JP2017513478A - 癌免疫療法のためのｂｃｍａ（ｃｄ２６９）特異的キメラ抗原受容体 - Google Patents

Abstract

本発明は、免疫細胞の特異性および反応性を、選択された膜抗原に再指向させることができる組換えキメラタンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、より具体的には、細胞外リガンド結合が、ＢＣＭＡ陽性細胞に対する特異免疫を付与するＢＣＭＡモノクローナル抗体由来のｓｃＦＶであるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。このようなＣＡＲを持つ人工免疫細胞は、リンパ腫、多発性骨髄腫および白血病を処置するのに特に適切である。

Description

発明の分野
本発明は、免疫細胞の特異性および反応性をＢＣＭＡ（ほとんどの骨髄細胞において見られ、患者における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を診断するために使用される細胞表面糖タンパク質）に再指向させることができる組換えキメラタンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞において発現される場合、ＢＣＭＡの抗原を有する悪性細胞を処置するために特に有用である。得られた人工免疫細胞は、悪性細胞に対する高レベルの特異性を示し、免疫療法の安全性および効率性を付与する。

本発明は、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）（ＣＡＲ、ＢＣＭＡ ＣＡＲまたは抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ）に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、および前記ＣＡＲを含む免疫細胞（好ましくは、Ｔ細胞、より好ましくはＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞）であって、ＴＣＲの発現が阻害されており、および／または少なくとも１つの薬物に対して耐性であり、さらにより好ましくは自殺遺伝子をさらに含む免疫細胞を提供する。本発明はまた、前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物、ならびに前記ＣＡＲおよび前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の作製および使用する方法を提供する。本発明は、医薬としての前記ＣＡＲ、被験体におけるＢＣＭＡ発現に関連する病的症状（例えば、癌）を処置するための方法を提供する。

発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的Ｔ細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫療法のために使用されるＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の増大または遺伝子操作を通したＴ細胞の再指向のいずれかによって生成され得る（Ｐａｒｋ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）。ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の移入は、移植に関連するウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。

Ｔ細胞における新規特異性は、トランスジェニックＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ＣＡＲは、単一の融合分子として１つ以上のシグナリングドメインと会合したターゲティング部分からなる合成受容体である。一般に、ＣＡＲの結合部分は、フレキシブルリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドのドメインに基づく結合部分も、成功裡に使用されている。第１世代ＣＡＲのためのシグナリングドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖またはＦｃ受容体ガンマ鎖の細胞質領域に由来する。第１世代ＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞傷害性の再指向に成功したことが示された。しかしながら、それらは、より長期間の増大および抗腫瘍活性をインビボで提供することはできなかった。共刺激分子由来のシグナリングドメインならびに膜貫通ドメインおよびヒンジドメインを付加して第２世代および第３世代のＣＡＲを形成することにより、ヒトにおける治療臨床試験はある程度成功し、ＣＤ１９を発現する悪性細胞にＴ細胞を再指向することができた（Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかしながら、ＣＤ１９ ＳｃＦｖに関して使用したシグナリングドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインの特定の組み合わせはむしろ抗原特異的であり、いかなる抗原マーカーも増大させることができなかった。

多発性骨髄腫は、クローン性形質細胞の蓄積を特徴とする悪性腫瘍である。多発性骨髄腫の現在の治療は緩和をもたらすことが多いが、最終的には、ほぼすべての患者が再発および死亡する（Ｌｉｏｎａｌ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．２０１１）。同種造血幹細胞移植の状況において、骨髄腫細胞が免疫によって除去されることの実質的な証拠がある；しかしながら、このアプローチの毒性は高く、ほとんどの患者が治癒しない。いくつかのモノクローナル抗体は、前臨床試験および早期臨床試験において、多発性骨髄腫の処置に有望であることが示されているが、多発性骨髄腫のいかなるモノクローナル抗体療法も一貫して臨床効果が示されていない（Ｖａｎ Ｄｅ Ｄｏｎｋ，Ｎ．Ｗ．Ｃ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２）。また、いくつかのモノクローナル抗体は、高サイトカイン血症（活性化免疫細胞からの大量のサイトカイン放出による周知の毒性）などの副作用を誘発する。これは、ＣＡＲを発現する免疫細胞を用いた治療中に観察され得る。

多発性骨髄腫のための新たな免疫療法に対する強い需要が明らかに存在し、この疾患のための有効かつ安全な抗原特異的養子Ｔ細胞療法の開発は大きな進歩であろう。

特に、このような疾患のための有効な抗原特異的養子Ｔ細胞療法であって、高サイトカイン血症を全くまたはあまり誘発しないものの開発が関心対象であろう。

多発性骨髄腫のための免疫療法の１つの候補抗原は、ＣＤ２６９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／Ｕｎｉｐｒｏｔ参照Ｑ０２２２３）とも称されるＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である。この抗原は、遺伝子ＴＮＦＲＳＦ１７によってコードされる。数人の研究者によって、多発性骨髄腫細胞では、ＢＣＭＡ ＲＮＡが一般に検出され、多発性骨髄腫を有する患者由来の形質細胞の表面上では、ＢＣＭＡタンパク質が検出された（Ｎｏｖａｋ Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＢＣＭＡは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合する。非悪性細胞では、ＢＣＭＡは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によってではなく形質細胞および一部の成熟Ｂ細胞によって主に発現されることが報告されている。したがって、それは、特にＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用して多発性骨髄腫を処置するための適切な標的抗原に相当する。

以前の戦略の代替案として、国際公開第２０１３／１５４７６０号では、Ｃ１１Ｄ５．３およびＣ１２Ａ３．２由来のＢＣＭＡ ＣＡＲが提案された。

改良された戦略として、本発明は、免疫細胞において発現されてＢＣＭＡ悪性細胞をターゲティングし得るＢＣＭＡ特異的ＣＡＲであって、有意な臨床的利点を有するＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。特に、本発明は、免疫細胞の表面において発現され得るＢＣＭＡ特異的ＣＡＲであって、ＢＣＭＡに結合し、ＢＣＭＡ発現細胞に対する（特に、ＢＣＭＡ発現癌細胞に対する）活性を示し、好ましくは、前記活性が、標的ＢＣＭＡ発現癌細胞に対する細胞溶解活性、より好ましくは、標的ＢＣＭＡ発現癌細胞および中（５０％減少）〜低（７０％以上減少）発現のサイトカインに対する細胞溶解活性であるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

宿主によって十分に寛容されるＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞であって、薬物の存在下で生存し、特に、癌の処置に使用される薬物（特に、細胞生存に影響を与える細胞傷害性化学療法剤（抗癌化学療法））の存在下で、ＢＣＭＡ発現細胞を選択的にターゲティングする能力を有するＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を提供する必要がある。

癌細胞、特にＢＣＭＡ発現癌細胞を殺傷するために、代謝拮抗物質、アルキル化剤、アントラサイクリン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、白金化合物および紡錘体毒などのいくつかの細胞傷害性剤が開発されている。

これらの化学療法剤は、それらの非特異的毒性のために、強固な抗腫瘍免疫担当細胞の樹立に有害であり得る。細胞増殖経路をターゲティングする小分子ベースの治療もまた、抗腫瘍免疫の樹立を妨げ得る。

したがって、ＢＣＭＡをターゲティングする十分に寛容されるＴ細胞であって、特異的であり、薬物（特に、細胞増殖に影響を与えるものなどの抗癌化学療法）の使用に適合するＴ細胞の開発も必要である。

国際公開第２０１３／１５４７６０号

Ｐａｒｋ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｌｉｏｎａｌ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｖａｎ Ｄｅ Ｄｏｎｋ，Ｎ．Ｗ．Ｃ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｎｏｖａｋ Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２００４

したがって、化学療法と組み合わせて「既製の」同種治療用細胞を使用するために、本発明者らは、低同種性のＢＣＭＡ発現ＣＡＲ Ｔ細胞（特に、低同種性かつ化学療法剤耐性の細胞であって、自殺遺伝子により場合により破壊され得る細胞）を操作する方法を開発する。

この戦略によってもたらされる治療上の利点は、化学療法と免疫療法との間の相乗効果によって増強されるはずである。また、薬剤耐性もまた、人工Ｔ細胞療法を選択的に増大する能力から利益を受け、これらの細胞への非効率的な遺伝子導入に起因する問題を回避し得る。

発明の概要
本発明者らは、異なる構造を有するＢＣＭＡ特異的ＣＡＲであって、異なるＢＣＭＡ特異的抗体由来の異なるｓｃＦＶを含むＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを作製した。

本発明は、Ｖ１〜Ｖ６から選択されるポリペプチド構造の１つと少なくとも８０％の同一性を有し、好ましくはＶ１、Ｖ３またはＶ５から選択されるポリペプチド構造を有するＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、
（ａ）モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８αヒンジおよびＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、
（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびに
（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含むＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

好ましい実施形態では、本発明は、Ｖ１、Ｖ３またはＶ５から選択されるポリペプチド構造の１つと少なくとも８０％の同一性を有するＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、
（ａ）モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８αヒンジおよびＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、
（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびに
（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含むＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

一実施形態では、本発明は、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメインを含む前記ポリペプチド構造が、以下のＣＤＲ配列：ＤＹＹＩＮ（配列番号：６１）、ＷＩＹＦＡＳＧＮＳＥＹＮＱＫＦＴＧ（配列番号：６２）およびＬＹＤＹＤＷＹＦＤＶ（配列番号：６３）、
ならびにＫＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号：６４）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号：６５）およびＡＥＴＳＨＶＰＷＴ（配列番号：６６）またはＳＱＳＳＩＹＰＷＴ（配列番号：６７）、
ＦｃγＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、好ましくはＣＤ８αヒンジまたはＩｇＧ１ヒンジ、ＣＤ８α由来の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む上記に記載のＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

本発明は、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む前記細胞外リガンド結合ドメインが、以下の配列：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＹＹＩＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＷＩＹＦＡＳＧＮＳＥＹＮＱＫＦＴＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＬＹＤＹＤＷＹＦＤＶＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号：６８）および／またはＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫＶＳＮＲＦＳＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＳＱＳＳＩＹＰＷＴＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号：６９）
（式中、Ｘは、アミノ酸である）を含む上記に記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

本発明は、前記ＶＨおよびＶＬが、配列番号：１１〜１４から選択されるポリペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する上記に記載のＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨを含む前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号：１１および配列番号：１３と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択され、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来の前記ＶＬが、配列番号：１２および配列番号：１４と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択される上記に記載のＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

本発明は、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む前記細胞外リガンド結合ドメインがヒト化されている上記に記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一実施形態では、本発明は、前記構造Ｖ１が、ＦｃγＲＩＩＩαヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、前記ＦｃγＲＩＩＩαヒンジが、配列番号：３と少なくとも８０％の同一性を有する上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、配列番号：１９または配列番号：２５と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む上記いずれか１つに記載の構造Ｖ１のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、前記構造Ｖ３が、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、前記ＣＤ８αヒンジが、配列番号：４と少なくとも８０％の同一性を有する適切な上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、配列番号：２１または配列番号：２７と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む適切な上記いずれか１つに記載の構造Ｖ３のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

一実施形態では、本発明は、前記構造Ｖ５が、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む適切な上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、前記ＩｇＧ１ヒンジが、配列番号：５と少なくとも８０％の同一性を有する適切な上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、配列番号：２３または配列番号：３５と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む適切な上記いずれか１つに記載の構造Ｖ５のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインが、配列番号：８と少なくとも８０％の同一性を有する上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、前記ＣＤ３ゼータシグナリングドメインが、配列番号：９と少なくとも８０％の同一性を有する上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、前記ＣＤ８α膜貫通ドメインが、配列番号：６と少なくとも８０％の同一性を有する上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、シグナルペプチドをさらに含む上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、前記シグナルペプチドが、配列番号：１または配列番号：２と少なくとも８０％の配列同一性を有する上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、ＢＣＭＡに特異的ではない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

本発明は、ヒト化されている上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを提供する。

一態様では、本発明は、上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。

一態様では、本発明は、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

別の態様では、本発明は、細胞表面膜において、上記に記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現する人工免疫細胞を提供する。

本発明は、少なくとも１つのＭＨＣタンパク質、好ましくはＭＨＣ関連β２ｍタンパク質の発現が抑制されている上記に記載の人工免疫細胞を提供する。

本発明は、少なくとも１つの免疫抑制薬または少なくとも１つの化学療法薬に対して耐性を有するように改変されており、好ましくは、少なくとも１つの免疫抑制薬または化学療法薬に対して耐性を有するように改変されており、自殺遺伝子をさらに含む上記いずれか１つに記載の人工免疫細胞を提供する。

本発明は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来する上記いずれか１つに記載の人工免疫細胞を提供する。

本発明は、ＴＣＲ ＫＯ人工免疫Ｔ細胞である上記いずれか１つに記載の人工免疫細胞を提供する。

本発明は、少なくとも１つの（ａｔ ｏｎｅ）抗癌または抗炎症性疾患化学療法に対してさらに耐性である上記に記載の人工免疫細胞を提供する。

好ましい実施形態は、上記に記載の前記人工免疫細胞は、多発性骨髄腫または炎症性疾患に対して使用される少なくとも１つの薬物（化学療法）に対してさらに耐性である。

別の態様では、本発明は、治療用の上記に記載の人工免疫細胞を提供する。
本発明は、病的症状の処置のための、上記に記載の治療用人工免疫細胞であって、前記病的症状が、ＢＣＭＡ発現細胞に関係する前悪性または悪性癌症状である、治療用人工免疫細胞を提供する。

本発明は、該病的症状が、ＢＣＭＡ発現細胞の過剰を特徴とする症状である上記に記載の治療用人工免疫細胞を提供する。

本発明は、該病的症状が血液癌症状である上記いずれか１つに記載の治療用人工免疫細胞を提供する。

本発明は、該血液癌症状が白血病である上記に記載の治療用人工免疫細胞を提供する。
本発明は、該血液癌症状が多発性骨髄腫（ＭＭ）である上記実施形態に記載の治療用人工免疫細胞を提供する。

本発明は、前記血液癌が悪性リンパ増殖性障害である上記に記載の治療用人工細胞を提供する。

本発明は、前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および骨髄異形成症候群からなる群より選択される上記に記載の治療用人工細胞を提供する。

本発明は、血液癌細胞を傷害する方法であって、前記細胞を、有効量の上記に記載の人工細胞と接触させて、前記癌細胞の傷害を引き起こすことを含む方法を提供する。

本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞、場合により、少なくとも１つの抗癌化学療法に対してさらに耐性のＴＣＲ ＫＯ免疫細胞を提供すること、
（ｂ）前記細胞の表面において、少なくとも１つの上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現させること
を含む方法を提供する。

本発明は、
（ａ）免疫細胞、場合により、少なくとも１つの抗癌化学療法に対してさらに耐性のＴＣＲ ＫＯ免疫細胞を提供すること、
（ｂ）前記ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む上記に記載の免疫細胞操作方法を提供する。

本発明は、
（ａ）免疫細胞、場合により、少なくとも１つの抗癌化学療法に対してさらに耐性のＴＣＲ ＫＯ免疫細胞を提供すること、
（ｂ）前記ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること、
（ｃ）ＢＣＭＡに特異的ではない少なくとも１つの他のキメラ抗原受容体を導入すること
を含む上記に記載の免疫細胞操作方法を提供する。

本発明は、それを必要とする被験体を処置する方法であって、
（ａ）表面において、上記に記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞；場合により、少なくとも１つの抗癌化学療法に対してさらに耐性のＴＣＲ ＫＯ免疫細胞を提供すること、
（ｂ）前記免疫細胞を前記患者に投与すること
を含む方法を提供する。

本発明は、前記免疫細胞が、ドナーから提供されるものである上記に記載の方法を提供する。

本発明は、前記免疫細胞が、患者自身から提供されるものである上記に記載の方法を提供する。

本発明の好ましいＣＡＲポリペプチドは、配列番号：１９〜４２から選択されるアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、本発明は、ＢＣＭＡ発現細胞媒介性疾患、特にＢＣＭＡ発現細胞媒介性血液癌の処置に使用するための組成物であって、本発明の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む組成物を提供し、好ましくは、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号：５０または配列番号：５６である。

一実施形態では、本発明は、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７および配列番号：２９、好ましくは配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２７、配列番号：２９、より好ましくは配列番号：２１または配列番号：２７から選択されるアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ ＣＡＲを提供する。

本発明のより好ましいＣＡＲは、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明のさらにより好ましいＣＡＲは、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２７、配列番号：２９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、さらにより好ましくは配列番号：２１または配列番号：２７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、本発明の好ましいＣＡＲは、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６および配列番号：５８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のより好ましいＣＡＲは、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５６および配列番号：５８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６および配列番号：５８から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のより好ましいＣＡＲは、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５６および配列番号：５８から選択されるアミノ酸配列を含む。

他の実施形態では、本発明は、ＢＣＭＡ発現細胞媒介性疾患、特にＢＣＭＡ発現細胞媒介性血液癌の処置に使用するための組成物であって、下記のような本発明の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む組成物を提供する。

（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズおよび組換えＩＬ２による）インビトロでの非特異的活性化の後、ドナー由来のＴ細胞を、ウイルス形質導入を使用して、これらのＣＡＲを発現するポリヌクレオチドで形質転換した。特定の場合では、Ｔ細胞をさらに操作して、より具体的には、対宿主移植片反応を防止するためにＴＣＲ（αβ−Ｔ細胞受容体）の成分を破壊することによって、非同種反応性Ｔ細胞を作った。好ましい実施形態では、ＴＣＲ（αβ−Ｔ細胞受容体）の破壊によって、および少なくとも１つの遺伝子の改変によってＴ細胞をさらに操作して、少なくとも１つの薬物（例えば、癌に対して使用される薬物）に対する耐性を前記人工Ｔ細胞に付与した。

ＢＣＭＡをターゲティングする本発明のＣＡＲ発現免疫Ｔ細胞は、抗癌処置として通常使用される処置のように、細胞傷害性化学療法剤と組み合わせて使用され得る。得られた人工Ｔ細胞は、様々な程度に、ＢＣＭＡ陽性細胞に対してインビトロで反応性を示したが、これは、本発明のＣＡＲが、Ｔ細胞の抗原依存的な活性化およびさらに増殖に寄与し、免疫療法に有用であることを示している。

加えて、得られた人工Ｔ細胞は、特定の特別な条件下で、Ｃ１１Ｄ５．３由来のＢＣＭＡ ＣＡＲを発現する人工Ｔ細胞と比較して増加したインビトロ選択性および増加した細胞溶解活性を示す。

本発明のＣＡＲをコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、本明細書に詳述されている。

本発明の人工免疫細胞は、多発性骨髄腫の処置などの治療用途に特に有用である。

本発明の人工免疫細胞の概略図。この図に示されている人工免疫細胞は、ＣＡＲをコードするレトロウイルスポリペプチドで形質導入したＴ細胞である。このＴ細胞は、患者へのより良好かつより安全な移植を可能にするようにさらに操作されているが、本発明の枠組みの中では、これは場合によりある。Ｘ遺伝子は、例えば、ＴＣＲの成分（ＴＣＲαまたはＴＣＲβ）を発現する遺伝子であり得、Ｙは、ＣＤ５２（キャンパスに関して）またはＨＰＲＴ（６−チオグアニンに関して）のような免疫抑制薬に対するＴ細胞の感受性に関与する遺伝子であり得る。 異なるＣＡＲアーキテクチャ（Ｖ１〜Ｖ６）の概略図。 ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ発現細胞（ＲＰＭＩ８２２６またはＨ９２９）と共に、またはＢＣＭＡ非発現細胞（Ｋ５６２）と共に６時間共培養した場合の、４つの異なるｓｃＦｖ由来のＣＡＲの脱顆粒活性。ＢＣ３０およびＢＣ５０ ｓｃＦｖについては、３つの異なるアーキテクチャを試験し（ｖ１、ｖ３およびｖ５）、２つの他のｓｃＦｖ Ｃ１１Ｄ５．３およびＣ１３Ｆ１２．１については、２つのみを試験した（ｖ３およびｖ５）。 ＢＣＭＡｎｅｇ細胞（Ｋ５６２）またはＢＣＭＡ発現細胞（ＲＰＭＩ８２２６およびＮＣＩ−Ｈ９２９）と共に６時間共培養した後の、ＣＡＲ Ｔ細胞の脱顆粒活性（ＣＤ１０７ａ＋細胞）。ＣＡＲ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションの２４時間後に、共培養を開始した。ＢＣ３０およびＢＣ５０ ｓｃＦｖについて、３つの異なるアーキテクチャを試験した（ｖ１、ｖ３およびｖ５）。結果は、３回の独立した実験の平均値を表す。 ＢＣＭＡ発現細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９またはＲＰＭＩ８２２６）と共に、またはＢＣＭＡ非発現細胞（Ｋ５６２）と共に２４時間共培養した場合の、Ｔ細胞によって放出されたＩＦＮガンマ。共培養と同じ条件において単独で培養したＴ細胞からのＩＦＮガンマ放出も示されている。ＢＣ３０およびＢＣ５０ ｓｃＦｖについて、３つの異なるアーキテクチャを試験した（ｖ１、ｖ３およびｖ５）。３つの別個のドナーについて、実験を行った。 ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異的細胞溶解活性。ＢＣ３０およびＢＣ５０ ｓｃＦｖについて、３つの異なるアーキテクチャを試験した（ｖ１、ｖ３およびｖ５）。ＣＡＲ ｍＲＮＡのトランスフェクションの４８時間後に、アッセイを行った。Ｔ細胞を、Ｋ５６２＋ＲＰＭＩ８２２６またはＫ５６２＋ＮＣＩＨ９２９細胞と共に４時間共培養した。共培養の終了時に、各細胞株の細胞生存率を決定し、特異的細胞溶解率を計算した。

発明の詳細な説明
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語はすべて、遺伝子治療、生化学、遺伝学および分子生物学の領域の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。

適切な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されるものに類似しているかまたは等価であるすべての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はすべて、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。

本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を利用するであろう。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ，２０００，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎ Ｉｎｃ，Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，ＵＳＡ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｍ．Ｓｉｍｏｎ，ｅｄｓ．−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）ａｎｄ Ｖｏｌ．１８５，“Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；およびＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと。

ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体
本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の新たな設計に関する。

本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。好ましい実施形態では、前記細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって連結された標的抗原特異的モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体の軽（Ｖ_Ｌ）および重（Ｖ_Ｈ）可変断片を含む一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。前記Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、好ましくは、表２に示されているＢＣＭＡ−５０、ＢＣＭＡ−３０、Ｃ１１Ｄ５．３およびＣ１３Ｆ１２．１と称される抗体から選択される。それらは、好ましくは、例えば、配列番号：１０の配列を含むフレキシブルリンカーによって互いに連結される。

より好ましい実施形態では、前記Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、好ましくは、表２に示されているＢＣＭＡ−５０（ＢＣ５０）およびＢＣＭＡ−３０（ＢＣ３０）と称される抗体から選択される。

いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって連結されたＢＣＭＡ特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域を含むｓｃＦｖを含む。一本鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを使用して、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を連結することによって作製される（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８）。

一般に、本発明のリンカーは短いフレキシブルポリペプチドであり、好ましくは、少なくとも２０個以下のアミノ酸残基を含む。次に、さらなる機能のために、本発明のリンカーを改変し得る（例えば、薬物の付着、または固体支持体への付着）。

連結ペプチドの例は、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号：１０）（これは、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間の約３．５ｎｍを架橋する）を有するＧＳリンカーである。他の配列のリンカーが設計および使用されている（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８、前掲）。

一本鎖変異体は、組換えまたは合成のいずれかによって生産され得る。ｓｃＦｖの合成生産では、自動合成装置が使用され得る。ｓｃＦｖの組換え生産では、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドが、適切な宿主細胞、すなわち酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物などの真核生物の細胞、または大腸菌などの原核生物に導入され得る。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、通常の操作、例えばポリヌクレオチドのライゲーションによって作製され得る。得られたｓｃＦｖは、当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を使用して単離され得る。

換言すれば、前記ＣＡＲは、配列番号：１１〜配列番号：１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の同一性を示すポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを優先的に含む。より好ましい実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を示すポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。

本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すれば、シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指令するタンパク質の部分を指す。

ＣＡＲにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の任意の誘導体または変異体および任意の合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナリング配列の２つの別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）を含む。一次細胞質シグナリング配列は、ＩＴＡＭの免疫受容活性化チロシンモチーフとして公知であるシグナリングモチーフを含み得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるＩＴＡＭの例としては、非限定的な例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられ得る。好ましい実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、（配列番号：９）からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含み得る。

特定の実施形態では、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとしては、限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドが挙げられ得る。共刺激リガンドはまた、とりわけ、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどの、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を包含する。

「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、これに限定されないが、増殖などの、細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびトールリガンド受容体が挙げられる。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。

好ましい実施形態では、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）の断片からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。特に、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、配列番号：８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。

本発明のＣＡＲは、細胞の表面膜上に発現される。したがって、このようなＣＡＲは、膜貫通ドメインをさらに含む。適切な膜貫通ドメインの特徴的な特徴は、細胞、本発明において好ましくは免疫細胞、特にリンパ球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面において発現され、予め定義された標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指令するために共に相互作用する能力を含む。膜貫通ドメインは、天然起源に由来し得るか、または合成起源に由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γ、もしくはδなどのＴ細胞受容体のサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ２受容体のｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）、もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体ＩＩＩのサブユニット鎖またはＣＤタンパク質であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。好ましい実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８アルファ鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。膜貫通ドメインは、前記細胞外リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域をさらに含み得る。本明細書で使用される「ヒンジ領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するよう機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインのために、より高い柔軟性および接近可能性を提供するために使用される。ヒンジ領域は、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、ＣＤ８、ＣＤ４またはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部などの、天然に存在する分子の全部または一部に由来し得る。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に相当する合成配列であり得るし、または完全に合成のヒンジ配列であり得る。好ましい実施形態では、前記ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８アルファ鎖、ＦｃγＲＩＩＩα受容体もしくはＩｇＧ１（本明細書では、それぞれ配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５と称される）の一部、またはこれらのポリペプチドと好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を示すヒンジポリペプチドを含む。

本発明のｃａｒは、一般に、ＣＤ８αおよび４−１ＢＢからより具体的に選択される膜貫通ドメイン（ＴＭ）であって、配列番号：６または７のポリペプチド、好ましくは配列番号：６のポリペプチドと同一性を示す膜貫通ドメイン（ＴＭ）をさらに含む。

本発明のｃａｒは、一般に、ＣＤ８αからより具体的に選択される膜貫通ドメイン（ＴＭ）であって、配列番号：６のポリペプチドと同一性を示す膜貫通ドメイン（ＴＭ）をさらに含む。

好ましい実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＤ８α由来のＴＭドメインであって、配列番号：６を有し、または配列番号：６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を示すＣＤ８α由来のＴＭドメインをさらに含む。

標的抗原のダウンレギュレーションまたは突然変異は、癌細胞において一般に観察され、抗原損失エスケープ変異体を作出する。したがって、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にするため、本発明のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それにより、免疫細胞の活性化および機能を強化するための、他の細胞外リガンド結合ドメインを含み得る。一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、同一の膜貫通ポリペプチド上にタンデムに置かれてもよく、場合により、リンカーによって隔てられていてもよい。別の実施形態では、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＡＲを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に置かれてもよい。別の実施形態では、本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を提供すること、および前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を発現させることを含む方法に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を提供すること、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含む方法に関する。ＣＡＲの集団は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のＣＡＲを意味する。本発明の異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それにより、免疫細胞の活性化および機能を強化し得る。本発明はまた、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を含む単離された免疫細胞に関する。

本発明は、図２に示されているＶ１〜Ｖ６から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ＦｃＲＩＩＩアルファ（α）ヒンジ、ＣＤ８αヒンジおよびＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

本発明は、図２に示されているＶ１、Ｖ３およびＶ５から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８アルファ（α）ヒンジおよびＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

特に、本発明は、図２に示されているＶ１、Ｖ３およびＶ５から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬ由来の細胞外リガンド結合ドメイン、ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８アルファ（α）ヒンジおよびＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、より具体的には、本発明は、図２に示されているＶ１、Ｖ３およびＶ５から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、ＢＣ５０およびＢＣ３０から選択されるモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬ由来の細胞外リガンド結合ドメイン、ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８アルファ（α）ヒンジおよびＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

好ましい実施形態では、本発明は、図２に示されているＶ１、Ｖ３およびＶ５から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、配列番号：１１および配列番号：１３から選択される配列を有するＶＨと、配列番号：１２および配列番号：１４から選択される配列を有するモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＬとに由来する細胞外リガンド結合ドメイン、ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８アルファ（α）ヒンジおよびＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

好ましい実施形態では、本発明は、図２に示されているポリペプチド構造Ｖ５の１つを有するＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、配列番号：１１および配列番号：１３から選択される配列を有するＶＨと、配列番号：１２および配列番号：１４から選択される配列を有するモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＬとに由来する細胞外リガンド結合ドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、図２に示されているポリペプチド構造Ｖ１の１つを有するＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、配列番号：１１および配列番号：１３から選択される配列を有するＶＨと、配列番号：１２および配列番号：１４から選択される配列を有するモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＬとに由来する細胞外リガンド結合ドメイン、ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

より好ましい実施形態では、本発明は、図２に示されているポリペプチド構造Ｖ３の１つを有するＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、配列番号：１１および配列番号：１３から選択される配列を有するＶＨと、配列番号：１２および配列番号：１４から選択される配列を有するモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＬとに由来する細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＤ８アルファ（α）ヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

一実施形態では、本発明は、以下のポリペプチドの１つを含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する：

より好ましい実施形態では、本発明の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ヒト化されている上記配列の１つを含む。

本明細書で使用される場合、「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」または「保存的配列改変」または「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」という用語は、（元の抗ＢＣＭＡ抗体または抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを使用して構築されたＣＡＲの特徴と比較して）ＣＡＲの特徴に有意に影響を与えず、もしくはＣＡＲの特徴を有意に変化させず、ならびに／または改変アミノ酸配列を含有するＣＡＲの活性に有意に影響を与えず、および可能なヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を低減もしくは抑制しないアミノ酸改変を指す。

本発明のヒト化ＣＡＲは、初代Ｔ細胞との関連で発現された場合、ＣＡＲに対する免疫応答（特に、ＨＡＭＡ）を誘導しない。このような保存的改変は、前記ＣＡＲの前記抗体断片および／または前記ＣＡＲ分子の他の部分のいずれかにおけるアミノ酸の置換、付加および欠失を含む。改変は、当技術分野で公知の標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介突然変異誘発によって、または最適化生殖細胞系列配列を用いることによって、抗体に、抗体断片に、または本発明のＣＡＲ分子の他の部分のいずれかに導入され得る。したがって、本発明は、（ヒト化）ＢＣＭＡ ＣＡＲであって、ＶＨが、配列番号：１１または配列番号：１３と少なくとも８０％の同一性を有し、ＶＬが、配列番号：１２または配列番号：１４と少なくとも８０％の同一性を有する（ヒト化）ＢＣＭＡ ＣＡＲを提供する。

保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基が置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、本発明のＣＡＲ内の１つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換することができ、本明細書に記載される機能アッセイを使用して、ＢＣＭＡ結合能力について、改変ＣＡＲを試験することができる。

一実施形態では、本発明は、
−配列番号：１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のシグナルペプチド；好ましくは、任意のシグナルペプチドは、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドが存在する。
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）；好ましくは、前記リンカーは、配列番号：１０のポリペプチドである。
−配列番号：３のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＦｃガンマ（γ）ＲＩＩＩアルファ（α）由来のヒンジ；
−配列番号：６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ８アルファ（α）由来の膜貫通ドメイン；
−配列番号：８のアミノ酸と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子；
−配列番号：９のアミノ酸と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一実施形態では、本発明は、
−配列番号：１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のシグナルペプチド；好ましくは、任意のシグナルペプチドは、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドが存在する。
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）；好ましくは、前記リンカーは、配列番号：１０のポリペプチドである。
−配列番号：３のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％；９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＦｃガンマ（γ）ＲＩＩＩアルファ（α）由来のヒンジ；
−配列番号：７のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の膜貫通ドメイン（ＴＭ）；
−配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子；
−配列番号：９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一実施形態では、本発明は、
−配列番号：１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のシグナルペプチド；好ましくは、任意のシグナルペプチドは、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドが存在する。
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）；好ましくは、前記リンカーは、配列番号：１０のポリペプチドである。
−配列番号：４のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＣＤ８アルファ鎖由来のヒンジ；
−配列番号：６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ８アルファ（α）由来の膜貫通ドメイン；
−配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子；
−配列番号：９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一実施形態では、本発明は、
−配列番号：１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のシグナルペプチド；好ましくは、任意のシグナルペプチドは、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドが存在する。
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）；好ましくは、前記リンカーは、配列番号：１０のポリペプチドである。
−配列番号：４のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＣＤ８アルファ鎖由来のヒンジ；
−配列番号：７のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の膜貫通ドメイン（ＴＭ）；
−配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子；
−配列番号：９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一実施形態では、本発明は、
−配列番号：１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のシグナルペプチド；好ましくは、任意のシグナルペプチドは、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドが存在する。
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）；好ましくは、前記リンカーは、配列番号：１０のポリペプチドである。
−配列番号：５のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ１由来のヒンジ；
−配列番号：６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ８アルファ（α）由来の膜貫通ドメイン；
−配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子；
−配列番号：９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一実施形態では、本発明は、
−配列番号：１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のシグナルペプチド；好ましくは、任意のシグナルペプチドは、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドが存在する。
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）；好ましくは、前記リンカーは、配列番号：１０のポリペプチドである。
−配列番号：５のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ１由来のヒンジ；
−配列番号：７のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の膜貫通ドメイン（ＴＭ）；
−配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子；
−配列番号：９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

好ましい実施形態では、本発明は、
−配列番号：１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のシグナルペプチド；好ましくは、任意のシグナルペプチドは、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドが存在する。
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）；好ましくは、前記リンカーは、配列番号：１０のポリペプチドである。
−配列番号：３のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＦｃガンマ（γ）ＲＩＩＩアルファ（α）由来のヒンジ；
−配列番号：６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ８アルファ（α）由来の膜貫通ドメイン；
−配列番号：８のアミノ酸と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子；
−配列番号：９のアミノ酸と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

より好ましい実施形態では、本発明は、
−配列番号：１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のシグナルペプチド；好ましくは、任意のシグナルペプチドは、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドが存在する。
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）；好ましくは、前記リンカーは、配列番号：１０のポリペプチドである。
−配列番号：５のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＩｇＧ１由来のヒンジ；
−配列番号：６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ８アルファ（α）由来の膜貫通ドメイン；
−配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子；
−配列番号：９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

さらにより好ましい実施形態では、本発明は、
−配列番号：１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のシグナルペプチド；好ましくは、任意のシグナルペプチドは、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドが存在する。
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）；好ましくは、前記リンカーは、配列番号：１０のポリペプチドである。
−配列番号：４のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＣＤ８アルファ鎖由来のヒンジ；
−配列番号：６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ８アルファ（□）由来の膜貫通ドメイン；
−配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子；
−配列番号：９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

特に、本発明は、
−配列番号：１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のシグナルペプチド；好ましくは、任意のシグナルペプチドは、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドが存在する。
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン、好ましくは、前記リンカーは、配列番号：１０のポリペプチドであり、前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する；前記ＶＨは、配列番号：１１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記ＶＬは、配列番号：１２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
−配列番号：４のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＣＤ８アルファ鎖由来のヒンジ；
−配列番号：６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ８アルファ（α）由来の膜貫通ドメイン；
−配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子；
−配列番号：９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

特に、本発明は、
−配列番号：１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のシグナルペプチド；好ましくは、任意のシグナルペプチドは、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドが存在する。
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン、好ましくは、前記リンカーは、配列番号：１０のポリペプチドであり、前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する；前記ＶＨは、配列番号：１３のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記ＶＬは、配列番号：１４のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
−配列番号：４のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＣＤ８アルファ鎖由来のヒンジ；
−配列番号：６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ８アルファ（α）由来の膜貫通ドメイン。
−配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子；
−配列番号：９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を提供する。

好ましい一実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号：４８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

好ましい一実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号：５０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

好ましい一実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号：５２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

好ましい一実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号：５４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

好ましい一実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号：５６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

好ましい一実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号：５８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

より好ましい実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号：５０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列、または配列番号：５６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

ヒト抗ＢＣＭＡ抗体（またはｓｃＦｖ）はまた、内因性遺伝子座の代わりにヒト免疫グロブリン遺伝子座がトランスジェニックに導入された動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウス）の免疫化によって作製され得る。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号；米国特許第５，５４５，８０６号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；および米国特許第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球（このようなＢリンパ球は、個体から、もしくはｃＤＮＡの単一細胞クローニングから回収され得るか、またはインビトロで免疫化されたものであり得る）を不死化することによって調製され得る。例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５，１９９１；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと。

ポリヌクレオチド、ベクター：
本発明はまた、本発明の上記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターに関する。

一実施形態では、本発明は、配列番号：４８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターを提供する。

好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：５０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターを提供する。

一実施形態では、本発明は、配列番号：５２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターを提供する。

一実施形態では、本発明は、配列番号：５４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターを提供する。

一実施形態では、本発明は、配列番号：５６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターを提供する。

一実施形態では、本発明は、配列番号：５８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターを提供する。

より好ましい実施形態では、本発明は、配列番号：５０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または配列番号：５６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターを提供する。

本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法またはＰＣＲを使用して得られ得る。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は当技術分野で周知であり、本明細書に詳細に記載される必要はない。当業者であれば、本明細書で提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用して、所望のＤＮＡ配列を生産し得る。

本明細書にさらに論じるように、組換え法を用いてポリヌクレオチドを調製するため、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入して、続いて、複製および増幅のため、適切な宿主細胞内にベクターを導入し得る。当技術分野で公知の任意の手段によって、ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入し得る。直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ交配またはエレクトロポレーションにより外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、細胞を形質転換する。導入されたら、外因性ポリヌクレオチドを、非組み込みベクター（プラスミドなど）として細胞内で維持し得、また宿主細胞ゲノムに組み込み得る。当技術分野で周知の方法によって、こうして増幅したポリヌクレオチドを宿主細胞から単離し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと。

あるいは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，８００，１５９号、米国特許第４，７５４，０６５号および米国特許第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４に記載されている。

適切なベクター中の単離されたＤＮＡを使用し、それを適切な宿主細胞に挿入することによって、ＲＮＡを得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されたら、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９前掲に示されている当業者に周知の方法を使用して、ＲＮＡを単離し得る。

適切なクローニングベクターは、標準的な技術にしたがって構築され得るか、または当技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは、使用する宿主細胞に応じて異なり得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製能を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一標的を有し得、および／またはベクターを含有するクローンを選択する際に使用可能なマーカーの遺伝子を有し得る。適切な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが挙げられる。これらのおよび多くの他のクローニングベクターが、ＢｉｏＲａｄ、ＳｔｒａｔｅｇｅｎｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業的業者から入手可能である。

発現ベクターは、一般に、本発明のポリヌクレオチドを含有する複製可能ポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な部分として宿主細胞中で複製可能でなければならないことが示唆される。適切な発現ベクターとしては、限定されないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、および国際公開第８７／０４４６２号に開示される発現ベクターが挙げられる。一般に、ベクター構成要素としては、限定されないが、以下の１つ以上が挙げられ得る：シグナル配列；複製起点；１つ以上のマーカー遺伝子；適切な転写調節要素（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）。発現（すなわち、翻訳）のため、リボソーム結合部位、翻訳開始部位および停止コドンなどの１つ以上の翻訳調節要素もまた、通常、必要である。

エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性病原体である場合）を含む、いくつかの適切な手段のいずれによって、目的のポリヌクレオチドを含有するベクターを宿主細胞に導入し得る。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、多くの場合、宿主細胞の特徴に依存するであろう。

本明細書に開示されるＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのウイルスベクター、例えばバキュロウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのプラスミドもしくはウイルスベクター、例えばレンチウイルス）中に存在し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば限定されないが、２Ａペプチドをコードする配列などを含み得る。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされる２つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ａｎｄ Ｅｌｌｉｏｔｔ ２００１；Ａｔｋｉｎｓ，Ｗｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２００８）を参照のこと）。「コドン」は、リボソームによって１つのアミノ酸残基へ翻訳されるｍＲＮＡ（またはＤＮＡ分子のセンス鎖）上の３ヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドが、インフレームにある２Ａオリゴペプチド配列によって隔てられている時、ｉｍＲＮＡ内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、２つのポリペプチドが合成され得る。このようなリボソームスキップ機序は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされる数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。

膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に指向させるために、いくつかの実施形態では、（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。すなわち、２つの配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路に指向されるよう配置される。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の５’に配置されるが、特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列の他の場所に配置され得る（例えば、Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。

当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化は、目的の配列において、所定の種の高発現遺伝子において一般に稀であるコドンを、このような種の高発現遺伝子において一般に高頻度であるコドンへ交換することを指し、このようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。

ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのウイルスベクター、例えばバキュロウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのプラスミドもしくはウイルスベクター、例えばレンチウイルス）中に存在し得る。

特定の実施形態では、異なる核酸配列は、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば２Ａペプチドをコードする配列を含む１つのポリヌクレオチドまたはベクターに含められ得る。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされる２つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ａｎｄ Ｅｌｌｉｏｔｔ ２００１；Ａｔｋｉｎｓ，Ｗｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２００８）を参照のこと）。「コドン」は、リボソームによって１つのアミノ酸残基へ翻訳されるｍＲＮＡ（またはＤＮＡ分子のセンス鎖）上の３ヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドが、インフレームにある２Ａオリゴペプチド配列によって隔てられている時、ｍＲＮＡ内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、２つのポリペプチドが合成され得る。このようなリボソームスキップ機序は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされる数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。

膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に指向させるために、（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。すなわち、２つの配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路に指向されるよう配置される。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の５’に配置されるが、特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列の他の場所に配置され得る（例えば、Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。好ましい実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号：１および２のアミノ酸配列を含む。

当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化は、目的の配列において、所定の種の高発現遺伝子において一般に稀であるコドンを、このような種の高発現遺伝子において一般に高頻度であるコドンへ交換することを指し、このようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。

ＣＡＲを持つ免疫細胞を操作する方法：
本発明は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法であって、前記ＢＣＭＡ ＣＡＲの１つをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを前記免疫細胞にエクスビボで導入することを含む方法を包含する。

好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、免疫細胞において安定発現されるということを考慮して、レンチウイルスベクターに含められる。

さらなる実施形態によれば、前記方法は、前記細胞を同種移植により適切なものにするようにそれらを遺伝子改変する工程をさらに含む。

第１の態様によれば、免疫細胞は、例えば、国際公開第２０１３／１７６９１５号に記載されているように、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の１つ以上の成分を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって（ＨＬＡまたはβ２ｍタンパク質発現をコードまたは調節する遺伝子の不活性化と組み合わせ得る）、低同種性にされ得る。したがって、移植片対宿主症候群および移植片拒絶のリスクが有意に低減される。好ましい実施形態では、ノックアウトＴＣＲ Ｔ細胞は、本明細書に記載される免疫細胞を操作するための方法によって前記ＴＣＲを欠失させることによって調製される。

別の態様によれば、免疫細胞は、免疫抑制薬または化学療法処置（これらは、ＢＣＭＡ陽性悪性細胞を処置するための標準治療として使用される）に対するそれらの耐性を改善させるようにさらに遺伝的に操作され得る。例えば、ＣＤ５２およびグルココルチコイド受容体（ＧＲ）（これらは、キャンパス（アレムツズマブ）およびグルココルチコイド処置の薬物標的である）を不活性化して、細胞をこれらの処置に対して耐性にし、特異的ＢＣＭＡ ＣＡＲを持たない患者自身のＴ細胞に対する競争優位性をそれらに与え得る。また、ＣＤ３遺伝子の発現を抑制または低減して、テプリズマブ（これは、別の免疫抑制薬である）に対する耐性を付与し得る。また、本発明にしたがって、ＨＰＲＴの発現を抑制または低減して、６−チオグアニン（特に急性リンパ芽球性白血病の処置のための化学療法において一般的に使用される細胞増殖抑制剤）に対する耐性を付与し得る。

本発明のさらなる態様によれば、免疫細胞は、ＰＤＣＤ１またはＣＴＬＡ−４などのＴ細胞活性化調節因子として作用する「免疫チェックポイント」として作用するタンパク質をコードする遺伝子を不活性化することによって、それらをより活性にし、または枯渇を制限するようにさらに操作され得る。発現が低減または抑制され得る遺伝子の例は、表９に示されている。

好ましい実施形態では、免疫細胞をさらに操作する前記方法は、特異的低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド（特に、ｍＲＮＡ）を前記Ｔ細胞に導入して、ＤＮＡ切断により上記遺伝子を選択的に不活性化することを含む。より好ましい実施形態では、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。ＴＡＬヌクレアーゼは、他の種類の低頻度切断エンドヌクレアーゼよりも特異性および切断効率が高いことがこれまでに証明されているので、それらは、一定のターンオーバーで大規模に人工免疫細胞を生産するために選択されるエンドヌクレアーゼである。

抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現免疫細胞における薬剤耐性遺伝子の発現
本発明のさらなる態様によれば、免疫細胞は、最も一般に使用される薬物または化学療法剤、例えばシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｎｅｏｓａｒ）、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃａｓａｒ、Ｏｎｃｏｖｉｎ）またはプレドニゾン（複数のブランド名）に対してそれらを耐性にするようにさらに操作され得る。

抗癌薬として使用される化学療法は、通常、静脈に注射され、または経口摂取される。これらの薬物は血流に入り、ほぼすべての身体部位に到達するので、この処置はリンパ腫に非常に有用になる。

本発明のＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、前記抗癌薬の存在下で生存および増殖することができるようにさらに操作される。

特定の実施形態では、前記薬剤耐性は、少なくとも１つの薬剤耐性遺伝子の発現によってＴ細胞に付与され得る。前記薬剤耐性遺伝子は、化学療法剤（例えば、メトトレキサート）などの薬剤に対する「耐性」をコードする核酸配列を指す。換言すれば、細胞における薬剤耐性遺伝子の発現は、薬剤耐性遺伝子を有しない対応する細胞の増殖よりも同じまたはそれ以上の程度に、薬剤の存在下における細胞の増殖を可能にする。細胞における薬剤耐性遺伝子の発現は、薬剤の存在下における細胞の増殖を可能にし、その活性に影響を与えない。本発明の薬剤耐性遺伝子は、代謝拮抗物質、メトトレキサート、ビンブラスチン、シスプラチン、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞傷害性抗生物質、抗イムノフィリン、それらの類似体または誘導体などに対する耐性をコードし得る。

このような抗癌化学療法の例は、
・シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））
・クロラムブシル
・ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））
・イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））、またはそれらの組み合わせ
から選択されるアルキル化剤
・プレドニゾンまたは
・デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））
などのコルチコステロイド
・シスプラチン
・カルボプラチン
・オキサリプラチンまたはそれらの組み合わせ
から選択されるプラチナ薬
・フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））
・ペントスタチン（Ｎｉｐｅｎｔ（登録商標））
・クラドリビン（２−ＣｄＡ、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））またはそれらの組み合わせ
から選択されるプリン類似体
・シタラビン（ａｒａ−Ｃ）
・ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））
・メトトレキサート
・プララトレキサート（Ｆｏｌｏｔｙｎ（登録商標））、またはそれらの組み合わせ
から選択される代謝拮抗物質
・ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））
・ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））
・ミトキサントロン
・エトポシド（ＶＰ−１６）
・ブレオマイシンまたはそれらの組み合わせ
から選択される他の薬物
であり得る。

この目的のために、本発明は、以下の工程：
（ｉ）前記薬物または複数の薬物に対する耐性を付与する少なくとも遺伝子をＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞に導入すること、または
（ｉｉ）ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において、（感受性または耐性を付与する）少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害または増加すること
を含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明の薬剤耐性遺伝子は、薬物（または薬剤）、特に、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（ＶＰ１６）、三酸化ヒ素、トランスレチノイン酸、三酸化ヒ素とトランスレチノイン酸との組み合わせ、メクロレタミン、プロカルバジン、クロラムブシル、シタラビン、アントラサイクリン、６−チオグアニン、ヒドロキシウレア、プレドニゾンおよびそれらの組み合わせから選択される抗癌薬に対する耐性を付与し得る。

薬剤耐性を本発明の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞に付与するために潜在的に使用され得るいくつかの薬剤耐性遺伝子が同定されている（Ｔａｋｅｂｅ，Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｔｓｕｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｚｉｅｌｓｋｅ，Ｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｎｉｖｅｎｓ，Ｆｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｂａｒｄｅｎｈｅｕｅｒ，Ｌｅｈｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｋｕｓｈｍａｎ，Ｋａｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）。

薬剤耐性遺伝子の一例はまた、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の突然変異体または改変型であり得る。ＤＨＦＲは、細胞におけるテトラヒドロ葉酸の量の調節に関与する酵素であり、ＤＮＡ合成に必須である。メトトレキサート（ＭＴＸ）などの葉酸類似体はＤＨＦＲを阻害するので、臨床では抗新生物剤として使用される。治療に使用される抗葉酸物質による阻害に対する耐性が増加している様々な突然変異型ＤＨＦＲが記載されている。特定の実施形態では、本発明の薬剤耐性遺伝子は、ヒト野生型ＤＨＦＲ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ７１９９６．１）の突然変異型（これは、メトトレキサートなどの抗葉酸処置に対する耐性を付与する少なくとも１つの突然変異を含む）をコードする核酸配列であり得る。特定の実施形態では、突然変異型ＤＨＦＲは、位置Ｇ１５、Ｌ２２、Ｆ３１またはＦ３４において、好ましくは位置Ｌ２２またはＦ３１において少なくとも１つの突然変異アミノ酸を含む（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ｄｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９０）；国際公開第９４／２４２７７号；米国特許第６，６４２，０４３号）。特定の実施形態では、前記突然変異型ＤＨＦＲは、位置Ｌ２２およびＦ３１において２つの突然変異アミノ酸を含む。本明細書に記載されるアミノ酸位置の対応は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ７１９９６．１に示されている野生型ＤＨＦＲポリペプチドのアミノ酸の位置に関連して表されることが多い。特定の実施形態では、位置１５のセリン残基は、好ましくは、トリプトファン残基で置換される。別の特定の実施形態では、位置２２のロイシン残基は、好ましくは、抗葉酸物質に対する突然変異体ＤＨＦＲの結合を破壊するであろうアミノ酸、好ましくはフェニルアラニンまたはチロシンなどの非荷電アミノ酸残基で置換される。別の特定の実施形態では、位置３１または３４のフェニルアラニン残基は、好ましくは、アラニン、セリンまたはグリシンなどの小型親水性アミノ酸で置換される。

本明細書で使用される場合、「抗葉酸剤」または「葉酸類似体」は、あるレベルで葉酸代謝経路を妨げるように指令された分子を指す。抗葉酸剤の例としては、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）；アミノプテリン；トリメトレキサート（Ｎｅｕｔｒｅｘｉｎ（商標）；エダトレキサート；Ｎ１０−プロパルギル−５，８−ジデアザ葉酸（ＣＢ３７１７）；ＺＤ１６９４（Ｔｕｍｏｄｅｘ）、５，８−ジデアザイソ葉酸（ＩＡＨＱ）；５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）；５−デアザ葉酸；ＰＴ５２３（Ｎアルファ−（４−アミノ−４−デオキシプテロイル）−Ｎデルタ−ヘミフタロイル−Ｌ−オルニチン）；１０−エチル−１０−デアザアミノプテリン（ＤＤＡＴＨＦ、ｌｏｍａｔｒｅｘｏｌ）；ピリトレキシム；１０−ＥＤＡＭ；ＺＤ１６９４；ＧＷ１８４３；ペメトレキサートおよびＰＤＸ（１０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリン）が挙げられる。

薬剤耐性遺伝子の別の例はまた、イオニシン−５’−一リン酸脱水素酵素ＩＩ（ＩＭＰＤＨ２）（グアノシンヌクレオチドのデノボ合成における律速酵素）の突然変異体または改変型であり得る。ＩＭＰＤＨ２の突然変異体または改変型は、ＩＭＰＤＨ阻害剤耐性遺伝子である。ＩＭＰＤＨ阻害剤は、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）またはそのプロドラッグのミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）であり得る。突然変異体ＩＭＰＤＨ２は、野生型ヒトＩＭＰＤＨ２（ＮＰ＿０００８７５．２）のＭＡＰ結合部位において、少なくとも１つの、好ましくは２つの突然変異（これは、ＩＭＰＤＨ阻害剤に対する耐性の有意な増加をもたらす）を含み得る。突然変異は、好ましくは、位置Ｔ３３３および／またはＳ３５１にある（Ｙａｍ，Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｓａｎｇｉｏｌｏ，Ｌｅｓｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ，Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．２０１３）。特定の実施形態では、位置３３３のトレオニン残基は、イソロイシン残基で置換され、位置３５１のセリン残基は、チロシン残基で置換される。本明細書に記載されるアミノ酸位置の対応は、ＮＰ＿０００８７５．２に示されている野生型ヒトＩＭＰＤＨ２ポリペプチドのアミノ酸の位置に関連して表されることが多い。

別の薬剤耐性遺伝子は、カルシニューリンの突然変異型である。カルシニューリン（ＰＰ２Ｂ）は、遍在的に発現されるセリン／トレオニンタンパク質ホスファターゼであり、多くの生物学的プロセスに関与し、Ｔ細胞活性化の中心である。カルシニューリンは、触媒サブユニット（ＣｎＡ；３つのアイソフォーム）および調節サブユニットＣｎＢ；２つのアイソフォーム）から構成されるヘテロ二量体である。Ｔ細胞受容体との結合後、カルシニューリンは、転写因子ＮＦＡＴを脱リン酸化して、その核移行およびＩＬ２などの重要な標的遺伝子の活性化を可能にする。ＦＫＢＰ１２と複合体形成したＦＫ５０６、またはＣｙＰＡと複合体形成したシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、ＮＦＡＴがカルシニューリンの活性部位にアクセスするのを妨げてその脱リン酸化を防止し、それにより、Ｔ細胞活性化を阻害する（Ｂｒｅｗｉｎ，Ｍａｎｃａｏ ｅｔ ａｌ．２００９）。本発明の薬剤耐性遺伝子は、ＦＫ５０６および／またはＣｓＡなどのカルシニューリン阻害剤に対して耐性の突然変異型カルシニューリンをコードする核酸配列であり得る。特定の実施形態では、前記突然変異型は、位置Ｖ３１４、Ｙ３４１、Ｍ３４７、Ｔ３５１、Ｗ３５２、Ｌ３５４、Ｋ３６０において、野生型カルシニューリンヘテロ二量体ａの少なくとも１つの突然変異アミノ酸を含み得、好ましくは、位置Ｔ３５１およびＬ３５４またはＶ３１４およびＹ３４１において、二重突然変異を含み得る。特定の実施形態では、位置３４１のバリン残基は、リジンまたはアルギニン残基で置換され得、位置３４１のチロシン残基は、フェニルアラニン残基で置換され得る；位置３４７のメチオニンはグルタミン酸、アルギニンまたはトリプトファン残基で置換され得る；位置３５１のトレオニンは、グルタミン酸残基で置換され得る；位置３５２のトリプトファン残基は、システイン、グルタミン酸またはアラニン残基で置換され得、位置３５３のセリンは、ヒスチジンまたはアスパラギン残基で置換され得、位置３５４のロイシンは、アラニン残基で置換され得る；位置３６０のリジンは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＸ３４０９２．１に対応する配列のアラニンまたはフェニルアラニン残基で置換され得る。本明細書に記載されるアミノ酸位置の対応は、（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＸ３４０９２．１）に示されている野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体ａポリペプチドのアミノ酸の位置に関連して表されることが多い。

別の特定の実施形態では、前記突然変異型は、位置Ｖ１２０、Ｎ１２３、Ｌ１２４またはＫ１２５において、野生型カルシニューリンヘテロ二量体ｂの少なくとも１つの突然変異アミノ酸を含み得、好ましくは、位置Ｌ１２４およびＫ１２５において、二重突然変異を含み得る。特定の実施形態では、位置１２０のバリンは、セリン、アスパラギン酸、フェニルアラニンまたはロイシン残基で置換され得る；位置１２３のアスパラギンは、トリプトファン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ヒスチジンまたはセリンで置換され得る；位置１２４のロイシンは、トレオニン残基で置換され得る；位置１２５のリジンは、アラニン、グルタミン酸、トリプトファンで置換され得、またはロイシン−アルギニンもしくはイソロイシン−グルタミン酸などの２つの残基は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＸ３４０９５．１に対応するアミノ酸配列の位置１２５のリジンの後に付加され得る。本明細書に記載されるアミノ酸位置の対応は、（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＸ３４０９５．１）に示されている野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体ｂポリペプチドのアミノ酸の位置に関連して表されることが多い。

薬剤耐性遺伝子の別の例は、ヒトアルキルグアニントランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）をコードする０（６）−メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）である。ＡＧＴは、ニトロソウレアおよびテモゾロミド（ＴＭＺ）などのアルキル化剤の細胞傷害性効果に対する耐性を付与するＤＮＡ修復タンパク質である。６−ベンジルグアニン（６−ＢＧ）は、ニトロソウレアの毒性を増強するＡＧＴの阻害剤であり、この薬剤の細胞傷害性効果を増強するためにＴＭＺと同時投与される。ＡＧＴの変異体をコードするいくつかの突然変異型ＭＧＭＴは、６−ＢＧによる不活性化に対して高耐性であるが、ＤＮＡ損傷を修復する能力を保持する（Ｍａｚｅ，Ｋｕｒｐａｄ ｅｔ ａｌ．１９９９）。特定の実施形態では、突然変異型ＡＧＴは、配列番号：１８のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１６４５５）の位置Ｐ１４０において、野生型ＡＧＴの突然変異アミノ酸を含み得る。好ましい実施形態では、位置１４０の前記プロリンは、リジン残基で置換される。

薬剤耐性遺伝子の別の例は、多剤耐性タンパク質１（ＭＤＲ１）遺伝子である。この遺伝子は、細胞膜を通過する代謝副産物の輸送に関与する膜糖タンパク質（Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ＧＰ）として公知である）をコードする。Ｐ−Ｇｐタンパク質は、いくつかの構造的に無関係の化学療法剤に対して広範な特異性を示す。

ミトキサントロンなどの薬物に対する耐性を付与するために、多剤耐性タンパク質１を過剰発現させることが記載されている（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓ．Ｍｏｒｒｏｗ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ Ｐｅｋｌａｋ−Ｓｃｏｔｔ，Ｂｉｍｊｈａｎａ Ｂｉｓｈｗｏｋａｒｍａ，Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｅ．Ｋｕｔｅ，Ｐａｍｅｌａ Ｋ．Ｓｍｉｔｈｅｒｍａｎ，ａｎｄ Ａｌａｎ Ｊ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ．Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＭＲＰ１，ＡＢＣＣ１）Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ ｖｉａ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｅｆｆｌｕｘ Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ａｐｒｉｌ ２００６ ６９：１４９９−１５０５）。

したがって、薬剤耐性は、ＭＤＲ−１（ＮＰ＿０００９１８）をコードする核酸配列の発現を増強することによって、本発明の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞に付与され得る。

薬剤耐性細胞を調製するさらに別の方法は、アムサクリンに対する耐性を付与するために、特定の突然変異（例えば、ヒトトポイソメラーゼＩＩ遺伝子におけるＡｒｇ４８６およびＧｌｕ５７１の突然変異）を有する細胞を調製することである（Ｓ．ＰＡＴＥＬ，Ｂ．Ａ．ＫＥＬＬＥＲ，ａｎｄ Ｌ．Ｍ．ＦＩＳＨＥＲ．２０００．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ．Ｖｏｌ ５７：ｐ７８４−７９１（２０００）。

薬剤耐性細胞を調製するさらに別の方法は、ダウノルビシンに対する耐性を付与するために、マイクロＲＮＡ−２１を過剰発現する細胞を調製することである（Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉＲ−２１ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＰＴＥＮ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ Ｋ５６２ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｂａｉ，Ｈａｉｔａｏ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ５８５，Ｉｓｓｕｅ ２，４０２−４０８）。

薬剤耐性遺伝子はまた、細胞傷害性抗生物質に対する耐性を付与し得、ｂｌｅ遺伝子またはｍｃｒＡ遺伝子であり得る。免疫細胞におけるｂｌｅ遺伝子またはｍｃｒＡの異所性発現は、化学療法剤（それぞれブレオマイシンまたはマイトマイシンＣ）への曝露の際に、選択的利点を与える。

遺伝子治療への非常に実用的なアプローチは、ベクター、好ましくはウイルスベクターによる効率的な遺伝子送達を使用することによってＴ細胞を操作するための遺伝子の追加である。したがって、特定の実施形態では、前記薬剤耐性遺伝子は、好ましくは少なくとも１つのベクターによってコードされる導入遺伝子を細胞に導入することによって、細胞において発現され得る。

一実施形態では、薬剤耐性遺伝子、または薬剤耐性を付与する改変遺伝子を有する細胞はまた、それらの選択的破壊を可能にする誘導性自殺遺伝子（その誘導は、細胞死を誘発する）を含む。

ゲノムへの遺伝子のランダム挿入は、挿入された遺伝子または挿入部位付近の遺伝子の不適切な発現につながり得る。内因性配列を含む外因性核酸の相同組換えを使用して遺伝子をゲノム内の特定部位にターゲティングする特定の遺伝子治療は、安全なＴ細胞の操作を可能にし得る。上記のように、前記方法の遺伝子改変工程は、内因性遺伝子と外因性核酸との間で相同組換えが起こるように、少なくとも薬剤耐性遺伝子をコードする配列と、内因性遺伝子の一部とを含む外因性核酸を細胞に導入する工程を含み得る。特定の実施形態では、前記内因性遺伝子は、相同組換え後に、薬剤耐性を付与する突然変異型遺伝子によって野生型遺伝子が置換されるような野生型「薬剤耐性」遺伝子であり得る。

エンドヌクレアーゼによる破壊は、相同組換えの割合を増やすことが公知である。したがって、特定の実施形態では、本発明の方法は、内因性遺伝子内の標的配列を切断することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼを細胞において発現させる工程をさらに含む。前記内因性遺伝子は、例えば、ＤＨＦＲ、ＩＭＰＤＨ２、カルシニューリンまたはＡＧＴをコードし得る。前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、ＭＢＢＢＤ−ヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼであり得る。

抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現免疫細胞における薬物感受性遺伝子の不活性化
別の特定の実施形態では、前記薬剤耐性は、薬物感受性遺伝子の不活性化によって、本発明の細胞、すなわち抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現免疫細胞に付与され得る。

本発明者は、免疫療法のためのＴ細胞を操作するために、特に、治療剤（抗癌薬）と組み合わせて使用され得る抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現免疫細胞を操作するために、潜在的な薬物感受性遺伝子を不活性化しようとした。

遺伝子の不活性化は、目的の遺伝子が、機能性タンパク質の形態で発現されないことを意図する。特定の実施形態では、前記方法の遺伝的改変は、提供される操作用細胞における１つの低頻度切断エンドヌクレアーゼの発現に依拠し、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、１つの標的遺伝子における切断を特異的に触媒し、それにより、前記標的遺伝子を不活性化する。特定の実施形態では、少なくとも１つの薬物感受性遺伝子を不活性化する工程は、少なくとも１つの薬物感受性遺伝子を破壊することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼを細胞に導入することを含む。より具体的な実施形態では、前記細胞は、薬物感受性遺伝子を破壊することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸で形質転換され、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼが前記細胞において発現される。前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＭＢＢＢＤ−ヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼであり得る。好ましい実施形態では、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。

好ましい実施形態では、薬剤耐性をＴ細胞に付与するために不活性化され得る薬物感受性遺伝子は、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）遺伝子である。この酵素は、デオキシリボヌクレオシドのデオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）およびデオキシアデノシン（ｄＡ）のリン酸化に必要である。プリンヌクレオチド類似体（ＰＮＡ）は、ｄＣＫによって、ＰＮＡ一リン酸、ＰＮＡ二リン酸およびＰＮＡ三リン酸に代謝される。それらの三リン酸形態、特にクロファラビン三リン酸は、ＤＮＡ合成でＡＴＰと競合し、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）の強力な阻害剤である。

好ましくは、Ｔ細胞におけるｄＣＫの不活性化は、ＴＡＬＥヌクレアーゼによって媒介される。この目標を達成するために、ｄＣＫ ＴＡＬＥヌクレアーゼのいくつかのペアが設計され、ポリヌクレオチドレベルでアセンブルされ、配列決定によって検証されている。本発明にしたがって使用され得るＴＡＬＥヌクレアーゼペアの例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７５３１７号に示されている。

Ｔ細胞におけるこのｄＣＫ不活性化は、クロファラビンおよびフルダラビンなどのプリンヌクレオシド類似体（ＰＮＡ）に対する耐性を付与する。

別の好ましい実施形態では、Ｔ細胞におけるｄＣＫ不活化をＴＲＡＣ遺伝子の不活性化と組み合わせて、これらのダブルノックアウト（ＫＯ）Ｔ細胞をクロファラビンなどの薬物に対して耐性にし、かつ低同種性にする。この二重特性は治療目的に特に有用であり、免疫療法のための「既製の」同種細胞を化学療法と併せて癌を有する患者を処置することを可能にする。この二重ＫＯ不活性化ｄＣＫ／ＴＲＡＣは、同時にまたは逐次に実施され得る。本発明で成功したＴＡＬＥヌクレアーゼｄＣＫ／ＴＲＡＣペアの一例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７５３１７号に記載されている（特に、２つの遺伝子座（ｄＣＫおよびＴＲＡＣ）の標的配列）。

不活性化され得る酵素の別の例は、ヒトヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｍ２６４３４．１）である。特に、ＨＰＲＴは、細胞増殖抑制代謝物６−チオグアニン（６ＴＧ）（これは、ＨＰＲＴによって細胞傷害性のチオグアニンヌクレオチドに変換され、癌、特に白血病を有する患者を処置するために現在使用されている）に対する耐性を付与するために、人工Ｔ細胞において不活性化され得る（Ｈａｃｋｅ，Ｔｒｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３）。ＨＰＲＴトランスフェラーゼ（これは、ホスホリボシル部分の付加を触媒し、６メルカプトプリン（６ＭＰ）および６チオグアニン（６ＴＧ）を含むＴＧＭＰグアニン類似体の形成を可能にする）によって代謝されるグアニン類似体は、ＡＬＬを処置するためのリンパ球減少薬として通常使用される。それらは、ＨＰＲＴ（これは、ホスホリボシル部分の付加を触媒し、ＴＧＭＰの形成を可能にするヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）によって代謝される。続いて、それらがリン酸化されてそれらの三リン酸化形態が形成され、これが最終的にＤＮＡに組み込まれる。ＤＮＡに組み込まれると、チオＧＴＰは、そのチオラート類を介してＤＮＡ複製の忠実度を低下させ、細胞の完全性に非常に有害なランダム点突然変異を生成する。

別の実施形態では、Ｔ細胞の表面において通常発現されるＣＤ３の不活性化は、テプリズマブなどの抗ＣＤ３抗体に対する耐性を付与し得る。

本明細書で使用される場合、「治療剤」、「化学療法剤」または「薬物」または「抗癌薬」という用語は、癌細胞と相互作用し、それにより、前記細胞の増殖状態を低減し、および／または前記細胞を殺傷し得る医薬、好ましくはその化合物またはその誘導体を指す。化学療法剤または「抗癌薬」の例としては、限定されないが、アルキル化剤（例えば、ブスルファン・カルボプラチン・クロラムブシル・シスプラチン・シクロホスファミド・イホスファミド・メルファラン・メクロレタミン・オキサリプラチン・ウラムスチン・テモゾロミド・ホテムスチン）、代謝拮抗薬（例えば、プリンヌクレオシド代謝拮抗物質、例えばクロファラビン、フルダラビンまたは２’−デオキシアデノシン、メトトレキサート（ＭＴＸ）、５−フルオロウラシルまたはその誘導体、アザチオプリン・カペシタビン・シタラビン・フロクスウリジン・フルオロウラシル・ゲムシタビン・メトトレキサート・ペメトレキセド）、抗腫瘍抗生物質（例えば、マイトマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン・ダウノルビシン・ドキソルビシン・エピルビシン・ヒドロキシウレア・イダルビシン・マイトマイシンＣ・ミトキサントロン）、植物由来の抗腫瘍剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、ビンブラスチン・（ビノレルビン）・ドセタキセル・パクリタキセル）、トポイソメラーゼ阻害剤（イリノテカン・トポテカン・エトポシド）が挙げられる。

好ましい実施形態では、本明細書で使用される場合、治療剤、化学療法薬は、癌を処置し、特に造血系癌細胞、より具体的にはＡＭＬを処置し、それにより、癌細胞の増殖状態を低減し、および／または癌細胞を殺傷するために使用され得る化合物またはその誘導体を指す。化学療法剤の例としては、限定されないが、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（ＶＰ１６）、三酸化ヒ素、トランスレチノイン酸、メクロレタミン、プロカルバジン、クロラムブシルおよびそれらの組み合わせが挙げられる。

本発明の他の実施形態では、本発明の細胞は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（ＶＰ１６）、三酸化ヒ素、トランスレチノイン酸、シタラビン、アントラサイクリン、６−チオグアニン、ヒドロキシウレア、プレドニゾンおよびそれらの組み合わせから選択される薬物（または薬剤）と併せて患者に投与される。

このような薬剤としてはさらに、限定されないが、抗癌剤ＴＲＩＭＥＴＨＯＴＲＩＸＡＴＥ（商標）（ＴＭＴＸ）、ＴＥＭＯＺＯＬＯＭＩＤＥ（商標）、ＲＡＬＴＲＩＴＲＥＸＥＤ（商標）、Ｓ−（４−ニトロベンジル）−６−チオイノシン（ＮＢＭＰＲ）、６−ベンジルグアニジン（６−ＢＧ）、ビス−クロロニトロソウレア（ＢＣＮＵ）およびＣＡＭＰＴＯＴＨＥＣＩＮ（商標）またはそれらの任意の治療誘導体が挙げられる。

より好ましい実施形態では、配列番号：５０または配列番号：５６の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＴ細胞は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（ＶＰ１６）、三酸化ヒ素、トランスレチノイン酸およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの治療剤と併せて患者に投与される。

本明細書で使用される場合、薬剤に対して「耐性または抵抗性」の細胞は、改変されていない細胞の増殖を阻害または防止する一定量の薬剤の存在下で細胞が増殖するように遺伝子改変された細胞を意味する。

多剤耐性抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現免疫細胞の調製
別の特定の実施形態では、本発明者らは、患者を異なる薬物で処置する際に、人工Ｔ細胞の選択を媒介するために、多剤耐性の同種Ｔ細胞、特に同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する「既製の」免疫療法戦略を開発しようとした。治療効果は、多剤耐性同種Ｔ細胞を遺伝的に操作することによって有意に増強され得る。このような戦略は、相乗効果を示す薬物の組み合わせに応答する腫瘍の処置において特に有効であり得る。また、多剤耐性人工Ｔ細胞は、最小量の薬物物質を使用して増殖および選択され得る。

したがって、本発明の方法は、Ｔ細胞を改変して、多剤耐性を前記Ｔ細胞に付与することを含み得る。前記多剤耐性は、複数の薬剤耐性遺伝子を発現させることによって、または複数の薬物感受性遺伝子を不活性化することによって付与され得る。別の特定の実施形態では、多剤耐性は、少なくとも１つの薬剤耐性遺伝子を発現させ、少なくとも１つの薬物感受性遺伝子を不活性化することによって、前記Ｔ細胞に付与され得る。特に、多剤耐性は、少なくとも１つの薬剤耐性遺伝子、例えば突然変異型ＤＨＦＲ、突然変異型ＩＭＰＤＨ２、突然変異型カルシニューリン、突然変異型ＭＧＭＴ、ｂｌｅ遺伝子およびｍｃｒＡ遺伝子を発現させ、少なくとも１つの薬物感受性遺伝子、例えばＨＰＲＴ遺伝子を不活性化することによって、前記Ｔ細胞に付与され得る。好ましい実施形態では、多剤耐性は、ＨＰＲＴ遺伝子を不活性化し、突然変異型ＤＨＦＲを発現させることによって；またはＨＰＲＴ遺伝子を不活性化し、突然変異型ＩＭＰＤＨ２を発現させることによって；またはＨＰＲＴ遺伝子を不活性化し、突然変異型カルシニューリンを発現させることによって；ＨＰＲＴ遺伝子を不活性化し、突然変異型ＭＧＭＴを発現させることによって；ＨＰＲＴ遺伝子を不活性化し、ｂｌｅ遺伝子を発現させることによって；ＨＰＲＴ遺伝子を不活性化し、ｍｃｒＡ遺伝子を発現させることによって付与され得る。

一実施形態では、本発明は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞であって、ＴＣＲ発現が影響を受けており、複数の薬剤耐性遺伝子を発現しており、および／または複数の薬物感受性遺伝子が不活性化されている抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を提供する。

−抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現免疫細胞における自殺遺伝子
−一実施形態では、自殺ポリペプチドは、（ＴＣＲがノックアウト（ＫＯ）されており、少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎ）抗癌化学療法に対して耐性の）本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞の表面において発現され得る；ポリペプチドのＲエピトープに対するリツキシマブの結合は、細胞の溶解を引き起こす。したがって、自殺ポリペプチドは、アミノ末端においてシグナルペプチドを含み得る。細胞表面において発現されたポリペプチド当たり、複数のリツキシマブ分子が結合し得る。ポリペプチドの各Ｒエピトープは、別個のリツキシマブ分子に結合し得る。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の除去は、例えば、リツキシマブを患者に投与することによってインビボで起こり得る。移植細胞を除去する判断は、患者において検出される、移植細胞に起因する望ましくない効果（例えば、許容し得ないレベルの毒性が検出される場合など）から生じ得る。

いくつかの場合では、人工Ｔ細胞は増殖し、投与後数年間にわたって持続し得るので、投与されるＴ細胞の選択的な除去を可能にする安全機構を含めることが望ましい場合がある。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、組換え自殺遺伝子による前記Ｔ細胞の形質転換を含み得る。前記組換え自殺遺伝子は、投与後の被験体における、直接的な毒性のおよび／または前記Ｔ細胞の無制限増殖のリスクを低減するために使用されるＱｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ Ｃ，Ｖｅｒａ Ｆ，ｂｌｏｏｄ ２００７；Ｔｅｙ ＳＫ，Ｄｏｔｔｉ Ｇ．，Ｒｏｏｎｅｙ ＣＭ，ｂｏｉｌ ｂｌｏｏｄ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２００７）。自殺遺伝子は、インビボにおける形質転換細胞の選択的な除去を可能にする。特に、自殺遺伝子は、非毒性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換し、または毒性遺伝子の発現産物を発現する能力を有する。換言すれば、「自殺遺伝子」は、それ自体によって、または他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす産物をコードする核酸である。

このような自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼをコードするものである。さらなる例は、水痘・帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼおよび細菌遺伝子のシトシンデアミナーゼ（これは、５−フルオロシトシンを高毒性の化合物５−フルオロウラシルに変換し得る）である。自殺遺伝子としてはまた、非限定的な例として、カスパーゼ−９またはカスパーゼ−８またはシトシンデアミナーゼが挙げられる。カスパーゼ−９は、特定の二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。自殺遺伝子はまた、細胞の表面において発現されるポリペプチドであり得、細胞を治療用モノクローナル抗体に対して感受性にし得る。本明細書で使用される場合、「プロドラッグ」は、本発明の方法において有用な任意の化合物であって、毒性産物に変換され得る化合物を意味する。プロドラッグは、本発明の方法において、自殺遺伝子の遺伝子産物によって毒性産物に変換される。このようなプロドラッグの代表例は、ＨＳＶチミジンキナーゼによって毒性化合物にインビボで変換されるガンシクロビルである。続いて、ガンシクロビル誘導体は、腫瘍細胞に対して毒性である。プロドラッグの他の代表例としては、アシクロビル、ＦＩＡＵ［１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル］、ＶＺＶ−ＴＫのための６−メトキシプリンアラビノシド、シトシンデアミナーゼのための５−フルオロシトシンが挙げられる。

１つの好ましい自殺遺伝子システムは、抗ＣＤ２０ ｍＡｂリツキシマブ、特にＱＢｅｎ１０によって認識される抗原モチーフを含む組換え抗原ポリペプチド、例えば国際公開第２０１３１５３３９１号に記載されているいわゆるＲＱＲ８ポリペプチドを用いる。次いで、必要であれば、許可された抗体医薬のリツキシマブを細胞枯渇に使用し得る。

一実施形態では、本発明は、同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞であって、複数の薬剤耐性遺伝子を発現しており、または複数の薬物感受性遺伝子が不活性化されており、自殺遺伝子、好ましくはＲＱＲ８が前記細胞の破壊を可能にする同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を提供する。

−自殺遺伝子発現は、例えば、ヒト細胞に適合された、Ｃｅｎｌｉｖｒｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１０）１７：，１４−２５などのようにドキシサイクリンによって誘導可能であり得る。

−本発明は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ−Ｔ細胞であって、配列番号：５０または配列番号：５６を含むポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該自殺ポリペプチドが、ＣＡＲ−Ｔ細胞の表面において発現される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ−Ｔ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、（配列番号：６０）に示されているアミノ酸配列を含む。

−好ましい一実施形態では、自殺遺伝子、特にＲＱＲ８遺伝子は、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞に導入される。例えば、国際公開第２０１３１５３３９１号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

クロファラビン耐性抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現免疫細胞
本発明は、クロファラビンなどの薬物に対して耐性の治療用ＴＣＲ欠損Ｔ細胞の製造を包含する。それらは、先に説明されているように、ｄＣＫ遺伝子の不活性化によって得られ得る。好ましい実施形態によれば、Ｔ細胞は、上記のようにｄＣＫ遺伝子およびＴＣＲ遺伝子の不活性化を組み合わせることによって、化学療法耐性および低同種性にされている。

したがって、本発明は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現細胞（特に、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞）であって、ＣＡＲが、（場合によりヒト化された配列番号：５０または配列番号：５６を含む）ＢＣ３０またはＢＣ５０に由来し、ｄＣＫ遺伝子が不活性化されている抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現細胞（特に、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞）を提供する。

薬剤耐性同種ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するためのＢＣＭＡ＋／ｌｕｃ＋薬剤耐性Ｈ９２９細胞
本発明はまた、ＣＡＲ Ｔ細胞に特異的な表面受容体および耐性遺伝子の両方を発現する標的細胞を製造するための方法を包含する。これらの標的細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するために特に有用である。これらの細胞は、臨床関連用量のクロファラビンに対して容易に耐性であり、ルシフェラーゼ活性を有する。この特徴の組み合わせは、マウスモデルにおいてそれらをインビボで追跡（ｔｒａｋｉｎｇ）することを可能にし、または必要であればそれらを破壊する。

より具体的には、それらは、クロファラビンまたは他のＰＮＡの存在下で、マウスの薬剤耐性Ｔ細胞の細胞傷害性特性を評価するために使用され得る。クロファラビン耐性Ｈ９２９細胞は、薬剤耐性Ｂ細胞悪性腫瘍を有する導入療法から再発した急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）患者の生理学的状態を模倣する。したがって、薬剤耐性ＣＡＲ Ｔ細胞の信頼性および細胞傷害性を評価するために、これらの細胞は非常に興味深い。好ましくは、これらの標的細胞は、ＢＣＭＡ＋ルシフェラーゼ＋Ｈ９２９細胞である。

単離された細胞
本発明は、本発明のＣＡＲを発現する単離された細胞であって、ＢＣＭＡに結合する単離された細胞に関する。したがって、本発明は、単離された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現細胞に関する。特定の実施形態では、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現細胞は、少なくとも１つの薬物に対して耐性であり、自殺遺伝子を持ち、および／またはＴ細胞受容体成分をコードする少なくとも１つの破壊された遺伝子を含む。

好ましい実施形態では、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも１つの薬剤耐性遺伝子、好ましくはｂｌｅ遺伝子、またはｍｃｒＡ遺伝子、または突然変異体ＤＨＦＲ、突然変異体ＩＭＰＤＨ２、突然変異体ＡＧＴもしくは突然変異体カルシニューリンをコードする遺伝子を発現する。

別の特定の実施形態では、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、少なくとも１つの破壊された薬物感受性遺伝子、例えばｄＣＫまたはＨＰＲＴ遺伝子を含む。より具体的な実施形態では、前記単離された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＨＰＲＴ遺伝子を含み、ＤＨＦＲ突然変異体を発現する；前記単離された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＨＰＲＴ遺伝子を含み、ＩＭＰＤＨ２突然変異体を発現する；前記単離された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＨＰＲＴ遺伝子を含み、カルシニューリン突然変異体を発現する；前記単離された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＨＰＲＴ遺伝子を含み、ＡＧＴ突然変異体を発現する。

免疫療法において使用するための薬剤耐性抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞
特に、本発明は、同種ＴＣＲ ＫＯ Ｔ細胞、特にＴＣＲ ＫＯ同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞、好ましくはＢＣ３０またはＢＣ５０由来のｓｃｆｖと８０％〜１００％の同一性を有するペプチドを含むＴＣＲ ＫＯ同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞に関し、ＢＣ３０またはＢＣ５０由来のｓｃｆｖと８０％〜１００％の同一性を有するペプチドを含む前記同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、より具体的には薬剤耐性であり、免疫療法に特に適切である。

好ましい実施形態では、前記ＴＣＲ ＫＯ同種抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、配列番号：５０または５６と８０％〜１００％の同一性を有するペプチドを含み、より具体的には薬剤耐性であり、免疫療法に特に適切である。

一実施形態では、本発明は、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現細胞を含む組成物、本発明の前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む前記組成物を提供し、好ましくは、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号：５０または配列番号：５６であり、好ましくはヒト化されており、抗癌または抗炎症性疾患化学療法として記載されている少なくとも１つの薬物である。

薬剤耐性は、薬物感受性遺伝子の不活性化によって、または薬剤耐性遺伝子の発現によって付与され得る。本発明に適切な薬物のいくつかの例は、化学療法、例えばメルファラン、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ−１６）、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、リポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））、コルチコステロイド、例えばデキサメタゾンおよびプレドニゾンである。

サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））、レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））、ポマリドマイド（Ｐｏｍａｌｙｓｔ（登録商標））などの免疫調節剤
ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、カーフィルゾミブ（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（登録商標））などのプロテアソーム阻害剤
パノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｋ（登録商標））などのヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤
本発明の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞と共に使用される併用薬物の例は、以下のものであり得る：
−サリドマイドまたはボルテゾミブの有無にかかわらず、メルファランおよびプレドニゾン（ＭＰ）、
−ビンクリスチン、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）およびデキサメタゾン、
−サリドマイド（またはレナリドマイド）およびデキサメタゾン、
−ボルテゾミブ、ドキソルビシンおよびデキサメタゾン、
−ボルテゾミブ、デキサメタゾンおよびサリドマイド（またはレナリドマイド）、
−リポソームドキソルビシン、ビンクリスチン、デキサメタゾン、
−カーフィルゾミブ、レナリドマイドおよびデキサメタゾン、
−デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシドおよびシスプラチン（ＤＣＥＰと称される）、
−ボルテゾミブの有無にかかわらず、デキサメタゾン、サリドマイド、シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミドおよびエトポシド（ＤＴ−ＰＡＣＥと称される）、
−パノビノスタット、ボルテゾミブおよびデキサメタゾン。

一態様では、本発明は、クロロファラビンまたはフルダラビンなどのプリンヌクレオチド類似体（ＰＮＡ）に対して耐性にするように免疫細胞を操作するための方法を提供し、それらは、これらの従来の化学療法または化学療法の組み合わせで前処置された患者における癌免疫療法処置において使用され得る。

薬剤耐性は、ｄＣＫおよび／またはＨＰＲＴ遺伝子などの薬物に対する細胞の感受性に関与する１つ以上の遺伝子（薬物感受性遺伝子）を不活性化することによって、Ｔ細胞に付与され得る。

別の態様によれば、薬剤耐性は、薬剤耐性遺伝子を発現させることによって、抗ＢＣＭＡ Ｔ細胞に付与され得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２）、カルシニューリンまたはメチルグアニントランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）などのいくつかの遺伝子の変異体対立遺伝子は、本発明にしたがって、薬剤耐性を細胞に付与することが確認されている。

例えば、ＣＤ５２およびグルココルチコイド受容体（ＧＲ）（これらは、キャンパス（アレムツズマブ）またはリツキシマブおよびグルココルチコイド処置の薬物標的である）を不活性化して、細胞をこれらの処置に対して耐性にし、特異的ＢＣＭＡ ＣＡＲを持たない患者自身のＴ細胞に対する競争優位性をそれらに与え得る。また、ＣＤ３遺伝子の発現を抑制または低減して、テプリズマブ（これは、別の免疫抑制薬である）に対する耐性を付与し得る。また、本発明にしたがって、ＨＰＲＴの発現を抑制または低減して、６−チオグアニン（特に多発性骨髄腫の処置のための化学療法において一般的に使用される細胞増殖抑制剤）に対する耐性を付与し得る。

本発明のさらなる態様によれば、免疫細胞は、以下のＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１（ｏｒｂｌｉｍｐ１）、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３から選択される遺伝子などのＴ細胞活性化調節因子として作用する「免疫チェックポイント」として作用するタンパク質をコードする遺伝子を不活性化することによって、それらをより活性にし、または枯渇を制限するようにさらに操作され得、好ましくは、前記遺伝子は、ＰＤＣＤ１またはＣＴＬＡ−４である。発現が低減または抑制され得る遺伝子の例は、表９に示されている。

一実施形態では、前記遺伝子は、ベータ２ミクログロブリンタンパク質をコードするＴ細胞活性化調節因子として作用する遺伝子である。

本発明のさらなる態様によれば、本発明の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ免疫細胞は、薬物、特に癌（特に、ＡＭＬなどのＢＣＭＡ発現細胞媒介性癌）に対する化学療法中に使用される薬物に対してそれらを耐性にするようにさらに操作され得る。これは、前記薬物に対する耐性を付与する遺伝子を導入することによって達成され得る。この同遺伝子は、以前に記載されているように、遺伝子誘導性阻害／発現系を使用することによって、オンおよびオフされ得る（Ｇａｒｃｉａ ＥＬ，Ｍｉｌｌｓ ＡＡ（２００２）Ｇｅｔｔｉｎｇ ａｒｏｕｎｄ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｃｉｓｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １３：１５１−８，Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ Ｍ（２００１）Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２：７４３−５５；Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｌ，Ｈｅｎｎｅｒｉｃｉ Ｔ，Ｋｉｒｌｙ Ｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｓｋｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｏｒ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １３４：ｅ１６；Ｓｃｈｗｅｎｋ Ｆ，Ｋｕｈｎ Ｒ，Ａｎｇｒａｎｄ ＰＯ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ａｎｄ ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６：１４２７−３２。

したがって、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現薬剤耐性免疫細胞であって、（ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の１つ以上の成分を発現する少なくとも１つの遺伝子が不活性化されており、（ｉｉ）薬剤耐性を付与する少なくとも１つの遺伝子が導入されており、または前記薬物に対する感受性を付与する遺伝子が欠失もしくは突然変異されて不活性化されており、（ｉｉｉ）場合により、表９に開示されている遺伝子から選択される別の遺伝子が不活性化されている抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現薬剤耐性免疫細胞が本発明の目的である。

本発明は、本発明の方法によって入手可能な単離された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ−免疫細胞または細胞株、より具体的には、本明細書に記載されるタンパク質、ポリペプチド、対立遺伝子変異体、改変もしくは欠失遺伝子またはベクターのいずれかを含む単離された細胞を包含する。

本発明の免疫細胞または細胞株は、外因性組換えポリヌクレオチド、特にＣＡＲもしくは自殺遺伝子をさらに含み得、またはそれらは、理想的に「既製の」製品のような治療用製品としての効率に寄与するチェックポイントタンパク質もしくはそのリガンドをコードする改変もしくは欠失遺伝子を含み得る。別の態様では、本発明は、上記方法によって入手可能な少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｃｅ）人工免疫細胞を投与することによって、患者における癌を処置または予防するための方法に関する。

送達方法
上記異なる方法は、ＣＡＲを細胞に導入することを含む。非限定的な例として、前記ＣＡＲは、１つのプラスミドベクターによってコードされる導入遺伝子として導入され得る。前記プラスミドベクターはまた、前記ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーを含有し得る。

ポリペプチドは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、前記ポリペプチドは、細胞外で生産され、次いで、細胞に導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を非限定的な例として含む。前記ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって細胞に導入され得る。例えば、一過性形質転換法としては、例えば、微量注入、エレクトロポレーションまたは微粒子銃が挙げられる。前記ポリヌクレオチドは、細胞における発現を考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含められ得る。

人工免疫細胞
本発明は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法であって、本発明のＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはベクターをエクスビボで前記免疫細胞に導入することを含む方法を包含する。免疫療法のための免疫細胞を調製する方法は、国際公開第２０１４／１３０６３５号、国際公開第２０１３１７６９１６号、国際公開第２０１３１７６９１５号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

同様に、人工免疫細胞を調製するための可能な個々の工程は、国際公開第２０１４／０３９５２３号、国際公開第２０１４／１８４７４１号、国際公開第２０１４／１９１１２８号、国際公開第２０１４／１８４７４４号および国際公開第２０１４／１８４１４３号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明はまた、細胞を操作する前記方法によって得られやすい単離された細胞または細胞株に関する。特に、前記単離された細胞は、少なくとも１つの上記ＣＡＲを含む。別の実施形態では、前記単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を含む。特に、前記単離された細胞は、ＣＡＲをコードする外因性のポリヌクレオチド配列を含む。本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖する。

以前に記載されている方法のいずれか１つによって得られる単離された免疫細胞、好ましくはＴ細胞も、本発明の範囲内に包含される。前記免疫細胞は、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞を指す。本発明の前記免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。前記単離された細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群より選択されるＴ細胞であり得る。別の実施形態では、前記細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して被験体から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から得られ得る。本発明の特定の実施形態では、当業者に入手可能であり公知である多数のＴ細胞株が使用され得る。別の実施形態では、前記細胞は、健常ドナー、癌を有すると診断された患者、または感染を有すると診断された患者に由来し得る。別の実施形態では、前記細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。以前に記載されている方法による形質転換Ｔ細胞から得られる細胞株も、本発明の範囲内に包含される。免疫抑制処置に対して耐性であり、以前の方法によって得られやすい改変細胞は、本発明の範囲内に包含される。

好ましい実施形態として、本発明は、患者への同種移植のための、上記ＢＣＭＡ ＣＡＲを持つＴ細胞またはＴ細胞集団であって、機能的ＴＣＲを発現せず、ＢＣＭＡ陽性細胞に対して反応性のＴ細胞またはＴ細胞集団を提供する。

より好ましい実施形態として、本発明は、患者への同種移植のための、上記ＢＣＭＡ ＣＡＲを持つＴ細胞またはＴ細胞集団であって、ＢＣＭＡ発現癌細胞の処置に使用される少なくとも１つの薬物に対してさらに耐性のＴ細胞またはＴ細胞集団、および／またはＲＱＲ８などの自殺遺伝子を提供する。

一実施形態では、本発明は、配列番号：４８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む上記ＢＣＭＡ ＣＡＲを持つＴ細胞またはＴ細胞集団を提供する。

好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：５０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む上記ＢＣＭＡ ＣＡＲを持つＴ細胞またはＴ細胞集団を提供する。

一実施形態では、本発明は、配列番号：５２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む上記ＢＣＭＡ ＣＡＲを持つＴ細胞またはＴ細胞集団を提供する。

一実施形態では、本発明は、配列番号：５４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む上記ＢＣＭＡ ＣＡＲを持つＴ細胞またはＴ細胞集団を提供する。

好ましい一実施形態では、一実施形態では、本発明は、配列番号：５６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むＢＣＭＡ ＣＡＲを持つ上記Ｔ細胞またはＴ細胞集団を提供する。

一実施形態では、本発明は、配列番号：５８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む上記ＢＣＭＡ ＣＡＲを持つＴ細胞またはＴ細胞集団を提供する。

より好ましい実施形態では、本発明は、配列番号：５０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含み、または配列番号：５６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む上記ＢＣＭＡ ＣＡＲを持つＴ細胞またはＴ細胞集団を提供する。

Ｔ細胞の活性化および増大
本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖するが、本発明の免疫細胞、特に、Ｔ細胞は、Ｔ細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；米国特許第６，５３４，０５５号；米国特許第６，９０５，６８０号；米国特許第６，６９２，９６４号；米国特許第５，８５８，３５８号；米国特許第６，８８７，４６６号；米国特許第６，９０５，６８１号；米国特許第７，１４４，５７５号；米国特許第７，０６７，３１８号；米国特許第７，１７２，８６９号；米国特許第７，２３２，５６６号；米国特許第７，１７５，８４３号；米国特許第５，８８３，２２３号；米国特許第６，９０５，８７４号；米国特許第６，７９７，５１４号；米国特許第６，８６７，０４１号および；米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を一般に使用して、さらに活性化させ増大させることができる。Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで増大させることができる。

一般に、本発明のＴ細胞は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３ ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激してＴ細胞のための活性化シグナルを作出する薬剤との接触によって増大する。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの分裂促進性レクチンなどの化学物質が、Ｔ細胞のための活性化シグナルを作出するために使用され得る。

非限定的な例として、Ｔ細胞集団は、例えば、表面に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗ＣＤ２抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、インビトロで刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件の下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。Ｔ細胞培養のために適切な条件としては、血清（例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ｇ、１Ｌ−４、１Ｌ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、−１０、−２、１Ｌ−１５、ＴＧＦｐおよびＴＮＦ−、または当業者に公知の細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存可能性のために必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ ５（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。細胞の増殖のための他の添加剤としては、限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｉ）などの還元剤が挙げられる。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが追加されているか、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセットおよび／もしくはＴ細胞の増殖および増大のために十分な量のサイトカインが補充されているＲＰＭＩ １６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ １およびＸ−Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養にのみ含まれ、被験体へ注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％Ｃ０２）で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。

別の特定の実施形態では、前記細胞は、組織または細胞との共培養によって増大させ得る。前記細胞はまた、前記細胞を被験体に投与した後、インビボで、例えば、被験体の血液中で増大させ得る。

治療用途
別の実施形態では、以前に記載されているような異なる方法によって得られる単離された細胞または前記単離された細胞に由来する細胞株は、医薬として使用され得る。別の実施形態では、前記医薬は、それを必要とする患者において、癌を処置するために、特に、Ｂ細胞リンパ腫およびＢ細胞白血病の処置のために使用され得る。別の実施形態では、本発明の前記単離された細胞または前記単離された細胞に由来する細胞株は、それを必要とする患者における癌の処置のための医薬の製造において使用され得る。

別の態様では、本発明は、それを必要とする患者を処置するための方法であって、以下の工程：
（ａ）以前に記載されている方法のいずれか１つによって入手可能な免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記形質転換免疫細胞を前記患者に投与すること
の少なくとも１つを含む方法に依拠する。

一実施形態では、本発明の前記Ｔ細胞は、頑強なインビボＴ細胞増大を受けることができ、より長時間にわたり、存続することができる。

前記処置は、寛解的、治癒的または予防的であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部のいずれかであり得る。自己は、患者を処置するために使用される細胞、細胞株または細胞の集団が、前記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性ドナーに起因することを意味する。同種は、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、前記患者ではなく、ドナーに起因することを意味する。

開示される方法によって使用され得る細胞は、先のセクションに記載されている。
したがって、一態様では、本発明は、医薬として使用するための本発明の人工免疫細胞であって、本発明の特異的ＢＣＭＡ ＣＡＲを含む本発明の人工免疫細胞を提供する。

好ましい実施形態では、本発明は、病的症状の予防または処置のための医薬として使用するための本発明の人工免疫細胞であって、本発明の特異的ＢＣＭＡ ＣＡＲを含む本発明の人工免疫細胞を提供する。

本発明では、前記病的症状は、ＢＣＭＡまたはＢＣＭＡ発現細胞によって直接的または間接的に誘導される。

一実施形態では、前記病的症状は、炎症性疾患または自己免疫疾患である。
別の実施形態では、前記病的症状は、前悪性または悪性癌症状である。

本発明の処置は、ＢＣＭＡ発現細胞、特にＢＣＭＡ発現細胞の過剰を特徴とする前悪性または悪性癌症状（癌）と診断された患者を処置するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、癌は、多発性骨髄腫、悪性形質細胞腫瘍、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優性ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔原発（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫、Ｔ細胞／組織球リッチ大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、皮膚原発びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（足型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、炎症に関連するびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に発生する大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との中間の特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的なホジキンリンパ腫との中間の特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、または別のＢ細胞関連リンパ腫である。

好ましくは、本発明の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を使用して処置される病的症状は、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性硬化症および慢性関節リウマチ、Ｂ細胞悪性腫瘍、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）である。

より好ましくは、本発明の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を使用して処置される病的症状は、再発性または難治性のＢ細胞悪性腫瘍、再発性または難治性の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、再発性または難治性の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および再発性または難治性の多発性骨髄腫（ＭＭ）である。

いくつかの実施形態では、本発明の単離された細胞、または該単離された細胞由来の細胞株は、それを必要とする患者における上記症状、特に病的症状の処置のための医薬の製造において使用され得る。

患者を処置するための方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、該方法は、本発明の免疫細胞をそれを必要とする患者に提供する工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、本発明のＢＣＭＡ ＣＡＲ発現免疫細胞をそれを必要とする患者に投与する工程を含む。

このような症状は、白血病または悪性リンパ増殖性障害などの血液癌に見られる。
白血病は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病および骨髄異形成症候群であり得る。

リンパ増殖性障害は、リンパ腫、特に多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫および濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）であり得る。

処置され得る癌は、血液腫瘍、限定されないが、前Ｂ ＡＬＬ（小児適応症）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などを含む非固形腫瘍を含み得る。本発明のＣＡＲで処置すべき癌の種類としては、限定されないが、白血病またはリンパ系悪性腫瘍が挙げられる。成人の腫瘍／癌および小児の腫瘍／癌も含まれる。

成人の腫瘍／癌および小児の腫瘍／癌は、固形癌、例えば尿路上皮膀胱癌および扁平上皮癌、再発性型または難治性型のこれらの癌であり得る。

好ましい実施形態では、本発明の単離された細胞、または該単離された細胞由来の細胞株は、癌転移を予防または改変するために使用され得る。本発明の人工免疫細胞による処置は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法および放射線療法からなる群より選択される１つ以上の抗癌療法と組み合わせられ得る。

本発明の人工免疫細胞による処置は、以下の薬剤、アルキル化剤、コルチコステロイド、プラチナ薬、プリン類似体、代謝拮抗物質および別の化学療法薬の１つ以上の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲと組み合わせられ得る。

アルキル化剤としては、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、クロラムブシル、ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））、イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））が挙げられる。

コルチコステロイドとしては、プレドニゾン、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））が挙げられ、プラチナ薬としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンが挙げられる。

プリン類似体としては、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、ペントスタチン（Ｎｉｐｅｎｔ（登録商標））、クラドリビン（２−ＣｄＡ、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））が挙げられる。

代謝拮抗物質としては、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、メトトレキサート、プララトレキサート（Ｆｏｌｏｔｙｎ（登録商標））が挙げられる。

化学療法薬としては、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ミトキサントロン、エトポシド（ＶＰ−１６）、ブレオマイシンが挙げられる。

本発明の特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現細胞は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（ＶＰ１６）、三酸化ヒ素、トランスレチノイン酸、メクロレタミン、プロカルバジン、クロラムブシルおよびそれらの組み合わせから選択される薬物と併せて（例えば、前に、同時にまたは後に）患者に投与される。これらの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現細胞と併せて投与される特定の薬物または薬物の組み合わせに対して耐性であり得る。

本発明の他の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現細胞は、シタラビン、アントラサイクリン、６−チオグアニン、ヒドロキシウレア、プレドニゾンおよびそれらの組み合わせから選択される薬物と併せて患者に投与され、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現細胞は、シタラビン、アントラサイクリン、６−チオグアニン、ヒドロキシウレア、プレドニゾンから選択される少なくとも１つの薬物に対して耐性である。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記処置は、免疫抑制処置を受けている患者に施すことができる。実際、本発明は、好ましくは、このような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化のため、少なくとも１つの免疫抑制剤に対して耐性にされた細胞または細胞の集団に依拠する。この態様では、免疫抑制処置は、患者における本発明のＴ細胞の選択および増大を支援するべきである。

本発明の細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込みまたは移植を含む、任意の便利な様式で実施され得る。本明細書に記載される組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者に投与され得る。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。

細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む、体重１ｋｇ当たり１０^４〜１０^９個の細胞、好ましくは、体重１ｋｇ当たり１０^５〜１０^６個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の実施形態では、前記有効量の細胞が、単回投与される。別の実施形態では、前記有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量は、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。

別の実施形態では、前記有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。前記投与は、静脈内投与であり得る。前記投与は、腫瘍内への注射によって直接行われ得る。

本発明の特定の実施形態では、細胞は、限定されないが、抗ウイルス治療、シドホビルおよびインターロイキン２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても公知）などの薬剤による処置、またはＭＳ患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはＰＭＬ患者のための他の処置を含む多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時にまたは後に）患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、もしくは他の抗体治療などの他の免疫除去剤、シトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｙａ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｌｉｕ，Ａｌｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｂｉｅｒｅｒ，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３）。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（ＸＲＴ）、シクロホスファミドなどの化学療法剤、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用したＴ細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時にまたは後に）患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去治療の後に投与される。例えば、一実施形態では、被験体は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。特定の実施形態では、移植の後、被験体は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態では、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。

他の定義
−他に特記されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「少なくとも１つ」は、交換可能に使用され、１つ以上を意味する。ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、１文字コードによって本明細書において表記され、例えば、ＱはＧｌｎ、すなわちグルタミン残基を意味し、ＲはＡｒｇ、すなわちアルギニン残基を意味し、ＤはＡｓｐ、すなわちアスパラギン酸残基を意味する。

−アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への交換を意味し、例えば、ペプチド配列内のアルギニン残基のグルタミン残基への交換は、アミノ酸置換である。

−ヌクレオチドは以下のように表記される：１文字コードがヌクレオシドの塩基を表記するために使用される：ａはアデニンであり、ｔはチミンであり、ｃはシトシンであり、ｇはグアニンである。縮重ヌクレオチドのため、ｒはｇまたはａ（プリンヌクレオチド）を表し、ｋはｇまたはｔを表し、ｓはｇまたはｃを表し、ｗはａまたはｔを表し、ｍはａまたはｃを表し、ｙはｔまたはｃ（ピリミジンヌクレオチド）を表し、ｄはｇ、ａまたはｔを表し、ｖはｇ、ａまたはｃを表し、ｂはｇ、ｔまたはｃを表し、ｈはａ、ｔまたはｃを表し、ｎはｇ、ａ、ｔまたはｃを表す。

−本明細書で使用される場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などのヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片を指す。核酸分子は、（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）または両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。改変ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾としては、例えば、１つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基への交換が挙げられ、または糖がエーテルもしくはエステルとして官能化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体などの立体的かつ電子的に類似の構造に交換されてもよい。塩基部分の改変の例としては、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこのような連結の類似体によって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。

−キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するため、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性を、Ｔ細胞受容体を活性化する細胞内ドメインと組み合わせた分子を意図する。一般に、ＣＡＲは、細胞外一本鎖抗体（ｓｃＦｖＦｃ）がＴ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合したもの（ｓｃＦｖＦｃ：ζ）からなり、Ｔ細胞において発現された時に、モノクローナル抗体の特異性に基づき、抗原認識を再指向させる能力を有する。本発明において使用されるＣＡＲの一例は、ＢＣＭＡ抗原に対するＣＡＲであり、非限定的な例として、アミノ酸配列：配列番号：１９〜４２を含み得る。好ましくは、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号：４８〜配列番号：５９であり、より好ましくは、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号：４８〜配列番号：５９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。

−Ｖ１構造は、
−ＣＤ８アルファシグナルペプチド、
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）、
−Ｆｃガンマ（□）ＲＩＩＩアルファ（□）由来のヒンジ
−ＣＤ８アルファ（□）由来の膜貫通ドメイン
−４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータ（□）由来の細胞質ドメイン
を併せ持つ分子を意図する。

−Ｖ２構造は、膜貫通ドメインが４１ＢＢに由来するＶ１構造の分子を意図する。
Ｖ３構造は、
−ＣＤ８アルファシグナルペプチド、
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）、
−ＣＤ８アルファ（□）由来のヒンジ
−ＣＤ８アルファ（□）由来の膜貫通ドメイン
−４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータ（□）由来の細胞質ドメイン
を併せ持つ分子を意図する。

−Ｖ４構造は、膜貫通ドメインが４１ＢＢに由来するＶ３構造の分子を意図する。
−Ｖ５構造は、
−ＣＤ８アルファシグナルペプチド、
−リンカーによってＶＬドメインと隔てられたＶＨドメイン（前記ＶＨおよびＶＬは、ＢＣＭＡに対する結合に寄与する）、
−ＩｇＧ１（□）由来のヒンジ
−ＣＤ８アルファ（□）由来の膜貫通ドメイン
−４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータ（□）由来の細胞質ドメイン
を併せ持つ分子を意図する。

−Ｖ６構造は、膜貫通ドメインが４１ＢＢに由来するＶ５構造の分子を意図する。
本発明のＣＡＲ構造は、図２に示されている。

「化学療法」という用語は、化学物質、特に癌に対して使用されるものを使用する任意の治療を指す。

−「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、好ましくは、ＤＮＡ分子の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる任意の野生型酵素または変異体酵素を指す。エンドヌクレアーゼは、その配列に関係なくＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を切断するのではなく、「標的配列」または「標的部位」とさらに称される特定のポリヌクレオチド配列においてＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を認識し切断する。エンドヌクレアーゼは、典型的には、１２塩基対（ｂｐ）長より長い、より好ましくは、１４〜５５ｂｐのポリヌクレオチド認識部位を有する時、低頻度切断エンドヌクレアーゼとして分類され得る。低頻度切断エンドヌクレアーゼは、定義された場所においてＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することによって、ＨＲを有意に増加させる（Ｐｅｒｒｉｎ，Ｂｕｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ．１９９３；Ｒｏｕｅｔ，Ｓｍｉｈ ｅｔ ａｌ．１９９４；Ｃｈｏｕｌｉｋａ，Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９５；Ｐｉｎｇｏｕｄ ａｎｄ Ｓｉｌｖａ ２００７）。低頻度切断エンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ（Ｐａｑｕｅｓ ａｎｄ Ｄｕｃｈａｔｅａｕ ２００７）、操作したジンクフィンガードメインとＦｏｋｌなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合に起因するキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（Ｐｏｒｔｅｕｓ ａｎｄ Ｃａｒｒｏｌｌ ２００５）、ＣＲＩＳＰＲ系に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｊｉｎｅｋ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｃｏｎｇ，Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｍａｌｉ，Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）または化学的エンドヌクレアーゼ（Ｅｉｓｅｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｌａｎｉｏ ｅｔ ａｌ．２００５；Ａｒｉｍｏｎｄｏ，Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．２００６）であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいては、化学的なまたはペプチド性の切断剤が、核酸のポリマーまたは特定の標的配列を認識する他のＤＮＡのいずれかにコンジュゲートされ、それにより、切断活性を特定の配列へターゲティングする。化学的エンドヌクレアーゼはまた、特定のＤＮＡ配列に結合することが公知の、オルトフェナントロリン、ＤＮＡ切断分子および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）のコンジュゲートなどの合成ヌクレアーゼを包含する（Ｋａｌｉｓｈ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ ２００５）。このような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明の「エンドヌクレアーゼ」という用語に含まれる。

−「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、典型的には、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する核酸結合ドメインおよび核酸標的配列を切断する１つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を意図する。触媒ドメインは、好ましくは、ヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えば、Ｉ−Ｔｅｖｌ、ＣｏｌＥ７、ＮｕｃＡ、Ｆｏｋ−Ｉなどのエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、例えば、Ｉ−ＣｒｅｌおよびＩ−Ｏｎｕｌまたはそれらの機能的変異体などのメガヌクレアーゼに融合され得る。より好ましい実施形態では、前記ヌクレアーゼは、単量体ＴＡＬＥヌクレアーゼである。単量体ＴＡＬＥヌクレアーゼは、国際公開第２０１２１３８９２７号に記載されている、人工ＴＡＬリピートとＩ−Ｔｅｖｌの触媒ドメインとの融合などの、特異的な認識および切断のために二量体化を必要としないＴＡＬＥヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、複数の反復配列を含む、細菌種ザントモナス由来のタンパク質であり、各リピートは、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に対して特異的な２残基（ＲＶＤ）を位置１２および１３に含む。類似のモジュラー１塩基対１塩基核酸結合特性を有する結合ドメイン（ＭＢＢＢＤ）も、異なる細菌種において出願人によって最近発見された新たなモジュラータンパク質に由来し得る。新たなモジュラータンパク質は、ＴＡＬリピートより多くの配列可変性を示すという利点を有する。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴを認識するためのＮＳ、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、Ｔを認識するためのＹＧ、Ａを認識するためのＴＬ、ＡまたはＧを認識するためのＶＴおよびＡを認識するためのＳＷである。別の実施形態では、重要なアミノ酸１２および１３は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣおよびＧに対する特異性をモジュレートするため、特に、この特異性を増強するため、他のアミノ酸残基に突然変異させ得る。ＴＡＬＥヌクレアーゼは既に記載されており、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変を刺激するために使用されている（Ｂｏｃｈ，Ｓｃｈｏｌｚｅ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ ２００９；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｌｉ，Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）。特注のＴＡＬヌクレアーゼは、商標ＴＡＬＥＮ（商標）の下で市販されている（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ，８ ｒｕｅ ｄｅ ｌａ Ｃｒｏｉｘ Ｊａｒｒｙ，７５０１３ Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）。

本発明の低頻度切断エンドヌクレアーゼはまた、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり得る。最近、ＩＩ型原核生物ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）適応免疫系（概説については（Ｓｏｒｅｋ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．２０１３）を参照のこと）から、ＲＮＡガイド（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｊｉｎｅｋ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｃｏｎｇ，Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｍａｌｉ，Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）に基づき、新しいゲノム操作ツールが開発された。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系は、細菌において最初に発見され、外来ＤＮＡ、ウイルスまたはプラスミドに対する防御として機能する。ＣＲＩＳＰＲによって媒介されるゲノム操作は、まず、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短い配列モチーフがしばしば隣接している標的配列の選択によって進行する。標的配列選択の後、この標的配列に相補的な特異的なｃｒＲＮＡが操作される。ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型系において必要とされるトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡと対合し、供給されたＣａｓ９タンパク質に結合する。Ｃａｓ９は、ｔｒａｃＲＮＡのｃＲＮＡとの塩基対合を容易にする分子アンカーとして作用する（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１１）。この三元複合体において、二重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ構造は、同族標的配列にエンドヌクレアーゼＣａｓ９を指向させるガイドＲＮＡとして作用する。Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体による標的認識は、標的配列とｃｒＲＮＡとの間の相同性について標的配列を走査することによって開始される。標的配列−ｃｒＲＮＡ相補性に加えて、ＤＮＡターゲティングは、プロトスペーサーに隣接した短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ−ＰＡＭ）の存在を必要とする。その後、二重ＲＮＡと標的配列との間の対合に続き、Ｃａｓ９が、ＰＡＭモチーフの３塩基上流に平滑末端二本鎖切断を導入する（Ｇａｒｎｅａｕ，Ｄｕｐｕｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１０）。

低頻度切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも公知のホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当技術分野で周知である（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖の切断を生成する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、１２〜４５塩基対（ｂｐ）長、一般に、１４〜４０ｂｐ長の範囲のＤＮＡ標的部位を認識する。本発明のホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼまたはＧＩＹ−ＹＩＧエンドヌクレアーゼに相当し得る。本発明の好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−Ｃｒｅｌ変異体であり得る。

−「送達ベクター」または「複数の送達ベクター」は、本発明において必要とされる薬剤／化学物質および分子（タンパク質または核酸）を、細胞と接触させるため（すなわち、「接触」）、または細胞もしくは細胞内区画へ送達するため（すなわち、「導入」）、本発明において使用され得る送達ベクターを意図する。それらとしては、限定されないが、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、微小気泡（超音波造影剤）、ナノ粒子、乳濁液または他の適切な移入ベクターが挙げられる。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子（遺伝子、タンパク質）またはプラスミド、Ｄｉａｔｏｓによって開発されたペプチドなどの他のベクターの送達を可能にする。これらのケースにおいて、送達ベクターは分子担体である。「送達ベクター」または「複数の送達ベクター」はまた、トランスフェクションを実施するための送達方法を意図する。

−「ベクター」または「複数のベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。本発明における「ベクター」は、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクターまたは染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子を含む。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製が可能なもの（エピソームベクター）および／または発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適切なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。

ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリアポックス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルスおよび肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが挙げられる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。

−「レンチウイルスベクター」は、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、通常、３つ（パッケージング、エンベロープおよび移入）またはそれ以上のプラスミドを産生細胞に一過性トランスフェクトした後、生成される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスＲＮＡが、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、感染細胞のＤＮＡへのウイルス組み込みのための基質となる二本鎖の直鎖状ウイルスＤＮＡである。「組み込みレンチウイルスベクター（またはＬＶ）」は、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るこのようなベクターを意味する。反対に、「非組み込みレンチウイルスベクター（またはＮＩＬＶ）」は、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。

−送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーションもしくはエレクトロポレーションなどの任意の細胞透過処理技術、またはこれらの技術の変法と併せ、または組み合わせ得る。

本明細書で使用される場合、「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術を使用して作製される抗体または抗体断片、例えば、バクテリオファージ、酵母発現系または哺乳類細胞発現系において発現される抗体または抗体断片を意味する。この用語はまた、抗体または抗体断片をコードするＤＮＡ分子の合成によって作製された抗体または抗体断片であって、該ＤＮＡ分子が、抗体もしくは抗体断片タンパク質、または抗体もしくは抗体断片を指定するアミノ酸配列を発現し、該ＤＮＡまたはアミノ酸配列が、当技術分野で周知の利用可能な組換えまたは合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである抗体または抗体断片を意味すると解釈されるべきである。細胞または複数の細胞は、インビトロ培養では、これらの生物に由来する任意の真核生物生細胞、初代細胞および細胞株を意図する。

−「初代細胞」または「複数の初代細胞」は、生体組織（すなわち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの増殖のために確立された細胞であって、集団倍化をほとんど受けていないため、連続発癌性細胞株または人工不死化細胞株と比較して、それらが由来する組織の主な機能的要素および特徴をより忠実に表す細胞を意図する。

アミノ酸は、アミノ酸のいずれか１つ、例えばアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸であり得る。

非限定的な例として、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２−ＯＳ細胞；ＮＩＨ ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；ジャーカット細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ−１０８０細胞；ＨＣＴ−１１６細胞；Ｈｕ−ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；Ｍｏｌｔ４細胞からなる群より選択され得る。

これらの細胞株はすべて、目的の遺伝子またはタンパク質を作製し、発現させ、定量し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するため、本発明の方法によって改変され得；これらのモデルは、研究および作製、ならびに非限定的な例としての化学物質、生物燃料、治療薬および農学などの様々な領域において、目的の生物活性分子をスクリーニングするためにも使用され得る。

−「突然変異」は、ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ、遺伝子）またはポリペプチドの配列における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個またはそれ以上までのヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図する。突然変異は、遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を与え得る。それはまた、ゲノム配列の構造またはコードされるｍＲＮＡの構造／安定性に影響を与え得る。

−「変異体」は、親分子のアミノ酸配列における少なくとも１個の残基の突然変異または交換によって得られるリピート変異体、変異体、ＤＮＡ結合変異体、ＴＡＬＥヌクレアーゼ変異体、ポリペプチド変異体を意図する。

−「機能的変異体」は、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性突然変異体を意図する；このような突然変異体は、その親のタンパク質またはタンパク質ドメインと比較して、同一の活性、または付加的な特性、またはより高いかもしくはより低い活性を有し得る。

−「同一性」は、２つの核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性を指す。同一性は、比較の目的のためにアライメントされ得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有する位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として入手可能であるＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、２つの配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載される特定のポリペプチドとの少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。他に示されない限り、類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくであろう。ＢＬＡＳＴＰが使用される時、パーセント類似性は、ＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一である高スコア配列対における全残基の数および画分を示す；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、アライメントスコアが正の値を有しており、相互に類似している残基の数および画分を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列との同一性もしくは類似性のこれらの程度または同一性もしくは類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を使用して推定され、従来の手段によって、特に、遺伝暗号を使用して、そのアミノ酸配列を逆翻訳することによって入手され得る。

−「シグナル伝達ドメイン」または「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとしては、限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ｉｇａｎｄ）（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが挙げられ得る。共刺激リガンドはまた、とりわけ、以下に限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどの、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を包含する。

「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定されないが、増殖などの、細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびトールリガンド受容体が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖および／または重要分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションをもたらすシグナルを指す。

本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。したがって、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫の感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連するものが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「被験体」または「患者」という用語は、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界のすべてのメンバーを含む。

「処置」という用語は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されないが、以下の１つ以上：新生細胞または癌性細胞の数および／もしくは増殖の減少、新生細胞の転移の阻害、ＢＣＭＡ発現腫瘍、特に尿路上皮膀胱癌および扁平上皮癌のサイズの減少、癌転移の予防もしくは変化、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、癌）の緩和、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、癌）に起因する症候の減少、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、癌）を患っている者の生活の質の向上、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、癌）を処置するために必要な他の医薬品の用量の減少、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、癌）の進行の遅延、ＢＣＭＡ関連疾患（例えば、癌）の治癒、ならびに／またはＢＣＭＡ関連疾患（例えば、癌）を有する患者の生存の延長が挙げられる。

「寛解」は、ＢＣＭＡ抗体またはＢＣＭＡ抗体コンジュゲートを投与しない場合と比較した、１つ以上の症候の軽減または改善を意味する。「寛解」はまた、症候の期間の短縮または減少を含む。上記本発明の説明は、当業者が本発明を作成および使用することが可能になるよう、本発明を作成および使用する様式および過程を提供するものであり、この可能性は、当初明細書の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために特に提供される。

本明細書において数的な限度または範囲が記述される場合、その終点が含まれる。数的な限度または範囲に含まれるすべての値および部分範囲も、明示的に記載されているかのごとく、具体的に含まれる。

上記説明は、当業者が本発明を作成および使用することを可能にするために提示され、特定の適用およびその必要条件に関して提供される。好ましい実施形態に対する様々な改変は、当業者に容易に明白になり、本明細書において定義される一般原理は、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、他の実施形態および用途に適用され得る。したがって、本発明は、示される実施形態に限定されず、本明細書に開示される原理および特徴と一致する最も広い範囲とすべきである。

一般的方法：
初代Ｔ細胞における特定の遺伝子の不活性化
初代Ｔ細胞における特定の遺伝子の不活性化は、Ｔ細胞へのＣＡＲ導入の前または後に実施され得る。

少なくとも１つの遺伝子、１つの遺伝子または２つの遺伝子は、一工程または連続工程で不活性化され得る。好ましい実施形態では、２つの遺伝子、好ましくはＴＣＲアルファ遺伝子および薬物感受性遺伝子は、一度に不活性化され得る。薬物感受性遺伝子の不活性化は、前記薬物に対する耐性を付与する。あるいは、薬剤耐性遺伝子の（過剰）発現は、前記薬物に対する耐性を付与する。

一般に、ヘテロ二量体ヌクレアーゼ、特に、標的遺伝子内のスペーサーによって分離された２つの長い配列（半標的と称される）をターゲティングするＴＡＬＥヌクレアーゼが設計および生産される。

各ＴＡＬＥヌクレアーゼ構築物は、適切な哺乳動物発現ベクターにクローニングされ得る。標的ゲノム配列を切断するＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、プロモーターの下流おいてコード配列を有するプラスミドから合成され得る。

細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズで予備活性化された精製Ｔ細胞である。細胞は、両方の半ＴＡＬＥヌクレアーゼ、特に両方の半ＴＡＬＥヌクレアーゼおよびスペーサーをコードする２つの各ｍＲＮＡでトランスフェクトされる。

細胞は、細胞増殖を測定するための可溶性抗ＣＤ２８と、細胞の活性化状態を評価するために検出される活性化マーカーＣＤ２５とで再活性化され得る。

キメラ抗原受容体
核酸−ベクター
本発明のＣＡＲをコードする酸核酸（ｍＲＮＡまたはレンチウイルスベクター）が構築される。

レンチウイルスベクターは、例えば、当技術分野で以前に記載されているように調製され得る（例えば、国際公開第２０１３１７６９１５号、国際公開第２０１３１７６９１６号または国際公開第２０１４１３０６３５号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる））。レンチウイルスベクターは、ＨＥＫ−２９３細胞においてゲノムおよびヘルパープラスミドをトランスフェクションすることによって、Ｖｅｃｔａｌｙｓ ＳＡ（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によって生産されている。

ＣＡＲ ｍＲＮＡは、Ｔ７ ｍＲＮＡポリメラーゼを使用して生産され得、トランスフェクションは、Ｃｙｔｏｐｕｌｓｅ技術を使用して行われ得る。

ＣＡＲのスクリーニングおよび選択
−初代Ｔ細胞培養
フィコール密度勾配媒質を使用して、ＥＦＳ（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）によって提供されるバフィーコートサンプルから、Ｔ細胞を精製する。ＰＢＭＣ層を回収し、市販のＴ細胞濃縮キットを使用して、Ｔ細胞を精製する。ヒトＩＬ−２およびＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ活性化剤ＣＤ３／ＣＤ２８を使用して、Ｘ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で、精製Ｔ細胞を活性化する。

ＣＡＲ ｍＲＮＡのトランスフェクション
Ｔ細胞の精製および活性化後４日目または１１日目に、異なるＣＡＲ構築物をコードするＣＡＲ ｍＲＮＡのトランスフェクションを実施する。

ＣＡＲの形質導入
組換えレンチウイルスベクターによるＴ細胞のＣＡＲ形質導入の発現を可能にする組換えレンチウイルスベクターによるＴ細胞の形質導入を、Ｔ細胞の精製／活性化の３日後に行う。様々な感染多重度（ＭＯＩ）で、特に５のＭＯＩで、形質導入を行い得る。本発明のＣＡＲが結合するタンパク質の細胞外ドメインがマウスＩｇＧ１ Ｆｃ断片（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ製）と融合したものからなる組換えタンパク質を使用して、Ｔ細胞の表面におけるＣＡＲ検出を実施する。

該タンパク質のマウスＦｃ部分をターゲティングするＰＥ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＣＡＲ分子に対するこのタンパク質の結合を検出する。

−脱顆粒アッセイ（ＣＤ１０７ａの動員）
Ｔ細胞を、本発明のＣＡＲによってターゲティングされる様々なレベルのタンパク質（ＢＣＭＡ）を発現する等量の細胞と共にインキュベートする。共培養物を少なくとも６時間維持する。細胞刺激の間、共培養の開始時に、蛍光抗ＣＤ１０７ａ抗体を追加することによって、ＣＤ１０７ａ染色を実施する。６時間のインキュベーション期間後に、細胞を、固定可能な生存色素および蛍光色素結合抗ＣＤ８で染色し、フローサイトメトリーによって分析する。ＣＤ８＋細胞間のＣＤ１０７ａ染色の平均蛍光強度シグナル（ＭＦＩ）を決定することによって、ＣＤ８＋／ＣＤ１０７ａ＋細胞の％として、脱顆粒活性を決定する。

ｍＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に、脱顆粒アッセイを行う。
−ＩＦＮガンマ放出アッセイ
ｍＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、様々なレベルのＢＣＭＡタンパク質を発現する細胞株と共に３７℃で２４時間インキュベートする。上清を回収し、細胞培養上清中のＩＦＮガンマの検出をＥＬＩＳＡアッセイによって行う。

−細胞傷害性アッセイ
同じウェルにおいて、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、標的細胞または（対照）細胞と共にインキュベートする。３７℃で４時間共培養する前に、標的細胞および対照細胞を蛍光細胞内色素（例えば、ＣＦＳＥまたはＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）で標識する。このインキュベーション期間後に、細胞を、固定可能な生存色素で標識し、フローサイトメトリーによって分析する。各細胞集団（標的細胞または対照細胞）の生存を決定し、特異的細胞溶解の％を計算する。ｍＲＮＡトランスフェクションの４８時間後に、細胞傷害性アッセイを行う。

−抗腫瘍マウスモデル
（ＣＡＲによって認識される）標的タンパク質を発現するルシフェラーゼ細胞を免疫欠損ＮＯＧマウスに静脈内（ｉｖ）注射する。場合により、ＣＡＲ Ｔ細胞の注射前に、様々な用量の抗癌処置をマウスに投与する。次いで、（腫瘍細胞株の注射の２日後または７日後のいずれかに）異なる用量の試験すべき本発明のＣＡＲ＋Ｔ細胞を、またはＣＡＲレンチウイルスベクターで形質導入しなかったＴ細胞をマウスに静脈内（ｉｖ）注射する。異なる動物における腫瘍進行を追跡するために、Ｔ細胞の注射日（Ｄ０）に、Ｔ細胞の注射後７日目、１４日目、２１日目、２８日目および４０日目に、生物発光シグナルを決定する。次いで、生存していたマウスを誘導物質で処置して、ＣＡＲ発現免疫細胞を選択的に破壊した。

本発明を一般的に説明したが、特定の具体例を参照することによって、さらなる理解を得ることができる。他に特記されない限り、前記具体例は、例示目的のために本明細書に提供されるに過ぎず、限定的なものではない。

実施例１：ＴＣＲ ＫＯ Ｔ細胞の調製
ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＴＣＲアルファ不活性化細胞の増殖
Ｔ細胞受容体アルファ定常鎖領域（ＴＲＡＣ）遺伝子内の１５ｂｐスペーサーによって隔てられた２つの１７ｂｐ長配列（半標的と称する）をターゲティングするヘテロ二量体ＴＡＬＥヌクレアーゼを設計および生産した。半標的は各々、表１０に記載されている半ＴＡＬＥヌクレアーゼのリピートによって認識される。

制限酵素消化を使用して、各ＴＡＬＥヌクレアーゼ構築物を、Ｔ７プロモーターの制御下の哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。ＴＲＡＣゲノム配列を切断するＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを、Ｔ７プロモーターから下流にコード配列を有するプラスミドから合成した。

抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズで７２時間予備活性化した精製Ｔ細胞を、両方の半ＴＲＡＣ＿Ｔ０１ ＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする２つの各ｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、同じドナー由来の異なるＴ細胞群を、前記ＢＣＭＡ ＣＡＲ（配列番号：１９〜４２）の１つをコードするレンチウイルスベクターでそれぞれ形質導入した。形質導入の２日後に、抗ＣＤ３磁気ビーズを使用して、ＣＤ３_ＮＥＧ細胞を精製し、形質導入の５日後に、細胞を可溶性抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で再活性化した。あるいは、ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現およびＴＣＲの不活性化を、適切なベクターの形質導入によって一工程で同時に実施し得る。

したがって、本発明は、増殖するＴＣＲ ＫＯ Ｔ細胞を提供する。
再活性化後に、細胞を週２回カウントすることによって、細胞増殖を最大３０日間追跡した。非形質導入細胞と比較して、特に抗ＣＤ２８で再活性化した場合、ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＴＣＲアルファ不活性化細胞における増殖の増加が観察された。

ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現ヒトＴ細胞が活性化状態を示すかを調査するために、形質導入の７日後に、活性化マーカーＣＤ２５の発現を、ＦＡＣＳによって分析する。非形質導入細胞と比較した活性化を評価するために、ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した精製細胞を、それらの表面におけるＣＤ２５発現についてアッセイした。ＣＤ２８再活性化または非再活性化条件の両方において、ＣＤ２５発現の増加が予想される。

本発明のＢＣＭＡ ＣＡＲのスクリーニング
Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１３Ｆ１２．１、ＢＣ３０およびＢＣ５０抗体由来の４つの異なるｓｃＦｖを構築および使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製し、ＢＣＭＡ＋細胞に対するそれらの脱顆粒活性をスクリーニングした。

各ＣＡＲの異なるアーキテクチャを設計し（すなわち、Ｖ１、Ｖ３およびＶ５）、ヒト初代Ｔ細胞における一過性発現によって、それらの活性を決定した。

−初代Ｔ細胞培養
フィコール密度勾配媒質（Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＥＦＳ（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）によって提供されるバフィーコートサンプルから、Ｔ細胞を精製した。ＰＢＭＣ層を回収し、市販のＴ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｔ細胞を精製した。２０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、５％ヒト血清（Ｓｅｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ活性化剤ＣＤ３／ＣＤ２８を補充したＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中、１：１のビーズ：細胞比（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、精製Ｔ細胞を活性化した。活性化後に、細胞を成長させ、２０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）および５％ヒト血清（Ｓｅｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で維持した。

−ＣＡＲ ｍＲＮＡのトランスフェクション
Ｔ細胞の精製および活性化後４日目または１１日目に、トランスフェクションを行った。５百万個の細胞を、異なるＣＡＲ構築物をコードする１５μｇのｍＲＮＡでトランスフェクトした。ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＡＲ ｍＲＮＡを生産し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。最終容量２００μｌの“Ｃｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ”（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）中、０．４ｃｍギャップキュベットにおいて、Ｃｙｔｏｐｕｌｓｅ技術を使用して、３０００Ｖ／ｃｍで０．１ｍＳパルスを２回適用し、続いて、３２５Ｖ／ｃｍで０．２ｍＳパルスを４回適用することによって、トランスフェクションを行った。細胞をＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）で直ぐに希釈し、５％ＣＯ_２、３７℃でインキュベートした。エレクトロポレーションの２時間後に、ＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製）を２０ｎｇ／ｍＬで追加した。

−脱顆粒アッセイ（ＣＤ１０７ａの動員）
９６ウェルプレート（細胞４０，０００個／ウェル）において、Ｔ細胞を、等量のＢＣＭＡタンパク質発現または非発現細胞と共にインキュベートした。最終容量１００μｌのＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で、共培養物を５％ＣＯ_２、３７℃で６時間維持した。細胞刺激の間、共培養の開始時に、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４９ｄ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）および１×Ｍｏｎｅｎｓｉｎ溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に、蛍光抗ＣＤ１０７ａ抗体（ＡＰＣ結合、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製）を追加することによって、ＣＤ１０７ａ染色を行った。６時間のインキュベーション期間後に、細胞を、固定可能な生存色素（ｅＦｌｕｏｒ７８０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）および蛍光色素結合抗ＣＤ８（ＰＥ結合、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ８＋細胞間のＣＤ１０７ａ染色の平均蛍光強度シグナル（ＭＦＩ）を決定することによって、ＣＤ８＋／ＣＤ１０７ａ＋細胞の％として、脱顆粒活性を決定した。ｍＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に、脱顆粒アッセイを行った。

図３の例は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ発現細胞（ＲＰＭＩ８２２６またはＨ９２９）と共に、またはＢＣＭＡ非発現細胞（Ｋ５６２）と共に６時間共培養した場合の、４つの異なるｓｃＦｖ由来のＣＡＲの脱顆粒活性を示している。

ＢＣ３０およびＢＣ５０ ｓｃＦｖについては、３つの異なるアーキテクチャを試験し（ｖ１、ｖ３およびｖ５）、２つの他のｓｃＦｖ Ｃ１１Ｄ５．３およびＣ１３Ｆ１２．１については、２つを試験した（ｖ３およびｖ５）。

図３の結果は、ＢＣ３０およびＢＣ５０由来ＣＡＲ Ｔ細胞がＢＣＭＡ発現癌細胞に対して活性である一方、ＣＡＲがＣ１１Ｄ５．３またはＣ１３Ｆ１２．１ ｓｃＦｖに由来するＣＡＲ Ｔ細胞では、活性が検出されないことを示している（図３）。

本発明の人工Ｔ細胞は、Ｃ１１Ｄ５．３またはＣ１３Ｆ１２．１ ｓｃＦｖ由来のＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＴ細胞と比較して、インビトロでの選択性の増加、および細胞溶解活性の増加を示す。

実施例３：ＢＣＭＡ発現癌細胞に対するＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性
さらなる活性試験のために、作製したすべてのＣＡＲ分子のうち、６つの活性分子を選択した。

このために、上記のように、バフィーコートサンプルからＴ細胞を単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化した。活性化後１１日目に、細胞を、異なる候補をコードするｍＲＮＡで一過性トランスフェクトした。ＢＣＭＡ発現または非発現細胞と共に共培養した場合の脱顆粒能力、ＩＦＮガンマ放出、および細胞傷害活性を測定することによって、ＣＡＲ活性を評価した。

図４は、ＢＣＭＡｎｅｇ細胞（Ｋ５６２）またはＢＣＭＡ発現細胞（ＲＰＭＩ８２２６およびＮＣＩ−Ｈ９２９）と共に６時間共培養した後の、ＣＡＲ Ｔ細胞の脱顆粒活性（ＣＤ１０７ａ＋細胞）を示している。ＣＡＲ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションの２４時間後に、共培養を開始した。結果は、３回の独立した実験の平均値を表す。

図４の結果により、Ｔ細胞において発現されたＢＣ３０およびＢＣ５０由来ＣＡＲの脱顆粒活性が確認された。

ＢＣＭＡ発現細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９またはＲＰＭＩ８２２６）と共に、またはＢＣＭＡ非発現細胞（Ｋ５６２）と共に２４時間共培養した場合の、ＣＡＲ Ｔ細胞によって放出されたＩＦＮガンマの量を測定した。共培養と同じ条件において単独で培養したＴ細胞からのＩＦＮガンマ放出も図５に示されている。３つの別個のドナーについて、実験を行った。

ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異的細胞溶解活性を測定した（図６）。ＣＡＲ ｍＲＮＡのトランスフェクションの４８時間後に、アッセイを行った。Ｔ細胞を、Ｋ５６２＋ＲＰＭＩ８２２６またはＫ５６２＋ＮＣＩＨ９２９細胞と共に４時間共培養した。共培養の終了時に、各細胞株の細胞生存率を決定し、特異的細胞溶解率を計算した。

３つの活性試験で得られた結果により、最も活性な候補としてＢＣ３０−ｖ３およびＢＣ５０−ｖ３を同定することができ、両ｓｃＦｖ由来のＣＡＲのｖ５またはＶ１バージョンもまた、ＩＦＮガンマ放出がより少ない対応する−ｖ３候補よりも低いが優れた活性を示した。

本発明のＢＣ３０およびＢＣ５０由来ＣＡＲは、ＢＣＭＡ発現癌細胞に対する特異性および活性をＴ細胞に付与する。

−ＩＦＮガンマ放出アッセイ
９６ウェルプレート（細胞４０，０００個／ウェル）において、Ｔ細胞を、ＢＣＭＡタンパク質発現または非発現細胞株と共にインキュベートした。最終容量１００μｌのＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で、共培養物を５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間維持した。このインキュベーション期間後に、プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を新たなプレートに回収した。細胞培養上清中のＩＦＮガンマの検出をＥＬＩＳＡアッセイ（Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）によって行った。ｍＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に、細胞共培養を開始することによって、ＩＦＮガンマ放出アッセイを行った。

−細胞傷害性アッセイ
９６ウェルプレート（細胞１００，０００個／ウェル）において、Ｔ細胞を、１０，０００個の標的ＢＣＭＡ発現細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９またはＲＰＭＩ−８２２６細胞）および１０，０００個の対照（ＢＣＭＡ ｎｅｇ Ｋ５６２）細胞と共に同じウェルにおいてインキュベートした。ＣＡＲ＋Ｔ細胞と共に共培養する前に、標的細胞および対照細胞を蛍光細胞内色素（ＣＦＳＥまたはＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で標識した。共培養物を５％ＣＯ_２、３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベーション期間後に、細胞を、固定可能な生存色素（ｅＦｌｕｏｒ７８０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞集団（標的細胞またはＢＣＭＡｎｅｇ対照細胞）の生存を決定し、特異的細胞溶解の％を計算した。ｍＲＮＡトランスフェクションの４８時間後に、細胞傷害性アッセイを行った。

次いで、本発明のＢＣＭＡ３０およびＢＣＭＡ５０由来ＣＡＲを初代ＴＣＲ ＫＯ初代Ｔ細胞に形質導入し、ＢＣＭＡ発現癌細胞に対してインビボで試験した。

結果は、抗癌薬（コルチコイド、ボルテゾミブ）の存在下におけるＢＣＭＡ発現癌細胞の量の有意な減少を実証している。加えて、ＴＣＲ陰性Ｔ細胞を接種した場合、マウスは、ＴＣＲ発現細胞を接種した場合よりも、はるかに少ない移植片対宿主拒絶反応の兆候を示した。

マウスにおけるＢＣＭＡ Ｔ細胞の移植の１００日後に、ＲＱＲ８陽性ＢＣＭＡ Ｔ細胞は、依然として検出可能であった。マウスへのリツキシマブの注射は、検出不可能なレベルの細胞をもたらした。マウスは適切に回復した。

したがって、本発明は、異なるＢＣＭＡ発現癌細胞に対する医薬として使用するための、本来的に同種性の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞、特にＢＣＭＡ３０またはＢＣＭＡ５０由来ＣＡＲ発現Ｔ細胞であって、十分に寛容され、排除され得るものを提供する。

ＣＡＲポリペプチド配列の例：
枠内の配列は、好ましいＶＨおよびＶＬ配列に対応する。ＣＡＲの効率を改善するために、ＶＨおよびＶＬを交換し得る。

一実施形態では、本発明は、以下のポリペプチドの１つを含むＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、場合によりヒト化されたＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

本発明では、以下の対象、主題および実施形態が提供される：
図２に示されているＶ１〜Ｖ６から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

前記構造Ｖ１が、Ｆｃ□ＲＩＩＩαヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記構造Ｖ２が、Ｆｃ□ＲＩＩＩαヒンジおよび４−１ＢＢ膜貫通ドメインを含む、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記構造Ｖ３が、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記構造Ｖ４が、ＣＤ８αヒンジおよび４−１ＢＢ膜貫通ドメインを含む、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記構造Ｖ６が、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記構造Ｖ６が、ＩｇＧ１ヒンジおよび４−１ＢＢ膜貫通ドメインを含む、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記ＶＨおよびＶＬが、配列番号：１１〜１８から選択されるポリペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインが、配列番号：８と少なくとも８０％の同一性を有する、上記実施形態に記載のいずれかのＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記ＣＤ３ゼータシグナリングドメインが、配列番号：９と少なくとも８０％の同一性を有する、上記実施形態に記載のいずれかのＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記Ｆｃ□ＲＩＩＩαヒンジが、配列番号：３と少なくとも８０％の同一性を有する、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記ＣＤ８αヒンジが、配列番号：４と少なくとも８０％の同一性を有する、上記実施形態に記載のいずれかのＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記ＩｇＧ１ヒンジが、配列番号：５と少なくとも８０％の同一性を有する、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記ＣＤ８α膜貫通ドメインが、配列番号：６と少なくとも８０％の同一性を有する、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

前記４−１ＢＢ膜貫通ドメインが、配列番号：７と少なくとも８０％の同一性を有する、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

ＢＣＭＡに特異的ではない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

配列番号：１９、配列番号：２５、配列番号：３１および配列番号：３７と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、上記に記載の構造Ｖ１のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２および配列番号：３８と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、上記に記載の構造Ｖ２のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

配列番号：２１、配列番号：２７、配列番号：３３および配列番号：３９と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、上記に記載の構造Ｖ３のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

配列番号：２２、配列番号：２８、配列番号：３４および配列番号：４０と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、上記に記載の構造Ｖ４のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３５および配列番号：４１と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、上記に記載の構造Ｖ５のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

配列番号：２４、配列番号：３０、配列番号：３６および配列番号：４２と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、上記に記載の構造Ｖ６のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

シグナルペプチドをさらに含む、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
前記シグナルペプチドが、配列番号：１または配列番号：２と少なくとも８０％の配列同一性を有する、上記に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。

上記実施形態のいずれかに記載のキメラ抗原受容体をコードする、ポリヌクレオチド。
上記に記載の核酸を含む、発現ベクター。

細胞表面膜において、上記に記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現する、人工免疫細胞。

炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来する、上記に記載の人工免疫細胞。

ＮＫ細胞に由来する、上記に記載の人工免疫細胞。
治療用の、上記に記載の人工細胞。

ヒト治療用の、上記に記載の人工細胞。
該症状が、ＢＣＭＡ発現細胞を特徴とする前悪性または悪性癌症状である、上記に記載の治療用人工細胞。

該症状が、ＢＣＭＡ発現細胞の過剰を特徴とする症状である、上記に記載の治療用人工細胞。

該症状が血液癌症状である、上記いずれか１つに記載の治療用人工細胞。
該血液癌症状が白血病である、上記いずれか１つに記載の治療用人工細胞。

該血液癌症状が多発性骨髄腫（ＭＭ）である、上記実施形態に記載の治療用人工細胞。
前記血液癌が悪性リンパ増殖性障害である、上記いずれか１つに記載の治療用人工細胞。

前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および髄異形成症候群からなる群より選択される、上記いずれか１つに記載の治療用人工細胞。

ＴＣＲの発現が前記免疫細胞において抑制されている、上記いずれか１つに記載の人工細胞。

少なくとも１つのＭＨＣタンパク質、好ましくはβ２ｍまたはＨＬＡの発現が前記免疫細胞において抑制されている、上記いずれか１つに記載の人工細胞。

前記細胞が、少なくとも１つの免疫抑制薬または化学療法薬に対する耐性を付与するように突然変異されている、上記いずれか１つに記載の人工細胞。

血液癌細胞を傷害する方法であって、前記細胞を、有効量の上記いずれか１つに記載の人工細胞と接触させて、前記癌細胞の傷害を引き起こすことを含む、方法。

免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を提供すること、
（ｂ）前記細胞の表面において、少なくとも１つの上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現させること
を含む、方法。

（ａ）免疫細胞を提供すること、
（ｂ）前記ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む、上記に記載の免疫細胞操作方法。

（ａ）免疫細胞を提供すること、
（ｂ）前記ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること、
（ｃ）ＢＣＭＡに特異的ではない少なくとも１つの他のキメラ抗原受容体を導入すること
を含む、上記に記載の免疫細胞操作方法。

それを必要とする被験体を処置する方法であって、
（ａ）表面において、上記いずれか１つに記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記免疫細胞を前記患者に投与すること
を含む、方法。

前記免疫細胞が、ドナーから提供されるものである、上記に記載の方法。
前記免疫細胞が、患者自身から提供されるものである、上記に記載の方法。

参考文献

Claims (45)

1. Ｖ１〜Ｖ６から選択されるポリペプチド構造の１つと少なくとも８０％の同一性を有し、好ましくはＶ１、Ｖ３またはＶ５から選択されるポリペプチド構造を有するＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造が、
   （ａ）モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
   （ｂ）ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８αヒンジおよびＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、
   （ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびに
   （ｄ）ＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
   を含む、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
2. モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメインを含む前記ポリペプチド構造が、以下のＣＤＲ配列：ＤＹＹＩＮ（配列番号：６１）、ＷＩＹＦＡＳＧＮＳＥＹＮＱＫＦＴＧ（配列番号：６２）およびＬＹＤＹＤＷＹＦＤＶ（配列番号：６３）、
   ならびにＫＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号：６４）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号：６５）およびＡＥＴＳＨＶＰＷＴ（配列番号：６６）またはＳＱＳＳＩＹＰＷＴ（配列番号：６７）、
   ＦｃγＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、好ましくはＣＤ８αヒンジまたはＩｇＧ１ヒンジ、ＣＤ８α由来の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、請求項１に記載のＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的（ＣＡＲ）。
3. モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来の前記細胞外リガンド結合ドメインＶＨおよびＶＬが、以下の配列：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＹＹＩＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＷＩＹＦＡＳＧＮＳＥＹＮＱＫＦＴＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＬＹＤＹＤＷＹＦＤＶＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号：６８）および／またはＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＫＶＳＮＲＦＳＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＳＱＳＳＩＹＰＷＴＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号：６９）
   （式中、Ｘは、アミノ酸である）を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的ＣＡＲ。
4. 前記ＶＨおよびＶＬが、配列番号：１１〜１４から選択されるポリペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的ＣＡＲ。
5. モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨを含む前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号：１１および配列番号：１３と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択され、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来の前記ＶＬが、配列番号：１２および配列番号：１４と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異的（ＣＡＲ）。
6. モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む前記細胞外リガンド結合ドメインがヒト化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
7. 前記構造Ｖ１が、ＦｃγＲＩＩＩαヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
8. 前記ＦｃγＲＩＩＩαヒンジが、配列番号：３と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
9. 配列番号：１９または配列番号：２５と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１〜８に記載の構造Ｖ１のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
10. 前記構造Ｖ３が、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
11. 前記ＣＤ８αヒンジが、配列番号：４と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜６、１０のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
12. 配列番号：２１または配列番号：２７と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１〜６、１０、１１のいずれか一項に記載の構造Ｖ３のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
13. 前記構造Ｖ５が、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
14. 前記ＩｇＧ１ヒンジが、配列番号：５と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜６、１３のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
15. 配列番号：２３または配列番号：３５と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１〜６、１３、１４のいずれか一項に記載の構造Ｖ５のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
16. ４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインが、配列番号：８と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
17. 前記ＣＤ３ゼータシグナリングドメインが、配列番号：９と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
18. 前記ＣＤ８α膜貫通ドメインが、配列番号：６と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
19. シグナルペプチドをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
20. 前記シグナルペプチドが、配列番号：１または配列番号：２と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１９に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
21. ＢＣＭＡに特異的ではない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
22. ヒト化されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ。
23. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチド。
24. 請求項２３に記載のＢＣＭＡ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
25. 細胞表面膜において、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現する、人工免疫細胞。
26. 少なくとも１つのＭＨＣタンパク質、好ましくはＭＨＣ関連β２ｍタンパク質の発現が抑制されている、請求項２５に記載の人工免疫細胞。
27. 少なくとも１つの免疫抑制薬または少なくとも１つの化学療法薬に対して耐性を有するように改変されており、好ましくは、少なくとも１つの免疫抑制薬または化学療法薬に対して耐性を有するように改変されており、自殺遺伝子をさらに含む、請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の人工免疫細胞。
28. 炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の人工免疫細胞。
29. ＴＣＲ ＫＯ人工免疫Ｔ細胞である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の人工免疫細胞。
30. 少なくとも１つの抗癌または抗炎症性疾患化学療法に対して耐性である、請求項２５〜請求項２９に記載の人工免疫細胞。
31. 治療用の、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の人工免疫細胞。
32. 病的症状の処置のための、請求項３１に記載の治療用人工免疫細胞であって、前記病的症状が、ＢＣＭＡ発現細胞に関係する前悪性または悪性癌症状である、治療用人工免疫細胞。
33. 該病的症状が、ＢＣＭＡ発現細胞の過剰を特徴とする症状である、請求項３２に記載の治療用人工免疫細胞。
34. 該病的症状が血液癌症状である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の治療用人工免疫細胞。
35. 該血液癌症状が白血病である、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の治療用人工免疫細胞。
36. 該血液癌症状が多発性骨髄腫（ＭＭ）である、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の治療用人工免疫細胞。
37. 前記血液癌が悪性リンパ増殖性障害である、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の治療用人工細胞。
38. 前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および髄異形成症候群からなる群より選択される、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の治療用人工細胞。
39. 血液癌細胞を傷害する方法であって、前記細胞を、有効量の請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の人工細胞と接触させて、前記癌細胞の傷害を引き起こすことを含む、方法。
40. 免疫細胞を操作する方法であって、
    −免疫細胞、場合により、少なくとも１つの抗癌化学療法に対してさらに耐性のＴＣＲ ＫＯ免疫細胞を提供すること
    −前記細胞の表面において、少なくとも１つの請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現させること
    を含む、方法。
41. −免疫細胞、場合により、少なくとも１つの抗癌化学療法に対してさらに耐性のＴＣＲ ＫＯ免疫細胞を提供すること、
    −前記ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること、
    −前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
    を含む、請求項３９に記載の免疫細胞操作方法。
42. −免疫細胞、場合により、少なくとも１つの抗癌化学療法に対してさらに耐性のＴＣＲ ＫＯ免疫細胞を提供すること、
    −前記ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること、
    −ＢＣＭＡに特異的ではない少なくとも１つの他のキメラ抗原受容体を導入すること
    を含む、請求項４０または４１に記載の免疫細胞操作方法。
43. それを必要とする被験体を処置する方法であって、
    −表面において、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞；場合により、少なくとも１つの抗癌化学療法に対してさらに耐性のＴＣＲ ＫＯ免疫細胞を提供すること、
    −前記免疫細胞を前記患者に投与すること
    を含む、方法。
44. 前記免疫細胞が、ドナーから提供されるものである、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記免疫細胞が、患者自身から提供されるものである、請求項４４に記載の方法。