの両方について陰性の細胞(囲われた集団)を、バルク選別(図14A)または96ウェルプレート内でクローナルに選別して、クローナルな株を作製した(図14B)。標的編集を用いたB2M−/−且つHLA−I欠損クローンを、クローンゲノムDNA塩基配列決定法によってさらに解析し、B2Mノックアウト表現型をもたらす小さな欠失または挿入を有することを確かめた。
HLA−Iの不在が、B2M−/−hiPSCがTリンパ系応答から逃れることを可能にするかどうかを確かめるため、末梢血T細胞を、hiPSCと一緒に10日間共培養することにより予備刺激した。10日後、増殖し予備刺激されたT細胞を回収し、細胞傷害性エフェクター細胞として使用した。野生型hiPSC(WT)またはB2M−/−(改変型)hiPSC標的細胞を、単独で、または予備刺激されたT細胞との1:3の比の共培養系として、播種した。ウェル当たりの標的細胞の数を、Incucyte Zoomを用いて5日間に亘って測定した。図15Aに示されるように、WT hiPSC標的細胞は予備刺激されたT細胞によって認識および死滅されたが、一方、改変hiPSCは影響を受けなかった。
改変型HLA−I欠損iPSCがインビボにおいて増加された残留性を有するかどうかを確かめるため、ルシフェラーゼを導入した野生型iPSCおよびB2M−/−HLA−E iPSCを、奇形腫アッセイにおける十分に免疫応答性のC57BL/6レシピエントの対立する側腹部に皮下注射した。マウスを毎日、ルシフェリン注射と併せたIVISイメージングで分析し、発達してゆく奇形腫を可視化した。図16Bには、注射後72〜144時間の時点で、B2M−/−HLA−E iPSCは野生型iPSCと比較して約6倍の量的残留性の増加を示すことが示されている。また、B2M−/−HLA−E iPSC奇形腫を有する、増強されたルシフェリンイメージングを示す3匹の代表的なマウスを図16Bに示した。HLA−Eの代わりにHLA−Gを使用した場合も同様の残留性向上が観察された。加えて、上記のように、切断を回避するための改変型のHLA−EまたはHLA−Gを適用することで、HLAクラスI改変iPSCのインビボ残留性はさらに増強される。興味深いことに、CMV+ドナーから得られたNK細胞がNKG2C発現を示す、すなわち活性型である、いくつかのシナリオの中で、HLA−E細胞表面発現がNKG2Cをむしろ活性化し、そうすることで、NK細胞認識およびその結果起るHLA−E発現細胞の死滅を含む有害作用をもたらすことが認められた。NK細胞がNKG2Aを発現する場合とは対照的に、これらのNK細胞はHLA−Eを表面に発現するiPSCおよび分化した子孫によって不活性化されることがあり、それによって、これらのHLA−E表面発現細胞の残留性が増強される。
現行の分化プラットフォームを介して得られた誘導リンパ球を用いる免疫療法で望ましい特性を増強するために、iPSCレベルで改変または調節された分子が使用され得る。これらの分子には、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補;または、iPSCもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、免疫応答の制御および調節、並びに/もしくは生存を促進するタンパク質が包含され得る。B2M/HLA−IおよびHLA−E/Gに加えて、所望の特性に寄与する標的分子として、CD16受容体および41BBL副刺激分子、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR(キメラ抗原受容体)、TCR(T細胞受容体)、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子、エンゲージャー、並びに二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーを結合するための表面上誘発受容体がさらに包含されるが、これらに限定されない。より具体的には、iPSCにおける標的分子の遺伝子改変は、以下のうちの一つまたは複数を包含する:B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、および染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子の発現の欠失または減少;HLA−E、HLA−G、HACD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受容体、エンゲージャー、または二重特異性もしくは多重特異性もしくは普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体の導入または発現増加。標的分子の発現の増加または減少は、永続的でも、一過的でも、時間的でも、または誘導性であってもよく、内在性プロモーターに制御されるものでも、または外来性プロモーターに制御されるものでもよい。
キメラ抗原受容体(CAR)は、特異性をT細胞またはNK細胞等の免疫エフェクター細胞上に向ける働きをする、改変された膜貫通受容体である。CARは、典型的には、抗原認識を与えるためのモノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片(scFV)、および免疫エフェクター細胞に活性化シグナルを与えるための細胞内シグナル伝達ドメインの組み合わせからなる融合タンパク質である。CAR−免疫エフェクター細胞は、あらゆる腫瘍関連抗原を認識するように改変可能であり、それ故、HLA適合の必要なく、改変された免疫エフェクター細胞を腫瘍細胞のみに標的化可能であることから、CARには強力な普遍的がん免疫療法として大いなる可能性がある。
iPSC、並びに、T細胞、NK細胞、NKT細胞、マクロファージ、および好中球を含む派生リンパ系エフェクター細胞の細胞傷害活性は、エフェクター細胞を標的腫瘍細胞に向け直すことが可能な二重特異性または多重特異性エンゲージャーを結合することにより、さらに増強できる。一般的に、二重特異的または多重特異的結合の概念は、腫瘍関連抗原およびエフェクター細胞の表面にある活性化受容体を同時に標的とする二重特異性または多重特異性抗体を用いる、エフェクター細胞の特定の腫瘍細胞への再標的化が焦点となる。また、この二重特異的結合はエフェクター細胞機能を刺激し、有効なエフェクター細胞活性化をもたらし、最終的には腫瘍細胞の破壊をもたらす。エフェクター細胞活性化および腫瘍細胞死滅は、エフェクターおよび標的細胞が二重特異性エンゲージャーによって架橋結合された時にのみ起るため、安全制御機構が与えられる。さらに、この再標的化エンゲージャーを通じて、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)拘束的な活性化が回避される。
テロメアの短縮は、細胞の加齢に伴って起こり、幹細胞の機能障害および細胞老化と関連している。iPSC由来細胞療法の重要な誘因は、iPSC由来細胞性産物が、より大きな増殖能に典型的なより長いテロメア長を有するであろうことである。iPSC由来iNK細胞のテロメア完全性を評価するため、27日間のiNK細胞培養物および成熟PB由来NK細胞から、CD56+細胞を単離した。精製後、各試料を、等しい数の参照細胞、30kbを超えるテロメアを有するヒトT細胞白血病細胞株(1301細胞株)、と組み合わせた。各々の試料/参照細胞混合物について、プローブを含まないハイブリダイゼーション液の存在下で、または、フルオレセイン結合型ペプチド核酸(PNA)テロメアプローブ(Telomere PNA kit、ダコ社(Dako Inc))を含有するハイブリダイゼーション液中で、DNAを変性させた。試料/参照細胞混合物を暗所、室温(RT)で一晩インキュベートし、次いで洗浄して未結合のプローブを除去した。DNA染色液を全試料に加えた後、BD Fortessa X−20(BDバイオサイエンス社)で取得を行った。1301細胞株と比較した相対テロメア長は、G0/1期のDNA指数に対する補正を伴う、各試料のテロメアシグナルと参照細胞(1301細胞株)のテロメアシグナルとの間の比として算出した。図31は、iNK細胞が、2種の別々の成熟NK細胞ドナーと比べてより長いテロメア長を有するが、iPSCコントロールと比べるとより短いテロメア長を有すること、を示しており、これは、ドナーNK細胞との比較における、iPSC由来NK細胞の、より大きな増殖能、生存能および残留性を示している。
一例としてiPSC由来プロT(T前駆細胞)を用いて、iPSC由来細胞性産物の凍結保存能;および、iPSC由来前駆細胞産物に関して、完全分化細胞へのさらなる分化能を維持する能力を評価した。iPSC由来の選別CD34+細胞を、T細胞分化培養液中でさらに10日間分化させた。10+10日目に、CD45+CD34+CD7+プロT細胞をFACSで単離し、2種の別々の凍結保存培地中で凍結保存した。プロT細胞を、凍結保存後、解凍してT細胞分化培養液に植え戻した。図35は、フローサイトメトリーによる、プロT細胞の単離前(A)、および解凍から3日後(BおよびC)の、CD34およびCD7の発現を示している。10+13日目、凍結保存したプロT細胞は、凍結保存されなかったプロT細胞(B)と比較して、同じように、CD34−CD45+CD7+細胞へのさらなる分化を起こす(C)。図35はさらに、これらのプロT細胞が解凍後も生存可能であること(D)を示しており、T細胞分化培地中で培養された場合の細胞増殖の増加(E)を示している。
Claims (126)
- 以下を含むコンストラクトであって、
前記コンストラクトに含まれる1もしくは複数の外来性プロモーターに機能的に連結された、または、組込み後に選択された部位に含まれる内在性プロモーターに機能的に連結された、1または複数の目的の外来性ポリヌクレオチド;および、前記選択された部位に特異的であり、且つ、前記目的の外来性ポリヌクレオチドと隣接している、一対のホモロジーアーム、
前記コンストラクトは、iPSCの選択された部位における外来性ポリヌクレオチドの標的組込みのためのコンストラクトであり;
前記1または複数の外来性ポリヌクレオチドは、後に増殖されたiPSC、前記iPSCに由来する分化細胞、および/またはそれに由来する脱分化細胞において、組み込まれ、且つ機能的なままである、
コンストラクト。 - 前記1もしくは複数の外来性ポリヌクレオチドがリンカー配列によって互いに連結されている;または、前記1もしくは複数の外来性ポリヌクレオチドが同一もしくは異なるプロモーターの下で発現する、請求項1に記載のコンストラクト。
- 前記リンカー配列が自己切断型ペプチドをコードする、請求項2に記載のコンストラクト。
- 前記リンカー配列が配列内リボソーム進入配列(IRES)を与える、請求項2に記載のコンストラクト。
- マーカーをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載のコンストラクト。
- 前記選択された部位における内在性プロモーターによって駆動される、マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項5に記載のコンストラクト。
- 前記選択された部位が、セーフ・ハーバー遺伝子座、高発現遺伝子座、時間発現される遺伝子座、または妨害のための遺伝子座である、請求項1に記載のコンストラクト。
- 前記セーフ・ハーバー遺伝子座がAAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRもしくはRUNX1、もしくはゲノム内セーフ・ハーバーの基準を満たす遺伝子座を含む;または、前記妨害のための遺伝子座がB2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、および染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子を含む、請求項7に記載のコンストラクト。
- 前記外来性ポリヌクレオチドの少なくとも1つが、CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC、または他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または細胞型特異的プロモーターを含む外来性プロモーターに機能的に連結されている、請求項1に記載のコンストラクト。
- 前記1または複数のポリヌクレオチドが、1または複数のセーフティ・スイッチタンパク質;標的化モダリティ;受容体;シグナル伝達分子;転写因子;薬剤的に活性なタンパク質またはペプチド;薬物標的候補;並びに、前記コンストラクトを組み込まれたiPSCまたはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/または生存を促進するタンパク質をコードする、請求項1に記載のコンストラクト。
- 前記1または複数のポリヌクレオチドがカスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変EGFR、B細胞CD20、またはこれらのあらゆる組み合わせを含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする、請求項1に記載のコンストラクト。
- セーフティ・スイッチタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドがCAGに機能的に連結されている、請求項11に記載のコンストラクト。
- ゲノム内の1または複数の選択された部位に少なくとも1つの標的ゲノム編集を含むゲノム改変iPSCを作製する方法であって、以下の(I)、(II)または(III)を含み:
(I):iPSCを遺伝子改変することであって、以下の(i)および(ii)の片方または両方を任意の順序で含む:
(i)iPSCに請求項1に記載のコンストラクトを1または複数導入して、選択された部位に標的組込みさせること;
(ii)
(a)選択された部位の認識が可能な1または複数のエンドヌクレアーゼを用いて、前記選択された部位において、1または複数の二重鎖切断をiPSCに導入すること;および
(b)段階(I)(ii)(a)のiPSCを培養して、内在性DNA修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入/欠失を生じさせること;
(II):再プログラム化中の非万能性細胞を遺伝子改変して、ゲノム改変iPSCを得ることであって、以下を含む:
(i)非万能性細胞を、1または複数の再プログラム化因子、並びに所望により、TGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤および/またはROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、前記非万能性細胞の再プログラム化を開始させること;並びに
(ii)段階(II)(i)の再プログラム化中の非万能性細胞に、(a)および(b)の片方または両方を、任意の順序で導入すること:
(a)選択された部位における標的組込みを可能にする、請求項1に記載の1または複数のコンストラクト;
(b)選択された部位の認識が可能な少なくとも1つのエンドヌクレアーゼを用いる、選択された部位における1または複数の二重鎖切断、
ここで、段階(II)(ii)(b)の細胞を、培養することで、内在性DNA修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入/欠失を生じさせる;
並びに、
(III):再プログラム化のための非万能性細胞を遺伝子改変して、ゲノム改変iPSCを得ることであって、以下の(i)および(ii)を含む:
(i)非万能性細胞に、(a)および(b)の片方または両方を、任意の順序で導入すること:
(a)選択された部位における標的組込みを可能にする、請求項1に記載の1または複数のコンストラクト;
(b)選択された部位の認識が可能な少なくとも1つのエンドヌクレアーゼを用いる、選択された部位における1または複数の二重鎖切断、
ここで、段階(III)(i)(b)の細胞を、培養することで、内在性DNA修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入/欠失を生じさせる;並びに
(ii)段階(III)(i)の細胞に、1または複数の再プログラム化因子、並びに所望により、TGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤および/またはROCK阻害剤を含む小分子組成物を接触させて、選択された部位に標的編集を含むゲノム改変iPSCを得ること;
これらにより、少なくとも1つの機能的な標的ゲノム編集を含み、且つ、部分分化細胞または完全分化細胞に分化可能である、ゲノム改変iPSCを得る方法。 - 1または複数の選択された部位における少なくとも1つの標的ゲノム編集が、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、または、ゲノム改変iPSCもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/もしくは生存を促進するタンパク質をコードする1または複数の外来性ポリヌクレオチドの挿入を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記外来性ポリヌクレオチドが、(1)CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む1もしくは複数の外来性プロモーター;または、(2)AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRもしくはRUNX1を含む選択された部位に含まれる1または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている、請求項14に記載の方法。
- 前記ゲノム改変iPSCが、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変EGFR、またはB細胞CD20を含むタンパク質をコードする1または複数の異なる外来性ポリヌクレオチドを含み、前記ゲノム改変iPSCが2つ以上の自殺遺伝子を含む場合、前記自殺遺伝子はAAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRまたはRUNX1を含む異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれる、請求項14に記載の方法。
- 前記ゲノム改変iPSCが、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答の制御および調節、または、iPSCもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した1または複数の内在性遺伝子に挿入/欠失を含む、請求項14または16に記載の方法。
- 前記内在性遺伝子が、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、および染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも1つを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記ゲノム改変iPSCが、カスパーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをAAVS1遺伝子座に含み、且つ、チミジンキナーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをH11遺伝子座に含む、請求項16に記載の方法。
- (I)群、(II)群および/または(III)群が、前記ゲノム改変iPSCを、MEK阻害剤、GSK3阻害剤およびROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させることをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 少なくとも1つの標的ゲノム編集を含む得られたゲノム改変iPSCが、機能的であり、分化能を有し、且つ、同一の機能的なゲノム編集を含む非万能性細胞に分化可能である、請求項13〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法13〜21のいずれか1つから作製されたゲノム改変iPSC。
- iPSCが請求項1に記載のコンストラクトに含まれた1または複数の外来性ポリヌクレオチドを含み、前記外来性ポリヌクレオチドが1または複数の選択された部位に組み込まれている、請求項22に記載のゲノム改変iPSC。
- 標的化モダリティ;受容体;シグナル伝達分子;転写因子;薬物標的候補;免疫応答の制御および調節;並びに、iPSCもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた1または複数の挿入/欠失を含む、請求項22または23に記載のゲノム改変iPSC。
- 前記内在性遺伝子がB2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、および染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子のうちの一つまたは複数を含む、請求項24に記載のゲノム改変iPSC。
- B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAPおよび染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも1つの欠失または発現低下を含む、請求項22に記載のゲノム改変iPSC。
- HLA−E、HLA−G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも1つの導入または発現増加を含む、請求項22または26に記載のゲノム改変iPSC。
- 前記導入または発現増加が、外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入するための組込み法または非組込み法を介したものである、請求項27に記載のゲノム改変iPSC。
- HLAクラスIおよび/またはクラスIIを欠損している、請求項22または26に記載のゲノム改変iPSC。
- ヌルまたは低発現のB2M、ヌルまたは低発現のTAP1、および/またはヌルまたは低発現のTAP2を含む、請求項22または29に記載のゲノム改変iPSC。
- HLA−Eタンパク質、HLA−Gタンパク質、CD16タンパク質、41BBLタンパク質およびPDL1タンパク質のうちの一つもしくは複数をコードする組込み型もしくは非組込み型の外来性ポリヌクレオチドを含む;または、HLA−Eタンパク質、HLA−Gタンパク質、CD16タンパク質、41BBLタンパク質およびPDL1タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入を含む、請求項22または30に記載のゲノム改変iPSC。
- 高親和性CD16受容体をコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;切断不可CD16受容体をコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;高親和性且つ切断不可のCD16受容体(hnCD16)をコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;切断不可なHLA−Eをコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;または、切断不可なHLA−Gをコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項22または31に記載のゲノム改変iPSC。
- セーフティ・スイッチタンパク質;標的化モダリティ;受容体;シグナル伝達分子;転写因子;薬剤的に活性なタンパク質もしくはペプチド;薬物標的候補;または、iPSCもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/もしくは生存を促進するタンパク質を含むタンパク質をコードする1または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項22〜32のいずれか一項に記載のゲノム改変iPSC。
- 前記1または複数のコンストラクトに含まれる外来性ポリヌクレオチドが、(1)CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む1もしくは複数の外来性プロモーター;または、(2)AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRもしくはRUNX1を含む選択された部位に含まれる1もしくは複数の内在性プロモーターに、組込みの後に機能的に連結される、請求項33に記載のゲノム改変iPSC。
- カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変EGFR、またはB細胞CD20を含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項22〜34のいずれか一項に記載のゲノム改変iPSC。
- AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRまたはRUNX1を含む同一のセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた、少なくとも2つの同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項22〜35のいずれか一項に記載のゲノム改変iPSC。
- AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRまたはRUNX1を含む異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた、2つの同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項22〜36のいずれか一項に記載のゲノム改変iPSC。
- 同じゲノム改変を持たないiPSCと比較して、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加された免疫耐性、または増加されたT細胞および/もしくはNK細胞に対する抵抗性を有し;且つ、万能性を維持し;且つ、同一の機能的なゲノム改変を有する非万能性細胞への分化能を維持している、請求項22〜37のいずれか一項に記載のゲノム改変iPSC。
- 部分分化細胞または完全分化細胞に分化可能であり、前記部分分化細胞または完全分化細胞は前記iPSCに含まれた少なくとも1つの標的ゲノム編集を含む、請求項22〜38のいずれか一項に記載のゲノム改変iPSC。
- 造血系細胞に分化可能な、請求項22〜39のいずれか一項に記載のゲノム改変iPSC。
- 前記部分分化細胞が中胚葉細胞、CD34細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、T細胞前駆細胞、またはNK細胞前駆細胞を含み;前記完全分化細胞がT細胞、NKT細胞、NK細胞、またはB細胞を含む、請求項22〜39のいずれか一項に記載のゲノム改変iPSC。
- 以下を含むゲノム改変iPSC:
(i)ヌルまたは低発現のB2M;
(ii)ヌルまたは低発現のTAP1;
(iii)ヌルまたは低発現のTAP2;
(iv)ヌルまたは低発現のタパシン;
(v)HLA−Eもしくは切断不可HLA−Eの発現導入;
(vi)HLA−Gもしくは切断不可HLA−Gの発現導入;
(vii)PDL1の発現導入;
(viii)高親和性切断不可CD16(hnCD16);
(ix)Fc受容体;
(x)T細胞受容体(TCR);
(xi)キメラ抗原受容体(CAR)
(xii)セーフティ・スイッチタンパク質を発現する1もしくは複数の自殺遺伝子;
(xiii)二重特異性、多重特異性もしくは普遍的なエンゲージャー、または
これらのあらゆる組み合わせ。 - 前記TCR、CAR、エンゲージャー、Fc受容体、または自殺遺伝子が誘導性である、請求項42に記載のゲノム改変iPSC。
- 同じゲノム改変を持たないiPSCと比較して、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたT細胞および/もしくはNK細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し;且つ、万能性を維持し;且つ、同一の機能的なゲノム改変を有する非万能性細胞への分化能を維持している、請求項42または43に記載のゲノム改変iPSC。
- HLAクラスIおよび/またはIIを欠損しており、且つ、(1)外来性のHLA−E、HLA−G、CD16、4lBBL、CD47、CD113、およびPDL1のうちの一つもしくは複数;または、(2)HLA−Eタンパク質、HLA−Gタンパク質、CD16タンパク質、4lBBLタンパク質、CD47タンパク質、CD113タンパク質、およびPDL1タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入;並びに所望により、(3)TCR、CAR、エンゲージャー、Fc受容体、および単一もしくは二重のセーフティ・スイッチタンパク質のうちの一つもしくは複数をさらに含む、改変HLA欠損iPSC。
- 前記TCR、CAR、エンゲージャー、Fc受容体、または自殺遺伝子が誘導性である、請求項45に記載の改変HLA欠損iPSC。
- 同じゲノム改変を持たないiPSCと比較して、向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたT細胞および/もしくはNK細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し;且つ、万能性を維持し;且つ、HLA欠損であり且つ同一の機能的なゲノム改変を有する非万能性細胞への分化能を維持している、請求項45または46に記載の改変HLA欠損iPSC。
- ゲノム改変iPSC由来のゲノム改変非万能性細胞を作製する方法であって、
(i) 少なくとも1つの機能的なゲノム編集を含む、請求項22〜44のいずれか一項に記載のゲノム改変iPSCまたは請求項45〜47に記載の改変HLA欠損iPSCを得ること;および
(ii) 前記ゲノム改変iPSCまたは前記改変HLA欠損iPSCを分化させて、前記ゲノム改変iPSCに含まれた同一の機能的な標的ゲノム編集を含む派生非万能性細胞を得ること、
を含む方法。 - 前記派生非万能性細胞が造血系細胞を含み;前記分化段階(ii)が胚様体の形成を含まない、請求項48に記載の方法。
- 前記派生非万能性細胞が中胚葉細胞、CD34細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、またはB細胞を含む、請求項48に記載の方法。
- iPSCからゲノム改変非万能性細胞を作製する方法であって、
(i) iPSCを、系譜特異的分化を開始させるのに十分な条件下に曝すこと;並びに
(ii) 任意の順序の(a)および(b)の片方または両方によって、段階(i)の分化中の細胞を遺伝子改変してゲノム改変非万能性細胞を得ること:
(a)段階(i)の分化中の細胞に請求項1に記載のコンストラクトを1または複数導入して、選択された部位に標的組込みさせること;
(b)
(1)選択された部位の認識が可能な少なくとも1つのエンドヌクレアーゼを用いて、前記選択された部位において、1または複数の二重鎖切断を段階(i)の分化中の細胞に導入すること;および
(2)段階(ii)(b)(1)から得られた細胞を培養して、内在性DNA修復を起こさせ、前記選択された部位に標的挿入/欠失を生じさせること;
を含み、
これらにより、1または複数の選択された部位に1または複数の機能的な標的編集を含むゲノム改変非万能性細胞を得る方法。 - 前記ゲノム改変非万能性細胞が造血系細胞を含む、請求項51に記載の方法。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞が中胚葉細胞、CD34細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、またはB細胞を含む、請求項51に記載の方法。
- 1または複数の機能的な標的ゲノム編集を含む、請求項48〜53のいずれか一項に記載の方法を用いて作製されたiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- 中胚葉細胞、造血内皮細胞、CD34細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、またはB細胞を含む、請求項54に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- セーフティ・スイッチタンパク質;標的化モダリティ;受容体;シグナル伝達分子;転写因子;薬剤的に活性なタンパク質もしくはペプチド;薬物標的候補;または、非万能性細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/もしくは生存を促進するタンパク質を含むタンパク質をコードする1または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項54および請求項55に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- 標的化モダリティ;受容体;シグナル伝達分子;転写因子;薬物標的候補;免疫応答の制御および調節;並びに、非万能性細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/または生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた1または複数の挿入/欠失を含む、請求項54および請求項56に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- 1または複数の挿入/欠失を含む前記内在性遺伝子がB2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、および染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子を含む、請求項57に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、および染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも1つに欠失または発現減少を含む、請求項57に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- HLA−E、HLA−G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも1つの導入または発現増加を含む、請求項57に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- (i)同一のセーフ・ハーバー遺伝子座にそれぞれ組み込まれ、同じもしくは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする、少なくとも2つの外来性ポリヌクレオチド;または
(ii)異なるセーフ・ハーバー遺伝子座にそれぞれ組み込まれ、同じもしくは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする、少なくとも2つの外来性ポリヌクレオチド、
を含む、請求項54〜60のいずれか一項に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。 - セーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドが、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変EGFR、B細胞CD20、およびこれらのあらゆる組み合わせから選択される、請求項61に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- 前記セーフ・ハーバー遺伝子座がAAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRまたはRUNX1を含む、請求項61に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- 非万能性細胞に含まれた同一の機能的な外来性ポリヌクレオチドを含むiPSCに再プログラム化することが可能な、請求項54〜63のいずれか一項に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- iPSC由来ゲノム改変非万能性細胞から再プログラム化されたiPSCが部分分化細胞または完全分化細胞に分化可能である、請求項64に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- 細胞が異なる予定運命の非万能性細胞に分化転換可能な、請求項54〜63に記載のiPSC由来ゲノム改変非万能性細胞。
- 以下を含み:
(i)ヌルまたは低発現のB2M;
(ii)ヌルまたは低発現のTAP1;
(iii)ヌルまたは低発現のTAP2;
(iv)ヌルまたは低発現のタパシン;
(v)HLA−Eもしくは切断不可HLA−Eの発現導入;
(vi)HLA−Gもしくは切断不可HLA−Gの発現導入;
(vii)PDL1の発現導入;
(viii)高親和性切断不可CD16(hnCD16);
(ix)Fc受容体;
(x)T細胞受容体(TCR);
(xi)キメラ抗原受容体(CAR)
(xii)セーフティ・スイッチタンパク質を発現する1もしくは複数の自殺遺伝子;
(xiii)二重特異性、多重特異性もしくは普遍的なエンゲージャー、または
これらのあらゆる組み合わせ、
iPSCはゲノム改変造血系細胞と同じゲノム編集を含む、
iPSC由来ゲノム改変造血系細胞。 - 前記TCR、CAR、エンゲージャー、Fc受容体、または自殺遺伝子が誘導性である、請求項67に記載のiPSC由来ゲノム改変造血系細胞。
- 中胚葉細胞、造血内皮細胞、CD34細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、T細胞前駆細胞、またはNK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、またはB細胞を含む、請求項67または68に記載のiPSC由来ゲノム改変造血系細胞。
- 向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたT細胞および/もしくはNK細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し;分化度が低いゲノム改変造血系細胞は同一の機能的なゲノム改変を有するより分化した造血系細胞への分化能を維持している、請求項67〜69のいずれか一項に記載のiPSC由来ゲノム改変造血系細胞。
- iPSC由来造血細胞を含む組成物であって、
請求項67〜70のいずれか一項に記載の、
(a) iPSC由来ゲノム改変CD34細胞;
(b) iPSC由来ゲノム改変造血幹細胞・前駆細胞;
(c) iPSC由来ゲノム改変造血幹細胞・前駆細胞;
(d) iPSC由来ゲノム改変造血性多能性前駆細胞;
(e) iPSC由来ゲノム改変T細胞前駆細胞;
(f) iPSC由来ゲノム改変NK細胞前駆細胞;
(g) iPSC由来ゲノム改変T細胞;または
(h) iPSC由来ゲノム改変NK細胞;
またはこれらのあらゆる組み合わせ、
を含む組成物。 - 以下を含むゲノム改変造血系細胞:
(i)ヌルまたは低発現のB2M;
(ii)ヌルまたは低発現のTAP1;
(iii)ヌルまたは低発現のTAP2;
(iv)ヌルまたは低発現のタパシン;
(v)HLA−Eもしくは切断不可HLA−Eの発現導入;
(vi)HLA−Gもしくは切断不可HLA−Gの発現導入;
(vii)PDL1の発現導入;
(viii)高親和性切断不可CD16(hnCD16);
(ix)Fc受容体;
(x)T細胞受容体(TCR);
(xi)キメラ抗原受容体(CAR)
(xii)セーフティ・スイッチタンパク質を発現する1もしくは複数の自殺遺伝子;
(xiii)二重特異性、多重特異性もしくは普遍的なエンゲージャー、または
これらのあらゆる組み合わせ。 - TCR、CAR、エンゲージャー、Fc受容体、または自殺遺伝子が誘導性である、請求項72に記載のゲノム改変造血系細胞。
- 中胚葉細胞、造血内皮細胞、CD34細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、またはB細胞を含む、請求項72または請求項73に記載のゲノム改変造血系細胞。
- 向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたT細胞および/もしくはNK細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し;分化度が低いゲノム改変造血系細胞は同一の機能的なゲノム改変を有するより分化した造血系細胞への分化能を維持している、請求項72〜74のいずれか一項に記載のゲノム改変造血系細胞。
- HLAクラスIおよび/またはIIを欠損しており、且つ、(1)外来性のHLA−E、HLA−G、CD16、4lBBL、CD47、CD113、およびPDL1のうちの一つもしくは複数;または、(2)HLA−Eタンパク質、HLA−Gタンパク質、CD16タンパク質、4lBBLタンパク質、CD47タンパク質、CD113タンパク質、およびPDL1タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入;並びに所望により、(3)TCR、CAR、エンゲージャー、Fc受容体、および単一もしくは二重のセーフティ・スイッチタンパク質のうちの一つもしくは複数をさらに含む、改変HLA欠損造血系細胞。
- TCR、CAR、エンゲージャー、Fc受容体、または自殺遺伝子が誘導性である、請求項76に記載の改変HLA欠損造血系細胞。
- 向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、増加されたT細胞および/もしくはNK細胞に対する抵抗性、または増加された免疫耐性を有し;分化度が低い改変HLA欠損造血系細胞は同一の機能的なゲノム改変を有するより分化した造血系細胞への分化能を維持している、請求項76または請求項77に記載の改変HLA欠損造血系細胞。
- ゲノム改変iPSCを得るための組成物であって、以下を含み:
(i) ゲノム内の1または複数の選択された部位に少なくとも1つの標的ゲノム編集を含む、ゲノム改変非万能性細胞、または請求項54〜70もしくは請求項72〜78のいずれか一項に記載の細胞;
(ii) 1または複数の再プログラム化因子;並びに所望により、
(iii) TGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤および/またはROCK阻害剤を含む小分子組成物;
ゲノム改変非万能性細胞に含まれた同一の標的ゲノム編集を含むiPSCを得るために有用である、組成物。 - 1または複数の選択された部位における少なくとも1つの標的ゲノム編集が、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質もしくはペプチド、薬物標的候補、または、前記非万能性細胞およびそれから再プログラム化されたiPSCの移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、自己複製、残留性、および/もしくは生存を促進するタンパク質をコードする1または複数の外来性ポリヌクレオチドの挿入を含む、請求項79に記載の組成物。
- 前記1または複数の外来性ポリヌクレオチドが、(1)CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む1もしくは複数の外来性プロモーター;または、(2)AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRもしくはRUNX1を含む選択された部位に含まれる1または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている、請求項80に記載の組成物。
- 前記1または複数の外来性ポリヌクレオチドが、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRまたはRUNX1を含む選択された挿入部位に含まれた1または複数の内在性プロモーターに機能的に連結されている、請求項80に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞が、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変EGFR、B細胞CD20、またはこれらのあらゆる組み合わせを含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする1または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項80に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞が、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRまたはRUNX1を含む異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた2つ以上の同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項80に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞が、カスパーゼをコードするポリヌクレオチドをAAVS1遺伝子座に含み、チミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドをH11遺伝子座に含む、請求項80に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞が、標的化モダリティ;受容体;シグナル伝達分子;転写因子;薬物標的候補;免疫応答の制御および調節;並びに、非万能性細胞およびそれに由来するiPSCの移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/または生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた1または複数の挿入/欠失を含む、請求項79または80に記載の組成物。
- 前記内在性遺伝子がB2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、および染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子のうちの一つまたは複数を含む、請求項86に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞が、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、および染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも1つの欠失または発現減少を含む、請求項79〜87のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞が、HLA−E、HLA−G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも1つの導入または発現増加を含む、請求項79〜88のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記導入または発現増加が外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入するための組込み法または非組込み法を介したものである、請求項79〜89のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞がHLAクラスIおよび/またはクラスIIを欠損している、請求項79〜90のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞がヌルまたは低発現のB2M、ヌルまたは低発現のTAP1および/またはヌルまたは低発現のTAP2を含む、請求項79〜91のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞がHLA−Eタンパク質、HLA−Gタンパク質、CD16タンパク質、41BBLタンパク質およびPDL1タンパク質のうちの一つもしくは複数をコードする組込み型もしくは非組込み型の外来性ポリヌクレオチドを含む;または、前記ゲノム改変非万能性細胞がHLA−Eタンパク質、HLA−Gタンパク質、CD16タンパク質、41BBLタンパク質およびPDL1タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入を含む、請求項79〜92のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変された非万能性細胞が、高親和性CD16受容体をコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;切断不可CD16受容体をコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;高親和性且つ切断不可のCD16受容体(hnCD16)をコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;切断不可なHLA−Eをコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;または、切断不可なHLA−Gをコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項79〜93のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞が中胚葉細胞、CD34細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、またはB細胞を含む、請求項79〜94のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変非万能性細胞が向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、もしくは増加された免疫耐性を有する;または、前記ゲノム改変非万能性細胞が増加されたT細胞および/もしくはNK細胞に対する抵抗性を有する、請求項79〜95のいずれか一項に記載の組成物。
- ゲノム改変iPSCを得るための組成物であって、
(i) 非万能性細胞;
(ii) 1または複数の選択された遺伝子座における標的編集のための1または複数のコンストラクト;
(iii) 1または複数の再プログラム化因子;並びに所望により、
(iv) TGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤および/またはROCK阻害剤を含む小分子組成物;
を含み、
標的ゲノム編集を含むiPSCを得るために有用であり、それによって、前記ゲノム改変iPSCは向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、もしくは増加された免疫耐性を有する;または、前記ゲノム改変iPSCは増加されたT細胞および/もしくはNK細胞に対する抵抗性を有する、組成物。 - 選択された部位に二重鎖切断を導入するための、選択された部位の認識が可能な1もしくは複数のエンドヌクレアーゼ;並びに/または、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、もしくは、非万能性細胞再プログラム化iPSCもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/もしくは生存を促進するタンパク質をコードする1もしくは複数の外来性ポリヌクレオチドを含むコンストラクト、をさらに含む、請求項97に記載の組成物。
- 前記1または複数の外来性ポリヌクレオチドが、(1)CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む1もしくは複数の外来性プロモーター;または、(2)AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRもしくはRUNX1を含む選択された部位に含まれる1または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている、請求項98に記載の組成物。
- 前記得られたゲノム改変iPSCが、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変EGFR、B細胞CD20、またはこれらのあらゆる組み合わせを含むセーフティ・スイッチタンパク質をコードする1または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項97に記載の組成物。
- 前記得られたゲノム改変iPSCが、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRまたはRUNX1を含む異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた2つ以上の同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項97に記載の組成物。
- 前記得られたゲノム改変iPSCが、カスパーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをAAVS1遺伝子座に含み、且つ、チミジンキナーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドをH11遺伝子座に含む、請求項97に記載の組成物。
- 前記得られたゲノム改変iPSCが、標的化モダリティ;受容体;シグナル伝達分子;転写因子;薬物標的候補;免疫応答の制御および調節;並びに、iPSCもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した内在性遺伝子に含まれた1または複数の挿入/欠失を含む、請求項97に記載の組成物。
- 1または複数の挿入/欠失を含む前記得られたゲノム改変iPSCが、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、および染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子のうちの一つまたは複数を含む、請求項103に記載の組成物。
- 前記非万能性細胞が中胚葉細胞、CD34細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、またはB細胞を含む、請求項97に記載の組成物。
- 前記得られたゲノム改変iPSCの万能性を維持するためのMEK阻害剤、GSK3阻害剤およびROCK阻害剤を含む小分子組成物をさらに含む、請求項97に記載の組成物。
- 以下を含む組成物であって、
(i) 以下から得られるゲノム改変iPSC、
(a)得られるiPSCがゲノム改変非万能性細胞の選択された部位における同一の標的組込みおよび/もしくは標的挿入/欠失を含む、ゲノム改変非万能性細胞の再プログラム化;または
(b)1もしくは複数の選択された部位に1もしくは複数の標的組込みおよび/もしくは標的挿入/欠失を導入することによる、クローナルiPSCもしくはiPSCのプールの遺伝子改変;または
(c)1もしくは複数の選択された部位に1もしくは複数の標的組込みおよび/もしくは標的挿入/欠失を、1または複数の再プログラム化因子、並びに所望によりTGFβ受容体/ALK阻害剤、MEK阻害剤、GSK3阻害剤および/もしくはROCK阻害剤を含む小分子組成物と接触させられている再プログラム化中の非万能性細胞のプールに導入することによる、ゲノム改変;
並びに、
(ii) MEK阻害剤、GSK3阻害剤およびROCK阻害剤を含む小分子組成物、
を含み、
前記ゲノム改変iPSCは、セーフティ・スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬剤的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、もしくは、前記非万能性細胞再プログラム化iPSCもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/もしくは生存を促進するタンパク質をコードする1もしくは複数の外来性ポリヌクレオチド;並びに/または、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答の制御および調節、もしくは、前記非万能性細胞再プログラム化iPSCもしくはその派生細胞の移植、輸送、ホーミング、生存度、自己複製、残留性、および/もしくは生存を抑制するタンパク質と関連した1もしくは複数の内在性遺伝子における挿入/欠失を含む、
組成物。 - 選択された部位に二重鎖切断を導入するための、選択された部位の認識が可能な1または複数のエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項107に記載の組成物。
- 前記1または複数の外来性ポリヌクレオチドが、(1)CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC、もしくは他の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、もしくは細胞型特異的プロモーターを含む1もしくは複数の外来性プロモーター;または、(2)AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRもしくはRUNX1を含む選択された部位に含まれる1または複数の内在性プロモーター、に機能的に連結されている、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCが、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変EGFR、B細胞CD20、およびこれらのあらゆる組み合わせから選択されるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする1または複数の外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCが、AAVS1、CCR5、ROSA26、コラーゲン、HTRP、H11、H11、β−2ミクログロブリン、GAPDH、TCRまたはRUNX1を含む異なるセーフ・ハーバー遺伝子座に組み込まれた2つ以上の同じまたは異なるセーフティ・スイッチタンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCが、カスパーゼをコードする遺伝子をAAVS1遺伝子座に含み、チミジンキナーゼをコードする遺伝子をH11遺伝子座に含む、請求項107に記載の組成物。
- 1または複数の挿入/欠失を含む前記ゲノム改変iPSCが、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、および染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子を含む、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCが、B2M、TAP1、TAP2、タパシン、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、および染色体6p21領域内のあらゆる遺伝子のうちの少なくとも1つの欠失または発現減少を含む、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCが、HLA−E、HLA−G、CD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受容体、エンゲージャー、および二重特異性または多重特異性または普遍的エンゲージャーとの結合のための表面上誘発受容体のうちの少なくとも1つの導入または発現増加を含む、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCが、外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入するための組込み法または非組込み法を介した導入または発現増加を含む、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCがHLAクラスIおよび/またはクラスIIを欠損している、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCがヌルまたは低発現のB2M、ヌルまたは低発現のTAP1および/またはヌルまたは低発現のTAP2を含む、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCがHLA−Eタンパク質、HLA−Gタンパク質、CD16タンパク質、41BBLタンパク質およびPDL1タンパク質のうちの一つもしくは複数をコードする組込み型もしくは非組込み型の外来性ポリヌクレオチドを含む;または、前記ゲノム改変iPSCがHLA−Eタンパク質、HLA−Gタンパク質、CD16タンパク質、41BBLタンパク質およびPDL1タンパク質のうちの一つもしくは複数の発現導入を含む、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCが、高親和性CD16受容体をコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;切断不可CD16受容体をコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;高親和性且つ切断不可のCD16受容体(hnCD16)をコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;切断不可なHLA−Eをコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチド;または、切断不可なHLA−Gをコードする少なくとも1つの外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCが向上された残留性、増加された免疫細胞に対する抵抗性、もしくは増加された免疫耐性を有する;または、前記ゲノム改変iPSCが増加されたT細胞および/もしくはNK細胞に対する抵抗性を有する、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCが同一の機能的な標的ゲノム編集を有する造血系細胞を含む非万能性細胞への分化能を有する、請求項107に記載の組成物。
- 前記ゲノム改変iPSCが中胚葉細胞、CD34細胞、造血内皮細胞、造血幹細胞・前駆細胞、造血性多能性前駆細胞、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、またはB細胞への分化能を有する、請求項122に記載の組成物。
- 以下を含む医薬組成物:
(a) 請求項22〜44のいずれか一項に記載のゲノム改変iPSC;
(b) 請求項45〜47のいずれか一項に記載の改変HLA欠損iPSC;
(c) 請求項54〜66のいずれか一項に記載のゲノム改変非万能性細胞;
(d) 請求項67〜70および請求項72〜75のいずれか一項に記載のゲノム改変造血系細胞;または
(e) 請求項76〜78のいずれか一項に記載の改変HLA欠損造血系細胞;またはこれらのあらゆる組み合わせ;並びに薬剤的に許容できる培地。 - 組成物を養子細胞療法に適した対象に導入することによる124の医薬組成物の治療用途であって、前記対象は自己免疫障害;造血器腫瘍;固形腫瘍;がん、または、HIV、RSV、EBV、CMV、アデノウイルス、もしくはBKポリオーマウイルスと関連した感染症を有する、治療用途。
- 請求項13〜21のいずれか一項に記載のゲノム改変iPSCを製造し、請求項48〜53のいずれか一項に記載のそれに由来する非万能性細胞を製造する方法。
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