WO2020017676A1 - Fresh-트레이서 기반 분리된 세포의 유전자 프로파일의 응용 - Google Patents

Fresh-트레이서 기반 분리된 세포의 유전자 프로파일의 응용 Download PDF

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WO2020017676A1
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stem cells
gapdh
embryonic
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강흔수
김혜미
송지은
인잉푸
신지웅
강혜원
김용환
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주식회사 셀투인
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
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    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
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    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
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    • A61P37/08—Antiallergic agents
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells

Definitions

  • the present invention relates to the application of the gene profile of FreSH-tracer based isolated cells.
  • ROS Free radical species
  • Nrf2 the main regulator of redox homeostasis, affects the function of embryonic stem cells and adult stem cells, such as self-renewal and pluripotency in embryonic stem cells (ESC) (Jang et al., 2014), and bone marrow niches.
  • ESC embryonic stem cells
  • cellular redox regulation is important for maintaining stem cell capacity and functional efficacy of embryonic stem cells and adult stem cells.
  • Patent WO2013059829 A1 describes non-tumor treatment of human fibroblasts with fibromodulin, an extracellular matrix component characterized by the expression of important pluripotent factors, nanog, oct4 and sox2, as well as negative cell cycle regulators p15 and p21.
  • An approach to generating formable PSCs is described.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2016-0062157 discloses a method for epigenetic control of pluripotent stem cells (PSCs) with pPSCs having highly controllable biological functions, and reprogramming the cells by metabolic reprogramming. There is a technique. However, both approaches inhibit aberrant proliferation or tumorigenicity, which is different from the present invention. In addition, the present invention is said to have a difference in finding a specific ratio genetically to manage quality according to stem cell characteristics.
  • An object of the present invention is to provide a stem cell composition for treatment using the gene profile of FreSH-tracer based isolated cells.
  • the present invention is to provide a therapeutic stem cell composition that can select and manage the characteristics of stem cells as needed by devising a genetically specific ratio to be isolated according to stem cell characteristics.
  • the term "FreSH- Real-time SH group-Tracer” is a compound represented by Formula 1, and refers to a coumarin derivative having a cyanoacrylamide electrophile, It is used as a fluorescent substance for measuring cell activity of the present invention.
  • the FreSH-tracer of the present invention is contacted with a cell. This is the step of labeling cells with FreSH-tracers. In this step, the fluorescence intensity at 430-550 nm or 550-680 nm, or the ratio of the fluorescence intensity at 430-550 nm to the fluorescence intensity at 550-680 nm of the cells labeled with the FreSH-tracer is measured in real time. do.
  • the fluorescence intensity at 430-550 nm is the fluorescence intensity at 450-550, 470-550, 470-530, 490-530, 500-520 or 510 nm.
  • the fluorescence intensity at 550-680 nm is the fluorescence intensity at 550-650, 550-620, 550-600, 570-590 or 580 nm.
  • the ratio of the fluorescence intensity at 430-550 nm to the fluorescence intensity at 430-550 nm or 550-680 nm of the present invention is high, or the fluorescence intensity at 550-680 nm is Low cells have high glutathione (GSH) activity and high cell antioxidant activity, and thus, cell antioxidant activity can be measured by the method of the present invention.
  • GSH glutathione
  • the method for measuring the anti-oxidative activity of stem cells includes the following steps. (a) contacting a cell with a composition for measuring cell activity comprising a compound represented by Formula 1 below or a salt thereof; And (b) the ratio of fluorescence intensity at 430-550 nm or 550-680 nm of the cell, or (ii) fluorescence intensity at 430-550 nm to fluorescence intensity at 550-680 nm. Observing in real time;
  • R 1 and R 2 in the above formulas are each independently hydrogen or C 1-4 straight or branched alkyl, or heterocycloalkyl or heterocycloalkenyl in which R 1 , R 2 and X together form a 5- or 6-membered ring ego;
  • R 3 is hydrogen or C 1-4 straight or branched alkyl;
  • R 4 and R 5 are each independently hydrogen, C 1-5 straight or branched alkyl,-(CH 2 ) m -COO-C 1-5 straight or branched alkyl, wherein m is an integer of 1-5 ),
  • R 4 , R 5 and Y together form C 3-7 heterocycloalkyl, wherein the heterocycloalkyl is heterocycloalkyl unsubstituted or substituted with R 6 ;
  • R 6 is —COO (CH 2 ) n —OCO—C 1-5 linear or branched alkyl (where n is an integer of 1-5), — (CONH) — (CH
  • the compound represented by Chemical Formula 1 is a compound selected from the group consisting of compounds represented by Chemical Formulas 2 to 7. According to another embodiment of the present invention, more preferably, the compound represented by Chemical Formula 1 is a compound represented by Chemical Formula 2.
  • antioxidant activity refers to the antioxidant activity recovery as an endogenous function expression of a cell.
  • ROS Reactive oxygen species
  • ROS signaling refers to a process in which ROS, which acts as a secondary messenger in cellular signaling, is typically produced during aerobic metabolism by oxidative phosphorylation.
  • ROS is an essential regulator of cell metabolism, which is in fact produced by the mitochondrial electron transfer system or by NADPH oxidase in all cells. Oxidative phosphorylation is required for aerobic metabolism.
  • the redox energy produced in the mitochondrial electron transport system during aerobic metabolism is bound to high energy phosphate groups in the form of ATP.
  • Cytochrome c oxidase is the final component in the electron transport system, which catalyzes the reduction of oxygen (O 2 ) to water (H 2 O), where oxygen serves as the final electron acceptor.
  • O 2 oxygen
  • H 2 O water
  • hydroxyl radicals OH *
  • ROS partially reduced oxygen species are described as ROS. If ROS are not inhibited by the cell's antioxidant enzyme system, it can have deleterious effects and lead to cell damage, aging and cell death.
  • ROS are also involved in nontoxic cell processes and play an important regulatory role in cells. For example, oxidation of transcription factors by hydrogen peroxide can lead to conformational changes and direct activation of gene expression.
  • the current paradox of ROS signaling is that too much ROS damage cells by oxidation of cellular components that are essential for life, but lack of or too little ROS impairs important physiological functions and cellular signaling mechanisms. It is. Therefore, ROS signaling is a highly regulated, balanced system in cells.
  • glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is also abbreviated as GAPDH or G3PDH.
  • stem cell refers to an undifferentiated cell having self replication and differentiation capacity.
  • Stem cells include subpopulations of pluripotent stem cells, multipotent stem cells, and unipotent stem cells, depending on their differentiation capacity.
  • the pluripotent stem cell refers to a cell having the ability to differentiate into all tissues or cells constituting the living body.
  • pluripotent stem cells are not all kinds, but mean cells which have the ability to differentiate into a plurality of tissues or cells.
  • Unipotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into specific tissues or cells. Examples of pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES Cell), undifferentiated germ cell (EG Cell), iPS cell and the like.
  • Pluripotent stem cells include mesenchymal stem cells (derived from fat, bone marrow, cord blood or umbilical cord), hematopoietic stem cells (derived from bone marrow or peripheral blood, etc.), neural stem cells, reproductive stem cells, etc. Can be mentioned.
  • mesenchymal stem cells derived from fat, bone marrow, cord blood or umbilical cord
  • hematopoietic stem cells derived from bone marrow or peripheral blood, etc.
  • neural stem cells derived from bone marrow or peripheral blood, etc.
  • reproductive stem cells etc.
  • a pluripotent stem cell usually exists in a state of low dividing capacity, and after activation, the stem cells (Committed stem cell) to make only hepatocytes with vigorous division after activation.
  • the mesenchymal stem cells (MSC) in the present invention is hES-MSC (Human embryonic stem cell-derived mesenchymal stroma cells), BM-MSC (Bone marrow mesenchymal stem cell), UC-MSC (Umbilical cord mesenchymal stem cell), And ADSC (Adipose Derived Stem Cell-Condtioned Medium), but are not limited thereto.
  • embryonic stem cell refers to cells cultured in vitro by separating an inner cell mass (inner cell mass) of the blastocyst immediately before implantation of the fertilized egg. It has a pluripotency that can differentiate into cells of all tissues of an individual. In a broad sense it includes embryoid bodies derived from embryonic stem cells.
  • embryoid bodies derived from embryonic stem cells.
  • embryoid body embryonic body or embryoid body, EB
  • EB embryoid body
  • the stem cells are ACAN, SOX9, AP2, RUNX2, OCN, ALP, OCT4, SOX2, CXCR4, cMET, PDGFRA, PDGFRB, VEGF-R1, VEGF -R2, CSF-1, IDO2, Sox2, Nanog, cMyc, Klf2, Klf4, Rex1, Esrrb, Neurog1, Neurod1, Nkx2.2, Ascl2, Gfap, S100b, Olig2, Neurog2, T, Nkx2.5, Esrrbb, Klf2 , Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, and Runx1, the expression level of any one or more genes selected from the group comprising a higher or lower ratio than the expression level of the Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene Provide stem cells.
  • GPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the stem cells are selected from the group consisting of mesenchymal stem cells (MSC), embryonic stem cells (ESC), or embryonic body (EB).
  • MSC mesenchymal stem cells
  • ESC embryonic stem cells
  • EB embryonic body
  • ALP is the expression of GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) gene Include at a high rate relative to the level.
  • the stem cells are cultured in a medium selected from the group consisting of adipose forming induction medium, bone formation induction medium, or cartilage formation induction medium.
  • the stem cells when the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of ACAN, SOX9, RUNX2, and OCN is GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) gene at a low rate compared to the expression level.
  • the stem cells are cultured in a medium selected from the group consisting of adipose forming induction medium, bone formation induction medium, or cartilage formation induction medium.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), OCT4, SOX2, CXCR4, cMET, PDGFRA, PDGFRB, VEGF-R1, VEGF-R2, CSF-1, and IDO2
  • MSC mesenchymal stem cells
  • OCT4 SOX2, CXCR4, cMET
  • PDGFRA PDGFRA
  • PDGFRB VEGF-R1
  • VEGF-R2 VEGF-R2
  • CSF-1 IDO2
  • the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of comprises a low proportion compared to the expression level of the GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) gene.
  • GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of Oct4, Sox2, Nanog, Klf2, Rex1, and Esrrb is GAPDH (Glyceraldehyde) 3-phosphate dehydrogenase) gene is included at a high rate compared to the expression level.
  • stem cells are embryonic stem cells (ESC)
  • ESC embryonic stem cells
  • the expression level of the gene is included in a lower ratio than the expression level of the GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) gene.
  • the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of Oct4, Esrrbb, and Klf2 in the early embryo embryo culture is GAPDH (Glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase) gene is included at a high rate compared to the expression level.
  • GAPDH Glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase
  • stem cells are embryonic body (EB), consisting of Neurog2, Olig2, T, Nkx2.5, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, and Runx1 at the beginning of embryonic culture
  • EB embryonic body
  • the expression level of any one or more genes selected from the group is included at a low rate compared to the expression level of the Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene.
  • GPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of T, and Oct4 in embryonic culture days 1-6 is GAPDH (Glyceraldehyde 3 -phosphate dehydrogenase) contains a high proportion relative to the expression level of the gene.
  • stem cells are embryonic body (EB), Neurog2, Olig2, Nkx2.5, Esrrbb, Klf2, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v on days 1-6 of embryonic culture
  • the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of, and Runx1 is included in a lower ratio than the expression level of the GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) gene.
  • GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the stem cells are embryonic body (EB)
  • the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of cTnT, a-Actin, and Mlc2v at 7-8 days of embryonic culture Compared to the expression level of GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) gene.
  • GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the stem cells are embryonic body (EB), 7 days to 8 days of embryonic culture, Neurog2, Olig2, T, Nkx2.5, Oct4, Esrrbb, Klf2, Klf4, and Runx1
  • the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of comprises a low proportion compared to the expression level of the GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) gene.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), when cartilage differentiation ACAN is 0.0009 to 0.0012 times as compared to GAPDH.
  • the stem cells are cultured in a medium selected from the group consisting of adipose forming induction medium, bone formation induction medium, or cartilage formation induction medium.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), SOX9 is 0.006 to 0.0077 times compared to GAPDH when cartilage differentiation.
  • the stem cells are cultured in a medium selected from the group consisting of adipose forming induction medium, bone formation induction medium, or cartilage formation induction medium.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), and when adipose differentiation AP2 is 9.3 to 11.4 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are cultured in a medium selected from the group consisting of adipose forming induction medium, bone formation induction medium, or cartilage formation induction medium.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), when bone differentiation RUNX2 is 0.38 to 0.48 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are cultured in a medium selected from the group consisting of adipose forming induction medium, bone formation induction medium, or cartilage formation induction medium.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), when bone differentiation OCN is 0.074 to 0.092 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are cultured in a medium selected from the group consisting of adipose forming induction medium, bone formation induction medium, or cartilage formation induction medium.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), when bone differentiation ALP is 27.6 to 33.8 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are cultured in a medium selected from the group consisting of adipose forming induction medium, bone formation induction medium, or cartilage formation induction medium.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), multipotent is promoted when OCT4 is 0.0051 to 0.0063 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), multipotent is promoted when SOX2 is 0.0099 to 0.0122 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), the mobility is promoted when CXCR4 is 0.0062 to 0.0077 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), the growth and proliferation is promoted when cMET is 0.063 to 0.078 times as compared to GAPDH.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), engraftment rate, survival rate and vascular regeneration is promoted when PDGFRA is 0.31 to 0.39 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), the engraftment rate, survival rate and vascular regeneration is promoted when the PDGFRB is 0.45 to 0.56 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), the engraftment rate, survival rate and vascular regeneration is promoted when VEGF-R1 is 0.44 to 0.55 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), the engraftment rate, survival rate and vascular regeneration is promoted when VEGF-R2 is 0.62 to 0.77 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), when the CSF-1 is 0.19 to 0.24 times compared to GAPDH promotes the immunomodulatory effect.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells (MSC), the anti-inflammatory effect is promoted when IDO2 is 0.00131 to 0.00160 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), and pluripotent is promoted when Oct4 is 21.4 to 26.2 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), pluripotency is promoted when Sox2 is 3.3 to 4.1 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), pluripotency is promoted when Nanog is 3.7 to 4.6 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), pluripotency is promoted when cMyc is 0.8 to 1.1 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), pluripotency is promoted when Klf2 is 10.6 to 13.1 times as compared to GAPDH.
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), pluripotency is promoted when Klf4 is 0.64 to 0.79 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), pluripotency is promoted when Rex1 is 8.5 to 10.4 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), pluripotency is promoted when Esrrb is 2.4 to 3.0 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), the neuronal differentiation is promoted when Neurog1 is 0.49 to 0.60 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), neuronal differentiation is promoted when Neurod1 is 0.17 to 0.22 times compared to GAPDH.
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), the nerve differentiation is promoted when Nkx2.2 is 0.00064 to 0.00080 times compared to GAPDH. In another embodiment of the present invention, the stem cells are embryonic stem cells (ESC), the nerve differentiation is promoted when Ascl2 is 0.16 to 0.21 times as compared to GAPDH. In another embodiment of the present invention, the stem cells are embryonic stem cells (ESC), the nerve differentiation is promoted when the Gfap is 0.13 to 0.17 times compared to GAPDH. In another embodiment of the present invention, the stem cells are embryonic stem cells (ESC), the neuronal differentiation is promoted when S100b is 0.012 to 0.016 times compared to GAPDH.
  • ESC embryonic stem cells
  • the stem cells are embryonic stem cells (ESC), the neuronal differentiation is promoted when Olig2 is 0.025 to 0.032 times as compared to GAPDH.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Neurog2 is 0.00008 to 0.00010 times compared to GAPDH at the beginning of embryonic body culture.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Olig2 is 0.0047 to 0.0059 times as compared to GAPDH at the beginning of embryonic body culture.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when T is 0.036 to 0.045 times as compared to GAPDH at the beginning of embryonic culture.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), the pluripotency and differentiation ability is promoted when Nkx2.5 is 0.0043 to 0.0053 times as compared to GAPDH at the beginning of embryonic body culture .
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Oct4 is 17.84 to 21.81 times compared to GAPDH at the beginning of embryonic culture.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Esrrbb is 2.74 to 3.36 times as compared to GAPDH at the beginning of embryonic body culture.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Klf2 is 10.10 to 12.50 times as compared to GAPDH at the beginning of embryonic body culture.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Klf4 is 0.60 to 0.73 times compared to GAPDH at the beginning of embryonic body culture.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when cTnT is 0.0009 to 0.0011 times as compared to GAPDH at the beginning of embryonic body culture.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when a-Actin is 0.36 to 0.45 times as compared to GAPDH at the beginning of embryonic body culture. .
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Mlc2v is 0.050 to 0.062 times as compared to GAPDH at the beginning of embryonic body culture.
  • the stem cells are stem cells constituting an embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Runx1 is 0.016 to 0.021 times compared to GAPDH at the beginning of embryonic body culture.
  • the stem cells are stem cells constituting an embryonic body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Neurog2 is 0.00030 to 0.00042 times compared to GAPDH on the first to sixth days of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryonic body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Olig2 is 0.00050 to 0.00072 times compared to GAPDH on the first to sixth days of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting an embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when T is 2.60 to 3.19 times compared to GAPDH on the first to sixth days of embryonic body culture. do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryonic body (EB), and pluripotency and differentiation capacity when Nkx2.5 is 0.0070 to 0.0090 times compared to GAPDH on days 1-6 of embryonic culture This is facilitated.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Oct4 is 1.20 to 1.60 times compared to GAPDH on the first to sixth days of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), the pluripotency and differentiation capacity is promoted when Esrrbb is 0.008 to 0.011 times compared to GAPDH on the 1-6 days of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Klf2 is 0.16 to 0.20 times compared to GAPDH on the first to sixth days of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Klf4 is 0.067 to 0.083 times compared to GAPDH on the first to sixth days of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when cTnT is 0.020 to 0.025 times as compared to GAPDH on the first to sixth days of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity when a-Actin is 0.15 to 0.20 times compared to GAPDH on day 1-6 of embryonic body culture This is facilitated.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryonic body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Mlc2v is 0.11 to 0.14 times compared to GAPDH on the first to sixth days of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryonic body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Runx1 is 0.089 to 0.110 times compared to GAPDH on the first to sixth days of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryonic body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Neurog2 is 0.00078 to 0.0010 times compared to GAPDH on the 7th to 8th embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryonic body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Olig2 is 0.0068 to 0.0084 times compared to GAPDH on the 7th to 8th day of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when T is 0.051 to 0.064 times compared to GAPDH on 7-8 days of embryonic body culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), pluripotency and differentiation capacity when Nkx2.5 is 0.086 to 0.110 times compared to GAPDH on the 7th to 8th day of embryonic culture This is facilitated.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryonic body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Oct4 is 0.050 to 0.061 times compared to GAPDH on the 7th to 8th day of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Esrrbb is 0.012 to 0.016 times compared to GAPDH on the 7th to 8th day of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), the pluripotency and differentiation capacity is promoted when Klf2 is 0.41 to 0.52 times compared to GAPDH on 7-8 days of embryonic body culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Klf4 is 0.071 to 0.088 times compared to GAPDH on the 7th to 8th day of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when cTnT is 2.10 to 2.58 times compared to GAPDH on the 7th to 8th day of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), and pluripotency and differentiation capacity when a-Actin is 3.79 to 4.65 times as compared to GAPDH on 7-8 days of embryonic culture This is facilitated.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryonic body (EB), and pluripotency and differentiation capacity is promoted when Mlc2v is 10.70 to 13.11 times compared to GAPDH on the 7th to 8th day of embryonic culture do.
  • the stem cells are stem cells constituting the embryoid body (EB), the pluripotency and differentiation capacity is promoted when Runx1 is 0.16 to 0.21 times compared to GAPDH on the 7th to 8th day of embryonic culture do.
  • EB embryoid body
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of asthma as an active ingredient the therapeutic stem cell composition according to the above.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for allergic asthma comprising the stem cell composition for treatment according to the above as an active ingredient.
  • the therapeutic stem cells provided by the present invention have the effect of selecting and managing the characteristics of stem cells as necessary by devising a specific ratio genetically to manage the quality of quality according to the stem cell characteristics.
  • FIG. 1 is a graph showing intracellular glutathione (GSH) levels that regulate the autologous replication and migration activity of mesenchymal stem cells.
  • GSH glutathione
  • 2 is a graph showing luminescence based quantification by comparing fluorescence changes.
  • Figure 3 is the result of measuring the difference in gene expression related to differentiation activity of stem cells isolated by FreSH-tracer. ns: no significance, *** p ⁇ 0.001.
  • CFU-F colony forming unit fibroblasts
  • PDGF platelet-induced growth factor
  • Figure 7 is a graph showing the results of measuring the difference in the growth factors of stem cells and their receptor gene expression in FR-based hES-MSC and unclassified control (naive) cells.
  • Figure 8 is the result of measuring the difference in immunoregulatory anti-inflammatory gene expression of stem cells isolated by FreSH-tracer.
  • Control and GSH-EE are graphs showing FRLow cells.
  • Scale bar 200 ⁇ . Values in all bar graphs represent mean ⁇ SEM. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001. ns, not significant.
  • FIG. 11 shows colony forming unit fibroblast assay (CFU-F, FIG. 8A) and 10 ng / mL platelet induced growth factor (PDGF) -AA (FIG) in FR High and FR Low hES-MSCs treated with BSO and GSH-EE.
  • CFU-F colony forming unit fibroblast assay
  • FIG. 8A platelet induced growth factor (PDGF) -AA
  • FIG. 11 shows colony forming unit fibroblast assay (CFU-F, FIG. 8A) and 10 ng / mL platelet induced growth factor (PDGF) -AA (FIG) in FR High and FR Low hES-MSCs treated with BSO and GSH-EE.
  • PDGF platelet induced growth factor
  • 19 is an analysis scheme for observing the increased therapeutic effect with stem cells with high glutathione levels.
  • the therapeutic stem cells provided by the present invention can be managed by selecting the characteristics of the stem cells as needed by devising a specific ratio genetically to manage the quality of the quality according to the stem cell characteristics.
  • the stem cells are ACAN, SOX9, AP2, RUNX2, OCN, ALP, OCT4, SOX2, CXCR4, cMET, PDGFRA, PDGFRB, VEGF-R1, VEGF-R2, CSF-1 , IDO2, Sox2, Nanog, cMyc, Klf2, Klf4, Rex1, Esrrb, Neurog1, Neurod1, Nkx2.2, Ascl2, Gfap, S100b, Olig2, Neurog2, T, Nkx2.5, Esrrbb, Klf2, Klf4, cTnT, a -One or more genes from the group consisting of Actin, Mlc2v, and Runx1 is to provide a therapeutic stem cell composition comprising a higher or lower ratio than the GAP
  • the present inventors have identified the relationship between the fluorescence intensity ratio at a specific range of wavelength of the FreSH-tracer (Fluorescent Real-time SH group-Tracer) of the present invention and the antioxidant activity of the sample.
  • the present invention has been completed by identifying that the antioxidant activity can be monitored in real time.
  • the anti-oxidative activity of stem cells was measured as follows. (a) contacting a cell with a composition for measuring cell activity comprising a compound represented by Formula 1 or a salt thereof; (b) The ratio of fluorescence intensity at 510 nm or 580 nm, or (ii) fluorescence intensity at 510 nm to fluorescence intensity at 580 nm, of the cells was observed in real time.
  • a compound represented by the formula (2) was used.
  • the compound represented by the formula (2) used 1 to 100uM, preferably 1 to 20uM, more preferably 1 to 10uM, even more preferably about 5uM.
  • cytotoxicity of live cells was assessed using FreSH-tracers for GSH monitoring in live cells.
  • Treatment of up to 10 ⁇ M FreSH-tracer for 24 hours did not affect the viability of HeLa cells and bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (hBM-MSCs) and embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells (hES-MSCs).
  • HeLa cells were equilibrated by treatment with 5 ⁇ M FreSH-tracer for 2 hours. From the confocal and ratiometric pseudochromosomal images, it was confirmed that the FreSH-tracer was distributed inside the cell to show a wide range of FR values. FRs in the nucleus were about 1.5-2 times higher than cytoplasmic FRs.
  • FRs of nucleolus showed relatively low GSH levels, and peripheral cytoplasmic FRs were higher than FRs in other regions.
  • variable FR values were observed in the cytoplasm, which resulted in mosaic patterns in pseudochromosomal images that could be caused by GSH in endoplasmic reticulum and mitochondria.
  • FR decreased slowly by diamide (or NEM) and then rapidly increased by dithiothreitol.
  • FreSH-tracers were found to react reversibly with thiols in the intracellular environment.
  • hBM-MSCs human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • flow cytometers to determine FR (fluorescence ratio of F510 / F580) (FR High ).
  • FR Mid and FR Low cells FIG. S5A.
  • the sorted cells were quickly removed by FreSH-tracer.
  • Functional characteristics of stem cell subpopulations sorted in vitro were compared.
  • FR High hBM-MSCs have improved cellular function against colony-forming unit fibroblasts (CFU-F) and platelet-derived growth (PDGF). The chemoattraction of the factor was significantly improved.
  • hES-MSCs were FACS-classified into three subsets, FR High , FR Mid and FR Low , based on FR.
  • GSH concentrations of cell lysates in each population were validated for FR based sorting methods in proportion to FR levels (FIG. 1).
  • FR reduction and recovery delay time after treatment with 100 ⁇ M H 2 O 2 was inversely proportional to the FR levels of the sorted cell population (FIG. 2A).
  • FR of FR High cells recovered above the basal level after H 2 O 2 exposure, indicating that FR High cells had greater GSH recovery than control cells.
  • the sorted hES-MSCs showed no significant difference in proliferation rate.
  • Pluripotency tests showed that both FR High and FR Low cells showed similar differentiation capacity to differentiate into cartilage, adipose and bone formation lines.
  • FR High hES-MSC showed a significant increase in the induction of some lineage markers, SOX9, AP2 and OCN, compared to FR Low cells (FIG. 3).
  • the cells were maintained in basal fluid for differentiation cultures, and the fat formation induction medium (DMEM supplemented with 5% FBS, 1 mM dexamethasone, 10 mM insulin, 200 mM indomethacin and 0.5 mM isobutylmethylxanthine, respectively), Cultured in bone formation induction medium (DMEM supplemented with 5% FBS, 50 mM ascorbate-2-phosphate, 0.1 mM dexamethasone, and 10 mM glycerophosphate), and cartilage induction medium (eg, StemPro chondrogenesis from Invitrogen) It was.
  • DMEM fat formation induction medium
  • DMEM fetal bovine serum
  • Figure 3 is a graph showing the results of qPCR analysis for quantifying lineage specific genes in non-differentiated (Non) FR High cells and FR Low cells, and differentiated (Diff) FR High cells and FR Low cells.
  • FR High hES-MSCs had a number of CFU-Fs approximately 4.7 and 4.9 times higher than FR Mid and FR Low cells, respectively (FIG. 4A).
  • FIG. 4B the CFU colonies of FR High hES-MSC showed twice the clonal activity than that of FR Low cells (FIG. 4B), which was FR High hES- It showed enhanced self-replicating activity of MSCs.
  • FR High cells in both types of stem cells showed significantly improved chemotaxis to substrate inducer-1 compared to na ⁇ ve cells or FR Low cells (FIG. 4C).
  • enhanced chemotaxis in FR High cells was shown by PDGF stimulation and was significantly blocked by STI571, a receptor (PDGFR) inhibitor (FIG. 4D). Therefore, FR High hES-MSCs had significantly higher mRNA levels of pluripotency-related genes or migration-related genes including OCI4 and CXCR4 than na ⁇ ve and FR Low cells (see FIGS. 5-8).
  • BSO butionine sulfoximine
  • mESCs murine embryonic stem cells
  • FR High cells showed markedly enhanced cell function for GSH recovery after H 2 O 2 treatment.
  • FR High cells showed domed colonies stained with a positive alkaline phosphatase stain characterizing undifferentiated murine embryonic stem cells.
  • FR High mESC showed self-renewal activity (FIG. 14) and more expression of pluripotency related genes (FIG. 15A and FIG. 15B), as shown in the limiting dilution assay. .
  • FR High mESC was superior to FR Low cells in terms of colonogenic efficiency.
  • FR Low mESCs showed defects in embryonic body formation when they differentiated to form embryoid bodies (EBs), neurons (eg Neurog2 and Olig2) and mesoderm (eg T and Nkx2.5) Several lineage markers, such as, were not induced (FIGS. 16 and 17). Defective differentiation in cells from the FR Low embryos was further confirmed by in vitro neural differentiation, verified by ⁇ III-tubulin + neurons and by the impaired induction of neural markers (FIG. 18). Overall, these findings demonstrated that high cytoplasmic GSH levels are necessary to maintain the core function of stem cells.
  • the mesenchymal stem cells were fractionated based on the FR of the FreSH-tracer to analyze the genetic differences between the FR high and FR low cell populations.
  • RUNX2, OCN, ALP, and MSX expression related to osteogenic genes related to differentiation capacity were measured by RQ-PCR.
  • Total RNA 50 ng was reverse transcribed using Taqman reverse transcriptase (Applied Biosystems, Canada) and threshold cycle (Ct) was determined using RQ-PCR as known.
  • Relative expression levels of target genes were determined using the 2 - ⁇ Ct method and GAPDH was used as an endogenous control gene. As a result, as shown in Figure 3, it was confirmed that OCN expression is significantly increased in FR high cells compared to FR low cells.
  • FR high and FR low cells were compared to measure relative expression levels of genes for bone differentiation.
  • Gene ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, and OLR1 showed no difference in gene expression.
  • the relative amount of expression of the gene was confirmed that the RUNX2 and OCN respectively 1.22 times and 2.96 times higher at high cell FR FR low compared to the cells.
  • the relative expression level of the ALP gene was confirmed to be 0.87 times lower in FR high cells.
  • FRhigh cells were found to significantly increase the expression of pluripotency-related genes OCT4, SOX2 and CXCR4 and cGF HGF receptor cMET compared to na ⁇ ve cells (Figs. 5 and 6), MSC in vivo engraftment rate and The expression of PDGF receptors (PDGF-RA and PDGF-RB) and VEGF growth factor receptors (VEGFR1, VEGF-R2 and ANGPT1) related to survival and vascular regeneration were also significantly increased (FIG. 7).
  • FR high and na ⁇ ve cells were compared to measure relative expression levels of genes for pluripotency.
  • Gene ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, and OLR1 showed no difference in gene expression.
  • FIG. 5 it was confirmed that relative expression levels of OCT4 and SOX2 genes were 4.3 and 7.2 times higher in FR high cells than in na ⁇ ve cells, respectively.
  • Figure 6 when the relative expression level of the gene for mobility was measured, it was confirmed that CXCR4 was 10.2 times higher in FR high cells compared to na ⁇ ve cells (Table 2).
  • FR high and na ⁇ ve cells were compared to measure relative expression levels of genes for growth and proliferation.
  • Gene ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, and OLR1 showed no difference in gene expression.
  • the relative expression level of the cMET gene was 2.2 times higher in FR high cells than in na ⁇ ve cells (Table 2).
  • macrophagecolony stimulating factor-1 (CSF-1) related to the immunomodulatory activity of MSC stem cells and the representative anti-inflammatory gene IDO2 (indoleamine 2,3-dioxygeniase 2) gene expression is FR high cells It was confirmed that significantly increased in (see Fig. 8 and Table 2).
  • FR high and na ⁇ ve cells were compared to determine the relative expression levels of genes for engraftment, survival and vascular regeneration.
  • Gene ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, and OLR1 showed no difference in gene expression.
  • the relative expression levels of the PDGFRA, PDGFRB, VEGF-R1, and VEGF-R2 genes were 4.0, 2.3, 1.6, and 1.4 times, respectively, in FR high cells compared to na ⁇ ve cells. Confirmed high.
  • FR high and na ⁇ ve cells were compared to measure relative expression levels of genes for immune regulation.
  • Gene ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, and OLR1 showed no difference in gene expression.
  • the relative expression level of CSF-1 gene was 2 times higher in FR high cells than in na ⁇ ve cells.
  • FR high and na ⁇ ve cells were compared to measure relative expression levels of genes for anti-inflammatory.
  • Gene ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, and OLR1 showed no difference in gene expression.
  • the relative expression level of IDO2 gene was 10-fold higher in FR high cells than in na ⁇ ve cells.
  • Embryonic stem cells were fractionated based on the FRs of the FreSH-tracer to analyze the genetic differences between the FR high and FR low cell populations as described above. By comparing FR high and FR low cells, relative expression levels of genes for pluripotency were measured. As shown in Table 3 and FIG. 15, the relative expression levels of Oct4, Nanog, Klf2, Klf4, Rex1, and Esrrb genes were 1.22-fold, 1.36-fold, 2.46-fold, 2.02-fold, respectively in FR high cells compared to FR low cells, 1.88-fold, and 2.92-fold higher. In addition, it was confirmed that the relative expression levels of Sox2 and cMyc genes were 0.98-fold and 0.65-fold lower in FR high cells, respectively.
  • Embryonic bodies were fractionated based on the FR of the FreSH-tracer to analyze the genetic differences between the FR high and FR low cell populations as described above. By comparing FR high and FR low cells, relative expression levels of genes for pluripotency were measured. As shown in Figure 16 and Figure 17, Neurog2, Olig2, T, Nkx2.5, Oct4, Esrrbb, Klf2, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, and the relative amount of expression of the gene Runx1 FR high compared to the FR low cell The ratios in the cells are shown in Table 4.
  • mice injected with FR High cells The number of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid in mice injected with FR High cells was less than in mice injected with FR Low or na ⁇ ve cells (FIG. 21). Similarly, tumor necrosis factor- ⁇ and interleukin (IL) -17 levels were low, but IL-10 levels were higher in bronchoalveolar lavage fluid in mice injected with FR High cells (FIG. 222). Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction confirmed that the mRNA levels of inflammatory cytokines were significantly reduced in lung tissues of mice injected with FR High cells (FIG. 23).
  • IL interleukin
  • Stem cell quality control method provided by the present invention can be managed by selecting the characteristics of the stem cells as needed by devising a specific ratio genetically to manage the quality according to the stem cell characteristics.

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Abstract

본 발명은 치료용 줄기세포 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 ACAN, SOX9, AP2, RUNX2, OCN, ALP, OCT4, SOX2, CXCR4, cMET, PDGFRA, PDGFRB, VEGF-R1, VEGF-R2, CSF-1, IDO2, Sox2, Nanog, cMyc, Klf2, Klf4, Rex1, Esrrb, Neurog1, Neurod1, Nkx2.2, Ascl2, Gfap, S100b, Olig2, Neurog2, T, Nkx2.5, Esrrbb, Klf2, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, 및 Runx1으로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상의 유전자가 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자에 비해 높거나 낮은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포 조성물을 제공하는 것이다.

Description

FRESH-트레이서 기반 분리된 세포의 유전자 프로파일의 응용
본 발명은 FreSH-트레이서 기반 분리된 세포의 유전자 프로파일의 응용에 관한 것이다.
활성산소종(ROS)은 세포 대사, 증식 및 생존을 조절하는 중요한 신호 분자이다(Winterbourn and Hampton, 2008). ROS의 증가는 신호전달 단백질의 시스테인 잔기의 티올 산화를 유도하여, 세포 기능을 조절하기 위한 단백질 활성의 변화를 가져온다. 특히, ROS 매개 산화는 자가 재생 능력, 만능성, 생존력 및 게놈 안정성에 영향을 주는 줄기세포(SC)의 다양한 신호전달 단백질을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 이들 신호 단백질은 OCT4, NRF2, FoxOs, APE1/Ref-1, ATM, HIF-1, p38, 및 p53를 포함한다(Wang et al., 2013). 예를 들어, 산화 환원 항상성의 주조절자인 Nrf2의 파괴는 배아줄기세포(ESC)에서 자가 재생 및 만능성과 같은 배아줄기세포 및 성체줄기세포의 기능에 영향을 미치고(Jang 등, 2014), 골수 틈새에서 조혈 모세포를 이동시키고 유지시키며(Tsai et al., 2013), 장내에서의 증식과 항상성에 영향을 미치고(Hochmuth et al., 2011), 기도 기저 줄기세포에 영향을 미친다(Paul et al., 2014). 따라서, 세포 산화환원 조절은 배아줄기세포 및 성인줄기세포의 줄기세포능과 기능적 효능을 유지하는 데 중요하다.
특허 WO2013059829 A1에는 중요한 만능성 인자인 nanog, oct4 및 sox2뿐만 아니라, 음성 세포 주기 조절인자인 p15 및 p21의 발현을 특징으로 하는 세포외기질 성분인 피브로모듈린으로 인간 섬유모세포를 처리함으로써 비종양형성성 PSC를 생성하는 접근법이 기술되어 있다. 대한민국 공개특허 제10-2016-0062157호에는 만능성 줄기세포(PSC)를 고도로 조절가능한 생물학적 기능을 갖는 pPSC로 후생유전학적으로 조절하고, 대사적으로 재프로그래밍함으로써 상기 세포를 재프로그래밍하는 방법에 대해서 기술이 있다. 그러나, 상기 두 접근법 모두 이상 증식 또는 종양형성성을 억제하는 것으로, 본 발명과는 차이가 있다. 또한, 본 발명은 줄기세포 특성에 따라 품질을 관리할 수 있도록 유전자적으로 특정한 비율을 밝혀낸 점에서 차이가 있다고 하겠다.
명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 FreSH-트레이서 기반 분리된 세포의 유전자 프로파일을 이용한 치료용 줄기세포 조성물을 제공하는 것이다.
구체적으로는, 본 발명은 줄기세포 특성에 따라 분리할 수 있도록 유전자적으로 특정한 비율을 고안하여 필요에 따른 줄기세포의 특징을 선별하여 관리할 수 있는 치료용 줄기세포 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기한 바와 같은 치료용 줄기세포 조성물을 가지고, 천식을 앓는 대상체에게 투여하여 천식을 개선, 예방 또는 치료하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기한 바와 같은 치료용 줄기세포 조성물을 가지고, 알레르기 천식을 앓는 대상체에게 투여하여 알레르기 천식을 개선, 예방 또는 치료하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예에서" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에서, 용어 "FreSH-트레이서(Fluorescent Real-time SH group-Tracer)"는 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 시아노아크릴아마이드 친전자체(cyanoacrylamide electrophile)를 갖는 쿠마린(coumarin) 유도체를 의미하고, 본 발명의 세포 활성 측정용 형광물질로서 사용된다. 우선, 본 발명의 FreSH-트레이서를 세포와 접촉시킨다. 이는 세포를 FreSH-트레이서로 표지하는 단계이다. 상기 단계에서 FreSH-트레이서로 표지된 세포의 430-550 nm 또는 550-680 nm에서의 형광세기, 또는 550-680 nm에서의 형광세기에 대한 430-550 nm에서의 형광세기의 비율을 실시간으로 측정한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 430-550 nm에서의 형광세기는 450-550, 470-550, 470-530, 490-530, 500-520 또는 510 nm에서의 형광세기이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 550-680 nm에서의 형광세기는 550-650, 550-620, 550-600, 570-590 또는 580 nm에서의 형광세기이다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 430-550 nm 또는 550-680 nm에서의 형광세기에 대한 430-550 nm에서의 형광세기의 비율이 높거나, 550-680 nm에서의 형광세기가 낮은 세포는 글루타치온(GSH) 활성이 높고, 세포 항산화 활성이 높은 바, 본 발명의 방법에 의하여 세포 항산화 활성의 측정이 가능하다.
줄기세포의 항산화능(anti-oxidative activity) 측정 방법은 하기와 같은 단계를 포함한다. (a) 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 세포 활성(Cell activity) 측정용 조성물을 세포에 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 세포의 (i) 430-550 nm 또는 550-680 nm에서의 형광세기, 또는 (ii) 550-680 nm에서의 형광세기에 대한 430-550 nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 실시간으로 관찰하는 단계;
[화학식 1]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000001
상기 화학식에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-4 직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나, R1, R2 및 X가 함께 5각 또는 6각 고리를 이루는 헤테로 사이클로알킬 또는 헤테로 사이클로알케닐이고; R3은 수소 또는 C1-4 직쇄 또는 가지쇄 알킬이며; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬, -(CH2)m-COO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나(상기 m는 1-5의 정수이다), R4, R5 및 Y는 함께 C3-7 헤테로사이클로알킬을 이루고, 상기 헤테로 사이클로알킬은 비치환 또는 R6으로 치환된 헤테로 사이클로알킬이고; 상기 R6은 -COO(CH2)n-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬(상기 n은 1-5의 정수이다), -(CONH)-(CH2)o-PPh3 +Cl-(상기 o는 1-5의 정수이다) 또는 -(CONH)-CHR7-COO(CH2)p-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬이며(상기 p는 1-5의 정수이다); 상기 R7은 -(CH2)q-COO(CH2)r-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬(상기 q 및 r은 각각 1-5의 정수이다)이고; X 및 Y는 각각 독립적으로 N 또는 O이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 바람직하게는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2 내지 7로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 보다 바람직하게는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2 로 표시되는 화합물이다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000003
[화학식 4]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000004
[화학식 5]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000005
[화학식 6]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000006
[화학식 7]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000007
본 명세서의 용어 "항산화 활성"은 세포의 내재적 기능 발현으로서 항산화도 회복력을 의미한다.
반응성 산소종(ROS)은 산소를 함유하는 화학적으로 반응성인 분자이다. "ROS 신호전달"이라는 용어는 세포성 신호전달에서 2차 메신저로서의 역할을 하는 ROS가 전형적으로는 산화적 인산화에 의한 호기성 대사 동안에 생성되는 프로세스를 의미한다. ROS는 세포 대사의 필수 조절인자이고, 이는 실제로는 모든 세포에서 미토콘드리아 전자 전달계에 의해 또는 NADPH 옥시다제에 의해 생성된다. 산화적 인산화는 호기성 대사를 위해 요구된다. 호기성 대사 과정 동안 미토콘드리아 전자 전달계에서 생성된 산화 환원 에너지는 ATP 형태로 고에너지 포스페이트기에 결합하게 된다. 시토크롬 c 옥시다제는 전자 전달계에서 최종 성분이며, 이는 산소 (O2)의 물 (H2O)로의 환원을 촉매화시키는데, 여기서, 산소는 최종 전자 수용체로서의 역할을 한다. 그러나, 산소의 불완전한 환원 또한 발생하며, 이는 슈퍼옥시드 라디칼 (O2 -) 및 과산화수소 (H2O2)를 포함하는 고도로 반응성인 산소 대사산물이 생성되도록 유도하고, 동시에 히드록실 라디칼 (OH*)은 전이 금속 이온의 존재하에서 형성될 수 있다. 이러한 부분적으로 환원된 산소 종은 ROS로 기술된다. ROS가 세포의 항산화 효소 시스템에 의해 억제되지 않으면, 이는 유해한 영향을 미칠 수 있고, 세포 손상, 노화 및 세포 사멸을 유도할 수 있다. 그러나, ROS는 또한 비유해성 세포 프로세스에도 관여하며, 세포에서 중요한 조절 역할을 한다. 예를 들어, 과산화수소에 의한 전사 인자의 산화는 입체형태적 변화, 및 유전자 발현의 직접적인 활성화를 유도할 수 있다. 현재 ROS 신호전달에 관한 패러독스는 너무 많은 ROS는 생명 유지에 필수적인 세포 성분의 산화에 의해 세포를 손상시키지만, ROS가 부족하거나, 또는 너무 적게 존재하는 것은 중요한 생리학적 기능 및 세포성 신호전달 기전을 손상시킨다는 것이다. 그러므로, ROS 신호전달은 세포에서 고도로 조절되고, 균형잡힌 시스템이다.
본 발명에서, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)는 GAPDH 또는 G3PDH라고도 약칭한다.
본 발명에서 용어, "줄기세포"는 자기 복제능 및 분화증식능을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라서, 만능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell), 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 상기 만능성 줄기세포는 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 또한, 다능성 줄기세포는 모든 종류는 아니지만, 복수 종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단분화능 줄기세포는 특정한 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 만능성 줄기세포로서는, 배아 줄기세포(ES Cell), 미분화생식선세포(EG Cell), 역분화줄기세포(iPS cell) 등을 들 수 있다. 다능성 줄기세포로서는, 간엽계 줄기세포(지방유래, 골수유래, 제대혈 또는 탯줄유래 등), 조혈계 줄기세포(골수 또는 말초 혈액 등에서 유래), 신경계 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 성체 줄기세포 등을 들 수 있다. 또한, 단분화능 줄기세포로는 평소에는 분열능이 낮은 상태로 존재하다가 활성화 이후 왕성한 분열로 오직 간세포들만을 만드는 간세포(Committed stem cell) 등을 들 수 있다. 특히, 본원 발명에서 중간엽 줄기세포(MSC)는 hES-MSC(Human embryonic stem cell-derived mesenchymal stroma cells), BM-MSC(Bone marrow mesenchymal stem cell), UC-MSC(Umbilical cord mesenchymal stem cell), 및 ADSC(Adipose Derived Stem Cell-Condtioned Medium)인 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)"는 수정란이 착상하기 직전인 배반포기(blastocyst)의 내부세포 덩어리(세포내괴, inner cell mass)를 분리하여 체외에서 배양한 세포로, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 만능성(pluripotency)을 갖는다. 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체를 포함한다. 본 발명에서 용어, "배아체(embryonic body 또는 embryoid body, EB)"는 부유 배양 상태에서 생성된 구형의 줄기세포의 덩어리를 의미하며, 잠재적으로 내배엽, 중배엽, 외배엽으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있어 조직특이적 분화 세포를 확보하기 위한 대부분의 분화 유도 과정에서 전구체로 이용된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 치료용 줄기세포에 있어서, 상기 줄기세포는 ACAN, SOX9, AP2, RUNX2, OCN, ALP, OCT4, SOX2, CXCR4, cMET, PDGFRA, PDGFRB, VEGF-R1, VEGF-R2, CSF-1, IDO2, Sox2, Nanog, cMyc, Klf2, Klf4, Rex1, Esrrb, Neurog1, Neurod1, Nkx2.2, Ascl2, Gfap, S100b, Olig2, Neurog2, T, Nkx2.5, Esrrbb, Klf2, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, 및 Runx1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준이 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현 수준에 비해 높거나 낮은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC), 배아 줄기세포(ESC), 또는 배아체(EB)로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 줄기세포가 중간엽 줄기세포(MSC)인 경우, AP2, 및 ALP로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 높은 비율로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포가 중간엽 줄기세포(MSC)인 경우, ACAN, SOX9, RUNX2, 및 OCN으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포가 중간엽 줄기세포(MSC)인 경우, OCT4, SOX2, CXCR4, cMET, PDGFRA, PDGFRB, VEGF-R1, VEGF-R2, CSF-1, 및 IDO2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포가 배아 줄기세포(ESC)인 경우, Oct4, Sox2, Nanog, Klf2, Rex1, 및 Esrrb로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 높은 비율로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포가 배아 줄기세포(ESC)인 경우, cMyc, Klf4, Neurog1, Neurod1, Nkx2.2, Ascl2, Gfap, S100b, 및 Olig2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 초기에 Oct4, Esrrbb, 및 Klf2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 높은 비율로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 초기에 Neurog2, Olig2, T, Nkx2.5, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, 및 Runx1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 1~6일차에서 T, 및 Oct4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 높은 비율로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 1~6일차에 Neurog2, Olig2, Nkx2.5, Esrrbb, Klf2, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, 및 Runx1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 7~8일차에 cTnT, a-Actin, 및 Mlc2v로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 높은 비율로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 7~8일차에 Neurog2, Olig2, T, Nkx2.5, Oct4, Esrrbb, Klf2, Klf4, 및 Runx1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 연골 분화시킨 경우에 ACAN이 GAPDH에 비해서 0.0009 내지 0.0012배이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 연골 분화시킨 경우에 SOX9이 GAPDH에 비해서 0.006 내지 0.0077배이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 지방 분화시킨 경우에 AP2가 GAPDH에 비해서 9.3 내지 11.4배이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 골 분화시킨 경우에 RUNX2가 GAPDH에 비해서 0.38 내지 0.48배이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 골 분화시킨 경우에 OCN이 GAPDH에 비해서 0.074 내지 0.092배이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 골 분화시킨 경우에 ALP가 GAPDH에 비해서 27.6 내지 33.8배이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, OCT4가 GAPDH에 비해서 0.0051 내지 0.0063배인 경우에 다능성(multipotent)이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, SOX2가 GAPDH에 비해서 0.0099 내지 0.0122배인 경우에 다능성(multipotent)이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, CXCR4가 GAPDH에 비해서 0.0062 내지 0.0077배인 경우에 이동성이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, cMET가 GAPDH에 비해서 0.063 내지 0.078배인 경우에 성장 및 증식이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, PDGFRA가 GAPDH에 비해서 0.31 내지 0.39배인 경우에 생착률, 생존률 및 혈관재생이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, PDGFRB가 GAPDH에 비해서 0.45 내지 0.56배인 경우에 생착률, 생존률 및 혈관재생이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, VEGF-R1가 GAPDH에 비해서 0.44 내지 0.55배인 경우에 생착률, 생존률 및 혈관재생이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, VEGF-R2가 GAPDH에 비해서 0.62 내지 0.77배인 경우에 생착률, 생존률 및 혈관재생이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, CSF-1이 GAPDH에 비해서 0.19 내지 0.24배인 경우에 면역조절 효과가 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, IDO2가 GAPDH에 비해서 0.00131 내지 0.00160배인 경우에 항염증 효과가 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Oct4가 GAPDH에 비해서 21.4 내지 26.2배인 경우에 만능성(pluripotent)이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Sox2가 GAPDH에 비해서 3.3 내지 4.1배인 경우에 만능성이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Nanog가 GAPDH에 비해서 3.7 내지 4.6배인 경우에 만능성이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, cMyc가 GAPDH에 비해서 0.8 내지 1.1배인 경우에 만능성이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Klf2가 GAPDH에 비해서 10.6 내지 13.1배인 경우에 만능성이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Klf4가 GAPDH에 비해서 0.64 내지 0.79배인 경우에 만능성이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Rex1이 GAPDH에 비해서 8.5 내지 10.4배인 경우에 만능성이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Esrrb가 GAPDH에 비해서 2.4 내지 3.0배인 경우에 만능성이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Neurog1이 GAPDH에 비해서 0.49 내지 0.60배인 경우에 신경 분화가 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Neurod1이 GAPDH에 비해서 0.17 내지 0.22배인 경우에 신경 분화가 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Nkx2.2가 GAPDH에 비해서 0.00064 내지 0.00080배인 경우에 신경 분화가 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Ascl2가 GAPDH에 비해서 0.16 내지 0.21배인 경우에 신경 분화가 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Gfap가 GAPDH에 비해서 0.13 내지 0.17배인 경우에 신경 분화가 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, S100b가 GAPDH에 비해서 0.012 내지 0.016배인 경우에 신경 분화가 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Olig2가 GAPDH에 비해서 0.025 내지 0.032배인 경우에 신경 분화가 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Neurog2가 GAPDH에 비해서 0.00008 내지 0.00010배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Olig2가 GAPDH에 비해서 0.0047 내지 0.0059배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 T가 GAPDH에 비해서 0.036 내지 0.045배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Nkx2.5가 GAPDH에 비해서 0.0043 내지 0.0053배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Oct4가 GAPDH에 비해서 17.84 내지 21.81배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Esrrbb가 GAPDH에 비해서 2.74 내지 3.36배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Klf2가 GAPDH에 비해서 10.10 내지 12.50배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Klf4가 GAPDH에 비해서 0.60 내지 0.73배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 cTnT가 GAPDH에 비해서 0.0009 내지 0.0011배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 a-Actin이 GAPDH에 비해서 0.36 내지 0.45배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Mlc2v가 GAPDH에 비해서 0.050 내지 0.062배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Runx1가 GAPDH에 비해서 0.016 내지 0.021배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Neurog2가 GAPDH에 비해서 0.00030 내지 0.00042배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Olig2가 GAPDH에 비해서 0.00050 내지 0.00072배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 T가 GAPDH에 비해서 2.60 내지 3.19배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Nkx2.5가 GAPDH에 비해서 0.0070 내지 0.0090배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Oct4가 GAPDH에 비해서 1.20 내지 1.60배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Esrrbb가 GAPDH에 비해서 0.008 내지 0.011배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Klf2가 GAPDH에 비해서 0.16 내지 0.20배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Klf4가 GAPDH에 비해서 0.067 내지 0.083배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 cTnT가 GAPDH에 비해서 0.020 내지 0.025배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 a-Actin이 GAPDH에 비해서 0.15 내지 0.20배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Mlc2v가 GAPDH에 비해서 0.11 내지 0.14배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Runx1가 GAPDH에 비해서 0.089 내지 0.110배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Neurog2가 GAPDH에 비해서 0.00078 내지 0.0010배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Olig2가 GAPDH에 비해서 0.0068 내지 0.0084배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 T가 GAPDH에 비해서 0.051 내지 0.064배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Nkx2.5가 GAPDH에 비해서 0.086 내지 0.110배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Oct4가 GAPDH에 비해서 0.050 내지 0.061배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Esrrbb가 GAPDH에 비해서 0.012 내지 0.016배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Klf2가 GAPDH에 비해서 0.41 내지 0.52배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Klf4가 GAPDH에 비해서 0.071 내지 0.088배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 cTnT가 GAPDH에 비해서 2.10 내지 2.58배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 a-Actin이 GAPDH에 비해서 3.79 내지 4.65배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Mlc2v가 GAPDH에 비해서 10.70 내지 13.11배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Runx1가 GAPDH에 비해서 0.16 내지 0.21배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기한 바에 따른 치료용 줄기세포 조성물을 유효성분으로 하는 천식 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기한 바에 따른 치료용 줄기세포 조성물을 유효성분으로 하는 알레르기성 천식용 약학 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예로 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 치료용 줄기세포는 줄기세포 특성에 따라 양질의 품질을 관리할 수 있도록 유전자적으로 특정한 비율을 고안하여 필요에 따른 줄기세포의 특징을 선별하여 관리할 수 있다는 효과가 있다.
도 1은 간엽세포 줄기 세포의 자가복제 및 이동 활성을 조절하는 세포 내 글루타티온(GSH) 수치를 나타낸 그래프이다. FRHigh, FRMid 및 FRLow hES-MSC에서 100 μM H2O2 (n = 3개의 세포)로 처리한 후 세포 용해물(n = 2 독립적인 생물학적 복제)의 GSH 비교를 통한 발광 기반 정량을 나타낸다.
도 2는 형광 변화 비교를 통한 발광 기반 정량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 FreSH-트레이서에 의하여 분리된 줄기세포의 분화 활성 관련 유전자 발현의 차이를 측정한 결과이다. ns: 유의성 없음, ***p <0.001.
도 4는 콜로니 형성 단위 섬유아세포(CFU-F, n = 15)의 분석, 1차 CFU 콜로니를 재도말하여 한계 희석 분석 (n = 6), 기질유도인자-1 알파에 대한 주화성 (SDF1α, 150 ng/mL, n = 8), 및 PDGFR 억제제인 STI571(0.5μg/mL)의 부재 또는 존재 하에서의 10ng/mL 혈소판-유도 성장인자(PDGF)-AA에 대한 주화성(n = 8)을 나타내는 그래프이다.
도 5는 FR 기반하여 분류된 hES-MSC 및 분류되지 않은 대조(나이브) 세포에서 만능성(pluripotency) 관련 유전자의 qPCR 결과(n = 8)를 나타내는 그래프이다.
도 6은 FR 기반하여 분류된 hES-MSC 및 분류되지 않은 대조(나이브) 세포에서 세포 이동성 관련 유전자의 qPCR 결과(n = 8)를 나타내는 그래프이다.
도 7은 FR 기반하여 분류된 hES-MSC 및 분류되지 않은 대조(나이브) 세포에서 줄기세포의 성장인자 및 이들의 수용체 유전자 발현의 차이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 FreSH-트레이서에 의하여 분리된 줄기세포의 면역조절활성 항염증 유전자 발현의 차이를 측정한 결과이다.
도 9는 hES-MSCs에서 높은 GSH 수준의 기능적 역할을 나타내는 그래프이다(CFU-F (n = 10)).
도 10은 대조군과 BSO 처리된 FRHigh hES-MSCs에서 줄기세포능 및 이동 관련 유전자(n = 4)의 qPCR 분석 대조군 및 GSH-EE는 FRLow 세포를 나타내는 그래프이다. 스케일 바, 200 μm. 모든 막대 그래프에서 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. n.s., 유의하지 않음.
도 11은 BSO 및 GSH-EE로 처리된 FRHigh 및 FRLow hES-MSC에서 콜로니 형성 단위 섬유아세포 분석(CFU-F, 도 8a) 및 10 ng/mL 혈소판 유도 성장 인자(PDGF)-AA(도 8b)에 대한 주화성 분석을 나타내는 그래프이다.
도 12는 BSO 또는 GSH-EE로 처리한 분류되지 않은 대조군(나이브) hES-MSC에서 10ng/mL PDGF-AA(n = 10)에 대한 주화성 분석을 나타낸다. 정량적 데이터는 비처리된 나이브 세포에 대한 비율로 나타낸다.
도 13은 낮은 글루타티온(GSH) 수준의 마우스 배아 줄기 세포의 다발성 분화도 및 분화 장애를 나타내는 그래프이다. 세포 용해물에서의 GSH의 발광 기반 정량(n = 4)을 나타낸다.
도 14는 FRHigh 및 FRLow mESC 및 분류되지 않은 대조(나이브) 세포에서 한계 희석에서의 콜로니 형성능(n = 5)을 나타내는 그래프이다. 스케일 바, 200 μm.
도 15는 FRHigh 및 FRLow mESC 및 분류되지 않은 대조(나이브) 세포에서 qPCR 및 웨스턴 블록 분석(n = 4)을 나타내는 그래프이다. 스케일 바, 200 μm.
도 16은 표시된 날에 EB에서 계통 특이 유전자(Neurog2, Olig2, T 및 Nkx2.5)에 대한 qPCR 분석(n = 4)을 나타내는 그래프이다.
도 17은 두 집단(FRHigh 및 FRLow 세포)으로 분류된 mESC는 배아체(EB)를 형성함으로써 분화되었고, EB에서 세포의 만능성과 계통 특이적 유전자의 qPCR 분석 (n = 4)이 표시된 날에 수행한 것을 나타내는 그래프이다. 정량적 데이터는 0 일째의 FRHigh 세포에 대한 비율로 나타낸다. 모든 오차 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, Bonferroni post-hoc 테스트를 사용한 일원 또는 양방체 ANOVA. 스케일 바, 200 μm.
도 18은 ESC 분화 중 신경 계통 마커(Neurog1, Neurod1, Nkx2.2, Ascl2, Gfap, S100b 및 Olig2, n = 4)의 βIII-튜불린+ 뉴런 세포 qPCR 분석을 나타내는 그래프이다. 스케일 바, 100 μm. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
도 19는 높은 글루타티온 수준을 가진 줄기 세포로 증가된 치료 효과를 관찰하기 위한 분석 계획도이다.
도 20은 나이브, FRHigh 및 FRLow hES-MSC 또는 인산염완충식염수(PBS)를 오발부민과 폴리(I:C)로 처리된 마우스에 투여한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 21은 대식세포, 호중구, 림프구 및 호산구의 총 세포수(n = 30)를 나타내는 그래프이다.
도 22는 기관지 폐포 세척액에서 TNFα, IL-10 및 IL-17의 효소 결합 면역 흡착 분석에 근거한 검출(n = 10) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 23은 폐 조직으로부터 분리된 RNA를 사용하여 Tnfa, Clcl2, Il1b, Il12a 및 Il18 발현의 qPCR 분석(n = 10)을 나타내는 그래프이다. 스케일 바, 200 μm. 모든 막대 그래프에서 값은 평균 ± SEM을 나타냅니다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. n.s., 유의하지 않음.
본 발명에서 제공하는 치료용 줄기세포는 줄기세포 특성에 따라 양질의 품질을 관리할 수 있도록 유전자적으로 특정한 비율을 고안하여 필요에 따른 줄기세포의 특징을 선별하여 관리할 수 있다. 본 발명은 치료용 줄기세포 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 ACAN, SOX9, AP2, RUNX2, OCN, ALP, OCT4, SOX2, CXCR4, cMET, PDGFRA, PDGFRB, VEGF-R1, VEGF-R2, CSF-1, IDO2, Sox2, Nanog, cMyc, Klf2, Klf4, Rex1, Esrrb, Neurog1, Neurod1, Nkx2.2, Ascl2, Gfap, S100b, Olig2, Neurog2, T, Nkx2.5, Esrrbb, Klf2, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, 및 Runx1으로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상의 유전자가 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자에 비해 높거나 낮은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포 조성물을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
FreSH-트레이서 기반 줄기세포의 항산화능 측정
줄기세포의 측정 방법
본 발명자들은 본 발명의 FreSH-트레이서(Fluorescent Real-time SH group-Tracer)의 특정 범위 파장에서의 형광세기 비율과 시료의 항산화능과의 관계를 규명하였고, 상술한 형광세기를 관찰함으로서, 세포의 항산화 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
줄기세포의 항산화능(anti-oxidative activity) 측정 방법은 하기와 같았다. (a) 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 세포 활성(Cell activity) 측정용 조성물을 세포에 접촉시켰고; (b) 예컨대 상기 세포의 (i) 510m 또는 580nm에서의 형광세기, 또는 (ii) 580nm에서의 형광세기에 대한 510nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 실시간으로 관찰하였다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000008
본 실시예에 따르면, 바람직하게는 화학식 2 로 표시되는 화합물을 사용하였다. 화학식 2 로 표시되는 화합물은 1 내지 100uM을 사용하고, 바람직하게는 1 내지 20uM, 보다 바람직하게는 1 내지 10uM, 더욱 바람직하게는 약 5uM을 사용하였다.
생세포의 세포내 세포기관에 따라 상이한 GSH 수준
생세포에서의 GSH 모니터링을 위해 FreSH-트레이서를 사용하여, 생세포의 세포독성을 평가하였다. 24시간 동안 최대 10 μM FreSH-트레이서의 처리는 HeLa 세포 및 골수 유래 인간 중간엽 줄기세포(hBM-MSCs)와 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포(hES-MSC)의 생존력에 영향을 미치지 않았다. HeLa 세포를 5 μM의 FreSH-트레이서로 2시간 동안 처리하여 평형을 이루었다. 공초점 및 비율계량 의사색체 이미지로부터 FreSH-트레이서가 세포 내부에 분포되어 광범위한 FR값을 나타냄을 확인하였다. 핵 내의 FR은 세포질의 FR보다 약 1.5-2배 높았다. 핵소체의 FR은 상대적으로 낮은 GSH 수준을 나타내었고, 말초 세포질의 FR은 다른 영역의 FR보다 높았다. 또한, 세포질 내에서 가변적인 FR 값이 관찰되었는데 이는 소포체와 미토콘드리아에서 GSH로 인해 발생할 수 있는 의사색체 이미지에서 모자이크 패턴을 만들었다. HeLa 세포를 5 μM FreSH-트레이서로 2시간 동안 평형시킨 후 디아미드로 처리했을 때, FR은 디아미드(또는 NEM)에 의해 서서히 감소한 후 디티오트레이톨에 의해 급격히 증가하였다. FreSH-트레이서는 세포내 환경에서 티올과 가역적으로 반응한다는 것을 확인하였다.
미토콘드리아는 정상적인 산화 대사 동안 내인성 ROS 생성의 중요한 부분이다. 세포액의 GSH는 미토콘드리아로 운반되어 고분자 손상을 방지하고 ROS 유도성 신호를 조절한다. 세포질에서의 FR 이질성을 더 분석하기 위해, FreSH-트레이서에 트리페닐포스포늄 잔기를 부착시켜 MitoFreSH-트레이서로 명명된 미토콘드리아 표적 FreSH-트레이서 유도체를 합성하였다. MitoFreSH-트레이서는 GSH와 함께 신속하고 가역적으로 반응하여 FreSH-트레이서와 유사한 GSH 의존적 인 FR 값을 보였다(KD = 1.3 mM). 24시간 동안 10 μM까지 처리한 HeLa 세포에는 세포 독성 효과가 나타나지 않았다. 공초점 이미지는 MitoFreSH-트레이서가 HeLa 세포의 미토콘드리아에 국한되고 있음을 확인하였고, FR은 디아미드 처리시 감소하였다. 이는 미토콘드리아 내의 GSH 수준이 MitoFreSH-트레이서에 의해 모니터링될 수 있음을 확인한 것이었다. 놀랍게도, 정상적인 배양 조건에서도 단일 세포 내에서 미토콘드리아의 FR 값에는 큰 변화가 있었고, 이는 단일 세포의 미토콘드리아에서 GSH 수준이 이질적임을 나타내었다. 또한, 세포가 안티마이신A로 처리될 때 FR의 농도 의존적 감소가 관찰되었으며, 이는 전자 전달을 억제하여 미토콘드리아에서 ROS를 생성한다. 분석 결과, 미토콘드리아 ROS 수준은 미토콘드리아에 국한되고 ROS에 의해 산화될 때 형광을 방출하는 비-형광성 로다민(rhodamine) 유도체인 DHR123의 처리로 증가하는 것을 확인하였다. 종합하면, 이러한 결과는 GSH 수준이 세포기관에 따라 다를 뿐만 아니라 생세포의 동일한 구획 내의 다른 영역에서도 다르다는 것을 입증한 것이다.
생세포에서의 GSH 농도의 실시간 측정
GSH가 세포에서 가장 풍부한 티올이지만, 단백질은 세포질 티올의 중요한 부분을 구성한다. 따라서, 본 발명자들은 생세포에서 GSH 수준의 지속적인 변화를 기록하기 위해 단백질 티올의 존재에 의해 FreSH-트레이서가 유의한 영향을 받는지 여부를 조사하였다. HeLa 세포를 48시간 동안 다양한 농도의 부티오닌 설폭시민(BSO; buthionine sulfoximine)으로 처리하여 GSH 합성을 억제할 때 GSH가 고갈된 세포에서 FR을 측정한 결과, FRGSH가 정상 세포에서 총 FR의 약 55%를 차지하고, 세포 용해액에서 발광-기반 분석에 의해 독립적으로 측정된 세포내 GSH 농도는 공 초점 현미경(R2 = 0.9135) 및 유동세포계측법(R2 = 0.9753)에 의해 결정된 FR과 직접 상관 관계가 있다는 것을 확인하였다.
상기한 바와 같은 시험관내 실험은 H2O2 처리가 FRGSH만 감소시키는 반면 FRPSH에는 거의 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 이와 같이, GSH가 고갈된 세포는 40분에 걸쳐 100 μM 또는 500 μM H2O2를 첨가한 후 FR값에 변화가 없었으며, 이는 PSH(세포 단백질에서의 시스테인 티올)가 아닌 GSH의 산화가 H2O2 처리된 세포에서 FR 변화를 일으킨다는 것을 나타내었다. 따라서 FreSH-트레이서는 산화 스트레스 하에 생세포에서 GSH 농도의 실시간 동적 변화를 기록할 수 있다. GSH가 고갈된 세포를 대조 실험으로서 디아미드로 처리하면 FR은 감소했지만 원래의 수준으로 즉시 회복하는 것을 확인하였다. 티오레독신환원효소 저해제인 1-클로로-2,4-디니트로벤젠을 처리하면 상기한 바와 같은 복원 활동이 중단되어 GSH 대신 티오레독신(thioredoxin)이 PSH의 이황화를 감소시키는 데 필요한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 FreSH-트레이서가 생세포에서 GSH와 PSH를 성공적으로 구별할 수 있음을 나타낸다.
산화 스트레스 하에서 동적으로 변화하는 세포질 GSH 수준
다양한 세포 조건에 의한 ROS 생산은 자가복제 및 분화와 같은 줄기세포 기능에 유의한 영향을 미쳤다. 따라서, 본 발명자들은 GSH 수준의 H2O2 유도성 변화를 모니터링하였다. HeLa 세포와 hBM-MSC를 H2O2로 처리한 경우, FR은 급격히 감소하고 변화가 없다가 최종적으로 천천히 증가하여 궁극적으로 처리하지 않은 수준으로 되돌아 가는 것을 확인하였다. 세포질과 핵질에서의 FR 변화의 프로파일 및 시간 경과는 전체 세포에서 관찰된 것과 유사하였다. 특히, HeLa 세포에서의 GSH 수준은 hBM-MSC보다 H2O2 처리에 더 민감하였다. H2O2의 농도가 증가함에 따라 처리 된 HeLa 세포에서 FR의 감소와 회복 지연 시간이 두드러짐을 확인하였다.
이러한 결과를 확인하기 위해 내생적으로 생성된 ROS에 의해 유도된 GSH 변화를 모니터링하였다. 대식세포에서 ROS는 세포가 활성화될 때 NADPH 산화 효소에 의해 생성된다. 따라서, RAW264.7 세포를 FreSH-트레이서에 넣고 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA)로 처리 하였다. 공초점 현미경으로 검사하여, 처리된 세포의 모든 영역에서 PMA 처리시 FR이 30분에 걸쳐 서서히 감소한 후 다음 30분 동안 서서히 제어 수준으로 회복됨을 확인하였다. 또한 ROS 생산은 저밀도 배양 또는 혈청 박탈 배지에서 증가하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, GSH 수준의 변화에 대한 배양 조건의 영향을 관찰하였다. HeLa 세포를 혈청이 없는 배지에 18시간 동안 노출시키면 세포질과 핵질에서 FR이 현저히 감소하였다. 서로 다른 밀도로 배양하였을 때 조밀하게 배양된 HeLa 세포의 평균 FR은 FR에서 큰 변화에도 불구하고 조밀하지 않게 배양된 세포의 평균 FR보다 유의하게 높고, 특히 핵질에서 높았다.
hBM-MSC의 GSH 수준을 모니터링하기 위해 세포를 상이한 접종 밀도에서 연속적으로 계대배양하였다. 유세포 분석 결과, hBM-MSC 집단은 GSH 수준과 관련하여 이질적이었으며, 특히 GSH 함량이 높은 세포의 수(GSHHigh)는 계대배양이 증가함에 따라 점차 감소하고, 특히 낮은 세포 밀도에서 배양된 경우, 이는 줄기세포의 GSH 수준이 배양 조건에 의존함을 나타내었다. 이러한 결과는 GSH 수준이 산화 스트레스에 반응하여 극적으로 변하고, FreSH-트레이서가 각각 세포의 산화 환원 완충 능력을 평가하기 위해 GSH 수준의 시공간 정보를 제공할 수 있음을 보여주었다.
줄기세포 기능을 위한 GSH 수준
줄기세포에서 재프로그램된 GSH 수준이 생물학적으로 중요하다는 것을 증명하기 위해, 본 발명자들은 hBM-MSC(골수 유래 인간 간엽 줄기세포)를 유세포 분석기로 분류하여 FR(F510/F580의 형광비율)(FRHigh, FRMid 및 FRLow 세포; 도 S5A)를 기반으로 3개의 하위 집단으로 분류하였다. 그후, 분류된 세포에서 FreSH-트레이서로 신속히 제거하였다. 시험관내에서 분류된 줄기세포 하위 집단의 기능적 특성을 비교하였다. FRMid 및 FRLow 세포와 비교하여, FRHigh hBM-MSC는 콜로니 형성 단위 섬유아세포(CFU-F; colony-forming unit fibroblasts)에 대한 세포 기능이 향상되었고 혈소판 유래 성장 인자(PDGF; platelet-derived growth factor)에 대한 주화성(chemoattraction)이 유의하게 향상하였다.
GSH(글루타치온) 함량이 높은 줄기세포의 향상된 기능성을 검증하기 위해 FR을 기반으로 hES-MSC를 FRHigh, FRMid 및 FRLow, 3개의 하위 집합으로 FACS 분류하였다. 각 집단의 세포 용해물의 GSH 농도는 FR 수준에 비례하여, FR에 기반한 분류 방법을 검증한 것이었다(도 1). 흥미롭게도, 100μM H2O2로 처리한 후에 FR 감소 및 회복 지연 시간은 분류된 세포 집단의 FR 수준에 반비례하였다(도 2a). 또한, FRHigh 세포의 FR은 H2O2 노출 후 기저 수준 이상으로 회복되어, FRHigh 세포가 대조군 세포에 비해 더 큰 GSH 회복량을 갖는 것으로 나타났다.
도 2b에 나타난 바와 같이, 분류된 hES-MSC는 증식 속도에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 만능성을 시험한 결과, FRHigh 및 FRLow 세포는 모두 연골 형성, 지방 형성 및 골 형성 계통으로 분화하는데 유사한 분화 능력을 나타내었다. 그러나 FRHigh hES-MSC는 FRLow 세포에 비해 일부 계통 마커, SOX9, AP2 및 OCN 등의 유도에서 유의한 증가를 보여주었다(도 3). 이 때, 분화 배양액에 대해서는 세포를 기본 베양액에서 유지시키고, 각각 지방 형성 유도 배지(5% FBS, 1mM 덱사메타손, 10mM 인슐린, 200mM 인도메타신 및 0.5mM 이소부틸메틸크산틴으로 보충된 DMEM), 골 형성 유도 배지(5% FBS, 50mM 아스코르베이트-2-포스페이트, 0.1mM 덱사메타손, 및 10mM 글리세로포스페이트로 보충된 DMEM), 및 연골 형성 유도 배지(예를 들면, Invitrogen사의 StemPro chondrogenesis)에서 배양하였다. 도 3은 비분화된(Non) FRHigh 세포와 FRLow 세포 및 분화된(Diff) FRHigh 세포와 FRLow 세포에서 계통 특이적 유전자를 정량화하기 위한 qPCR 분석을 한 결과를 나타내는 그래프이다. 또한, FRHigh hES-MSC는 각각 FRMid 및 FRLow 세포보다 약 4.7 및 4.9배 높은 수의 CFU-F를 가졌다(도 4a). 각각의 CFU 콜로니를 수확하고 한계 희석 분석을 위해 재접종한 경우, FRHigh hES-MSC의 CFU 콜로니는 FRLow 세포의 것보다 2배의 클론 생성 활성을 나타내고(도 4b), 이는 FRHigh hES-MSC의 향상된 자가복제 활성을 나타내었다. 두 종류 모두의 줄기세포에서 FRHigh 세포는 나이브세포 또는 FRLow 세포와 비교하여 기질유도인자-1에 대한 현저하게 향상된 주화성을 나타내었다(도 4c). 또한, FRHigh 세포에서의 향상된 주화성은 PDGF 자극에 의해 나타나고, 수용체(PDGFR) 억제제인 STI571에 의해 상당히 차단되었다(도 4d). 따라서, FRHigh hES-MSCs는 나이브세포 및 FRLow 세포보다 OCI4와 CXCR4를 포함하는 만능성 관련 유전자 또는 이동 관련 유전자의 mRNA 수준이 유의하게 높았다(도 5 내지 도 8 참고).
높은 GSH 수준의 기능적 역할을 증명하기 위해, 본 발명자들은 부티오닌 설폭시민(BSO; buthionine sulfoximine)를 사용하여 FRHigh hES-MSCs에서 세포질 GSH를 고갈시키고, GSH이 결핍되면 콜로니 형성능 및 이동능뿐만 아니라 FRHigh hES-MSC에서 관찰된 관련 유전자의 상향 조절을 크게 저해한다는 것을 발견하였다(도 9, 도 10, 도 11a 및 도 11b). 이러한 데이터와 일치하여, FRLow hES-MSC에서 저하된 세포 기능은 세포 투과가능한 글루타티온인 글루타티온 에틸에스터(glutathione ethyl ester; GSH-EE)에 의해 FRHigh 세포 기능과 유사한 수준으로 역전된 것을 관찰하였다. 또한, BSO 및 GSH-EE로 처리된 나이브세포는 각각 PDGF에 대한 주화성의 활성 및 유의한 억제를 나타내었다(도 12).
다른 종류의 줄기세포들 중에서 높은 GSH 함량의 유의함을 조사하기 위해, 뮤린 배아줄기세포(mESCs)를 FreSH-트레이서의 FR에 의거하여 보다 높은 GSH 수준의 세포와 보다 낮은 GSH 수준의 세포로 분획하였다(도 13). FRLow 뮤린 배아줄기세포와 비교하여, FRHigh 세포는 H2O2 처리 후 GSH 회복 능력에 대해 현저하게 향상된 세포 기능을 나타내었다. 이들 FRHigh 세포는 미분화된 뮤린 배아줄기세포의 특징인 양성 알칼리성 포스파타아제 염색약으로 염색된 돔형 형태 콜로니를 나타내었다. 또한, FRHigh mESC는 한계 희석 분석(limiting dilution assay)에서 나타내는 바와 같이, 자가복제(self-renewal) 활성(도 14) 및 만능성 관련 유전자의 더 많은 발현(도 15a 및 도 15b)을 나타내었다. 따라서, FRHigh mESC는 콜로니 형성능(clonogenic efficiency) 측면에서 FRLow 세포보다 우수하였다. 이들이 분화하여 배아체(embryoid body; EB)를 형성한 경우에 FRLow mESC는 배아체 형성에 결함(defect)을 보였고, 신경(예컨대, Neurog2 및 Olig2) 및 중배엽(예컨대, T 및 Nkx2.5)과 같은 몇 가지 계통 마커가 유도되지 않았다(도 16 및 도 17). FRLow 배아체로부터의 세포에서의 결함있는 분화능은 시험관내 신경 분화에 의해 추가로 확인하였고, βIII-튜불린+ 뉴런으로 검증하고 신경 마커의 손상된 유도로 검증하였다(도 18). 종합적으로는, 이러한 발견은 높은 세포질 GSH 수준이 줄기세포의 핵심 기능을 유지하기 위해 필요하다는 것을 입증한 것이었다.
FreSH-트레이서 기반 분리된 세포의 유전자 발현 분석
i) 중간엽 줄기세포(hES-MSC)에서의 FreSH-트레이서 기반 분석
FreSH-트레이서의 FR에 의거하여 중간엽 줄기세포(hES-MSC)를 분획하여 FRhigh와 FRlow 세포군 간의 유전자 차이를 분석하였다. 우선, 분화 유도 2주 후에 분화능과 관련된 골형성(osteogenic) 관련 유전자들인 RUNX2, OCN, ALP, MSX 발현 변화를 RQ-PCR를 통하여 측정하였다. Taqman 역전사 시약(Applied Biosystems, 캐나다)를 이용하여 총 RNA(50 ng)을 역전사 시키고, 공지된 바와 같이 RQ-PCR을 이용하여 역치 사이클(Ct)을 결정하였다. 표적 유전자의 상대적 발현 레벨은 2-△△Ct방법을 이용하여 결정하였고, 내인성 대조 유전자로 GAPDH를 이용하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, OCN 발현이 FRlow 세포와 비교하여 FRhigh 세포에서 유의적으로 증가됨을 확인하였다.
한편, FRhigh와 FRlow 세포를 비교하여, 골분화에 대한 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다. 유전자 ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, 및 OLR1에서는 유전자 발현량의 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, RUNX2 및 OCN 유전자의 상대적인 발현량이 FRlow 세포에 비해 FRhigh 세포에서 각각 1.22배 및 2.96배 높았음을 확인하였다. 또한, ALP 유전자의 상대적인 발현량은 FRhigh 세포에서 0.87배 낮음을 확인하였다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 연골 분화에 대한 유전자의 상대적 발현량은 ACAN 및 SOX9이 FRlow 세포에 비해 FRhigh 세포에서 각각 1.52배 및 1.83배 높았음을 확인하였다. 지방 분화에 대한 유전자의 상대적 발현량을 측정한 경우에, AP2가 FRlow 세포에 비해 FRhigh 세포에서 1.22배 높았음을 확인하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000009
또한, 만능성(pluripotency) 및 MSC 줄기세포 치료 효능에 관련된 세포이동성, 성장 인자 및 수용체, 염증 및 면역 조절 유전자들의 발현 변화를 qPCR를 통하여 확인하였다. 그 결과, FRhigh 세포는 나이브 세포와 비교하여 만능성 관련 유전자인 OCT4, SOX2 및 CXCR4와 HGF 수용체인 cMET 발현이 유의적으로 증가되어 있음을 확인하였고(도 5 및 도 6), MSC 생체 내 생착률 및 생존률과 혈관재생능력에 관련된 PDGF 수용체(PDGF-RA 및 PDGF-RB)와 VEGF 성장 인자 수용체(VEGFR1, VEGF-R2 및 ANGPT1)의 발현이 역시 유의적으로 증가되어 있음을 확인하였다(도 7).
구체적으로는, FRhigh와 나이브 세포를 비교하여, 다능성에 대한 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다. 유전자 ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, 및 OLR1에서는 유전자 발현량의 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나, 도 5에 나타난 바와 같이, OCT4 및 SOX2 유전자의 상대적인 발현량이 나이브 세포에 비해 FRhigh 세포에서 각각 4.3배 및 7.2배 높았음을 확인하였다. 또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 이동성에 대한 유전자의 상대적 발현량을 측정한 경우에, CXCR4가 나이브 세포에 비해 FRhigh 세포에서 10.2배 높았음을 확인하였다(표 2).
[표 2]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000010
한편, 도 6에 나타난 바와 같이, FRhigh와 나이브 세포를 비교하여, 성장 및 증식에 대한 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다. 유전자 ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, 및 OLR1에서는 유전자 발현량의 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나, cMET 유전자의 상대적인 발현량이 나이브 세포에 비해 FRhigh 세포에서 2.2배 높았음을 확인하였다(표 2).
더불어, 도 8에 나타난 바와 같이, MSC 줄기세포의 면역조절활성에 관련된 CSF-1(macrophagecolony stimulating factor-1) 및 대표적 항염증 유전자인 IDO2(indoleamine 2,3-dioxygeniase 2) 유전자 발현이 FRhigh 세포에서 유의적으로 증가되어 있음을 확인하였다(도 8 및 표 2 참고).
마찬가지로, FRhigh와 나이브 세포를 비교하여, 생착률, 생존률 및 혈관재생에 대한 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다. 유전자 ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, 및 OLR1에서는 유전자 발현량의 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나, 도 7 및 표 2에 나타난 바와 같이, PDGFRA, PDGFRB, VEGF-R1, 및 VEGF-R2 유전자의 상대적인 발현량이 나이브 세포에 비해 FRhigh 세포에서 각각 4.0배, 2.3배, 1.6배, 및 1.4배 높았음을 확인하였다.
또한, FRhigh와 나이브 세포를 비교하여, 면역 조절에 대한 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다. 유전자 ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, 및 OLR1에서는 유전자 발현량의 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나, CSF-1 유전자의 상대적인 발현량이 나이브 세포에 비해 FRhigh 세포에서 2배 높았음을 확인하였다.
또한, FRhigh와 나이브 세포를 비교하여, 항염증에 대한 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다. 유전자 ATF2, HEY1, FOSL1, FOSL2, FSHB, JUN, JUNB, JUND, GRB2, KITLG, MITF, 및 OLR1에서는 유전자 발현량의 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나, IDO2 유전자의 상대적인 발현량이 나이브 세포에 비해 FRhigh 세포에서 10배 높았음을 확인하였다.
ii) 배아 줄기세포(mESC)에서의 FreSH-트레이서 기반 분석
FreSH-트레이서의 FR에 의거하여 배아 줄기세포(mESC)를 분획하여 상기한 바와 마찬가지로 FRhigh와 FRlow 세포군 간의 유전자 차이를 분석하였다. FRhigh와 FRlow 세포를 비교하여, 만능성에 대한 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다. 하기 표 3 및 도 15에 나타난 바와 같이, Oct4, Nanog, Klf2, Klf4, Rex1, 및 Esrrb 유전자의 상대적인 발현량이 FRlow 세포에 비해 FRhigh 세포에서 각각 1.22배, 1.36배, 2.46배, 2.02배, 1.88배, 및 2.92배 높았음을 확인하였다. 또한, Sox2 및 cMyc 유전자의 상대적인 발현량은 FRhigh 세포에서 각각 0.98배 및 0.65배 낮음을 확인하였다.
한편, FRhigh와 FRlow 세포를 비교하여, 신경분화 촉진에 대한 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다. 하기 표 3 및 도 18에 나타난 바와 같이, Neurog1, Neurod1, Nkx2.2, Ascl2, Gfap, S100b, 및 Olig2 유전자의 상대적인 발현량이 FRlow 세포에 비해 FRhigh 세포에서 각각 7.56배, 2.16배, 1.09배, 2.91배, 10.42배, 1.48배, 및 2.71배 높았음을 확인하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000011
iii) 배아체(EB)에서의 FreSH-트레이서 기반 분석
FreSH-트레이서의 FR에 의거하여 배아체(EB)를 분획하여 상기한 바와 마찬가지로 FRhigh와 FRlow 세포군 간의 유전자 차이를 분석하였다. FRhigh와 FRlow 세포를 비교하여, 만능성에 대한 유전자의 상대적 발현량을 측정하였다. 도 16과 도 17에 나타난 바와 같이, Neurog2, Olig2, T, Nkx2.5, Oct4, Esrrbb, Klf2, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, 및 Runx1 유전자의 상대적인 발현량이 FRlow 세포에 비해 FRhigh 세포에서 비율을 확인하여 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000012
[표 5]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000013
상기한 바와 같은 유전자들에 대해서 RQ-PCR 분석 시, RQ-PCR 분석에 사용된 모든 프라이머는 Primer Express 3.0(Applied Biosystems)을 이용하여 디자인하였으며, 서열은 하기 표 6과 같다.
[표 6]
Figure PCTKR2018008239-appb-I000014
Figure PCTKR2018008239-appb-I000015
Figure PCTKR2018008239-appb-I000016
Figure PCTKR2018008239-appb-I000017
Figure PCTKR2018008239-appb-I000018
천식 마우스 모델에서 FRHigh 줄기세포의 치료 효과 입증
이러한 결과를 생체 내에서 확인하기 위해 바이러스 관련 천식의 마우스 모델에서 FRHigh 및 FRLow hES-MSC의 치료 효과를 비교하였다. 마우스를 감작시키고 오발부민과 폴리(I:C)로 자극한 다음, 꼬리 정맥을 통해 나이브한 hES-MSC 또는 분류된 FRHigh 및 FRLow hES-MSC를 각각 주사하였다(도 19). 조직 검사 결과, FRHigh 세포를 주입한 마우스의 폐에서 기관지 및 혈관주위 영역에서의 염증 반응이 나타나고, FRLow 또는 나이브한 세포를 주입한 마우스와 비교하여 현저하게 약화 되었음이 나타났다(도 20). FRHigh 세포를 주입한 마우스의 기관지 폐포 세척액에서의 염증 세포의 수는 FRLow 또는 나이브한 세포를 주입한 마우스에서보다 적었다(도 21). 유사하게, 종양 괴사 인자-α 및 인터루킨(IL)-17 수준은 낮았지만, IL-10 수준은 FRHigh 세포를 주입한 마우스의 기관지 폐포 세척액에서 더 높았다(도 222). 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 통해 FRHigh 세포를 주입한 마우스의 폐 조직에서 염증성 사이토카인의 mRNA 수준이 현저하게 감소된 것을 확인하였다(도 23). 또한, 인간 β2 마이크로글로불린 항체로 면역조직화학적 염색을 실시한 결과, FRHigh hES-MSC 주사된 마우스의 폐에서 이식된 세포가 현저하게 증가하였으며, 이는 항- 전구계면활성제 단백질 C(SFTPC) 항체로 염색하여 2형 폐포세포인 것을 확인하였다. 이러한 결과는 주입된 hES-MSCs가 폐포 상피로 분화되어, 조직 재생에 기여하였음을 나타낸다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에서 제공하는 줄기세포의 품질관리 방법은 줄기세포 특성에 따라 품질을 관리할 수 있도록 유전자적으로 특정한 비율을 고안하여 필요에 따른 줄기세포의 특징을 선별하여 관리할 수 있다.

Claims (90)

  1. 치료용 줄기세포에 있어서,
    상기 줄기세포는 ACAN, SOX9, AP2, RUNX2, OCN, ALP, OCT4, SOX2, CXCR4, cMET, PDGFRA, PDGFRB, VEGF-R1, VEGF-R2, CSF-1, IDO2, Sox2, Nanog, cMyc, Klf2, Klf4, Rex1, Esrrb, Neurog1, Neurod1, Nkx2.2, Ascl2, Gfap, S100b, Olig2, Neurog2, T, Nkx2.5, Esrrbb, Klf2, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, 및 Runx1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준이 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현 수준에 비해 높거나 낮은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC), 배아 줄기세포(ESC), 또는 배아체(EB)로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택되는, 치료용 줄기세포.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포가 중간엽 줄기세포(MSC)인 경우, AP2, 및 ALP로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 높은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양하는, 치료용 줄기세포.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포가 중간엽 줄기세포(MSC)인 경우, ACAN, SOX9, RUNX2, 및 OCN으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양하는, 치료용 줄기세포.
  7. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포가 중간엽 줄기세포(MSC)인 경우, OCT4, SOX2, CXCR4, cMET, PDGFRA, PDGFRB, VEGF-R1, VEGF-R2, CSF-1, 및 IDO2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  8. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포가 배아 줄기세포(ESC)인 경우, Oct4, Sox2, Nanog, Klf2, Rex1, 및 Esrrb로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 높은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  9. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포가 배아 줄기세포(ESC)인 경우, cMyc, Klf4, Neurog1, Neurod1, Nkx2.2, Ascl2, Gfap, S100b, 및 Olig2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  10. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 초기에 Oct4, Esrrbb, 및 Klf2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 높은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  11. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 초기에 Neurog2, Olig2, T, Nkx2.5, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, 및 Runx1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  12. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 1~6일차에서 T, 및 Oct4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 높은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  13. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 1~6일차에 Neurog2, Olig2, Nkx2.5, Esrrbb, Klf2, Klf4, cTnT, a-Actin, Mlc2v, 및 Runx1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  14. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 7~8일차에 cTnT, a-Actin, 및 Mlc2v로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 높은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  15. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포가 배아체(EB)인 경우, 배아체 배양 7~8일차에 Neurog2, Olig2, T, Nkx2.5, Oct4, Esrrbb, Klf2, Klf4, 및 Runx1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현수준은 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 발현수준에 비해 낮은 비율로 포함하는, 치료용 줄기세포.
  16. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 연골 분화시킨 경우에 ACAN이 GAPDH에 비해서 0.0009 내지 0.0012배인, 치료용 줄기세포.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양하는, 치료용 줄기세포.
  18. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 연골 분화시킨 경우에 SOX9이 GAPDH에 비해서 0.006 내지 0.0077배인, 치료용 줄기세포.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양하는, 치료용 줄기세포.
  20. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 지방 분화시킨 경우에 AP2가 GAPDH에 비해서 9.3 내지 11.4배인, 치료용 줄기세포.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양하는, 치료용 줄기세포.
  22. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 골 분화시킨 경우에 RUNX2가 GAPDH에 비해서 0.38 내지 0.48배인, 치료용 줄기세포.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양하는, 치료용 줄기세포.
  24. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 골 분화시킨 경우에 OCN이 GAPDH에 비해서 0.074 내지 0.092배인, 치료용 줄기세포.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양하는, 치료용 줄기세포.
  26. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, 골 분화시킨 경우에 ALP가 GAPDH에 비해서 27.6 내지 33.8배인, 치료용 줄기세포.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방 형성 유도 배지, 골 형성 유도 배지, 또는 연골 형성 유도 배지로 이루어진 군으로부터 어느 하나 선택된 배지에서 배양하는, 치료용 줄기세포.
  28. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, OCT4가 GAPDH에 비해서 0.0051 내지 0.0063배인 경우에 다능성(multipotent)이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  29. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, SOX2가 GAPDH에 비해서 0.0099 내지 0.0122배인 경우에 다능성(multipotent)이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  30. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, CXCR4가 GAPDH에 비해서 0.0062 내지 0.0077배인 경우에 이동성이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  31. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, cMET가 GAPDH에 비해서 0.063 내지 0.078배인 경우에 성장 및 증식이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  32. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, PDGFRA가 GAPDH에 비해서 0.31 내지 0.39배인 경우에 생착률, 생존률 및 혈관재생이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  33. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, PDGFRB가 GAPDH에 비해서 0.45 내지 0.56배인 경우에 생착률, 생존률 및 혈관재생이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  34. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, VEGF-R1가 GAPDH에 비해서 0.44 내지 0.55배인 경우에 생착률, 생존률 및 혈관재생이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  35. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, VEGF-R2가 GAPDH에 비해서 0.62 내지 0.77배인 경우에 생착률, 생존률 및 혈관재생이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  36. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, CSF-1이 GAPDH에 비해서 0.19 내지 0.24배인 경우에 면역조절 효과가 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  37. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)이고, IDO2가 GAPDH에 비해서 0.00131 내지 0.00160배인 경우에 항염증 효과가 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  38. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Oct4가 GAPDH에 비해서 21.4 내지 26.2배인 경우에 만능성(pluripotent)이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  39. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Sox2가 GAPDH에 비해서 3.3 내지 4.1배인 경우에 만능성이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  40. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Nanog가 GAPDH에 비해서 3.7 내지 4.6배인 경우에 만능성이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  41. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, cMyc가 GAPDH에 비해서 0.8 내지 1.1배인 경우에 만능성이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  42. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Klf2가 GAPDH에 비해서 10.6 내지 13.1배인 경우에 만능성이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  43. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Klf4가 GAPDH에 비해서 0.64 내지 0.79배인 경우에 만능성이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  44. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Rex1이 GAPDH에 비해서 8.5 내지 10.4배인 경우에 만능성이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  45. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Esrrb가 GAPDH에 비해서 2.4 내지 3.0배인 경우에 만능성이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  46. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Neurog1이 GAPDH에 비해서 0.49 내지 0.60배인 경우에 신경 분화가 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  47. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Neurod1이 GAPDH에 비해서 0.17 내지 0.22배인 경우에 신경 분화가 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  48. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Nkx2.2가 GAPDH에 비해서 0.00064 내지 0.00080배인 경우에 신경 분화가 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  49. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Ascl2가 GAPDH에 비해서 0.16 내지 0.21배인 경우에 신경 분화가 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  50. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Gfap가 GAPDH에 비해서 0.13 내지 0.17배인 경우에 신경 분화가 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  51. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, S100b가 GAPDH에 비해서 0.012 내지 0.016배인 경우에 신경 분화가 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  52. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포(ESC)이고, Olig2가 GAPDH에 비해서 0.025 내지 0.032배인 경우에 신경 분화가 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  53. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Neurog2가 GAPDH에 비해서 0.00008 내지 0.00010배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  54. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Olig2가 GAPDH에 비해서 0.0047 내지 0.0059배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  55. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 T가 GAPDH에 비해서 0.036 내지 0.045배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  56. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Nkx2.5가 GAPDH에 비해서 0.0043 내지 0.0053배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  57. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Oct4가 GAPDH에 비해서 17.84 내지 21.81배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  58. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Esrrbb가 GAPDH에 비해서 2.74 내지 3.36배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  59. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Klf2가 GAPDH에 비해서 10.10 내지 12.50배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  60. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Klf4가 GAPDH에 비해서 0.60 내지 0.73배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  61. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 cTnT가 GAPDH에 비해서 0.0009 내지 0.0011배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  62. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 a-Actin이 GAPDH에 비해서 0.36 내지 0.45배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  63. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Mlc2v가 GAPDH에 비해서 0.050 내지 0.062배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  64. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 초기에 Runx1가 GAPDH에 비해서 0.016 내지 0.021배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  65. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Neurog2가 GAPDH에 비해서 0.00030 내지 0.00042배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  66. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Olig2가 GAPDH에 비해서 0.00050 내지 0.00072배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  67. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 T가 GAPDH에 비해서 2.60 내지 3.19배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  68. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Nkx2.5가 GAPDH에 비해서 0.0070 내지 0.0090배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  69. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Oct4가 GAPDH에 비해서 1.20 내지 1.60배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  70. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Esrrbb가 GAPDH에 비해서 0.008 내지 0.011배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  71. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Klf2가 GAPDH에 비해서 0.16 내지 0.20배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  72. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Klf4가 GAPDH에 비해서 0.067 내지 0.083배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  73. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 cTnT가 GAPDH에 비해서 0.020 내지 0.025배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  74. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 a-Actin이 GAPDH에 비해서 0.15 내지 0.20배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  75. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Mlc2v가 GAPDH에 비해서 0.11 내지 0.14배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  76. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 1~6일차에 Runx1가 GAPDH에 비해서 0.089 내지 0.110배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  77. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Neurog2가 GAPDH에 비해서 0.00078 내지 0.0010배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  78. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Olig2가 GAPDH에 비해서 0.0068 내지 0.0084배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  79. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 T가 GAPDH에 비해서 0.051 내지 0.064배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  80. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Nkx2.5가 GAPDH에 비해서 0.086 내지 0.110배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  81. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Oct4가 GAPDH에 비해서 0.050 내지 0.061배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  82. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Esrrbb가 GAPDH에 비해서 0.012 내지 0.016배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  83. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Klf2가 GAPDH에 비해서 0.41 내지 0.52배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  84. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Klf4가 GAPDH에 비해서 0.071 내지 0.088배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  85. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 cTnT가 GAPDH에 비해서 2.10 내지 2.58배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  86. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 a-Actin이 GAPDH에 비해서 3.79 내지 4.65배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  87. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Mlc2v가 GAPDH에 비해서 10.70 내지 13.11배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  88. 제 2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아체(EB)를 구성하는 줄기세포이고, 배아체 배양 7~8일차에 Runx1가 GAPDH에 비해서 0.16 내지 0.21배인 경우에 만능성 및 분화능이 촉진되는, 치료용 줄기세포.
  89. 제 1항 내지 제 88항 중 어느 한 항에 따른 치료용 줄기세포 조성물을 유효성분으로 하는 천식 치료용 약학 조성물.
  90. 제 1항 내지 제 88항 중 어느 한 항에 따른 치료용 줄기세포 조성물을 유효성분으로 하는 알레르기성 천식용 약학 조성물.
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